TWI507191B - 含ｓｒｃ同源區２蛋白酪胺酸磷酸酶－１增效劑及其治療方法 - Google Patents

含ｓｒｃ同源區２蛋白酪胺酸磷酸酶－１增效劑及其治療方法 Download PDF

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Description

含SRC同源區2蛋白酪胺酸磷酸酶-1增效劑及其治療方法
本發明係關於一種具有含Src同源區-2的蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)促進劑活性的新穎化合物，以及使用該化合物的治療方法。
SHP-1，一種帶有二個Src同源區2(SH2)結構區域的蛋白酪胺酸磷酸酶，是一種對不同的細胞內信號分子的調節劑，例如信號轉導因子和轉錄激活因子3(STAT3)、KIT、CD22、CD5、CD72、SHPS-1、TIMP(金屬蛋白酶)、CDK2、p27、SRC、ZAP70、介白素10(IL-10)、NF-κB、Lck、3BP2、Lyn，以及細胞週期素D1。
STAT3是一種藉由調制目標基因的表現來調節細胞生長和存活的轉錄因子。它在許多癌症中作為構成型活化的致癌基因，包含肝癌、肺癌、頭部及頸部、前列腺癌、乳癌、骨髓癌以及白血病。SHP-1是STAT3活性的一個關鍵調節因子。從機構的觀點來看，SHP-1顯現蛋白磷酸酶的活性，進而減少磷酸化-STAT3(P-STAT3)的濃度，並隨後阻斷P-STAT3的二聚合作用。因此，目標基因的表現，例如由STAT3轉錄的細胞週期素D1以及生存素，明顯地減少。此外，SHP-1蛋白以及SHP-1 mRNA的研究顯示，在大部份的癌細胞中SHP-1的表現量低；且在癌細胞中SHP-1基因表現的增加導致細胞生長的抑制，這意味著SHP-1基因具有腫瘤抑制因子的作用。從藥物發現的觀點來看，開發一種可以減少P-STAT3以及增加SHP-1濃度的小分子是一個很有前景的癌症治療方向。SHP-1並且在骨骼再成型中扮演一個重要的角色，骨骼再成型是一種造骨細胞形成骨骼以及噬骨細胞再吸收骨骼的過程。SHP-1的功能喪失造成噬骨細胞活性的增加且 最終導致骨質疏鬆症。因此，增強SHP-1的活性可能是對骨質疏鬆症患者的一種治療方向。此外，SHP-1的增加對於多發性硬化症患者的巨噬細胞而言是有益的。
本發明係基於意外地發現新設計的化合物可作為SHP-1促進劑以及具有減少P-STAT3的能力，且對於治療某些疾病，如癌症，是有用的。特定而言，本發明之化合物並不阻斷如Raf-1以及VEGFR2等激酶的活性。
具體而言，在一方面，本發明提供一種式I的化合物
其中R1 、R2 、以及R3 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -、或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
在另一方面，本發明提供一種式II的化合物，包括式II(a)的化合物、式II(b)的化合物、或式II(c)的化合物。
其中R4 、R5 以及R6 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
在又另一方面，本發明提供一種式III的化合物
其中R7 係為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯 基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
本發明並提供一種包含一或多種上述化合物的醫藥組合物。本發明之醫藥組合物可用於增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性，或是用於治療以含Src同源區-2的蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症，包括但不限於癌症(如：肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、頭部及頸部癌症)、硬化及骨質疏鬆症。而且使用任一上述化合物以增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性，或治療本文所述的以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症，以及使用任一上述化合物以製造用以治療該疾病或病症的藥物也在本發明的範圍之內。
本發明並提供一種增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性的方法，包含將該細胞與一有效量的本文所述之化合物或醫藥組合物接觸。
本發明並進一步提供一種在需要SHP-1的個體中治療以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症的方法，包含將本文所述之化合物或醫藥組合物以有效量投與至該個體。
本發明之各種具體實施例詳述如下。本發明之其他特徵將會由以下關於各種具體實施例及申請專利範圍的詳細描述和圖式清楚地呈現。
一般認為，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以根據此處之描述且無需進一步闡釋，而將本發明利用到其最廣泛之範圍。因此，以下之描述應當被理解為作為示範之目的，而非以任何方式限制本發明之範圍。
為了說明本發明，顯示於圖式中的為目前較佳的具體實施例。然而，本發明應當被理解為不限於圖式中所示之較佳具體實施例。
在圖式中：圖1所示為索拉非尼(sorafenib)及化合物SC-1的化學結構。
圖2所示為本發明式I、II、及III化合物之一般合成的程序。
圖3所示為在分別用索拉非尼及化合物1處理的細胞內的Raf-1活性。Huh-7細胞暴露於10 μM索拉非尼或化合物1的環境下24小時，接著將其細胞裂解物進行raf-1活性分析。柱代表平均值；條帶代表標準差(n=3)；＊ P <0.05。
圖4所示為化合物1-25及索拉非尼，每種化合物以10 μM濃度處理PLC5細胞24小時後，對於在PLC5細胞內經IL-6刺激的P-STAT的抑制效果的ELISA分析結果。柱代表平均值；條帶代表標準差(N=3)。
圖5所示為化合物1及12，分別以5 μM及10 μM濃度於含FBS培養基內處理PLC5細胞24小時後，對於PLC5細胞內P-STAT3、STAT3、細胞週期素D及生存素的磷酸化的影響的西方墨點分析結果。
圖6所示為(A)化合物1及12，分別以5 μM及10 μM濃度處理PLC5細胞24小時後，誘導細胞死亡的ELISA分析結果；及(B)所示為化合物1及12，分別以5 μM及10 μM濃度處理PLC5細胞24小時後，誘導細胞死亡的流式細胞儀分析結果。
圖7所示為(A)索拉非尼及SC-1對於HUVEC細胞內磷酸化-VEGFR2的影響，其中該細胞係以10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時；(B)索拉非尼及SC-1對Raf-1活性的影響，其中該細胞係以10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時。點代表平均值；條帶代表標準差(n =6)。
圖8所示為(A)索拉非尼及SC-1對四種肝癌細胞株的細胞存活率的影響，該影響是隨劑量而遞增的，其中該細胞係以指示劑量的索拉非尼或SC-1處理72小時，並以MTT分析法分析細胞存活率；以及索拉非尼及SC-1對四種肝癌細胞株的細胞凋亡的影響，該影響是隨劑量而遞增的，其中該細胞係以指示劑量的索拉非尼或SC-1處理24小時，並將細胞裂解液以流式細胞儀(B)，或細胞死亡ELISA(C)分析。點代表平均值；條帶代表標準差(n =6)。
圖9所示為(A)索拉非尼或SC-1對STAT3-相關的蛋白質 的影響，其中該細胞係以10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時；(B)索拉非尼或SC-1對PLC5細胞內磷酸化-STAT3的影響，該影響是隨劑量而遞增的，其中該細胞係以指示劑量的藥物處理24小時；(C)索拉非尼及SC-1對STAT3活性的影響(左 ，磷酸化-STAT3 ELISA；右 ，STAT3的螢光酶報導基因分析)，其中該細胞係以10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時，並測量磷酸化-STAT3 ELISA或螢光酶活性；(D)STAT3對PLC5細胞中由索拉非尼誘導之細胞凋亡的保護效果，其中該細胞(野生型或STAT3的異位表達)係以10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時，並以流式細胞儀分析細胞凋亡的細胞。柱代表平均值；條帶代表標準差(n =3)；＊ P <0.05。
圖10所示為索拉非尼及SC-1對磷酸化-STAT3及細胞凋亡的SHP-1逆轉效果的抑制。A，左 ，釩酸鈉，一種非專一性的磷酸酶抑制劑。右 ，SHP-1專一性的抑制劑。柱代表平均值；條帶代表標準差(n =3)；＊ P <0.05。B，左 ，siRNA引起的SHP-1基因靜默降低了索拉非尼或SC-1對肝癌細胞中磷酸化-STAT3的影響。將對照組siRNA或SHP-1 siRNA轉染至PLC5細胞內24小時，接著以索拉非尼或SC-1再處理24小時。中間 ，PLC5細胞中SHP-1的活性。柱代表平均值；條帶代表標準差(n =3)；＊ P <0.05。右 ，索拉非尼或SC-1對於SHP-1及STAT3之間的蛋白交互作用的影響。以10 μM索拉非尼或SC-1處理PLC5細胞24小時。C，SHP-2基因的剔除並不影響索拉非尼或SC-1對p-STAT3及細胞凋亡的效果。D，PTP-1B基因的剔除並不影響索拉非尼對p-STAT3及細胞凋亡的效果。將對照組siRNA或SHP-2 siRNA或PTP-1B siRNA轉染至PLC5細胞內24小時，接著以10 μM索拉非尼或SC-1再處理24小時。
圖11所示為SC-1在HUVEC細胞中向下調節p-STAT3及誘導細胞凋亡。A，索拉非尼或SC-1在HUVEC細胞中對p-STAT3(左 )及細胞凋亡(右 )的影響。以10 μM索拉非尼或SC-1處理細胞24小時。以流式細胞儀分析細胞凋亡的細胞(sub-G1)。B，SC-1在肝癌組織中對TRAIL增敏作用的影響。以SC-1(10 μM)及/或TRAIL(100 ng/ml)處理PLC5細胞24小時。C，Raf-1基因靜默並不影響藥物對p-STAT3的作用。將對照組siRNA或Raf-1 siRNA轉染至PLC5細胞內24小時，接著以 10 μM索拉非尼或SC-1處理24小時。D，索拉非尼及SC-1對JAK2活性的影響。以10 μM索拉非尼或SC-1處理PLC5細胞24小時。點代表平均值；條帶代表標準差(n =6)。E，索拉非尼及SC-1對SOCS-1及SOCS-3的影響。Sk-Hep1細胞先以介白素-6預處理24小時後，接著於介白素-6存在的條件下以指示劑量的索拉非尼或SC-1再處理24小時。F，STAT-C對於在PLC5細胞中由SC-1引起的細胞凋亡的影響。以10 μM索拉非尼或SC-1處理細胞(野生型或STAT3-C的異位表現)24小時。G，索拉非尼及SC-1對SHP-1的影響。柱代表平均值；條帶代表標準差(n =3)；＊ P <0.05。
圖12所示為索拉非尼及SC-1對Huh-7異體移植裸鼠體內的影響。A，索拉非尼對Huh-7腫瘤具有抗腫瘤效果。左，點代表平均值(n =6)；條帶代表標準差；＊ 代表P <0.05；＊＊ 代表P<0.01。右上 ，在Huh-7腫瘤內p-STAT3及STAT3的西方墨點分析。右下 ，在Huh-7腫瘤內SHP-1的活性。B，SC-1對Huh-7腫瘤具有顯著的抗腫瘤效果。左 ，點代表平均值(n =6)；條帶代表標準差。右上 ，在Huh-7腫瘤內p-STAT3及STAT3的西方墨點分析。右下 ，在Huh-7腫瘤內SHP-1的活性。
圖13所示為SC-1及SC-43在不同癌症細胞株內具有抗增殖效果，包括乳癌細胞株(A)MDAMB231、(B)MDAMB468及(C)MCF-7，以及白血病癌症細胞株(D)HL-60、(E)KG-1及(F)ML-1。
圖14所示為索拉非尼衍生物以劑量依賴方式誘導顯著的細胞凋亡，其中(A)、(B)、(C)、(D)及(E)係指SC-43分別對PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T及SK-Hep1細胞；以及(F)、(G)、(H)、(I)及(J)係指SC-40分別對PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T及SK-Hep1細胞。點代表平均值；條帶代表標準差(n =6)。
圖15所示為SC-43在肝癌細胞中向下調節磷酸化-STAT3-相關的信號傳導途徑，包括PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T及SK-Hep1細胞。
圖16所示為SC-40在肝癌細胞中向下調節磷酸化-STAT3-相關的信號傳導途徑，包括PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T及SK-Hep1細胞。
圖17所示為SC-43在肝癌細胞中對p-STAT3-相關的信號傳導途徑的抑制效果優於索拉非尼，(A)PLC5及(B)Hep3B細胞。
圖18所示為SC-43及SC-40兩者皆可引發p-STAT3活性的強烈抑制作用，(A)及(B)為以p-STAT3 ELISA分別分析SC-43及SC-40，以及(C)及(D)為以STAT3報導基因分別分析SC-43及SC-40。
圖19所示為SC衍生物在體外增加SHP-1的磷酸酶活性，(A)SC-43、(B)SC-40、及(C)SC-49。
圖20所示為SC衍生物在體外增加SHP-1的磷酸酶活性，(A)SC-43及(B)SC-40。
圖21所示為(A)SC-40對PLC5腫瘤的抗腫瘤效果；(B)PLC5腫瘤內p-STAT3及STAT3的西方墨點分析；(C)受測動物的體重；(D)腫瘤重量以及(E)PLC5腫瘤內SHP-1的活性。點代表平均值(n =6)；條帶代表標準差。
圖22所示為SC-43在體外及體內抗腫瘤的效果，(A)SC-43在肝癌細胞內的細胞毒性，(B)SC-43在帶有肝癌的小鼠體內的抗腫瘤效果，(C)由SC-43誘導的SHP-1活性，以及(D)在藉由SC-43處理的肝癌細胞內p-STAT3及STAT3的西方墨點分析(10 μM及20 μM)。
圖23所示為(A)以非侵入性體內成像系統分析處理組小鼠所得的圖像，(B)所示為該小鼠的體重，以及(C)顯示為對照組小鼠及處理組小鼠之間的存活曲線。
除非另有定義，本文所用之所有技術及科學術語與本發明所屬技術領域之技術人員通常理解的含義相同。本文所提及之所有出版物皆以引用方式併入本文，以揭露及描述與該被引用之出版物有關的方法及/或材料。
如本文所使用，單數形式「一」(a、an)和「該」(the)包括複數對象，除非該內文清楚地另有規定。因此，例如，參照「一樣品」包括複數個此類樣品以及本領域之技術人員已知的等同物。
索拉非尼(Sorafenib)(拜耳BAY43-9006，蕾莎瓦膜衣錠) 已被使用於腎癌和肝癌(HCC，hepatocellular carcinoma)的臨床應用上。該藥已知為一多激酶抑制劑，其抑制Raf-1和其它酪胺酸激酶如VEGFR2、VEGFR3、Flt-3、PDGFR、和FGFR-1的活性。
在本發明中，我們研究了索拉非尼的結構與其生物活性之間的關係，並修改了索拉非尼的結構。我們據此開發了一些不具有阻斷激酶活性能力的索拉非尼衍生物，並且意外地發現，至少相較於索拉非尼，這些化合物在某些疾病中，如癌症，具有良好的治療效果。根據本發明，本發明新設計之化合物作用為SHP-1促進劑，且對治療以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症，如癌症(例如：肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、頭部及頸部癌症)、硬化及骨質疏鬆症，是有用的。本發明之化合物亦提供對激酶抑制劑具有抗性的病患一種新的治療選擇。既使在激酶抑制劑存在的情況下，這些腫瘤在治療後仍產生激酶突變，並且以磷酸化活性形式存在。因此，對化療具有抗性的病患而言，腫瘤抑制因子，特別是SHP-1，的向上調節以抑制激酶的活性突變形式，是一種具有前景的治療方向。換言之，本發明之化合物透過一種新的標靶機制(非依賴激酶的)，提供替代的治療選擇，該選擇可能在對傳統醫藥治療具有抗性之癌症的治療上是有幫助的。
在一方面，本發明提供一種式I的化合物
其中R1 、R2 、以及R3 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -、或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、 可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
在一具體實施例中，該式I的化合物包括那些其中R1 、R2 、以及R3 各自獨立，為氫、可經取代的低碳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、或-(C)s NH(C)t Re 。
在另一具體實施例中，該式I的化合物包括那些其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 係各自獨立，為苯基或萘基，此等基可經1至3個選自鹵素、可經取代的低碳烷基(例如經鹵素取代的低碳烷基，如三氟甲基)、可經取代的烷氧基(例如經鹵素取代的低碳烷氧基，如三氟甲基)以及可經取代的芳氧基(例如經氰基取代的苯氧基)所組成之群組中之基取代。
在某些實例中，該式I的化合物為如表1所列之化合物SC-1、SC-48、SC-49、SC-54、SC-55、SC-56、SC-58、SC-43、SC-44、SC-45、SC-50、SC-51、SC-52、SC-59、SC-60以及SC-40其中之一。
在另一方面，本發明提供一種式II的化合物，包括式II(a)的化合物、式II(b)的化合物、或式II(c)的化合物。
其中R4 、R5 以及R6 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
在一具體實施例中，該式II的化合物包括那些其中R4 、R5 以及R6 各自獨立，為氫、可經取代的低碳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、或-(C)s NH(C)t Re 。
在另一具體實施例中，該式II的化合物包括那些其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為苯基、萘基，此等基可經1至3個選自鹵素、可經取代的低碳烷基(例如經鹵素取代的低碳烷基，如三氟甲基)、可經取代的烷氧基(例如經鹵素取代的低碳烷氧基，如三氟甲基)以及可經取代的芳氧基(例如經氰基取代的苯氧基)所組成之群組中之基取代。
在某些實例中，該式II的化合物為如表2所列之化合物SC-31、SC-32、SC-33、SC-34以及SC-35其中之一。
在又另一方面，本發明提供一種式III的化合物
其中R7 係為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、-(C)r (X)NHRd -或-(C)s NH(C)t Re ； 其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；X為氧(O)或硫(S)；以及m、n、p、q、r、s、t為0、1或2。
在一具體實施例中，該式III的化合物包括那些其中R7 各自獨立，為氫、可經取代的低碳烷基、-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、或-(C)s NH(C)t Re 。
在另一具體實施例中，該式III的化合物包括那些其中Ra 、Rb 、Rc 、Rd 以及Re 各自獨立，為苯基、萘基，此等基可經1至3個選自鹵素、可經取代的低碳烷基(例如經鹵素取代的低碳烷基，如三氟甲基)、可經取代的烷氧基(例如經鹵素取代的低碳烷氧基，如三氟甲基)以及可經取代的芳氧基(例如經氰基取代的苯氧基)所組成之群組中之基取代。
在某些實例中，該式III的化合物為如表3所列之化合物SC-36、SC-37以及SC-38其中之一。
術語「鹵素的」或「鹵素」單獨或組合使用係指所有鹵素，如氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)。
術語「羥基」係指基團-OH。
術語「硫基」以及「氫硫基」可互換使用且意指基團-SH。
術語「烷基」單獨或組合使用係指一烷羥衍生的基團，除非另有說明，否則包含1至20個碳原子(C1 -C20 )，較佳地為1至15個碳原子(C1 -C15 )，更佳地為1至10個碳原子(C1 -C10 )。其為一直鏈烷基、支鏈烷基或環烷基，較佳地為直鏈或支鏈烷基，包含1至15，更佳地為1至8，甚至更佳地為1至6，再更佳地為1至4，以及最佳地為1至2個碳原子，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基，叔丁基及其類似物。本文所使用的「低碳烷基」乙詞係用來描述如上所述的直鏈烷基。較佳地，環烷基係為每環3至8個環成員，更佳地為每環3至6個環成員的單環、雙環或三環系統，如環丙基、環戊基、環己基、金剛烷基及其類似物。烷基還包括一直鏈或支鏈烷基，該基團係含有或被一環烷基的部份中斷。該直鏈或支鏈烷基係被附於任何可用的位置以產生一穩定的化合物。此一實例包括，但不限於，4-(異丙基)-伸環己基或2-甲基-環丙基戊基。烷基可經1至3個選自以下的取代基取代：鹵素、羥基、烷氧基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、醯氧基、芳氧基、雜芳氧基、可經烷基、芳基、雜芳基單-或雙取代的胺、脒基、可經烷基、芳基、雜芳基或雜環基取代的脲、可經烷基、芳基或雜芳基進行N-單-或N，N-二-取代的胺基亞磺醯基、烷基磺醯胺基、芳基磺醯胺基、雜芳基磺醯胺基、烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、雜芳基羰基胺基，或類似物。
「烯基」乙詞單獨或組合使用係指一直鏈、支鏈、或環狀的碳氫化合物，包含2至20個碳原子，較佳地為2至17個碳原子，更佳地為2至10個碳原子，甚至更佳地為2至8個碳原子，最佳地為2至4個碳原子，以及至少1個，較佳地為1至3個，更佳地為1至2個，最佳地為1個碳-碳雙鍵。在環烯基的情況下，超過1個碳-碳雙鍵的共軛作用並非是將芳香性賦予該環。碳-碳雙鍵可能包含在一環烷基部份之內，除了環丙基以外，或是包含在一直鏈或支鏈部份之內。烯基的實例包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、環己烯基、環己烯基烷基及其類似物。一經取代的烯基係為先前定義的直鏈烯基、支鏈烯基或環烯基，各自獨立地經1至3個 選自以下的取代基取代：鹵素、羥基、芳氧基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基，各自獨立地經烷基、芳基或雜芳基取代，脒基、可經烷基、芳基、雜芳基或雜環基取代的脲、可經烷基、芳基或雜芳基進行N-單-或N,N-二-取代的胺基磺醯基、烷基磺醯胺基、烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基，或附加在任何可用的位置上以產生穩定化合物的類似物。
「炔基」乙詞單獨或組合使用係指一直鏈、支鏈、或環狀的碳氫化合物，包含2至20個碳原子，較佳地為2至17個碳原子，更佳地為2至10個碳原子，甚至更佳地為2至8個碳原子，最佳地為2至4個碳原子，以及至少1個，較佳地為1至3個，更佳地為1至2個，最佳地為1個碳-碳三鍵。炔基的實例包括乙炔基、丙炔基、異丙炔基、丁炔基、及其類似物。一經取代的炔基係為先前定義的直鏈炔基、支鏈炔基，各自獨立地經1至3個選自以下的取代基取代：鹵素、羥基、芳氧基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基，各自獨立地經烷基、芳基或雜芳基取代，脒基、可經烷基、芳基、雜芳基或雜環基取代的脲、可經烷基、芳基或雜芳基進行N-單-或N,N-二-取代的胺基磺醯基、烷基磺醯胺基、烷基羰基胺基、芳基甲基胺基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基，或附加在任何可用的位置上以產生穩定化合物的類似物。
「烷基烯基」乙詞係指基團-R-CR’=CR”R'''，其中R係為低碳烷基，或經取代的低碳烷基，R’、R”、R'''可各自獨立，為氫、鹵素、低碳烷基、經取代的低碳烷基、醯基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、或經取代的雜芳基，其定義見下文。
「烷基炔基」乙詞係指基團-R-CCR’，其中R係為低碳烷基，或經取代的低碳烷基，R’係為氫、鹵素、低碳烷基、經取代的低碳烷基、醯基、芳基、經取代的芳基、雜芳基、或經取代的雜芳基，其定義見下文。
「烷氧基」乙詞係指基團-OR，其中R係為如定義之低碳烷基、經取代的低碳烷基、醯基、芳基、經取代的芳基、芳烷基、經取代的芳烷基、雜烷基、雜芳基烷基、環烷基、經取代的環烷基、環雜烷基、或 經取代的環雜烷基。
「烷硫基」或「硫代烷氧基」乙詞係指基團-SR、S(O)n=1-2 -R，其中R係為如本文定義之低碳烷基、經取代的低碳烷基、醯基、芳基、經取代的芳基、芳烷基、或經取代的芳烷基。
「醯基」乙詞係指基團-C(O)R，其中R係為氫、低碳烷基、經取代的低碳烷基、芳基、經取代的芳基，及其如本文定義之類似物。
「芳氧基」乙詞係指基團-OAr，其中Ar係為如本文定義之芳基、經取代的芳基、雜芳基、或經取代的雜芳基。
「醯胺基」乙詞係指基團-C(O)NRR’，其中R和R’各自獨立，為如本文定義之氫、低碳烷基、經取代的低碳烷基、芳基、經取代的芳基，及其類似物。
「羧基」乙詞係指基團-C(O)OR，其中R係為如本文定義之氫、低碳烷基、經取代的低碳烷基、芳基、經取代的芳基，及其類似物。
「芳基」乙詞單獨或組合使用係指苯基或萘基，該苯基或萘基係可與環烷基碳環融合，該環烷基較佳地為5至7，更佳地為5至6員環及/或可經1至3個選自以下的取代基取代：鹵素、羥基、芳氧基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基，各自獨立地經烷基、芳基或雜芳基取代，脒基、可經烷基、芳基、雜芳基或雜環基取代的脲、可經烷基、芳基或雜芳基進行N-單-或N,N-二-取代的胺基磺醯基、烷基磺醯胺基、烷基羰基胺基、芳基甲基胺基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基，或其類似物。
「雜環」乙詞係指一飽和的、不飽和的、或芳香族的碳環基團，該基團具有一單環(例如，嗎啉基、吡啶基或呋喃基)或多個稠環(例如，萘吡啶、喹咢啉、喹啉基、吲嗪基或苯並[b]噻吩基)以及在環內具有至少一個雜原子，如氮、氧或硫，該雜原子可經或非經例如，鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺胺基及其類似物所取代。
「雜芳基」乙詞單獨或組合使用係指含有5或6個環原子的單環芳環結構，或含有8至10個原子的雙環芳環，包含一或多個，較佳地 為1至4，更佳的為1至3，甚至更佳地為1至2個雜原子，該雜原子係各自獨立地選自於氧、硫和氮所組成的群組，且可經1至3個選自以下的取代基取代：鹵素、羥基、烷氧基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、醯氧基、芳氧基、雜芳氧基、可經烷基、芳基或雜芳基進行單-或雙取代的胺、脒基、可經烷基、芳基、雜芳基或雜環基取代的脲、可經烷基、芳基或雜芳基進行N-單-或N,N-二-取代的胺基亞磺醯基、烷基磺醯胺基、芳基磺醯胺基、雜芳基磺醯胺基、烷基羰基胺基、芳基羰基胺基、雜芳基羰基胺基，或其類似物。雜芳基亦包括氧化的硫或氮，如亞磺醯基、磺醯基和三級環氮的氮-氧化物。碳或氮原子係為雜芳基環結構的附著點，以使一穩定的芳環可被維持。雜芳基的實例為吡啶基、噠嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、茚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、異噁唑基、氧雜噻二唑基、異噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基及其類似物。經取代的雜芳基含有一個取代基附加在一可用的碳或氮上以產生一穩定的化合物。
「雜環基」乙詞單獨或組合使用係指一具有5至10個原子的非芳香族的環烷基，其中在環內的1至3個碳原子係由雜原子氧、硫、氮所替換，而且可與苯并融合或與5至6員環的雜芳基融合及/或在環烷基的情況下可經取代。雜環基亦包括氧化的硫或氮，如亞磺醯基、磺醯基和三級環氮的氮-氧化物。碳或氮原子係為附著點。雜環基的實例為四氫呋喃基、二氫吡啶基、哌啶基、吡咯啶基、哌嗪基，二氫苯并呋喃基、二氫吲哚基，及其類似物。經取代的雜環基含有一個取代基氮，其附加在一可用的碳或氮上以產生一穩定的化合物。
「經取代的雜芳基」乙詞係指一雜環，該雜環可經一或多個官能基，例如鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物進行單一或多重取代。
「芳烷基」乙詞係指基團-R-Ar，其中Ar為一芳香基，而R為一低碳烷基或經取代的低碳烷基。芳基可經或非經例如鹵素、低碳烷基、 低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物取代。
「雜烷基」乙詞係指基團-R-Het，其中Het為一雜環基，而R為一低碳烷基。雜烷基可經或非經鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物取代。
「雜芳烷基」乙詞係指基團-R-Het AR，其中HetAr為一雜芳基，而R為一低碳烷基。雜芳烷基可經或非經鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物取代。
「環烷基」乙詞係指一含有3至15個碳原子的雙價環的或多環的烷基。
「經取代的環烷基」乙詞係指一含有一或多個取代基的環烷基，該取代基為例如鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物。
「環雜烷基」乙詞係指一環烷基，其中一或多個環上的碳原子係由一雜原子(例如，氮、氧、硫或磷)所替代。
「經取代的環雜烷基」乙詞係指本文定義之環雜烷基，該基團含有一或多個取代基，如鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物。
「烷基環烷基」乙詞係指基團-R’-環烷基，其中環烷基為一環烷基基團，而R為一低碳烷基或經取代的低碳烷基。環烷基可經或非經例如鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧 基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物取代。
「烷基環雜烷基」乙詞係指基團-R’-環雜烷基，其中R為一低碳烷基或經取代的低碳烷基。環雜烷基可經或非經例如鹵素、低碳烷基、低碳烷氧基、烷硫基、乙炔基、胺基、醯胺基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環基、經取代的雜環基、雜芳基、經取代的雜芳基、硝基、氰基、氫硫基、磺醯胺基及其類似物取代。
本發明之化合物可由一般的化學程序所製備，如弗朗西斯凱利(Francis Carey)與理查桑德博格(Richard Sundberg)所著的進階有機化學或評論期刊「Account of Chemical research」內所述的程序。
具體而言，在以下總體圖解內所示的程序提供了本發明某些化合物的合成實例。
式I、II、III的一般合成程序：a為碳酸鉀(K2 CO3 )、二甲基甲醯胺(DMF)； b為吡啶、四氫呋喃(THF)；c為三乙胺(Et3 N)、二氧化二伸乙基。
本發明之化合物經合成後可以色層分析法或結晶法或本領域中已知的任何其他適當的方法進一步純化。
本發明並且提供一種醫藥組合物，包含一或多個上述之化合 物以及一醫藥上可接受的載劑。本發明之醫藥組合物可用於增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性，或用於治療以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症。此外，將任何上述之化合物用於增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性，或用於治療如本文所述之以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症的用途，以及用於治療該等疾病的藥劑的製造也包含在本發明的範圍之內。
本發明並且提供一種增加SHP-1在細胞內的表現量或生物活性的方法，包含將該細胞與一有效量的本文所述之化合物或醫藥組合物接觸。本發明並進一步提供一種在需要SHP-1的個體中治療以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症的方法，包含將本文所述之化合物或醫藥組合物以有效量投與至該個體。
「治療」(動詞)或「治療」(名詞)乙詞包括該特定失調或病症的預防，或與一特定失調或病症有關的症狀的減輕及/或該症狀的預防或消除。
本發明之化合物可以被用於治療以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症。本發明之化合物可以單獨或以醫藥組合物的形式投與人類病患一劑量，該醫藥組合物係與適當的載劑或賦形劑混合，以治療或改善各種以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之病症。一因子(例如SHP-1)的表現量或生物活性的增加或減少可以藉由該因子的基因產物如蛋白質或RNA而容易地偵測到，在來自於一個體的檢體(例如自血液或活體組織而來)中使用本領域已知的檢測方法如酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、西方墨點分析法以及北方墨點分析法進行體外分析其RNA含量、表現蛋白及其類似物的結構及/或活性。根據本發明，以SHP-1的表現量或生物活性減少為特徵之疾病或病症的具體實例包括，但不限於，癌症(例如肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌)及骨質疏鬆症。
具體而言，一「個體」係為一動物，如人類，但也可以是一寵物(例如，狗、貓及其類似物)、經濟動物(例如，牛、羊、豬、馬及其類似物)或實驗用動物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似物)，該動物係需要如本文所述之治療。
本文所述之「有效量」係指在一個體上達到治療效果所需要的活性劑的量，不論是單獨或與一種或多種其他活性劑組合使用。根據給藥途徑、賦形劑的使用，以及與其他活性劑共同使用等不同情況，在由本領域技術人員確認下，有效量各不相同。
適合的給藥途徑可能包括如口服、直腸給藥、黏膜給藥、或腸道給藥；非經口傳輸，包括肌內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈、腹膜、鼻內或眼內注射，並可為補充或緩釋劑型。
本發明之醫藥組合物可以本領域已知之方式製造，例如，透過習用的混合、溶解、乳化、包埋、包封、或凍乾過程製造。因此，根據本發明所提供使用之醫藥組合物係可以常規的方式配製，使用一個或多個生理上可接受的載劑，包含賦形劑及/或助劑，以助於活性化合物的加工而形成醫藥上可使用的製劑。如本文所用，「可接受」係指該載劑必須與該組合物的活性成分相容(且較佳地，能夠穩定該活性成分)，且不會對受治療的個體有害。適當的劑型係取決於所選擇的給藥途徑。
具體而言，針對注射給藥，本發明之化合物可以被配製於例如生理上相容的緩衝液內，如漢克緩衝液、林格氏緩衝液或生理食鹽緩衝液。針對口服給藥，本發明之化合物的配製可經由將該活性化合物與本領域已知的醫藥上可接受之載劑結合，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，及/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，polyvinylpyrrolidone)，以使本發明之化合物可以配製為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及其類似物。針對吸入法給藥，本發明之化合物可被配製為自加壓容器或噴霧器噴出之氣霧噴霧，並搭配使用適當的推進劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。
不需進一步的闡述，一般認為，上面的描述已充分地使本發明能被據以實施。因此，以下特定的實施例係被解釋為僅作為說明之用，而非以任何方式限制本發明所揭露的其餘部分。所有本文中所引用的出版物，包括專利，係透過引用方式將其全部內容併入本文。
實施例1：化學合成 1.1材料
質子核磁共振(1 H-NMR)光譜記錄於核磁共振光譜儀(Bruker DPX300(400 MHz))。化學位移係被報告為δ值(ppm)低磁場，該低磁場來自指示用有機溶液內部的氘代氯仿。峰的多重性係表示如下：s，單峰；d，雙峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，雙重雙峰；ddd，雙重峰組成的雙重雙峰；dt，雙重三重峰；brs，寬單峰；m，多重峰。偶合常數(J 值)係以赫茲(Hz，hertz)表示。反應進程係以在矽膠60 F254板(Merck)上進行薄層色層分析法(TLC，thin layer chromatography)分析而確定。色層分析的純化係於矽膠管柱60(0.063-0.200 mm或0.040-0.063 mm，Merck)，鹼性矽膠中進行。使用市售的試劑和溶劑而無需再純化。化學式縮寫如下所示：CDCl3 ，氘代氯仿；DMSO-d 6，二甲亞碸-d 6；EtOAc，乙酸乙酯；DMF，N ,N -二甲基甲醯胺；MeOH，甲醇；THF，四氫呋喃；EtOH，乙醇；DMSO，二甲亞碸；NMP，N -甲基吡咯烷酮。高解析質譜係紀錄於FINNIGAN MAT 95S質譜儀上。
1.2方法
本發明之化合物的結構設計描述如下。首先，為瞭解經由索拉非尼對Raf激酶抑制與P-STAT3的向下調節之間的關係，我們以化學方法來減少索拉非尼的醯胺基與Raf之間的氫鍵相互作用，係透過以苯基氰基替換醯胺基來進行(化合物1，圖1)。基於含有不同尺寸的官能基、氫供體、氫受體、疏水性和親水性的能力，我們也修改了SC-1以產生一系列的化合物SC-48、SC-49、SC-54、SC-55、SC-56、SC-58、SC-43、SC-44、SC-45、SC-50、SC-51、SC-52、SC-59、SC-60以及SC-40。此外，我們以不同的醯胺及磺胺替換索拉非尼骨幹上的尿素官能基以得到化合物2-11。進一步地，我們以喹啉替換吡啶環，並以其作為平台以進行結構修飾，產生一系列化合物12-19和20-25。這些SC-1衍生物係根據圖2式II中所描述的一般程序進行合成。此外，我們藉由增加一苯環來延伸化合物的長度，以探索帶有不同官能基36-38的結構的活性關係。
1.2.1化合物1(式I)的合成程序
將4-氯-3-(三氟甲基)苯胺(0.21g，1.1mmol)和2當量的三乙胺加入50mL含有三光氣(0.30g，1.0 mmol)的THF溶液中。將混合物加熱至50℃後加熱30分鐘。待溫度降至室溫後，將溶於10 mL THF溶液的4-(4-胺基苯氧基)芐腈加入該混合物中，並再次加熱至50℃後加熱30分鐘。將該混合物蒸發，用水稀釋，並用乙酸乙酯(EtOAc)萃取。以食鹽水洗滌萃取液，以無水硫酸鎂乾燥，並進行減壓濃縮，得到化合物1(0.34g，80%)。
1.2.1.1. 1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4-氰基苯氧基)苯基)脲 (1)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.17(s,1H),8.94(s,1H),8.10(s,1H),7.81(d,2H,J =6.8),7.63-7.59(m,2H),7.54(d,2H,J =7.2 Hz),7.10(d,2H,J =6.8 Hz),7.05(d,2H,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz，甲醇-d 4 )：δ 163.7,163.6,154.8,151.4,151.2,140.1,137.7,137.4,135.3,132.9,129.7,129.4,129.1,128.8,128.3,125.6,125.5,125.4,124.2,122.9,122.4,122.3,122.1,120.2,119.7,118.8,118.7,118.6,118.6,106.5,106.4；C21 H13 ClF3 N3 O2 (M+H)的HRMS計算值：431.0648；實測值：431.0656。
1.2.1.2. 1-(3-(4-氰基苯氧基)苯基)-3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲 (43)
1 H NMR(400 MHz,DMSO)：δ 9.17(s,1H),9.03(s,1H),8.04 (d,J =2.4 Hz,1H),7.83(d,J =8.8 Hz,2H),7.64-7.55(m,2H),7.41-7.32(m,2H),7.23(d,J =7.2 Hz,1H),7.11(d,J =8.0 Hz,2H),6.75(dd,J =8.0 Hz,2.4 Hz,1H)；C21 H12 N3 O2 F3 Cl[M-H]- 的HRMS計算值：430.0570；實測值：430.0576。
1.2.1.3. 4-(3-(3-(三氟甲基)苯-磺醯基胺基)苯氧基)芐腈 (44)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.00(s,1H),7.96(d,J=8.0 Hz,1H),7.81(d,J=8.0 Hz,1H),7.65-7.54(m,3H),7.26(t,J=8.0 Hz,1H),7.08(s,1H),7.05-6.97(m,1H),6.94-6.86(m,3H),6.84(t,J=2.0 Hz,1H),6.81(dd,J=8.4 Hz,2.0 Hz,1H)；C20 H12 N2 O3 F3 S[M-H]- 的HRMS計算值：417.0521；實測值：417.0518。
1.2.1.4. 4-(3-(3-(三氟甲氧基)芐基胺基)苯氧基)芐腈 (45)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.61(d,J =8.8 Hz,2H),7.43(t,J =8.0 Hz,1H),7.33(d,J =8.4 Hz,1H),7.29-7.16(m,3H),7.04(d,J =8.8 Hz,2H),6.55(dd,J =8.0 Hz,2.4 Hz,1H),6.46(dd,J =8.0 Hz,2.0 Hz,1H),6.34(t,J =2.4 Hz,1H),4.41(s,2H)；C21 H16 N2 O2 F3 [M+H]+ 的HRMS計算值：385.1164；實測值：385.1157。
1.2.1.5. 1-(4-(4-氰基苯氧基)苯基)-3-(3,4-二甲氧基芐基)脲 (48)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.56(d,J=6.8 Hz,2H),7.34(d,J=8.8 Hz,2H),6.98-6.94(m,4H),6.88-6.75(m,4H),6.56(brs,1H),4.36(s,2H),3.84(s,6H)；C23 H20 N3 O4 [M-H]- 的HRMS計算值：402.1454；實測值：402.1462。
1.2.1.6. 1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4-氰基苯氧基)芐基)脲 (49)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.76 Hz(s,1H),7.51-7.39(m,3H),7.29(dd,J =8.8 Hz,2.4 Hz,1H),7.13(d,J =8.4 Hz,3H),6.83(dd,J =8.8 Hz,4.8 Hz,4H),5.93(t,J =6.0 Hz,1H),4.24(d,J =6.0 Hz,2H)；C22 H14 N3 O2 F3 Cl[M-H]- 的HRMS計算值：444.0727；實測值：444.0732。
1.2.1.7. 1-(3-(4-氰基苯氧基)苯基)-3-(3-氟苯基)脲 (50)
1 H NMR(400 MHz,MeOD)：δ 7.66(d,J =9.2 Hz,2H),7.60(s,1H),7.41-7.34(m,2H),7.22(q,J =8.0 Hz,1H),7.18(dd,J=8.0 Hz,2.0 Hz,1H),7.10-7.02(m,3H),6.71(dd,J =8.8 Hz,2.4 Hz,2H)；C20 H13 N3 O2 [M-H]- 的HRMS計算值：346.0992；實測值：346.0999。
1.2.1.8. N-(3-(4-氰基苯氧基)苯基)苯甲醯胺 (51)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.82(s,1H),7.75(d,J =7.6 Hz,2H),7.53(s,1H),7.46-7.35(m,4H),7.28(t,J =8.0 Hz,2H),7.22(t,J =8.0 Hz,1H),6.90(d,J =8.8 Hz,2H),6.72(dd,J =8.0 Hz,2.0 Hz,1H)；C20 H13 N2 O2 [M-H]- 的HRMS計算值：313.0977；實測值：313.0971。
1.2.1.9. N-(3-(4-氰基苯氧基)苯基)苯磺醯胺 (52)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.79(d,J=8.4 Hz,2H),7.53(t,J =4.4 Hz,3H),7.42(t,J =8.0 Hz,2H),7.20(t,J =8.0 Hz,1H),6.93(dd,J =8.0 Hz,2.0 Hz,1H),6.86-6.83(m,3H),6.73(dd,J =8.0 Hz,2.0 Hz,1H)；C19 H13 N2 O3 S[M-H]- 的HRMS計算值：349.0647；實測值：2349.0643。
1.2.1.10. 1-(4-(4-氰基苯氧基)芐基)-3-(3,4-二甲氧基芐基)脲 (54)
1 H NMR(400 MHz,DMSO)：δ 7.81(d,J =9.2 Hz,2H),7.33(d,J =8.4 Hz,2H),7.06(dd,J =15.6 Hz,9.2 Hz,4H),6.86(d,J =9.2 Hz,2H),6.76(dd,J =8.0 Hz,2.0 Hz,1H),6.45(t,J =6.0 Hz,1H),6.38(t,J =6.0 Hz,1H),4.23(d,J =5.2 Hz,2H),4.14(d,J =5.2 Hz,2H),3.69(s,6H)；C24 H24 N3 O4 [M+H]+ 的HRMS計算值：418.1767；實測值：418.1773。
1.2.1.11. 1-(4-(4-氰基苯氧基)芐基)-3-(3-(三氟甲氧基)芐基) 脲 (55)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.49(d,J =9.2 Hz,2H),7.17(t,J =8.0 Hz,1H),7.10(d,J =8.4 Hz,2H),7.00-6.92(m,3H),6.88(d,J =9.2 Hz,2H),6.84(d,J =8.4 Hz,2H),6.17-6.05(m,2H),4.10(m,4H)；C23 H19 N3 O3 F3 [M+H]+ 的HRMS計算值：442.1379；實測值：442.1381。
1.2.1.12. (R)-1-(4-(4-氰基苯氧基)苯基)-3-(1-(萘1-基)乙基)脲 (56)
1 H NMR(400 MHz,MeOD)：δ 8.17(d,J =8.0 Hz,1H),7.87(d,J =8.0 Hz,1H),7.78(d,J =8.0 Hz,1H),7.65(d,J =8.8 Hz,2H),7.58(d,J =7.2 Hz,1H),7.53(d,J =7.2 Hz,1H),7.50-7.45(m,2H),7.41(d,J =8.8 Hz,2H),6.99(t,J=9.2 Hz,4H),5.74(d,J=6.8 Hz,1H),1.63(d,J =6.8 Hz,3H)；C26 H20 N3 O2 [M-H]- 的HRMS計算值：406.1556；實測值：406.1563。
1.2.1.13. 1-(4-氯-3-(三氟甲基)芐基)-3-(4-(4-氰基苯氧基)苯基)脲 (58)
1 H NMR(400 MHz,MeOD)：δ 7.74(brs,1H),7.66(d,J =9.2 Hz,2H),7.56(d,J =2.0 Hz,2H),7.44(d,J =9.2 Hz,2H),7.05-6.98(m,4H),4.43(s,2H)；C22 H14 N3 O2 F3 Cl[M-H]- 的HRMS計算值：444.0727；實測值： 444.0736。
1.2.1.14. 1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(3-(4-氰基苯氧基)-4-甲基苯基)脲 (59)
1 H NMR(400 MHz,MeOD)：δ 7.87(d,J =2.8 Hz,1H),7.60(d,J =9.2 Hz,2H),7.54(dd,J =8.4 Hz,2.4 Hz,1H),7.39(d,J =8.8 Hz,1H),7.25(d,J =2.4 Hz,1H),7.18(d,J =8.0 Hz,1H),7.12(dd,J =8.0 Hz,2.4 Hz,1H),6.93(d,J =9.6 Hz,2H),2.02(s,3H)；C22 H14 N3 O2 F3 Cl[M-H]- 的HRMS計算值：444.0727；實測值：444.0725。
1.2.1.15. 1,3-雙(3-(4-氰基苯氧基)-4-甲基苯基)脲 (60)
1 H NMR(400 MHz,DMSO)：δ 8.77(s,2H),7.80(d,J =8.0 Hz,4H),7.29(s,2H),7.24(d,J =8.0 Hz,2H),7.13(d,J =8.4 Hz,2H),6.98(d,J =8.4 Hz,4H),2.02(s,6H)；C29 H21 N4 O3 [M-H]- 的HRMS計算值：473.1614；實測值：473.1619。
1.2.2化合物2-25的一般程序
在25mL的雙頸圓底燒瓶中，於室溫下將苯胺衍生物(1mmol)和催化量的吡啶加入無水THF(10mL)。將醯基氯或磺醯基氯化合物加入該混合物中，並在室溫下攪拌2小時。在真空下除去溶劑，並在矽膠管柱中以色層分析法純化粗殘餘物，以乙酸乙酯(EtOAc)/己烷(1/10至1/2)作為洗提液。此一程序得到白色固體的預期的耦合產物，其產率為70%至95%。
1.2.2.1. N-甲基-4-(4-(苯磺醯胺基)苯氧基)吡啶醯胺(2 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.36(d,1H,J =5.6 Hz),8.01(brs,1H),7.76(d,2H,J =7.6 Hz),7.59(s,1H),7.54(t,1H,J =8.0 Hz),7.46(t,2H,J =8.0 Hz),7.12(d,2H,J =8.8 Hz),6.94(d,2H,J =8.8 Hz),6.92-6.90(m,1H),3.00(d,3H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 166.0,164.6,152.1,151.0,149.7,138.9,134.2,133.0,129.0,127.1,123.9,121.6,114.3,109.9,26.1；C19 H17 N3 O4 S(M+H)的HRMS計算值：383.0940；實測值：383.0941。
1.2.2.2. N-甲基-4-(4-(4-硝基苯磺醯胺基)苯氧基)吡啶醯胺(3 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.39(d,1H,J =5.6 Hz),8.30(d,2H,J =8.8 Hz),8.07(brs,1H),7.93(d,2H,J =8.8 Hz),7.49(s,1H),7.17(d,2H,J =8.8 Hz),7.01-6.98(m,3H),3.00(d,3H,J =5.2 Hz)；C19 H16 N4 O6 S(M+H)的HRMS計算值：428.0791；實測值：428.0798。
1.2.2.3. 4-(4-(4-氟苯磺醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺(4 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.37(d,1H,J =5.6 Hz),8.00(brs,1H),7.77-7.43(m,2H),7.57(s,1H),7.17-7.09(m,4H),6.99-6.93(m,4H),3.00(d,3H,J =4.8 Hz)；NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 166.5,165.9,164.6,163.9,152.1,151.2,149.7,135.0,134.0,130.0,129.9,124.1,121.7,116.4,116.2,114.5,109.8,26.19；C19 H16 FN3 O4 S(M+H)的HRMS計算值：401.0846；實測值：401.0849。
1.2.2.4. 4-(4-(4-叔丁基苯磺醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶醯胺(5 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.33(d,1H,J =6.0 Hz),8.21(brs,1H),7.79(brs,1H),7.69(d,2H,J =6.8 Hz),7.62(s,1H),7.44(d,2H,J =6.8 Hz),7.15(d,2H,J =6.8 Hz),6.91(s,2H,J =6.8 Hz),6.88-6.86(m,1H),2.98(d,3H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 166.0,164.6,156.8,152.2,150.8,149.7,136.1,134.4,127.0,126.1,123.6,121.6,114.1,110.1,35.1,30.1,26.1；C23 H25 N3 O4 S(M+H)的HRMS計算值：439.1566；實測值：439.1564。
1.2.2.5. N-甲基-4-(4-(萘-2-磺醯胺基)苯氧基)吡啶醯胺(6 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.34(s,1H),8.30(d,1H,J =5.2 Hz),8.05-8.02(m,1H),7.89-7.83(m,4H),7.74(dd,1H,J =8.4,1.6 Hz),7.60-7.52(m,3H),7.16(d,2H,J =8.8 Hz),6.88(d,2H,J =8.8 Hz),6.84-6.82(m,1H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：165.9,164.6,152.1,151.0,149.7,135.9,134.9,134.2,132.0,129.4,129.3,128.9,128.7,127.9,127.5,123.9,122.2,121.6,114.2,110.1,26.2；C23 H19 N3 O4 S(M+H)的HRMS計算值：433.1096；實測值：433.1079。
1.2.2.6. 4-(4-(2-溴-4-(三氟甲基)苯磺醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶醯胺(7 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.35(d,1H,J =5.6 Hz),8.15(d,1H,J =8.0 Hz),7.79(brs,1H),7.96(s,1H),7.67(d,2H,J =8.0 Hz),7.57(s,1H),7.18(d,2H,J =9.2 Hz),6.95(d,2H,J =9.2 Hz),6.90-6.88(m,1H),2.98(d,3H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 165.7,164.5,152.2,151.6,149.8,141.5,136.1,135.8,135.5,135.2,132.7,132.2(m),124.9(m),124.1,123.5,121.7,120.8,120.4,114.5,110.0,26.1；C20 H15 BrF3 N3 O4 S(M+H)的HRMS計算值：528.9919；實測值：528.9917。
1.2.2.7. N-甲基-4-(4-(2-硝基苯磺醯胺基)苯氧基)吡啶醯胺(8 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.37(d,1H,J =6.0 Hz),7.98(brs,1H),7.86-7.83(m,2H),7.72-7.68(m,2H),7.55(s,1H),7.24(d,2H,J =8.8 Hz),6.98(d,2H,J =8.8 Hz),6.94-6.92(m,1H),2.98(d,3H,J =4.8 Hz)；C19 H16 N4 O6 S(M+H)的HRMS計算值：428.0791；實測值：428.0796。
1.2.7.8 4-(4-(3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶醯胺(9 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.92(s,1H),8.40(s,1H),8.33(d,1H,J =5.6 Hz),8.10(q,1H,J =5.2 Hz),7.90(s,1H),7.71(d,2H,J =8.8 Hz),7.40(d,1H,J =2.8 Hz),6.99-6.97(m,1H),6.93(d,2H,J =8.8 Hz),2.91(d,3H,J =4.8 Hz)；13 C NMR(100 MHz,甲醇-d 4 )：δ 167.8,166.8,165.1,153.4,151.8,151.6,138.6,137.6,133.6,133.3,133.0,132.6,129.4(d),126.2(m),126.0,124.2,123.2,122.4,115.2,110.7,26.4；C22 H15 F6 N3 O3 (M+H)的HRMS計算值：483.1018；實測值：483.1017。
1.2.2.9 4-(4-(5-氟-2-(三氟甲基)苯甲醯胺基)苯氧基)-N-甲基吡啶醯胺(10 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.66(d,1H,J =12.4 Hz),8.31-8.26(m,2H),7.93(s,1H),7.70-7.65(m,3H),7.56(t,1H,J =2.4 Hz),7.24-7.19(m,1H),7.02(d,2H,J =6.4 Hz),6.89-6.87(m,1H),2.90(d,3H,J =3.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,甲醇-d 4 )：δ 166.2,164.5,162.9,160.4,160.0,159.9,152.2,150.4,149.7,135.0,130.6(m),129.8(m),128.3,128.1,127.7,127.4,124.5,122.5,122.4,122.3,121.8,121.5,117.2,117.0,114.1,110.1,26.1；C21 H15 F4 N3 O3 (M+H)的HRMS計算值：433.1050；實測值：433.0152。
1.2.2.10. N-甲基4-(4-(4-(三氟甲基)苯甲醯胺基)苯氧基)吡啶醯胺(11 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.45(s,1H),8.31(d,1H,J =5.6 Hz),8.15(s,1H),8.08(d,2H,J =8.0 Hz),7.71-7.65(m,3H),7.50(d,1H,J =2.4 Hz),7.47(t,1H,J =8.0 Hz),6.96-6.91(m,3H),2.92(d,3H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ166.4,164.8,164.7,151.8,149.9,149.8,138.8,135.5,131.4,131.1,130.8,130.7,130.5,129.1,128.1,125.0,124.3(m),122.6,122.3,121.2,114.4,109.5,26.1；C21 H16 F3 N3 O3 (M+H)的HRMS計算值：415.1144；實測值：415.1146。
1.2.2.11. 2-硝基-N-(4-(喹啉-4-基氧基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺醯胺(12 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.71(d,1H,J =5.2 Hz),8.28(d,1H,J =8.4 Hz),8.12(d,1H,J =8.4 Hz),8.10(s,1H),8.05(d,1H,J =8.4 Hz),7.89(d,1H,J =8.4 Hz),7.80-7.76(m,1H),7.61-7.57(m,1H),7.31(d,2H,J =8.8 Hz),7.13(d,1H,J =8.8 Hz),6.53(d,1H,J =5.2 Hz)；C22 H14 F3 N3 O5 S(M+H)的HRMS計算值：489.0606；實測值：489.0610。
1.2.2.12. 2-硝基-N-(4-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺醯胺(13 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.78(d,1H,J =5.2 Hz),8.51(d,1H,J =8.8 Hz),8.19(s,1H),8.12-8.02(m,3H),7.89(t,1H,J =9.6 Hz),7.62(t,1H,J =8.4 Hz),7.34(d,2H,J =9.6 Hz),7.15(d,2H,J =9.6 Hz),6.91(d,1H,J =6.8 Hz),6.59(d,1H,J =5.2 Hz),6.55(d,1H,J =6.8 Hz)；C22 H13 F3 N4 O7 S(M+H)的HRMS計算值：534.0457；實測值：534.0423。
1.2.2.13 2-溴-N-(4-(4-喹啉-4-基氧基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺醯胺(14 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.65(d,1H,J =5.2 Hz),8.25(d,1H,J =8.4 Hz),8.18(d,1H,J =8.4 Hz),8.07(d,1H,J =8.4 Hz),7.98(s,1H),7.73(t,1H,J =7.6 Hz),7.67(d,1H,J =8.4 Hz),7.54(t,1H,J =7.6 Hz),7.24(d,2H,J =8.8 Hz),7.05(d,2H,J =8.8 Hz),6.43(d,1H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 161.3,152.6,150.9,149.7,141.4,135.9,135.6,135.3,132.7,132.4,132.2(m),130.3,129.1,126.3,124.9(m),124.4,123.5,122.1,122.0,121.9,121.6,121.3,120.8,120.4,116.3,104.4；C22 H14 BrF3 N2 O3 S(M+H)的HRMS計算值：521.9861；實測值：521.9858。
1.2.2.14. 2-溴-N-(4-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-4-(三氟甲基)苯磺醯胺(15 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.76(d,1H,J =5.2 Hz),8.49(d,1H,J =8.4 Hz),8.18(d,1H,J =8.4 Hz),8.04(d,1H,J =7.6 Hz),7.99(s,1H),7.68(d,1H,J =8.4 Hz),7.60(t,1H,J =8.4 Hz),7.25(d,2H,J =8.4 Hz),7.07(d,2H,J =8.4 Hz),6.53(d,1H,J =5.2 Hz)；C22 H13 BrF3 N3 O5 S(M+H)的HRMS計算值：566.9711；實測值：566.9706。
1.2.2.15. N-(4-(喹啉-4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(16 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 10.02(s,1H),8.59(d,1H,J =5.6 Hz),8.37(s,2H),8.34(d,1H,J =8.4 Hz),7.99(d,1H,J =8.4 Hz),7.92(s,1H),7.80(d,2H,J =9.2 Hz),7.70(t,1H,J =7.6 Hz),6.56(t,1H,J =7.6 Hz),7.14(d,2H,J =9.2 Hz),6.52(d,1H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,DMSO-d 6 )：δ 162.6,161.0,151.5,150.0,149.2,137.0,136.1,131.0,130.7,130.4,130.3,130.0,128.8,128.5(m),126.4,125.2(m),124.5,122.5,121.7,121.5,121.3,120.6,104.3；C24 H14 F6 N2 O2 (M+H)的HRMS計算值：476.0959；實測值：476.0958。
1.2.2.16 N-(4-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(17 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.05(s,1H),8.69(d,1H,J =5.0 Hz),8.59(d,1H,J =5.0 Hz),8.35(s,2H),8.06(d,1H,J =7.8 Hz),7.97(s,1H),7.80(d,2H,J =9.0 Hz),7.63(t,1H,J =8.6 Hz),7.16(d,2H,J =9.0 Hz),6.62(d,1H,J =5.0 Hz)；C24 H13 F6 N3 O4 (M+H)的HRMS計算值：521.0810；實測值：521.0814。
1.2.2.17 2-氟-N-(4-(喹啉-4-基氧基)苯基)-5-(三氟甲基)苯甲醯胺(18 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.83(d,1H,J =12.8 Hz),8.68(d,1H,J =5.2 Hz),8.39-8.30(m,2H),8.11(d,1H,J =8.4 Hz),7.79-7.67(m,4H),7.58(t,1H,J =8.0 Hz),7.27-7.22(m,1H),7.18(d,2H,J =9.2 Hz),6.56(d,1H,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,甲醇-d 4 )：δ 164.4,164.2,163.8,161.7,151.9,151.8,149.7,137.5,132.1(m),131.2(m),128.9(m),128.3,128.1,127.9,126.5,126.3,123.7,123.6,123.0,122.7,122.6,119.1,119.8,118.7,118.5,105.2；C23 H14 F4 N2 O2 (M+H)的HRMS計算值：426.0991；實測值：426.0991。
1.2.2.18. 2-氟-N-(4-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-5-(三氟甲基)苯甲醯胺(19 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.81(d,1H,J =5.2 Hz),8.59(d,1H,J =8.8 Hz),8.53-8.47(m,2H),8.06(d,1H,J =7.6 Hz),7.83-7.77(m,3H),7.64(t,1H,J =7.6 Hz),7.37-7.32(m,1H),7.23-7.20(m,2H),6.68(d,1H,J =5.2 Hz)；C23 H13 F4 N3 O4 (M+H)的HRMS計算值：471.0842；實測值：471.0850。
1.2.2.19 N-(3-甲基-4-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(20 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.86(s,1H),8.45(d,1H,J =5.2 Hz),8.38(s,2H),8.31(d,1H,J =8.4 Hz),7.92(s,1H),7.89(d,1H,J =8.4 Hz),7.69-7.63(m,2H),7.53(t,1H,J =7.6 Hz),7.33(s,1H),7.28(d,1H,J =8.4 Hz),6.33(d,1H,J =5.2 Hz)；C25 H15 F6 N3 O4 (M+H)的HRMS計算值：535.0967；實測值：535.0956。
1.2.2.20. N-(4-(8-胺基喹啉-4-基氧基)-3-甲基苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(21 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.49(d,1H,J =2.0 Hz),8.27(s,1H),8.02(s,1H),7.94(s,1H),7.65(d,1H,J =8.0 Hz),7.48-7.45(m,2H),7.37-7.32(m,2H),6.96(d,1H,J =7.6 Hz),4.95(s,2H),2.16(s,3H)；C25 H17 F6 N3 O2 (M+H)的HRMS計算值：505.1225；實測值：505.1216。
1.2.2.21. N-(4-(8-乙醯胺基喹啉-4-基氧基)-3-甲基苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(22 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.77(s,1H),9.36(s,1H),8.65(d,1H,J =7.2 Hz),8.46(s,2H),8.44(d,1H,J =5.2 Hz),7.97(s,1H),7.87(d,1H,J =8.4 Hz),7.72(d,1H,J =8.4 Hz),7.50(d,1H,J =2.0 Hz),7.37(t,1H,J =8.0 Hz),7.28(d,1H,J =8.4 Hz),6.41(d,1H,J =5.2 Hz),2.26(s,3H),2.10(s,3H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 169.2,163.0,161.2,152.0,148.8,139.5,137.2,136.7,133.8,132.6,132.3,132.2,132.0,131.6,127.8,127.1,126.3,125.2(m),124.2,121.5,120.4,118.8,118.3,116.7,115.7,113.8,25.0,15.4；C27 H19 F6 N3 O3 (M+H)的HRMS計算值：547.1331；實測值：547.1325。
1.2.2.22. N-(3-(8-硝基喹啉-4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(23 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.78(d,1H,J =5.6 Hz),8.58(d,1H,J =8.4 Hz),8.52(s,1H),8.31(s,2H),8.22(s,1H),8.08-8.04(m,2H),7.71(s,1H),7.64(t,1H,J =8.0 Hz),7.53-7.49(m,2H),7.03(d,1H,J =7.2 Hz),6.71(d,1H,J =4.8 Hz)；C24 H13 F6 N3 O4 (M+H)的HRMS計算值：521.0810；實測值：521.0821。
1.2.2.23. N-(3-(8-胺基喹啉-4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(24 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.55(d,1H,J =4.8 Hz),8.29(s,2H),8.05(s,1H),7.90(s,1H),7.60(d,1H,J=8.4 Hz),7.55(s,1H),7.70-7.43(m,2H),7.34(t,1H,J =8.0 Hz),7.01(d,1H,J =8.0 Hz),6.96(d,1H,J =7.9 Hz),6.63(d,1H,J =4.8 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 163.1,161.3,155.3,147.9,143.6,139.9,138.8,136.5,132.7,132.4,132.1,131.7,130.6,127.5(d),127.0,126.8,125.3(m),124.1,122.0,118.7,117.4,117.2,113.1,111.1,110.0,105.4；C24 H15 F6 N3 O2 (M+H)的HRMS計算值：491.1068；實測值：491.1068。
1.2.2.24. N-(3-(8-乙醯胺基喹啉4-基氧基)苯基)-3,5-雙(三氟甲基)苯甲醯胺(25 )
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 9.77(s,1H),8.74(d,1H,J =7.6 Hz),8.54(d,1H,J=5.2 Hz),8.48(s,1H),8.39(s,2H),8.04(s,1H),7.87(d,1H,J =8.4 Hz),7.67-7.60(m,2H),7.50-7.43(m,2H),7.37(t,1H,J =8.0 Hz),7.00(d,1H,J =8.4 Hz),6.65(d,1H,J =5.2 Hz),2.30(s,3H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 169.3,163.1,161.7,154.6,148.7,139.6,136.6,133.8,132.7,132.4,132.1,131.7,130.8,127.8(d),126.9,126.5,125.3(m),124.2,121.5,120.8,117.7,117.3,116.8,115.7,113.2,104.9,25.0；C26 H17 F6 N3 O3 (M+H)的HRMS計算值：533.1174；實測值：533.1167。
1.2.2.25 N-(3-(三氟甲基)苯磺醯基)-3-(3-胺基-4-硝基苯氧基)苯胺 (SC-40)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.06(d,J =9.6 Hz,1H),8.00(s,1H),7.96(d,J =8.0 Hz,1H),7.81(d,J =8.0 Hz,1H),7.61(t,J =8.0 Hz,1H),7.27(t,J =8.0 Hz,1H),6.91-6.80(m,3H),6.19(dd,J =9.6 Hz,2.4 Hz,1H),6.14(d,J =2.4 Hz,1H),6.10(brs,2H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )：δ 163.1,155.5,146.7,140.0,137.6,132.0,131.6,130.9,130.3,130.0,129.9(m),128.8,128.0,124.4,124.3,124.2,124.2,124.0,121.6,117.8,117.6,113.6,107.6,104.3；LC-MS(ESI)：M/Z 452[M-H]- ；C19 H13 N3 O5 F3 S[M-H]- 的HRMS計算值：452.0528；實測值：452.0529。
1.2.3化合物36-38 1.2.3.1 3-(2-苯基H-咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基氧基)-N-(3-(三氟甲氧基)芐基)苯胺 (36)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 7.96(d,J =8.0 Hz,1H),7.89(d,J =8.0 Hz,2H),7.71(s,1H),7.40(t,J =7.2 Hz,2H),7.35-7.24(m,3H),7.18(s,1H),7.14(t,J =8.0 Hz,1H),7.09(d,J =7.6 Hz,1H),6.98(d,J =2.4 Hz,1H),6.60(dd,J =7.2 Hz,2.4 Hz,1H),6.46-6.40(m,2H),6.32(t,J =2.4 Hz,1H),4.31(s,1H),4.20(s,1H)；C27 H21 N3 O2 F3 [M+H]+ 的HRMS計算值：476.1586；實測值：476.1592。
1.2.3.2 N-(3-(2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基氧基)苯基)-3-(三氟甲基)苯磺醯胺 (37)
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )：δ 8.03(d,J =6.8 Hz,2H),7.92(d,J =8.0 Hz,1H),7.87(d,J =6.8 Hz,2H),7.76(d,J =6.0 Hz,2H),7.60(t,J =7.6 Hz,1H),7.39(t,J =8.0 Hz,2H),7.30(t,J =6.4 Hz,1H),7.21(d,J =8.8 Hz,1H),6.96-6.90(m,2H),6.83(dd,J =13.6 Hz,2.4 Hz,1H),6.82(t,J =2.0 Hz,2H),6.60(dd,J =7.2 Hz,2.4 Hz,1H)；C26 H19 N3 O3 F3 S[M+H]+ 的HRMS計算值：510.1099；實測值：510.1100。
1.2.3.3 N-(3-(2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-7-基氧基)苯基)苯磺醯胺 (38)
1 H NMR(400 MHz,DMSO)：δ 8.52(d,J =7.2 Hz,1H),8.33(s,1H),7.93(d,J =7.2 Hz,2H),7.76-7.70(m,2H),7.66-7.54(m,3H),7.43(t,J =7.6 Hz,2H),7.33-7.26(m,2H),6.92(d,J =7.6 Hz,1H),6.84-6.76(m,3H),6.64(dd,J =7.6 Hz,2.4 Hz,1H)；C25 H20 N3 O3 S[M+H]+ 的HRMS計算值：442.1225；實測值：442.1216。
實施例2：生物活性檢測 2.1材料與方法 2.1.1試劑與抗體
索拉非尼(蕾莎瓦膜衣錠®)係由拜耳製藥公司(Bayer Pharmaceuticals)(西哈芬，康乃迪克州)提供。釩酸鈉及SHP-1抑制劑皆購自開曼化學公司(Cayman Chemical)(安娜堡，密西根州)。免疫墨點分析所用的抗體，如Raf-1、細胞週期素D1、以及PARP抗體均購自聖克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology)(聖地牙哥，加州)。其他抗體，如抗pVEGFR2(Y1175)、VEGFR2、存活素、磷酸化STAT3(Tyr705)，以 及STAT3抗體均來自細胞信號轉導公司(Cell Signaling)(丹弗斯，麻州)。
2.1.2細胞培養
Huh-7肝癌細胞株係獲自健康科學研究資源庫(Health Science Research Resources Bank)(大阪，日本；JCRB0403)。PLC/PRF/5(PLC5)、Sk-Hep-1、以及Hep3B細胞株則獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(馬那薩斯，維吉尼亞州)。上述細胞維持在含有10%胎牛血清、100 units/mL青黴素G、100 μg/mL鏈黴素硫酸鹽以及25 μg/mL兩性黴素B的DMEM培養液中，置於37℃含有5%二氧化碳紛圍的加濕培養箱中。其它細胞株，包括乳腺癌細胞，例如MDAMB231、MDAMB468、MCF-7，以及白血病癌細胞，例如HL-60、KG-1、以及ML-1也提供給如下所述的檢測使用。
2.1.3.以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)偵測細胞死亡
本發明之化合物對細胞存活率的效果係以細胞死亡ELISA檢測(羅氏應用科學公司(Roche Applied Science)，曼海姆，德國)進行評估。將細胞以待測化合物處理，例如待測化合物濃度為5和10μM、處理24小時。接著收集細胞，並以廠商提供之標準操作程序進行分析。
2.1.4.細胞凋亡分析
以流式細胞儀(sub-G1)對凋亡的細胞進行計量。在以各種化合物處理後，細胞以胰蛋白酶消化、通過離心收集並再懸浮於PBS中。離心後，將細胞以PBS沖洗並再懸浮於碘化鉀(PI，potassium iodide)染色溶液。於黑暗中、37℃下將樣本培養30分鐘，然後以EPICS Profile II流式細胞儀(庫爾特公司(Coulter Corp.,)，海厄利亞，佛羅里達州)分析。所有實驗皆進行三重複。
2.1.5.磷酸化-STAT3-程度
使用PathScan磷酸化Stat3(Tyr705)三明治酵素結合免疫吸附法套組偵測磷酸化STAT3(細胞信號轉導公司(Cell Signaling)，丹弗斯，麻州)。細胞以1 ng/ml介白素-6預處理，然後與濃度10μM的各種化合物處理24小時。在與細胞裂解物一起培養後，非磷酸化以及磷酸化Stat3蛋白均被塗覆的抗體捕捉。以在波長450nm處的吸光度測定磷酸化-STAT3蛋 白的表現量。
2.1.6.西方墨點分析法
細胞與濃度5及10μM的各種化合物處理24小時。細胞裂解物以西方墨點分析法分析。
2.1.7.使用siRNA進行基因剔除
Smart-pool siRNA，包括對照組(D-001810-10)、RAF-1、SHP-1、SHP-2、以及PTP-1B，均購自Dharmacon公司(芝加哥，伊利諾州)。實驗操作程序已於先前文獻中描述(Chen KFet al.J Biol Chem 2009；284：11121-11133)。
2.1.8. PLC5與STAT3的異位表達
STAT3 cDNA(KIAA1524)及STAT3-C皆購自Addgene質體庫(http：//www.addgene.org/)。簡言之，經轉染作用後，細胞在G418(0.78 mg/mL)的存在下培養。經8週的篩選後，存活的細胞集落，意即從穩定轉染的細胞所產生的細胞，分別經選擇並各自增殖。
2.1.9.磷酸酶及激酶活性
使用RediPlate 96 EnzChek®酪胺酸磷酸酶檢測套組(R-22067)進行SHP-1活性測定(分子探針公司(Molecular Probes)，卡爾斯巴德，加州)。Raf-1激酶訊息放大效應檢測套組(上州-密里博公司(Upstate-Millipore)，比爾里卡，麻州)則被用來檢驗Raf-1激酶的活性。JAK2激酶活性套組係購自反應生物股份有限公司(Reaction Biology Corp.)(馬爾文，賓州)。
2.1.10. STAT3報導基因分析
將細胞接種於96孔盤中，並以劑量為10 ng/μl的介白素-6預處理30分鐘。STAT3報導基因套組購自SABiosciences(佛雷德里克，馬里蘭州)。
2.1.11異體移植腫瘤的生長
雄性NCr無胸腺裸鼠(5-7週齡)係自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台北，台灣)而來。所有使用這些小鼠進行的實驗程序，皆按照國立台灣大學批准的實驗操作程序。當Huh-7 腫瘤達到100至200 mm3 ，對小鼠進行口服投藥，每天一次，投予甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(10 mg/kg)，或SC-1(10 mg/kg)。對照組則投與基劑(Chen KFet al.Cancer Res. 2008；68：6698-6707)。
2.1.12統計分析
平均值的比較係採用在支援Windows11.5的SPSS軟體(SPSS公司，芝加哥，伊利諾州)中的獨立樣本t檢驗來進行(Chen KF et al.Cancer Res 2008；68：6698-6707)。
2.2結果 2.2.1化合物1不影響Raf激酶的活性
如上所述，我們藉由以氰苯替換吡啶環和醯胺官能基的方式，在不提供氫供體的能力的情況下合成了索拉非尼的衍生物。接著，我們測試了化合物1 在PLC5細胞中抑制Raf激酶活性的能力，並與索拉非尼的該能力相比。如圖3所示，在PLC5細胞中5 μM的濃度下，索拉非尼可以抑制未處理細胞50%的Raf-1激酶活性；然而以化合物1 處理的細胞則顯示具有與處理基劑的對照組相同的Raf-1活性。抑制Raf-1能力的損失可以推測是因為氫鍵結能力的損失，而氫鍵結能力的損失則是由於以氰苯替換吡啶環和醯胺官能基所造成的結果。
2.2.2在細胞死亡中，脲基與吡啶環的替換的結構活性關係
如上所述，我們以各種醯胺及磺醯胺替換索拉非尼的脲官能基鍵結，以生成化合物2-11 。以MTT法分析這些化合物在PLC5細胞中對細胞生長的抑制作用。其結果如表4所示。
結果顯示，這些衍生物不論是具有推電子或拉電子基，其細胞毒性皆未比索拉非尼及化合物1 的毒性高。
接下來，我們將吡啶改為喹啉環及醯胺交聯劑以生成化合物12-25 。亦使用MTT法分析這些化合物在PLC5細胞中對細胞生長的抑制作 用。其結果如表5所示。
醯胺鏈接劑顯現出不同於磺醯基鏈接劑的構形，其展現出比磺醯基鏈接劑化合物具有更佳的活性。例如，化合物16 顯現出比化合物12 更好的細胞毒性。化合物25 則顯現出與索拉非尼及化合物1 相當的細胞毒性。我們得到的結論是脲和醯胺鏈接劑在PLC5細胞中展現出的最高的細胞毒性。
2.2.3.索拉非尼衍生物的作用模式的機制驗證
為確認索拉非尼衍生物對STAT3的去磷酸化作用，先將PLC5細胞以10 μM各種化合物處理24小時，並以ELISA分析這些PLC5細胞內P-STAT3的狀態。結果如圖4所示，磺醯基鏈接劑化合物對P-STAT3沒有明顯的變化；然而，化合物1 與一些醯胺鏈接劑化合物則具有高度的STAT3去磷酸化作用。由這些衍生物引起的P-STAT3量的下降與細胞毒性有關。換言之，這些衍生物係部分透過抑制STAT3而誘導細胞死亡。
此外，我們測試了在抑制P-STAT3後的下游訊號傳導途徑。以化合物1 及12 分析細胞週期素D1及生存素的表現量，細胞週期素D1及生存素係為STAT3的下游目標基因。如圖5所示，化合物1 具有抑制STAT3的活性，可以降低細胞週期素D1及生存素的表現量，但化合物12 則對上述兩種蛋白質均無影響。此外，將以化合物1 處理的PLC5細胞進行DNA片段化分析與流式細胞儀分析，結果顯示細胞死亡是由於STAT3的抑制作用且進一步誘導了細胞凋亡的信號所造成(圖6)。
我們的前提是，索拉非尼對Raf及STAT3的抑制作用可以經由結構離解，該前提被化合物1 所證實，化合物1 缺乏Raf活性，但其對P-STAT3向下調節的程度卻與索拉非尼相同。我們認為，化合物1 的氰基降低了其與Raf的交互作用。透過將鏈接劑及吡啶環改變為醯胺及喹啉以對索拉非尼進行後續的修飾(分別產生化合物1 、16 及25 )結果導致對STAT3抑制能力的降低。
2.2.4. SC-1，一種索拉非尼的衍生物，缺乏Raf-1的抑制功能，在肝癌細胞株內出現類似索拉非尼對細胞死亡的影響
在此實驗中，我們再次檢驗索拉非尼和SC-1對Raf-1活性的影響。將自PLC5或Hep3B細胞萃取物而來的Raf-1免疫沉澱物與MEK重組蛋白共同培養，並於索拉非尼或經SC-1處理的細胞內分析磷酸化-MEK的狀態。在索拉非尼的存在下我們觀察到Raf-1激酶活性減少了20-40%； 然而，SC-1並不抑制Raf-1的活性，這表示SC-1不是Raf-1的抑製劑(圖7A)。此外，我們亦檢測VEGFR2的磷酸化，VEGFR2係為索拉非尼在癌症治療上的一個關鍵目標。在以索拉非尼處理的PLC5細胞中，p-VEGFR2(Tyr1175)的表現減少，而處理SC-1則沒有顯著的影響(圖7B)。這些數據表示，衍生自索拉非尼的SC-1不影響激酶的抑制作用。
接著，我們檢驗了索拉非尼及SC-1的抗增殖效果。SC-1以及索拉非尼兩者皆依照劑量依賴的方式降低各種肝癌細胞的存活率，包括PLC5、SK-Hep1、Huh7、及Hep3B細胞(圖8A)。此外，以SC-1或索拉非尼處理24小時的肝癌細胞的sub-G1期細胞數量顯著增加(圖8B)。如同在以SC-1或索拉非尼處理的肝癌細胞中偵測到DNA片段化的誘發，這兩種藥物皆會誘導顯著的細胞凋亡而造成的細胞死亡(圖8C)。這些數據表示，即使SC-1不具有阻礙激酶活性的能力，SC-1對細胞凋亡仍具有顯著的效果，如同索拉非尼在抑制肝癌細胞生長一樣有效，這表示，索拉非尼誘導肝癌細胞凋亡的機制可能與其激酶抑制活性無關。
2.2.5. STAT3對索拉非尼及SC-1在肝癌細胞株中的增敏效果極為重要
為了驗證p-STAT3的向下調節是否依賴索拉非尼的激酶抑制作用，我們進一步檢測在以SC-1處理的肝癌細胞內與STAT3相關的信號傳導途徑。有鑑於索拉非尼會對STAT3向下調節並導致細胞死亡的誘發，因此檢測包括誘發骨髓白血病細胞分化蛋白-1(Mcl-1，Induced myeloid leukemia cell differentiation protein)、細胞週期素D1、和生存素的與細胞凋亡相關的調控因子之表現。我們發現，p-STAT3的抑制在調節SC-1-誘導或索拉非尼誘導的細胞死亡中具有作用。SC-1降低了STAT3相關蛋白在肝癌細胞中的表現。STAT3蛋白的第705個胺基酸為酪胺酸(Y705)，該酪胺酸的磷酸化對STAT3的轉錄活化極為重要。SC-1以及索拉非尼皆會在Y705殘基上對p-STAT3向下調節，並且在所有測試的肝癌細胞株中抑制Mcl-1及細胞週期素D1，肝癌細胞株包括PLC5、Huh7、及Sk-Hep1細胞株(圖9A)。值得注意的是，STAT3總蛋白並未受到索拉非尼及SC-1的影響(圖9A)。此外，SC-1及索拉非尼係以劑量及時間依賴的方式對p-STAT3進行 向下調節(圖9B)。這些數據進一步表示，索拉非尼係藉由一種非依賴激酶的機制來抑制STAT3。
我們還以STAT3 ELISA測定p-STAT3的活性狀態。在處理索拉非尼或SC-1之前24小時，Sk-Hep1細胞先以重組介白素-6預處理，以模仿STAT3的高表現量，接著在介白素-6存在的情況下，以SC-1或索拉非尼處理細胞24小時。SC-1或索拉非尼處理過的細胞萃取物與抗在Y705上磷酸化的STAT3的抗體共同培養。ELISA結果顯示，索拉非尼以及SC-1皆顯著地降低了p-STAT3的活性(圖9C，左 )。為了評估轉錄活性，將STAT3結合區選殖到Luc 報導基因之前。我們發現，當索拉非尼或SC-1存在的情況下，STAT3的轉錄活性顯著地降低(圖9C，右 )。以水母冷光酶對螢火蟲螢光酶的活性進行評估及正常化。這些結果顯示，索拉非尼及SC-1兩者皆透過抑制轉錄作用而有效地降低STAT3磷酸化的程度。我們接著建立了過度表現STAT3的肝癌細胞穩定殖株，以驗證索拉非尼在肝癌內的影響。如圖9D所示，以sub-G1分析證實，在過度表現STAT3的肝癌細胞中，索拉非尼誘導的細胞凋亡以及SC-1誘導的細胞凋亡皆被廢止，這表示STAT3是索拉非尼及SC-1誘導的細胞凋亡的一個主要調節因子。
2.2.6. SHP-1磷酸酶在索拉非尼及SC-1對磷酸化-STAT3及細胞凋亡的效果上發揮了作用
為了進一步研究索拉非尼如何在肝癌組織中抑制STAT3，我們檢驗了數種可能參與調節p-STAT3的蛋白磷酸酶。我們的研究結果顯示，釩酸鈉，一種常見的磷酸酶抑制劑，可降低細胞凋亡以及增加p-STAT3(圖10A，左 )。這些數據表示，藉由將STAT3相關的蛋白磷酸酶作為目標，索拉非尼及SC-1可能影響p-STAT3。此外，我們發現，SHP-1磷酸酶專一的抑制劑會逆轉由索拉非尼誘導的細胞死亡及p-STAT3的抑制(圖10A，右 )。為了進一步確認SHP-1在由SC-1及索拉非尼誘導的p-STAT3的抑制中的作用，我們採用了SHP-1的特異性siRNA以檢驗索拉非尼及SC-1的影響。我們發現，SHP-1基因的靜默逆轉了索拉非尼或SC-1誘導的細胞凋亡及p-STAT3的抑制(圖10B，左 )。此外，相較於對照組細胞，索拉非尼及SC-1兩者皆可使SHP-1的活性增加3倍(P <0.05)(圖10B，中間 )。將 索拉非尼或SC-1處理的PLC5細胞以SHP-1特異性抗體進行免疫沉澱，然後將含有SHP-1的複合物以螢光為基礎的磷酸基進行測定。值得注意的是，經由SHP-1免疫沉澱證實，無論是索拉非尼或SC-1皆不會影響STAT3和SHP-1的交互作用(圖10B，右 )。這些數據表示，索拉非尼係透過SHP-1依賴的STAT3去活化作用來誘導細胞死亡。
除了SHP-1之外，其他的磷酸酶如SHP-2及PTP-1B，已被報導可以調節p-STAT3。如圖10C所示，索拉非尼對細胞凋亡和p-STAT3的影響並沒有因為SHP-2或PTP-1B的靜默而逆轉，這表示，無論是SHP-2或PTP-1B皆對於調節索拉非尼或SC-1對p-STAT3的影響上沒有作用。
2.2.7. SC-1向下調節p-STAT3且在HUVEC細胞內誘發細胞凋亡
p-VEGFR2為索拉非尼在癌症治療上的一個關鍵目標，為了釐清索拉非尼對p-VEGFR2的影響，我們檢驗了索拉非尼及SC-1在人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC，Human umbilical vein endothelial cells)內的影響。如圖11A左 半部所示，索拉非尼及SC-1兩者在HUVEC細胞內皆對p-STAT3向下調節，且在肝癌組織中明顯地誘導細胞凋亡(P <0.05)。值得注意的是，在HUVEC細胞內，索拉非尼，而非SC-1，對VEGFR的磷酸化向下調節(圖7A，中間 )。這些結果顯示，Raf-1及VEGFR皆未調節索拉非尼對細胞凋亡及p-STAT3的影響。
先前的研究也發現Mcl-1在調解索拉非尼對TRAIL增敏化的效果上是極為重要。有趣的是，我們的數據顯示，藉由p-STAT3的向下調節，在肝癌組織中，SC-1也顯示出類似的由TRAIL誘導的細胞凋亡的增強(圖11B )。為了進一步探討索拉非尼對p-STAT3的抑制作用是否與Raf-1有關，我們以小片段干擾RNA來剔除Raf-1基因。Raf-1的靜默並未影響索拉非尼或SC-1對p-STAT3的效果(圖11C )，表示Raf-1並不調節索拉非尼對p-STAT3的效果。值得注意的是，無論是索拉非尼或是SC-1，兩者皆不改變JAK2的激酶活性(圖11D)，這表示JAK2並不調節這兩種化合物對p-STAT3的影響。此外，我們的數據顯示，索拉非尼及SC-1並不會影響細胞激素信息抑制劑-1(SOCS-1，Suppressor of cytokine signaling-1)及細 胞激素信息抑制劑-3(SOCS-3)的蛋白量(圖11E)。有趣的是，具有組成性活化的STAT-3(STAT3-C)的肝癌細胞並無法完全抵抗SC-1(圖11F)。如同SC-1增強了SHP-1的活性(圖11B，中間 )，我們的數據表示，除了STAT-3之外，其他SHP-1相關的分子可能也在調節SC-1的效果上發揮作用。為了檢驗索拉非尼或SC-1是否直接以SHP-1為目標，PLC5細胞與SHP-1抗體進行免疫沉澱，然後與索拉非尼或SC-1共同培養6小時。如圖11G所示，在這些裂解物中，索拉非尼和SC-1增加了SHP-1的活性，顯示索拉非尼及SC-1是直接以SHP-1為目標的。
2.2.8. SC-1及索拉非尼對Huh7-帶瘤小鼠的治療效果的評估
為了驗證SC-1的治療效果，我們進一步將SC-1應用於肝癌異體移植，以評估其在體內的重要性。首先，Huh7帶瘤小鼠每日以口服接受基劑或10 mg/kg/day劑量的索拉非尼的治療。索拉非尼處理組顯著地抑制了Huh7異體移植腫瘤的生長，且索拉非尼處理的動物的腫瘤尺寸比對照組小鼠的腫瘤小一半(圖12A ，左 )。任何小鼠的體重或毒性皆無明顯的差異(未顯示數據)。此外，自以基劑處理的小鼠及索拉非尼處理的小鼠上取得的腫瘤以p-STAT3進行免疫墨點分析。在以索拉非尼處理的腫瘤內p-STAT3是向下調節的(圖12A ，右 )。在三顆具有代表性的Huh7腫瘤的均質液中觀察到p-STAT3/STAT3。此外，我們檢驗了在以索拉非尼處理的Huh7異體移植中SHP-1的活性。以索拉非尼處理的腫瘤在體內顯示出顯著誘導SHP-1的活性(圖12A ，右 )。將這些結果合併，證實在涉及肝癌異體移植模型中的腫瘤抑制，索拉非尼能增加SHP-1的活性以抑制p-STAT3。
此外，SC-1處理組具有強烈的抑制效果(P <0.05)，且在處理結束時，此組的腫瘤尺寸只有基劑處理組小鼠腫瘤的25%(圖12B，左 )。p-STAT3的免疫墨點分析和SHP-1的活性分析也在從SC-1處理的動物的腫瘤樣品上進行。有趣的是，SC-1誘導了SHP-1活性顯著地上升，且向下調節p-STAT3(圖12B，右 )。這些數據顯示，SC-1，一種SHP-1的促進劑與STAT3的抑制劑，表現出在抑制腫瘤生長的治療效果。
2.2.9.癌細胞生長的抑制作用
我們還檢驗了在其它癌症細胞株中SC-1及SC-43的影響，包括乳癌細胞株，例如MDAMB231、MDAMB468、MCF-7，以及白血病的癌症細胞株，例如HL-60、KG-1和ML-1。圖13顯示這些檢驗結果。這些數據顯示，本發明之化合物在抑制癌細胞的生長上是有效的。
2.2.10.在肝癌細胞內的抗癌效果
以指示劑量的索拉非尼衍生物(SC-43或SC-40 )處理肝癌細胞24小時。收集的細胞以75%乙醇固定，並以20 μg/ml碘化丙啶(PI，Propidium Iodide)染色。以流式細胞儀進行sub-G1分析。圖14顯示，索拉非尼衍生物SC-43及SC-40在肝癌細胞中顯示出顯著的抗癌效果，(A)、(B)、(C)、(D)和(E)係分別指以SC-43處理PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T和SK-Hep1細胞；而(F)、(G)、(H)、(I)和(J)則分別指以SC-40處理PLC5、HepG2、Hep3B、HA59T和SK-Hep1細胞。點代表平均；條帶代表標準差(n=6)。
2.2.11.索拉非尼或SC-43對STAT3相關蛋白質的影響
以RIPA裂解緩衝液收集以SC-43(10μM、24小時)處理的肝癌細胞。用來進行免疫墨點分析的抗體如細胞週期素D1係購自Santa Cruz生技公司。其他抗體，如生存素、磷酸化STAT3(Tyr705)、STAT3、Mcl-1、SOCS1、和SOCS3則來自細胞信號傳導公司。圖15顯示在肝癌組織中，SC-43向下調節與磷酸化STAT3相關的信號傳導途徑。
2.2.12.索拉非尼或SC-40對STAT3相關蛋白質的影響
以RIPA裂解緩衝液收集以SC-40(10μM、24小時)處理的肝癌細胞。用來進行免疫墨點分析的抗體如細胞週期素D1係購自Santa Cruz生技公司。其他抗體，如生存素、磷酸化STAT3(Tyr705)、STAT3、Mcl-1、SOCS1、和SOCS3則來自細胞信號傳導公司。圖16顯示在肝癌組織中，SC-40向下調節與磷酸化STAT3相關的信號傳導途徑。
2.2.13.索拉非尼或SC-43對STAT3相關蛋白質的影響
以RIPA裂解緩衝液收集以SC-43(10μM、24小時)處理的肝癌細胞。用來進行免疫墨點分析的抗體如細胞週期素D1係購自Santa Cruz生技公司。其他抗體，如生存素、磷酸化STAT3(Tyr705)、STAT3、以及Mcl-1則來自細胞信號傳導公司。圖17顯示在肝癌組織中，SC-43對p-STAT3相關的信號傳導途徑的抑制效果優於索拉非尼，(A)PLC5及(B)Hep 3B。在比索拉非尼處理劑量低的情況下，SC-43對p-STAT3相關的蛋白具有顯著的抑制效果。
2.2.14. SC-43及SC-40對STAT3活性的影響
p-STAT3活性 ：以RIPA緩衝液收集以SC衍生物處理的PLC5細胞，並以p-STAT3 ELISA套組進行分析。分析實驗操作流程係依照製造商所提供。
STAT3報導基因分析 ：將PLC5細胞接種在96孔盤中。細胞以STAT3報導基因構築物預轉染24小時，接著以衍生物再處理24小時。STAT3報導基因套組係購自SABiosciences公司。
以10 μM SC-43或SC-40處理細胞24小時後，進行磷酸化-STAT3 ELISA分析或螢光酶活性測定。圖18顯示SC-43及SC-40兩者皆可誘導對p-STAT3活性的強烈抑制作用，(A)和(B)分別為處理SC-43和SC-40的細胞的p-STAT3 ELISA分析結果，以及(C)和(D)分別為處理SC-43和SC-40的細胞的STAT3報導基因的分析結果。
2.2.15. SC-43/40對磷酸酶活性的影響
PLC5細胞的蛋白質萃取物與抗-SHP-1抗體在免疫沉澱緩衝液中共同培養整夜。將蛋白G瓊脂糖凝膠4快速流動(Protein G Sepharose 4 Fast flow)(GE Healthcare Bio-Science公司)加到各樣品中，接著在4℃下旋轉培養3小時。該含有SHP-1的蛋白質萃取物進一步與SC化合物(10或100 nmol/L)在4℃下培養30分鐘。以RediPlate 96 EnzChek酪胺酸磷酸酶測定套組(R-22067)進行SHP-1活性的測定(Molecular Probes公司)。圖19顯示SC衍生物在體外增加了SHP-1的磷酸酶活性，(A)SC-43，(B)SC-40，以及(C)SC-49。
2.2.16. SC衍生物在重組SHP-1內對磷酸酶活性的影響
以RediPlate 96 EnzChek酪胺酸磷酸酶測定套組(R-22067)進行SHP-1活性的測定(Molecular Probes公司)。重組SHP-1蛋白(25 ng) 與指示劑量的SC-43或SC-40共同培養30分鐘，然後進行SHP-1磷酸酶活性分析。圖20顯示SC衍生物在體外增加了SHP-1的磷酸酶活性，(A)SC-43以及(B)SC-40。
2.2.17. SC-40對帶有PLC5的異體移植的體內作用
雄性NCr無胸腺裸鼠(5-7週齡)係自國家實驗動物中心(台北，台灣)而來。所有使用這些小鼠進行的實驗程序，皆按照國立台灣大學實驗動物管理及使用委員會批准的實驗操作程序進行。在每隻小鼠的背側面以皮下注射方式，接種1×106 個PLC5細胞，該細胞係懸浮於0.1 mL含有50%基質膠(BD Biosciences公司)的無血清培養基內。當腫瘤達到100至200 mm3 時，對小鼠投與SC-40甲苯磺酸(10或20 mg/kg)，每日口服一次。每週使用游標卡尺測量腫瘤，並使用下列標準公式計算其體積：寬×長×高×0.52。
圖21顯示(A)SC-40在PLC5腫瘤上的抗腫瘤效果；點代表平均(n=6)；條帶代表標準差；(B)p-STAT3和STAT3在PLC5腫瘤內的西方墨點分析；(C)受測動物的體重；以及(D)腫瘤重量和(E)SHP-1在PLC5腫瘤內的活性。這些結果顯示，SC-40對PLC5腫瘤具有顯著的抗腫瘤效果，但不影響動物的體重。對照組小鼠的體重與經SC-40處理過的小鼠的體重沒有顯著差異。
2.2.18 SC-43的抗腫瘤效果
在本實施例中，我們證明SC-43在體外和體內皆具有抗腫瘤的效果。SC-43在肝癌細胞中顯示出顯著的細胞毒性(IC50 約為0.5 μM)。此外，SC-43顯著地造成在帶有肝癌的小鼠體內腫瘤生長的抑制。SHP-1/STAT3-相關的信息傳導途徑是SC-43的抗腫瘤效果的一個重要的目標。請參照圖22(A)SC-43在肝癌細胞內的細胞毒性；(B)SC-43在帶有肝癌的小鼠體內的抗腫瘤作用；(C)由SC-43引起的SHP-1活性；以及(D)在以SC-43(10μM和20μM)處理的肝癌細胞中p-STAT3和STAT3的西方墨點分析。
2.2.19 SC-43對PLC5/luc原位模型的體內作用
雄性NCr無胸腺裸鼠(5-7週齡)係自國家實驗動物中心(台 北，台灣)而來。所有使用這些小鼠進行的實驗程序，皆按照國立台灣大學實驗動物管理及使用委員會批准的實驗操作程序進行。在每隻小鼠的背側面肝臟範圍內，接種1×104 個PLC5/luc細胞，該細胞係懸浮於0.1mL含有50%基質膠(BD Biosciences公司)的無血清培養基內。當腫瘤形成時，對小鼠投與索拉非尼或SC-43甲苯磺酸(10mg/kg)，每日口服一次。每週兩次以非侵入性體內成像系統(IVIS，in vivo imaging system)的圖像系統監測腫瘤生長。
SC-43對帶有PLC5腫瘤的原位小鼠顯現出顯著的抗腫瘤效果。腫瘤的生長係於指定時間以IVIS圖像系統監測。小鼠係以基劑、索拉非尼(10mg/kg)或SC-43(10mg/kg)處理。圖23顯示(A)處理過的小鼠的圖像；(B)顯示小鼠的體重；以及(C)顯示對照組及處理組小鼠之間的生存曲線。結果顯示，SC-43對帶有PLC5腫瘤的原位小鼠顯現出顯著的抗腫瘤效果。對照組小鼠的體重與經SC-43處理過的小鼠的體重沒有顯著差異。

Claims (12)

  1. 一種化合物，係具有如式I之結構 其中R1 及R3 各自獨立，為氫、鹵素、羥基、可經取代的烷氧基、可經取代的烷硫基、可經取代的烷基、可經取代的烯基、可經取代的炔基、可經取代的環烷基、可經取代的雜環烷基、可經取代的芳基、可經取代的芳烷基、可經取代的雜芳基、可經取代的雜芳烷基；其中R2 為-(C)m NHC(X)NH(C)n Ra -、-(C)p NHC(X)Rb -、-(C)q NHS(O)2 Rc 、或-(C)s NH(C)t Re ；其中Ra 、Rb 、Rc 以及Re 各自為可經取代的苯基；X為氧(O)；以及m、n、p、q、s、t為0、1或2。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該R1 及R3 各自獨立，為氫或可經取代的低碳烷基。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之化合物，其中該Ra 、Rb 、Rc 以及Re 之苯基，可經1至3個選自鹵素、可經取代的低碳烷基、可經取代的烷氧基以及可經取代的芳氧基所組成之群組中之基取代。
  4. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1 及R3 為氫；及 R2 為、、、、或；或 其中R1 為氫；R3 為甲基；及 R2 為或。
  5. 一種化合物，係具有如下式之結構：
  6. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1至5項之任一項中所定義之化合物，以及藥理上可接受的載劑。
  7. 一種用於增加含Src同源區-2的蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)在細胞內表現的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1至5項之任一項中所定義之化合物，以及藥理上可接受的載劑。
  8. 一種用於治療以含Src同源區-2的蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)減少為特徵之疾病或病症的醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1至5項之任一項中所定義之化合物，以及藥理上可接受的載劑。
  9. 一種用於在活體外增加含Src同源區-2的蛋白酪胺酸磷酸酶-1(SHP-1)在細胞內表現的方法，包含將該細胞與有效量的如申請專利範圍第1至5項之任一項中所定義之化合物或如申請專利範圍第6項之醫藥組合物接觸。
  10. 一種如申請專利範圍第1至5項之任一項中所定義之化合物在製造治療以SHP-1表現量減少為特徵之疾病或病症的藥劑的用途。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該以SHP-1表現量減少為特徵之疾病或病症為癌症或骨質疏鬆症。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該癌症為肝癌、白血病、肺癌、乳癌、腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、頭部或頸部癌症。
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