TWI508732B - 用於抗癌化療法之籠狀鉑金奈米團簇 - Google Patents

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Description

用於抗癌化療法之籠狀鉑金奈米團簇
本發明係關於抗癌症之化學療法。
鉑(Pt)被視為一種貴重金屬，它不像順鉑僅藉由水就可活化其毒性，Pt僅可溶解於強腐蝕劑中，例如王水(HNO3 /HCl)。王水首先氧化之後溶解Pt以形成含Pt氯複合物。最近已發現縮小Pt的體積以增加表面積比，進而允許氧氣吸附並促進表面腐蝕之水氧化反應，可顯著地增加氧化的程度。然而，如何有效地縮小Pt，仍是一項挑戰。
在一方面，本發明係關於一種雙重籠狀鉑奈米團簇複合物(double-caged platinum nanocluster complex)，其包含(a)樹枝狀聚合物(dendrimer)；(b)包含鉑氧化物之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該樹枝狀聚合物之內；及(c)聚乙二醇(PEG)，其係塗佈於該樹枝狀聚合物的表面。該樹枝狀聚合物可以是胺基終端樹枝狀聚合物。
在另一方面，本發明係關於一種籠狀鉑奈米團簇複合物，其包含(a)一胺基終端樹枝狀聚合物；及(b)一包含鉑氧化物及具有平均直徑為0.93nm，標準差為0.22nm之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該胺基終端樹枝狀聚合物之內。
在另一方面，本發明係關於一種合成上述籠狀鉑奈米團簇複合物之方法，其包括下列步驟： (a)混合包含八面體六氯鉑酸鹽陰離子之第一溶劑與包含一胺基終端樹枝狀聚合物或一羥基終端樹枝狀聚合物之第二溶劑，以形成包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物之混合物；(b)培養該包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物的混合物達一段足夠的時間；(c)還原PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物中之PtCl6 2- 陰離子，以形成包含樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之混合物；(d)將包含該樹枝狀聚合物包圍鉑之奈米團簇複合物之混合物通過過濾器，以得到包含該樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之濾液；及(e)冷凍乾燥該過濾液以得到樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物。
在另一方面，本發明係關於一種合成雙重籠狀鉑奈米團簇複合物之方法，其包括：(i)溶解上述樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物於溶劑中以形成溶液，該複合物包含；(a)胺基終端之樹枝狀聚合物或羥基終端之樹枝狀聚合物；及(b)包含鉑氧化物之鉑奈米團簇，其係被限制在該胺基終端之樹枝狀聚合物或該羥基終端之樹枝狀聚合物之內；(ii)當該樹枝狀聚合物為胺基終端時，加入PEG-醛至該溶液中；或當該樹枝狀聚合物為羥基終端時，加入PEG-NH2 至該溶液中；及(iii)允許PEG-醛與該胺基終端之樹枝狀聚合物的一級胺進行反 應；或允許PEG-NH2 與羥基終端之樹枝狀聚合物進行反應，藉此獲得雙重籠狀鉑奈米團簇複合物。
在進一步之方面，本發明係關於一種上述籠狀鉑奈米團簇複合物或雙重籠狀鉑奈米團簇複合物製備於所需個體抑制腫瘤細胞生長的藥物的用途。或者，本發明係關於一種上述籠狀鉑奈米團簇複合物或雙重籠狀鉑奈米團簇複合物於個體所需抑制腫瘤細胞生長的用途。
另一方面，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含：(a)治療有效量之前述複合物；及(b)醫藥上可接受之載劑。
藉由以下較佳實例態樣之敘述並配合以下圖式的說明，將更清楚瞭解本發明之各方面內容。附隨圖式例示本發明之一或多種態樣，並配合文字敘述以解釋本發明之原理。無論在什麼可能的情況下，相同的參照編號在各圖式中用於指涉一實施態樣之相同或相似元件。
圖1A顯示一種基於調控陰離子幾何特性以形成PN之新穎策略；途徑(i)及(ii)顯示G2 NH2 之外部及內部分別選擇性地與平面PtCl4 2- 及八面體PtCl6 2- 交聯。
圖1B顯示籠狀PN與腫瘤侵入胜肽混合，以標靶腫瘤並藉由脫去外部PEG冠，進而在腫瘤內部活化以殺死惡性細胞。抗癌功效的關鍵在於，PN失去其內因性化學鈍性，而在弱酸性胞器中表現其溶解性。
圖2A-B顯示PtCl4 2- /G2 NH2 複合物(A)及PtCl6 2- /G2 NH2 複合物(B)之拉曼光譜，顯示自前者複合物形成N-Pt-N協調性。
圖2C-D顯示在還原前PtCl4 2- /G2 NH2 複合物(C)及PtCl6 2- /G2 NH2 複合物(D)之HRTEM影像。
圖2E-F顯示當(C)及(D)複合物還原時，PN被籠在G2 NH2 外部(E) 及內部(F)。所有TEM樣本在測量前兩天新鮮配置，並將一配置好的樣品予以自然乾燥。所有的測量均在不存在陰性染色的條件下進行。
圖3A顯示CPN之IC50 值高於順鉑及卡鉑之IC50 值。其中插入圖顯示較低濃度，範圍自0至50μg/mL。
圖3B係觀察細胞死亡途徑之顯微影像。將未經處理或以大概50μg/mL CPN予以不同時間處理之MDA-MB-231細胞以annexin V-FITC及PI予以雙重染色。上圖自左至右分別表示未經處理的細胞及經CPN處理5小時的細胞。下圖則分別表示經CPN處理10小時及24小時的細胞。比例尺：30μm。
圖4A-B係XPS光譜顯示Pt(A)與氧(B)的鍵結能量，其中圖A特別代表CPN及Pt奈米粒子之(4f7/2 )及(4f5/2 )部位。星星表示CPN之鍵結能量推移至73.4eV。以沈積於受質上的金膜的Au4f7/2 (83.7eV)波峰作為內標準品予以校正。
圖4C顯示在細胞吸收過程中檢測CPN內化途徑之各種胞引作用抑制劑。
圖4D顯示MDA-MB-231細胞之CPN細胞吸收行為之共焦顯微影像；以FITC標記CPN以利觀察(綠色)及溶酶體追蹤(紅色)，而CPN及溶酶體追蹤共處的區域呈黃色。細胞型態之改變係基於CPN之毒性。
圖4E顯示在擬內體環境下，以ICP-MS測定本發明CPN溶解成Pt離子形式。CPN溶解於王水(3：1 HCl/HNO3 )作為對照組。
圖5A-F分別顯示經IT及IV注射後，CPN(A-C)及DCPN(D-F)之抗癌治療效果。A)及E)顯示腫瘤體積，B)表示每一群組在終點時腫瘤大小的代表影像，C)表示利用TUNEL測試所觀察的凋亡性細胞死亡(比例尺：20μm)，D)腫瘤標靶，及F)體重之記錄。以IT及IV注射帶有腫瘤之裸鼠後，其體積分別達大概60mm3 及150mm3 。動物模式 以兩組處理方式加以處理，包括IT注射(PBS、G2 NH2 、CPN及順鉑)以及IV注射(PBS、G2 NH2 、iRGD、DCPN及順鉑)。為避免圖表過於複雜，IT之G2 NH2 及IV之iRGD的數據予以省略。在指定的日子測量腫瘤體積及小鼠體重。每一數據表示給藥注射後腫瘤體積平均值的相對變化(n=5,P<0.05且n.s表示未具統計上顯著性)。SD表誤差柱。注射次數以黑色箭頭標記。
圖6顯示CPN之EDS光譜，星星代表Pt訊號。
圖7A-C顯示CPN及PN聚集特徵之比較，這些材料係由調控陰離子幾何特性而製得。A)代表溶解度，B)代表細胞毒性評估，C)代表胞內吸收效率。
圖8A-D係顯微影像以比較順鉑誘發之細胞死亡與CPN誘發之細胞死亡之途徑。將未經處理或以30μg/mL順鉑予以不同時間處理之MDA-MB-231細胞以annexin V-FITC及PI予以雙重染色。上圖自左至右分別表示未經處理的細胞(A)及經順鉑處理5小時的細胞(B)。下圖則分別表示經順鉑處理10小時(C)及24小時的細胞(D)。比例尺：50μm。
圖9顯示CPN生成ROS。將MDA-MB-231細胞在37℃、5% CO2 大氣壓下培養於RPMI 1640培養基中(其中添加10%胎牛血清)。將細胞以1×105 細胞/孔的密度接種於6孔細胞培養盤中，在37℃下培養24小時。之後以不同處理替換培養基，包括僅G2 HN2 、CPN、順鉑及0.03% H2 O2 。每次測試進行3小時不更換培養基，移除細胞培養基之上清液後，分離細胞並利用CM-H2 DCFDA(INVITROGENTM )進行ROS測試。
圖10A顯示BA之預估安全劑量及處理時間。值得注意的是，已知BA易於透過破壞粒線體功能而導致MDA-MB-231細胞死亡。因此，BA的濃度與處理時間必須最小化且縮短，以避免從抑制劑與 CPN的增效效果而來之細胞死亡，導致在CPN處理期間BA之存在或不存在並未產生顯著的差異。
圖10B顯示內體/溶酶體pH-上升導致CPN對細胞毒性的影響。
圖11顯示活性蛋白酶-3免疫染色所觀察到CPN所致凋亡性細胞死亡。比例尺：20μm。
圖12A-C顯示DCPN及其前驅物之1 H NMR光譜。
圖13顯示在終點後CPN之生物清除(bio-clearance)。
圖14顯示G2 NH2 塗佈可裂解PEG對於腫瘤標靶與抗癌化療功效之比較。並未發現對於腫瘤抑制具顯著功效。腫瘤質量在終點時則顯著大於其初始點。
圖15顯示小鼠之食物攝取量。每一數據代表在藥物注射後每一籠內(n=5)所有食物攝取量。
圖16A-D顯示在切開的腫瘤內組織H&E染色之比較。圖像A)-D)表不同的處理，包括PBS、G2 NH2 、DCPN及順鉑(放大400倍)。
以下以較特定實施例描述本發明僅係作為說明之用，因為各種修飾及變化乃該技術領域之技藝人士所熟知者。此處詳細說明本發明之各種實例態樣。至於圖式，從整體圖式之編號標明其內容。本文中及申請專利範圍所用「一」及「該」等用語包含複數含意，除非本文中清楚另有所指。此外，本文中及申請專利範圍所用「在其中」包含「在其中」及「在其內」等意義，除非本文中清楚另有所指。再者，本文使用標題及副標題利於讀者閱讀，該等用法並未影響本案所請發明之範圍。以下提供本文所使用部份術語特定之定義。
定義
一般而言，本案說明書所用的術語在本發明的上下文以及每一術語在特定的上下文具有該領域所知的通常意義。以下或本案說明書 其他處所討論的特定術語，提供實施者更多有關實施本發明的指導。為方便起見，特定術語將予以標記，例如使用斜體字及/或使用引號。所使用的標記對於該術語的範圍及意義並無影響，本案說明書中所用的術語，不論是否被標記，其範圍與意義都是相同的。一件相同的事物當可用超過一種的方式予以說明。因此，此處所討論任何術均可以替代語言或同義字表示，不論術語是否被詳解或討論，都不會賦予它任何特殊的含意。某些術語提供其同義字，所列舉之一或多種同義字亦不將其他同義字的用法排除在外。本案說明書任一處所用實例，包括任何術語的實例僅用於例示本發明，而非限制本發明或任一例示之術語的範圍及意義。同樣地，不該將本發明限制在本案說明書所載各種實施態樣。
除非另有定義，本案說明書所有技術及科學術語具有與該領域技藝人士通常地理解的相同意義。如有衝突，以本文，包括本文所定義者予以支配。
本文所用「近似」、「約」或「大概」一般代表對一特定數值或範圍之20%以內，較佳者係於10%以內，更佳者係於5%以內。本文中所指數量是「大概的」，即若未被指明，「近似」、「約」或「大概」等術語是可被推論用於本文中。
本文所用術語「奈米團簇」，係指具有小於2nm直徑或由少於100個原子所組成之粒子。
六氯鉑酸鹽陰離子(hexachloroplatinate anion)具有化學式[PtCl6 ]2- 。
樹枝狀聚合物係重複分枝分子。樹枝狀聚合物典型上圍繞核心呈對稱，且多呈球狀三維構型。樹枝狀聚合物亦可根據其代數(generation)產生而分類，其係與合成過程中重複分支環的數量相關連。例如，如樹枝狀聚合物以收歛性合成所製成，且分支反應於核心 分子上進行三次，所得的樹枝狀聚合物被視為第三代樹枝狀聚合物。每一續代導致樹枝狀聚合物大約為前一代的兩倍分子量。一代、二代及三代樹枝狀聚合物分別以(G-1)、(G-2)及(G-3)樹枝狀聚合物表示。
術語「籠狀」(caged)係指被放置或限制於籠狀物或如同籠狀物之內。
術語「希夫鹼(Schiff base)」係指一亞胺功能基。希夫鹼係由一胺基與醛或酮之羰基所縮合而成。
術語「溶解度」係指斷裂、崩解或溶解。
術語「限制」、「捕集的」、「籠狀」及「包覆的」均可交互使用。
濾液係指過濾過程後通過濾器所收集的流體/液體。
樹枝狀聚合物之端點基團一般亦指樹枝狀聚合物之「終端基」或「表面基團」。具有胺基端點之樹枝狀聚合物稱之「胺基終端之樹枝狀聚合物」。
iRGD係一肽(胺基酸鏈)，其係特異性地辨識並穿透癌腫瘤，但不穿透正常組織。該肽亦顯示可遞送診斷粒子及藥物進入腫瘤。iRGD可大幅增進癌症的偵測與治療。iRGD有助於共同投藥以深入地穿透腫瘤組織。該肽顯示在小鼠中，可實質地增進對抗人類乳癌、前列腺癌及胰臟癌之治療效果，使用MPEG(methoxy polyethylene glycol(甲氧基聚乙二醇))的1/3劑量即可達到正常劑量的治療效果。
術語「治療」或「療法」係指針對有需要的個體為達治癒、緩解、緩和、治療、改善或預防疾病或其症狀，或改變易染病體質，而投予有效量之治療劑。該個體係根據健康照顧專業基於任何適當的診斷方式予以鑑定。
術語「有效量」係指對受治療個體為達到治療效果所需活性劑的劑量。如該領域技藝人士所知悉者，有效劑量係根據投藥途徑、賦 形劑的使用及與其他治療方法共用的可能性而有所變化。
計算游離Pt：CPN中游離Pt的量=14.4μ mol/kg×35原子/1nm。因此，經由IT投予游離Pt為504μ mol/kg。DCPN中游離Pt的量=16.6μ mol/kg×35原子/1nm。因此，經由IV投予游離Pt為581μ mol/kg。
根據美國衛生部食品藥物管理署出版之「(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」所示，「人類等劑量」可由以下公式獲得：HED=動物劑量毫克/公斤×(動物重量(公斤)/人類重量(公斤))0.33 。HED會根據其他諸如給藥途徑等因子而變化。例如以DCPN i.v.投藥，假如小鼠(20公克BW)的劑量為16.6μ mol/kg，HED經計算而得16.6μ mol/kg×(0.02/病人的體重)0.33 。至於CPN IT注射，假如小鼠的劑量為7.5mg/kg，HED經計算而得7.5mg/kg×(0.02/病人的體重)0.33 。
腐蝕性PN可以藉化學反應(圖1，紅色矩形)使得腐蝕性PN繼續溶解而快速製得，氯離子可加速其溶解速率。我們假設細胞內酸性的胞器(即內體(endosome)及溶酶體)具有質子來源及氯離子以啟動腐蝕性PN之溶解使得DNA鉑化(DNA platination)。然而，如何有效地縮小Pt，仍是一項挑戰。我們發展一種簡單的策略，其係使用低代數及胺基終端樹枝狀聚合物(G2 NH2 )作為一籠狀物捕捉特異性幾何陰離子，以形成籠狀PN(CPN，圖1A)。基於此腐蝕能力，CPN被一額外可裂解之PEG冠(corona)及可標靶分子，諸如iRGD，所修飾，以標靶腫瘤並且釋放毒素對抗惡性細胞，藉由脫去外部PEG冠使得抗癌化學療法在腫瘤內部得以運作(Chien等人”Caged Pt Nanoclusters Exhibiting Corrodibility to Exert Tumor-Inside Activation for Anticancer Chemotherapeutics”Advanced Materials.2013,25,5067- 5073)。
在一方面，本發明係關於一種雙重籠狀鉑奈米團簇複合物，其包含(a)樹枝狀聚合物；(b)包含鉑氧化物之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該樹枝狀聚合物之內；及(c)聚乙二醇(PEG)，其係塗佈於該樹枝狀聚合物的表面。該樹枝狀聚合物可以是胺基終端樹枝狀聚合物。
在另一方面，本發明係關於一種籠狀鉑奈米團簇複合物，其包含(a)胺基終端樹枝狀聚合物；及(b)包含鉑氧化物及具有平均直徑為0.93nm而標準差為0.22nm之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該胺基終端樹枝狀聚合物之內。
根據本發明之一實施態樣，鉑氧化物係選自由PtO、PtOH、PtO2 、Ptx Oy 及其任何組合之群組，其中x及y係各自獨立為一大於0的整數。前述複合物不包含樹枝狀聚合物之聚合體，且對癌症細胞呈現毒性。
根據本發明之另一實例態樣，該PEG透過希夫鹼與該胺基終端樹枝狀聚合物的一級胺共軛。該雙重籠狀鉑奈米團簇複合物的表面包含對pH反應或敏感的鍵結(例如雙鍵)。在酸性條件下，該對pH反應鍵結呈現分裂及溶解特徵，因而提供單一籠狀鉑奈米團簇複合物(即，胺基終端樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物，在其表面不具有PEG塗佈)。
根據本發明之另一實例態樣，該雙重籠狀鉑奈米團簇複合物呈現眼睛形狀之外觀。
根據本發明之另一實例態樣，在pH小於5.0的條件下，該雙重籠狀鉑奈米團簇複合物表現釋放Pt2+ 、PtCl4 2- 及/或PtCl6 2- 離子的特徵。在pH小於5.0的條件下，該鉑奈米團簇表現溶解力。
根據本發明之另一實例態樣，該奈米團簇的直徑小於2nm。或 者，該奈米團簇具有直徑小於3nm之球狀。
根據本發明之另一實例態樣，該樹枝狀聚合物為聚醯胺(PAMAM)樹枝狀聚合物。前述之複合物可進一步包含腫瘤侵入胜肽，其係被吸附在樹枝狀聚合物的表面。該胜肽可以是iRGD(CRGDKGPDC；SEQ ID NO：1)。
根據本發明之另一實例態樣，該樹枝狀聚合物係選自由零代(G-0)、一代(G-1)、二代(G-2)及三代(G-3)樹枝狀聚合物所組成之群組。
根據本發明之另一實例態樣，前述之複合物不含六氯鉑酸鹽及/或四氯鉑酸鹽陰離子。
根據本發明之另一實例態樣，該胺基終端樹枝狀聚合物的表面或外圍不包含鉑奈米團簇。
根據本發明之另一實例態樣，該籠狀鉑奈米團簇複合物基本上由以下所組成：(a)胺基終端樹枝狀聚合物；及(b)鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇包含鉑氧化物且被限制在該樹枝狀聚合物之內(內部)。
在另一方面，本發明係關於上述籠狀或雙重籠狀鉑奈米團簇複合物於製備在有需要個體抑制腫瘤細胞生長的藥物的用途。或者本發明係關於上述籠狀或雙重籠狀鉑奈米團簇複合物於個體所需抑制腫瘤細胞生長的用途。當用於抑制腫瘤細胞生長時，係投予上述複合物的有效量給個體。該腫瘤細胞可以是乳房腫瘤細胞，或該個體係罹患乳癌。
本發明另一方面係關於一種醫藥組合物，其包含：(a)治療有效量之前述之複合物；及(b)醫藥上可接受之載劑。
本發明之另一方面係關於合成上述籠狀鉑奈米團簇複合物之方 法，其包括下列步驟：(a)混合包含八面體六氯鉑酸鹽陰離子之第一溶液與包含胺基終端樹枝狀聚合物或羥基終端樹枝狀聚合物之第二溶液以形成包含一PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物之混合物；(b)培養包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物的混合物達一段足夠的時間；(c)在PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物中還原PtCl6 2- 陰離子以形成包含樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物之混合物；(d)將該包含樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物之混合物通過過濾器以得到包含樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物之濾液；及(e)冷凍乾燥該濾液以得到樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物。
另一方面，本發明係關於一種合成雙重籠狀鉑奈米團簇複合物之方法，其包括：(i)溶解上述樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物於溶劑中以形成溶液，該複合物包含：(a)胺基終端樹枝狀聚合物或羥基終端樹枝狀聚合物；及(b)包括鉑氧化物之鉑奈米團簇，其係被限制在該胺基終端樹枝狀聚合物或該羥基終端樹枝狀聚合物之內；(ii)當該樹枝狀聚合物為胺基終端，加入PEG-醛至該溶液中；或當該樹枝狀聚合物為羥基終端，加入PEG-NH2 至該溶液中；及(iii)使該PEG-醛與該胺基終端樹枝狀聚合物的一級胺進行反應；或使該PEG-NH2 與羥基終端樹枝狀聚合物進行反應，藉此獲得該雙重籠狀鉑奈米團簇複合物。
步驟(a)、(b)或(c)無或不包括銀離子、硝酸銀或NaBH4 。
上述合成複合物之方法可進一步包括純化樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物，其係藉由自其中移除多餘的PtCl6 2- 。
根據本發明之一實例態樣，該還原步驟係藉由微波輻射而進行。
根據本發明之一實例態樣，該培養步驟係進行於室溫下過夜培養。
實施例
以下所示本發明之各實例態樣之實施例說明、裝置、方法及其相關結果不具限制本發明範圍的意圖。需要注意的是本文使用標題及副標題利於讀者閱讀，不應用此限制本案所請發明之範圍。再者，此處亦提出並揭示特定理論，然而這些理論，不論是對或錯，無須考慮任何特定理論或行動方案，只要根據本發明所實施者均不應以此限制本發明範圍。
方法
CPN的合成與特徵化
將H2 PtCl6 (Acros,200μ L，30μ mol，150mM)及K2 PtCl4 (UniRegion Bio-Tech,200μ L，30μ mol，150mM)加入分別含有G2 NH2 、G2 OH或G2 COOH(Aldrich,94.7μ L，5μ mol，20wt%甲醇溶液)之去離子水中。在進行微波輻射(CEM,Discover LabMate System,300W/120℃達30分鐘)前，將G2 HN2 、G2 OH或G2 COOH與H2 PtCl6 或K2 PtCl4 之混合物在室溫下培養過夜。還原後，將所沈積之大型鉑奈米粒子通過0.22-μ m濾紙(Millipore,PES膜，用於鉑金奈米團簇)。將溶液冷凍乾燥並溶解於~1毫升水中待進一步純化。使用陰離子交換層析(Merck,Fractogel EMD TMAE Hicap)進一步去除多餘的陰離子 (PtCl6 2- 及PtCl4 2- )以獲致經純化的CPN及PN聚合物。使用高解析穿透式電子顯微鏡(HRTEM,JEOL-2010)鑑別該CPN及PN組(assembly)的大小。
MPEG2000-共軛苯甲醛的合成
將對-醛基苯甲酸(TCI，10當量，5mmol，751mg)在室溫下溶解於二氯甲烷(20mL)，之後依序加入DCC(Acros,N,N’-二環己基碳二亞胺，10當量，5mmol，1g)、MPEG2000(Aldrich，0.5mmol，1g)及DMAP(α,4-二甲基胺基吡啶，2.5當量，1.25mmol，150mg)。在室溫下攪拌反應混合物24小時。將鹽濾掉，並濃縮濾液，溶解於異丙醇(20mL)，並在0℃下冷卻達2小時。利用過濾收集所的結晶並以乙酸乙酯予以洗滌。將粗產物溶解於四氫呋喃，並逐滴加入乙醚中。將沈澱物以乙醚洗滌兩次。在減壓條件下以蒸發方式回收MPEG2000-苯甲醛，呈白色粉末狀。MPEG2000-苯甲醛(CDCl3 )之1 H NMR(Varian,400MHz)：d 3.64(MPEG2000之質子)，7.96(d,2H)，8.22(d,2H)，10.11(醛，s，1H)。
DCPN的合成
將CPN(5μ mol)溶解於DMSO(15mL)。將MPEG2000-苯甲醛(40μ mol，86mg，根據上述步驟製得)或MPEG2000-NH2 (40μ mol，86mg，商業上可取得者)加入含有CPN的溶液中，在37℃下分別以G2 HN2 或G2 OH予以圍籠達4小時。必須注意衍生自G2 OH及G2 COOH之CPN，其羥基/羧基終端的基團可能部份轉換為醛基終端的基團，透過希夫鹼進行MPEG2000-NH2 反應。之後移除DMSO，將粗化合物以SEPHADEXTM G-10管柱予以純化，以甲醇作為沖提液。在減壓條件下以蒸發方式回收DCPN，呈藍色粉末狀。DCPN(d-DMSO)之1 H NMR(Varian,400MHz)：d 3.50及3.60(MPEG2000之質子)，6.76(d,br,2H)，7.29(d,br,2H)，8.47(亞胺，s，1H)。
具標記cy5.5的DCPN的合成
將CPN(5μ mol)溶解於DMSO(15mL)，並加入Cy5.5-NHS(GE healthcare)作為配置溶液(10mg/mL，5μ mol，564μ L)。該反應混合物在37℃下攪拌16小時，之後再將MPEG2000-苯甲醛(40μ mol，86mg)加入該溶液中，在相同的條件下達4小時。之後移除DMSO，將粗化合物以SEPHADEXTM G-10管柱予以純化，以甲醇作為沖提液。在減壓條件下以蒸發方式回收DCPN，呈藍色粉末狀。DCPN標記Cy5.5(d-DMSO)之1 H NMR(Varian,400MHz)：d 3.38及3.49(MPEG2000之質子)，6.66(d,br,2H)，7.23(d,br,2H)，8.49(亞胺，s，1H)。
細胞毒性
MDA-MB-231細胞株(生物資源及研究中心，台灣)在37℃、5% CO2 大氣壓下培養於添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中。24孔細胞培養盤以1×105 細胞/孔的密度在37℃下進行培養24小時。培養基根據不同的處理(僅G2 HN2 、卡鉑、順鉑及CPN)以不同的濃度予以替換(三次重複)。試驗進行三天不更換培養基，將覆蓋細胞之培養基移除後，將細胞置於3-(4,5-二甲基塞唑-2基)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT,Sigma,MO,USA)37℃下1小時。經處理後，將MTT甲腊產物(formazan)溶解於DMSO並以傳統酵素免疫判讀基在570nm波長定量。為校正之用，在同樣的條下，另實施24孔盤作為空白試驗。
為確認活體外溶解度，將CPN及巴佛洛霉素(bafilomycin)A1(BA)，一種液泡形式之H+ -ATPase強抑制劑共同處理以進行MDA-MB-231細胞活性試驗。24孔細胞培養盤以1×104 細胞/孔的密度在37℃下培養24小時。已知BA透過破壞粒線體功能可輕易導致細胞死亡。因此，以低濃度BA(≦0.2μM)逐步地改變內體/溶酶體pH值，並縮短處理時間至6小時。將細胞置於0.1μM或0.2μM BA與CPN(45μg/mL)中於37℃下培養達6小時，之後以PBS洗滌。每一孔中加入WST1試劑 (25μL/孔)，將混合物反應達兩小時後進行測定。
細胞凋亡測試
進行細胞凋亡的過程中，使用凋亡測試套組(INVITROGENTM )估計細胞數目。利用螢光顯微鏡，將細胞培養在含有SPNP的培養基之35-mm μ-皿(ibidi)中達不同時間，根據操作指示利用螢光染劑Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)套組染色凋亡細胞。在共焦顯微鏡(Olympus FVI0i)下觀察被染色的細胞。
細胞攝入途徑的分析
將MDA-MB-231細胞置於6孔培養皿中，以1×105 細胞/孔的密度在37℃下培養24小時。將培養基以含有特定胞飲作用抑制劑(氯丙嗪(chloropromazine)10μg/mL或利尿劑阿米洛利(amiloride)1mM或抗黴菌劑寧司泰定(nystatin)25μg/mL)的培養基所取代，並預先培養15分鐘。移除培養基後，再加入含有CPN及抑制劑的培養基。對照組則僅含有CPN。將培養基移除兩小時後，以冰冷的PBS洗滌。胰蛋白酶消化後，收集細胞，以冰冷PBS洗滌兩次後，離心(2000g,4℃,5分鐘)，儲存於-20℃下待分析。為測定細胞的鉑含量，利用Triton X-100溶液(1% w/w)使細胞丸粒予以均質化，稀釋後以感應耦合電漿質譜儀(ICP-MS)進行鉑分析。三次測試後得平均值作為結果。
TUNEL試驗
末端去氧核苷酸轉移酶-調控dUTP斷裂口及標記(TUNEL)試驗係用於凋亡性細胞死亡的原位偵測。將腫瘤組織(4微米厚度)冷凍切片予以回溫至室溫，以PBS洗滌切片三次以去除OCT(一種為冷凍組織所使用之包埋培養基)。根據套組標準程序進行標記。以3,3’-二胺基聯苯胺(DAB,Thermo,S20124-2)染色切片，之後以蘇木紫進行複染，並予以固定在玻璃蓋玻片上以光學顯微鏡進行偵測。
免疫組織化學
腫瘤組織(4微米厚度)冷凍切片予以回溫至室溫下，以PBS(5分鐘/次)洗滌切片三次並以新鮮配置含有4%三聚甲醛之PBS予以固定15分鐘。在4℃下將該固定切片浸於多株兔子抗小鼠活性蛋白酶-3抗體(Abcam Inc.,ab2302,10% BSA或PBS中5μg/mL，50μL)過夜，之後以PBS洗滌(三次，15分鐘/次)，並與過氧化酶共價結合之多株山羊抗兔子抗體(Abcam Inc.,ab6721-200,PBS中以1：500(v/v),100μL/樣本)在室溫下培養兩小時。這些切片先以DAB染色，續以蘇木紫複染，並予以固定在玻璃蓋玻片上以光學顯微鏡進行偵測。
動物模型及腫瘤抑制
七週大雌性Balb/c裸鼠(16-20克)，在24±2℃、50±10%相對濕度條件下，在12小時光照/12小時暗室循環的環境下，自由取用食物及水。每隻小鼠接受皮下注射2×106 細胞以建立乳癌腫瘤模型。利用數位游標卡鉗測量腫瘤的最長(a)及最短(b)直徑，以公式V =0.5a×b2 計算腫瘤體積(V )。當腫瘤體積達大約60mm3 及150mm3 ，分別以IT及IV注射方式投以CPN及DCPN。進行腫瘤抑制的比較功效的研究。小鼠每週一次接受IT注射投以CPN，共達三週。類似地，小鼠每週一次接受IV注射投以DCPN，共達四週。注射量為5微升/克體重，而每2至3天計算腫瘤體積。犧牲小鼠後，收集腫瘤及血液並置於EDTA玻璃管中。
結果
我們使用低代數、胺基終端樹枝狀合物(G2 NH2 )作為籠狀物以捕捉特定幾何陰離子以形成籠狀PN(CPN，圖1A，途徑ii)。該CPN進一步以額外可裂解PEG冠及可標靶分子，諸如iRGD(CRGDKGPDC；SEQ ID NO：1)所修飾，以標靶腫瘤並且釋放毒素對抗惡性細胞，其係脫去外部PEG冠使得抗癌化學療法在腫瘤內部得以運作(圖1B)。
我們選擇G2 NH2 作為籠狀物是因為其生物安全疑慮較低，可限制 該PN大小至原子級並提供適用於胞吞作用。然而，因G2 NH2 具有一似星狀的結構及周圍胺基基團，使得其作為籠狀物仍有挑戰性，因為它傾向於形成大型奈米粒子，而非小型的奈米團簇，且透過周圍胺基與金屬陰離子間的協調交互作用使得該樹枝狀聚合物聚集化。為克服這些限制，使用具不同幾何形狀的兩個陰離子，平面(PtCl4 2- )及八面體(PtCl6 2- )，其係自發地分別與G2 NH2 外部及內部結合。PtCl4 2- 很容易地與G2 NH2 的周圍胺基進行取代反應。PtCl4 2 的親核性置換導致其與G2 NH2 交聯，並因此阻擋陰離子進入G2 NH2 孔(圖1A，途徑i)。經還原反應後，親金屬作用(metallophilic attraction)使得周圍Pt離子傾向於在樹枝狀聚合物的外部形成PN。相反地，具有立體阻礙的八面體陰離子(PtCl6 2- )緩慢地進行取代反應與周圍胺基鍵結，透過三級胺與PtCl6 2- 之間的靜電反應，促進G2 NH2 之內部捕捉，進而形成PN(圖1A，途徑ii)。
使用拉曼光譜儀檢定何種複合物導致取代反應。如圖2A-B所示，PtCl4 2- /G2 NH2 複合物在250cm-1 處有一明顯的帶(band)，可被指定為N-Pt-N彎曲振動，顯示PtCl4 2- 配位體易於遭到G2 NH2 周圍胺基的置換。相反地，PtCl6 2- /G2 NH2 複合物在250cm-1 處則未見顯著的波峰，顯示PtCl6 2- 的立體結構阻礙G2 NH2 配位體置換。此外，TEM測量提供直接的證據顯示這兩種複合物(即PtCl4 2- /G2 NH2 及PtCl6 2- /G2 NH2 )具有其協調上的差異性。顯然地，平面正方形陰離子(PtCl4 2- )可見其在還原前以不同內徑誘導G2 NH2 交聯作用以形成樹枝狀聚合物之聚合體(圖2C)。一旦PtCl4 2- /G2 NH2 複合物經微波處理還原後，可產生PN並沿著樹枝狀聚合物之聚合物的周圍集合(圖2E，白色方塊及箭頭)。相反地，PtCl6 2- /G2 NH2 複合物的TEM影像僅觀察到小型奈米粒子(大概5毫米)(圖2D)，其大小僅略大於單獨的G2 NH2 ，暗示陰離子斥力導致G2 NH2 孔脹大。令人驚奇的是，我們發現當PtCl6 2- /G2 NH2 複合物還原時，在其TEM影像上有幾個類眼狀之奈米粒子(圖2F)。明顯地，PN被籠罩在G2 NH2 中以形成具有約4毫米直徑之類眼狀結構。此外，內部奈米團簇的直徑估計為0.93±0.22nm。因此，我們認為PN如圖1A(途徑ii)所預期的被籠罩在G2 NH2 中。利用陰離子交換層析移除多餘的陰離子型陰離子後，以能量彌散x射線譜儀(EDS)測量CPN。圖5顯示元素Pt的特性波峰，確認PN的存在。
檢測它們在水中的溶解度。相較於CPN，在樹枝狀聚合物之聚集物的周圍聚集的PN表現較差的水溶性(圖7A)。可能是因為周圍胺基被PN聚集所阻擋，因此降低其溶解度。圖7B顯示CPN較PN聚集對癌細胞表現較強的毒性，其可能原因與CPN具有極佳的溶解度，進而最大化癌細胞之胞內吸收作用有關。以CPN處理24小時後的細胞，比起以PN聚集處理的細胞，具有較高之Pt累積(圖7C)。
人類乳癌細胞株DA-MB-231被用來研究為何CPN可以殺死癌細胞。CPN之IC50 值約為37μg/mL，其係高於順鉑(7μg/mL)並略高於卡鉑(35μg/mL)(圖3A)。DA-MB-231細胞分別以CPN及順鉑處理，並接著以annexin V-FITC(一種用於細胞凋亡之綠色染劑)及碘化丙啶(PI，一種用於細胞壞死之紅色染劑)雙重染色，以觀察時間依賴性細胞凋亡與壞死(圖3B)。未經處理的對照組並未發現明顯的螢光反應(左上方圖)。處理組的早期僅自annexin V-FITC發現綠色螢光反應(右上方圖)，此即顯示以CPN處理的DA-MB-231細胞表現細胞凋亡的還原現象。經過長時間的培養後觀察到陽性PI染色(下方圖)，顯示死細胞增加。圖8顯示順鉑誘導細胞死亡的類似結果。CPN誘導細胞死亡的外表型可能與順鉑處理之細胞類似，其機制已知為DNA斷裂。
圖9顯示CPN及順鉑均未表現顯著ROS增加或減少，顯示ROS生成並未參與細胞死亡。再者，若CPN如同大塊Pt的鈍性，那麼不會有 毒性離子溶解。因此我們假設具有約1nm大小的CPN已被氧化以形成腐蝕性PN而進一步被溶解。為證實此一可能性，我們利用x射線光電光譜儀(XPS)檢測表面氧化的程度。圖4A顯示來自CPN之Pt(4f7/2 )的主要波峰在於73.4eV，其係高於Pt奈米粒子(>1nm，大約71.2eV)。這相對而言較高的鍵結能量(即73.4eV)來自Pt氧化物，可能是來自PtO的PN。亦利用XPS檢測O(1s)光譜以粗略估計CPN的氧含量，O(1s)波峰的鍵結能量在於531.8eV，不能被歸於前述研究的數值，因為CPN已被籠在樹枝狀聚合物中而改變O(1s)之鍵結能量。然而，相較於單獨G2 NH2 ，CPN之O(1s)波峰仍有顯著的增加(圖4B)，顯示CPN被氧化。在氧化的狀態下，當CPN被酸性的胞器內化，低pH條件及氯離子可促進CPN之溶解。
我們藉由調整培養溫度以及使用各種專一性抑制劑來檢測CPN內化的途徑。首先，DA-MB-231細胞在37℃下以CPN處理作為對照組(圖4C，第1欄)。其次，當處理溫度調整至冷卻後及冷卻前為4℃時，CPN之攝入分別劇烈地降到~50%(第2欄)及~10%(第3欄)，顯示由能量依賴性途徑，例如內體途徑(endosomal routes)所控制。最後，將細胞與不同胞飲作用抑制劑共同培養，相較於利尿劑阿米洛利(第5欄)及抗黴菌劑寧司泰定(第6欄)，僅氯丙嗪(第4欄)，一種格形蛋白調控胞飲作用之抑制劑，顯著地抑制細胞內CPN的累積。我們認為透過格形蛋白調控胞飲作用(clathrin-dependent endocytosis)，CPN可被攝入至細胞內，其係與單獨PAMAM樹枝狀聚合物的內化途徑一致。我們也發現，CPN之胞內分佈可與溶酶體追蹤共同定位(圖4D)。此即暗示CPN可進入這些酸性內體/溶酶體以進行可能的溶解。為定量Pt離子，將CPN完全溶解於王水(3：1 HCl/HNO3 )作為陽性對照組，另將CPN分別以水(第2欄)、pH值~5之酸性溶液(第3欄)及含有80mM NaCl之pH值~5之酸性溶液(第4 欄)處理。結果發現含有80mM NaCl之pH值~5之酸性溶液中Pt離子量顯著地提昇，顯示CPN具有對pH值敏感的溶解性。為確認活體外溶解度，將MDA-MB-231細胞與0.1μM或0.2μM巴佛洛霉素A1(bafilomycin(BA)，一種液泡形式之H+ -ATPase的強抑制劑)與CPN共同處理。經BA處理後，MDA-MB-231細胞之內體/溶酶體pH值略微增加，原因在於當BA存在時(估計的安全劑量如圖10A所示)，MDA-MB-231細胞表現低容忍度。圖10B顯示CPN誘導的細胞死亡在短時間內可被顯著地逆轉。此即顯示減少內體/溶酶體的酸化現象會破壞Pt的釋放。因此，CPN可預防與生物環境間所產生的預熟交互作用(premature interaction)，以將系統性毒害最小化。
在小鼠身上利用皮下乳癌異種移植，以瘤內(IT)注射方式評估CPN之治療效果。針對不同藥物，例如CPN及順鉑，其最大容忍劑量(MTD)如表一所示。IT注射後，相較於另兩組對照組(PBS及G2 NH2 )，CPN及順鉑表現顯著抑制腫瘤的功效(圖5A-B)。此外，可藉由TUNEL測試偵測到DNA斷裂(圖5C)，即。經CPN及順鉑處理48小時後可見褐色細胞核(TUNEL-陽性染色)；而對照組則呈藍色細胞核(TUNEL-陰性細胞)。我們也使用免疫組織化學分析檢測活性蛋白酶-3以進一步確認CPN殺死癌細胞確實導致細胞凋亡，如同順鉑殺死癌細胞一樣(圖11)。因此，CPN處理的細胞之死亡途徑可能類似於順鉑處理的細胞。我們要確認是否將CPN注射入血管中啟動腫瘤內活化反應，進而達到抗癌化療功效。因此，將CPN額外塗佈可裂解之PEG塗層預防靜脈(i.v.)注射後蛋白質附著形成雙重籠狀PN(DCPN)。DCPN的特徵如圖12所示，且PEG冠在擬腫瘤pH(pH 6.8)情況下自DCPN裂解。為使DCPN具有標靶功能，iRGD腫瘤侵入胜肽及DCPN經IV共同投予給患有乳癌之皮下異種移植裸鼠。每隻小鼠的腫瘤生長至150mm3 ，以促進DCPN傳遞。此外，將DCPN及對照組之一 (G2 NH2 塗佈PEG冠)預先與NIR染劑(cy5.5)接觸，以利於在投予藥物後進行即時追蹤。為利於比較，所有群組包括PBS、G2 NH2 、DCPN及順鉑均共同給予iRGD，以靜脈注射方式給予小鼠達四週。圖5D例示治療後腫瘤有一明顯cy5.5訊號，顯示DCPN腫瘤標靶性。該訊號在第1天注射後4小時後達到平線區，顯示CPN之聚乙烯二醇化會促進血液循環增加腫瘤吸收。相較於肺臟及心臟，cy5.5訊號在肝臟及脾臟相當地微弱，顯示PEG外套膜也會降低DCPN在肝臟中的累積。已知低代數的樹枝狀聚合物(G2 NH2 ,n<5)可輕易地由排尿所排出。在此，在腫瘤及其他器官中的訊號會在第14天逐漸減少，並集中在腎臟。直到第31天，腎臟中的訊號明顯地減少，顯示已被尿液排出。圖13例示不同器官中(腦、心臟、肺臟、肝臟、胰臟及腎臟)殘餘Pt的量少於15%(表二)，顯示DCPN被排出。在7天間隔/週經由IV注射給予相同的劑量(16.6μmol/kg)，圖5E顯示相較於兩組對照組(PBS及G2 NH2 )，DCPN及順鉑確實可以導致腫瘤委縮。而G2 NH2 單獨存在者塗佈可裂解PEG冠亦表現顯著的腫瘤標靶功效(圖14)。不同於給予小鼠投以DCPN，在PN不存在的情形下，腫瘤的生長不會被抑制。再者，我們也觀察在小鼠的副作用，相較於投予順鉑，投予DCPN並未顯著減少小鼠的體重(圖5F)，亦未減少食物的攝取(圖15)。四組連續的組織切片，包括對照組、順鉑、G2 NH2 及DCPN以蘇木紫及曙紅染劑(H&E)於終點染色，進行組織學檢查，將切片進行獨立病理學檢查(圖16)。經治療後，DCPN也會導致細胞壞死，其效應類似順鉑。
表一及二分別例示活體內實驗所用Pt劑量及預估DCPN排出量：
總之，以上所揭示者為特定設計之PN(即CPN)，其係具有腫瘤內活化特性，可將系統性毒害最小化而用於抗癌化療。藉由限制Pt的大小至原子級(0.93±0.22nm直徑)，以賦予其在於奈米級醫藥應用上作為前藥極具吸引力的特性。特定言之，PN易於被氧化，使得其失去內因性化學鈍性，並獲得表面腐蝕性以至於進一步在弱酸性胞器中，例如內體及溶酶體，溶解以釋放毒性Pt離子造成DNA鉑金化(DNA platination)。此途徑的關鍵即在於控制PN的大小。因此，本發明提供一種新穎合成策略，其係基於籠住一特定幾何胺基至G2 NH2 內部。本發明已證實CPN在活體內顯著地抑制腫瘤生長，其係將CPN以pH-可裂解PEG冠予以後修飾，並混合腫瘤導向胜肽，進而在腫瘤內進行活化作用。

Claims (19)

  1. 一種雙重籠狀鉑金奈米團簇複合物，其包含：(a)胺基終端樹枝狀聚合物(dendrimer)或羥基樹枝狀聚合物；(b)包含鉑氧化物之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該樹枝狀聚合物之內；及(c)聚乙二醇(PEG)，其係塗佈於該樹枝狀聚合物的表面。
  2. 如請求項1之複合物，其中該鉑氧化物係選自由PtO、PtOH、PtO2 、Ptx Oy 及其任何組合之群組，其中x及y係各自獨立為一大於0的整數。
  3. 如請求項1之複合物，其中PEG透過希夫鹼(Shiff base)與該樹枝狀聚合物的一級胺共軛。
  4. 如請求項1之複合物，其中該複合物之表面包含對pH反應之鍵結。
  5. 如請求項1之複合物，其進一步包含吸附在樹枝狀聚合物的表面上之腫瘤可辨識性胜肽。
  6. 如請求項1之複合物，其中在pH小於5.0的條件下，該複合物表現釋放Pt2+ 、PtCl4 2- 及/或PtCl6 2- 離子的特徵。
  7. 如請求項1之複合物，其中在pH小於5.0的條件下，該鉑奈米團簇複合物呈現釋放Pt2+ 、PtCl4 2- 及/或PtCl6 2- 離子之溶解力。
  8. 如請求項1之複合物，其中該奈米團簇具有小於1.3nm之平均大小。
  9. 如請求項1之複合物，其中該樹枝狀聚合物係選自由零代(G-0)、一代(G-1)、二代(G-2)及三代(G-3)樹枝狀聚合物所組成之群組。
  10. 一種如請求項1至9中任一項之雙重籠狀鉑奈米團簇複合物於製備抑制腫瘤細胞生長之藥物之用途。
  11. 一種合成如請求項1至9中任一項之雙重籠狀鉑奈米團簇複合物之方法，其包括：(a)混合包含八面體六氯鉑酸鹽陰離子之第一溶劑與包含一胺基終端樹枝狀聚合物或一羥基終端樹枝狀聚合物之第二溶劑，以形成包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物之混合物；(b)將該包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物的混合物培養過夜；(c)還原PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物中之PtCl6 2- 陰離子，以形成包含樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之混合物；(d)將包含該樹枝狀聚合物包圍鉑之奈米團簇複合物之混合物通過過濾器，以得到包含該樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之濾液；(e)冷凍乾燥該過濾液以得到樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物；(f)溶解該樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物於溶液中以形成溶液；(g)當該樹枝狀聚合物為胺基終端，加入PEG-醛至該溶液中；或當該樹枝狀聚合物為羥基終端，加入PEG-NH2 至該溶液中；及(h)使PEG-醛與該胺基終端樹枝狀聚合物的一級胺進行反應；或使PEG-NH2 與羥基終端樹枝狀聚合物進行反應，並藉此獲得該雙重籠狀鉑奈米團簇複合物。
  12. 一種籠狀鉑奈米團簇複合物，其包含：(a)胺基終端樹枝狀聚合物；及(b)包含鉑氧化物及具有平均直徑為0.93nm而標準差為0.22nm 之鉑奈米團簇，該鉑奈米團簇係被限制在該胺基端樹枝狀聚合物之內。
  13. 一種合成如請求項12之複合物之方法，其包括：(a)混合包含八面體六氯鉑酸鹽陰離子之第一溶劑與包含一胺基終端樹枝狀聚合物或一羥基終端樹枝狀聚合物之第二溶劑，以形成包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物之混合物；(b)將該包含PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物複合物的混合物培養過夜；(c)還原PtCl6 2- 陰離子/樹枝狀聚合物中之PtCl6 2- 陰離子，以形成包含樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之混合物；(d)將包含該樹枝狀聚合物包圍鉑之奈米團簇複合物之混合物通過過濾器，以得到包含該樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物之濾液；及(e)冷凍乾燥該過濾液以得到樹枝狀聚合物籠罩鉑之奈米團簇複合物。
  14. 如請求項11或13之方法，其中該還原步驟係藉由微波輻射進行。
  15. 如請求項11或13之方法，其中該培養步驟係於室溫下過夜培養進行。
  16. 如請求項11或13之方法，其中步驟(e)進一步包括純化樹枝狀聚合物籠狀鉑奈米團簇複合物，其係藉由自其中移除多餘的PtCl6 2- 所而進行。
  17. 如請求項1至9及12中任一項之複合物，其中該樹枝狀聚合物係聚醯胺(PAMAM)樹枝狀聚合物。
  18. 如請求項1至9及12中任一項之複合物，其係不含六氯鉑酸鹽及/ 或四氯鉑酸鹽陰離子。
  19. 如請求項1至9及12中任一項之複合物，其中該複合物對癌細胞呈現細胞毒性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI594794B (zh) * 2015-01-26 2017-08-11 國立臺灣科技大學 催化性的中孔徑多孔奈米複合材料、其製備方法及應用
TWI601534B (zh) * 2016-03-03 2017-10-11 財團法人國家衛生研究院 內毒素奈米微粒：親水性奈米金控制內毒素聚集結構形成奈米微粒進而調節免疫反應
CN111848471A (zh) * 2016-08-05 2020-10-30 深圳深见医药科技有限公司 含金团簇的物质在制备预防和治疗帕金森症药物中的应用
AU2018205349B2 (en) * 2017-01-09 2022-09-29 The Curators Of The University Of Missouri Targeted doxorubicin-gold nanoconjugates for tumor therapy
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Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5317031B2 (ja) * 2008-05-07 2013-10-16 公立大学法人大阪府立大学 ヘッド−テイル型共重合体の中空ナノ微粒子
EP2130553A1 (en) * 2008-06-05 2009-12-09 Nanobiotix Inorganic nanoparticles of high density to destroy cells in-vivo
CN109293927A (zh) * 2009-02-04 2019-02-01 布里格姆及妇女医院股份有限公司 纳米级铂化合物及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Zhu Huizhen. "Applications of polyamidoamine dendrimers in polymer electrolyte membrane fuel cells." 2009. *

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