TWI516479B - 組織蛋白酶ｓ抑制劑 - Google Patents

Description

組織蛋白酶S抑制劑

本發明是關於組織蛋白酶S抑制劑，特別是作用為抗癌及/或治療血管新生相關疾病醫藥組成物的組織蛋白酶S抑制劑。

半胱胺酸組織蛋白酶(Cathepsin cysteine protease)指的是一類特徵為在其酵素催化位置具有半胱胺酸殘基的胜肽酶。組織蛋白酶與蛋白質的正常分解及處理有關。然而，當組織蛋白酶的活性不正常時，例如因為加強表現或是增強活化的緣故，可能會造成病理結果。因此，部分的組織蛋白酶與許多疾病狀態有關，例如關節炎、肌肉萎縮症、發炎、腫瘤浸潤、腎小球腎炎(glomerulonephritis)、瘧疾、牙周疾病、異染性腦白質營養不良(metachromatic leukodystrophy)等。

組織蛋白酶(Cathepsin S,CTSS)是一種蛋白分解酵素，並在第二類主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex class II,MHC class II)抗原展示路徑之中具有重要角色。具體而言，此酵素在恆定鏈(invariant chain，一種第二類MHC帶位子(chaperone))從第二類MHC胜肽結合裂縫移除之前，將恆定鏈分解。由此促成抗原醯胺化合物載入到第二類MHC之α β-二聚體，以及後續將此複合體運送到細胞表面，以啟動第二類MHC專屬的CD4+ T細胞識別。關於此部分敘述，請參照Pierre and Mellman,Cell 1998,93,1135-1145.目前已知CTSS與自體免疫及發炎疾病相關，例如氣喘、過敏、動脈硬化、肺氣腫及類風濕關節炎。

CTSS也在腫瘤生長、浸潤及轉移的過程中參與結蹄組織與基膜(basement membrane)之溶解與重組。關於此部分敘述，請參照Sloane et al.,Biochemical and Molecular Aspects of selected Cancers,1994,411-466,Academic Press,New York.目前已有報導抑制上述酵素可有效治療癌症。關於此部分敘述，請參照Reise et al.,Immunity 1996,4,357-366 and Liu et al.,Drug News Prespect 2004,17,357-363.

此外，CTSS在癌症浸潤及血管新生過程中是一個扮演重要角色的蛋白酶。最近，已生產一種抗CTSS的擷抗性抗體，其不僅展現抑制腫瘤浸潤的效果並且可以抑制內皮細胞形成微血管。這些研究顯示，CTSS不僅可以做為預後指標，還可做為發展抗癌藥物的分子標的。

目前已發現一些醯胺化合物可作為半胱胺酸組織蛋白酶的抑制物。其中Ward等人揭示具有氰基之醯胺化合物1可有效抑制CTSS(IC=6nM)(J.Med.Chem.2002,45,5471-5482.)，但是目前並不知道具有氰基之醯胺化合物1是否可抑制其他的半胱胺酸組織蛋白酶。

有鑑於在許多的疾病之中，已經發現半胱胺酸組織蛋白酶的活性增加造成疾病的病理及/或徵候，因此可抑制這類酵素(特別是抑制組織蛋白酶B、K、L及/或S)的分子應可做為治療的藥物。

本發明係基於發現部分醯胺化合物具有抑制CTSS之功效。

在一實施例之中，本發明提出如化學式(I)之化合物：

其中R₁為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基、OR_a、SR_a、NR_aR_b、N(R_a)C(O)R_b、N(R_a)C(O)OR_b、C(O)R_a、COOR_a、OC(O)R_a、C(S)R_a、C(O)NR_aR_b、C(S)NR_aR_b、N(R_a)C(S)R_b、或N(R_a)N(R_b)C(O)R_c，其中R_a、R_b及R_c係獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基；或者R_a、R_b以及與其連結的一或多個氮原子共同形成雜環烷基、雜環烯基或雜芳基；X為CH2、O或S；R₂及R₃係獨立為為氫、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基或選擇性具有環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基取代基之烷基；R₄及R₅係獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基。

請參照化學式(I)，本發明之化合物可具有下列之一或多種特徵(i)R₂為環烷基(例如環己烷)或是芳基(例如苯基)，(ii)R₃為選擇性具有環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基(例如芐(benzyl))取代基之烷基，以及(iii)R₄及R₅之其一為氫，而另一為環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基，或是選擇性具有環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、OR_d、C(O)R_d、COOR_d或OC(O)R_d取代基之烷基，其中R_d為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基(例如選擇性具有芳基或COOR_d取代基之烷基，或是選擇性具有鹵素取代基或與雜環烷基融合之苯基)。

部分之化學式(I)之化合物具有下列立體化學式：

在另一實施例之中，本發明提供如化學式(II)之醯胺化合物：

，其中m為0,1,2或3；X為0或S；R₆為環烷基、環烯基、雜環基或NR_aR_b，R_a及R_b係獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基；R₇為環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基或是選擇性具有環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基取代基之烷基；R₈為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基；R₉為環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基、OR_c、CN、CONR_cR_d、CON(R_c)NR_dR_e、C=NNR_dR_e、N(R_c)NR_dR_e或是具有COOR_c取代基之烯基，其中R_c及R_d獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基，或是R_c及R_d以及與其連結的一或多個氮原子共同形成雜環烷基、雜環烯基或雜芳基；R_e為CN、C(O)R_f、C(S)R_f、C(O)NR_fR_g、C(S)NR_fR_g；R_f及R_g獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基，或是R_f及R_g以及與其連結的一個氮原子共同形成雜環烷基、雜環烯基或雜芳基。

請參照化學式(II)，本發明之化合物可具有下列之一或兩種特徵：(i)R₆為雜芳基(例如吡嗪基(pyrazinyl))，以及(i)R₉為CON(R_c)NR_dR_e或CONR_cR_d。

部分之化學式(II)之化合物具有下列立體化學式：

在再一實施例之中，本發明提供如化學式(III)之醯胺化合物：

其中n為1,2或3；R₁₀為芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基或雜芳氧基；R₁₁為環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基，或是選擇性具有環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基取代基之烷基；以及當R₁₀為烷氧基時，R₁₂及R₁₃獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基；或者當R₁₀為芳基、雜芳基、芳氧基或雜芳氧基時，R₁₂及R₁₃獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基，或是R₁₂及R₁₃以及與其連結的多個氮原子共同形成雜環烷基、雜環烯基或雜芳基。

化學式(III)之部分化合物具有下列立體化學式：

「烷基」一詞係指一飽和直鏈或支鏈之碳氫基團，例如-CH₃或-CH(CH₃)₂。「烯基」一詞係指包含至少一雙鍵之一直鏈或支鏈之碳氫基團，例如-CH=CH-CH₃。「烴基」一詞係指包含至少一三鍵之一直鏈或支鏈之碳氫基團，例如-C≡C-CH₃。「環烷基」一詞指的是一飽和、環狀之 碳氫基團，例如環己烷。「環烯基」一詞指的是一包含至少一雙鍵之非芳香族、環狀之碳氫基團，例如環己烯。「雜環烷基」一詞指的是至少包含一雜原子(例如N,O或S)之飽和環狀基團，例如4-四氫吡喃基。「雜環烯基」一詞指的是至少包含一雜原子環(例如N,O或S)之非芳香族環狀基團，例如吡喃基。「芳基」一詞係指包含一個或多個芳香環之一碳氫基團。芳基基團範例包括苯基(Ph)、伸苯基(phenylene)、萘基、伸萘基(naphthylene)、芘基、蒽基以及菲基。「雜芳基」一詞係指包含一種或多種含有至少一雜原子(例如N,O或S)之芳香環。雜芳基基團範例包括呋喃基、伸呋喃基、茀基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、奎林基、雜奎林基與吲哚基。

假使無特別指出，此處所指之烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基及雜芳基均包括取代與非取代基團兩者。環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基及雜芳基之可能取代基包括但不限於：C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、C₁-C₂₀雜環烷基、C₁-C₂₀雜環烯基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、胺基、C₁-C₁₀烷胺基、C₁-C₂₀雙烷胺基、芳胺基、雙芳胺基、C₁-C₁₀烷磺胺基、芳磺胺基、C₁-C₁₀烷亞胺基、芳烷亞胺基、C₁-C₁₀烷磺亞胺基、芳烷磺亞胺基、氫氧基、鹵素、硫基、C₁-C₁₀烷硫基、芳烷硫基、C₁-C₁₀烷磺基、芳烷磺基、酰胺、胺酰、胺硫酰、醯胺基，亞醯胺基、胍、脲、硫脲、氰基、硝基、亞硝基、疊氮、酰基、硫酰基、酰氧基、羧基及羧酸酯。另一方面，亦可能取代於烷基、烯基或炔基，包括上述除了C₁-C₁₀烷基之外的取代基。環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基及雜芳基亦可彼此融合。

在另一個實施例之中，本發明是關於一種治療癌症、自體免疫/發炎或是血管新生相關疾病。包括將有效劑量的一或多種化學式(I)、(II)或(III)之醯胺化合物施加到有需要的主體。「癌症」一詞指的是細胞細腫瘤。癌細胞具有自發性生長之細胞，亦即，一種快速增殖之細胞生長的不正常狀態或狀況。「癌症」一詞於本文中係指任何形式之類似 癌化細胞之生長或是傾向於癌化之過程，轉移性的組織或是轉變為惡性之細胞、組織或器官，而無論其組織病理學態樣或侵入之程度。癌症之範例包括但不限於：癌症(carcinoma)或腫瘤(sarcoma)如：白血病、肉瘤、骨瘤、淋巴腫瘤、黑色素瘤、神經膠瘤、嗜鉻性細胞瘤、肝癌、卵巢癌、皮膚癌、睪丸癌、胃癌、腎臟癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、直腸癌、頭頸部之癌症、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎上腺皮質癌、肺癌、支氣管癌、子宮內膜癌、鼻咽癌、子宮頸癌或肝癌以及未知的原位癌等。「血管新生相關疾病」一詞包括：因血管增生所致之疾病包含脈絡膜新生血管疾病(choroidal neovascular diseases)、視網膜新生血管疾病(retina neovascular diseases)、房角新生血管(neovascularization of the angle,NVA)、巴爾通氏體病(Bartonellosis)、慢性發炎(chronic inflammation)、骨關節炎(osteoarthritis)、動脈硬化(atherosclerosis phemphigoid)、沙眼(trachoma)或奧韋任疾病(Osler-Weber-Rendu disease)。

此外，本發明包含一種醫藥組成物，其包含有效劑量的一或多種上述醯胺化合物及一醫藥可接受載體。

此外本發明亦包括包含一或多種上述醯胺化合物的組成物用以治療上述疾病之用途以及用以達成上述治療方式生產所需之藥劑所需的組成物。

以下詳細說明本發明之一或多個實施例。本發明之其他特徵、目的及優勢可由下列敘述及申請專利範圍而更加清楚。

以下所顯示的是本發明的例示化合物：

表4：

本發明之醯胺化合物可由本項技術領域中所熟知之方法製備。下列的簡圖I說明合成具有部分化學式(I)之化合物的合成路徑。

簡圖I

可由市售的N-叔丁氧基羰基-L-絲氨酸(Boc-Ser-OH)製備羧基保護的N-叔丁氧基羰基-L-絲氨酸(Boc-Ser-OH)A，首先將其進行還原接著進行部分氧化以得到醛類化合物B。將得到的醛類化合物與具有N-Boc-保護的環己基丙氨酸及異氰基乙酸(isocyanoacetate)反應進行Passerini反應以得到化合物C，接著將化合物C去保護接著進行氧到氮酰基移轉反應(O-to N-acyl group migration)以得到α-羥基醯胺化合物D。接著此醯類化合物與酸結合以形成化合物E，接著進行Dess-Martin氧化反應為α-酮醯胺化合物化合物F，即為化學式(I)之化合物。

化學式(II)及(III)之化合物可由下列簡圖所示的合成途徑合成得到：

(a)HBTU,HOBt,DIPEA,DMF,83%；(b)TFA,CH₂Cl₂；接著RCOOH,IBCF,NMM,THF,90%，2步驟；(c)NaBH₄,H₂O,0ºC；接著Dess-Martin,CH₂Cl₂，室溫反應；(d)Wittig反應，接著氫化反應(e)1M LiOH,THF,H₂O,97%；(f)IBCF,NMM,THF；接著N,N’-二甲基聯氨(N,N’-dimethylhydrazine)氫氯酸鹽，3N NaOH,89%2步驟；(g)BrCN,NaOAc,MeOH，室溫反應，65%。

如同以上所示，將兩個胺基酸化合物結合可得到雙胜肽化合物G，其可繼續與酸反應而得到N-醯雙胜肽化合物H。雙胜肽化合物H進行 還原而成為醛類化合物I，醛類化合物I接著進行Wittig反應及氫化反應以得到化合物J，即為化學式(II)所示之化合物。合成化學式(III)化合物的方法為將雙胜肽化合物H進行水解以得到酸類化合物J，接著酸類化合物J與聯氨(hydrazine)化合物進行反應以得到酰肼(hydrozide)化合物L。化合物L與BrCN反應以得到標的醯類化合物M。

上述方法所合成的醯胺化合物可由適當方法進行純化，例如管柱層析、高壓液相色譜儀或再結晶。

熟知本項技藝之人士可藉由調整上述的合成轉換方式以合成其他醯胺化合物。這些轉換方法也可額外地增加步驟，不論是在此特定描述步驟之前後，以增加或是移除合適地保護官能團，以最終達成醯胺化合物之合成。此外，可以交換順序(alternate sequence)之方式進行各種合成步驟以得到標的化合物。

在此所述的醯胺化合物可具有非芳香族雙鍵或是一或多個非對稱中心。因此，上述化合物可以消旋體(racemates)、外消旋混合物(racemic mixtures)、單一對映體(single enantiomers)、個別非對映體(individual diastereomers)、非對映混合物(diastereomeric mixtures)、順式或反式異構體(cis-or trans-isomeric)等形式存在，上述的所有異構物形式皆應列入考慮。

在此所述的醯胺化合物包括化合物本身、以及其鹽類、前藥(prodrug)及溶合物(solvates)，假若可行的話。舉例而言，鹽類可由負離子與醯胺化合物的正價官能團(例如胺基)所形成。合適的陰離子包括氯、溴、碘、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、磺酸、三氟、醋酸、蘋果酸、苯磺酸、酒石酸、富馬酸、谷氨酸、葡萄糖醛酸、乳酸、戊二酸和馬來酸。同理，鹽類也可由正離子與醯胺化合物上的負價官能團(例如羧酸基)所形成。合適的正離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、銨離子(例如四甲基銨離子)。醯胺化合物也可包含具有四級氮原子的鹽類。前藥之例子包括酯類及其他醫藥可接受之衍生物，其可在施加到主體之後提供活性醯胺化合物。溶合物指的是由 活性醯胺化合物與醫藥可接受溶劑所形成的複合物。醫藥可接受溶劑包括水、酒精、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。

此外本發明範圍包括將有效劑量的一或多種醯胺化合物施加到具有於發明內容中所述疾病之病患。「治療」一詞係指將上述之一或多種醯胺化合物給予一具有疾病或具有疾病症狀或傾向的患者，以達成治癒、痊癒、減輕、緩和、改變、醫治、改善、改進或是影響此類疾病，其感染症狀，以及具有罹患此類疾病傾向之效果。「有效劑量」指活性醯胺化合物劑量可以對投藥個體有治療的效果；如熟習此項技藝者之所知，有效劑量亦可能依治療之疾病種類，投藥的路徑，受試者的利用率與其他治療合併使用之活性物質而改變。為實行本發明所述之方法，可將包含一種或數種上述醯胺化合物之組成物，經由靜脈、口服、經鼻、經直腸、局部或是舌下等方式投藥。「靜脈投藥」在此指的是皮下、腹腔、靜脈注射、肌肉注射、關節腔內注射、主動脈注射、關節液內注射、胸腔注射、脊髓內注射、疾病部位內注射、顱內注射或其他適合的投藥技術。

無菌注射組成物的製備可以是一無菌注射液或懸浮液，含無毒性、經由非腸道途徑可接受的稀釋液或溶劑，例如1,3-丁二醇溶液。在這些可接受的載體與溶劑中，可利用的為甘露糖醇、水、Ringer’s溶液，以及等張氯化鈉溶液。此外，不易揮發的油在習知技術之中係作為溶劑或懸浮介質(如合成之單甘油酯或雙甘油酯)。脂肪酸(例如油酸及其甘油衍生物)可助於注射劑的製備，而天然的醫藥上可接受油脂亦同，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是在其為聚氧化乙烯的形式下。這些油脂液體或懸浮液也可包含一長鏈的醇類稀釋劑、分散劑、羧甲基纖維素或是其他相似的分散劑。其他一般使用的介面活性劑如Tweens或是Spans或其他相似的乳化劑或是一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發目的之劑量型式的生物可利用增強劑。

以口服方式投予的組成物可以是任何一種可接受的口服方式，包含膠囊、錠劑、乳狀液以及水樣懸浮液，分散液及液體等。常用的錠劑 載體包含乳糖與玉米澱粉。潤滑劑如硬脂酸鎂，也常被應用於錠劑中。以膠囊型式口服時，有效稀釋劑為乳糖與乾玉米澱粉。在以水樣懸浮液或乳狀液型式提供口服時，可利用乳化法或懸浮劑將活性物質懸浮或稀釋於油相中。如有需要，可添加入特定的甜味劑，風味劑或著色劑。

一鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物可依醫藥配方之技藝中習知之技術製備，如製成食鹽水溶液之組成物，使用苯甲醇或其他適合之防腐劑，增加生體可用率之吸收促進劑，氟碳化合物，及/或其他技藝中已知之溶解劑或分散劑。

一含一種或多種活性醯胺化合物之組成物亦可以栓劑形式經由直腸給藥。

醫藥組成物之載體必須為「可接受」，意思為與配方中之活性成分相容(且較佳是使活性成分安定)及對接受治療之病患無害。一或多種安定劑可用以作為醫藥賦形劑，以遞送一具活性之醯胺化合物。其他載體之實例包括膠狀二氧化矽、硬酯酸鎂，纖維素，十二烷基硫酸鈉，及D&C黃色10號。

本發明之醯胺化合物可經由初步體外分析方式篩選其對於抑制癌症的效果，並佐以動物試驗與臨床試驗證明。其他方法亦可使熟習該項技藝者明顯的理解。

下列特定具體實施例僅解釋為說明性，無論以任何方式皆不限制本揭示之其餘者。不須再進一步詳述，相信上述已能充分表達本發明，且可由熟習本項技藝者據以實施。本文所引述之所有公開文件將全部併入本文以供參考。

化學合成

以下顯示化合物1之合成方式：

(S)-叔丁基1-(芐氧基)-3-甲氧基-丙苄酰胺((S)-tert-butyl 1-(benzyloxy)-3-oxopropan-2-yl carbamate)(i)

Boc-Ser-OH(5g,24.4mmole)溶於無水DMF(150mL)，於0℃充滿氮氣環境中緩慢加入60%NaH(2.1g,53.7mmole)。逐滴加入溴苄(Benzyl Bromide)(3.2mL,26.8mmole)直到沒有氫氣產生。將得到的溶液於25℃攪拌過夜，接著於減壓條件之下移除DMF。將殘餘物溶於EtOAc，以1N HCl、H₂O及滷水清洗，以Na₂SO₄乾燥，並於真空中濃縮。將粗產物於真空中乾燥。接著便可使用而無需進一步純化。

將(2S)-3-(芐氧基)-2-[4-叔丁氧羰基氨基]丙酸((2S)-3-(benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]propanoic acid)(7.2g,24.4mmole)溶於乙二醇二甲醚(ethylene glycol dimethyl ether)(50mL)之中。加入N-甲基嗎啉(N-Methylmorpholine)(2.7ml,24.4mmole)，並將所得到的清澈溶液冷卻到-20℃。

逐滴加入氯甲酸異丁酯(Isobutyl chloroformate)(3.19ml,24.4mmole)以沈澱氫氯酸鹽之N-甲基嗎啉(N-methylmorpholine)。持續攪拌15分鐘，接著將上清液經由一過濾嘴漏斗移到冰浴中快速攪拌的NaBH₄(2.93g,73.2mmole)溶液並以無水DME清洗。將混合物攪拌30分鐘之後，利用EtOAc對混合進行萃取，並以H₂O沖洗。收集有機層，並以Na₂SO₄乾燥並於真空中濃縮。接著進行層析純化(二氧化矽，4/1：己烷/EtOAc，R_f=0.2)以得到白色固體叔丁基N-[(1R)-2-(芐氧基)-1-(羥基甲基)乙基]氨基甲酸酯(tert-butyl N-[(1R)-2-(benzyloxy)-1-(hydroxymethyl)ethyl]carbamate)(6.3g,92%)。將叔丁基N-[(1R)-2-(芐氧基)-1-(羥基甲基)乙基]氨基甲酸酯(tert-Butyl N-[(1R)-2-(benzyloxy)-1-(hydroxymethyl)ethyl]carbamate)(1.2g,4.3mmole)溶於CH₂Cl₂(40mL)，加入Dess-Martin過碘烷(periodinane)(2.4g,5.5mmole)。室溫攪拌此溶液2小時，接著以Na₂S₂O₃及飽和重碳酸根溶液淬熄(quench)溶液。在由CH₂Cl₂進行萃取之後，有機層接著以MgSO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發(rotary evaporation)濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，4/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.4)以得到白色固體(S)-叔丁基1-(芐氧基)-3-甲氧基丙苄酰胺((S)-tert-butyl 1-(benzyloxy)-3-oxopropan-2-ylcarbamate)(1.1g,96%)。

3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-1-[(2-乙氧基-2-二氧乙基)氨基]羰基丙基(2R)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-戊酸甲酯 (3-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]carbonylpropyl (2R)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-methylpentanoate)(ii)及乙基2-[(3S)-3-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊酸]氨基4-(芐氧基)-2-羥基丁酰]乙酸乙酯(ethyl 2-[(3S)-3-[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino-4-(benzyloxy)-2-hydroxybutanoyl]aminoacetate)(iii)

將(S)-叔丁基1-(芐氧基)-3-甲氧基丙苄酰胺((S)-tert-Butyl 1-(benzyloxy)-3-oxopropan-2-ylcarbamate)(630mg,2.3mmole)、Boc-Leu-OH(622mg,2.5mmole)及異氰基乙酸乙酯(ethyl isocyanoacetate)(274ul,2.5mmole)溶於無水CH₂Cl₂(20mL)。於室溫將此溶液攪拌48小時，濃縮並進行層析純化(二氧化矽，2/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.5)，以得到白色固體3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-1-[(2-乙氧基-2-二氧乙基)氨基]羰基丙基(2R)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-戊酸甲酯(3-(benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]carbonylpropyl(2R)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-methylpentanoate)(1.1g,75%)。

將3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-1-[(2-乙氧基-2-二氧乙基)氨基]羰基丙基(2R)-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-戊酸甲酯(3-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]carbonylpropyl(2R)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-methylpentanoate)溶於含有50%TFA的CH₂Cl₂溶液。將此溶液攪拌30分鐘接著進行濃縮。將此殘留物重新溶於CH₂Cl₂，並以三乙胺中和。接著繼續攪拌10分鐘然後進行濃縮。進行層析純化(二氧化矽，1/1：己烷/乙酸乙酯具有10%MeOH，R_f=0.2)以得到白色固體乙基2-[(3S)-3-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊酸]氨基4-(芐氧基)-2-羥基丁酰]乙酸乙酯(ethyl 2-[(3S)-3-[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino-4-(benzyloxy)-2-hydroxy butanoyl]aminoacetate)。

乙基2-(4-(芐氧基-2-羥基-3-[((2R)-4-甲基-2-[(9-羰基-9H-1-芴)羰基]氨基戊酸)氨基]丁酰氨基)乙酸(Ethyl 2-(4-(benzyloxy)-2-hydroxy-3-[((2R)-4-methyl-2-[(9-oxo-9H-1-fluorenyl)carbonyl]aminopentanoyl)amino]butanoylamino)acetate)(iv)

將乙基2-[(3S)-3-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊酰]氨基-4-(芐氧基)-2-羧基丁酰]乙酸乙酯(Ethyl 2-[(3S)-3-[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino-4-(benzyloxy)-2-hydroxyl butanoyl]aminoacetate)(500mg,1.2mmole)、9-芴-1-羧酸(9-Fluorenone-1-Carboxylic acid)(266mg,1.2mmole)及HBTU(587mg,1.6mmole)溶於DMF(10mL)。加入Et₃N(330uL,2.4mmole)並持續攪拌過夜。於減壓環境中移除DMF。以乙酸乙酯稀釋殘留物，並以水沖洗。有機層接著以MgSO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，乙酸乙酯，R_f=0.3)以得到白色固體乙基2-(4-(芐氧基-2-羥基-3-[((2R)-4-甲基-2-[(9-羰基-9H-1-芴)羰基]氨基戊酸)氨基]丁酰氨基)乙酸(ethyl 2-(4-(benzyloxy)-2-hydroxy-3-[((2R)-4-methyl-2-[(9-oxo-9H-1-fluorenyl)carbonyl]aminopentanoyl)amino]butanoylamino)acetate)(641mg,85%)。

乙基2-(4-(芐氧基-2-羥基-3-[((2R)-4-甲基-2-[(9-羰基-9H-1-芴)羰基]氨基戊酸)氨基]丁酰氨基)乙酸(Ethyl 2-(4-(benzyloxy)-3-[((2R)-4-methyl-2-[(9-oxo-9H-1-fluoreny1)carbonyl]aminopropanoyl)amino]-2-oxobutanoylamino)acetate)(1)

將α-Hydroxy(50mg,0.08mmole)溶於CH₃Cl₂(1mL)。加入Dess-Martin periodinane(100mg,0.24mmole)，並將溶液於室溫攪拌2小時。接著以Na₂S₂O₃及飽和重碳酸根溶液淬熄溶液。在由CH₂Cl₂進行萃取之後，有機層接著以MgSO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。以層析純化(二氧化矽，乙酸乙酯，R_f=0.5)以得到白色固體乙基2-[(3S)-3-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊酰]氨基-4-(芐氧基)-2-羧基丁酰]乙酸乙酯(ethyl-(4-(benzyloxy)-3-[((2R)-4-methyl-2-[(9-oxo-9H-1-fluorenyl)carbonyl]aminopropanoyl)amino]-2-oxobutanoylamino)acetate)(41mg,82%)。

¹H NMR(CDCl_3,400MHz)δ 10.41(d,J=6.8Hz,1H),8.20(d,J=7.6Hz,1H),7.65-7.50(m,5H),7.34-7.24(m,3H),7.19-7.14(m,5H),5.52-5.49(m,1H),4.76-4.71(m,1H),4.41(s,2H),4.21(q,J=14.0,7.6Hz,2H),4.16(dd,J=9.6,3.6Hz,1H),4.00(d,J=5.2Hz,2H),3.80(dd,J=10.0,3.6Hz,1H),1.90-1.80(m,3H),1.26(t,J=7.2Hz,3H),1.00(d,J=6.0Hz,3H),0.95(d,J=6.0Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ 195.70,192.9,171.97,168.49,164.3,159.1,145.7,143.5,137.4,135.9,135.2,133.4,132.9,132.6,130.3,129.7,128.3,127.6,127.5,125.4,123.2,120.1,73.3,69.5,61.8,55.5,52.9,41.0,40.3,40.3,24.9,23.0,22.0,14.1；HRFABMS calcd for C₃₅H₃₇N₃O₈Na 650.2478,found 650.2471.

其中化合物2,3,5,8,9,10,12,13,14,16,20,22,24,25,26,28,30,35,37,43,45,49,51,52,55,56,59之製備方法如同化合物1。

甲基2-氨基-4-([(1R)-2-(1-[(芐氧基)甲基]-3-[(2-乙氧基-2-氧乙基)氨基]-2,3-雙氧丙氧基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]胺基羰基)(Methyl 2-amino-4-([(1R)-2-(1-[(benzyloxy)methyl]-3-[(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino]-2,3-dioxopropylamino)-1-(cyclohexylmethyl)-2-oxoethyl]aminocarbonyl)benzoate)(21)

將化合物56溶於CH₂Cl₂，並於低於0℃加入TFA。攪拌溶液30分鐘並進行濃縮，進行層析純化(二氧化矽，1/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.3)以得到白色固體化合物21。

1H NMR(CDCl3,400MHz，兩種非對映體之混合物)7.84 and 7.82(d,J=8.3 and 8.2Hz,1H),7.42(t,J=5.4Hz,1H),7.27-7.15(m,5H),7.05 and 7.04(s,1H),7.03(d,J=7.8Hz,1H),6.89 and 6.88(dd,J=8.3Hz,1H),6.77(d,J=8.1Hz,1H),5.48-5.44(m,1H),4.77(dd and,J=6.0 and 21.0,5.9Hz,1H),4.43 and 4.40(s and dd,J=8.3,12.0,2H),4.22(q,J=7.1Hz,2H),4.15(dd,J=10.0,3.7Hz,1H),4.01 and 3.97(dd and d,J=5.5,3.6 and 5.6Hz,2H),3.86 and 3.85(s,3H),3.78 and 3.73(dd,J=9.9,3.3 and 9.9,3.3Hz,1H),1.81-1.57(m,7H),1.37-1.35(m,1H),1.27(t,J=7.1Hz,3H),1.24-1.10(m,3H),1.00-0.86(m,2H)；HRFABMS calcd forC33H43N4O9 639.3030,found 639.3026.其中，化合物4及23之製備方法如同化合物21。

化合物66之生產方式如下列：

3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]羰基丙基2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-環己基丙酸 (3-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]carbonylpropyl 2R)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-cyclohexylpropanoate)(i)

將叔丁氧基羰基N-[(1R)-2-(芐氧基)-1-(羧甲基)乙基]氨基甲酸酯(tert-Butyl N-[(1R)-2-(benzyloxy)-1-(hydroxymethyl)ethyl]carbamate)(450mg,1.6mmole)、Boc-Cha-OH(405mg,1.8mmole)及四甲基丁基異氰(1,1,3,3-Tetramethylbutyl isocyanide)(304ul,1.8mmole)溶於無水CH₂Cl₂(16mL)。於室溫將此溶液攪拌48小時，濃縮並進行層析純化(二氧化矽，1/4己烷/乙酸乙酯，R_f=0.4)，以得到白色固體3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]羰基丙基2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-環己基丙酸(3-(benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]carbonylpropyl 2R)-2-[(tert-butoxy carbonyl)amino]-3-cyclohexylpropanoate)(914mg,83%)。

N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(芐氧基)甲基]-2-羧基-3-氧-3-[(1,1,3,3-叔丁氧基羰基)氨基]丙基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]-4-嗎啉甲酰胺 (N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(benzyloxy)methyl]-2-hydroxy-3-oxo-3-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]propylamino)-1-(cyclohexylmethyl)-2-oxoethyl]-4-morpholinecarboxamide)(ii)

將3-(芐氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]羰基丙基2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-環己基丙酸(3-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]carbonylpropyl 2R)-2-[(tert-butoxy carbonyl)amino]-3-cyclohexylpropanoate)溶於含50%TFA之CH₂Cl₂。

攪拌溶液30分鐘接著進行濃縮，將殘留物重新溶於CH₂Cl₂並以三乙胺中和。繼續攪拌10分鐘，接著進行濃縮，並進行層析純化(二氧化矽：己烷/乙酸乙酯具有10%MeOH，R_f=0.2)以得到白色固體N1-(1,1,3,3-四甲基丁基)-(3S)-3-[(2S)-2-氨基-3-環己基丙酰]氨基-4-(芐氧基)-2-羧基丁酰胺(N1-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-(3S)-3-[(2S)-2-amino-3-cyclohexylpropanoyl]amino-4-(benzyloxy)-2-hydroxybutanamide)。

將N1-(1,1,3,3-四甲基丁基)-(3S)-3-[(2S)-2-氨基-3-環己基兩酰]氨基-4-(芐氧基)-2-羧基丁酰胺(N1-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-(3S)-3-[(2S)-2-amino-3-cyclohexylpropanoy l]amino-4-(benzyloxy)-2-hydroxybutanamide)(360mg,0.7mmole)溶於DMF(7mL)，接著加入DMF(7mL)，並於氮氣環境下攪拌15分鐘。加入4-嗎啉碳酰氯(4-Morpholinecarbonyl chloride)(93ul,0.8mmole)。接著繼續攪拌過夜，並於減壓環境之下，移除DMF。將溶液以乙酸乙酯稀釋，並以水清洗。將有機層以MgSO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，己烷/乙酸乙酯具有10%MeOH，R_f=0.5)以得到白色固體N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(芐氧基)甲基]-2-羧基-3-氧-3-[(1,1,3,3-叔丁氧基羰基)氨基]丙基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]-4-嗎啉甲酰胺(N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(benzyloxy)methyl]-2-hydroxy-3-oxo-3-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]propylamino)-1-(cyclohexylmethyl)-2-oxoethyl]-4-Morpholinecarboxamide)(280mg,63%)。

N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(芐氧基)甲基]-2,3-雙氧-3-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]丙基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]-4-嗎啉甲酰胺 (N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(benzyloxy)methyl]-2,3-dioxo-3-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl) amino]propylamino)-1-(cyclohexylmethyl)-2-oxoethyl]-4-morpholinecarboxamide)(66a)

將N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(芐氧基)甲基]-2-羧基-3-氧-3-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]丙基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]-4-嗎啉甲酰胺(N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(benzyloxy)methyl]-2-hydroxy-3-oxo-3-[(1,1,3,3-tetramethyl butyl) amino]propylamino)-1-(cyclohexylmethyl)-2-oxoethyl]-4-Morpholinecarboxamide)(260mg,0.4mmole)溶於CH₂Cl₂(4mL)。加入Dess-Martin過碘烷(550mg,1.2mmole)於室溫攪拌2小時，並以Na₂S₂O₃及飽和重碳酸根溶液進行淬熄。在由CH₂Cl₂進行萃取之後，有機層接著以MgSO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。

藉由層析純化(二氧化矽，1/3：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.6)以得到白色固體N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(芐氧基)甲基]-2,3-雙氧-3-[(1,1,3,3-四甲基丁基)氨基]丙基氨基)-1-(環己基甲基)-2-氧乙基]-4-嗎啉甲酰胺(N4-[(1S)-2-((1S)-1-[(benzyloxy)methyl]-2,3-dioxo-3-[(1,1,3,3-tetramethylbutyl)amino]propylamino)-1-(cyclohexyl-methyl)-2-oxoethyl]-4-morpholinecarboxamide)(170mg,71%)。

¹H NMR(CDCl_3,400MHz)δ 7.30-7.21(m,3H),7.19-7.17(m,2H),6.98(d,J=7.2Hz,1H),6.78(s,1H),5.47(ddd,J=7.8,3.3,1.7Hz,1H),5.13(d,J=6.8Hz,1H),4.47-4.44(m,1H),4.40(dd,J=26.9,12.1Hz,2H),4.19(dd,J=9.8,3.6Hz,1H),3.72(dd,J=9.8,3.4Hz,1H),3.64-3.57(m,4H),3.36-3.26(m,4H),1.78-1.58(m,8H),1.52-1.43(m,1H),1.40(s,3H),1.39(s,3H),1.36-1.09(m,4H),0.95(s,9H),0.92-0.82(m,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ 194.6,173.3,157.9,157.3,137.2,128.2,127.6,127.4,73.2,69.8,66.3,55.3,55.1,52.1,51.5,43.9,40.3,33.9,33.4,32.7,31.5,31.2,28.4,28.3,26.3,26.0,25.9；HRFABMS calcd for C₃₃H₅₃N₄O₆ 601.3965,found 601.3963.

化合物99之合成方式如下列：

甲基2-(2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-苯基丙酰氨基)-4-甲基戊酸(Methyl 2-(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropanoylamino)-4-methyl pentanoate)(i)

將Boc-Phe-OH(2g,13.77mmol)、H-Leu-OMe(11g,41.32mmol)、HOBt(5.58g,41.32mmol)及HBTU(15.67g,41.32mmol)溶於(69mL)，接著於氬氣環境中加入DIPEA(7.2mL,41.32mmol)。於室溫攪拌反應物8小時，將反應物以乙酸乙酯萃取並以5%NaHSO₃、飽和NaHCO₃及滷水清洗。有機層接著以Na₂SO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。接著將粗萃物以層析純化(二氧化矽，4/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.3)以得到白色固體甲基2-(2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-苯基丙酰氨基)-4- 甲基戊酸(methyl 2-(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropanoylamino)-4-methylpentanoate)(4.5g,8%)。

甲基4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸(Methyl 4-methyl- 2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylamino)pentanoate)(ii)

將甲基2-(2-[(叔丁氧羰基)氨基]-3-苯基丙酰氨基)-4-甲基戊酸(Methyl 2-(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-phenylpropanoylamino)-4-methyl pentanoate)(2.24g,5.69mmol)溶於具有33%TFA的DCM。將溶液攪拌2小時接著進行濃縮以移除TFA。將2-Pyrazinecarboxylic acid(1.06g,8.55mmol)溶於THF(43mL)，並冷卻至-10ºC。接著逐滴加入N-甲基嗎啉(2.19mL,19.95mmol)及isobutyl氯甲酸異丁酯(1.12mL,8.55mmol)。在N-甲基嗎啉氫氯酸鹽沈澱之後，將粗萃物溶於THF(29mL)。於室溫攪拌溶液2小時，將溶液以乙酸乙酯萃取並以水、飽合重碳酸鈉溶液及滷水清洗。有機層接著以Na₂SO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，2/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.3)以得到甲基4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸(methyl 4-methyl-2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylamino)pentanoate)(1.9g,90%)。

4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸 (4-Methyl-2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylamino)pentanoic acid)(iii)

將甲基4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸(Methyl 4-methyl-2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylamino)pentanoate)(1.7g,4.27mmol)溶於THF(21mL)，並加入1M LiOH(21mL)。攪拌溶液6小時並以旋轉蒸發濃縮。藉由使用HCl水溶液將水層之pH值調整為2。將溶液以乙酸乙酯萃取並以水及滷水清洗。將有機層以Na₂SO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮以得到白色固體4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸(4-methyl-2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylamino)pentanoic acid)(1.6g,97%)。

N2-[1-苯甲基-2-(1-[(1,2-雙氧基雙氨基)羰基]-3-甲基丁烷氨基)-2-氧乙基]-2-吡嗪羰酰胺(N2-[1-benzyl-2-(1-[(1,2-dimethylhydrazino)carbonyl]-3-methylbutylamino)-2-oxoethyl]-2-pyrazinecarboxamide)(iv)

將4-甲基-2-(3-苯基-2-[(2-吡嗪基羰基)氨基]丙酰氨基))戊酸(4-Methyl-2-(3-phenyl-2-[(2-pyrazinylcarbonyl)amino]propanoylami no)pentanoic acid)(200mg,0.52mmol)溶於THF(1.2mL)。加入N-甲基嗎啉(0.057mL,0.52mmol)，並將所得到的清澈溶液冷卻至-10ºC。逐滴加入氯甲酸異丁酯(0.068mL,0.52mmol)以使N-Methylmorpholine氫氯酸鹽沈澱。N,N’-雙甲基聯氨氫氯酸鹽(346mg,2.6mmol)溶於3N NaOH(1.7mL)。將所得到的混合物加入至溶液並攪拌1小時。將溶液以乙酸乙酯萃取，並以5%NaHSO₃、飽和重碳酸鈉溶液及滷水清洗。有機層接著以Na₂SO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，20/1：DCM/MeOH，R_f=0.3)以得到淡黃色固體N2-[1-苯甲基-2-(1-[(1,2-雙氧基雙氨基)羰基]-3-甲基丁烷氨基)-2-氧乙基]-2-吡嗪羰酰胺(N2-[1-benzyl-2-(1-[(1,2-dimethylhydrazino)carbonyl]-3-methylbutylamino)-2-oxoethyl]-2-pyrazinecarboxamide)(197mg,89%)。

N2-[1-苯甲基-2-(1-[(2-氰基-1,2-雙甲基聯胺)羰基]-3-甲基丁烷氨基)-2-氧乙基]-2-吡嗪羰酰胺 (N2-[1-benzyl-2-(1-[(2-cyano-1,2-dimethylhydrazino)carbonyl]-3-methylbutylamino)-2-oxoethyl]-2-pyrazinecarboxamide)(99)

將N2-[1-苯甲基-2-(1-[(1,2-雙氧基雙氨基)羰基]-3-甲基丁烷氨基)-2-氧乙基]-2-吡嗪羰酰胺(N2-[1-benzyl-2-(1-[(1,2-dimethylhydrazino)carbonyl]-3-methy lbutylamino)-2-oxoethyl]-2-pyrazinecarboxamide)(100mg,0.23mmol)及醋酸鈉(53mg,0.64mmol)溶於甲醇(1mL)。加入溴化氰(Cyanogen bromide)(49mg,0.46mmol)並攪拌4小時，藉由旋轉蒸發濃縮甲醇。使用5%NaHSO₃調整pH值為1-2，以乙酸乙酯萃取溶液，並以水及滷水清洗。有機層接著以Na₂SO₄乾燥、過濾並由旋轉蒸發濃縮。藉由層析純化(二氧化矽，1/1：己烷/乙酸乙酯，R_f=0.3)以得到淡黃色固體N2-[1-苯甲基-2-(1-[(2-氰基-1,2-雙甲基聯胺)羰基]-3-甲基丁烷氨基)-2-氧乙基]-2-吡嗪羰酰胺(N2-[1-benzyl-2-(1-[(2-cyano-1,2-dimethylhydrazino)carbonyl]-3-methylbutylamino)-2-oxoethyl]-2-pyrazinecarboxamide)(67mg,65%)。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ 9.34(d,J=1.2Hz,1H),8.73(d,J=2Hz,1H),8.51(dd,J=2.0,1.2Hz,1H),7.28-7.10(m,5H),5.00(dd,J=14.2,7.6Hz,1H),4.87(dd,J=14.4,7.2Hz,1H),3.21(s,3H),3.17(s.3H),3.09(m,2H),1.59-1.40(m,3H),0.92(d,J=6.4Hz,3H),0.87(d,J=6.4Hz,3H)；¹³C NMR(CDCl3,75MHz)δ 173.71,170.68,162.86,147.49,144.28,143.76,142.71,136.06,129.28,128.52,127.01,113.40,53.97,47.74,41.03,40.84,38.22,30.41,24.74,23.02,21.34；LRMSEI calcd for C₂₃H₂₉N₇O₃ 451.23,found 452.2(M+1),474.2(M+23).

生物測定：純化組織蛋白酶S

人類組織蛋白酶S是酶原前體(pre-proenzyme)形式生產的，其包含N-端分泌信號、前導序列區域(pro-sequence region)及成熟多胜肽(mature polypeptide)。在細胞之中，成熟組織蛋白酶S蛋白質之產生是由酶原進行酸活化自動處理(acid-activated autoprocessing)，其中殘基99之前導序列區域會被移除。為得到重組組織蛋白酶S，將編碼組織蛋白酶原S(胺基酸序列17-331)複製到載體pET23a，而於C端附加6組氨酸標籤(His₆ tag)的蛋白質則於E.coli中表現。重組的組織蛋白酶原S(~35kDa)可於細菌裂解液的可溶層以及可溶解的包 含體(inclusion bodies)之中大量回收。接著進行重新折疊(refolding)，於組織蛋白酶原S加入乙酸(pH 4.5)，結果得到分子量為24.6kDa的組織蛋白酶S。組織蛋白酶S之識別可藉由進行使用具人類組織蛋白酶S專一性的多株抗體的西方墨點法(Western blotting)加以確認。重組組織蛋白酶S之專一活性之決定則是藉由使用Z-VVR-AMC作為受質，並利用螢光測定法測量，結果為0.26U/mg。

組織蛋白酶S活性試驗

重組酵素組織蛋白酶S之活性是藉由使用benzyloxycarbonyl-valine-valine-arginine-7-amido-4-methylcoumarin(Z-VVR-AMC)作為受質以進行試驗。試驗混合物總體積為200μl，其包括了50mM MES緩衝液(pH 6.5)、1mM DTT、2.5mM EDTA、5μM受質及50nM酵素溶液。接著偵測由合成胜肽受質Z-VVR-AMC所釋出的螢光基團AMC。在37℃環境中，使用光譜儀(model LS55,Perkin Elmer instruments)測量AMC的螢光強度，其中激發及放射之設定分為370nm及460nm。潛在組織蛋白酶S抑制劑的識別方式是利用多孔盤(microplate)式篩選步驟。將合成化合物溶於二甲亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)，其最終濃度為100μM，與重組之具活性於37℃共同培養10分鐘，之後再如同前述加入受質Z-VVR-AMC。為決定IC₅₀，將受試化合物進行兩倍稀釋並加入試驗混合物，接著測量AMC螢光強度。IC₅₀之計算是利用GraphPad Prism軟體。

對化合物2-99進行測試，並發現其具有抑制活性。其中，部分化合物，例如化合物2-56、62-79及99的IC₅₀值小於50nm。

生長抑制試驗

將對數期生長的細胞接種於96孔盤並在入特定化合物之前培養過夜。在與不同濃度之測試化合培養三代時間之後，將細胞與含有0.4mg/mL3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)之培養液培養2小時。具有代謝活性的細胞會將MTT轉換為甲臢(formazan)，進而於96孔盤識別機測量在570nm的吸收值。 空白對照組細胞的轉換比例被用以評估化合物影響細胞生長的效果並決定抑制生長50%之濃度(GI₅₀)。

癌細胞移動試驗

癌細胞移動試驗是於96孔-多層MIC盤(96-well-MultiScreen-MIC plates)(Millipore)之中進行，其具有孔徑大小為8μm的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。簡言之，將具有高度轉移性的人類肺腺癌CL1-5置於上層腔室(2×10⁴cells/well)，包含溶於完整培養液(含有1%FBS的RPMI 1640培養液)之中的受試化合物，而於下層腔室之中僅放入培養液。於37℃進行腔室培養24小時，接著將未移動的細胞自膜的上表面洗掉。移動到底部的細胞利用細胞脫落緩衝液(Cell Detachment Buffer)(Chemicon,Inc.)、溶解並利用CyQuant GR染料(Molecular Probes)進行核酸染色。訊號強度之測量是利用螢光顯示器(VICTORTIM 1420 Multilabel Counter,Wallac)，其中激發波長為485nm而發射波長為535nm(1sec)。結果是以三次獨立實驗，每次兩重複所得的平均值呈現。

化合物2-4,7,10,14,16,21-25,30,36,43,45,49,56,62,64,66,67及70-72具有25%以上的CL-15細胞移動抑制能力。

HUVEC移動測試

HUVEC移動是利用活體外傷口癒合試驗所決定。簡言之，將HUVEC置放於具有以明膠塗佈的六格培養盤(3×10°cells/well)，並使細胞生長至鋪滿的單層細胞達24小時。傷口的產生方式是藉由使用移液管尖將鋪滿的單層細胞割開傷痕以產生空曠處。在以PBS沖洗以移除漂浮細胞之後，加入含有1%FBS及20ng/ml VEGF以及各種不同濃度受試化合物的培養液。接著培養24小時，之後藉由計算由傷口邊緣移到空曠處的細胞數目以量化細胞移動，HUVEC的存活率則是藉由對二重覆之孔格進行MTT試驗所得到。

其中，化合物2-4,9,16,21-25,27,28,30,36,43,45及48具有25%以上的HUVEC移動抑制能力。

活體內試驗

將A2058黑色素腫瘤細胞接種到BALB/cAnN-Foxnlnu/CrlNarl母鼠之中，到7日時，將含有化合物1的DMSO(mg/kg)以靜脈注射方式打入12隻老鼠，另外8隻老鼠則注射DMSO以作為對照組。此試驗持續72天。之後將老鼠犧牲並稱其肺臟重量。利用化合物處理的老鼠顯然較未有化合物處理的老鼠具有較輕的肺臟重量(0.471g vs.0.671g)。這代表化合物1可有效地抑制A2058接種老鼠中腫瘤生長。

其他實施例

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何方式組合。本說明書中所揭示之特徵可被相同、相當、或類似目的之另一種特徵所取代。因此，除非另有指明，否則所揭示之各特徵僅為一般性之相當或類似特徵之實例。數種關於本發明之實施例已詳述於上。

熟習本項技藝者應可理解本發明之必要特徵，且在不背離本發明之精神與範疇下，均可由熟習本項技藝者據以實施，因此其他具體實施例亦在本申請專利範圍內。

以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

Claims (10)

1. 一種化合物，其具有化學式(I)： 其中R₁為氫、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團、包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環、OR_a、SR_a、NR_aR_b、N(R_a)C(O)R_b、N(R_a)C(O)OR_b、C(O)R_a、COOR_a、OC(O)R_a、C(S)R_a、C(O)NR_aR_b、C(S)NR_aR_b、N(R_a)C(S)R_b、或N(R_a)N(R_b)C(O)R_c，其中R_a、R_b及R_c係獨立為氫、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團或包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環；X為CH2、O或S；R₂及R₃係獨立為氫、C₁-C₁₀環烷基、C₂-C₁₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團、包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環或選擇性具有C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、 氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、芳基或雜芳基取代基之C₁-C₁₀烷基；以及R₄及R₅係獨立為氫、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀環烷基、C₂-C₁₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團或包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環。
2. 如請求項1所述之化合物，具有下列化學式：
3. 如請求項2所述之化合物，其中R₂為環烷基或是包含至少一個芳香環之一碳氫基團。
4. 如請求項3所述之化合物，其中R₂為環己基或是苯基。
5. 如請求項4所述之化合物，其中R₃為烷基，其選擇性具有C₁-C₁₀環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團或包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環之取代基。
6. 如請求項5所述之化合物，其中R₃為芐基(benzyl)。
7. 如請求項6所述之化合物，其中R₄及R₅之其一為氫，而另一為C₁-C₁₀環烷基、C₂-C₁₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個 芳香環之一碳氫基團或包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環，或是選擇性具有C₃-C₂₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團或包含一種、多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環、OR_d、C(O)R_d、COOR_d或OC(O)R_d取代基之C₁-C₁₀烷基，其中R_d為氫、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烷基、包含氮、氧以及硫原子至少其中之一之C₁-C₂₀雜環烯基、包含至少一個芳香環之一碳氫基團或包含一種或多種含有氮、氧以及硫原子至少其中之一之芳香環。
8. 如請求項7所述之化合物，其中R₄及R₅之另一為選擇性具有包含至少一個芳香環之一碳氫基團或COOR_d取代基之C₁-C₁₀烷基，或是選擇性具有鹵素取代基或與雜環烷基融合之苯基。
9. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物如表1所示之化合物1至61，表2所示之化合物62至79。
10. 一種治療癌症之醫藥組成物，包含一醫藥可接受載體以及一請求項1至9之至少其一所述之化合物。