KR20130069019A - 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법 - Google Patents

발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법 Download PDF

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이상학
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이현아
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부산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 맥문동을 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주로 발효시킨 후 그 발효물을 다시 용매로 추출하여 얻어짐으로써 개선된 항염증, 항산화능 및 발모 촉진 효과를 나타내는 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법 {Hair growth stimulants including fermented Liriope platyphylla extract and preparing method thereof}
본 발명은 개선된 발모 촉진 효과를 나타내는 발모 촉진제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
탈모는 중년 이후의 남성이나 갱년기 이후의 여성에게서 많이 나타나는 특정 질환으로 인식되어 왔으나, 현대화, 산업화의 발달로 인하여 다양한 환경의 영향을 받으며 탈모와 두피 문제가 연령대와 성별의 구분 없이 증가하고 있다. 현재 국내 탈모 인구는 20세 이상 성인 남녀 중 약 23% 가량인 350만 명으로 추정되고 있다.
양, 한방에서 제시하는 다양한 탈모의 요인 중 현대인에게 있어 가장 크게 작용하는 것은 치열한 경쟁과 미래에 대한 불확실성에 따른 자기중심적인 생활에 의해 유발되는 스트레스와 강박관념으로 급격한 호르몬의 변화 및 자가 면역력 약화 현상으로 알려져 있다. 스트레스 등 환경에 의한 탈모의 기전은 면역세포와 호중구들이 활성화되어 염증반응을 일으키고 모낭의 조직을 파괴하여 모발세포의 세포사를 유발하여 탈모가 발생하는 것이다.
현재 완벽한 치료 효과를 나타내는 발모제는 없으나, 모발 성장을 촉진하는 제품으로 미녹시딜(Minoxidil, Pharmacia & Upjohn, Sweden)과 프로페시아(Propecia, Merck, Germany)가 있다. 미녹시딜의 발모 효과 작용 기전은 명확하게 밝혀지지 않았지만 혈관 확장을 통한 영양 공급 및 칼륨 채널 개방 효과 등이 모발 성장을 유도하는 것으로 알려지고 있다. 그러나 가려움증, 표피 벗겨짐, 건성화를 동반한 피부염, 알레르기 접촉성 및 지루성 피부염을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다. 또한 급격한 몸무게 증가, 심장박동 증가, 협심증 및 혈액학적 부작용에 대해서도 경고 되고 있다. 프로페시아는 남성 호르몬 대사에 작용하는 효소인 5α-환원효소의 활성을 억제하는 물질로 알려져 있으나 이 역시 성욕감퇴, 발기부전, 남성의 여성용 유방 등의 부작용이 보고되고 있다. 이에 따라 두피와 모발 관련제품의 안정성에 대한 관심이 안정성이 보장된 천연물에 대한 관심으로 이어지고 있어, 천연물을 이용한 연구개발의 배경이 되고 있다.
맥문동은 백합과에 속하는 다년생 초본식물로 학명은 Liriope platyphylla WANG et TANG이다. 맥문동은 진액을 보하는 대표적인 약으로 폐음손상으로 인한 마른기침, 각혈, 가래, 해수에 쓰이며, 위음부족으로 인한 갈증, 소갈 및 변비에도 사용된다. 음혈 소상으로 가슴이 답답하고 팔다리를 가만히 두지 못하는 증상과 불면증에 사용된다. 약리효과는 항염증작용, 항산화작용, 혈류량촉진, 심장수축력증가, 진정, 면역증강, 혈당강하, 항균작용 등이 보고되었다.
발효는 유기물이 미생물 작용에 의해 분해 및 변화되는 현상, 좁은 뜻으로는 당질이 미생물에 의해 무산소적으로 분해되는 현상이며 넓은 뜻으로는 미생물에 의한 유용한 물질의 생산을 의미한다. 효모는 미생물군 중에서 인간이 상업적으로 개척하여 온 가장 중요한 미생물 중의 하나로, 실제 수백 가지의 종류가 있으며 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 등이 있다.
빵을 만들기 위한 식용 효모, 술, 맥주 등의 배양을 위한 알콜 효모 등 기타 발효 배양의 목적 등으로 사용되고 있으며, 식사료용 단백질, 비타민, 핵산 관련 물질 등 여러 가지 중요한 효소를 생산함으로써 산업에 이용되고 있다.
맥문동의 발모 용도 관련하여, 한국 특허 제852263호 (2008. 8. 14. 공고)에는 맥문동 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물이 기재되어 있다. 이는 천연물인 맥문동을 활용한다는 점에서 화학 물질을 포함하는 경우보다 염증을 적게 유발시킨다는 점에서 개선된 점이 있지만 그 발모 촉진 효과가 충분하지 못한 단점이 있었다.
특허문헌 1: 한국 특허 제852263호 (2008. 8. 14. 공고)
본 발명은 발모 촉진 효과와 함께 항산화성 및 항염증성이 충분히 개선된 천연 발모 촉진제 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제.
2. 위 1에 있어서, 발효는 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의해 이루어진 것인 발모 촉진제.
3. 위 1에 있어서, 발효는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 의해 이루어진 것인 발모 촉진제.
4. 위 2 또는 3에 있어서, 균주는 맥문동 100중량부에 대해 0.1 내지 5 중량부로 접종되는 발모 촉진제.
5. 위 1에 있어서, 발효된 맥문동 추출물은 맥문동을 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 발효시킨 후 그 발효물을 추출하여 얻어진 것인 발모 촉진제.
6. 위 1에 있어서, 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출된 것인 발모 촉진제.
7. 위 1에 있어서, 추출물은 50 내지 90% 에탄올 용매로 추출된 것인 발모 촉진제.
8. 위 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 맥문동에 접종하여 발효시키는 단계; 및 발효물을 50 내지 90% 에탄올 용매로 추출하는 단계를 포함하는 위 1의 발모 촉진제의 제조 방법.
9. 위 8에 있어서, 발효 단계는 사카로마이세스 세레비지애에 의해 이루어지는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
10. 위 8에 있어서, 발효 단계는 맥문동 분말 100중량부에 대해 물 90중량부를 넣은 후 사카로마이세스 세레비지애를 0.1 내지 5중량부 접종하여 이루어지는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
11. 위 8에 있어서, 균주는 맥문동 100중량부에 대해 0.1 내지 5중량부로 접종되는 발모 촉진제의 제조 방법.
12. 위 8에 있어서, 추출 단계는 12 내지 84시간 동안 수행되는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
본 발명의 발모 촉진제는 우수한 항염증, 항산화능 및 발모 촉진 효과를 나타낸다.
본 발명의 발모 촉진제는 기존의 발모 촉진제, 예컨대 비발효 맥문동 추출물 등을 사용하는 경우보다 항산화능이 약 20% 내지 60%, 바람직하게는 약 30% 내지 110% (사카로마이세스 세레비지애 균주로 발효시키는 경우) 개선된다. 이에 따라, 피지가 두피에서 과산화지질로 축적되는 것이 방지되고 항산화효소인 SOD가 증가되어 모발에 염증을 만드는 활성 산소가 됨으로써 모낭이 재형성되고 발모가 보다 촉진되는 효과가 있다.
본 발명의 발모 촉진제를 소정의 방법(맥문동을 특정 균주로 발효시킨 후 그 발효물을 추출)에 따라 제조하는 경우에는 그 외 방법들에 비해 미생물 발효가 더 잘 이루어져서 항염증, 항산화능 및 발모 촉진 효과 발현에 유리하다.
도 1은 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 세포 생존율 측정 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 NO 수준 측정 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 세포 내 ROS 수준 측정 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 지질 과산화물 측정 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 5 및 6은 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 웨스턴 블롯 측정 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 7 및 8은 사카로마이세스 세레비지애로 발효된 맥문동 추출물의 C57BL/6 마우스를 이용한 발모촉진 시험 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 발효된 맥문동 추출물의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 항산화 시험 결과를 나타낸 것이다 (AO: 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae)를 이용한 발효된 맥문동 추출물, BS: 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)을 이용한 발효된 맥문동 추출물, BB: 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve)를 이용한 발효된 맥문동 추출물, LA: 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 를 이용한 발효된 맥문동 추출물, SC: 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 발효된 맥문동 추출물, LP: 맥문동(Liriope platyphylla) 추출물) 및 vit.C: 비타민 C).
도 10은 발효된 맥문동 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 (Superoxide anion radical) 소거능에 대한 항산화 시험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 맥문동을 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주로 발효시킨 후 그 발효물을 다시 용매로 추출하여 얻어짐으로써 개선된 항염증, 항산화능 및 발모 촉진 효과를 나타내는 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발효된 맥문동 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.
맥문동을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 동결 건조한다. 맥문동은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다.
동결 건조한 맥문동을 로스터에서 볶음 처리한 후, 분말화하고, 균주를 이용해 발효시킨다.
맥문동 분말에 균주를 접종하기 전에 물 등을 가할 수 있다. 물은 맥문동 100중량부에 대해 예컨대 30 내지 100중량부 가해질 수 있다. 물의 양은 균주의 특성에 따라 차이가 있을 수 있다.
균주의 접종량은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 맥문동 100 중량부에 대해 0.1 내지 5중량부로 접종될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2중량부로 접종될 수 있다. 상기 조건하에서 최적의 생육조건을 나타내어 보다 발효가 잘 이루어질 수 있다.
균주에 따라 발효 시간 및 온도는 적절히 선택될 수 있다.
균주의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주일 수 있다.
보다 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재 KCCM 12698, 비피도박테리움 브레브 KCCM 11208, 바실러스 서브틸리스 KCCM 11316, 락토바실러스 아시도필루스 KCCM 41270, 사카로마이세스 세레비지애 KCCM 50757 균주일 수 있다.
다음으로, 발효된 맥문동을 적당한 양의 추출 용매에 완전히 침지시킨다. 추출 용매로는 예컨대, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 용매일 수 있으며, 물 또는 50 내지 90% 에탄올이 바람직하고, 70% 에탄올이 보다 바람직하다.
추출 용매로부터 추출하는 시간은 추출물이 충분히 얻어질 수 있을 때까지 적절하게 수행될 수 있다. 예를 들면 12 내지 84시간, 바람직하게는 12 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
상기 과정을 통해 수득 된 발효된 맥문동 추출물을 감압 농축한 후, 동결 건조하여 본 발명의 추출물을 수득한다.
본 발명의 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모촉진제는 활성산소를 제거하는 항산화 활성이 있으므로, 피지가 두피에서 과산화지질로 축적되는 것을 방지하고, 항산화효소인 SOD를 증가시켜 모발에 염증을 만드는 활성산소를 제거하여 모낭을 재형성(reformation)하고 발모를 촉진하게 된다.
본 발명의 발모촉진제의 기제는 통상적으로 사용되는 한 어떠한 것도 사용가능하며, 그 예로 정제수, 미네랄워터, 에탄올, 글리세린, 스쿠알렌, 1,3-프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 피마자유, 츠바키유 및 리퀴드 페트롤레이텀(liquid petrolatum)을 포함한다. 본 발명의 조성물에 배합되는 기타 성분의 예는 계면활성제, 유화제, 증점제, 방부제(예를 들어, 파라옥시안식향산메틸), 산화방지제, 향료 등을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 발모촉진제는 모낭에 영양소를 공급하는 역할을 할 수 있는 성분이나 통상적으로 사용되는 모발성장 촉진 보조성분을 포함할 수 있는데, 예를 들면 비타민류, 아미노산류, 동식물유, 염화나트륨 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들의 양은 전체 조성물의 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.01 내지 1중량%로 첨가되는 것이 좋다. 이때, 비타민류는 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 나이아신(니코틴산), 비타민 C, 비타민 E, 판토텐산 나트륨, 판토텐산 칼륨, 비오틴 H(비타민 H) 등을 모두 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니며, 아미노산류는 도파를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 동식물유는 마유, 난유, 올리브유, 동백유, 유채기름, 참기름, 배아유 등을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 발모촉진제는 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명에서 '모발'이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다. 따라서 본 발명은 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제 또는 속눈썹영양제, 또는 애완동물용 샴푸 및 애완동물용 린스로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예, 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 아스퍼질러스 오리재를 이용한 발효된 맥문동 추출물의 제조
아스퍼질러스 오리재를 이용한 발효 맥문동 추출물의 제조과정은 다음과 같다. 맥문동을 세정하여 동결 건조하고, 로스터에서 15분간 볶음처리한 후 200메쉬로 분말화하여 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 맥문동 분말 100중량부에 대해 물을 40중량부로 첨가한 후, 물과 맥문동 분말을 잘 섞어주고 맥문동 100중량부에 대해 1 중량부의 아스퍼질러스 오리재 종균을 접종하였다. 이를 34℃ 인큐베이터에서 1∼2일간 배양시킨 후, 10배의 중량의 70% 에탄올에서 24시간 동안 추출하고, 동결 건조 후 실험에 사용하였다.
실시예 2. 바실러스 서브틸리스를 이용한 발효된 맥문동 추출물의 제조
바실러스 서브틸리스를 이용한 발효 맥문동 제조과정은 다음과 같다. 맥문동을 세정하여 동결 건조하고, 로스터에서 15분간 볶음처리한 후 200메쉬로 분말화하여 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 맥문동 분말 100중량부에 대해 물을 90중량부로 첨가한 후, 물과 맥문동 분말을 잘 섞어주고 맥문동 100중량부에 대해 1중량부의 바실러스 서브틸리스 종균을 접종하였다. 이를 35∼37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양 후, 10배의 중량의 70% 에탄올에서 24시간 동안 추출하고, 동결 건조 후 실험에 사용하였다.
실시예 3. 비피도박테리움 브레브를 이용한 발효된 맥문동 추출물의 제조
비피도박테리움 브레브를 이용한 발효 맥문동 제조과정은 다음과 같다. 맥문동을 세정하여 동결 건조하고, 로스터에서 15분간 볶음처리한 후 200메쉬로 분말화하여 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 맥문동 분말 100중량부에 대해 물을 90중량부로 첨가한 후, 물과 맥문동 분말을 잘 섞어주고 맥문동 100중량부에 대해 1중량부의 비피도박테리움 브레브 종균을 접종하였다. 이를 37℃ 인큐베이터에서 24∼48시간동안 혐기적 배양한 후, 10배의 중량의 70% 에탄올에서 24시간 동안 추출하고, 동결 건조 후 실험에 사용하였다.
실시예 4. 락토바실러스 아시도필루스를 이용한 발효된 맥문동 추출물의 제조
락토바실러스 아시도필루스를 이용한 발효 맥문동 제조과정은 다음과 같다. 맥문동을 세정하여 동결 건조하고, 로스터에서 15분간 볶음처리한 후 200메쉬로 분말화하여 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 맥문동 분말 100중량부에 대해 물을 90중량부로 첨가한 후, 물과 맥문동 분말을 잘 섞어주고 맥문동 100중량부에 대해 1중량부의 락토바실러스 아시도필루스 종균을 접종하였다. 이를 30℃ 인큐베이터에서 7일간 혐기적 배양한 후, 10배의 중량의 70% 에탄올에서 24시간 동안 추출하고, 동결 건조 후 실험에 사용하였다.
실시예 5. 사카로마이세스 세레비지애를 이용한 발효된 맥문동 추출물의 제조
사카로마이세스 세레비지애를 이용한 발효 맥문동 제조과정은 다음과 같다. 맥문동을 세정하여 동결 건조하고, 로스터에서 15분간 볶음처리한 후 200메쉬로 분말화하여 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 맥문동 분말 100중량부에 대해 물을 90중량부로 첨가한 후, 물과 맥문동 분말을 잘 섞어주고 맥문동 100중량부에 대해 1중량부의 사카로마이세스 세레비지애 종균을 접종하였다. 이를 30℃에서 48시간 동안 발효시킨 후, 10배의 중량의 70% 에탄올에서 24시간 동안 추출하고, 동결 건조 후 실험에 사용하였다.
실험예 1. 발효된 맥문동 추출물의 항염증활성 검증
발효된 맥문동 추출물은 맥문동을 세정하여 동결건조 후 로스터에서 15분간 볶음처리 한 후, 분말화하여 멸균처리 후 균을 접종하여 발효시켜 70% 에탄올로 추출한 뒤 동결 건조하여 시료로 실험에 사용하였다.
세포 배양과 처리
RAW 264.7 쥐의 대식세포(murine macrophage cell)를 DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) 배지를 사용하여 티플라스크에 접종하여 CO2 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다. 각 실험에서 배양된 세포에 발효된 맥문동 추출물을 각각 0.05mg/㎖, 0.1mg/㎖, 0.25mg/㎖, 0.5mg/㎖이 되도록 첨가하고 2시간 배양한 후 스트레스를 유발하기 위해 지질다당류(Lipopolysaccharide,LPS) 1㎍/㎖을 첨가하고 20시간 배양하였다.
세포 생존율 측정
RAW 264.7 세포 생존율 측정을 위해 MTT assay를 실시하였다. 96-well plate에 well당 2x104 cells/㎖ 로 세포를 파종하여 2시간 배양하고, 시료를 농도별로 처리하여 20시간 배양 후 배지를 버리고 3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide(MTT) 용액을 각 well에 주입하여 37℃에서 4시간 재배양한다. 배지에서 MTT 용액을 제거하고 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 주입하고 30분 동안 배양 한 후 ELISA plate reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
발효된 맥문동 추출물에 의한 RAW 264.7 세포의 생존율은 세포만 배양한 경우 생존율 100%를 기준으로 0.05~0.5mg/㎖의 농도에서 각각 93.36%, 92.38%, 93.67%, 90.43%로 측정되어 0.5mg/㎖의 농도에서 독성이 없는 것으로 나타났다(도 1 참조).
NO 수준 측정
96-well plate에 well당 2x104 cells/㎖로 세포를 주입하여 2시간 동안 배양시키고, 시료를 농도별로 처리하여 2시간 배양하였다. LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 스트레스를 유발하여 20시간 배양한 후 상층액을 취해 측정하였다. 상층액의 NO 함량은 그리스 반응으로 측정하였다. 상층액에 같은 양의 그리스 시약(Griess reagent, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine, 1% 설파닐아마이드 in 5% 인산)을 넣어서 섞어주고, 실온에서 배양하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정결과를 살펴보면 LPS 자극을 통해 증가된 NO의 생성량은 발효된 맥문동 추출물 처리농도 0.05~0.5mg/㎖의 농도에서 각각 108.2%, 104.4%, 100.1%, 95.6%로 측정되어, 유의적이고 농도 의존적으로 NO생성이 감소함을 알 수 있다(도 2 참조).
세포내 ROS 수준 측정
96-well plate에 well당 2x104 cells/㎖로 세포를 주입하여 2시간 동안 배양시키고, 시료를 농도별로 처리하여 2시간 배양하였다. LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 스트레스를 유발하여 20시간 배양한 후 배양된 배지를 제거하고, 세포는 PBS로 두 번 세척한다. 세포에 100㎛의 DCF-DA를 넣어 배양하여, DCF-DA fluorescence 상승률은 유세포분석기(flow cytometer)로 측정하였다.
측정결과를 살펴보면 0.05~0.5 mg/㎖ 농도의 발효된 맥문동 추출물로 사전 처리된 RAW 264.7 세포에서 ROS 생성물은 유의적(p<0.05)이고 농도 의존적으로 감소하였다. 특히, 발효된 맥문동 추출물을 0.1mg/㎖ 처리했을 시 ROS 생성율은 129.73% 로 시료 무첨가(180.36%)에 비해 유의적(p<0.05)으로 크게 감소하는 경향을 나타내었다(도 3 참조).
지질 과산화물 측정
96-well plate에 well당 2x104 cells/㎖ 로 세포를 주입하여 2시간 동안 배양시키고, 시료를 농도별로 처리하여 2시간 배양하였다. LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 스트레스를 유발하여 20시간 배양한 후 각 well당 상층액을 코닝튜브에 담아 1시간 배양한 후 TBARS(싸이오바르비투르산염 반응성 물질, thio-barbituric acid substances) 용액을 넣어서 섞어주고, 95℃에서 20분간 끓인다. 식히면서 다시 섞어준 후 원심분리 한 상층액으로 532nm에서 흡광도를 측정했다. 지질과산화물은 말론다이알데하이드(MDA)의 양으로 환산하여 계산했다.
측정결과를 살펴보면 발효된 맥문동 추출물을 처리한 군에서 0.05, 0.01, 0.25, 0.5mg/㎖ 농도 의존적으로 TBARS 생성이 감소하였다. 특히, 발효된 맥문동 추출물을 0.25mg/㎖ 로 처리했을 경우 TBARS의 생성율은 시료 무첨가에 비해 유의적(p<0.05)으로 크게 감소하는 경향을 나타내었다(도 4 참조).
항산화효소 활성
96-well plate에 well당 2x104 cells/㎖ 로 세포를 주입하여 2시간 동안 배양시키고, 시료를 농도별로 처리하여 2시간 배양하였다. LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 스트레스를 유발하여 20시간 배양한 후 배양된 media를 제거하고, 세포는 PBS로 두 번 세척한다. 세포를 0℃에서 전기분해한 후 원심분리한 상층액을 떠서 실험에 사용했다.
단백질 정량은 소혈청알부민(bovine serum albumin)의 standard와 Bradford의 방법을 이용해 측정하고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 활성은 피로갈롤(pyrogallol)의 자동산화측정에 의해 결정되었다. GSH-퍼옥시다아제(GSH-px) 활성은 Lawrence와 Burk 등의 방법으로 측정하며, 활성 1 unit는 1분당 1mM의 NADPH가 산화되는 효소의 양으로 나타냈다. 카탈라아제 활성은 인산완충액(pH 7.0)에 조효소액을 가하여 혼합한 후 방치한 후 H2O2 용액을 가하여 혼합하고 즉시 240nm에서 15초간 변화되는 흡광도를 측정한다. 효소의 활성도는 1분 동안 1㎛의 H2O2를 분해시키는 효소의 양을 1unit로 하여 효소활성을 측정했다.
측정결과를 살펴보면 발효된 맥문동 추출물을 처리한 RAW 264.7 세포에 LPS로 산화적 스트레스를 유발했을 경우 발효된 맥문동 추출물에 의해 항산화효소에 대한 보호효과가 높게 나타났다.
Untreated FLPE ( mg / ml ) + LPS (1㎍/ ml )
0 0.05 0.1 0.25 0.5
SOD
(μM/㎎ protein / min ) 		63.07±2.1 a 38.42±2.4 54.01±1.48 54.78±3.34 58.24±2.63 60.49±1.82
Catalase
(μM/㎎ protein / min ) 		2.64±0.02 a 1.50±0.04 1.61±0.04 1.85±0.03 2.08±0.05 2.24±0.02
GSH - px
( unit /㎎ protein ) 		4.95±0.08 c 4.07±0.19 4.33±0.07 4.98±0.16 5.30±0.11 5.92±0.09
웨스턴 블롯
처리된 세포를 PBS로 씻어내고 셀 스크래퍼를 사용하여 부유시킨 다음 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 모아진 세포에 적당량의 lysis buffer를 첨가하여 0℃에 보관하면서 1시간동안 혼합한 후, 4℃에서 원심 분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약을 사용하여 정량하고 Laemmli 샘플 버퍼와 머캅토메탄올을 섞어 표본을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 소듐 도데실 설페이트 (SDS)- 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, 아크릴아마이드 겔을 니트로셀루로오스 막으로 옮긴다. 5% 탈지유를 함유한 TBS-T(1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 1시간동안 밀폐하고 TBS-T로 3번 세척하였다. 준비된 막에 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 또는 4℃에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 3번 세척하였다. 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 40분에서 1시간 정도 반응시킨 후, TBS-T로 5분마다 3번 세척하였다. ECL 용액을 적용시킨 다음 암실에서 BioMax MR film 에 감광시켜 단백질의 발현을 분석하였다.
측정결과를 살펴보면 LPS에 의해 유도되는 염증 사이토카인인 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 발현이 발효된 맥문동 추출물에 의해 저해되는지 알아보기 위해 웨스턴 블롯 분석결과, LPS만을 처리한 세포에서는 발현 정도가 뚜렷하게 증가하였으며, 발효된 맥문동 추출물을 처리한 세포에서는 농도 의존적으로 그 발현이 감소하였다. 또한 IL-1β와 IL-6의 발현에서도 LPS만 단독 처리한 세포에서는 그 발현이 증가하였으나, 발효된 맥문동 추출물을 처리한 세포에서는 발현이 억제되었다(도 5a, 5b 참조).
이와 같은 결과는 발효된 맥문동 추출물이 활성화된 대식세포에서 분비하는 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 유전자 전자 단계를 조절하여 그 생성을 억제하는 것으로 나타났다. NK-κB는 LPS를 처리했을 경우 그 발현이 증가하였으며, 발효된 맥문동 추출물을 각각의 농도로 처리했을 경우 LPS만 처리했을 경우에 비해 NK-κB의 발현이 유의적(p<0.05)으로 감소하였다. 또한 iNOS와 COX-2의 발현 수준은 세포만 배양했을 경우보다 LPS를 처리할 경우 뚜렷하게 증가하였으며, 발효된 맥문동 추출물을 처리한 세포에서는 iNOS와 COX-2의 발현이 유의적(p<0.05)으로 감소하였다(도 6a, 6b 참조).
실험예 2. 항염증 활성을 가진 발효 맥문동을 이용한 C57BL /6 마우스에서의 발모 촉진 효과 측정
실험동물 및 사육
C57BL/6 마우스는 생후부터 모든 모낭이 모발성장주기의 성장기로 들어가 털이 자라기 시작하여 생후 약 3주경 휴지기로 전이된 다음 바로 2차 성장기로 접어든다. 6~8주경이 되면 다시 모든 모낭이 휴지기로 전이되어 약 4주간 이상 지속되므로 실험물질의 효과를 평가하기 위한 시간적 여유가 있다는 장점이 있다. 실험동물은 체중 17g 내외의 5주경의 C57BL/6 마우스 20마리를 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 실험군은 대조군(50% 에탄올), 실험대조군(3% 미녹시딜), 맥문동군, 발효 맥문동군으로 모두 4군이며, 각 군당 실험동물은 각각 5마리씩 나누어 한 케이지에 2~3마리씩 사육하였다. 사육실의 온도 및 습도는 20±2℃, 50±10%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등을 하였으며, 07:00~19:00에 불을 켜두었다. 물과 식이는 제한 없이 자유 공급하였다.
도포할 시료의 조제 및 도포 방법
맥문동과 발효된 맥문동 추출물을 50% 에탄올 용액에 3%가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다. 제모하지 않은 실험군은 동물용 제모기를 이용하여 털을 깎은 후 제모제를 이용하여 각 군의 등 쪽 피부에 도포하여 털을 완전히 제거한 후 흐르는 물로 남은 제모제를 수세하였다. 피부에 도포하는 방법은 하루 1회씩, 주 6회, 매회 붓을 이용하여 4주간 도포하였다. 제모 전의 상태와 비슷하게 발모가 된 후 자발적으로 탈모가 일어나기 시작하면 위와 동일한 방법으로 4주간 도포하였다.
육안적인 관찰
실험 시작 후 털이 자란 상태를 육안으로 관찰하기 위해 실험기간 동안 주 1회 디지털 카메라로 사진 촬영을 하였다(도 7 참조). 또한 주 1회 핀셋을 이용하여 털을 뽑아 그 길이를 측정하였다.
측정결과를 살펴보면 일주일 경과 후부터 각 군마다 털 길이 성장 속도가 달라지면서 2주경과 후부터 각 군의 털 길이가 CON군에 비해 유의적(p<0.05)으로 나타났다. 4주경과 시 측정했을 때 FLPE군(0.69cm)과 MXD군(0.73cm) 사이에서 큰 차이가 나타나지 않았고, LPE군(0.61cm)에 비해 10% 이상 향상된 발모 촉진 효과를 나타냈다(도 8 참조).
도 7, 8에서 CON은 50% 에탄올그룹, MXD는 3% 미녹시딜 그룹, LPE는 3% 맥문동 추출물 그룹 (1.5mg / 50ml / 50% 에탄올) 그리고 FLPE는 3% 발효 맥문동 추출물 그룹 (1.5mg / 50ml / 50% EtoH) 을 나타낸다.
실험예 3. DPPH (1,1- diphenyl -2- picryhydrazyl ) 라디칼 소거능 측정
모든 유리기 소거능을 알아보는 DPPH 라디칼 소거능은 Nandita 등의 방법에 의해 측정하였다. 에탄올에 DPPH를 용해시켜 차광하여 여과시킨 후, 각각의 시료와 동일 양으로 첨가하였다. 30분 동안 실온에 방치한 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거능의 계산은 아래 식을 사용하였다.
저해율(%) = 1-[O.D(sample)-O.D(control) / O.D(control)] × 100
음성대조군으로 발효 과정을 거치지 않은 일반 맥문동 추출물(LP)을 이용하였으며, 양성대조군으로 기존에 알려진 항산화제인 비타민 C (vit.C, 아스코르브산)를 이용하였다. 일반 맥문동 추출물 및 발효된 맥문동 추출물은 각각 0.1, 0.25, 0.5㎎/㎖의 농도로 처리하였다.
측정 결과를 살펴보면 실시예 1 내지 5에서 수득한 발효된 맥문동 추출물 (IC50 0.49± 0.01 mg/ml)이 일반 맥문동 추출물에 비해 뛰어난 DPPH 라디칼 소거효과가 나타났으며, 그 중 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로 발효시킨 발효 맥문동이 IC50 0.18± 0.06mg/ml로 가장 DPPH 라디칼 소거효과가 좋은 것으로 나타났다(도 9 참조).
실험예 4. 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정
슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능을 측정하기 위해 NBT/XO (니트로블루 테트라졸륨/잔틴 산화효소) 테스트를 실시하였다. 모든 시약의 용매로 PBS (인산완충액; pH 7.4)를 이용하였다. EDTA (에틸렌 다이아민 테트라 아세트산 이나트륨염), NBT 및 잔틴 산화효소와 각각의 시료를 넣고, 2.5분 후 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. 소거능의 계산은 다음 식을 사용하였다.
저해율(%) = [(C-CB) - (S-SB)] / (C-CB) × 100
(C: control, CB: control blank, S: sample, SB: sample blank)
음성대조군으로 발효 과정을 거치지 않은 일반 맥문동 추출물(LP)을 이용하였으며, 양성대조군으로 기존에 알려진 항산화제인 비타민 C (vit.C, 아스코르브산)를 이용하였다. 일반 맥문동 추출물 및 발효된 맥문동 추출물은 각각 0.1, 0.25, 0.5㎎/㎖의 농도로 처리하였다.
측정결과를 살펴보면 실시예 1 내지 5에서 수득한 발효된 맥문동 추출물이 모두 일반 맥문동 추출물 (IC50 1.23± 0.03mg/ml) 에 비해 높은 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능을 나타내었다. 특히, 사카로마이세스 세레비지애로 발효시킨 발효 맥문동은 0.1, 0.25, 0.5㎎/㎖의 농도에서 44.33%, 53.84%, 66.46%의 소거능과 IC50 0.19± 0.04mg/ml을 보여, 다른 균주에 비해 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거효과가 뛰어난 것으로 확인되었다(도 10 참조).
상기 실험 결과를 통해, 맥문동이 발효과정을 거치면서 생성되는 중간대사산물에 의해 항산화 활성 물질의 생성 내지는 증가가 일어나는 것을 알 수 있으며, 특히, 사카로마이세스 세레비지애로 발효 제조된 발효된 맥문동 추출물이 가장 뛰어난 항산화 효능을 보임을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 발효된 맥문동 추출물을 포함하는 발모 촉진제.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 발효는 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 의해 이루어진 것인 발모 촉진제.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 발효는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 의해 이루어진 것인 발모 촉진제.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 균주는 상기 맥문동 100중량부에 대해 0.1 내지 5중량부로 접종되는 발모 촉진제.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 발효된 맥문동 추출물은 맥문동을 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 발효시킨 후 그 발효물을 추출하여 얻어진 것인 발모 촉진제.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출된 것인 발모 촉진제.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 50 내지 90% 에탄올 용매로 추출된 것인 발모 촉진제.
  8. 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 맥문동에 접종하여 발효시키는 단계; 및
    상기 발효물을 50 내지 90% 에탄올 용매로 추출하는 단계를 포함하는 청구항 1의 발모 촉진제의 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 발효 단계는 사카로마이세스 세레비지애에 의해 이루어지는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 발효 단계는 상기 맥문동 분말 100 중량부에 대해 물 90중량부를 넣은 후 사카로마이세스 세레비지애를 0.1 내지 5중량부 접종하여 이루어지는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 균주는 상기 맥문동 100 중량부에 대해 0.1 내지 5중량부로 접종되는 발모 촉진제의 제조 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 추출 단계는 12 내지 84시간 동안 수행되는 것인 발모 촉진제의 제조 방법.
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