KR20210037153A - 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새싹삼추출물을 유산균인 락토바실러스 람노서스균(Lactobacillus rhamnosus)으로 발효시킨 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법 및 이를 포함하는 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic composition comprising the sprout fermentation and preparation method thereof}

본 발명은 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 갖는, 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시킨 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근, 환경 및 생활 패턴의 변화에 따라 피부에 가해지는 스트레스가 가중되고 있다. 이에 따라 피부는 각질층의 수분 감소, 거칠기 증가 등 다양한 현상이 발생한다. 따라서 피부 보습제, 피부 주름 개선 및 피부 진정 등의 효능을 갖는 소재에 대한 니즈가 증가하고 있다.

종래 개발된 화학물질들은 독성, 저활성, 용도의 한계성 및 과량복용에 따른 부작용 등의 여러 가지 문제로 사용에 제한을 받고 있는 바, 부작용 가능성이 적은 소재를 개발하려는 일환으로 천연 식물에서의 유효 성분 추출하는 연구가 활발하다. 특히, 최근 웰빙(well-being) 트랜드의 확산으로 건강과 아름다움을 오랫동안 유지하려는 요구가 증가하면서 식품, 화장품, 주거 환경 등의 모든 분야에서 천연 식물성 소재와 전통적인 민간요법으로 전래 되는 생리활성이 우수한 식물소재에 대한 관심이 증가하고 있다.

천연 식물소재는 합성소재에 비해 안전하고 자연 친화적이기 때문에 화장품 산업 분야에서 오래전부터 사용하여 왔으며, 최근에는 생리활성이 높은 식물소재 및 한약재를 이용한 화장품이 주를 이룬다. 전통적으로 수 백년간 사용되어 오면서 안전성이나 효과 측면에서 입증된 소재이기 때문에 소비자들에게 쉽게 인식되어 사용될 수 있으며, 그 효과도 합성소재에 비해 뒤떨어지지 않는 장점을 가지고 있다. 더 나아가 이러한 식물소재 및 한약재에서 얻은 추출액에 자체발효 또는 유산균이나 효모 등을 접종, 발효시켜 식물체의 영양성분이 흡수되기 쉬운 형태로 변환될 수 있을 뿐만 아니라 효소작용에 의해 생성된 성분이 새로운 생리조절 기능을 발현할 수 있다.

한편, 발효(fermentation)란, 미생물이 분비하는 효소에 의해 유기물을 분해하는 과정을 말한다. 또한 미생물이 에너지를 얻는 과정에서 유용한 물질을 내는 것도 발효이다. 한국인은 이러한 발효와 친숙한데 예로부터 김치를 비롯하여 된장, 청국장 등의 전통 발효식품이 대표적이다. 이러한 발효과정은 무산소호흡을 하는 미생물들로 유기물을 완전히 분해 시키고 다른 종류의 유기물을 만들어 내기도 하여 적은 양의 에너지를 생성시킨다. 이러한 발효의 종류는 미생물에 따라 젖산발효, 알콜 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이 있다.

이러한 발효에 관계되는 미생물의 대표적인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하며 부산물로 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제와 같은 효소를 생성하여 천연물 내의 거대분자의 저분자화를 통하여 피부침투를 용이하게 해준다.

하지만, 이러한 식물소재 및 이를 통한 발효물과 같은 천연물 경우에도 안전성, 안정성 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있으며, 만족할 만한 효과를 내지 못하는 실정이다.

대한민국 공개특허공보 10-2019-0037014

이에, 본 발명자들은 기존에 알려진 물질들보다 뛰어난 주름개선, 피부보습 및 항산화 활성 향상 등의 효능을 가지는 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 새싹삼발효물을 혼합하였을 때, 항산화 효과, 콜라겐합성 촉진 효과 및 보습효과가 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 갖는, 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시킨, 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 새싹삼발효물을 유효성분으로 포함한다.

상기 새싹삼발효물은 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시킬 수 있다.

상기 유산균은 새싹삼추출물 100중량부에 대하여 0.1~1.5중량부로 투입될 수 있다.

상기 새싹삼발효물의 함량은 화장료 조성물 100중량% 중 0.001~60중량%일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 보습 및 주름 개선으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 효능을 갖을 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물의 제조방법은 새싹삼을 추출하여 새싹삼추출물을 수득하는 단계 및 상기 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시켜 새싹삼발효물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 새싹삼추출물은 열수추출물, 용매추출물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.

상기 열수추출은 상기 준비한 새싹삼 대비 8~22배의 부피의 정제수를 가하는 단계 및 상기 정제수를 가한 새싹삼을 1~3시간 동안 50~90℃에서 추출을 하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 용매는 발효주정, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 에틸아세테이트, 아이소펜틸디올, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 페트로레움에테르, 디에틸에테르로 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.

상기 새싹삼추출물은 0.20~0.50μm 여과지로 여과할 수 있다.

상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 균주 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함할 수 있다.

상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophillus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 컨푸수스(L. confusus), 락토바실러스 루테리(L. luteri), 락토바실러스 카제이(L. casei) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고, 상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 브레이브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 써모필럼(B. thermophyllum) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 페이스칼리스(Str.facecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Str. thermophillus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함할 수 있다.

상기 발효는 새싹삼추출물 100중량부에 대하여 유산균을 0.1~1.5중량부로 투입하여 35~39℃에서 3~5일 동안 발효시킬 수 있다.

본 발명에 따라 제조한 새싹삼발효물은 세포독성이 낮을 뿐만 아니라, 보습인자 생성량 증가, 콜라겐 및 콜라겐 섬유 생성량 증가, 자유라디칼 소거, 및 세포 내 활성산소종 억제 효과를 확인하였다. 이는 본 발명의 새싹삼발효물이 천연물 유래 보습, 항주름 및 항산화 기능성 소재로 이용 가능성이 있음을 의미하는바, 본 발명의 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물은 피부 상태 개선을 위한 미용 및 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법을 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 새싹삼발효물의 대조군 대비 히알루론산의 생산량(HA Production % of control)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 새싹삼발효물의 콜라겐의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4는 시험예 1-1에 따른 NHDF 섬유아세포에 본 발명에 따른 새싹삼발효물을 처리한 뒤, 면역형광염색방법에 따라 세포 내 콜라겐 섬유(collagen fiber)를 염색하고 그 형광 발현 정도를 형광현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5는 본 발명에 따른 새싹삼발효물의 라디칼소거 활성(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 시험예 1-1에 따른 HaCaT 세포에 본 발명에 따른 새싹삼발효물을 처리한 뒤, 면역형광염색방법에 따라 세포 내 활성 산소를 염색하고 그 형광 발현 정도를 형광현미경으로 관찰한 이미지이다.

이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 폴리머 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

이하, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 상세히 설명한다.

상기 일 실시예에 따라 제조된 화장료 조성물 은 새싹삼발효물을 유효성분으로 포함하며, 바람직하게는 상기 새싹삼발효물은 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시킬 수 있다. 상기 본 발명에 따른 새싹삼은 통상의 새싹삼으로서, 보통 1~2년의 기간 동안 재배된 인삼으로, 뿌리보다 잎과 줄기에 사포닌 성분이 약 7~8배 더 함유되어 있으며 수경재배, 연중생산 가능 및 재배기간의 단축으로 인해 종래에 이용되는 뿌리인삼보다 낮은 가격을 형성하고 있다는 장점이 있어, 인삼가공품의 원료로서 사용이 용이한 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 새싹삼에 포함된 사포닌이 중추신경계, 내분비계, 면역계, 대사계 등에 영향을 미쳐 신체조절 기능에 다양한 효과를 발휘하는 것 이외에도 지방분해력이 크고, 영양분흡수와 소화를 촉진시키며, 세포내의 효소활성화로 신진대사촉진, 에너지를 증가시켜 원기회복, 피로, 무력감, 식욕부진 개선, 혈청단백질 합성 촉진 등의 효과와 같은 약리작용이 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

상기 새싹삼추출물, 새싹삼발효물 및 유산균은 하기 제조방법에 설명한 내용과 동일하거나 다를 수 있다.

본 발명에 따른 상기 새싹삼발효물의 함량은 화장료 조성물 100중량% 중 0.001~60중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~10 중량%일 수 있다. 새싹삼발효물의 함량이 0.001중량% 미만이면 항산화, 피부 보습 또는 주름 개선과 같은 효능이 감소될 수 있다는 단점이 있고, 60중량%을 초과하면 독성이 생길 수 있는 단점이 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품료 조성물에 함유된 화장품료에 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 브틸렌글리콜, 헥산디올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 바람직하게, 제형이 용액, 유탁액, 현탁액 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법을 도시한 흐름도이다. 이를 참조하면, 상기 화장료 조성물의 제조방법은 새싹삼을 준비하는 단계(S10), 상기 새싹삼을 추출하여 새싹삼추출물을 수득하는 단계(S20), 상기 새싹삼추출물을 여과하는 단계(S30) 및 상기 여과한 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시켜 새싹삼발효물을 수득하는 단계(S40)를 포함한다.

상기 새싹삼을 준비하는 단계(S10)는 새싹삼을 보다 쉽게 추출하기 위하여 새싹삼을 분쇄하는 단계이다. 상기 새싹삼은 상기 화장료 조성물에서 설명한 내용과 동일하거나 다를 수 있다.

상기 준비한 새싹삼을 분쇄하는 단계는 추출물을 수득하기 위해 통상적인 분쇄방법이면 특별하게 제한되지 않는다. 다만, 효율적으로 새싹삼을 추출하기 위하여, 새싹삼을 새싹삼을 10~55℃로 건조 후 분쇄할 수 있다. 건조 온도가 10℃ 미만이면 새싹삼을 충분히 건조할 수 없고, 55℃를 초과하면 유효성분이 파괴되는 단점이 있다.

상기 새싹삼추출물을 수득하는 단계(S20)는 새싹삼을 추출하여 새싹삼추출물을 수득하고 이를 발효시키기 위해 준비하는 단계이다. 상기 새싹삼추출물은 새싹삼발효물을 얻기 위한 통상의 새싹삼추출물이면 특별히 제한되지 않으나, 열수추출물, 용매추출물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.

상기 열수추출물을 수득하기 위한 열수추출하는 방법은 상기 준비한 새싹삼 대비 8~22배의 부피 바람직하게는 18~22배의 부피의 정제수를 가하는 단계 및 상기 정제수를 가한 새싹삼을 1~3시간 동안 50~90℃에서 추출을 하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 열수추출 시간이 1시간 미만이면 유효성분이 충분히 추출되지 않아 효능을 충분히 나타내지 못하는 단점이 있고, 3시간을 초과하면 투여 시간 대비 추출 효율이 높지 않아 경제적이지 못한 단점이 있다. 또한, 열수추출 온도가 50℃ 미만이면 유효성분이 완전히 추출되지 못하는 단점이 있고, 90℃를 초과하면 유효성분이 파괴되는 단점이 있다.

상기 용매추출물을 수득하기 위한 용매추출하기 위한 방법은 용매추출물을 수득하기 위한 통상의 추출 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 용매는 발효주정, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 에틸아세테이트, 아이소펜틸디올, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 페트로레움에테르, 디에틸에테르로 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있고, 바람직하게는 물일 수 있다.

상기 새싹삼추출물을 여과하는 단계(S30)는 유산균으로 발효시키기 위한 상태로 상기 추출한 새싹삼추출물을 여과하는 단계이다. 본 발명에 따른 여과는 추출물을 여과시키기 위한 통상의 여과방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게, 유산균과 효율적으로 발효시키기 위해 여과지는 0.20~0.50μm일 수 있고 더욱 더 바람직하게는 0.45μm일 수 있다. 여과지가 0.20μm 미만이면 발효 대사산물이 없어지는 단점이 있고, 0.50μm을 초과하면 균이 남아있을 가능성이 있다.

상기 새싹삼발효물을 수득하는 단계(S40)는 상기 여과한 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시켜 새싹삼발효물을 수득하는 단계이다. 본 발명에 따른 발효방법은 통상의 추출물을 발효하는 방법이면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 향상시키기 위해, 유산균을 새싹삼추출물 100중량부에 대하여 0.1~1.5중량부로 투입하여 35~39℃에서 3~5일 동안 발효시킬 수 있고, 바람직하게는 새싹삼추출물 100중량부에 대하여, 1.0중량부를 투입하여 37℃에서 3~5일 동안 발효시켜 새싹삼발효물을 수득할 수 있다. 상기 유산균의 함량이 0.1중량% 미만이면 발효율이 감소하는 단점이 있고, 1.5중량%를 초과하면 과발효된다는 단점이 있다. 또한, 발효온도가 35

미만이거나 39

를 초과하면 유산균의 생존율 감소하는 단점이 있다. 또한, 발효기간이 3일 미만이면 발효 대사산물 함량이 적은 단점이 있고, 5일을 초과하면 과발효로 인해 발효초가 될 수 있는 단점이 있다.

상기 발효를 위해 사용되는 유산균은 새싹삼추출물을 발효시켜 우수한 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 갖는 새싹삼발효물을 수득할 수 있는 통상의 유산균, 예를 들어, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속에서 선택되는 1종 이상의 균주일 수 있다.

상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophillus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 컨푸수스(L. confusus), 락토바실러스 루테리(L. luteri), 락토바실러스 카제이(L. casei) 등이 포함되며,

상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 브레이브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 써모필럼(B. thermophyllum) 등이 포함되며,

상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 페이스칼리스(Str.facecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Str. thermophillus) 등이 포함된다.

특정 유산균으로 한정되지 않으나, 바람직하게는 가장 효율적으로 새싹삼에 우수한 항산화 활성 효과, 피부 보습 효과 또는 주름 개선 효과를 부여할 수 있는 락토바실러스 속 균주인 것이 바람직하며, 락토바실러스 람노서스 균주인 것이 더 바람직하며, 락토바실러스 람노서스 KCTC5033 균주인 것이 더욱 바람직하다.

이후, 추가적으로 발효물을 한번 더 필터하여 최종적으로 새싹삼발효물을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예

(S10) 새싹삼은 50℃로 건조 후 분쇄하였다. (S20) 정제수를 준비한 새싹삼 시료 대비 20배 부피량으로 가한 후 80℃에서 2시간 동안 열수 추출을 수행하였다. (S30) 상기 추출을 수행한 후, 0.45 ㎛ 여과지로 여과한다. (S40) 수득한 추출물에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCTC5033을 1% 용량으로 가한 후 37℃에서 3 내지 5일간 발효과정을 진행하였다. 상기 락토바실러스 람노서스 KCTC5033은 생물자원센터에서 분양받은 것이다. 이후 필터하여 새싹삼발효물을 본 발명의 시료로 사용하였다.

시험예 1 - 새싹삼발효물의 세포 독성 평가(EZ-cytox assay)

시험예 1-1 피부세포 배양

피부각질세포 배양은 피부각질형성세포인 HaCaT 세포는 Cell Line Service GmbH.(Germany)에서 분양 받아 사용하였다. penicillin-streptomycin과 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였으며, 2~3일 간격으로 계대배양을 시행하였다.

또한, 피부섬유아세포 배양은 피부섬유아세포인 Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF) 세포는 Lonza (Lonza Walkersville, Inc)로부터 분양 받아 hFGF-B, Insulin, GA-1000 과 fetal bovine serum(FBS)이 함유된 Fibroblast Basal Medium(FBM) 배지를 사용하여 37℃ 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3~5일 간격으로 계대배양을 시행하였다.

시험예 1-2 세포 독성 평가(EZ-cytox assay)

EZ-cytox assay는 water solution tetrazolium salt (WST)가 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 주황색의 수용성 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

세포에서의 독성을 확인하기 위하여 HaCaT 세포 및 NHDF 세포를 배양 DMEM 배지를 이용하여 5 Х 10⁴ 과 1 Х 10⁴ cells/mL로 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 serum-free 배지로 교환하여 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물을 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 2.0%)로 처리하였다. 이후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 평가의 대조군은 어떠한 추출물도 처리하지 않은 세포를 이용하였다. 각 실험군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.

구분	처리농도(%)	세포독성
		HaCaT세포생장률(%)	NHDF세포생장률(%)
무처리군 (대조군)	-	100	100
실시예	0.5	105.6 ± 2.1	127.4 ± 1.4
실시예	1.0	99.05 ± 5.1	135.8 ± 2.8
실시예	2.0	107 ± 2.8	135.1 ± 2.4

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물은 다양한 농도에서 피부각질형성세포 및 피부섬유아세포에서 세포독성이 관찰되지 않았다.

시험예 2 - 새싹삼발효물의 보습 효과 확인

HaCaT 세포를 24 well plate에 1.0 Х 10⁵ cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양하였다. Serum-free DMEM으로 교환하고 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물을 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 2.0%)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 본 실험의 음성대조군은 어떠한 추출물도 처리하지 않았으며, 양성대조군은 레티노산(retinoic acid, RA)을 10nM의 농도로 처리하였다. 이후 각 군마다 배양액을 취하여 HA-ELISA kit (Cusabio Biotechnology Co.,Ltd )를 이용하여 HA 생성량을 측정하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였으며, 그 결과를 도 2 및 표 2에 나타내었다.

구분	처리농도(%)	HA 생성량 (%)
무처리군	-	100 ± 7.36
실시예	0.5	122 ± 0.6
실시예	1.0	173 ± 2.6
실시예	2.0	149 ± 12.8
Retinoic acid	0.001	113 ± 4.4

도 2 및 표 2를 참조하면, 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 HA 생성을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 새싹삼발효물은 대조군인 레티노산보다 히알루론산 생성을 증가시키는 것을 알 수 있다.

시험예 3 - 새싹삼발효물의 주름 개선 효과 확인

시험예 3-1 PIP 생성 효과 확인

NHDF 섬유아세포를 24-well plate에 2×10⁴ cells/ml로 분주한 다음 세포배양조건에서 24시간 배양한다. 배양 후 serum-free FBM 으로 교체하여 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물을 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 2.0%)로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 본 실험의 음성대조군은 어떠한 추출물도 처리하지 않았으며, 양성대조군은 아스코브산(ascorbic acid)을 10ppm의 농도로 처리하였다. 배양 후 각 군마다 상층액을 취하여 배지 중 유리된 procollagen의 양을 procollagen type I peptide(PIP) EIA kit(Takara Biomedical Co.)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 콜라겐 양을 정량한다. 측정방법은 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. 그 결과를 도 3 및 표 3에 나타내었다.

구분	처리농도(%)	콜라겐 생성량 (%)
무처리군	-	100 ± 1.0
실시예	0.5	139 ± 0.2
실시예	1.0	168 ± 0.3
실시예	2.0	198 ± 0.3
Ascorbic acid	0.001	156 ± 1.0

도 3 및 표 3을 참조하면, 새싹삼발효물이 농도 의존적으로 콜라겐 합성을 증가시키는 것을 확인하였다.

시험예 3-2 콜라겐 섬유(collagen fiber) 생성 효과 확인

NHDF 섬유아세포를 24-well plate에 2×10⁴ cells/ml로 분주한 다음 세포배양조건에서 24시간 배양한다. 배양 후 serum-free FBM 으로 교체하여 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물을 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 2.0%)로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 본 실험의 음성대조군은 어떠한 추출물도 처리하지 않았으며, 양성대조군은 아스코브산(ascorbic acid)을 10 ppm의 농도로 처리하였다. 배양 후 HEPES-BSS로 세척 후 면역형광염색방법에 따라 세포 내 콜라겐 섬유(collagen fiber)를 염색하였다. 그 후 형광현미경으로 형광 발현정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다

도 4를 참조하면 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 collagen fiber 생성을 증가시키는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 콜라겐 합성 및 콜라겐 섬유 생성을 증가시키는바, 이는 주름 개선 효과가 우수하다는 것을 의미한다.

시험예 4 - 새싹삼발효물의 항산화 활성 효과 확인

시험예 4-1 항산화 효과 측정

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical)의 흡광도가 517nm에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 옅은 노란색이 될수록, 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 517 nm 파장에서 흡광도가 줄어듦을 응용한 시험법이다.

먼저, 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물의 농도가 3.125%, 6.25%, 12.5%, 25%, 50%가 되도록 메탄올로 희석하여 새싹삼발효물 희석액을 제조하였다. 상기 새싹삼발효물 희석액 1ml 및 0.1mM DPPH(Sigma) 용액 1mL을 혼합하여 시료를 준비하였다. 제조된 시료를 실온에서 15분간 방치한 후 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 517 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 본 시험예에서 제1 대조군(DPPH 1 ml 및 아스코브산 10ppm) 시료를 위와 같은 방법으로 측정하였으며, 제2 대조군(DPPH 1 ml 및 메탄올 1 ml)은 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정 값을 얻기 위해 사용하였다. 새싹삼발효물의 자유라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 도 5 및 표 4에 나타내었다.

구분	처리농도(%)	DPPH 라디칼소거활성 (%)
무처리군	-	0 ± 2.0
실시예	3.13	10.3 ± 1.6
실시예	6.25	17.6 ± 1.8
실시예	12.50	32.4 ± 1.5
실시예	25.00	52.7 ± 1.4
실시예	50.00	73.3 ± 2.6
Ascorbic acid	0.001	46.6 ± 7.4

도 5를 참조하면 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 라디칼 소거활성이 증가하는 것을 확인하였다.

시험예 4-2 세포 내 활성산소(ROS) 억제 효과 측정

세포 내 활성산소(ROS) 변화를 측정하기 위하여 HaCaT 세포를 24 well plate에 1.0× 10⁵ cells/well 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예에서 제조된 새싹삼발효물을 다양한 농도(0.5%, 1.0%, 2.0%)로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 300uM H₂O₂를 3시간 동안 처리하여 추가 배양하였다. 세포 내 활성산소(ROS)를 측정하기 위한 dye인 DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate)를 50uM 첨가하여 1시간 동안 배양 후 PBS 세척 후 형광현미경으로 형광 발현정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6를 참조하면 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 새싹삼발효물은 농도 의존적으로 라디칼 소거활성이 증가될 뿐만 아니라 ROS 생성을 억제하는바, 이는 항산화 효과 가 우수하다는 것을 의미한다.

종합적으로 본 발명자들은 새싹삼발효물을 제조하고, 상기 발효물이 세포독성이 낮을 뿐만 아니라 보습인자 생성량 증가, 콜라겐 및 콜라겐 섬유 생성량 증가, 자유라디칼 소거 및 세포 내 활성산소종 억제 효과가 우수하다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 새싹삼발효물이 천연물 유래 보습, 항주름 및 항산화 기능성 소재로 이용 가능성이 있음을 의미하는 바, 본 발명의 새싹삼발효물을 포함하는 화장용 조성물은 피부 상태 개선을 위한 미용 및 식품 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Claims (12)

1. 새싹삼발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 새싹삼발효물은 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시킨 것인 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 유산균은 새싹삼추출물 100중량부에 대하여 0.1~1.5중량부로 투입되는 것인 화장료 조성물.
4. 제2항에 있어서,
   상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 균주 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하는 것인 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophillus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 컨푸수스(L. confusus), 락토바실러스 루테리(L. luteri), 락토바실러스 카제이(L. casei) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고,
   상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 브레이브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 써모필럼(B. thermophyllum) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고,
   상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 페이스칼리스(Str.facecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Str. thermophillus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하는 것인 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 새싹삼발효물의 함량은 화장료 조성물 100중량% 중 0.001~60중량%인 것인 화장료 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 항산화, 피부 보습 및 주름 개선으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 효능을 갖는 것인 화장료 조성물.
8. 새싹삼을 추출하여 새싹삼추출물을 수득하는 단계;
   상기 새싹삼추출물을 유산균으로 발효시켜 새싹삼발효물을 수득하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 새싹삼 추출은
   상기 준비한 새싹삼 대비 8~22배의 부피의 정제수를 가하는 단계; 및
   상기 정제수를 가한 새싹삼을 1~3시간 동안 50~90℃에서 추출을 하는 단계를 포함하는 것인 화장료 조성물의 제조방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 균주 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하는 것인 화장료 조성물의 제조방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophillus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 컨푸수스(L. confusus), 락토바실러스 루테리(L. luteri), 락토바실러스 카제이(L. casei) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고,
    상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 브레이브(B. breve), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 써모필럼(B. thermophyllum) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하고,
    상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 페이스칼리스(Str.facecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Str. thermophillus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 균주를 포함하는 것인 화장료 조성물의 제조방법.
12. 제8항에 있어서,
    상기 발효는 새싹삼추출물 100중량부에 대하여 유산균을 0.1~1.5중량부로 투입하여 35~39℃에서 3~5일 동안 발효시키는 것인 화장료 조성물의 제조방법.

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