KR20150119417A - 항암 화학치료제를 위한 케이지된 백금 나노클러스터 - Google Patents

항암 화학치료제를 위한 케이지된 백금 나노클러스터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다. 상기 착물은 (a) 아민-말단화된 덴드리머; 및 (b) 산화백금을 포함하고 상기 아민-말단화된 덴드리머 내부에 국한되어 있는 백금 나노클러스터를 포함한다. 상기 착물은 암 세포에 대해 세포독성을 나타낸다. 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물이 또한 기재되어 있고, 이는 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물의 표면상에 피복된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 상기 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물은 이의 표면상에 pH-민감성 결합을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 착물을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항암 화학치료제를 위한 케이지된 백금 나노클러스터{CAGED PLATINUM NANOCLUSTERS FOR ANTICANCER CHEMOTHERAPEUTICS}
본 발명은 항암 화학치료제에 관한 것이다.
단순히 물에 의해 활성화되는 시스플라틴의 독성과 달리, Pt는 초기에 산화하고 이어서 Pt를 용해시켜 염화백금 착물을 형성하는 왕수(aqua regia)(HNO3/HCl)와 같은 고도로 부식성 제제에서만 용해할 수 있는 귀금속인 것으로 고려된다. 최근에 산화도는 Pt 크기를 감소시켜 표면 대 용적 비율을 증가시킴으로써 산소 흡착시켜 표면 부식에 대한 물 산화를 촉진시킴에 의해 상당히 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, Pt를 효율적으로 수축시키는 방법에 대한 모색이 여전히 도전 과제로 남아있다.
발명의 요약
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 덴드리머; (b) 산화백금을 포함하고 상기 덴드리머 내부에 국한되어 있는 백금 나노클러스터; 및 (c) 상기 덴드리머 표면상에 피복된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 이중-케이지된(double-caged) 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다. 상기 덴드리머는 된 덴드리머일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 아민-말단화된 덴드리머; 및 (b) 산화백금을 포함하고 표준 편차가 0.22nm인 0.93nm의 평균 직경을 가지며 상기 아민-말단화된 덴드리머 내부에 국한되어 있는 백금 나노클러스터를 포함하는, 케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다.
추가로, 또 다른 양상에서, 본 발명은,
(a) 8면체 헥사클로로플라티네이트 음이온을 포함하는 제1 용액을 아민-말단화된 덴드리머 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 PtCl6 2- 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
(b) 충분한 기간동안 PtCl6 2- 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 항온처리하는 단계;
(c) PtCl6 2- 음이온/덴드리머 착물 중에서 PtCl6 2- 음이온을 환원시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
(d) 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스 착물을 필터에 통과시켜 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 여과물을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 여과물을 동결 건조시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계
를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 합성하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가로, 또 다른 양상에서, 본 발명은
(i) (a) 아민-말단화된 덴드리머 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머; 및
(b) 상기 아민-말단화된 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머의 내부에 국한되어 있는, 산화백금을 포함하는 백금 나노클러스터를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 용매중에 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
(ii) 상기 덴드리머가 아민-말단화된 경우 PEG-알데하이드를 상기 용액에 첨가하거나 상기 덴드리머가 하이드록실-말단화된 경우 상기 용액에 PEG-NH2를 첨가하는 단계; 및
(iii) 상기 PEG-알데하이드를 아민-말단화된 덴드리머의 1급 아민과 반응시키거나, 상기 PEG-NH2를 상기 하이드록실-말단화된 덴드리머와 반응시켜 이중 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계
를 포함하는, 이중 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 합성하기 위한 방법에 관한 것이다.
추가로, 또 다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 세포 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에 있어서 상기 언급된 바와 같은 케이지된 백금 나노클러스터 착물 또는 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 세포를 억제하는데 사용하기 위한 상기 언급된 바와 같은 케이지된 백금 나노클러스터 착물 또는 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다.
그러나, 또 다른 양상에서, 본 발명은
(a) 상기 언급된 바와 같은 치료학적 유효량의 착물; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이들 및 다른 양상은 하기의 도면과 연계하여 취해진 바람직한 실시형태의 하기의 기재로부터 명백해질 것이다. 첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 설명하고, 서술된 기재와 함께 본 발명의 원리를 설명하기 위해 제공된다. 가능한한, 하나의 실시형태의 동일하거나 유사한 요소들을 언급하기 위해 도면 전반에 걸쳐 동일한 참조 번호를 사용한다.
도 1a는 PN의 형성을 위한 튜닝 음이온성 기하학적 구조를 기초로 하는 신규 전략에 대한 도식적 설명이고; 경로 (i) 및 (ii)는 G2NH2의 외측 및 내측이 각각 사각 평판 PtCl4 2 - 및 8면체 PtCl6 2 -과 선택적으로 연합할 수 있음을 보여준다.
도 1b는 종양-내부 활성화를 발휘하도록 외측 PEG 코로나를 쉐딩함에 의해 종양을 표적화하여 악성 세포를 사멸시키도록 종양 침투 펩타이드와 혼합된 케이지된 PN의 도식적 설명이다. 항암 효능의 주요 요지는 약산성 기관에서 이의 분해가 나타나도록 이의 고유 불활성(적색 삼각형의 삽도)을 상실시키는 PN을 기초로 하였다.
도 2a-b는 PtCl4 2 -/G2NH2 착물(A) 및 PtCl6 2 -/G2NH2 착물(B)의 라만 스펙트럼을 보여주고, 이는 상기 전자 착물로부터 N-Pt-N 입체배좌를 보여준다.
도 2c-d는 환원전 PtCl4 2 -/G2NH2 착물(C) 및 PtCl6 2 -/G2NH2 착물(D)의 HRTEM 이미지를 보여준다.
도 2e-f는 (C) 및 (D)의 착물이 환원되었지만, PN는 G2NH2 외측 (E) 및 내측 (F)내에 케이지됨을 보여준다. 모든 TEM 샘플은 측정 2일 전에 새롭게 제조하였고 제조된 바와 같은 샘플을 자연 건조시켰다. 모든 측정은 음성 염색 부재하에 수행되었다.
도 3a는 CPN의 IC50이 시스플라틴 및 카보플라틴 둘다의 IC50 보다 높았음을 보여준다. 확대된 삽도는 0 내지 50㎍/mL 범위의 보다 낮은 농도를 보여준다.
도 3b는 세포사의 경로를 관찰하기 위한 현미경 이미지이다. 비처리되거나 상이한 시간동안 대략 50㎍/mL에서 CPN으로 처리된 MDA-MB-231 세포는 어넥신 V-FITC 및 PI로 이중 염색시켰다. 좌측에서 우측으로의 상부 패널은 각각 5시간동안 비처리된 세포 및 CPN으로 처리된 세포를 보여준다. 상기 하부 패널은 각각 10시간 및 24시간 동안 CPN으로 처리된 세포를 보여준다. 스케일 막대: 30㎛.
도 4a-b는 Pt(A) 및 산소(B)의 결합 에너지를 보여주는 XPS 스펙트럼이고, 특별히 (A)에서 제공된 것은 CPN 및 Pt 나노입자의 Pt(4f7/2) 및 Pt(4f5/2) 영역이다. 상기 별표는 CPN의 결합 에너지가 73.4 eV로 전환되었음을 지적한다. 상기 결합 에너지는 내부 표준으로서 기질상에 침적된 골드 필름의 Au 4f7 /2 (83.7eV) 피크에 의해 계산되었다.
도 4c는 CPN의 내재화 경로를 입증하기 위해 세포 취득 동안에 사용되는 다양한 세포내이입 억제제를 보여준다.
도 4d는 MDA-MB-231 세포에 대한 CPN의 세포 취득 거동의 공초점 현미경을 보여주고; CPN은 가시화(녹색) 및 리소좀 트랙커(적색)를 위해 FITC로 표지시켰고 CPN 및 리소좀 트랙커의 동시 위치화는 황색이었다. 상기 세포 형태는 CPN 독성으로 인해 변화하였다.
도 4e는 ICP-MS에 의해 결정된 바와 같이 엔도좀-모방 환경하에 본 발명의 CPN이 이온 형태로 Pt가 용해됨을 보여준다이. 상기 CPN은 대조군으로서 왕수(3:1 HCl/HNO3)에 용해시켰다.
도 5a-f는 각각 IT 및 IV 주사 후 평가된 CPN(A-C) 및 DCPN(D-F)의 항암 치료학적 효과를 보여준다. A) 및 E) 연속 종양 용적, B) 각각의 그룹에 대한 종점에서 종양 크기의 대표적인 이미지, C) 아폽토시스 세포사는 TUNEL 검정을 사용하여 관찰되었고(스케일 막대: 20㎛), D) 종양 표적, 및 F) 체중이 기록되었다. 종양을 갖는 누드 마우스의 크기는 IT 및 IV 주사 동안 각각 대략 60mm3 및 150mm3에 도달하였다. 상기 동물 모델은 치료 2개 세트로 처리하였고 이는 IT 주사(PBS, G2NH2, CPN 및 시스플라틴) 및 IV 주사(PBS, G2NH2, iRGD, DCPN 및 시스플라틴)를 포함했다. IT에서 G2NH2 및 IV에서 단독의 iRGD의 프로필은 복잡합 그래프를 회피하기 위해 누락시켰다. 마우스의 종양 용적 및 체중은 지정된 날에 측정하였다. 각각의 데이타 포인트는 약물 주사 후 평균 종양 용적(n=5, P<0.05 및 n.s는 어떠한 통계학적 유의성을 나타내지 않았다)에서의 상대적 변화를 나타내고; 오착 막대는 SD를 나타낸다. 주사 시간은 검정 화살표로 표지한다.
도 6은 CPN의 EDS 스펙트럼을 보여준다. 화살표는 Pt 시그날을 나타낸다.
도 7a-c는 CPN과 PN 어셈블리의 성질 비교를 보여준다. 이들 물질은 음이온 기하학적 구조를 튜닝시킴에 의해 제조하였다. A) 용해도 제공. B) 세포독성 평가. C) 세포내 취득 효능.
도 8a-d는 시스플라틴-유도된 세포사 및 CPN-유도된 세포사 경로를 비교하기 위한 현미경 이미지이다. 비처리되거나 상이한 시간동안 30㎍/mL의 시스플라틴으로 처리된 MDA-MB-231 세포는 어넥신 V-FITC 및 PI로 이중 염색시켰다. 좌측에서 우측으로 상부 패널은 각각 비처리된 세포(A) 및 5시간동안 시스플라틴으로 처리된 세포(B)를 보여준다. 하부 패널은 각각 10시간(C) 및 24시간(D) 동안 CPN으로 처리된 세포를 보여준다. 스케일 막대: 50㎛.
도 9는 CPN의 ROS 생성을 보여준다. MDA-MB-231 세포주는 37℃에서 5% CO2 대기하에 RPMI 1640 배지(배지에 10% 태아 소 혈청을 보충하였다)에서 배양하였다. 상기 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1 x 105 세포로 접종하고 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 이어서, 배양 배지는 배양 배지내 G2NH2 단독, CPN, 시스플라틴 및 0.03% H2O2를 포함하는 다양한 치료의 존재로 변화시켰다. 상기 시험은 배지를 변화시키는 것 없이 3시간동안 수행하였다. 세포 배양 배지의 상등액을 제거한 후, 상기 세포는 INVITROGENTM으로부터 CM-H2DCFDA를 사용하는 ROS 검정을 위해 분리하였다.
도 10a는 BA의 평가된 안전한 용량 및 치료 시간을 보여준다. 상기 BA는 또한 미토콘드리아 기능을 손상시킴을 통해 MDA-MB-231 세포가 용이하게 사멸하도록 하는 것으로 널리 공지되어 있음을 주목할만하다. 따라서, BA의 농도 및 치료 시간은 각각 최소화하고 단축시켜 억제제 및 CPN의 공동상승작용 효과로 인한 세포사를 회피하여 CPN 치료 동안에 BA의 존재 및 부재간의 어떠한 유의적 차이가 없도록 해야한다.
도 1Ob는 CPN 세포 독성에 대한 엔도좀/리소좀 pH-상승 효과를 보여준다.
도 11은 활성 카스파제-3 면역염색에 의해 관찰된 CPN에 의해 유도된 아폽토시스 세포사를 보여준다. 스케일 막대: 20㎛.
도 12a-c는 DCPN 및 이의 전구체로부터 1H NMR을 보여준다.
도 13은 종점 후 CPN의 생물-제거를 보여준다.
도 14는 절단 가능한 PEG로 피복된 G2NH2의 종양 표적화 및 항암 화학치료제에서 비교 효율을 보여준다. 종양 억제에서 어떠한 유의적인 효능은 검출되지 않았다. 종점에서 상기 종양 질량은 개시점에서 보다 훨씬 컸다.
도 15는 기록된 바와 같이 마우스의 음식물 섭취를 보여준다. 각각의 데이타 포인트는 약물 주사 후 각각의 케이지(n=5)에서 총 음식물 섭취량을 나타낸다.
도 16a-d는 절단된 종양에서 비교 조직학적 H&E 염색을 보여준다. 이미지 A) - D), 400배 확대에서 PBS, G2NH2, DCPN, 및 시스플라틴을 포함하는 다양한 치료.
본 발명은 수많은 변형 및 변화가 당업자에게 자명할 것이기 때문에 단지 설명하기 위한 것으로 의도된 하기의 실시예에 보다 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 다양한 양태가 지금부터 보다 상세하게 기재된다. 도면을 참조로, 도시된 것 전반에 걸쳐 유사 번호는 유사 구성원을 지적한다. 본원에 기재에서 사용되고 하기의 청구 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 "a", "an", 및 '"the"의 의미는 문단에서 달리 명백하게 기재하고 있지 않는 경우 복수 언급을 포함한다. 또한, 본원의 기재 및 하기 청구항 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 "in"의 의미는 문단에 달리 명백하게 기재하고 있지 않는 경우 "in" 및 "on"을 포함한다. 더욱이, 표제 또는 부표제는 검토자들의 편의를 위해 명세서에 제공될 수 있고 이는 본 발명의 범위에 어떠한 영향을 미치지 않는다. 추가로, 본원 명세서에 사용된 일부 용어는 하기에서 보다 구체적으로 정의된다.
정의
본원 명세서 사용된 용어는 일반적으로, 본 발명의 문단내 및 각각의 용어가 사용된 특정 문단에서 당업계의 통상적인 의미를 갖는다. 본 발명을 기재하기 위해 사용된 특정 용어는 본 발명의 기재에 관하여 당업자에게 추가의 지침을 제공하기 위해 하기에서 또는 본원 명세서의 그밖의 다른 곳에서 논의된다. 편의를 위해, 특정 용어는 예를 들어, 이탤릭 및/또는 인용 마크를 사용하여 강조될 수 있다. 상기 강조의 사용은 용어의 범위 및 의미에 어떠한 영향을 미치지 않고; 용어의 범위 및 의미는 이것이 강조되는지에 상관없이 동일한 문단에서 동일하다. 동일한 것이 한가지 이상의 방식으로 표기될 수 있음을 인지할 것이다. 결과적으로, 또 다른 용어 및 동의어는 본원에 논의된 임의의 하나 이상의 용어에 대해 사용될 수 있고, 용어가 본원에서 자세히 설명되거나 논의되는지에 상관없이 어떠한 특별한 유의성이 부과되지 않는다. 특정 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어의 인용은 다른 동의어의 사용을 배제하지 않는다. 본원에 논의된 임의의 용어의 예시를 포함하는 본 명세서에서 어느 위치에서의 예시의 사용은 단지 설명을 위한 것이고 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위 및 의미 또는 임의의 예시된 용어의 범위 및 의미를 제한하지 않는다. 또한, 본 발명은 본원 명세서에 주어진 다양한 실시형태로 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 발생하는 경우, 정의를 포함하는 본원의 내용을 조절할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약(around)", "약(about)" 또는 "대략적으로(approximately)"는 소정의 값 또는 범위에 대해 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내 및 보다 바림작하게는 5% 이내를 의미한다. 본원에 주어진 수치적 양은 대략적인 것이고 상기 용어 "약(around)", "약(about)" 또는 대략적으로"는 명백하게 진술되지 않는 경우, 추론될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "나노클러스터"는 직경이 2nm 보다 작거나 100개 미만의 원자로 이루어진 입자를 언급한다.
헥사클로로플라티네이트 음이온은 화학식 [PtCl6]2-을 갖는다.
덴드리머는 반복적으로 측쇄화된 분자이다. 덴드리머는 전형적으로 코어 주변에서 대칭이고 흔히 구형 3차원 형태를 채택한다. 덴드리머는 또한 이의 합성 동안에 수행되는 반복적인 측쇄화 사이클 수를 언급하는 생성에 의해 분류된다. 예를 들어, 덴드리머가 집중적 합성에 의해 제조되고 측쇄화 반응이 코어 분자상에서 3회 수행되는 경우, 상기 수득한 덴드리머는 제3 생성 덴드리머인 것으로 간주된다. 각각의 연속적 생성은 이전 생성의 분자량의 대략 2배의 덴드리머를 유도한다. 제1, 제2 및 제3 생성 덴드리머는 각각 생성-1(G-1), 생성-2 (G-2) 및 생성-3 (G-3) 덴드리머로서 지정한다.
상기 용어 "케이지된"은 케이지 내부에 또는 내부에 있는 것 처럼 놓이거나 국한된 것을 언급한다.
상기 용어 " 쉬프 염기(Schiff base)"는 이민 기능성 그룹을 언급한다. 쉬프 염기는 알데하이드 또는 케톤의 카보닐 그룹과 아민 그룹의 축합으로부터 형성된다.
상기 용어 "용해도"는 파괴거나, 붕괴되거나 용해되는 것을 언급한다.
상기 용어 "국한된", "포집된". "케이지된" 및 "포획된"은 모두 상호교환가능하다.
여과물은 여과 과정 후 필터를 통과하여 통(can)에 수거되는 유체/액체이다.
덴드리머의 말단 그룹은 또한 일반적으로, 덴드리머의 "말단 그룹" 또는 "표면 그룹"으로 언급된다. 아민 말단 그룹을 갖는 덴드리머는 "아미노-말단화된 덴드리머"로 호칭된다.
iRGD는 암성 종양을 특이적으로 인지하여 암성 종양을 침투하지만 정상 조직에 대해서는 그렇지 않은 펩타이드(아미노산의 쇄)이다. 상기 펩타이드는 또한 진단학적 입자 및 약물을 종양으로 전달하는 것으로 나타났다. iRGD는 암 검출 및 치료 둘다를 급격히 증진시킬 수 있다. iRGD는 통시 투여된 약물이 종양 조직으로 깊게 침투하도록 도와준다. 상기 펩타이드는 마우스에서 사람 유방암, 전립선암 및 췌장암에 대한 치료 효능을 실질적으로 증가시켜 많은 약물의 3분의 1로 정상의 용량과 동일한 치료학적 효과를 달성한다. MPEG (메톡시 폴리에틸렌 글리콜).
상기 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질환, 이의 증상 또는 이에 대한 성향을 치유, 완화, 경감, 처치, 개선 또는 예방할 목적으로 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 치료학적 제제의 투여를 언급한다. 상기 대상체는 임의의 적합한 진단학적 방법으로부터의 결과를 토대로 건강 케어 전문의에 의해 확인될 수 있다.
"유효량"은 치료받은 대상체에 대해 치료학적 효과를 부여하기 위해 요구되는 활성 제제의 양을 언급한다. 유효량은 투여 경로, 부형제 용법, 및 다른 치료학적 치료제와 동시 용법의 가능성에 의존하여 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 다양할 것이다.
유리된 Pt를 계산하기 위해: CPN내 유리된 Pt의 양 = 14.4μmol/kg x 35 원자들/1nm. 따라서, IT 투여된 유리된 Pt는 504μmol/kg이다. DCPN내 유리된 Pt의 양은 16.6μmol/kg x 35 원자들/1nm이다. 따라서, IV 투여된 유리된 Pt는 581μmol/kg이다.
"성인 건강한 지원자에서 치료제를 위한 임상적 시험에서 안전한 초기 용량을 평가하는 산업 및 검토자들을 위한 지침"은 미국 건강 및 사람 서비스 식약품 투여 부서에 의해 공개되었고 "사람 등가 용량"이 하기식으로부터의 계산에 의해 수득될 수 있음을 기재하고 있다:
HED = mg/kg의 동물 용량 x (kg의 동물 체중/kg의 사람 체중)0.33
HED는 투여 경로와 같은 다른 인자들에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, DCPN i.v. 투여를 위해, 마우스(20g BW) 용량이 16.6μmol/kg인 경우, HED는 16.6μmol/kg x (0.02/환자의 체중)0.33로서 계산될 수 있다. CPN IT 주사를 위해, 마우스 용량이 7.5 mg/kg인 경우, HED는 7.5mg/kg x (0.02/환자의 체중)0.33이다.
부식성 PN은 부식성 PN이 후속적 용해가 가능하도록 화학적 반응(도 1, 적색 삼각형) 후 신속하게 제조될 수 있다. 상기 용해율은 클로라이드 이온에 의해 가속화될 수 있다. 본원 발명자는 세포내 산성 기관(즉, 엔도좀 및 리소좀)은 DNA 백금화를 위해 부식성 PN의 용해를 개시하기 위해 양성자 공급 및 클로라이드 이온을 갖는 것으로 추정하였다. 그러나, Pt를 효율적으로 수축시키는 방법의 모색이 여전히 도전 과제로 남아있다. 본원 발명자는 케이지된 PN(CPN, 도 1a)의 형성을 위해 특이적으로 기하학적 구조의 음이온을 포집하기 위한 케이지로서 낮은 생성 및 아민 말단화된 덴드리머(G2NH2)의 사용을 기초로 하는 단순한 전략을 개발하였다. 상기 부식능이 제공되면, CPN은 항암 화학치료를 위한 종양 내부 활성화를 발휘하기 위해 외측 PEG 코로나를 쉐딩함에 의해 악성 세포에 대하여 종양을 표적화하고 독소를 방출할 수 있는 iRGD와 같은 여분의 절단가능한 PEG 코로나 및 표적화할 수 있는 분자로 변형시켰다(도 1b) (문헌참조: Chien et al. "Caged Pt Nanoclusters Exhibiting Corrodibility to Exert Tumor-Inside Activation for Anticancer Chemotherapeutics" Advanced Materials, 2013, 25, 5067-5073).
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) 덴드리머; (b) 덴드리머의 내부에 국한된, 산화백금을 포함하는 백금 나노클러스터; 및 (c) 덴드리머의 표면상에 피복된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함하는, 이중 케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다. 상기 덴드리머는 아민-말단화된 덴드리머일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 아민-말단화된 덴드리머; 및 (b) 산화백금을 포함하고, 표준 편차가 0.22nm인 0.93nm의 평균 직경을 가지며 아민-말단화된 덴드리머의 내부에 국한된 백금 나노클러스터를 포함하는, 케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 산화백금은 PtO, PtOH, PtO2, PtxOy, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, x 및 y는 각각 독립적으로 0 보다 큰 정수이다, 상기 언급된 바와 같은 착물은 어떠한 덴드리머 응집체를 포함하지 않고 암 세포에 대해 세포독성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, PEG는 쉬프 염기를 통해 아민-말단화된 덴드리머의 1급 아민에 접합시킨다. 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물의 표면은 pH 응답성, 또는 민감성, 결합(이중 결합과 같은)을 포함한다. pH 응답성 결합은 단일 케이지된 백금 나노클러스터 착물(즉, 이의 표면상에 PEG 피복 없이, 아민 말단화된 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물)을 제공하는 산성 조건하에 붕괴 및 용해 특성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물은 눈-형태의 외관을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물은 pH가 5.0 미만인 조건하에서 Pt2 -, PtCl4 2 -, 및/또는 PtCl6 2 - 이온을 방출하는 특성을 나타낸다. 상기 백금 나노클러스터는 pH가 5.0 미만인 조건하에서 용해능을 나타낸다.
추가로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 나노클러스터는 2nm 미만의 직경을 갖는다. 대안적으로, 상기 나노클러스터는 3nm 미만의 직경을 갖는 구형 형태를 갖는다.
추가로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머이다. 싱기 언급된 바와 같은 착물은 덴드리머의 표면상으로 흡수된 종양-침투 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 iRGD(CRGDKGPDC; 서열번호 1)일 수 있다.
추가로, 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 덴드리머는 생성-0(GO), 생성-1(G-1), 생성-2(G-2) 및 생성-3(G-3) 덴드리머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가로, 본 발명의 추가의 실시형태에서, 상기 언급된 바와 같은 착물은 헥사클로로플라티네이트 및/또는 테트라클로로플라티네이트 음이온이 없다.
추가로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 아민-말단화된 덴드리머의 표면 또는 외측은 어떠한 백금 나노클러스터를 포함하지 않는다.
추가로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 케이지된 백금 나노클러스터 착물은,
(a) 아민 말단화된 덴드리머; 및
(b) 산화백금을 포함하고 아민 말단화된 덴드리머의 내부(내측)에 국한된 백금 나노클러스터로 이루어지거나 필수적으로 이루어진다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 세포 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에 있어서 상기 언급된 바와 같은 케이지된, 또는 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 세포 성장을 억제하는데 사용하기 위한 상기 언급된 바와 같은 케이지된 또는 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물에 관한 것이다. 종양 세포 성장을 억제하는데 사용되는 경우, 상기 언급된 바와 같은 유효량의 착물이 대상체에게 투여된다. 상기 종양 세포는 유방암 세포일 수 있거나 상기 대상체는 유방암을 앓을 수 있다.
추가로, 또 다른 양상에서, 본 발명은,
(a) 상기 언급된 바와 같은 치료학적 유효량의 착물; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 담체
를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가로, 또 다른 양상에서, 본 발명은,
(a) 8면체 헥사클로로플라티네이트 음이온을 포함하는 제1 용액을 아민-말단화된 덴드리머 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계:
(b) 상기 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 상기 혼합물을 충분한 기간 동안 항온처리하는 단계;
(c) 상기 PtCl6 2- 음이온/덴드리머 착물 중의 상기 PtCl6 2- 음이온을 환원시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
(d) 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 상기 혼합물을 필터에 통과시켜 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 여과물을 수득하는 단계; 및
(e) 여과물을 동결 건조시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 언급된 바와 같이 케이지된 플라티늄 나노클러스터 착물을 합성하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은,
(i) 용매 중에 상기 언급된 바와 같은 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 용해시켜 용액을 형성하는 단계로서, 상기 착물이,
(a) 아민-말단화된 덴드리머 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머; 및
(b) 상기 아민-말단화된 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머의 내부에 국한된 산화백금을 포함하는 백금 나노클러스터를 포함하는, 단계; 및
(ii) 상기 착물이 상기 아민-말단화된 덴드리머를 포함하는 경우 PEG-알데하이드를 상기 용액에 첨가하거나, 상기 착물이 하이드록실-말단화된 덴드리머를 포함하는 경우 PEG-NH2를 첨가하는 단계; 및
(iii) 상기 PEG-알데하이드가 상기 아민-말단화된 덴드리머의 1급 아민과 반응하도록 하거나, PEG-NH2가 하이드록실-말단화된 덴드리머와 반응하도록 하여 이중 케이지된 나노클러스터 착물을 수득하는 단계를 포함하는, 이중 케이지된 백금 나노클러스터 복합체를 합성하기 위한 방법에 관한 것이다.
단계 (a), (b) 또는 (c)에서 언급된 상기 혼합물은 은 이온, 질산화은 또는 NaBH4가 없거나 포함하지 않는다.
착물을 합성하기 위한 상기 언급된 방법은 착물로부터 과량의 PtCl6 2-를 제거함에 의해 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 환원 단계는 마이크로파로 조사함에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 항온처리 단계는 밤새 실온에서 수행된다.
실시예
본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것 없이, 본 발명의 실시형태에 따른 예시적 기구, 장치, 방법 및 관련 결과는 하기에 제공된다. 표제 또는 부제는 검토자의 편의를 위해 실시예에 사용될 수 있고 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하지 말아야 함을 주지한다. 더욱이, 특정 이론이 본원에서 제안되고 기재되지만 어떠한 방식으로든지 이들은 옳든 그릇되건 상관 없이 발명이 어떠한 특정 이론 또는 작용 기획과 관련 없이 본 발명에 따라 수행될 수 있는 한 본 발명의 범위를 제한하지 말아야 한다.
방법:
CPN의 합성 및 특징 분석. H2PtCl6(Acros, 200㎕, 30μmol, 150mM), 및 K2PtCl4(UoiRegion Bio-Tech, 200㎕, 300μmol, 15OmM)은 각각 G2NH2 또는 G2OH 또는 G2COOH(Aidrich, 94,7㎕, 5 μmol, 20 wt% 메탄올 용액)를 함유하는 탈이온수 20mL에 첨가하였다. G2NH2 또는 G2OH 또는 G2COOH와 H2PtCl6 또는 K2PtCl4의 혼합물은 마이크로파(CEM, Discver LabMate System, 300W/120℃ 및 30분)로 조사하기 전에 밤새 실온에서 항온처리하였다. 환원 후, 침전된 대형 백금 나노입자는 0.22㎛ 막 필터(Millipore, PES 막, 백금 나노클러스에 대하여)를 통해 여과하였다. 상기 용액은 추가의 정제를 위해 동결 건조시키고 이어서 약 1mL의 물에 용해시켜야 한다. 여분의 음이온(PtCl6 2 - 및 PtCl4 2 -)을 추가로 제거하기 위해, 음이온 교환 크로마토그래피(Merck, Fractogel EMD TMAE Hicap)를 사용하여 정제된 CPN 및 PN 응집물을 수득하였다. 고-해상도 전송 전자 현미경(HRTEM, JEOL-2010)을 사용하여 CPN 및 PN 어셈블리의 크기를 확인하였다.
MPEG200 - 접합된 벤즈알데하이드의 합성. P-포밀벤조산(TCI. 10당량, 5mmol, 751mg)을 실온에서 디클로로메탄(20mL) 중에 용해시키고 DCC(Acros. N,N'-디사이클로헥실카보디이미드, 10당량, 5mmol, 1g), MPEG2000(aldrieh, 0.5mmol, 1g), 및 DMAP(Alfa, 4-디메틸아미노피리딘, 2.5당량, 1.25 mmol. 1.50 mg)을 연속으로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반시켰다. 상기 염을 여과 제거하고 여과물을 농축시키고, 이소프로판올(20ml) 중에 용해시키고, 2시간동안 0℃로 냉각하였다. 상기 수득한 결정은 여과 수거하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 상기 조 생성물을 테트라하이드로푸란 중에 용해시키고 디에틸 에테르에 적가하였다. 상기 침전물은 디에틸 에테르로 2회 세척하고, MPEG2000-벤즈알데하이드는 감압하에 증발시켜 백색 분말로서 회수하였다. MPEG2000-벤즈알데하이드(CDCl3)의 1H NMR (Varian 400 MHz): d 3.64 (PEG2000의 양성자). 7.96 (d, 2H), 8.22 (d, 2H), 10.11 (알데하이드, s, 1H).
DCPN의 합성. CPN (5μmol)을 DMSO(15mL)에 용해시키고, MPEG2000-벤즈알데하이드(40μmol, 86mg, 상기 언급된 단계에 의해 제조됨) 또는 MPEG200O-NH2(40μmol, 86 mg, 상업적으로 시판됨)을 CPN을 함유하는 용액에 첨가하고 각각 37℃에서 4시간동안 G2NH2 및 G2OH에 의해 케이징시킨다. CPN은 G2OH 및 G2COOH로부터 유래되고 하이드록실/카복실레이트-말단화된 그룹은 쉬프 염기를 통한 MPEG2000-NH2의 반응을 위해 알데하이드-말단화된 그룹으로 부분적으로 전환시킬 수 있다. 이어서, DMSO를 제거하고, 조 화합물은 용출제로서 메탄올을 사용하는 SEPHADEXTMG-10 칼럼에 의해 정제하였다. 상기 DCPN은 감압하에 증발시켜 청색 분말로서 회수하였다. DCPN(d-DMSO)의 1H NMR (Varian, 400 MHz): d 3.50 & 3.60 (MPEG2000의 양성자), 6.76 (d, br, 2H), 7.29 (d, br, 2H), 8.47 (이민, s, 1H).
cy5.5 표지화와 함께 DCPN의 합성. CPN (5μmol)을 DMSO(15ml) 중에 용해시키고 DMSO 중 스톡(10mg/ml, 5μmol, 564㎕)으로서 Cy5.5-NHS (GE healthcare)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 16시간동안 37℃에서 교반하고 이어서 MPEG2000-벤즈알데하이드(40μmol, 86 mg)를 동일한 조건하에서 또 다른 4시간동안 상기 용액에 첨가하였다. 이어서, DMSO는 제거하고 조 화합물을 용출제로서 메탄올을 사용하는 SEPHADEXTM G-10 칼럼으로 정제하였다. DCPN은 감압하에 증발시켜 청색 분말로서 회수하였다. Cy5.5(d-DMSO) 표지화와 함께 DCPN의 1H NMR(Varian. 400 MHz): d 3.38 & 3.49 (MPEG20OO의 양성자). 6.66 (d, br, 2H), 7.23 (d, br, 2H), 8.49 (이민, s, 1H).
세포 독성. MDA-MB-231 세포주(Bioresource Collection and Research Cen ter, Taiwan)를 37℃에서 5% CO2 대기하에 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 24웰 세포 배양 플레이트는 웰당 1 x 105 세포로 접종하고 24시간동안 37℃에서 유지시켰다. 상기 배양 배지는 배양 배지에서 다양한 농도의 상이한 처리(단독의 G2NH2, 카보플라틴, 시스플라틴 및 CPN)의 존재하에 변화시켰다(3회 반복). 상기 시험은 배지를 변화시키는 것 없이 3일동안 수행하였다. 오버레잉 세포-배양 배지를 제거한 후, 상기 세포는 1시간동안 37℃에서 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT, Sigma, MO, USA)로 항온처리하였다. 처리 후, MTT 기원의 포마잔 생성물을 DMSO 중에 용해시키고 570nm에서 통상의 ELISA 판독기를 사용하여 정량하였다. 계산을 위해, 블랭크 시험은 동일한 조건하에서 24-웰 플레이트에서 수행하였다.
시험관내 수준에서 용해를 확인하기 위해, MDA-MB-231 세포의 세포 생존능 연구는 CPN과, 액포형 H+-ATPase의 강한 억제제인 바필로마이신 A1(BA)으로 동시처리함에 의해 수행하였다. 24웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1 x 104 세포를 접종하고 37℃에서 24시간동안 유지시켰다. BA는 또한 미토콘드리아 기능을 손상시킴을 통해 MDA-MB-231 세포를 용이하게 사멸시키는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, 저농도의 BA(≤0.2μΜ)를 채택하여 엔도좀/리소좀 pH를 점진적으로 변화시키고 처리시간을 6시간으로 단축시켰다. 세포는 37℃에서 6시간동안 0.1 μΜ 또는 0.2 μΜ의 BA 및 CPN (45㎍/mL)와 항온처리함에 이어서 PBS로 세척하였다. WSTI 시약을 각각의 웰에 첨가하고(25㎕/웰), 상기 혼합물을 측정 2시간 전에 반응시켰다.
세포 어팝토시스 검정. 어팝토시스 키트(INVITROGEN™)를 사용하여 어팝토시스를 진행하는 세포의 수를 평가하였다. 형광 현미경을 위해, 세포는 35-mmμ-디쉬(ibidi)에서 상이한 시간동안 SPNP를 함유하는 배지에서 배양하고 이어서 어팝토시스 세포는 제조업자의 지침에 따라 어넥신 V-FITC/프로피디움 요오다이드(PI) 키트를 사용하는 형광 염료에 의해 염색시켰다. 상기 염색된 세포는 공초점 현미경(Olympus FV10i)하에 관찰하였다.
세포 취득 경로의 분석. MDA-MB-231 세포는 웰당 1 x 105 세포로 6웰 세포 배양 플레이트에 분주하고 24시간동안 37℃에서 배양하였다. 상기 배지는 특이적 세포내이입 억제제(클로르프로마진 10㎍/mL 또는 아밀로라이드 1mM 또는 니스타틴 25㎍/mL)을 함유하는 배지로 대체하고 15분동안 예비 항온처리하였다. 이어서 상기 배지를 제거하고 상기 CPN 및 억제제를 함유하는 배지를 첨가하였다. 상기 대조군 그룹에는 CPN만을 투여하였다. 상기 배지는 2시간 후 제거하고 상기 세포는 빙냉 PBS로 세척하였다. 트립신 처리 후, 상기 세포를 수거하고 빙냉 PBS로 2회 세척하고 분석때까지 -20℃에서 보관을 위해 원심분리하였다(2000g, 4℃, 5분). 세포 백금 함량을 측정하기 위해, 상기 세포 펠렛을 Triton X-100 용액(1% w/w) 중에서 균질화시키고 유도적으로 커플링된 플라스마 매쓰 분광측정기(SCP-MS)에 의해 백금 분석을 위해 희석시켰다. 상기 결과는 3개 실험의 평균으로서 계산하였다.
TIINEL 검정. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 dUTP 닉 말단 표지화(TUNEL) 검정은 어팝토시스 세포사의 동일계 검출을 위해 사용하였다. 종양 조직의 동결된 섹션(4㎛ 두께)을 실온으로 가온하였다. 상기 슬라이드는 PBS로 3회 세척하여 OCT를 제거하였다(동결된 조직을 위해 종양의 매립된 배지 중 하나). 상기 표지화 과정은 상기 키트의 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 이들 슬라이드는 3.3'-디아미노벤지딘(DAB, Thermo, S21024-2)을 사용하여 염색시킴에 이어서 헤마톡실린으로 대비 염색시키고 광 현미경으로 모니터링하기 전에 유리커버 슬립상으로 탑재하였다.
면역조직화학. 종양 조직의 동결된 섹션(4㎛ 두께)은 실온으로 가온하였고, PBS(5분/시간)로 3회 세척하고 15분동안 PBS 중에서 새롭게 제조된 4% 파라포름알데하이드로 고정화하였다. 상기 고정화된 섹션을 4℃에서 밤새 폴리클로날 래빗 항-마우스 활성 카스파제-3 항체(Abeam Inc., ab2302, PBS의 10% BSA 중에 5㎍/mL, 50㎕/샘플)에 침지시킴에 이어서 PBS(3회, 15분/시간)로 세척하고 실온에서 2시간동안 퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-래빗 항체(Abeam Inc., PBS 중 ab6721 - 200, 1:500 (v/v), 100㎕/샘플)로 항온처리하였다. 이들 슬라이드는 첫번째로 DAB로 염색하고 이어서 헤마톡실린으로 대비 염색시키고 광 현미경에 의해 모니터링 전에 유리 커버슬립상에 탑재하였다.
동물 모델 및 종양 억제. 7주령 암컷 Balb/c 누드 마우스(16-20g)를 24 ± 2℃ 및 50 ± 10% 상대 습도에서 12시간 명(light)/12시간 암(dart) 주기상에 유지시키고 물과 음식물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 이들에게 피하내로 2 x 106세포/마우스를 주사하여 유방 종양 모델을 확립하였다. 종양은 각각의 종양의 가장 긴 직경(a) 및 가장 짧은 직경(b)을 가로질러 디지탈 베니어 캘리퍼로 측정하고 종양 용적(V)은 화학식 V = 0.5a x b2에 의해 계산하였다. 종양 크기가 대략 60mm3 및 150mm2에 도달하는 경우, CPN 및 DCPN을 각각 IT 및 IV 주사로 투여하였다. 종양 억제에서 비교 효율의 연구를 수행하였다. 상기 마우스는 총 3주동안 1주에 1회 IT 주사를 통해 CPN으로 치료하였다. 유사하게, DCPN은 4주동안 1주 1회 IV를 통해 마우스에 투여하였다. 상기 주사 용적은 5㎕/g 체중이었고 종양 크기는 2 내지 3일마다 계산하였다. 마우스를 희생시킨 후, 종양 및 혈액을 수거하고 EDTA 유리 튜브에 놓았다.
결과
본원 발명자는 특이적으로 기하학적 구조의 음이온을 포획하기 위한 케이지로서 낮은 생성, 아민-말단화된 덴드리머(G2NH2)를 사용하여 케이지된 PN(CPN, 도 1a, 경로 ii)을 형성하였다. CPN은 추가로 항암 화학치료제에 대한 종양 내부 활성화를 나타내도록 외측 PEG 코로나를 쉐딩함에 의해 종양을 표적화하고 악성 세포에 대한 독소를 방출할 수 있는 iRGD(CRGDKGPDC; 서열번호 1)과 같은 여분의 절단가능한 PEG 코로나 및 표적화할 수 있는 분자로 변형시켰다(도 1b).
낮은 생물안전성과 관련된 G2NH2는 원자 수준 상에서 PN 크기를 국한시키고 엔도좀 취득을 제공하기 위한 케이지로서 선택되었다. 그러나, 성상형 구조 및 주변 아민 그룹을 소유하는 G2NH2는 이것이 소형 나노입자 보다는 대형 나노입자를 형성하는 경향이 있기 때문에 케이지로서 과제를 제공하고 입체배좌를 통한 덴드리머 응집 및 주변 아민과 금속 음이온간의 상호작용을 유발한다. 이들 한계를 극복하기 위해, 상이한 기하학적 구조를 갖는 2개의 음이온인 사각 평판(PtCl4 2 -) 및 8면체(PtCl6 2-)를 사용하였고, 이는 각각 G2NH2 외측 및 내측과 자발적으로 연합할 수 있다. 상기 PtCl4 2 -는 G2NH2의 말단 아민과 용이하게 치환 반응을 수행할 수 있다. PtCl4 2-의 상기 친핵성 이탈은 G2NH2와의 교차 연결을 유발할 수 있고 따라서 음이온을 차단하여 G2NH2 공간에 진입할 수 있다(도 1a, 경로 i). 환원 후, 주변의 Pt 이온은 금속친화성 인력을 통해 덴드리머 외측 상에 PN을 형성하는 경향이 있다. 대조적으로, 8면체 음이온(PtCl6 2-)은 입체 장애와 함께 서서히 치환 반응을 진행하여 말단 아민과 결합하고 이것은 3급 아민과 PtCl6 2-간의 정전기적 상호작용과 후속적 PN 형성(도 1a, 경로 ii)을 통해 G2NH2의 내측 포획을 촉진시킬 수 있다(도 1a, 경로 ii).
라만 분광측정기는 착물이 치환 반응을 유발하는지를 입증하기 위해 사용하였다. 도 2a-b에 도시된 바와 같이, 유의적인 밴드는 PtCl4 2-/G2NH2 착물로부터 250cm-1에서 나타나고 N-Pt-N 휨 진동으로 할당될 수 있고 이는 PtCl4 2-의 리간드가 분해되기 쉬워 G2NH2의 말단 아민의 대체를 가능하게 하였음을 지적한다. 대조적으로, PtCl6 2-/G2NH2 착물에서는 250cm-1에서 어떠한 감지할만한 피크가 관찰될 수 없었고 이는 상기 PtCl6 2-의 입체 효과가 G2NH2로부터의 리간드 대체를 방해하였음을 시사한다. 추가로, TEM 측정은 2개의 착물(즉, PtCl4 2-/G2NH2 및 PtCl6 2-/G2NH2)에서 입체배좌 차이를 입증하는 직접적인 증거를 보여준다, 명백하게, 사각 평판 음이온(PtCl4 2-)은 G2NH2의 교차-연결을 유도하여 환원 전에 다양한 직경을 갖는 덴드리머 응집체를 형성하는 것으로 명백히 보일 수 있다(도 2c). PtCl4 2-/G2NH2 착물이 마이크로파로 환원되면, PN이 생성되어 덴드리머 응집체의 주변을 따라 어셈블리하는 것으로 밝혀졌다(도 2e, 백색 사각형 및 화살표). 대조적으로, TEM 이미지(도 2d)에서 소형 나노입자(대략 5nm)만이 PtCl6 2-/G2NH2 착물에서 관찰되었다. 상기 스케일은 단독의 G2NH2 보다 약간 컸고, 이는 음이온의 반발력이 G2NH2 공간의 팽창을 유발함을 의미한다. 놀랍게도, 본원 발명자는 TEM 이미지(도 2f)에서 여러 눈(eye)-형 나노클러스터를 발견하였고 PtCl6 2-/G2NH2 착물은 환원되었다. 명백하게, PN은 직경이 약 4nm인 눈-형 구조를 형성하기 위해 G3NH2에 케이지되었다. 추가로. 내부 클러스터는 직경이 0.93±0.22nm인 것으로 평가되었다. 결과로서, 본원 발명자는 본원 발명자는 PN이 도 1a(경로 ii)에서 예측된 바와 같이 G2NH2에 케이지되는 것으로 결론지었다. 상기 CPN은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용함에 의해 여분의 음이온성 음이온을 제거한 후 에너지 분산 x-선 분광기(EDS)에 의해 측정하였다. 도 5는 PH의 존재를 재확인시켜준 요소 Pt에 대한 특징적인 피크를 보여준다.
이들의 수용해도를 조사하였다. 덴드리머 응집체 주변의 상기 PN 어셈블리는 CPN과 비교하여 불량한 수용해도를 나타냈다(도 7a). 추측컨대, 말단 아민은 PN과 어셈블리하여 용해도가 감소하도록 차단되었다. 도 7b는 상기 CPN이 PN 어셈블리 보다 암 세포에 대해 보다 큰 독성을 가짐을 보여주고 이것은 CPN이 암 세포의 세포내 취득을 최대화하기 위해 우수한 용해도를 갖는다는 사실과 상호관련될 수 있다. 24시간 후 CPN으로 처리된 세포는 PN 어셈블리로 처리된 세포 보다 높은 Pt 축적을 갖는다(도 7c).
사람 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 사용하여 CPN이 암 세포를 사멸시킬 수 있는지의 이유를 조사하였다. 상기 CPN의 IC50 값은 약 37㎍/mL이었고, 이것은 시스플라틴의 값(7㎍/mL) 보다 높았고 카보플라틴의 값(35㎍/mL) 보다 약간 높았다( 3a). DA-MB-231 세포는 각각 CPN 및 시스플라틴으로 처리하고 이어서 어넥신 V-FITC(어팝토시스에 대한 녹색 염료) 및 프로피디움 요오다이드(PI, 괴사에 대한 적색 염료)로 이중 염색시켜 시간-의존성 어팝토시스 및 괴사를 관찰하였다(도 3b). 어떠한 상당한 형광성(좌측 상부 패널)도 비처리된 대조군에서 관찰되지 않았다. 어넥신-V-FITC로부터 녹색 형광(우측 상부 패널)만이 처리 조기 단계에서 관찰되었고 이는 CPN을 사용한 치료 후 MDA-MB-231 세포에서 어팝토시스의 유도를 지적하였다. 양성 PI 염색(하부 패널)은 연장된 항온처리 기간 후 관찰되었고 이는 죽은 세포의 증가를 지적한다. 도 8은 시스플라틴-유도된 세포사와 유사한 결과를 보여준다. 이것은 CPN-유도된 세포사의 표현형이 시스플라틴-처리된 세포의 표현형과 유사할 수 있음을 지적했고 이의 기작은 DNA 분해인 것으로 공지되어 있다.
도 9는 CPN 및 시스플라틴으로부터 어떠한 유의적인 ROS 증가 또는 감소가 없음을 보여주고, 이것은 ROS 생성이 세포사에 관여하지 않음을 지적한다. 다음에, CPN이 벌크 Pt와 같이 비활성인 경우, 어떠한 독성 이온이 용해될 수 없다. 따라서, 본원 발명자는 대략 1nm의 크기를 갖는 본 발명의 CPN이 산화되어 추가의 용해를 위해 부식성 PN을 형성함을 고려하였다. 상기 가능성을 입증하기 위해, 본원 발명자는 x선 광전자 분광기(XPS)에 의해 표면 산화 정도를 조사하였다. 도 4a는 CPN 기원의 73.4 eV에서 나타나는 Pt(4f7/2)의 주요 피크를 보여주고, 이는 Pt 나노입자 (>1nm, 대략 71.eV) 값 보다 높다. 상대적으로 높은 결합 에너지(즉, 73.4eV)는 Pt 산화물로부터 제안되었고, 아마도 PN이 PtO를 형성할 수도 있다. 또한, XPS를 사용하여 CPN의 산소 양의 대략적 평가를 위해 O(1s) 스펙트럼을 조사하였다, 531.8 eV에서 나타나는 O(1s) 피크의 결합 에너지는 CPN이 O(ls)의 결합 에너지를 변화시키기 위해 덴드리머내에 케이지되기 때문에 이전의 연구로부터 다양한 것으로 언급될 수 없다. 그러나, 단독의 G2NH2의 피크와 비교하여 CPN의 O(1s) 피크에서 상당한 증가가 있었고(도 4b), 이것은 상기 CPN이 산화됨을 지적한다. 이러한 산화 상태와 함께, 본 발명의 CPN이 산성 기관으로 내재화되는 경우 낮은 pH 및 클로라이드 이온이 상기 CPN의 용해를 촉진시킬 수 있다.
본원 발명자는 항온처리 온도를 조정하고 다양한 특이적 억제제를 사용함에 의해 CPN의 내재화된 경로를 조사하였다. 첫번째로, MDA-MB-231 세포는 대조군으로서 37℃에서 CPN으로 처리하였다(도 4c. 칼럼 1), 두번째로, CPN의 취득은 ∼50%(칼럼 2) 및 ∼10%(칼럼 3)로 급격히 감소할 수 있고 처리 온도는 각각 4℃로 후-냉각 및 이전-냉각이었고, 이것은 엔도좀 경로와 같은 에너지-의존 경로가 우세화되었음을 지적한다. 최종적으로, 상기 세포는 세포내이입의 다양한 억제제로 동시 항온처리하였다. 클래트린-매개된 세포내이입에 대한 억제제인 클로르프로마진(칼럼 4)만이 다른 억제제, 예를 들어, 아밀로리드(칼럼 5) 및 니스타틴(칼럼 6)과 같은 다른 억제제와 비교하여 세포에서 CPN 축적을 상당히 억제할 수 있다. 본원 발명자는 CPN이 클래트린-의존성 세포내이입을 통해 세포 내부에 취득될 수 있는 것으로 결론지었고, 이것은 단독의 PAMAM 덴드리머의 내재화된 경로와 일치하였다. 본원 발명자는 또한 CPN의 세포내 분포가 리소좀 트래커와 동시 위치할 수 있음을 밝혔다(도 4d). 이것은 CPN이 가능한 용해를 위해 이들 산성 엔도좀/리소좀에 진입할 수 있음을 의미했다. Pt 이온의 양을 결정하기 위해, 상기 CPN은 양성 대조군으로서 왕수(3:1 HCl/HNO3)에서 완전히 용해하였다(도 4e, 칼럼 1). 상기 CPN은 또한 물(칼럼 2), pH ∼5의 산성 용액(칼럼 3) 및 80mM NaCl을 함유하는 pH ∼5의 산성 용액(칼럼 4)으로 처리하였다. Pt 이온의 양은 80mM NaCl을 함유하는 pH ∼5의 산성 용액 중에서 유의적으로 상승되는 것으로 밝혀졌고, 이는 CPN이 pH 민감성 용해를 소유함을 지적한다. 시험관내 용해 수준을 확인하기 위해, MAD-MB-231 세포는 0.1μΜ 또는 0.2 μΜ 바필로마이신 A1 (BA, 액포형 H+-ATPase의 강한 억제제) 및 CPN으로 동시 처리하였다. MDA-MB-231 세포의 엔도좀/리소좀 pH는 BA 처리 후 약간 증가될 수 있고; 이는 BA의 존재하에 (도 10a에 나타낸 평가된 안전한 용량) MDA-MD-231 세포의 낮은 내성 때문이다. 도 10b는 CPN-유도된 세포사가 단시간내 유의적으로 역전될 수 있음을 보여준다. 이것은 엔도좀/리소좀의 산성화 감소가 Pt 방출을 손상시킬 수 있음을 지적했다. 상기 지적에 따르면, 상기 CPN은 전신 독성을 최소화하기 위한 생물학적 환경과의 미성숙한 상호작용을 예방할 수 있다.
마우스에서 피하 유방암 이종이식체를 사용한 CPN의 치료학적 효능은 종양내(IT) 주사에 의해 평가하였다. CPN 및 시스플라틴과 같은 다양한 약물의 최대 관용성 용량(MTD)은 표 1에 기재되어 있다. IT 주사 후, CPN 및 시스플라틴은 2개의 대조군 그룹(PBS 및 G2NH2)과 비교하여 종양 억제에서 현저히 효능적인 것으로 밝혀졌다(도 5a-b). 추가로, 분해된 DNA 가닥은 TUNEL 검정에 의해 검출될 수 있고(도 5c), 갈색 핵(TUNBL-양성 염색)은 대조군 그룹의 청색 핵(TUNEL-음성 세포)과 비교하여 48시간동안 CPN 및 시스플라틴의 처리 후 관찰된다. 본원 발명자는 또한 시스플라틴-사멸 암 세포 뿐만 아니라 CPN-사멸 암 세포가 실제로 어팝토시스를 나타낼 수 있는지를 추가로 확인하기 위해 활성 카스파제-3을 검출하기 위한 면역조직화학 분석을 사용하였다(도 11). 따라서, CPN-처리된 세포의 프로그램화된 사멸 경로는 시스플라틴-처리된 세포의 경로와 유사할 수 있다. 본원 발명자는 상기 CPN이 항암 화학치료제에 대해 종양-내부 활성화를 발휘하도록 혈관으로 주사될 수 있는지를 입증하였다. 따라서, 상기 CPN은 이중-케이지드 FN(DCPN)을 형성하기 위한 정맥내(i.v.) 주사 후 단백질 부착을 예방하기 위해 절단가능한 PEG 층으로 피복된 여분이었다. DCPN의 특성은 도 12에 나타내고, PEG 코로나는 종양-모방 pH(pH 6.8)에서 DCPN으로부터 절단되는 것으로 입증되었다. DCPN에 표적화 기능을 부여하기 위해, iRGD 종양-침투 펩타이드는 IV 투여에 의해 유방암의 피하 이종이식체 누드 마우스로 DCPN과 함께 동시 투여하였다. 각각의 마우스에서 종양 크기는 약 150mm3으로 성장하였고 DCPN 전달을 촉진시켰다. 추가로, DCPN 및 대조군 그룹(PEG 코로나로 피복된 G2NH2)에 투여 후 실시간 추적을 위해 NIR 염료 cy5.5를 미리 부착시켰다. 비교를 위해, PBS, G2NH2, DCPN 및 시스플라틴을 포함하는 모든 그룹에 iRGD의 동시 투여하에 4주동안 정맥내 주사하였다. 도 5d는 처리 후 종양내 유의적인 cy5.5 시그날을 보여주고, 이것은 DCPN의 종양 표적화를 지적한다. 상기 종양내 시그날은 주사 후 4시간째 및 1일째에 정체기에 도달하였고, 이는 CPN의 페길화가 종양 취득을 증가시키기 위해 긴 혈액 순환을 촉진시킬 수 있음을 밝힌다. 간 및 비장에서 cy5.5 시그날은 폐 및 심장에서 시그날과 비교하여 보다 많이 약하고 이는 PEG 맨틀이 또한 간에서 DCPN 축적을 감소시킬 수 있음을 지적한다. 보다 낮은 생성 덴드리머(G2NH2, n<5)가 뇨 분비에 의해 용이하게 제거될 수 있다는 것은 널리 공지되어 있다. 여기서, 종양 및 다른 기관내 시그날은 14일째에 점진적으로 감소할 수 있고 이어서 신장에서 농축시킬 수 있다. 31일째에, 신장내 시그날은 급진적으로 감소할 수 있고, 이는 DCPN이 분비될 수 있음을 지적한다. 도 13은 다양한 기관(뇌, 심장, 폐, 간, 비장 및 신장)에서 잔류 Pt는 15% 미만임을 보여주고(표 2), 이는 DCPN의 분비를 지적한다. IV 주사에 의해 7일 격주에서 동일 용량(16.6μmol/kg)의 모든 물질이 주어지는 경우, 도 5e는 DCPN 및 시스플라틴이 실제로 종양을 2개의 대조군 그룹(PBS 및 G2NH2)의 종양과 비교하여 줄어들게 함을 보여준다. 절단 가능한 PEG 코로나로 피복된 단독의 C2NH2는 또한 유의적인 종양 표적화를 나타냈다(도 14). DCPN이 투여되는 마우스의 경우와 달리, 상기 종양 성장은 PN의 부재하에 억제될 수 없다. 더욱이, 본원 발명자는 DCPN이 투여된 마우스에서 역 효과를 조사하였고 이들 투여된 시스플라틴과 비교하여 유의적인 체중 감소(도 5f) 및 공급물 섭취의 감소(도 15)가 없음을 밝혔다. 대조군, 시스플라틴, G2NH2 및 DCPN 그룹을 포함하는 4개 그룹 기원의 연속 조직 절개부를 종점에서 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의해 조직학적으로 조사하였고 상기 슬라이드는 독립적 병리학자에 의해 평가되었다(도 16). 상기 DCPN은 또한 시스플라틴의 효과와 유사한 처리 후 종양 세포 괴사를 유도할 수 있다. 표 1 및 2는 각각 생체내 실험에 사용된 Pt 나노클러스터의 용량 및 DCPN의 평가된 유리된 Pt 분비를 보여준다.
투여 시스플라틴a CPNb DCPNc
IT 주사 25μmol/kg
(7.5mg/kg)		 14.4μmol/kg X
IV 주사 16.6μmol/kg X 16.6μmol/kg
a 시스플라틴의 분자량은 301이다.
b CPN의 분자량: G2NH2+1nm 나노클러스터(35개 원자들 Pt)=3256.195 x 35 = 10,081.
c DCPN의 분자량= 8(PEG 2kD) + G2NH2 + 1nm 나노클러스터(35개 원자들 Pt) = 8 x 2000 + 3256 + 195 x 35 = 26,081
** CPN 중 유리된 Pt의 양 = 14.4μmol/kg x 35원자들/1nm
따라서, IT 투여된 유리된 Pt = 504μmol/kg
** DCPN 중 유리된 Pt의 양 = 16.6μmol/kg x 35 원자들/1nm
따라서, IV 투여된 유리된 Pt는 581μmol/kg
기관 A1
뇌		 A2
심장		 A3
폐		 A4
비장		 A7
신장		 A6
간
기관 무게(g) X 0.172 0.249 0.125 0.592 2.093
Pt 양(㎍/g)2 ND 11.55 39.34 156.4 996.9 195.1
다양한 기관 중 총 Pt 양(㎍) ND 1.987 9.796 19.55 590.2 408.3
기관 내 축적 = A1+A2+A3+A4+A5+A6 = 1029.8(㎍) = 1.0298 mg
∵ DCPN = 16.6μmol/kg; 1nm = 35개 Pt 원자들; Pt Mw = 195; 마우스의 중량 ≒ 20g
∵ 유리된 Ptb = 16.6μmol/kg x 35 - 581μmol/kg
581μmol/kg x 195 = 113.3mg/kg
113.3mg/kg x 0.02kg = 2.27 mg
∵ 주사 = 4 ∵ 2.27mg x 4= 9.06mg
따라서, 잔류 Pt = (1.0298/9.06) x 100% = 11.4%
ND: 검출되지 않음
a 상기 값은 도 13에 보여지는 ICP-매쓰에 의해 측정하였다
b CPN 및 DCPN 내 유리된 Pt는 동일하고 이는 표 1에서 평가하였다.
요약하여, 본원에 기재된 내용은 전신 독성을 최소화하면서 항암 화학치료제에 대한 종양-내부 활성화를 갖는 특별히 디자인된 PN(즉, CPN)이다. Pt의 크기를 원자 수준 (직경 0.93 ± 0.22nm)으로 한정함에 의해, 프로드럭으로서 나노약물 적용을 위한 매력적인 성질이 부여될 수 있다. 구체적으로, PN은 용이하게 산화될 수 있고 이는 이의 고유 화학적 둔감함을 상실시키고 DNA 백금화를 위한 독성 Pt 이온을 방출하기 위해 엔도좀 및 리소좀과 같은 약산성 기관에서 추가의 추가의 용해를 위한 표면 부식성을 획득할 수 있다. 상기 접근법의 주요 요지는 PN의 크기를 조절하는데 있고, 따라서, 특이적 기하학적 구조의 음이온을 G2NH2 내측으로 케이징시킴을 기준으로 신규 합성 전략을 개발하였다. 종양-내부 활성화를 발휘하는데 있어서 CPN의 실행가능성은 pH-절단가능한 PEG 코로나를 후-변형시키고, 종양 성장의 상당한 억제를 유도하는 종양-호밍 펩타이드와 혼합함에 의해 생체내 확인되었다.

Claims (20)

  1. (a) 덴드리머;
    (b) 산화백금을 포함하고 상기 덴드리머 내부에 국한되어 있는 백금 나노클러스터; 및
    (c) 상기 덴드리머 표면상에 피복된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)
    을 포함하는 이중-케이지된(double-caged) 백금 나노클러스터 착물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화백금이 PtO, PtOH, PtO2, PtxOy, 및 이의 임의의 배합물(여기서, x 및 y는 각각 독립적으로 0보다 큰 정수이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 착물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 덴드리머가 아민-말단화된 덴드리머인, 착물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PEG가 쉬프 염기(Shiff base)를 통해 아민-말단화된 덴드리머의 1급 아민에 접합된, 착물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 착물의 표면이 pH-반응성 결합을 포함하는, 착물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 덴드리머의 표면상으로 흡수된 종양-침투 펩타이드를 추가로 포함하는, 착물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 착물이 pH 5.0 미만의 조건하에서 Pt2 +, PtCl4 2 - 및/또는 PtCl6 2- 이온을 방출시키는 특징을 나타내는, 착물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 백금 나노클러스터가 pH 5.0 미만의 조건하에서 용해성을 나타내는, 착물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노클러스터가 1.3nm 미만의 평균 크기를 갖는, 착물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 덴드리머가 생성-0(G-0), 생성-1(G-1), 생성-2(G-2) 및 생성-3(G-3)T 덴드리머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 착물.
  11. 종양 세포 성장을 억제하기 위한 약물의 제조에 있어서 청구항 1 내지 제10항에 따른 이중 케이지된 백금 나노클러스터 착물의 용도.
  12. (a) 8면체 헥사클로로플라티네이트 음이온을 포함하는 제1 용액을 아민-말단화된 덴드리머 또는 하이드록실-말단화된 덴드리머를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 PtCl6 2- 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 충분한 기간동안 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 항온처리하는 단계;
    (c) PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물 중에서 PtCl6 2 - 음이온을 환원시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (d) 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스 착물을 필터에 통과시켜 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 여과물을 수득하는 단계;
    (e) 상기 여과물을 동결 건조시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계;
    (f) 용매 중에 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
    (g) 상기 덴드리머가 아민-말단화된 경우 상기 PEG-알데하이드를 상기 용액에 첨가하거나, 상기 덴드리머가 하이드록실-말단화된 경우 PEG-NH2를 상기 용액에 첨가하는 단계; 및
    (h) 상기 PEG-알데하이드가 아민-말단화된 덴드리머의 1급 아민과 반응하도록 하거나 상기 PEG-NH2가 하이드록실-말단화된 덴드리머와 반응하도록 하여 이중 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계를 포함하는, 이중-케이지된 백금 나노클러스터 착물을 합성하기 위한 방법.
  13. (a) 아민-말단화된 덴드리머; 및
    (b) 산화백금을 포함하고 표준 편차가 0.22nm인 0.93nm의 평균 직경을 가지며 상기 아민-말단화된 덴드리머 내부에 국한되어 있는 백금 나노클러스터를 포함하는, 케이지된 백금 나노클러스터 착물.
  14. (a) 8면체 헥사클로로플라티네이트 음이온을 포함하는 제1 용액을 아민-말단화된 덴드리머를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계:
    (b) 상기 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물을 포함하는 상기 혼합물을 충분한 기간동안 항온처리하는 단계;
    (c) 상기 PtCl6 2 - 음이온/덴드리머 착물 중의 상기 PtCl6 2 - 음이온을 환원시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
    (d) 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 상기 혼합물을 필터에 통과시켜 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 포함하는 여과물을 수득하는 단계; 및
    (e) 여과물을 동결 건조시켜 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 수득하는 단계를 포함하는, 제13항의 착물을 합성하기 위한 방법.
  15. 제12항 또는 제14항에 있어서, 상기 환원 단계가 마이크로파로 조사함에 의해 수행되는, 방법.
  16. 제12항 또는 제14항에 있어서, 상기 항온처리 단계가 밤새 실온에서 수행되는, 방법.
  17. 제12항 또는 제14항에 있어서, 단계 (e)가 여분의 PtCl6 2 -를 제거함에 의해 상기 덴드리머 케이지된 백금 나노클러스터 착물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덴드리머가 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머인, 착물.
  19. 제1항 내지 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 헥사클로로플라티네이트 및/또는 테트라클로로플라티네이트 음이온이 없는, 착물.
  20. 제1항 내지 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 착물이 암 세포에 세포독성을 나타내는, 착물.
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