TWI542693B

TWI542693B - 具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物及其製備方法

Info

Publication number: TWI542693B
Application number: TW103123433A
Authority: TW
Inventors: 張德生; 蔡以萱
Original assignee: 國立臺南大學
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2016-07-21
Also published as: TW201602350A

Description

具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物及其製備方法

本發明係有關於一種具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物及其製備方法，尤其係指將一具有CYP57B3與CPR融合基因的重組質體於一酵母菌中表達，再將酵母菌培養於含有類黃酮之培養基內一段時間，使類黃酮生物轉換(flavonoids biotransformation)後，產生具有抑制黑色素能力之含類黃酮代謝產物(metablolites)之酵母萃取物；藉此，含類黃酮代謝產物之酵母萃取物可進一步用於化妝品組合物，以達到美白淡斑功效。

按，膚色係取決於黑色素在皮膚中的含量，皮膚黑色素細胞(melanocyte)的黑色素小體(melanosome)透過黑色素生成作用(melanogenesis)產生黑色素(melanin)以防禦抵抗陽光中的紫外線。過去研究指出酪胺酸酶(tyrosinase)為調控黑色素生成之關鍵酵素，不僅參與黑色素生成過程中的許多反應，並且為催化反應中速率限制步驟的關鍵酵素，因此酪胺酸酶的含量可作為黑色素生成反應之指標。雖然黑色素具有光保護作用，但黑色素在皮膚不同部位累積所造成的斑塊常常影響美觀。因此，如何有效抑制酪胺酸酶活性及防止異常色素沉著，已成為一研發重點。

類黃酮(flavonoid)屬於植物中一種重要的次級代謝產物，近年來發現類黃酮對於人體生理有許多功效，包含抗氧化性、預防骨質疏鬆、降低心血管疾病及減緩更年期症狀等。雖然有很多研究證實類黃酮衍生物具有多種不同的生物活性，然而，低生產率仍是阻礙類黃酮運用於保健食品或醫藥產品的主因。為解決此問題，本發明人已提出不同方法以期能大量生產出類黃酮衍生物；例如可參閱台灣專利申請號第102145727號「利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法」，即揭示一種以生物轉換(biotransformation)製備大量類黃酮衍生物之方法。

再者，位於類黃酮骨架上不同碳原子之官能基會影響類黃酮的生化活性，尤其羥基類黃酮(hydroxyl flavonoid)衍生物通常具有相異於前驅物類黃酮的生化活性。例如在本發明人過去的研究中，證實鄰位-羥基大豆黃酮(ortho-hydroxydaidzein,OHDe)衍生物，包括6-OHDe(Biosci.Biotechnol.Biochem.2005,69(10),1999-2001)以及8-OHDe(J.Agric.Food Chem.2007,55(5),2010-2015；Int.J.Mol.Sci.2009,10(10),4257-4266)具有酪胺酸酶抑制劑的活性，但該前驅物大豆黃酮(daidzein)則不具此活性。

爰此，如何研發出更多具有抑制黑色素生成之類黃酮衍生物以期發展出低劑量、高效能之皮膚保養品，便成為相關領域發明人思及之方向。

本發明主要目的為提供一種具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物及其製備方法，其係指製備一具有CYP57B3與CPR融合基因的重組酵母菌，再將重組酵母菌培養於含有類黃酮之培養基內一段時間，使類黃酮進行生物轉換後，產生具有抑制黑色素效果之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物；藉此，含類黃酮代謝產物之酵母萃取物可進一步用於化妝品組合物，以達到美白淡斑功效。

為了達到上述實施目的，本發明一種具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物，其中含類黃酮代謝產物之酵母萃取物係以下列步驟製得：步驟一：將一環狀重組質體置於一適合的微生物表達系統中，其中環狀重組質體係包含來自米麴菌(A.oryzae)之CYP57B3基因及來自釀酒酵母(S.cerevisiae)之細胞色素還原酶(CPR)基因，其中，微生物表達系統可例如為畢赤酵母(P.pastoris)；以及步驟二：利用含有類黃酮之培養基培養微生物表達系統一作用時間以形成一總培養液，再利用乙酸乙酯萃取該總培養液並濃縮，以產生一含類黃酮代謝產物之酵母萃取物；其中，類黃酮係大豆黃酮、芹菜素或染料木黃酮，最佳係為染料木黃酮。

本發明另一目的為含類黃酮代謝產物之酵母萃取物用於抑制黑色素生成之用途，其係施予一有效劑量之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物於皮膚，以抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中含類黃酮代謝產物之酵母萃取物係以如上述步驟一~步驟二製得；其中，類黃酮係大豆黃酮、芹菜素或染料木黃酮，最佳係為染料木黃酮；有效劑量可例如為125-500μg/ml。

於本發明之一實施例中，培養基係YPD(yeast extract peptone dextrose)培養基。

於本發明之一實施例中，作用時間可例如為24至96小時。

(S1)‧‧‧步驟一

(S2)‧‧‧步驟二

第一圖：本發明較佳實施例之製備方法步驟流程圖

第二A圖：含大豆黃酮(daidzein)代謝產物之酵母萃取物對於黑色素生成之影響

第二B圖：含染料木黃酮(genistein)代謝產物之酵母萃取物對於黑色素生成之影響

第二C圖：含芹菜素(apigenin)代謝產物之酵母萃取物對於黑色素生成之影響

第三A圖：含大豆黃酮(daidzein)代謝產物之酵母萃取物之細胞毒性測試結果

第三B圖：含染料木黃酮(genistein)代謝產物之酵母萃取物之細胞毒性測試結果

第三C圖：含芹菜素(apigenin)代謝產物之酵母萃取物之細胞毒性測試結果

第四圖：以分光光度法分析含染料木黃酮(genistein)代謝產物之酵母萃取物對於黑色素細胞內酪胺酸酶活性之影響

第五A圖：以染色酶譜法分析含染料木黃酮(genistein)代謝產物之酵母萃取物對於黑色素細胞內酪胺酸酶活性之影響

第五B圖：第五A圖之量化圖

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

首先，本發明一種具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物，請參閱第一圖，含類黃酮代謝產物之酵母萃取物係以下列步驟製得：步驟一(S1)：將一環狀重組質體置於一適合的微生物表達系統中，其中環狀重組質體係包含來自米麴菌(Aspergillus oryzae) 之CYP57B3基因及來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之細胞色素還原酶(cytochrome reductase,CPR)基因，其中微生物表達系統可例如為畢赤酵母(Pichia pastoris)；以及步驟二(S2)：利用含有類黃酮之培養基培養微生物表達系統一作用時間以形成一總培養液，再利用乙酸乙酯萃取該總培養液並濃縮，以產生一含類黃酮代謝產物之酵母萃取物；其中，類黃酮可例如為大豆黃酮(daidzein)、芹菜素(apigenin)或染料木黃酮(genistein)，最佳為染料木黃酮；培養基可例如為YPD(yeast extract peptone dextrose)培養基。

再者，本發明亦揭示一種含類黃酮代謝產物之酵母萃取物用於抑制黑色素生成之用途，其係施予一有效劑量之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物於皮膚，以抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中含類黃酮代謝產物之酵母萃取物係以如上述之步驟一(S1)~步驟二(S2)製得；其中有效劑量較佳為125-500μg/ml；而作用時間可例如為24至96小時。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實驗一：製備含類黃酮代謝產物之酵母萃取物

(1)建構含融合基因之重組畢赤酵母以進行類黃酮生物轉換作用

建構含有CYP57B3與CPR融合基因之重組畢赤酵母(recombinant P.pastoris)之技術已為習知技藝中眾所皆知之知識，已公開於申請人之台灣專利申請號第102145727號「利用生物轉換製備6-羥基芹菜素之方法」中，於此不再贅述。

(2)發酵及製備含類黃酮代謝產物之酵母萃取物

將畢赤酵母重組體培養於20mL YPD(1% yeast extract, 2% peptone,2% dextrose)培養基內2天，條件為28℃，200rpm，此培養基尚含有100μg/ml的抗生素Zeocin，當作種菌培養物(seed culture)。再將種菌培養物接種(inoculate)到7L的發酵槽中，此發酵槽係含有3L的YPD培養基，並添加有100μg/ml的抗生素Zeocin、250μM的δ-aminolevulinic acid、100μM類黃酮，以及1%(v/v)的消泡劑(antifoam,Sigma)，然後伴隨通氣(0.5,v/v/m)和攪拌(280rpm)，於28℃進行反應；其中類黃酮包括以下十種之一：黃酮(flavones)、芹菜素(apigenin)；黃烷酮(flavanones)、甘草素(liquiritigenin)、柚皮素(naringenin)；異黃酮(isoflavones)、大豆黃酮(daidzein)、染料木黃酮(genistein)；黃酮醇(flavonols)；以及兒茶素(catechin)。發酵96小時之後，利用2L乙酸乙酯萃取總培養液兩次，將此含有類黃酮代謝產物之乙酸乙酯萃取液於真空下合併濃縮形成酵母萃取物(yeast extracts,YE)，再將酵母萃取物(yeast extracts,YE)懸浮於DMSO中以進行抗黑素生成試驗分析。

結果顯示，僅五種類黃酮可成功由生物轉換出類黃酮代謝產物，包括芹菜素(apigenin)、甘草素(liquiritigenin)、柚皮素(naringenin)、染料木黃酮(genistein)及大豆黃酮(daidzein)。因此，進一步分析上述五種類黃酮代謝產物對於黑色素生成之影響。

實驗二：含類黃酮代謝產物之酵母萃取物對於黑色素生成之影響

〈黑色素含量之測定〉

在此實驗中，利用IBMX作為黑色素生成刺激劑(melanogenic-stimulating agen)以及利用已被證實具有抑制黑色素生成活性之danazol作為正控制組。

小鼠B16黑色素瘤細胞(4A5)係由生物資源保存及研究中心(BCR；新竹財團法人食品工業發展研究所)購得。將細胞培養於含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培養基內，在37℃、5% CO₂之濕潤培養箱中培養。以一適當細胞密度將細胞種於24-well培養皿中，經過一天培養後，將細胞於存有400μM黑色素生成刺激劑(IBMX)的條件下，各別利用125、250或500μg/ml含有類黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from flavonoids)處理細胞，並培養2天。之後收集細胞並以PBS緩衝液洗滌細胞2次；再將沉澱細胞溶解於含20mM磷酸鈉(pH6.8)和1% Triton X-100的裂解緩衝液(lysis buffer)。以15,000×g離心15分鐘後，在95℃下將黑色素沉澱物(melanin pellets)溶解於含有20% DMSO的1N NaOH中1小時。黑色素含量之測定係利用分光光度計(U-5100；Hitachi，日本)測量490nm處的吸光度；黑色素含量係以相對IBMX刺激組別的百分比(% of IBMX-stimulated control)表示。

結果請參閱第二A圖~第二C圖，Y軸代表黑色素含量(melanin content)，X軸代表不同處理條件；與IBMX組相較下，含有大豆黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from daidzein)、含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)及含有芹菜素代謝產物之酵母萃取物(YE from apigenin)，皆各別呈現抑制B16細胞黑色素含量之能力。如第二A圖，濃度500μg/ml的大豆黃酮代謝產物明顯地抑制黑色素含量；再者，如第二B圖及第二C圖所示，125、250及500μg/ml的染料木黃酮代謝產物及芹菜素(apigenin)代謝產物皆呈現出顯著的抑制黑色素含量作用；其中以染料木黃酮代謝產物之抑制效果最佳，濃度500μg/ml的染料木黃酮代謝產物可抑制相對於IBMX組的49.5%，並且抑制效果呈現濃度依存(dose-dependent)關係。然，含有甘草素(liquiritigenin)或柚皮素(naringenin)之酵母萃取物，對於黑色素含量皆沒有影響(數據未顯示)。

實驗三：含類黃酮代謝產物之酵母萃取物之細胞毒性測試結果

〈細胞存活率之測定〉

為了探討上述類黃酮代謝產物的抑制效果是否透過細胞毒殺作用(cytotoxicity)造成，本實驗進一步利用MTT法檢測類黃酮代謝產物之細胞存活率。利用不同類黃酮代謝產物處理細胞48小時之後，將培養液移除，加入溶於PBS之1mg/mL MTT溶液培養2小時；再將MTT溶液移除，並加入DMSO。利用分光光度計(U-5100；Hitachi，日本)測量溶解的甲臢晶體(formazan crystals)於570nm處的吸光度；細胞存活率係以相對控制組的百分比(% of control)表示。

結果請參閱第三A圖~第三C圖，Y軸代表細胞存活率(cell survival)，X軸代表不同處理條件；與控制組(control)相較下，含有大豆黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from daidzein)、含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)及含有芹菜素代謝產物之酵母萃取物(YE from apigenin)，其細胞存活率不同。如第三A圖，僅濃度500μg/ml的大豆黃酮代謝產物具細胞毒殺性；如第三B圖所示，不論在任何測試濃度下，染料木黃酮代謝產物皆不具細胞毒殺性；然而，如第三C圖所示，濃度大於125μg/ml的芹菜素代謝產物皆具有顯著的細胞毒殺性。

由此可知，含染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物抑制黑色素含量之效果並非透過細胞毒殺作用達成，因此後續係利用含染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物進行試驗。

實驗四：含類黃酮代謝產物之酵母萃取物對於酪胺酸酶活性之影響

由於酪胺酸酶在黑色素生成中扮演重要角色，因此利用含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)測試其對於B16細胞酪胺酸酶活性之影響。在此實驗中，利用IBMX作為酪胺酸酶刺激劑以及利用danazol作為正控制組。

細胞內酪胺酸酶活性之測定，是利用(1)分光光度法或(2)原位(in-situ)染色酶譜法(zymographic method)測定。

(1)以分光光度法分析細胞酪胺酸酶活性之測定

在B16細胞中酪胺酸酶活性係藉由測量L-DOPA的氧化速率來測定。細胞經由含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)處理之後，利用冰的PBS洗滌細胞並利用包含1% Triton X-100與1mM PMSF的20mM PBS(pH 6.8)溶解細胞；其中，1% Triton X-100係用以將膜結合酪胺酸酶(membrane-bound tyrosinase)由黑色素小體中釋放。利用冷凍和解凍破裂細胞，將溶解產物(lysates)以15,000×g離心15分鐘；用Bradford法測定上清液中的蛋白質含量，並以牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白質標準。在酪胺酸酶活性的測定實驗中，1mL的反應混合物(reaction mixture)中含有50mM PBS(pH 6.8)、2.5m L-DOPA，及500μg的懸浮蛋白質(supernatant protein)；於37℃作用15分鐘之後，多巴色素(dopachrome)的形成係利用分光光度計(U-5100；Hitachi，日本)測量475nm處的吸光度；酪胺酸酶活性係以相對IBMX刺激組別的百分比(% of IBMX-stimulated control)表示。

結果請參閱第四圖，Y軸代表酪胺酸酶活性(tyrosinase activity)，X軸代表不同處理條件；含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)可抑制酪胺酸酶活性，尤其在濃度500μg/ml時，與IBMX組相較下，其酪胺酸酶活性僅剩56.8%。

(2)以原位染色酶譜法分析細胞酪胺酸酶活性

細胞經由含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)處理之後，用冰的PBS洗滌細胞3次，再利用含20mM磷酸鈉(pH6.8)、1% Triton X-100、1mM PMSF與蛋白酶抑製劑混合物(Abcam,Cambridge)的冰裂解緩衝液(lysis buffer)溶解細胞。於15,000 x g離心5分鐘之後，用Bradford法測定上清液中的蛋白質含量，並以牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白質標準。將100μg蛋白質與sampling buffer(無β-mercaptoethanol或加熱)混合，並利用10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。電泳完成後利用200ml的100mM PBS(pH6.8)沖洗，並在室溫下平衡輕輕搖動30分鐘；再利用新鮮的PBS替換。接著，將凝膠移轉至含有2.5mM L-DOPA的200mL染色溶液(staining solution)中，於作用在黑暗中、37℃下反應1小時。膠體上的帶狀(band)可看出酪胺酸酶活性，再利用密度計(densitometer system GS-700；Bio-Rad)定量膠體上的帶狀。

結果請參閱第五圖，第五A圖為染色酶譜法分析細胞酪胺酸酶活性之結果，其量化圖為第五B圖。由第五圖結果顯示含有染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物(YE from genistein)可抑制酪胺酸酶活性，尤其在濃度500μg/ml時，與IBMX組相較下，其酪胺酸酶活性僅剩40.0%。

由此可知，含染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物係透過降低酪胺酸酶活性，達到有效抑制黑色素生成。故此含染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物適合進一步運用於抑制黑色素生成之化妝品組合物，其中化妝品組合物可例如為水劑、乳劑、膏劑、粉劑、美白劑或淡斑劑等，以達到美白功效。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明證實將具有CYP57B3與CPR融合基因的重組酵母菌培養在含有daidzein、genistein或apigenin之類黃酮中，經生物轉換作用後之酵母萃取物，可產生具有抑制黑色素生成之類黃酮代謝產物；藉此，含類黃酮代謝產物之酵母萃取物可進一步用於化妝品組合物，以達到美白淡斑功效。

2.本發明亦證實以含genistein代謝產物之酵母萃取物抑制黑色素生成之效果最佳，並且含genistein代謝產物之酵母萃取物係透過調控酪胺酸酶活性達到抑制黑色素生成之效果，促使酪胺酸酶活性降低，而非直接破壞細胞。

綜上所述，本發明之具抑制黑色素生成能力之含類黃酮代謝產物之酵母萃取物及其製備方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims

一種製備含染料木黃酮(genistein)代謝產物之酵母萃取物之方法，其係以下列步驟製得：步驟一：將一環狀重組質體置於一畢赤酵母(Pichia pastoris)中，其中該環狀重組質體係包含來自米麴菌(Aspergillus oryzae)之CYP57B3基因及來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之細胞色素還原酶(cytochrome reductase,CPR)基因；以及步驟二：利用含有100μM染料木黃酮之YPD(yeast extract peptone dextrose)培養基培養該畢赤酵母96小時以形成一總培養液，再利用乙酸乙酯萃取該總培養液並濃縮，以產生一含染料木黃酮代謝產物之酵母萃取物；其中該有效劑量為125-500μg/ml之酵母萃取物可抑制黑色素生成。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該有效劑量係500μg/ml。