CN105451721A - 用于抗癌化疗法的笼状铂金纳米团簇 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示一种笼状铂金纳米团簇复合物。该复合物包含(a)胺基终端树枝状聚合物；及(b)包含铂氧化物的铂纳米团簇，该铂纳米团簇限制在该胺基终端树枝状聚合物之内。本发明复合物对癌细胞表现细胞毒性。本发明另揭示一种双重笼状铂金纳米团簇复合物，其包含在树枝状聚合物的笼状铂纳米团簇复合物的表面涂布的聚乙二醇(PEG)。该双重笼状铂纳米团簇复合物在其表面具有pH-敏感键结。本发明亦揭示这些复合物的制备方法及其用途。

Description

用于抗癌化疗法的笼状铂金纳米团簇
【技术领域】
本发明关于抗癌症的化学疗法。
【先前技术】
铂(Pt)被视为一种贵重金属，它不像顺铂仅藉由水就可活化其毒性，Pt仅可溶解于强腐蚀剂中，例如王水(HNO3/HCl)。王水首先氧化的后溶解Pt以形成含Pt氯复合物。最近已发现缩小Pt的体积以增加表面积比，进而允许氧气吸附并促进表面腐蚀的水氧化反应，可显著地增加氧化的程度。然而，如何有效地缩小Pt，仍是一项挑战。
【发明内容】
在一方面，本发明关于一种双重笼状铂纳米团簇复合物(double-cagedplatinumnanoclustercomplex)，其包含(a)树枝状聚合物(dendrimer)；(b)包含铂氧化物的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该树枝状聚合物之内；及(c)聚乙二醇(PEG)，其涂布于该树枝状聚合物的表面。该树枝状聚合物可以是胺基终端树枝状聚合物。
在另一方面，本发明关于一种笼状铂纳米团簇复合物，其包含(a)一胺基终端树枝状聚合物；及(b)一包含铂氧化物及具有平均直径为0.93nm，标准偏差为0.22nm的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该胺基终端树枝状聚合物之内。
在另一方面，本发明关于一种合成上述笼状铂纳米团簇复合物的方法，其包括下列步骤：
(a)混合包含八面体六氯铂酸盐阴离子的第一溶剂与包含一胺基终端树枝状聚合物或一羟基终端树枝状聚合物的第二溶剂，以形成包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物；
(b)培养该包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物达一段足够的时间；
(c)还原PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物中的PtCl6 2-阴离子，以形成包含树枝状聚合物笼状铂(dendrimercagedplatinum)的纳米团簇复合物的混合物；
(d)将包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的混合物通过过滤器，以得到包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的滤液；及
(e)冷冻干燥该过滤液以得到树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物。在另一方面，本发明关于一种合成双重笼状铂纳米团簇复合物的方法，其包括：
(i)溶解上述树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物于溶剂中以形成溶液，该复合物包含：
(a)胺基终端的树枝状聚合物或羟基终端的树枝状聚合物；及
(b)包含铂氧化物的铂纳米团簇，其被限制在该胺基终端的树枝状聚合物或该羟基终端的树枝状聚合物之内；
(ii)当该树枝状聚合物为胺基终端时，加入PEG-醛至该溶液中；或当该树枝状聚合物为羟基终端时，加入PEG-NH2至该溶液中；及
(iii)允许PEG-醛与该胺基终端的树枝状聚合物的一级胺进行反应；或允许PEG-NH2与羟基终端的树枝状聚合物进行反应，藉此获得双重笼状铂纳米团簇复合物。
在进一步的方面，本发明关于一种上述笼状铂纳米团簇复合物或双重笼状铂纳米团簇复合物制备于所需个体抑制肿瘤细胞生长的药物的用途。或者，本发明关于一种上述笼状铂纳米团簇复合物或双重笼状铂纳米团簇复合物于个体所需抑制肿瘤细胞生长的用途。
另一方面，本发明关于一种医药组合物，其包含：
(a)治疗有效量的前述复合物；及
(b)医药上可接受的载剂。
藉由以下较佳实施例的叙述并配合以下附图的说明，将更清楚了解本发明的各方面内容。附随附图例示本发明的一或多种态样，并配合文字叙述以解释本发明的原理。无论在什么可能的情况下，相同的参照编号在各附图中用于指涉一实施态样的相同或相似组件。
【附图说明】
图1A显示一种基于调控阴离子几何特性以形成PN的新颖策略；途径(i)及(ii)显示G2NH2的外部及内部分别选择性地与平面PtCl4 2-及八面体PtCl6 2-交联。
图1B显示笼状PN与肿瘤侵入性肽混合，以标靶肿瘤并藉由脱去外部PEG冠，进而在肿瘤内部活化以杀死恶性细胞。抗癌功效的关键在于，PN失去其内因性化学钝性，而在弱酸性胞器中表现其溶解性。
图2A-B显示PtCl4 2-/G2NH2复合物(A)及PtCl6 2-/G2NH2复合物(B)的拉曼光谱，显示自前者复合物形成N-Pt-N协调性。
图2C-D显示在还原前PtCl4 2-/G2NH2复合物(C)及PtCl6 2-/G2NH2复合物(D)的HRTEM影像。
图2E-F显示当(C)及(D)复合物还原时，PN被笼在G2NH2外部(E)及内部(F)。所有TEM样本在测量前两天新鲜配置，并将一配置好的样品予以自然干燥。所有的测量均在不存在阴性染色的条件下进行。
图3A显示CPN的IC50值高于顺铂及卡铂的IC50值。其中插入图显示较低浓度，范围自0至50μg/mL。
图3B是观察细胞死亡途径的显微影像。将未经处理或以大概50μg/mLCPN予以不同时间处理的MDA-MB-231细胞以annexinV-FITC及PI予以双重染色。上图自左至右分别表示未经处理的细胞及经CPN处理5小时的细胞。下图则分别表示经CPN处理10小时及24小时的细胞。比例尺：30μm。
图4A-B是XPS光谱显示Pt(A)与氧(B)的键结能量，其中图A特别代表CPN及Pt纳米粒子的(4f7/2)及(4f5/2)部位。星星表示CPN的键结能量推移至73.4eV。以沉积于受质上的金膜的Au4f7/2(83.7eV)波峰作为内标准品予以校正。
图4C显示在细胞吸收过程中检测CPN内化途径的各种胞引作用抑制剂。
图4D显示MDA-MB-231细胞的CPN细胞吸收行为的共焦显微影像；以FITC标记CPN以利观察(绿色)及溶酶体追踪(红色)，而CPN及溶酶体追踪共处的区域呈黄色。细胞型态的改变基于CPN的毒性。
图4E显示在拟内体环境下，以ICP-MS测定本发明CPN溶解成Pt离子形式。CPN溶解于王水(3∶1HCl/HNO3)作为对照组。
图5A-F分别显示经IT及IV注射后，CPN(A-C)及DCPN(D-F)的抗癌治疗效果。A)及E)显示肿瘤体积，B)表示每一群组在终点时肿瘤大小的代表影像，C)表示利用TUNEL测试所观察的凋亡性细胞死亡(比例尺：20μm)，D)肿瘤标靶，及F)体重的记录。以IT及IV注射带有肿瘤的裸鼠后，其体积分别达大概60mm3及150mm3。动物模式以两组处理方式加以处理，包括IT注射(PBS、G2NH2、CPN及顺铂)以及IV注射(PBS、G2NH2、iRGD、DCPN及顺铂)。为避免图表过于复杂，IT的G2NH2及IV的iRGD的数据予以省略。在指定的日子测量肿瘤体积及小鼠体重。每一数据表示给药注射后肿瘤体积平均值的相对变化(n＝5，P＜0.05且n.s表示未具统计上显著性)。SD表误差柱。注射次数以黑色箭头标记。
图6显示CPN的EDS光谱，星星代表Pt讯号。
图7A-C显示CPN及PN聚集特征的比较，这些材料由调控阴离子几何特性而制得。A)代表溶解度，B)代表细胞毒性评估，C)代表胞内吸收效率。
图8A-D是显微影像以比较顺铂诱发的细胞死亡与CPN诱发的细胞死亡的途径。将未经处理或以30μg/mL顺铂予以不同时间处理的MDA-MB-231细胞以annexinV-FITC及PI予以双重染色。上图自左至右分别表示未经处理的细胞(A)及经顺铂处理5小时的细胞(B)。下图则分别表示经顺铂处理10小时(C)及24小时的细胞(D)。比例尺：50μm。
图9显示CPN生成ROS。将MDA-MB-231细胞在37℃、5％CO2大气压下培养于RPMI1640培养基中(其中添加10％胎牛血清)。将细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养盘中，在37℃下培养24小时。之后以不同处理替换培养基，包括仅G2HN2、CPN、顺铂及0.03％H2O2。每次测试进行3小时不更换培养基，移除细胞培养基的上清液后，分离细胞并利用CM-H2DCFDA(INVITROGENTM)进行ROS测试。
图10A显示BA的预估安全剂量及处理时间。值得注意的是，已知BA易于透过破坏粒线体功能而导致MDA-MB-231细胞死亡。因此，BA的浓度与处理时间必须最小化且缩短，以避免从抑制剂与CPN的增效效果而来的细胞死亡，导致在CPN处理期间BA的存在或不存在并未产生显著的差异。
图10B显示内体/溶酶体pH-上升导致CPN对细胞毒性的影响。
图11显示活性蛋白酶-3免疫染色所观察到CPN所致凋亡性细胞死亡。比例尺：20μm。
图12A-C显示DCPN及其前驱物的1HNMR光谱。
图13显示在终点后CPN的生物清除(bio-clearance)。
图14显示G2NH2涂布可裂解PEG对于肿瘤标靶与抗癌化疗功效的比较。并未发现对于肿瘤抑制具显著功效。肿瘤质量在终点时则显著大于其初始点。
图15显示小鼠的食物摄取量。每一数据代表在药物注射后每一笼内(n＝5)所有食物摄取量。
图16A-D显示在切开的肿瘤内组织H&E染色的比较。图像A)-D)表不同的处理，包括PBS、G2NH2、DCPN及顺铂(放大400倍)。
【具体实施方式】
以下以较特定实施例描述本发明仅作为说明之用，因为各种修饰及变化乃该技术领域的技术人士所熟知者。此处详细说明本发明的各种实施例。至于附图，从整体附图的编号标明其内容。本文中及申请专利范围所用“一”及“该”等用语包含复数含意，除非本文中清楚另有所指。此外，本文中及申请专利范围所用“在其中”包含“在其中”及“在其内”等意义，除非本文中清楚另有所指。再者，本文使用标题及副标题利于读者阅读，该等用法并未影响本案所请发明的范围。以下提供本文所使用部份术语特定的定义。
定义
一般而言，本案说明书所用的术语在本发明的上下文以及每一术语在特定的上下文具有该领域所知的通常意义。以下或本案说明书其他处所讨论的特定术语，提供实施者更多有关实施本发明的指导。为方便起见，特定术语将予以标记，例如使用斜体字及/或使用引号。所使用的标记对于该术语的范围及意义并无影响，本案说明书中所用的术语，不论是否被标记，其范围与意义都是相同的。一件相同的事物当可用超过一种的方式予以说明。因此，此处所讨论任何术均可以替代语言或同义字表示，不论术语是否被详解或讨论，都不会赋予它任何特殊的含意。某些术语提供其同义字，所列举的一或多种同义字亦不将其他同义字的用法排除在外。本案说明书任一处所用实例，包括任何术语的实例仅用于例示本发明，而非限制本发明或任一例示的术语的范围及意义。同样地，不该将本发明限制在本案说明书所载各种实施态样。
除非另有定义，本案说明书所有技术及科学术语具有与该领域技术人士通常地理解的相同意义。如有冲突，以本文，包括本文所定义者予以支配。
本文所用“近似”、“约”或“大概”一般代表对一特定数值或范围的20％以内，较佳者为于10％以内，更佳者为于5％以内。本文中所指数量是“大概的”，即若未被指明，“近似”、“约”或“大概”等术语是可被推论用于本文中。
本文所用术语“纳米团簇”，是指具有小于2nm直径或由少于100个原子所组成的粒子。
六氯铂酸盐阴离子(hexachloroplatinateanion)具有化学式[PtCl6]2-。
树枝状聚合物是重复分枝分子。树枝状聚合物典型上围绕核心呈对称，且多呈球状三维构型。树枝状聚合物亦可根据其代数(generation)产生而分类，其与合成过程中重复分支环的数量相关连。例如，如树枝状聚合物以收敛性合成所制成，且分支反应于核心分子上进行三次，所得的树枝状聚合物被视为第三代树枝状聚合物。每一续代导致树枝状聚合物大约为前一代的两倍分子量。一代、二代及三代树枝状聚合物分别以(G-1)、(G-2)及(G-3)树枝状聚合物表示。
术语“笼状”(caged)是指被放置或限制于笼状物或如同笼状物之内。
术语“希夫碱(Schiffbase)”是指一亚胺功能基。希夫碱由一胺基与醛或酮的羰基所缩合而成。
术语“溶解度”是指断裂、崩解或溶解。
术语“限制”、“捕集的”、“笼状”及“包覆的”均可交互使用。
滤液是指过滤过程后通过滤器所收集的流体/液体。
树枝状聚合物的端点基团一般亦指树枝状聚合物的“终端基”或“表面基团”。具有胺基端点的树枝状聚合物称之为“胺基终端的树枝状聚合物”。
iRGD是一肽(氨基酸链)，其是特异性地辨识并穿透癌肿瘤，但不穿透正常组织。该肽亦显示可递送诊断粒子及药物进入肿瘤。iRGD可大幅增进癌症的侦测与治疗。iRGD有助于共同投药以深入地穿透肿瘤组织。该肽显示在小鼠中，可实质地增进对抗人类乳癌、前列腺癌及胰脏癌的治疗效果，使用MPEG(methoxypolyethyleneglycol(甲氧基聚乙二醇))的1/3剂量即可达到正常剂量的治疗效果。
术语“治疗”或“疗法”是指针对有需要的个体为达治愈、缓解、缓和、治疗、改善或预防疾病或其症状，或改变易染病体质，而投予有效量的治疗剂。该个体是根据健康照顾专业基于任何适当的诊断方式予以鉴定。
术语“有效量”是指对受治疗个体为达到治疗效果所需活性剂的剂量。如该领域技术人士所知悉者，有效剂量是根据投药途径、赋形剂的使用及与其他治疗方法共享的可能性而有所变化。
计算游离Pt：CPN中游离Pt的量＝14.4μmol/kg×35原子/1nm。因此，经由IT投予游离Pt为504μmol/kg。DCPN中游离Pt的量＝16.6μmol/kg×35原子/1nm。因此，经由IV投予游离Pt为581μmol/kg。
根据美国卫生部食品药物管理署出版的“(GuidanceforIndustryandReviewersEstimatingtheSafeDoseinClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers)”所示，“人类等剂量”可由以下公式获得：
HED＝动物剂量毫克/公斤×(动物重量(公斤)/人类重量(公斤))0.33。HED会根据其他诸如给药途径等因子而变化。例如以DCPNi.v.投药，假如小鼠(20公克BW)的剂量为16.6μmol/kg，HED经计算而得16.6μmol/kg×(0.02/病人的体重)0.33。至于CPNIT注射，假如小鼠的剂量为7.5mg/kg，HED经计算而得7.5mg/kg×(0.02/病人的体重)0.33。
腐蚀性PN可以藉化学反应(图1，红色矩形)使得腐蚀性PN继续溶解而快速制得，氯离子可加速其溶解速率。我们假设细胞内酸性的胞器(即内体(endosome)及溶酶体)具有质子来源及氯离子以启动腐蚀性PN的溶解使得DNA铂化(DNAplatination)。然而，如何有效地缩小Pt，仍是一项挑战。我们发展一种简单的策略，其使用低代数及胺基终端树枝状聚合物(G2NH2)作为一笼状物捕捉特异性几何阴离子，以形成笼状PN(CPN，图1A)。基于此腐蚀能力，CPN被一额外可裂解的PEG冠(corona)及可标靶分子，诸如iRGD，所修饰，以标靶肿瘤并且释放毒素对抗恶性细胞，藉由脱去外部PEG冠使得抗癌化学疗法在肿瘤内部得以运作(Chien等人”CagedPtNanoclustersExhibitingCorrodibilitytoExertTumor-InsideActivationforAnticancerChemotherapeutics”AdvancedMaterials.2013，25，5067-5073)。
在一方面，本发明关于一种双重笼状铂纳米团簇复合物，其包含(a)树枝状聚合物；(b)包含铂氧化物的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该树枝状聚合物之内；及(c)聚乙二醇(PEG)，其涂布于该树枝状聚合物的表面。该树枝状聚合物可以是胺基终端树枝状聚合物。
在另一方面，本发明关于一种笼状铂纳米团簇复合物，其包含(a)胺基终端树枝状聚合物；及(b)包含铂氧化物及具有平均直径为0.93nm而标准偏差为0.22nm的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该胺基终端树枝状聚合物之内。
根据本发明的一实施态样，铂氧化物选自由PtO、PtOH、PtO2、PtxOy及其任何组合的群组，其中x及y各自独立为一大于0的整数。前述复合物不包含树枝状聚合物的聚合体，且对癌症细胞呈现毒性。
根据本发明的另一实施例，该PEG透过希夫碱与该胺基终端树枝状聚合物的一级胺共轭。该双重笼状铂纳米团簇复合物的表面包含对pH反应或敏感的键结(例如双键)。在酸性条件下，该对pH反应键结呈现分裂及溶解特征，因而提供单一笼状铂纳米团簇复合物(即，胺基终端树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物，在其表面不具有PEG涂布)。
根据本发明的另一实施例，该双重笼状铂纳米团簇复合物呈现眼睛形状的外观。
根据本发明的另一实施例，在pH小于5.0的条件下，该双重笼状铂纳米团簇复合物表现释放Pt2+、PtCl4 2-及/或PtCl6 2-离子的特征。在pH小于5.0的条件下，该铂纳米团簇表现溶解力。
根据本发明的另一实施例，该纳米团簇的直径小于2nm。或者，该纳米团簇具有直径小于3nm的球状。
根据本发明的另一实施例，该树枝状聚合物为聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物。前述的复合物可进一步包含肿瘤侵入性肽，其被吸附在树枝状聚合物的表面。该肽可以是iRGD(CRGDKGPDC；SEQIDNO：1)。
根据本发明的另一实施例，该树枝状聚合物选自由零代(G-0)、一代(G-1)、二代(G-2)及三代(G-3)树枝状聚合物所组成的群组。
根据本发明的另一实施例，前述的复合物不含六氯铂酸盐及/或四氯铂酸盐阴离子。
根据本发明的另一实施例，该胺基终端树枝状聚合物的表面或外围不包含铂纳米团簇。
根据本发明的另一实施例，该笼状铂纳米团簇复合物基本上由以下所组成：
(a)胺基终端树枝状聚合物；及
(b)铂纳米团簇，该铂纳米团簇包含铂氧化物且被限制在该树枝状聚合物之内(内部)。
在另一方面，本发明关于上述笼状或双重笼状铂纳米团簇复合物于制备在有需要个体抑制肿瘤细胞生长的药物的用途。或者本发明关于上述笼状或双重笼状铂纳米团簇复合物于个体所需抑制肿瘤细胞生长的用途。当用于抑制肿瘤细胞生长时，投予上述复合物的有效量给个体。该肿瘤细胞可以是乳房肿瘤细胞，或该个体罹患乳癌。
本发明另一方面关于一种医药组合物，其包含：
(a)治疗有效量的前述的复合物；及
(b)医药上可接受的载剂。
本发明的另一方面关于合成上述笼状铂纳米团簇复合物的方法，其包括下列步骤：
(a)混合包含八面体六氯铂酸盐阴离子的第一溶液与包含胺基终端树枝状聚合物或羟基终端树枝状聚合物的第二溶液以形成包含一PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物；
(b)培养包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物达一段足够的时间；
(c)在PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物中还原PtCl6 2-阴离子以形成包含树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物的混合物；
(d)将该包含树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物的混合物通过过滤器以得到包含树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物的滤液；及
(e)冷冻干燥该滤液以得到树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物。
另一方面，本发明关于一种合成双重笼状铂纳米团簇复合物的方法，其包括：
(i)溶解上述树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物于溶剂中以形成溶液，该复合物包含：
(a)胺基终端树枝状聚合物或羟基终端树枝状聚合物；及
(b)包括铂氧化物的铂纳米团簇，其被限制在该胺基终端树枝状聚合物或该羟基终端树枝状聚合物的内；
(ii)当该树枝状聚合物为胺基终端，加入PEG-醛至该溶液中；或当该树枝状聚合物为羟基终端，加入PEG-NH2至该溶液中；及
(iii)使该PEG-醛与该胺基终端树枝状聚合物的一级胺进行反应；或使该PEG-NH2与羟基终端树枝状聚合物进行反应，藉此获得该双重笼状铂纳米团簇复合物。
步骤(a)、(b)或(c)中的混合物无或不包括银离子、硝酸银或NaBH4。
上述合成复合物的方法可进一步包括纯化树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物，其藉由自其中移除多余的PtCl6 2-。
根据本发明的一实施例，该还原步骤藉由微波辐射而进行。
根据本发明的一实施例，该培养步骤是进行于室温下过夜培养。
实施例
以下所示本发明的各实施例的实施例说明、装置、方法及其相关结果不具限制本发明范围的意图。需要注意的是本文使用标题及副标题利于读者阅读，不应用此限制本案所请发明的范围。再者，此处亦提出并揭示特定理论，然而这些理论，不论是对或错，无须考虑任何特定理论或行动方案，只要根据本发明所实施者均不应以此限制本发明范围。
方法
CPN的合成与特征化
将H2PtCl6(Acros，200μL，30μmol，150mM)及K2PtCl4(UniRegionBio-Tech，200μL，30μmol，150mM)加入分别含有G2NH2、G2OH或G2COOH(Aldrich，94.7μL，5μmol，20wt％甲醇溶液)的去离子水中。在进行微波辐射(CEM，DiscoverLabMateSystem，300W/120℃达30分钟)前，将G2HN2、G2OH或G2COOH与H2PtCl6或K2PtCl4的混合物在室温下培养过夜。还原后，将所沈积的大型铂纳米粒子通过0.22-μm滤纸(Millipore，PES膜，用于铂金纳米团簇)。将溶液冷冻干燥并溶解于～1毫升水中待进一步纯化。使用阴离子交换层析(Merck，FractogelEMDTMAEHicap)进一步去除多余的阴离子(PtCl6 2-及PtCl4 2-)以获致经纯化的CPN及PN聚合物。使用高解析穿透式电子显微镜(HRTEM，JEOL-2010)鉴别该CPN及PN组(assembly)的大小。
MPEG2000-共轭苯甲醛的合成
将对-醛基苯甲酸(TCI，10当量，5mmol，751mg)在室温下溶解于二氯甲烷(20mL)，之后依序加入DCC(Acros，N，N’-二环己基碳二亚胺，10当量，5mmol，1g)、MPEG2000(Aldrich，0.5mmol，1g)及DMAP(α，4-二甲基胺基吡啶，2.5当量，1.25mmol，150mg)。在室温下搅拌反应混合物24小时。将盐滤掉，并浓缩滤液，溶解于异丙醇(20mL)，并在0℃下冷却达2小时。利用过滤收集所的结晶并以乙酸乙酯予以洗涤。将粗产物溶解于四氢呋喃，并逐滴加入乙醚中。将沉淀物以乙醚洗涤两次。在减压条件下以蒸发方式回收MPEG2000-苯甲醛，呈白色粉末状。MPEG2000-苯甲醛(CDCl3)的1HNMR(Varian，400MHz)：d3.64(MPEG2000的质子)，7.96(d，2H)，8.22(d，2H)，10.11(醛，s，1H)。
DCPN的合成
将CPN(5μmol)溶解于DMSO(15mL)。将MPEG2000-苯甲醛(40μmol，86mg，根据上述步骤制得)或MPEG2000-NH2(40μmol，86mg，商业上可取得者)加入含有CPN的溶液中，在37℃下分别以G2HN2或G2OH予以围笼达4小时。必须注意衍生自G2OH及G2COOH的CPN，其羟基/羧基终端的基团可能部份转换为醛基终端的基团，透过希夫碱进行MPEG2000-NH2反应。之后移除DMSO，将粗化合物以SEPHADEXTMG-10管柱予以纯化，以甲醇作为冲提液。在减压条件下以蒸发方式回收DCPN，呈蓝色粉末状。DCPN(d-DMSO)的1HNMR(Varian，400MHz)：d3.50及3.60(MPEG2000的质子)，6.76(d，br，2H)，7.29(d，br，2H)，8.47(亚胺，s，1H)。
具标记cy5.5的DCPN的合成
将CPN(5μmol)溶解于DMSO(15mL)，并加入Cy5.5-NHS(GEhealthcare)作为配置溶液(10mg/mL，5μmol，564μL)。该反应混合物在37℃下搅拌16小时，之后再将MPEG2000-苯甲醛(40μmol，86mg)加入该溶液中，在相同的条件下达4小时。之后移除DMSO，将粗化合物以SEPHADEXTMG-10管柱予以纯化，以甲醇作为冲提液。在减压条件下以蒸发方式回收DCPN，呈蓝色粉末状。DCPN标记Cy5.5(d-DMSO)的1HNMR(Varian，400MHz)：d3.38及3.49(MPEG2000的质子)，6.66(d，br，2H)，7.23(d，br，2H)，8.49(亚胺，s，1H)。
细胞毒性
MDA-MB-231细胞株(生物资源及研究中心，台湾)在37℃、5％CO2大气压下培养于添加10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。24孔细胞培养盘以1×105细胞/孔的密度在37℃下进行培养24小时。培养基根据不同的处理(仅G2HN2、卡铂、顺铂及CPN)以不同的浓度予以替换(三次重复)。试验进行三天不更换培养基，将覆盖细胞的培养基移除后，将细胞置于3-(4，5-二甲基塞唑-2基)-2，5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT，Sigma，MO，USA)37℃下1小时。经处理后，将MTT甲腊产物(formazan)溶解于DMSO并以传统ELISA检测仪在570nm波长定量。为校正之用，在同样的条下，另实施24孔盘作为空白试验。
为确认活体外溶解度，将CPN及巴佛洛霉素(bafilomycin)A1(BA)，一种液泡形式的H+-ATPase强抑制剂共同处理以进行MDA-MB-231细胞活性试验。24孔细胞培养盘以1×104细胞/孔的密度在37℃下培养24小时。已知BA透过破坏粒线体功能可轻易导致细胞死亡。因此，以低浓度BA(≤0.2μM)逐步地改变内体/溶酶体pH值，并缩短处理时间至6小时。将细胞置于0.1μM或0.2μMBA与CPN(45μg/mL)中于37℃下培养达6小时，之后以PBS洗涤。每一孔中加入WST1试剂(25μL/孔)，将混合物反应达两小时后进行测定。
细胞凋亡测试
进行细胞凋亡的过程中，使用凋亡测试套组(INVITROGENTM)估计细胞数目。利用荧光显微镜，将细胞培养在含有SPNP的培养基的35-mmμ-皿(ibidi)中达不同时间，根据操作指示利用荧光染剂AnnexinV-FITC/碘化丙啶(PI)套组染色凋亡细胞。在共焦显微镜(OlympusFVI0i)下观察被染色的细胞。
细胞摄入途径的分析
将MDA-MB-231细胞置于6孔培养皿中，以1×105细胞/孔的密度在37℃下培养24小时。将培养基以含有特定胞饮作用抑制剂(氯丙嗪(chloropromazine)10μg/mL或利尿剂阿米洛利(amiloride)1mM或抗霉菌剂宁司泰定(nystatin)25μg/mL)的培养基所取代，并预先培养15分钟。移除培养基后，再加入含有CPN及抑制剂的培养基。对照组则仅含有CPN。将培养基移除两小时后，以冰冷的PBS洗涤。胰蛋白酶消化后，收集细胞，以冰冷PBS洗涤两次后，离心(2000g，4℃，5分钟)，储存于-20℃下待分析。为测定细胞的铂含量，利用TritonX-100溶液(1％w/w)使细胞丸粒予以均质化，稀释后以感应耦合电浆质谱仪(ICP-MS)进行铂分析。三次测试后得平均值作为结果。
TUNEL试验
末端脱氧核苷酸转移酶-调控dUTP断裂口及标记(TUNEL)试验用于凋亡性细胞死亡的原位侦测。将肿瘤组织(4微米厚度)冷冻切片予以回温至室温，以PBS洗涤切片三次以去除OCT(一种为冷冻组织所使用的包埋培养基)。根据套组标准程序进行标记。以3，3’-二胺基联苯胺(DAB，Thermo，S20124-2)染色切片，的后以苏木紫进行复染，并予以固定在玻璃盖玻片上以光学显微镜进行侦测。
免疫组织化学
肿瘤组织(4微米厚度)冷冻切片予以回温至室温下，以PBS(5分钟/次)洗涤切片三次并以新鲜配置含有4％三聚甲醛的PBS予以固定15分钟。在4℃下将该固定切片浸于多株兔子抗小鼠活性蛋白酶-3抗体(AbcamInc.，ab2302，10％BSA或PBS中5μg/mL，50μL)过夜，之后以PBS洗涤(三次，15分钟/次)，并与过氧化酶共价结合的多株山羊抗兔子抗体(AbcamInc.，ab6721-200，PBS中以1∶500(v/v)，100μL/样本)在室温下培养两小时。这些切片先以DAB染色，续以苏木紫复染，并予以固定在玻璃盖玻片上以光学显微镜进行侦测。
动物模型及肿瘤抑制
七周大雌性Balb/c裸鼠(16-20克)，在24±2℃、50±10％相对湿度条件下，在12小时光照/12小时暗室循环的环境下，自由取用食物及水。每只小鼠接受皮下注射2×106细胞以建立乳癌肿瘤模型。利用数字光标卡钳测量肿瘤的最长(a)及最短(b)直径，以公式V＝0.5a×b2计算肿瘤体积(V)。当肿瘤体积达大约60mm3及150mm3，分别以IT及IV注射方式投以CPN及DCPN。进行肿瘤抑制的比较功效的研究。小鼠每周一次接受IT注射投以CPN，共达三周。类似地，小鼠每周一次接受IV注射投以DCPN，共达四周。注射量为5微升/克体重，而每2至3天计算肿瘤体积。牺牲小鼠后，收集肿瘤及血液并置于EDTA玻璃管中。
结果
我们使用低代数、胺基终端树枝状合物(G2NH2)作为笼状物以捕捉特定几何阴离子以形成笼状PN(CPN，图1A，途径ii)。该CPN进一步以额外可裂解PEG冠及可标靶分子，诸如iRGD(CRGDKGPDC；SEQIDNO：1)所修饰，以标靶肿瘤并且释放毒素对抗恶性细胞，其是脱去外部PEG冠使得抗癌化学疗法在肿瘤内部得以运作(图1B)。
我们选择G2NH2作为笼状物是因为其生物安全疑虑较低，可限制该PN大小至原子级并提供适用于胞吞作用。然而，因G2NH2具有一似星状的结构及周围胺基基团，使得其作为笼状物仍有挑战性，因为它倾向于形成大型纳米粒子，而非小型的纳米团簇，且透过周围胺基与金属阴离子间的配位(coordination)交互作用使得该树枝状聚合物聚集化。为克服这些限制，使用具不同几何形状的两个阴离子，平面(PtCl4 2-)及八面体(PtCl6 2-)，其自发地分别与G2NH2外部及内部结合。PtCl4 2-很容易地与G2NH2的周围胺基进行取代反应。PtCl4 2的亲核性置换导致其与G2NH2交联，并因此阻挡阴离子进入G2NH2孔(图1A，途径i)。经还原反应后，亲金属作用(metallophilicattraction)使得周围Pt离子倾向于在树枝状聚合物的外部形成PN。相反地，具有立体阻碍的八面体阴离子(PtCl6 2-)缓慢地进行取代反应与周围胺基键结，透过三级胺与PtCl6 2-之间的静电反应，促进G2NH2之内部捕捉，进而形成PN(图1A，途径ii)。
使用拉曼光谱仪检定何种复合物导致取代反应。如图2A-B所示，PtCl4 2-/G2NH2复合物在250cm-1处有一明显的带(band)，可被指定为N-Pt-N弯曲振动，显示PtCl4 2-配位体易于遭到G2NH2周围胺基的置换。相反地，PtCl6 2-/G2NH2复合物在250cm-1处则未见显著的波峰，显示PtCl6 2-的立体结构阻碍G2NH2配位体置换。此外，TEM测量提供直接的证据显示这两种复合物(即PtCl4 2-/G2NH2及PtCl6 2-/G2NH2)具有其协调上的差异性。显然地，平面正方形阴离子(PtCl4 2-)可见其在还原前以不同内径诱导G2NH2交联作用以形成树枝状聚合物的聚合体(图2C)。一旦PtCl4 2-/G2NH2复合物经微波处理还原后，可产生PN并沿着树枝状聚合物的聚合物的周围集合(图2E，白色方块及箭头)。相反地，PtCl6 2-/G2NH2复合物的TEM影像仅观察到小型纳米粒子(大概5毫米)(图2D)，其大小仅略大于单独的G2NH2，暗示阴离子斥力导致G2NH2孔胀大。令人惊奇的是，我们发现当PtCl6 2-/G2NH2复合物还原时，在其TEM影像上有几个类眼状的纳米粒子(图2F)。明显地，PN被笼状在G2NH2中以形成具有约4毫米直径的类眼状结构。此外，内部纳米团簇的直径估计为0.93±0.22nm。因此，我们认为PN如图1A(途径ii)所预期的被笼状在G2NH2中。利用阴离子交换层析移除多余的阴离子型阴离子后，以能量弥散x射线谱仪(EDS)测量CPN。图5显示元素Pt的特性波峰，确认PN的存在。
检测它们在水中的溶解度。相较于CPN，在树枝状聚合物的聚集物的周围聚集的PN表现较差的水溶性(图7A)。可能是因为周围胺基被PN聚集所阻挡，因此降低其溶解度。图7B显示CPN较PN聚集对癌细胞表现较强的毒性，其可能原因与CPN具有极佳的溶解度，进而最大化癌细胞的胞内吸收作用有关。以CPN处理24小时后的细胞，比起以PN聚集处理的细胞，具有较高的Pt累积(图7C)。
人类乳癌细胞株DA-MB-231被用来研究为何CPN可以杀死癌细胞。CPN的IC50值约为37μg/mL，其高于顺铂(7μg/mL)并略高于卡铂(35μg/mL)(图3A)。DA-MB-231细胞分别以CPN及顺铂处理，并接着以annexinV-FITC(一种用于细胞凋亡的绿色染剂)及碘化丙啶(PI，一种用于细胞坏死的红色染剂)双重染色，以观察时间依赖性细胞凋亡与坏死(图3B)。未经处理的对照组并未发现明显的荧光反应(左上方图)。处理组的早期仅自annexinV-FITC发现绿色荧光反应(右上方图)，此即显示以CPN处理的DA-MB-231细胞表现细胞凋亡的还原现象。经过长时间的培养后观察到阳性PI染色(下方图)，显示死细胞增加。图8显示顺铂诱导细胞死亡的类似结果。CPN诱导细胞死亡的外表型可能与顺铂处理的细胞类似，其机制已知为DNA断裂。
图9显示CPN及顺铂均未表现显著ROS增加或减少，显示ROS生成并未参与细胞死亡。再者，若CPN如同大块Pt的钝性，那么不会有毒性离子溶解。因此我们假设具有约1nm大小的CPN已被氧化以形成腐蚀性PN而进一步被溶解。为证实此一可能性，我们利用x射线光电光谱仪(XPS)检测表面氧化的程度。图4A显示来自CPN的Pt(4f7/2)的主要波峰在于73.4eV，其高于Pt纳米粒子(＞1nm，大约71.2eV)。这相对而言较高的键结能量(即73.4eV)来自Pt氧化物，可能是来自PtO的PN。亦利用XPS检测O(1s)光谱以粗略估计CPN的氧含量，O(1s)波峰的键结能量在于531.8eV，不能被归于前述研究的数值，因为CPN已被笼在树枝状聚合物中而改变O(1s)的键结能量。然而，相较于单独G2NH2，CPN的O(1s)波峰仍有显著的增加(图4B)，显示CPN被氧化。在氧化的状态下，当CPN被酸性的胞器内化，低pH条件及氯离子可促进CPN的溶解。
我们藉由调整培养温度以及使用各种专一性抑制剂来检测CPN内化的途径。首先，DA-MB-231细胞在37℃下以CPN处理作为对照组(图4C，第1栏)。其次，当处理温度调整至冷却后及冷却前为4℃时，CPN的摄入分别剧烈地降到～50％(第2栏)及～10％(第3栏)，显示由能量依赖性途径，例如内体途径(endosomalroutes)所控制。最后，将细胞与不同胞饮作用抑制剂共同培养，相较于利尿剂阿米洛利(第5栏)及抗霉菌剂宁司泰定(第6栏)，仅氯丙嗪(第4栏)，一种格形蛋白调控胞饮作用的抑制剂，显著地抑制细胞内CPN的累积。我们认为透过格形蛋白调控胞饮作用(clathrin-dependentendocytosis)，CPN可被摄入至细胞内，其与单独PAMAM树枝状聚合物的内化途径一致。我们也发现，CPN的胞内分布可与溶酶体追踪共同定位(图4D)。此即暗示CPN可进入这些酸性内体/溶酶体以进行可能的溶解。为定量Pt离子，将CPN完全溶解于王水(3∶1HCl/HNO3)作为阳性对照组，另将CPN分别以水(第2栏)、pH值～5的酸性溶液(第3栏)及含有80mMNaCl的pH值～5的酸性溶液(第4栏)处理。结果发现含有80mMNaCl的pH值～5的酸性溶液中Pt离子量显著地提升，显示CPN具有对pH值敏感的溶解性。为确认活体外溶解度，将MDA-MB-231细胞与0.1μM或0.2μM巴佛洛霉素A1(bafilomycin(BA)，一种液泡形式的H+-ATPase的强抑制剂)与CPN共同处理。经BA处理后，MDA-MB-231细胞之内体/溶酶体pH值略微增加，原因在于当BA存在时(估计的安全剂量如图10A所示)，MDA-MB-231细胞表现低容忍度。图10B显示CPN诱导的细胞死亡在短时间内可被显著地逆转。此即显示减少内体/溶酶体的酸化现象会破坏Pt的释放。因此，CPN可预防与生物环境间所产生的预熟交互作用(prematureinteraction)，以将系统性毒害最小化。
在小鼠身上利用皮下乳癌异种移植，以瘤内(IT)注射方式评估CPN的治疗效果。针对不同药物，例如CPN及顺铂，其最大容忍剂量(MTD)如表一所示。IT注射后，相较于另两组对照组(PBS及G2NH2)，CPN及顺铂表现显著抑制肿瘤的功效(图5A-B)。此外，可藉由TUNEL测试侦测到DNA断裂(图5C)，即，经CPN及顺铂处理48小时后可见褐色细胞核(TUNEL-阳性染色)；而对照组则呈蓝色细胞核(TUNEL-阴性细胞)。我们也使用免疫组织化学分析检测活性蛋白酶-3以进一步确认CPN杀死癌细胞确实导致细胞凋亡，如同顺铂杀死癌细胞一样(图11)。因此，CPN处理的细胞的死亡途径可能类似于顺铂处理的细胞。我们要确认是否将CPN注射入血管中启动肿瘤内活化反应，进而达到抗癌化疗功效。因此，将CPN额外涂布可裂解的PEG涂层预防静脉(i.v.)注射后蛋白质附着形成双重笼状PN(DCPN)。DCPN的特征如图12所示，且PEG冠在拟肿瘤pH(pH6.8)情况下自DCPN裂解。为使DCPN具有标靶功能，iRGD肿瘤侵入性肽及DCPN经IV共同投予给患有乳癌的皮下异种移植裸鼠。每只小鼠的肿瘤生长至150mm3，以促进DCPN传递。此外，将DCPN及对照组的一(G2NH2涂布PEG冠)预先与NIR染剂(cy5.5)接触，以利于在投予药物后进行实时追踪。为利于比较，所有群组包括PBS、G2NH2、DCPN及顺铂均共同给予iRGD，以静脉注射方式给予小鼠达四周。图5D例示治疗后肿瘤有一明显cy5.5讯号，显示DCPN肿瘤标靶性。该讯号在第1天注射后4小时后达到平线区，显示CPN的聚乙烯二醇化会促进血液循环增加肿瘤吸收。相较于肺脏及心脏，cy5.5讯号在肝脏及脾脏相当地微弱，显示PEG外套膜也会降低DCPN在肝脏中的累积。已知低代数的树枝状聚合物(G2NH2，n＜5)可轻易地由排尿所排出。在此，在肿瘤及其他器官中的讯号会在第14天逐渐减少，并集中在肾脏。直到第31天，肾脏中的讯号明显地减少，显示已被尿液排出。图13例示不同器官中(脑、心脏、肺脏、肝脏、胰脏及肾脏)残余Pt的量少于15％(表二)，显示DCPN被排出。在7天间隔/周经由IV注射给予相同的剂量(16.6μmol/kg)，图5E显示相较于两组对照组(PBS及G2NH2)，DCPN及顺铂确实可以导致肿瘤委缩。而G2NH2单独存在者涂布可裂解PEG冠亦表现显著的肿瘤标靶功效(图14)。不同于给予小鼠投以DCPN，在PN不存在的情形下，肿瘤的生长不会被抑制。再者，我们也观察在小鼠的副作用，相较于投予顺铂，投予DCPN并未显著减少小鼠的体重(图5F)，亦未减少食物的摄取(图15)。四组连续的组织切片，包括对照组、顺铂、G2NH2及DCPN以苏木紫及曙红染剂(H&E)于终点染色，进行组织学检查，将切片进行独立病理学检查(图16)。经治疗后，DCPN也会导致细胞坏死，其效应类似顺铂。
表一及二分别例示活体内实验所用Pt剂量及预估DCPN排出量：表一
a顺铂分子量为301
bCPN分子量＝G2NH2+1nm纳米团簇(35原子Pt)＝3256+195×35＝10,081
cDCPN分子量＝8(PEG2KD)+G2NH2+1毫米纳米团簇(35原子Pt)＝8×2000+3256+195×35＝26,081
**CPN中游离Pt量＝14.4μmol/kg×35原子/1nm。因此，经IT投药的游离Pt量为504μmol/kg。
**DCPN中游离Pt量＝16.6μmol/kg×35原子/1nm。因此，经IV投药的游离Pt量为581μmol/kg。
表二
在器官中的累积量＝A1+A2+A3+A4+A5+A6＝1029.8(μg)＝1.0928mg
∵DCPN＝16.6μmol/kg；1nm＝35Pt原子；PtMW＝195；小鼠体重～20克；
∴游离Ptb＝16.6μmol/kg×35＝581μmol/kg。
581μmol/kg×195＝113.3mg/kg。
113.3mg/kg×0.02kg＝2.27mg。
∵注射次数＝4∴2.27mg×4＝9.06mg
因此，残余Pt＝(1.0928/9.06)×100％＝11.4％
---------------------------
ND：未侦测到
a以ICP-Mass测得该数值，如图13所示。
b在CPN及DCPN中游离Pt像相同，如表一所示。
----------------------------------
总之，以上所揭示的为特定设计的PN(即CPN)，其具有肿瘤内活化特性，可将系统性毒害最小化而用于抗癌化疗。藉由限制Pt的大小至原子级(0.93±0.22nm直径)，以赋予其在于纳米级医药应用上作为前药极具吸引力的特性。特定言之，PN易于被氧化，使得其失去内因性化学钝性，并获得表面腐蚀性以至于进一步在弱酸性胞器中，例如内体及溶酶体，溶解以释放毒性Pt离子造成DNA铂金化(DNAplatination)。此途径的关键即在于控制PN的大小。因此，本发明提供一种新颖合成策略，其是基于笼住一特定几何胺基至G2NH2内部。本发明已证实CPN在活体内显著地抑制肿瘤生长，其将CPN以pH-可裂解PEG冠予以后修饰，并混合肿瘤导向性肽，进而在肿瘤内进行活化作用。

Claims (20)

1.一种双重笼状铂金纳米团簇复合物，其包含：
(a)树枝状聚合物(dendrimer)；
(b)包含铂氧化物的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该树枝状聚合物之内；及
(c)聚乙二醇(PEG)，其涂布于该树枝状聚合物的表面。
2.如权利要求1的复合物，其中该铂氧化物选自由PtO、PtOH、PtO2、PtxOy及其任何组合的群组，其中x及y各自独立为一大于0的整数。
3.如权利要求1的复合物，其中该树枝状聚合物是胺基终端树枝状聚合物。
4.如权利要求3的复合物，其中PEG透过希夫碱(Shiffbase)与该树枝状聚合物的一级胺共轭。
5.如权利要求1的复合物，其中该复合物的表面包含对pH反应的键结。
6.如权利要求1的复合物，其进一步包含吸附在树枝状聚合物的表面上的肿瘤穿透肽。
7.如权利要求1的复合物，其中在pH小于5.0的条件下，该复合物表现释放Pt2+、PtCl4 2-及/或PtCl6 2-离子的特征。
8.如权利要求3的复合物，其中在pH小于5.0的条件下，该铂纳米团簇呈现溶解力。
9.如权利要求1的复合物，其中该纳米团簇具有小于1.3nm的平均大小。
10.如权利要求1的复合物，其中该树枝状聚合物选自由零代(G-0)、一代(G-1)、二代(G-2)及三代(G-3)树枝状聚合物所组成的群组。
11.一种如权利要求1至10中任一项的双重笼状铂纳米团簇复合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
12.一种合成如权利要求1至10中任一项的双重笼状铂纳米团簇复合物的方法，其包括：
(a)混合包含八面体六氯铂酸盐阴离子的第一溶液与包含胺基终端树枝状聚合物或羟基终端树枝状聚合物的第二溶液，以形成包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物；
(b)培养该包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物达一段足够的时间；
(c)还原该PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物中的PtCl6 2-阴离子，以形成包含树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的混合物；
(d)将包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的混合物通过过滤器，以得到包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的滤液；
(e)冷冻干燥该滤液以得到树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物；
(f)溶解该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物于溶剂中以形成溶液；
(g)当该树枝状聚合物为胺基终端，加入PEG-醛至该溶液中；或当该树枝状聚合物为羟基终端，加入PEG-NH2至该溶液中；及
(h)使PEG-醛与该胺基终端树枝状聚合物的一级胺进行反应；或使PEG-NH2与羟基终端树枝状聚合物进行反应，并由此获得该双重笼状铂纳米团簇复合物。
13.一种笼状铂纳米团簇复合物，其包含：
(a)胺基终端树枝状聚合物；及
(b)包含铂氧化物及具有平均直径为0.93nm而标准偏差为0.22nm的铂纳米团簇，该铂纳米团簇被限制在该胺基端树枝状聚合物之内。
14.一种合成如权利要求13的复合物的方法，其包括：
(a)混合包含八面体六氯铂酸盐阴离子的第一溶液与包含胺基终端树枝状聚合物或羟基终端树枝状聚合物的第二溶液，以形成包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物；
(b)培养该包含PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物复合物的混合物达一段足够的时间；
(c)还原该PtCl6 2-阴离子/树枝状聚合物的复合物中的PtCl6 2-阴离子，以形成包含树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的混合物；
(d)将包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的混合物通过过滤器，以得到包含该树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物的滤液；及
(e)冷冻干燥该滤液以得到树枝状聚合物笼状铂的纳米团簇复合物。
15.如权利要求12或14的方法，其中该还原步骤藉由微波辐射进行。
16.如权利要求12或14的方法，其中该培养步骤在室温下过夜培养进行。
17.如权利要求12或14的方法，其中步骤(e)进一步包括纯化树枝状聚合物笼状铂纳米团簇复合物，其藉由自其中移除多余的PtCl6 2-而进行。
18.如权利要求1至10及13中任一项的复合物，其中该树枝状聚合物是聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物。
19.如权利要求1至10及13中任一项的复合物，其不含六氯铂酸盐和/或四氯铂酸盐阴离子。
20.如权利要求1至10及13中任一项的复合物，其中该复合物对癌细胞呈现细胞毒性。
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