TWI494127B - 具有白蛋白結合子ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－的ｆｇｆ２１衍生物及其用途 - Google Patents

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Description

具有白蛋白結合子A-B-C-D-E-的FGF21衍生物及其用途
本發明係關於纖維母細胞生長因子21(Fibroblast Growth Factor 21，FGF21)，更詳言之，係關於具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物。本發明亦係關於新穎的FGF21類似物，以及該等FGF21衍生物及類似物之醫藥用途，尤其用於治療糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(Non Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)。
本發明衍生物經延長，例如能夠維持低血糖含量歷時較長時間，能夠增加FGF21之活體內半生期，及/或產生較低的FGF21清除率。此外，本發明衍生物較佳具有改善之氧化穩定性。
纖維母細胞生長因子為表現於發育組織及成體組織中之多肽。其參與數種生理機制，包括例如代謝調控及細胞分化。存在一個具有超過二十種纖維母細胞生長因子之完整家族(FGF家族)。FGF家族之3個成員(包括FGF19、FGF21及FGF23)形成充當參與代謝調控之內分泌因子的亞族。
纖維母細胞生長因子21或FGF-21(本文簡稱為FGF21)優先表現於肝中，且已顯示出發揮激素樣代謝效應。
舉例而言，已證實FGF21激活小鼠脂肪細胞中之葡萄糖攝取，以在過度表現於轉殖基因小鼠中時阻止小鼠因膳食而誘發肥胖症，且當投予糖尿病性齧齒動物時降低血糖及三酸甘油酯含量(Kharitonenkov等人,J. Clin. Invest .(2005),115:1627-1635)。
糖尿病性猴中亦顯示FGF21降低血糖及三酸甘油酯之效應。FGF21亦能夠顯著降低糖尿病性猴之LDL且顯著增加其HDL(Kharitonenkov等人,Endocrinology (2007),148(2):774-81)。
在因膳食而誘發肥胖之小鼠及ob/ob小鼠中，FGF21亦顯示主要藉由增加能耗及降低肥胖而減少體重(Coskun等人,Endocrinology (2008),149(12): 6018-6027)。
基於該等結果，表明FGF21為有可能治療糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病及代謝症候群之藥理學藥劑。代謝症候群包括多個方面，如胰島素抵抗、血脂異常、內臟型肥胖症及高血壓，參見例如Grundy等人,Circulation (2004),(109): 433-438中關於代謝症候群之定義。
此外，FGF21可用作有可能治療非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之藥理學藥劑，參見Coskun等人,Endocrinology, 2008,上述及Xu等人,Diabetes (2009),58(1):250-9(2008年10月7日先於印刷版推出電子版)。NAFLD已由Erickson,J. Lipid Res .(2008)(2008年12月12日先於印刷版推出電子版)加以定義。
Yie等人研究FGF21之N端及C端在受體相互作用及活化中之作用，參見FEBS Letters, 583(2009),19-24。
WO 2003/011213 A2揭示使用FGF21化合物來治療第1型及第2型糖尿病或肥胖症之方法，該等FGF21化合物與FGF21前驅胺基酸序列至少95%一致。
WO 2003/061712 A1揭示醫藥性質有所改善之FGF21突變蛋白(mutein)，例如A145E。
WO 2005/091944 A2揭示FGF21之聚乙二醇化衍生物，即FGF21-K59C及FGF21-K122C。
WO 2005/113606 A2揭示各種具有IgG4免疫球蛋白Fc部分或人類血清白蛋白之FGF21融合蛋白。
WO 2006/028595 A2揭示當表現於酵母中時O-糖基化能力降低之其他FGF21突變蛋白，例如L118C-A134C-S167A。
WO 2006/028714 A1揭示當表現於酵母中時對蛋白降解(proteolytic degradation)之敏感性降低的其他FGF21突變蛋白，例如L153I。
WO 2006/065582 A2揭示脫醯胺作用減小之其他FGF21突變蛋白，例如des-HPIP-L118C-A134C-N121D。
WO 2006/078463 A2揭示使用天然的成熟FGF21或其特定變異體來治療心血管疾病之方法。
WO 2008/121563揭示經修飾成包括非天然編碼胺基酸之FGF21多肽，以及其衍生物。
簡言之，本發明係如下文申請專利範圍第1項中所定義。
本發明係關於具有白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物上之FGF21化合物衍生物，其中白蛋白結合子具有式A-B-C-D-E-，其中單元A為脂肪酸或其衍生物。本發明亦係關於新穎的FGF21類似物，以及本發明衍生物及類似物在醫藥組成物中之用途，尤其用於治療糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
本發明衍生物經延長，例如能夠維持低血糖含量歷時較長時間，能夠增加FGF21之活體內半生期，及/或產生較低的FGF21清除率。延長之FGF21衍生物保留令人滿意的生物活性，且投藥頻率可能較低。此外，該等衍生物較佳具有改善之氧化穩定性。
本發明係關於具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-不存在，表示一鍵或選自-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX、IX或XXVIII的單元，或至多4個式IIX及/或式IX及/或式XXVIII的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點；
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)，其中u為2、3或4，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-不存在，表示一鍵或為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點；且#為與-B-之連接點；-D-不存在，表示一鍵或為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)或#-NH-(CH2 )t *(式XIII)，其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-不存在，表示一鍵或為式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦係關於新穎的FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R；視情況獨立地具有N端M(例如，-1M)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。SEQ ID NO:1為具有181個胺基酸殘基之成熟野生型人類FGF21肽。
最後，本發明係關於醫藥組成物，其包含治療有效量之本發明類似物或衍生物、及醫藥學上可接受之載劑；以及關於治療展現糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之患者的方法，該等方法包含向患者投予治療有效量之本發明類似物、衍生物或組成物。
在第一個方面，本發明衍生物具有式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之硫醇基(亦即，半胱胺酸殘基)上。
在第二個方面，本發明衍生物具有式A-B-C-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之胺基上，該胺基可為N端胺基及/或內部胺基(諸如離胺酸殘基之ε-胺基)。
本發明衍生物及本發明類似物之生物效應應與FGF21之生物效應類似，例如關於葡萄糖降低效應，會改善血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
定義
如本文所使用之術語「FGF21化合物」係指天然人類FGF21以及其類似物。
天然人類FGF21蛋白之序列可自UNIPROT資料庫以寄存編號Q9NSA1獲得。含209個胺基酸之前驅蛋白質包括信號肽(胺基酸1-28)及成熟蛋白(胺基酸29-209)。本文包括成熟蛋白作為SEQ ID NO:1(胺基酸1-181)，且信號肽為SEQ ID NO:2(胺基酸1-28)。
自例如US2001012628 A1已知天然人類FGF21之成熟蛋白中，用Pro替代本文SEQ ID NO:1之位置146處的Leu所獲得之同功異構或對偶基因形式(在該公開之美國申請案中為SEQ ID NO:2之第174個殘基)。
自WO 2003/011213已知另一具有較短信號肽之同功異構物，該信號肽中本文SEQ ID NO:2之位置23處的Leu缺失(參見該WO公開案之SEQ ID NO:2，其具有含27個胺基酸殘基之信號肽)。
因此，天然人類FGF21之特定實例為：SEQ ID NO:1、具有取代L146P之SEQ ID NO:1以及在此等序列中任一者之前加上以上所提及之含27或28個胺基酸之信號肽。天然人類FGF21之較佳實例為成熟部分，即SEQ ID NO:1及其L146P同功異構物。
如本文在FGF21之情況下所提及之術語「類似物」(亦即FGF21類似物)係指自或可自天然FGF21、尤其SEQ ID NO:1藉由修飾其胺基酸序列而產生或衍生之多肽。該修飾、修改或改變可包括取代、缺失及/或添加一或多個胺基酸。舉例而言，在胺基酸序列之C端、N端或內部可添加及/或缺失胺基酸。較佳在C端及/或N端、更佳在N端添加及/或缺失胺基酸。如此項技術中所知，C端或N端缺失胺基酸之胺基酸序列亦可稱為截短序列。同樣，在序列內部添加胺基酸可稱為插入。術語「變異體」或「突變蛋白」在本文中有時替代術語「類似物」使用。
FGF21類似物之一個實例為移除成熟蛋白(HPIP)之4個N端胺基酸殘基的天然成熟FGF21截短形式，其揭示於例如WO 2006/065582中。該截短形式被認為以與野生型FGF21相同之程度刺激小鼠3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取。該蛋白質具有含本文SEQ ID NO：1之胺基酸5-181之胺基酸序列。
FGF21類似物之另一實例為具有N端Met之SEQ ID NO：1多肽(亦稱為「Met-FGF21」或SEQ ID NO：1之取代-1M((負1)M))。當FGF21化合物表現於大腸桿菌中時，添加N端Met，參見例如WO 2006/050247，表6。
FGF21類似物之其他實例為經修飾FGF21序列(通常稱為突變蛋白)，其揭示於例如WO 2003/061712、WO 2005/091944、WO 2006/028595、WO 2006/028714、WO 2006/065582及WO 2008/121563(參見本文之先前技術章節)。
FGF21類似物之其他實例揭示於本文之實驗部分以及隨附申請專利範圍中。
如本文在FGF21修飾之情況下所提及之術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」包括20種由細胞在蛋白質生物合成中使用且由遺傳密碼指定之標準α-胺基酸，即丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。該術語亦包括非標準胺基酸，諸如硒代半胱胺酸 及吡咯離胺酸，其亦由遺傳密碼編碼，但在蛋白質較罕見。蛋白質中發現之其他非標準胺基酸可由轉譯後修飾形成，例如γ-羧基-麩胺酸鹽及羥基脯胺酸。不由遺傳密碼編碼之非標準或非天然胺基酸之其他實例為鳥胺酸及磷酸絲胺酸。非標準胺基酸之其他實例為合成胺基酸，包括由化學合成製造之胺基酸，例如，由遺傳密碼編碼的胺基酸之D-異構物，諸如D-丙胺酸、D-麩醯胺酸、D-組胺酸及D-白胺酸、Aib(α-胺基-異丁酸)、Abu(α-胺基丁酸)、Tle(第三丁基甘胺酸)、β-丙胺酸、3-胺基甲基苯甲酸、鄰胺基苯甲酸、消-胺基-組胺酸(縮寫成DesaminoHis，替代名稱為咪唑基丙酸，縮寫成Impr)；胺基酸之β類似物，諸如β-丙胺酸、2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、N α-乙醯基-組胺酸、α-氟-甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、α,α-二甲基-麩胺酸、m-CF3 -苯丙胺酸(縮寫成m-CF3 -Phe)、α,β-二胺基丙酸(縮寫成Dap)、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸、(1-胺基環丙基)甲酸、(1-胺基環丁基)-甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸及(1-胺基環辛基)甲酸。
出於本發明之目的，標準胺基酸之兩種識別編碼(一個字母及三個字母)可互換使用，或有時寫出胺基酸全稱。該等術語當然被視為完全等效(例如S=Ser=絲胺酸)。
如本文所使用之術語「衍生物」係指經共價修飾之FGF21化合物。該術語本身不具有限制性，而是描述性的，因為其意欲標示對組成部分FGF21多肽化合物之類(「類似物」)所作改變之間的區別，及側鏈共價結合該FGF21化合物，藉此該化合物「經衍生」。必要時，該術語可用其他通用化學術語(例如化合物)替代。
術語「白蛋白結合子」本身亦不意欲具有限制性。同樣，而是描述性的，因為其反映之總目的在於使A-B-C-D-E-鏈連接於FGF21化合物上，即所得化合物(衍生物)能夠結合人類血清白蛋白，此提供或至少有助於本發明衍生物旨在獲得之延長效應。必要時，該術語亦可用其他通用化學術語(例如化合物)替代。
命名法：本文中，可互換使用被認為最適於簡化理解所討論技術問題之多肽命名法、有機化學命名法及化學式或其混合形式來命名類似物及衍生物。舉例而言，實施例4之衍生物可命名為S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys122]-Met-FGF21(意謂[Cys122]Met-FGF21在位置122之Cys之硫醇基處經1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基修飾)。然而，該化合物亦可既定為K122C Met-FGF21，在C122處經以下化合物衍生：
變異體命名法(類似物之命名法)：本文中，可互換使用被認為最適於簡化理解所討論技術問題之多肽命名法、有機化學命名法、化學式、胺基酸序列或其混合形式來命名FGF21之變異體(或類似物)。
舉例而言，變異體中之取代可以「原始胺基酸-位置-取代之胺基酸」表示。可使用三個字母之編碼或一個字母之編碼。因此，表示法「K122C」或「Lys122Cys」意謂當變異體與FGF21如下文(「排比」)進一步描述進行排比時，變異體在對應於FGF21(SEQ ID NO:1)之位置122處之胺基酸的變異體胺基酸位置處包含用半胱胺酸取代離胺酸。
多重修飾(諸如取代)可用逗號(逗號之後存在空格)隔開，且必要時可用括號圍住以明確其屬於同一變異體。實施例7中衍生之類似物可例如指定為「K56R,K59R,K69R,K122R Met-FGF21」或「(K56R,K59R,K69R,K122R)Met-FGF21」，或可稱為「具有K56R、K59R、K69R及K122R以及N端M之SEQ ID NO:1」。關於具有呈取代及插入之混合形式之多重修飾的變異體之命名法，參見實施例2之化合物Y。
替代修飾(諸如既定位置處之替代取代基)可用逗號隔開，例如符號「S181K,R」意謂位置181處之Ser可經Lys或Arg取代。
延伸可參考SEQ ID NO:1藉由添加位置編號來描述(在C末端繼續為正數且在N末端繼續為負數)，或更簡單言之，藉由在所討論化合物中使用正確序列添加所討論延伸之胺基酸來描述，亦為簡化理解相關技術要點，隨後通常給予該化合物一俗名，諸如FGF21。舉例而言，化合物(s)MGGGGG-FGF21表示參考SEQ ID NO:1位置-1處為G、位置-2處為G、位置-3處為G、位置-4處為G、位置-5處為G且位置-6處為M的SEQ ID NO:1(FGF21)多肽。同樣，化合物(q) MS-FGF21(或Met-Ser-FGF21)表示參考SEQ ID NO:1位置-1處為S且位置-2處為M的SEQ ID NO:1(FGF21)多肽。
變異體中之插入可以「插入之前的胺基酸位置編號-索引-插入之胺基酸」表示。插入之前的胺基酸位置編號係指FGF21(SEQ ID NO:1)中正位於當如下文(「排比」)進一步描述排比變異體與FGF21時所產生之空位之前的胺基酸位置。對於胺基酸，可使用三個字母之編碼或一個字母之編碼。索引為按字母順序之小寫字母，例如視情況而定，第一個插入之胺基酸殘基為「a」，第二個插入之胺基酸殘基為「b」等。因此，表示法「V169aT」(或「Val169aThr」)或簡單地「169aT」(或「169aThr」))均意謂當如下文(「排比」)進一步描述排比變異體與FGF21時，變異體在FGF21(SEQ ID NO:1)之位置169處的纈胺酸之後包含蘇胺酸插入。
在FGF化合物中存在額外二硫橋之情況下，將兩個Cys表示成彼此鄰接且經由短劃連接，例如當位置118處之Cys與位置134處之Cys之間存在二硫橋時，以「L118C-A134C」表示。
出於本發明之目的，可使用來自EMBOSS套件之尼德爾程式(Needle program)(http://emboss.org)進行兩個胺基酸序列之排比。較佳版本為2.8.0。尼德爾程式執行Needleman,S. B.及Wunsch,C. D.(1970)J. Mol. Biol. 48,443-453中描述之全域排比算法。所使用之取代矩陣為BLOSUM62，空位開放罰分為10，且空位延伸罰分為0.5。
本發明之FGF21類似物序列(「本發明之序列」；例如具有K56R、K59R及K69R之SEQ ID NO:1)與另一胺基酸序列(「外來序列」；例如SEQ ID NO:1之FGF21序列)之間的一致性程度或百分比係以此兩個序列排比時之精確匹配數除以「本發明之序列」之長度或「外來序列」之長度(不考慮哪個最短)來計算。結果以一致性百分比表示。
當「本發明之序列」與「外來序列」在重疊的相同位置處具有相同胺基酸殘基時，發生精確匹配(在下文排比實例中，此以「*」表示)。序列之長度為序列之胺基酸殘基數目(例如，SEQ ID NO:1之長度為181)。
此為以上所提及之「本發明之序列」與「外來序列」之排比的實例：
因此，該FGF21類似物與FGF21之一致性百分比為178/181×100%=98.3%。
在替代情形中，兩個胺基酸序列之間的一致性程度可利用程式「排比」來確定，該程式為尼德曼-溫塞奇排比(Needleman-Wunsch alignment)(亦即全域排比)。利用該程式，使用預設計分矩陣BLOSUM50來排比序列。空位之第一個殘基的罰分為12，且空位之其他殘基之罰分為2。尼德曼-溫塞奇算法描述於Needleman,S.B.及Wunsch,CD.,(1970),Journal of Molecular Biology, 48: 443-453中，且排比程式由Myers及W. Miller描述於Optimal Alignments in Linear Space CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4:11-17中。「排比」為FASTA套件v20u6版之一部分(參見W. R. Pearson及D. J. Lipman(1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS 85:2444-2448，及W. R. Pearson(1990)"Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,"Methods in Enzymology 183:63-98)。
包含本發明之FGF21化合物衍生物或FGF21類似物的醫藥組成物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。對於注射，載劑可為水，必要時可補充有其他物質，例如鹽水，諸如生理鹽水。亦可使用其他醫藥學上可接受之試劑，諸如稀釋劑及適當的緩衝劑。必要時，亦可使用其他醫藥學上可接受之試劑，諸如乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、膨化劑、佐劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑及/或調味劑。如此項技術中所知，FGF21化合物衍生物或FGF21類似物可以純多肽或其衍生物形式使用，或使用適當的醫藥學上可接受之賦形劑加以調配。醫藥組成物可以此項技術中已知之任何方式投予，例如注射，例如靜脈內(i.v.)或皮下(s.c)注射。
醫藥組成物中可包括治療有效量或預防有效量之FGF21化合物衍生物或FGF21類似物。該量取決於治療目標或預防目標，諸如所討論之適應症、需要治療之患者的病狀、所需投藥途徑等。根據此項技術中之慣例，熟練醫師可能必須視該等因素來調整劑量，並改變投藥。
特定具體實例
以下為本發明衍生物之特定具體實例，詳言之，本發明的第一個方面之衍生物的特定具體實例，在該第一個方面中，式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之硫醇基(亦即，例如半胱胺酸殘基)上：
在一個具體實例中，A-為式I的單元：(式I)，其中n為14、16或18。
在一個具體實例中，-B-包含-B1-，較佳為式IV或V的單元：
在一個具體實例中，-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IIX或IX的單元：
其中更佳c為0且b為2(γ-Glu)，或c為0且b為1(β-Asp)，或其中更佳d為1且e為2，或d為2且e為1。
在一個具體實例中，-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IIX的單元：(式IIX)，其中更佳c為0且b為2(γ-Glu)，或c為0且b為1(β-Asp)。
在一個具體實例中，-C-為式X的單元：(式X)，其中較佳q為0、1、2、3或4，更佳q為1或2。
在一個具體實例中，-C-為式X的單元：(式X)，其中較佳p為1或2，更佳p為1，甚至更佳p為1且q為1或2，或最佳p為1且q為2。
在一個具體實例中，-C-為式XI的單元：(式XI)，其中較佳m為0、1或2，更佳m為1或2。
在一個具體實例中，-C-為式XI的單元：(式XI)，其中較佳k為1、2、3、4、5或11，更佳k為5。
在一個具體實例中，-C-為式XI的單元：(式XI)，其中m為1且k為4、5或11，較佳m為1且k為5。
在一個具體實例中，-D-為式XII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)，其中較佳r為2，及/或其中較佳s為1或2，最佳r為2且s為2。
在一個具體實例中，-D-為式XIII的單元：#-NH-(CH2 )t -*(式XIII)，其中較佳t為1、2或3，更佳t為2。
在一個具體實例中，-D-不存在。
在一個具體實例中，-E-為式XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI或XXVII的單元：
(式XXV)、(式XXVI)、(式XXIV)、(式XXVII)，或為一鍵。
在一個具體實例中，-E-為式XXII、XXIII、XXV或XXVI的單元：(式XXII)、(式XXIII)、(式XXV)、(式XXVI)，或為一鍵。
在一個具體實例中，-E-為FGF21化合物與活化酯之反應產物，例如(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺(式XIV)，或為式XV、XVI、XVII、IIXX、IXX、XX或XI之活性的單元：(式XV)、(式XVI)或其醯胺(碘乙醯胺)、(式XVII)、(式IIXX)、(式IXX)、(式XX)或(式XXI)，其中#為與-C-或-D-之連接點。
在一個具體實例中，衍生物具有1或2個式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子。
在一個具體實例中，衍生物具有2個白蛋白結合子，較佳其中A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為8、9、10、11、12或13。
在一個具體實例中，衍生物具有2個白蛋白結合子，較佳其中A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為10、11、12或13。
在一個具體實例中，衍生物具有1個白蛋白結合子，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為10、11、12、13、14、15、16、17或18。
在一個具體實例中，衍生物具有1個白蛋白結合子，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為14、15、16、17或18。
在一個具體實例中，A-B-C-D-E-係選自以下式(1)-(12)：
(14):，或任何相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。順便提及，包括(2)及(3)之衍生物可藉由降解包括式(1)之衍生物而產生。
在一個具體實例中，A-B-C-D-E-係選自以下式(1)-(12)：
或任何相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。順便提及，包括(2)及(3)之衍生物可藉由降解包括式(1)之衍生物而產生。
在一個具體實例中，白蛋白結合子連接於FGF21化合物中一或多個(諸如2個)選自位置-1(例如在類似物MetCys-FGF21中)、6、71及122的位置處之半胱胺酸殘基上，其中位置編號係參考SEQ ID NO:1。
在一個具體實例中，本發明化合物係選自實施例4、5及6之衍生物，較佳為以下：S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys122]-Met-FGF21；S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys71]Met-FGF21；及S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[Cys71]Met-FGF21；或該等化合物中任一者之醫藥學上可接受之鹽。
以下為本發明衍生物之特定具體實例，詳言之，本發明的第二個方面之衍生物的特定具體實例，在該第二個方面中，式A-B-C-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之胺基上：
在一個具體實例中，A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：(式IV或Trx)、(式V或Inp)、(式VI)或(式VII)；其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX、IX或XXVII的單元，或至多4個式IIX及/或式IX及/或XXVII的單元之組合：(式IIX)，其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點；或(式IX)，其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中u為2、3或4，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點，且-C-為式X或XI的單元：(式X)，其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或(式XI)，其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個具體實例中，A-為式I、II或III的單元：
(式III)；其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：(式IIX)，其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或(式IX)，其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-為式X或XI的單元：(式X)，其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或(式XI)，其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個具體實例中，A-為式I的單元：(式I)，其中n較佳為14、16或18。
在一個具體實例中，-B-包含-B1-，較佳為式IV或V的單元：(式Iv)或(式v)。
在一個具體實例中，-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IIX的單元：(式IIX)，其中更佳c為0且b為2(γ-Glu)，或c為0且b為1(β-Asp)。
在一個具體實例中，-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IX的單元：(式IX)，其中更佳d為1且e為2，或d為2且e為1。
在一個具體實例中，-B-包含-B2-，較佳為1或2個式XXVIII的單元：#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)，其中更佳u為3。
在一個具體實例中，-C-為式X的單元：(式X)，其中較佳q為0、1、2、3或4，更佳q為1或2。
在一個具體實例中，-C-為式X的單元：(式X)，其中較佳p為1或2，更佳p為1。
在一個具體實例中，-C-為式X的單元：(式X)，其中p為1且q為1或2，較佳p為1且q為2。
在一個具體實例中，-C-為式XI的單元：(式XI)，其中較佳m為0、1或2，更佳m為1或2。
在一個具體實例中，-C-為式XI的單元：(式XI)，其中較佳k為1、2、3、4、5或11，更佳k為5，甚至更佳m為1且k為4、5或11，或最佳m為1且k為5。
在一個具體實例中，本發明化合物為具有1或2個式A-B-C-之白蛋白結合子之衍生物。
在一個具體實例中，本發明化合物為具有2個白蛋白結合子之衍生物，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為8、9、10、11、12或13。
在一個具體實例中，本發明化合物為具有2個白蛋白結合子之衍生物，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為10、11、12或13。
在一個具體實例中，本發明化合物為具有1個白蛋白結合子之衍生物，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為10、11、12、13、14、15、16、17或18。
在一個具體實例中，本發明化合物為具有1個白蛋白結合子之衍生物，其中較佳A-為式I、II或III的單元：(式I)、(式II)或(式III)；其中n為14、15、16、17或18。
在一個具體實例中，本發明化合物為衍生物，其中A-B-C-係選自以下式(13)-(19)：
(19):；或任一相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
在一個具體實例中，本發明化合物為衍生物，其中A-B-C-係選自以下式(13)-(15)：
或任一相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
在一個具體實例中，本發明化合物為白蛋白結合子經由N端胺基酸殘基之胺基、較佳在形成醯胺鍵之情況下進行連接的化合物。
在一個具體實例中，本發明化合物為白蛋白結合子經由離胺酸殘基之ε胺基、較佳在形成醯胺鍵之情況下進行連接的化合物。
在一個具體實例中，本發明化合物為一個白蛋白結合子連接於N端胺基酸殘基上且另一白蛋白結合子連接於內部離胺酸殘基上的化合物。
在一個具體實例中，本發明化合物為白蛋白結合子連接於FGF21化合物中一或多個(諸如2個)選自位置56、59、69、122及152之位置處的離胺酸殘基上之化合物，其中位置編號係參考SEQ ID NO:1。
在一個具體實例中，本發明化合物為實施例7之化合物，較佳為以下：N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Arg56,Arg59,Arg69,Arg122]-Met-FGF21；或其醫藥學上可接受之鹽。
以下為本發明衍生物之其他特定具體實例，其特性在於組成部分FGF21化合物之結構：較佳地，FGF21化合物與SEQ ID NO:1之一致性為至少80%，較佳為至少85%，更佳為至少90%，甚至更佳為至少95%。
較佳地，FGF21化合物與SEQ ID NO:1相比具有最多36個胺基酸改變(修飾)，較佳最多30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變，更佳最多15、14、13、12、11或10個胺基酸修飾，甚至更佳最多9、8、7、6或5個胺基酸修飾，或最佳最多4、3、2或1個胺基酸修飾。
FGF21化合物較佳具有含至多25個胺基酸殘基之N端延伸。該等延伸可使用負殘基編號(亦即SEQ ID NO:1之殘基編號-1至-25)提及。該N端延伸為預期有助於如本文所定義及主張之白蛋白結合子連接於FGF21化合物之N端的連接子。當使用該連接子時，衍生物可僅包含單元A-(或由單元A-組成)，意謂單元-B-、-C-、-D-及-E-可能均不存在。然而，除A-以外，較佳亦包括單元-B-及/或單元-C-，更佳亦包括Trx或Inp之-B1-單元，或最佳亦包括式IIX、IX或XXVII之-B2-單元，詳言之γ-Glu。N端延伸較佳具有至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基。
較佳地，至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為甘胺酸或絲胺酸。
在一個具體實例中，FGF21化合物包含SEQ ID NO:1胺基酸序列。
在一個具體實例中，FGF21化合物(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1M、-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、L118C、K122C、K122R、A134C、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為以下至少一者：-1M、-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、L118C、K122C、K122R、A134C、I152K及/或M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。
在一個具體實例中，FGF21化合物(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(i)K122C、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)及/或(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為K122C、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E及/或M168L)、(ii) -1G及(-1G,M168L)，或(iii) S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)及(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)，其中(i)及(iii)之FGF21化合物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21化合物中，N端M可視情況缺失。
在一個具體實例中，FGF21化合物包含Y179F、A180E及S181K或S181R(i)；較佳地，其另外包含V169aT、P171L、S172E、Q173A及G174V(ii)；更佳地，其另外包含L166F、S167G及M168L(iii)；最佳地，其包含(i)、(ii)及(iii)。該等具體實例(i)-(iii)各視情況包括N端M(例如-1M)。
在一個具體實例中，與SEQ ID NO:1相比，FGF21化合物包含以下取代:(a)K122C；(b)(K59R,K69R,K122R)；(c)(K56R,K69R,K122R)；(d)(K56R,K59R,K69R)；(e)S71C；(f)S6C；(g)(K56R,K59R,K69R,K122R)；(h)(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)；(i)(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)；(j)(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)；或(k)M168L。
在一個具體實例中，與FGF21(SEQ ID NO:1)相比，FGF21化合物包含以下修改：(i)N端存在Met-Gly-，(ii)M168L，(iii)具體實例(i)及(ii)，(iv)N端存在Met-Cys-，(v)N端存在Gly-，(vi)具體實例(v)及(ii)，(vii)N端存在Met-Ser-，或(iix)N端存在Ser-；FGF21化合物較佳係選自以下：(l)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)Gly-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21，或(r)Ser-FGF21；其中FGF21係指SEQ ID NO:1多肽。
在一個具體實例中，與SEQ ID NO:1相比，FGF21化合物包含以下N端延伸：(q)MS-FGF21，(s)MSGSGSGSGSG-，(t)MGGGGG-，(u)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-，(v)MSGGGGG-，(X)MSGSGGS-，(y)MSGGSSG-，及(z)MSGSGSG-；以及無N端Met之具體實例(q)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)、(y)及(z)中任一者。
在一個具體實例中，FGF21化合物係選自SEQ ID NO:1多肽之以下變異體：(a)K122C，(e)S71C，(f)S6C，(n)Met-Cys-FGF21，具有N端Met之化合物(a)、(e)及(f)中任一者，及無N端Met之化合物(n)。
在一個具體實例中，FGF21化合物係選自SEQ ID NO:1多肽之以下變異體：(b)(K59R,K69R,K122R)；(c)(K56R,K69R,K122R)；(d)(K56R,K59R,K69R)；(g)(K56R,K59R,K69R,K122R)；(h)(K56R,K59R,K69R,K122R,1152K)；(i)(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)；(j)(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)；(k)(179F,180E,181R)；(1)(169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)；及(m)(166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)；以及具有N端Met之化合物(b)、(c)、(d)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)及(m)中任一者(較佳為(b)-(j)+/-N端Met)。
在一個具體實例中，FGF21化合物在位置146處具有脯胺酸，其中位置編號係指SEQ ID NO:1，該化合物為先前技術中已知之FGF21之對偶基因野生型形式。
以下為本發明衍生物之其他特定具體實例，其特性在於生物及化學性質：在一個具體實例中，本發明衍生物較佳經延長，參見本文實驗章節之實施例11。
在一個具體實例中，當對小鼠進行皮下給藥時，本發明衍生物之為至少1.5小時，較佳至少2小時，更佳至少4小時，甚至更佳至少5小時，或最佳至少6小時。
在一個具體實例中，當對小鼠進行皮下給藥時，衍生物之為至少10小時，較佳至少15小時，更佳至少24小時，或最佳至少48小時。小鼠為db/db小鼠，較佳為缺乏瘦素受體之小鼠。
在一個具體實例中，衍生物之劑量為0.5mg/kg，但亦可使用0.1mg/kg至1.0mg/kg範圍內之劑量。
在另一具體實例中，當對迷你豬進行靜脈內給藥時，本發明衍生物之為至少15小時，較佳至少20小時，更佳至少30小時，甚至更佳至少40小時，或最佳至少50小時。
當對迷你豬進行靜脈內給藥時，本發明衍生物之甚至可為至少60小時，較佳至少70小時，更佳至少75小時。迷你豬較佳為正常雄性格廷根(Gttingen)迷你豬。各處理組中豬之數目較佳為n=3-4。豬較佳為12-15月齡，且更佳地體重為約25kg。較佳給予豬較佳為0.1mg/kg(約5nmol/kg)之單次靜脈內劑量。
本發明衍生物及類似物以及比較性FGF21化合物之血漿濃度可由此項技術中已知之任何適合方法測定。較佳檢定為纖維母細胞生長因子-21人類ELISA，可以目錄號RD191108200R獲自BioVendor(例如BioVendorGmbH,Im Neuenheimer Feld 583,D-69120 Heidelberg,Germany)。
衍生物較佳具有可接受之效能，參見本文實驗章節之實施例8。
在一個具體實例中，效能為Met-FGF21之效能的至少1%，較佳至少5%，更佳至少10%，甚至更佳至少20%，或最佳至少30%，其中效能係藉由量測3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取來測定。
在一個具體實例中，效能為Met-FGF21之效能的至少40%，較佳至少50%，更佳至少60%，甚至更佳至少70%。
在一個具體實例中，效能甚至可為Met-FGF21之效能的至少80%，較佳至少90%，更佳至少100%，甚至更佳至少110%或最佳至少120%。
對於該等具體實例中每一者，效能較佳藉由量測3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取來測定。
效能以衍生物之EC50 相對於Met-FGF21之EC50 來計算。
3T3-L1脂肪細胞源自小鼠3T3-L1纖維母細胞，較佳源自ATCC CL-173。
3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取可如實施例8中所概述進行量測。
本發明衍生物較佳具有可接受之效能及延長之半生期：在一個具體實例中，當對小鼠進行皮下給藥時，本發明衍生物之為至少1.5小時，較佳至少2小時，更佳至少4小時，甚至更佳至少5小時，或最佳至少6小時，且同時，效能如上述具體實例中任一者所述。
在一個具體實例中，當對小鼠進行皮下給藥時，本發明衍生物之為至少10小時，較佳至少15小時，更佳至少24小時，或最佳至少48小時，且同時，效能如上述具體實例中任一者所述。
在一個具體實例中，當對迷你豬進行靜脈內給藥時，本發明衍生物之為至少15小時，較佳至少20小時，更佳至少30小時，甚至更佳至少40小時，或最佳至少50小時，且同時，效能如上述具體實例中任一者所述。
在一個具體實例中，當對迷你豬進行靜脈內給藥時，衍生物之為至少60小時，較佳至少70小時，更佳至少75小時，且同時，效能如上述具體實例中任一者所述。
衍生物對db/db小鼠之血糖含量具有活體內效應，參見本文實驗章節之實施例11：相對於媒劑對照組，衍生物能夠活體內降低db/db小鼠之血糖。
在一個具體實例中，血糖值在投予最後一劑衍生物之後24小時、較佳48小時降低。
在一個具體實例中，以平均血糖量測值(mM)計且相對於相應煤劑對照組，血糖值降低至少10%，較佳至少15%，更佳至少20%，甚至更佳至少25%，或最佳至少30%。舉例而言，參考表3之資料：最後劑量之後48小時，實施例4之衍生物(給藥量為0.22mg/kg)產生之平均血糖量測值為17.1mM。在相同時間點，煤劑產生之平均血糖量測值為23.9mM。因此，與媒劑對照組相比，實施例4之衍生物(給藥量為0.22mg/kg)使血糖降低或減少100%-(100×17.1/23.9)%=28%。
在一個具體實例中，血糖值降低至少35%，較佳至少40%，更佳至少45%，或最佳至少50%，參看實施例10之測試方法。
參考本文之實施例9，本發明衍生物較佳具有氧化穩定性。
在一個具體實例中，本發明衍生物比Met-FGF21對氧化穩定。此可藉由儲存於不同溫度下並檢查氧化或藉由在25℃下在300mM H2 O2 存在下培育1小時來測試。
術語「穩定」(亦即穩定性)係指如上文所述而測定之效能。
與H2 O2 一起培育之後，衍生物之效能為至少15%，較佳至少20%，更佳至少30%，甚至更佳至少40%，或最佳至少50%，其中效能相對於以相同方式處理但無H2 O2 之Met-FGF21。
以下為本發明之FGF21類似物之特定具體實例，首先利用結構進行定義，接著利用生物及化學性質進行定義，最後為一些其他結構具體實例。
一個具體實例為FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K及/或M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。
一個具體實例為FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(i)(K122C)、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)或(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)及/或(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E及/或M168L)，(ii)-1G及(-1G,M168L)，或(iii)S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)及(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)，其中(i)及(iii)之FGF21類似物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N端M可視情況缺失。
一個具體實例為FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(i)(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)或(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)及/或(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E及/或M168L)，(ii)-1G及(-1G,M168L)，或(iii)S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122K)及(S6K,K56K,K59K,K69K,K122K)，其中(i)及(iii)之FGF21類似物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N端M可視情況缺失。
一個具體實例為FGF21類似物，與SEQ ID NO:1多肽相比，其包含一或多個以下修飾：S6C、S6K、K56K、K59R、K69K、S71C、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為S6C、S6K、K56R、K59R、K69R、S71C、K122R、I152K及/或M168L)。該具體實例在FGF21之成熟部分包括新穎的單取代(按數字順序)。
一個具體實例為FGF21類似物，與SEQ ID NO:1多肽相比，其包含一或多個以下修飾：S6C、S71C、M168L、(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、(K56R,K69R,K122R)、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)及(K56R,K59R,K69R,K122R,L118C-A134C)、(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)及/或(Y179F,A180E,S181R)；較佳為S6C、S71C、M168L、(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、(K56R,K69R,K122R)、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)及/或(K56R,K59R,K69R,K122R,L118C-A134C)。該具體實例包括在FGF21之成熟部分含組成部分單取代及多取代或組合取代的新穎本發明類似物。
首先列出單取代，隨後在第一取代之後按數字順序列出組合取代，接著為數目遞增之取代。
一個具體實例為FGF21類似物，其包含Y179F、A180E及S181K或S181R(i)；較佳另外包含V169aT、P171L、S172E、Q173A及G174V(ii)；更佳另外包含L166F、S167G及M168L(iii)；最佳包含(i)、(ii)及(iii)。
在一個具體實例中，任何上述具體實例之FGF21類似物均可進一步在SEQ ID NO:1之位置-1處包括Met。
一個具體實例為選自以下之FGF21類似物:(1)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)Gly-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21，或(r)Ser-FGF21；其中FGF21表示SEQ ID NO:1多肽。
一個具體實例為FGF21類似物，與SEQ ID NO:1相比，其具有N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為甘胺酸或絲胺酸。
一個具體實例為FGF21類似物，與SEQ ID NO:1相比，其包含以下N端延伸：(q)MS-FGF21，(s)MSGSGSGSGSG-，(t)MGGGGG-，(u)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-，(v)MSGGGGG-，(x)MSGSGGS-，(y)MSGGSSG-，及(z)MSGSGSG-；以及無N端Met之具體實例(q)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)、(y)及(z)中任一者。
一個具體實例為選自以下之FGF21類似物：(r)MSGSGSGSGSG-FGF21，(s)MGGGGG-FGF21，(t)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21，(u)MSGGGGG-FGF21，(v)MSGSGGS-FGF21，(x)MSGGSSG-FGF21及(y)MSGSGSG-FGF21，以及無N端Met之具體實例(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)及(y)中任一者；其中FGF21係指SEQ ID NO:1。
一個具體實例為任何上述具體實例之FGF21類似物，其在位置146處具有P(脯胺酸)，其中位置編號係指SEQ ID NO:1。
在一個具體實例中，FGF21類似物之效能為Met-FGF21之效能的至少1%，其中效能係藉由量測3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取來測定。
在一個具體實例中，FGF21類似物之效能為Met-FGF21之效能的至少5%，較佳至少10%，更佳至少20%，甚至更佳至少30%，或最佳至少40%。
在一個具體實例中，FGF21類似物之效能為Met-FGF21之效能的至少50%，較佳至少60%，更佳至少70%，甚至更佳至少80%，或最佳至少90%。
在一個具體實例中，FGF21類似物之效能為Met-FGF21之效能的至少100%，較佳至少120%，更佳至少140%，甚至更佳至少160%，或最佳至少180%。
在一個具體實例中，FGF21類似物之效能為Met-FGF21之效能的至少200%，較佳至少250%，更佳至少300%，甚至更佳至少350%，或最佳至少400%。
效能係如以上關於FGF21衍生物所述來測定。
相對於媒劑對照組，本發明之FGF21類似物能夠降低db/db小鼠之血糖。
在一個具體實例中，以平均血糖量測值(mM)計且相對於相應媒劑對照組，血糖降低至少1%，較佳至少2%，更佳至少3%，甚至更佳至少4%，或最佳至少5%，參看實施例10之測試方法。
術語「穩定」或穩定性係指如上文所述而測定之效能。
在一個具體實例中，與H2 O2 一起培育之後，本發明類似物之效能為至少15%，較佳至少20%，更佳至少30%，甚至更佳至少40%，或最佳至少50%，其中效能相對於以相同方式處理但無H2 O2 之Met-FGF21。
該等類似物較佳對氧化穩定：在一個具體實例中，與FGF21(SEQ ID NO:1)相比，該等類似物包含以下修改：(i)N端存在Met-Gly-，(ii)M168L，(iii)具體實例(i)及(ii)，(iv)N端存在Met-Cys-，(v)N端存在Gly-，(vi)具體實例(v)及(ii)，(vii)N端存在Met-Ser-，或(iix)N端存在Ser-；FGF21類似物較佳係選自以下：(1)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)Gly-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21，或(r)Ser-FGF21；其中FGF21係指必要時在位置146處具有P(脯胺酸)之SEQ ID NO:1多肽。
FGF21化合物(包括FGF21類似物)及FGF21化合物之衍生物可類似地如關於類似化合物所述來製備。更特定言之，參考下文特定實施例。
下文實施例1及2描述在大腸桿菌中選殖及表現FGF21及FGF21類似物。或者，視情況具有N端延伸之FGF21及FGF21類似物可如下表現於酵母中：具有N端胺基酸延伸之FGF21可表現於釀酒酵母(S. cerevisiae)中。在一個具體實例中，此需要菌株設計，其中產生PMT2、PEP4及YPS1受到破壞之菌株。此菌株可使用依賴於同源重組且允許在各別基因座處進行特異性整合之經典技術來設計。在可維持在釀酒酵母中之釀酒酵母表現載體上編碼具有N端延伸之FGF21。為引導FGF21類似物至分泌路徑，可在重組表現載體中提供前原序列(包括信號肽)(例如MFα前原前導序列)。此序列與編碼FGF21類似物之DNA在正確讀框中連接。此信號肽確保分泌至培養基中。在FGF21類似物序列上游鄰接置放二元胺基酸序列，以確保初前序列在分泌至培養基中之前自FGF21類似物裂解。很可能由KEX2活性引起裂解。可自培養基收集FGF21類似物。
必要時，FGF化合物衍生物及FGF21類似物可與其他醫藥品(諸如胰島素)一起調配。
以下章節中之所有具體實例(亦即具體實例1-180)均在可能的程度上根據下文申請專利範圍第1項。
其他特定具體實例
1.　一種具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-不存在，表示一鍵或選自-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-不存在，表示一鍵或為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-不存在，表示一鍵或為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)或#-NH-(CH2 )t -*(式XIII)，其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-不存在，表示一鍵或式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
2.一種具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-不存在，表示一鍵或選自-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX及/或式XXVII的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點，或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中u為2、3或4，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-不存在，表示一鍵或為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-不存在，表示一鍵或為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)，或#-NH-(CH2 )t -*(式XIII)其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-不存在，表示一鍵或式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
3.　如具體實例1或2之衍生物，其中若A為式(III)的單元，則-B-、-C-、-D-及-E-中之至少一者存在及/或不表示一鍵。
4.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-及-C-存在且不表示一鍵。
5.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX、IX或XXVIII的單元，或至多4個式IIX及/或式IX及/或式XXVIII的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中u為2、3或4，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-為可選的，且當存在時，為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -* (式XII)或#-NH-(CH2 )t -* (式XIII)其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-為可選的，且當存在時，為一鍵或式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
6.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-為可選的，且當存在時，為式XII或XIII的單元：
其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-為可選的，且當存在時，為一鍵或式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
7.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之硫醇基上的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；-C-為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)或#-NH-(CH2 )t -*(式XIII)其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-為式XXII、XXIII、XXIIIa、XXIV、XXIVa、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
8.在可能的程度上如前述具體實例中任一者、尤其如前一具體實例之衍生物，其中-E-為式XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI或XXVII的單元：
其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點。
9.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I的單元：(式I)，其中n如本文所定義。
10.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中n為14、16或18，較佳為14或16。
11.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I的單元，較佳為n為13之式I的單元。
12.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B1-，較佳為式IV或V的單元：
13.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IIX的單元：
其中更佳c為0且b為2，或c為0且b為1。
14.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-為-B2-，更確切言之為式IX的單元，
較佳為d為1且e為2之式IX的單元。
15.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-為一鍵。
16.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式X的單元：
其中較佳q為0、1、2、3或4，更佳q為1或2，且甚至更佳q為2。
17.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式X的單元：
其中較佳p為1或2，更佳p為1。
18.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中p為1且q為1或2，較佳p為1且q為2。
19.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式XI的單元：
其中較佳m為0、1或2，更佳m為1或2。
20.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式XI的單元：
其中較佳k為1、2、3、4、5或11，更佳k為5。
21.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中m為1且k為4、5或11，較佳m為1且k為5。
22.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-D-為式XII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)，其中較佳r為2，及/或其中較佳s為1或2，最佳r為2且s為2。
23.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-D-為式XIII的單元：
其中較佳t為1、2或3，更佳t為2。
24.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-D-不存在。
25.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-E-為式XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI或XXVII的單元：
26.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-E-為式XXII、XXIII、XXIIIa、XXV或XXVI的單元：
或為一鍵。
27.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-E-為式XXIV的單元。
28.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有1或2個式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子。
29.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子，其中A-為式I或II的單元，-B-為一鍵或式IIX或IX的單元，-C-為式X的單元，-D-為式XII或XIII的單元，且-E-為式XXII或XXIV的單元，且較佳n為13、14或16，b為2，d為1，e為2，p為1，q為2，r為2，s為2，且t為2。
30.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有2個白蛋白結合子。
31.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12或13。
32.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為8、9、10、11、12或13。
33.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有1個白蛋白結合子。
34.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為14、15、16、17、18或19。
35.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為12、13、14、15、16、17或18。
36.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-B-C-D-E-係選自以下式(1)-(14)：
(14)：；或任一相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
37.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-B-C-D-E-係選自以下式(1)-(12)：
或任一相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
38.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中白蛋白結合子經由半胱胺酸殘基之硫醇基進行連接。
39.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中白蛋白結合子連接於FGF21化合物中一或多個選自位置-1、6、71及122的位置處之半胱胺酸殘基上，其中位置編號係參考SEQ ID NO:1。
40.一種化合物，其選自在可能的程度上如前述具體實例中任一者之實施例4、5及6之衍生物，較佳為以下：S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基-胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys122]-Met-FGF21(化合物F)；S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基-胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys71]Met-FGF21(化合物H)；及S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[Cys71]Met-FGF21(化合物O)；或該等化合物中任一者之醫藥學上可接受之鹽。
41.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有式A-B-C-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之胺基上的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；且-C-為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
42.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有式A-B-C-之白蛋白結合子共價連接於FGF21化合物之胺基上的FGF21化合物衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B1-、-B2-或其組合，其中-B1-為式IV、V、VI或VII的單元：
其中*為與-B2-或-C-之連接點，且#為與A-或-B2-之連接點；且-B2-為式IIX或IX的單元，或至多4個式IIX及/或式IX的單元之組合：
其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-、-B1-或另一-B2-之連接點，且#為與A-、-B1-或另一-B2-之連接點，或
其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點，或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中u為2、3或4，*為與-C-或-B1-之連接點，且#為與A-或-B1-之連接點；且-C-為式X或XI的單元：
其中p為0、1、2、3、4、5或6，q為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或
其中k為0、1、2、3、4、5、11或23，m為0、1、2、3、4、5或6，*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
43.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者、較佳如具體實例1至3及29中任一者之衍生物，其中A-為式I的單元：
44.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中n為14、16或18。
45.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B1-，較佳為式IV或V的單元：
46.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IIX的單元：
其中更佳c為0且b為2，或c為0且b為1。
47.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B2-，較佳為1或2個式IX的單元：
其中更佳d為1且e為2，或d為2且e為1。
48.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-B-包含-B2-，較佳為1或2個式XXVIII的單元：#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中更佳u為3。
49.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式X的單元：
其中較佳q為0、1、2、3或4，更佳q為1或2。
50.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式X的單元：
其中較佳p為1或2，更佳p為1。
51.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中p為1且q為1或2，較佳p為1且q為2。
52.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式XI的單元：
其中較佳m為0、1或2，更佳m為1或2。
53.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中-C-為式XI的單元：
其中較佳k為1、2、3、4、5或11，更佳k為5。
54.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中m為1且k為4、5或11，較佳m為1且k為5。
55.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有1或2個式A-B-C-之白蛋白結合子。
56.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有2個白蛋白結合子。
57.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為10、11、12或13。
58.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為8、9、10、11、12或13。
59.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其具有1個白蛋白結合子。
60.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為14、15、16、17、18或19。
61.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中A-為式I、II或III的單元：
其中n為12、13、14、15、16、17、18或19。
62.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-B-C-係選自以下式(13)-(19)：
(19):；或任何相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
63.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之具有共價連接之式A-B-C-之白蛋白結合子的FGF21化合物衍生物，其中A-B-C-係選自以下式(13)-(15)：
或任何相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
64.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中白蛋白結合子經由N端胺基酸殘基之胺基進行連接。
65.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中白蛋白結合子經由離胺酸殘基之ε胺基進行連接。
66.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中一個白蛋白結合子連接於N端胺基酸殘基上且另一白蛋白結合子連接於內部離胺酸殘基上。
67.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中白蛋白結合子連接於FGF21化合物中一或多個選自位置56、59、69、122及152的位置處之離胺酸殘基上，其中位置編號係參考SEQ ID NO:1。
68.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，較佳為實施例7之衍生物，較佳為以下：N-α1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Arg56,Arg59,Arg69,Arg122]Met-FGF21(化合物V)；或其醫藥學上可接受之鹽。
69.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物與SEQ ID NO:1之一致性為至少80%，較佳至少85%，更佳至少90%，甚至更佳至少95%。
70.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物與SEQ ID NO:1相比具有最多36個胺基酸修飾，較佳最多30、25、20、15、10或5個胺基酸改變，或最多30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸改變，更佳最多15、14、13、12、11或10個胺基酸修飾，甚至更佳最多9、8、7、6或5個胺基酸修飾，或最佳最多4、3、2或1個胺基酸修飾。
71.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物之N端延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基。
72.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為甘胺酸或絲胺酸。
73.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
74.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1M、-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、L118C、K122C、K122R、A134C、1152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為以下至少一者：-1M、-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、L118C、K122C、K122R、A134C、1152K及/或M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。
75.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(i)K122C、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)及/或(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為K122C、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E及/或M168L)，(ii) -1G及(-1G,M168L)，或(iii) S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)及(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R),其中(i)及(iii)之FGF21化合物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比,包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSG SGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-,其中在各(iv)之FGF21化合物中，N端M可視情況缺失。
76.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中與SEQ ID NO:1相比，FGF21化合物包含以下取代：(a)K122C；(b)(K59R,K69R,K122R)；(c)(K56R,K69R,K122R)；(d)(K56R,K59R,K69R)；(e)S71C；(f)S6C；(g)(K56R,K59R,K69R,K122R)；(h)(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)；(i)(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)；(j)(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)；或(k)M168L。
77.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中與SEQ ID NO:1相比，FGF21化合物包含以下修改：Y179F、A180E及S181K或S181R(i)；較佳另外包含V169aT、P171L、S172E、Q173A及G174V(ii)；更佳另外包含L166F、S167G及M168L(iii)；最佳包含(i)、(ii)及(iii)，其中各具體實例獨立地且視情況包括N端M(例如-1M)。
78.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中與FGF21(SEQ ID NO:1)相比，FGF21化合物包含以下修改：(i)N端存在Met-Gly-，(ii)M168L，(iii)具體實例(i)及(ii)，(iv)N端存在Met-Cys-，(v)N端存在Gly-，(vi)具體實例(v)及(ii)，(vii)N端存在Met-Ser-，或(iix)N端存在Ser-；較佳地，FGF21化合物係選自以下：(l)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)G1y-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21，或(r)Ser-FGF21；其中FGF21係指SEQ ID NO:1多肽。
79.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中與SEQ ID NO:1相比，FGF21化合物包含以下N端延伸：(q)MS-FGF21，(s)MSGSGSGSGSG-，(t)MGGGGG-，(u)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-，(v)MSGGGGG-，(x)MSGSGGS-，(y)MSGGSSG-及(z)MSGSGSG-；以及無N端Met之具體實例(q)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)、(y)及(z)中任一者。
80.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物係選自SEQ ID NO:1多肽之以下變異體：(a) K122C，(e) S71C，(f) S6C，(n) Met-Cys-FGF21，具有N端Met之化合物(a)、(e)及(f)中任一者，及無N端Met之化合物(n)。
81.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物係選自SEQ ID NO:1多肽之以下變異體：(b)(K59R,K69R,K122R)；(c)(K56R,K69R,K122R)；(d)(K56R,K59R,K69R)；(g)(K56R,K59R,K69R,K122R)；(h)(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)；(i)(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)；(j)(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)；(k)(179F,180E,181R)；(1)(169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)；及(m)(166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)；以及具有N端Met之化合物(b)、(c)、(d)、(g)、(h)、(i)及(j)中任一者(較佳為(b)-(j)+/-N端Met)。
82.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其在位置146處具有脯胺酸，其中位置編號係指SEQ ID NO:1
83.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，當對小鼠進行皮下給藥時，其為至少1.5小時，較佳至少2小時，更佳至少4小時，甚至更佳至少5小時，或最佳至少6小時。
84.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，當對小鼠進行皮下給藥時，其為至少10小時，較佳至少15小時，更佳至少24小時，或最佳至少48小時。
85.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中(i)小鼠為db/db小鼠，較佳為缺乏瘦素受體之小鼠，及/或(ii)衍生物之劑量為0.5mg/kg。
86.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其效能為Met-FGF21之效能的至少1%，較佳至少5%，更佳至少10%，甚至更佳至少20%，或最佳至少30%，其中效能係藉由量測3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取來測定。
87.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其效能為Met-FGF21之效能的至少40%，較佳至少50%，更佳至少60%，甚至更佳至少70%。
88.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其效能為Met-FGF21之效能的至少80%，較佳至少90%，更佳至少100%，甚至更佳至少110%或最佳至少120%。
89.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中效能以衍生物之EC50 相對於Met-FGF21之EC50 來計算。
90.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中3T3-L1脂肪細胞源自小鼠3T3-L1纖維母細胞，較佳源自ATCC CL-173。
91.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取係如實施例8中所概述進行量測。
92.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其效能為Met-FGF21之效能的至少1%，其中效能係如具體實例64至69中任一者所述來測定。
93.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中效能相對於Met-FGF21為至少1%，較佳至少5%，更佳至少10%，甚至更佳至少20%，或最佳至少30%。
94.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中效能相對於Met-FGF21為至少40%，較佳至少50%，更佳至少60%，或最佳至少70%。
95.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中效能相對於Met-FGF21為至少80%，較佳至少90%，更佳至少100%，甚至更佳至少110%，或最佳至少120%。
96.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，相對於媒劑對照組，其能夠活體內降低db/db小鼠之血糖。
97.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中血糖在投予最後一劑衍生物之後24小時、較佳48小時降低。
98.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中以平均血糖量測值(mM)計且相對於相應媒劑對照組，血糖降低至少10%，較佳至少15%，更佳至少20%，甚至更佳至少25%，或最佳至少30%。
99.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中血糖降低至少35%，較佳至少40%，更佳至少45%，或最佳至少50%。
100.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中(i)db/db小鼠為雄性且為9-11週齡，(ii)衍生物經皮下投予，(iii)衍生物劑量在0.2-1.0mg/kg範圍內，較佳為0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mg/kg，(iv)衍生物溶解於PBS中，(v)衍生物每天一次給藥，較佳在第1天、第2天及第3天給藥，(vi)媒劑對照組用PBS處理，較佳為每50公克小鼠250μl，及/或(vii)血糖係使用葡萄糖氧化酶方法、較佳使用葡萄糖分析儀(諸如Biosen 5040)來量測。
101.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中煤劑對照組用Met-FGF21替換。
102.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，在藉由在25℃下在300mM H2 O2 存在下培育1小時而氧化之後，其比Met-FGF21穩定。
103.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，其中穩定性係指如具體實例70至75中任一者所測定之效能。
104.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物或在可能的程度上如下述具體實例中任一者之FGF類似物，與H2 O2 一起培育之後，其效能為至少15%，較佳至少20%，更佳至少30%，甚至更佳至少40%，或最佳至少50%，其中效能係相對於以相同方式處理但無H2 O2 之Met-FGF21。
105.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中(i)衍生物及Met-FGF21均溶解於PBS(pH 7.2)中，及/或(ii)衍生物及Met-FGF21之濃度為1mg/mL。
106.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為上述實施例4至7及12至55中所提及之任一特定衍生物。
107.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181K]Ala-FGF21。
108.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)[28R,56R,59R,69K,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T]Ala-FGF21。
109.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T]Ala-FGF21。
110.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181]Ala-FGF21。
111.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁醯基][K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181]Ala-FGF21。
112.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁醯基][Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T]Ala-FGF21。
113.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(Q28R,K56R,K59R,K69R,S71C,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21。
114.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Gly-FGF21。
115.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ala-FGF21。
116.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ser-FGF21。
117.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)FGF21。
118.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Gly-FGF21。
119.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21。
120.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ser-FGF21。
121.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)FGF21。
122.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21。
123.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物,其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,1152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)A1a-FGF21。
124.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物,其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,Q161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21。
125.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物,其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21。
126.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181) Ser-FGF21。
127.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181) Ser-FGF21。
128.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181) Ser-FGF21。
129.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21。
130.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21。
131.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,1152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21。
132.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21。
133.　在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物,其為N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21。
134.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為FGF類似物，其為上述實施例2(較佳為實施例2a-2af)、56(較佳為實施例56a-56as)及57(較佳為實施例57a-57v)中所提及之任一特定類似物。
135.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為存在於本文實施例4至7及12至55中之任一者中的FGF化合物。
136.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為(Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21。
137.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為(S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181)Ala-FGF21。
138.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為(K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181)Ala-FGF21。
139.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF化合物為(Q28R,K56R,K59R,K69R,S71C,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21。
140.在可能的程度上如前述具體實例中任一者之衍生物，其中FGF21化合物為任一以下具體實例中所提及之任一FGF21類似物。
141.一種FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1G、-1C、-1S、-1A、S6C、S6K、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102T、N121Q、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、G170T、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K及/或M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。
142.一種FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為-1G、-1C、-1S、S6C、S6K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102T、K122R、I152K及/或M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S。
143.一種FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾:-1A、-1C、-1S、-1G、S6K、S6C、Q15F、V16K、D24K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、des121D、D121D、D121Q、K122R、P143V、A145E、145aP、145bM、L146V、L146E、148aD、P149L、P149E、P150R、G151E、I152E、I152K、I152H、153aE、153bS、153cD、153dM、I154F、I154R、P155S、P155G、Q156H、Q156S、P157L、P158L、P158E、D159E、D159S、V160D、V160T、G161M、G161D、S162F、S163M、D164S、L166F、S167E、S167G、M168T、M168A、M168I、M168L、M168S、V169D、169aT、G170T、G170S、P171M、P171L、S172D、S172E、Q173P、Q173A、G174F、G174A、G174V、R175G、S176L、P177V、S178T、Y179G、Y179F、A180E、S181K、S181R、182G，及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S，或至少一個以下修飾：-15E、-14E、-13E、-12A、-10A、-11A、-11E、-10S、-9G、-8G、-8A、-7A、-6A、-6G、-5G、-4S、-3A、-3G、-2A、-2G、-2S。
144.　一種FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1A、-1C、-1S、-1G、S6K、S6C、Q15F、V16K、D24K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、des121D、D121D、D121Q、K122R、P143V、A145E、L146E、148aD、P149L、P150R、I152K、I152H、153aE、153bS、153cD、153dM、I154F、P155S、Q156S、P158L、D159E、V160T、G161D、S163M、L166F、S167G、M168A、M168I、M168L、M168S、169aT、G170T、P171L、S172E、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181K、S181R、182G，及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S，或至少一個以下修飾：-15E、-14E、-13E、-12A、-10A、-11A、-11E、-10S、-9G、-8G、-8A、-7A、-6A、-6G、-5G、-4S、-3A、-3G、-2A、-2G、-2S。
145.　一種FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含至少一個以下修飾：-1A、-1C、-1S、-1G、S6K、S6C、Q15F、V16K、D24K、A26E、Q27E、Q28R、A31E、K56R、K59R、K69R、S71C、D102E、D102N、D102T、des121D、D121D、D121Q、K122R、I152K、D159E、L166F、S167G、M168A、M168I、M168L、M168S、169aT、G170T、P171L、S172E、Q173A、G174A、G174V、Y179F、A180E、S181K、S181R、182G，及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為G或S，或至少一個以下修飾：-15E、-14E、-13E、-12A、-10A、-11A、-11E、-10S、-9G、-8G、-8A、-7A、-6A、-6G、-5G、-4S、-3A、-3G、-2A、-2G、-2S。
146.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中該FGF21類似物含有不超過210個胺基酸殘基，較佳不超過209個胺基酸殘基，更佳不超過206個胺基酸殘基。
147.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中若N端延伸僅為單個胺基酸，則該胺基酸不為Met。
148.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(i)(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)、(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E或M168L),(ii)-1G及(-1G,M168L)，或(iii)S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)及(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R),其中(i)及(iii)之FGF21類似物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N端M可視情況缺失。
149.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E、M168L、(Y179F,A180E,S181R)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)或(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)(較佳為(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、S71C、(K56R,K59R,K69R,K122R)或(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)、D102T、A26E、(Q28R,A31E)、Q27E或M168L)，其中FGF21類似物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv) MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N端M可視情況缺失。
150.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：-1G及(-1G,M168L)；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N端M可視情況缺失。
151.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其(a)與SEQ ID NO:1相比，包含以下修飾：S6C、(L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)及(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)，其中FGF21類似物可能進一步視情況包括N端M；及/或(b)與SEQ ID NO:1相比，包含選自以下之N端延伸：(iv)MG-、MC-、MS-、MSGSGSGSGSG-、MGGGGG-、MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-、MSGGGGG-、MSGSGGS-、MSGGSSG-及MSGSGSG-，其中在各(iv)之FGF21類似物中，N 端M可視情況缺失。
152.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其與SEQ ID NO:1多肽相比，包含一或多個以下修飾：S6C、S6K、K56R、K59R、K69R、S71C、K122R、I152K、L166F、S167G、M168L、V169aT、P171L、S172E、Q173A、G174V、Y179F、A180E及/或S181K,R(較佳為S6C、S6K、K56R、K59R、K69R、S71C、K122R、I152K及/或M168L)。
153.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其與SEQ ID NO:1多肽相比，包含一或多個以下修飾：S6C、S71C、M168L、(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、(K56R,K69R,K122R)、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)及(K56R,K59R,K69R,K122R,L118C-A134C)、(L166F,S167G,M168L,V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)、(V169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)及/或(Y179F,A180E,S181R)；較佳為(S6C,S71C,M168L、(S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R)、(K56R,K69R,K122R)、(K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R)、(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)及/或(K56R,K59R,K69R,K122R,L118C-A134C)。
154.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其包含Y179F、A180E及S181K或S181R(i)；較佳另外包含V169aT、P171L、S172E、Q173A及G174V(ii)；更佳另外包含L166F、S167G及M168L(iii)；最佳包含(i)、(ii)及(iii)。
155.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例89至90(包括90a)中任一者之FGF21類似物，其進一步在SEQ ID NO:1之位置-1處包括Met。
156.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其選自以下：(l)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)Gly-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21或(r)Ser-FGF21；其中FGF21表示SEQ ID NO:1多肽。
157.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其與SEQ ID NO:1相比，具有N端延伸，該延伸具有至多25個胺基酸殘基，較佳至多20個胺基酸殘基，更佳至多15個胺基酸殘基，甚至更佳至多10個胺基酸殘基，或最佳至多6個胺基酸殘基，其中至少50%、較佳至少60%、更佳至少70%、甚至更佳至少80%或最佳至少90%之N端延伸的胺基酸殘基為甘胺酸或絲胺酸。
158.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，較佳具體實例93之類似物，其與SEQ ID NO:1相比，包含以下N端延伸：(q)MS-FGF21，(s)MSGSGSGSGSG-，(t)MGGGGG-，(u)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-，(v)MSGGGGG-，(x)MSGSGGS-，(y)MSGGSSG-及(z)MSGSGSG-；以及無N端Met之具體實例(q)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)、(y)及(z)中任一者。
159.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其選自以下：(r)MSGSGSGSGSG-FGF21，(s)MGGGGG-FGF21，(t)MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21，(u)MSGGGGG-FGF21，(v)MSGSGGS-FGF21，(x)MSGGSSG-FGF21及(y)MSGSGSG-FGF21，以及無N端Met之具體實例(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(x)及(y)中任一者；其中FGF21係指SEQ ID NO:1。
160.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其在位置146處具有P(脯胺酸)，其中位置編號係指SEQ ID NO:1。
161.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其效能為Met-FGF21之效能的至少1%，較佳至少5%，更佳至少10%，或最佳至少20%，其中效能係藉由量測3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取來測定。
162.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中效能為Met-FGF21之效能的至少30%，較佳至少40%，更佳至少50%，甚至更佳至少60%，或最佳至少70%。
163.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中效能為(i)Met-FGF21之效能的至少80%，較佳至少90%，更佳至少100%，甚至更佳至少110%，或最佳至少120%；(ii)Met-FGF21之效能的至少100%，較佳至少120%，更佳至少140%，甚至更佳至少160%，或最佳至少180%；或(iii)Met-FGF21之效能的至少200%，較佳至少250%，更佳至少300%，甚至更佳至少350%，或最佳至少400%。
164.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中效能係如具體實例70至75中任一者所述來測定。
165.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，相對於媒劑對照組，其能夠降低db/db小鼠之血糖。
166.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中以平均血糖量測值(mM)計且相對於相應媒劑對照組，血糖降低至少1%，較佳至少2%，更佳至少3%，甚至更佳至少4%，或最佳至少5%。
167.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中(i)db/db小鼠為雄性且為9-11週齡，(ii)類似物經皮下投予，(iii)類似物劑量在0.1-1.0mg/kg範圍內，較佳為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0mg/kg，(iv)類似物每天一次給藥，較佳在第1天、第2天及第3天給藥，及/或(v)血糖係使用葡萄糖氧化酶法、較佳使用葡萄糖分析儀(諸如Biosen 5040)來量測。
168.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，在藉由在25℃下在300mM H2 O2 存在下培育1小時而氧化之後，其比Met-FGF21穩定。
169.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其中穩定性係指如具體實例70至75中任一者所測定之效能。
170.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，與H2 O2 一起培育之後，其效能為至少15%，較佳至少20%，更佳至少30%，甚至更佳至少40%，或最佳至少50%，其中效能係相對於以相同方式處理但無H2 O2 之Met-FGF21。
171.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其與FGF21(SEQ ID NO:1)相比，包含以下修改:(i)N端存在Met-Gly-，(ii)M168L，(iii)具體實例(i)及(ii)，(iv)N端存在Met-Cys-，(v)N端存在Gly-，(vi)具體實例(v)及(ii)，(vii)N端存在Met-Ser-，或(iix)N端存在Ser-；較佳地，FGF21類似物係選自以下:(l)Met-Gly-FGF21，(m)Met-Gly-FGF21-M168L，(n)Met-Cys-FGF21，(o)Gly-FGF21-M168L，(p)Gly-FGF21，(q)Met-Ser-FGF21，或(r)Ser-FGF21；其中FGF21係指SEQ ID NO:1多肽。
172.在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者之FGF21類似物，其在位置146處具有P(脯胺酸)，其中位置編號係指SEQ ID NO:1。
173.　在可能的程度上如前述針對FGF類似物之具體實例中任一者之FGF類似物，其為上述實施例2(亦即2a-2af)、56(亦即56a-56as)及57中所提及之任一特定類似物。
174.　一種組成物，其包含如任一針對類似物的上述具體實例之類似物或如任一針對衍生物的上述具體實例之衍生物，及醫藥學上可接受之載劑。
175.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例141至173中任一者之類似物、在可能的程度上如前述與衍生物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例1至140中任一者之衍生物或如具體實例174之組成物，其用作醫藥品。
176.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例141至173中任一者之類似物、如具體實例1至140中任一者之衍生物或如具體實例174之組成物，其用作供治療或預防糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的醫藥品。
177.　在可能的程度上如前述與類似物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例141至173中任一者之類似物、在可能的程度上如前述與衍生物相關之具體實例中任一者、較佳如具體實例1至140中任一者之衍生物或如具體實例174之組成物，其用於製備供治療或預防糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的醫藥品。
178.　一種治療展現糖尿病、血脂異常、肥胖症、心血管疾病、代謝症候群及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的患者之方法，該方法包含向患者投予治療有效量之如具體實例141至173中任一者之類似物、如具體實例1至140中任一者之衍生物或如具體實例174之醫藥組成物。
179.　一種治療需要加強護理之患者之方法，該方法包含向患者投予治療有效量之如具體實例141至173中任一者之類似物、如具體實例1至140中任一者之衍生物或如具體實例174之醫藥組成物。
180.　一種本文所述之具體實例、特徵及技術方案之任何新穎組合。
本文引用各種參考文獻，其揭示內容均以全文引用之方式併入本文中。
實施例
以下實施例用於說明本發明。
縮寫
下文使用以下縮寫(按字母順序)：DCM為二氯甲烷，DIC為二異丙基碳化二亞胺，DIPEA為二異丙基乙胺，DPBS為杜氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，DVB為二乙烯基苯，EDAC為(3-二甲基胺基丙基)乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，Fmoc為9H-茀-9-基甲氧羰基，HEPES為4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，HOAt為1-羥基-7-氮雜苯并三唑，HOBt為1-羥基苯并三唑，HP β CD為羥基丙基β環糊精，HPLC為高效液相層析，IBMX為3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，Inp為異哌啶甲酸，IPTG為異丙基β-D-1-硫代半乳糖哌喃糖苷抑制劑，LCMS為液相層析質譜，MALDI-TOF MS為基質輔助雷射脫附離子化飛行時間質譜，MeOH為甲醇，NanoES-MS為奈米電噴霧串聯質譜，NMP為1-甲基-吡咯啶-2-酮，OEG為8-胺基-3,6-二氧雜辛酸，OtBu為第三丁酯，PBS為磷酸鹽緩衝鹽水，RT為室溫，TFA為三氟乙酸，THF為四氫呋喃，TIPS為三異丙基矽烷，Tris為參(羥基甲基)胺基甲烷或2-胺基-2-羥基甲基丙烷-1,3-二醇，Trx為胺甲環酸(tranexamic acid)，TSTU為四氟硼酸O-(N-丁二醯亞胺基)-N,N,N',N'-四甲基，且UPLC為超高效液相層析。
一般方法 LCMS方法1(LCMS1)
使用Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質譜儀來鑑別自Agilent 1200系列HPLC系統洗提之後樣品之質量。用Agilent之蛋白質確認軟體計算蛋白質光譜之解迴旋。
洗提劑：
A：0.1%三氟乙酸之水溶液
B：0.1%三氟乙酸之乙腈溶液
管柱：Zorbax 5u，300SB-C3，4.8×50mm
梯度：25%-95%乙腈，15分鐘
LCMS方法2(LCMS2)
使用Perkin Elmer Sciex API 3000質譜儀來鑑別自Perkin Elmer系列200 HPLC系統中洗提之後樣品之質量。
洗提劑：
A：0.05%三氟乙酸之水溶液
B：0.05%三氟乙酸之乙腈溶液
管柱：Waters Xterra MS C-18×3mm id 5μm
梯度：5%-90%乙腈，7.5min，1.5ml/min
LCMS方法3(LCMS3)
使用Waters Micromass ZQ質譜儀來鑑別自Waters Alliance HT HPLC系統洗提之後樣品之質量。
洗提劑：
A：0.1%三氟乙酸之水溶液
B：0.1%三氟乙酸之乙腈溶液
管柱：Phenomenex，Jupiter C4 50×4.60mm id 5μm
梯度：10%-90% B，7.5min，1.0ml/min
實施例1：選殖及表現FGF21
人類FGF21之DNA及胺基酸序列已由例如Nishimura等人,Biochim. Biophys. Acta 1492(1):203-206(2000)揭示。該等序列亦可分別以寄存編號EMBL:AB021975及UNIPROT:Q9NSA1自公開資料庫獲得。
用含28個胺基酸之分泌信號肽合成天然多肽：
以上以斜體顯示之信號肽包括在隨附序列表中作為SEQ ID NO:2。由其餘181個胺基酸組成之成熟FGF21多肽包括在序列表中作為SEQ ID NO:1。
選殖成熟FGF21多肽，且使其於大腸桿菌中作為細胞內蛋白質表現，雖表現為無信號肽，但N端添加有甲硫胺酸。更詳言之，在噬菌體T7啟動子控制下，將3'端包括Met之ATG密碼子以及分別在3'端及5'端包括Nde1及BamH1限制位點的含550個鹼基對之編碼區插入表現載體pET 11c之Nde1-BamH1中，且轉型至大腸桿菌BBL21(DE3)中。使細胞在LB amp(100μg/mL)中生長至OD450 為0.5，且在37℃下用0.3mM IPTG誘導表現歷時4小時。藉由音波處理製備細胞之粗提取物以分析FGF21表現。
考馬斯亮藍染色之SDS-PAGE顯示FGF21成功表現，此主要在可溶性上清液洗提份中得到鑑別，而極少在不溶性集結粒中得到鑑別。雖然所表現之FGF21(Met-FGF21)(化合物A)之計算分子量為19.5kD，但其在凝膠上遷移呈25kD蛋白質，此可能歸因於脯胺酸含量較高，使得蛋白質之移動延遲。
實施例2：選殖及表現FGF21類似物
如此項技術中已知來設計Met-FGF21之以下12種類似物，且如實施例1中一般所描述使其表現於大腸桿菌中，或使用類似方法使其表現於釀酒酵母中：2a) K122C Met-FGF21(化合物B)，2b)(K59R,K69R,K122R)Met-FGF21(化合物C)，2c)(K56R,K69R,K122R)Met-FGF21(化合物D)，2d)(K56R,K59R,K69R)Met-FGF21(化合物G)，2e) S71C Met-FGF21(化合物E)，2f)(K56R,K59R,K69R,K122R)Met-FGF21(化合物S)，2g)(K56R,K59R,K69R,K122R,I152K)Met-FGF21(化合物R)，2h) D102T Met-FGF21(化合物M)，2i) A26E Met-FGF21(化合物N)，2j)(Q28R,A31E)Met-FGF21(化合物P)，2k) Q27E Met-FGF21(化合物Q)，及21) M168L Met-FGF21(化合物K)。
所製備之另外3種Met-FGF21類似物包括以下：2m)(179F,180E,181R)Met-FGF21(化合物X)，2n)(169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)Met-FGF21(化合物Y)，及2o)(166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) Met-FGF21(化合物Z)。
亦如上文所述來製備以下2種FGF21類似物：2p) Gly-FGF21-M168L(化合物J)，及2q) Gly-FGF21(化合物I)。
如上文所述而製備之另外14種FGF21類似物包括以下：2r) S6C-Met-FGF21，2s) (L118C-A134C,K56R,K59R,K69R,K122R)-Met-FGF21，2t) (S6K,K56R,K59R,K69R,K122R)-Met-FGF21，2u) Met-Gly-FGF21，2v) Met-Gly-FGF21-M168L，2x) Met-Cys-FGF21，2y) Met-Ser-FGF21，2z) (r) MSGSGSGSGSG-FGF21，2aa) (s) MGGGGG-FGF21，2ab) (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21，2ac) (u) MSGGGGG-FGF21，2ad) (v) MSGSGGS-FGF21，2ae) (x) MSGGSSG-FGF21，及2af) (y) MSGSGSG-FGF21。
實施例3：純化FGF21及類似物
進一步，如下或使用類似技術純化如實施例1至2中所述而製備之FGF21多肽及其類似物：音波處理大腸桿菌於10mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)中之漿液(20% w/v)(在冰上經歷3秒開/關間隔，歷時5分鐘)。藉由離心(10,000×g，30分鐘)對多肽造粒，藉由音波處理使其再溶解於50mM Tris(pH 8.0)中，且藉由離心(10,000×g，30分鐘)移除碎片。如Protein Purification . Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes,Robert K.第3版,1994中一般所描述，利用陰離子交換層析(50mM Tris(pH 8.0)、50-250mM NaCl)使用Q Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)來純化所得上清液中之多肽。在一些情況下，利用尺寸排阻層析，使用HiLoad 26/60 Superdex pg 75管柱(GE Healthcare)以50mM Tris(pH 8.0)及200mM NaCl操作來進行進一步純化。為進行儲存，將多肽轉移至50mM碳酸氫銨(pH 7.9)中，凍乾且保持在-80℃下。
實施例4：用白蛋白結合子在FGF21化合物之Cys處進行衍生
可如下文所述來合成含順丁烯二醯亞胺之白蛋白結合子，且亦可如下文所述用該等白蛋白結合子來衍生含自由半胱胺酸之FGF21及其類似物。
製備17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十七烷酸 步驟1：Fmoc-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂：
使5.8g(7.5mmol)2-氯三苯甲基氯樹脂(100-200目，1% DVB，裝載量為1.3mmol/g)在DCM(80mL)中溶脹約1小時，隨後排出。將Fmoc-乙二胺鹽酸鹽懸浮於NMP(30mL)及DCM(30mL)及DIPEA(5當量，6.42mL)中。將該懸浮液添加至樹脂中且震盪3小時。排出樹脂，且用17:2:1 DCM:MeOH:DIPEA、DCM、NMP及DCM(3×80mL)洗滌。在乾燥器中經KOH/NaOH乾燥。
步驟2:Fmoc-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂：
使用CEM Liberty微波肽合成儀及基於Fmoc之固相肽方法學改質3mmol Fmoc-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂。使樹脂在NMP(60mL)中溶脹，且排出。
使用5%哌啶之NMP(60mL)溶液脫除樹脂之Fmoc保護基，加熱30秒，排出，用NMP(60ml)洗滌，接著再用5%哌啶之NMP(60mL)溶液洗滌，在70-75℃下加熱3分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。向樹脂中添加0.3M Fmoc-8-胺基-3,6-二氧雜辛酸溶液+0.3M HOAt之NMP(45mL)溶液，接著添加0.75M DIC之NMP(18mL)溶液。加熱反應物至70-75℃歷時10分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。
步驟3：Fmoc-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂：
使用5%哌啶之NMP(60mL)溶液脫除樹脂之Fmoc保護基，加熱30秒，排出，用NMP(60ml)洗滌，接著再用5%哌啶之NMP(60mL)溶液洗滌，在70-75℃下加熱3分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。向樹脂中添加0.3M Fmoc-8-胺基-3,6-二氧雜辛酸溶液+0.3M HOAt之NMP(45mL)溶液，接著添加0.75M DIC之NMP(18mL)溶液。加熱反應物至70-75℃歷時10分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。
步驟4：Fmoc-γ-Glu-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂：
使用5%哌啶之NMP(60mL)溶液脫除樹脂之Fmoc保護基，加熱30秒，排出，用NMP(60ml)洗滌，接著再用5%哌啶之NMP(60mL)溶液洗滌，在70-75℃下加熱3分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。向樹脂中添加0.3M Fmoc-Glu-OtBu溶液+0.3M HOAt之NMP(45mL)溶液，接著添加0.75M DIC之NMP(18mL)溶液。加熱反應物至70-75℃歷時10分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。
步驟5：C18-二酸-γ-Glu-OEG-OEG-乙二胺2-氯三苯甲基樹脂：
使用5%哌啶之NMP(60mL)溶液脫除樹脂之Fmoc保護基，加熱30秒，排出，用NMP(60ml)洗滌，接著再用5%哌啶之NMP(60mL)溶液洗滌，在70-75℃下加熱3分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。向樹脂中添加0.3M十八烷二酸單第三丁酯溶液+0.3M HOAt之NMP(45mL)溶液，接著添加0.75M DIC之NMP(18mL)溶液。加熱反應物至70-75℃歷時10分鐘，接著用NMP(4×60mL)洗滌。
步驟6：17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]-十七烷酸：
用95:2.5:2.5 TFA/TIPS/水處理樹脂1小時。濾出樹脂，且在真空下濃縮濾液。添加乙腈，且再濃縮樣品。利用HPLC(10-50%乙腈，0.1% TFA，60mL/min，C18，50mm×200mm，15)純化粗產物。
LCMS2 m/z: 777(M+1)。
步驟7：17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基-胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十七烷酸：
將N-順丁烯二醯基-β-丙胺酸(0.65mmol，110mg)溶解於NMP中。添加EDAC(0.65mmol，125mg)及HOBt(0.65mmol，88mg)，且在室溫下攪拌混合物1小時。添加17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]-十七烷酸(0.65mmol，504mg)於NMP(5ml)中之溶液，且在室溫下攪拌混合物16小時。利用HPLC(25-65%乙腈，0.1% TFA，60mL/min，C18，50mm×200mm，15)純化粗產物，得到200mg標題化合物。
LCMS2 m/z:927.8(M+1)。
製備K122C Met-FGF21衍生物S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys122] Met-FGF21(化合物F)
用如上所述而製備之以下試劑修飾如實施例2及3中所述而製備之K122C Met-FGF21類似物(具有K122C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置122處的Cys殘基之硫醇基：
將[Cys122]-Met-FGF21(凍乾)溶解於20mM Tris緩衝液(pH 7.5)中，且使用PD-10管柱(GE Healthcare 170851-01)將緩衝液更換成20mM Tris緩衝液。向7ml(1.48μmol)該溶液(4.1mg/ml)中添加1.5ml含17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十七烷酸(2.96μmol)之乙腈/Tris緩衝液(1.3:1)溶液。在室溫下使反應物反應1小時。經0.22μm過濾器過濾反應混合物，且使用尺寸排阻層析(GE Healthcare，Superdex 200，26/60)用20mM Tris緩衝液(pH 7.5)洗提來進行純化，接著使用離子交換層析(Mono-Q 5/50，梯度為0-0.5M NaCl之20mM Tris(pH 7.5)溶液，60管柱體積)進行純化。利用LCMS及SDS-PAGE進行分析，之後彙集相關洗提份，且將緩衝液更換成50mM NH4 HCO3 ，並凍乾。
LCMS1：理論質量=20442.2，實驗值：20442.3。
實施例5：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備S71C Met-FGF21衍生物S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys71]Met-FGF21(化合物H) 製備19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸 步驟1：19-{(S)-1-第三丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基-胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸第三丁酯：
向2-(19-第三丁氧羰基十九醯基胺基)戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(2.50g)及[2-(2-{2-[2-(2-胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙醯基胺基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(1.47g)於乙醇(40ml)中之溶液中添加DIPEA(1.26ml)。在室溫下攪拌混合物隔夜，隨後在真空中濃縮。向殘餘物中添加0.1N鹽酸水溶液(150ml)及乙酸乙酯(200ml)。分離各層，且用乙酸乙酯(100ml)萃取水層。用水及鹽水洗滌合併之有機層，脫水(硫酸鎂)且在真空中濃縮，得到油狀物，其在靜置時結晶。產率為96%(3.1g)。LCMS3：理論質量：874.2；實驗值：874.49。
步驟2：19-((S)-1-第三丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸第三丁酯：
向19-{(S)-1-第三丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸第三丁酯(3.1g)於乙腈(50ml)中之溶液中添加TSTU(1.39g)及DIPEA(0.91ml)。在室溫下攪拌混合物隔夜，隨後在真空中濃縮。向殘餘物中添加0.1N鹽酸水溶液(100ml)及乙酸乙酯(200ml)。分離各層，且用乙酸乙酯(50ml)萃取水層。用水及鹽水洗滌合併之有機層，脫水(硫酸鎂)且在真空中濃縮，得到油狀物。產率為99%(3.4g)。
LCMS3：理論質量：971.2；實驗值：971.8。
步驟3：19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸：
將19-((S)-1-第三丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸第三丁酯(3.4g)在TFA(75ml)中攪拌45分鐘，隨後在真空中濃縮。與甲苯一起濃縮殘餘物3次，得到固體。在2-丙醇中使殘餘物結晶且過濾，得到白色結晶化合物。產率為80%(2.4g)。LCMS3：理論質量：859.03；實驗值：859.44。
步驟4：3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫吡咯-1-基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯：
將順丁烯二醯亞胺丙酸(500mg)溶解於無水THF(15ml)中。添加TSTU(790mg)及DIPEA(0.62ml)。在室溫下，在氮氣下攪拌混合物隔夜。濃縮黃色稠懸浮液。將殘餘物溶解於DCM中，且用0.1N HCl(2×)及鹽水(1×)萃取。使有機層脫水(Na2 SO4 )且濃縮，得到白色固體。
LCMS3：理論質量：266.21；實驗值：267.26(M+1)。
步驟5：19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸：
向N-丁氧羰基乙二胺(70mg)於乙腈(4ml)中之溶液中添加DIPEA(0.07ml)，且添加3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫吡咯-1-基)丙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(100mg)。攪拌1小時，之後在真空中濃縮混合物。將殘餘物溶解於DCM中，且用5%檸檬酸洗滌，經硫酸鎂脫水且濃縮。向殘餘物中添加TFA(8ml)。在室溫下攪拌1小時，之後在真空中濃縮混合物，且與甲苯共濃縮兩次。將殘餘物溶解於THF(5ml)中。添加19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸(75mg)及DIPEA(0.09ml)。在室溫下攪拌混合物隔夜。利用HPLC進行純化，使用A緩衝液：0.1% TFA之水溶液，及B緩衝液：0.1% TFA之乙腈溶液。梯度為10-80% B，45分鐘。流速：20ml/min，C18管柱30mm×250mm，110。產量為116mg(34%)。
LCMS3：理論質量：955.17；實驗值：955.7。
用如上所述而製備之以下試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之S71C Met-FGF21類似物(具有S71C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
將自NH4 HCO3 冷凍乾燥之[Cys71]Met-FGF21(1.68mg，85.9nmol)溶解於MiliQ水(1ml)中。將PD 10管柱(GE healthcare 179851-01)中之緩衝液更換成0.02M Tris(pH 7.8)。收集約3.5ml洗出液。向該洗出液中添加19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-吡咯-1-基)-丙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十九烷酸(0.86μmol)之0.02M Tris(pH 7.8)/乙腈1:1(0.205ml)溶液。使混合物在室溫下靜置1小時，隨後在5℃下靜置隔夜。利用陰離子交換在monoQ 5/50 GL管柱上進行純化，使用A緩衝液：20mM Tris，pH 7.8；B緩衝液：20mM Tris、50mM NaCl，pH 7.8；流量：0.5ml；且梯度為0-100% B，20 CV。進一步利用尺寸排阻層析，在HiLoad 26/60 superdex 200 prep grade上以來自Bio Whittaker之DPBS緩衝液純化含產物之分離洗提份。產量為0.466g。
LCMS1：理論質量：20511.3；實驗值：20511.3。
實施例6：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備S71C Met-FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[Cys71]Met-FGF21(化合物O) 製備9-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸 步驟1：19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-第三丁氧羰基-丙基胺甲醯基]-十九烷酸第三丁酯：
向19-{(S)-1-第三丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸第三丁酯(500mg)於乙腈(15ml)中之溶液中添加TSTU(224mg)及DIPEA(0.13ml)。在室溫下攪拌2小時，之後將該混合物傾入乙二胺(0.50ml)於乙腈(5ml)中之溶液中。攪拌2小時，之後在真空中濃縮混合物。在1N NaOH(100ml)及乙酸乙酯(400ml)中攪拌殘餘物。分離各層。經硫酸鎂使有機層脫水且在真空中濃縮，得到白色固體。在乙醇中攪拌該固體，隨後過濾。濃縮濾液，得到糖漿。產量為250mg(48%)。
LCMS3：理論質量：916.26；實驗值：916.7。
步驟2：19-{(S)-1-第三丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基-胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸第三丁酯：
向碘乙酸(60mg)於DCM(8ml)中之溶液中添加TSTU(90mg)及DIPEA(0.05ml)。在室溫下攪拌60分鐘，之後添加19-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基-胺甲醯基)-1-第三丁氧羰基-丙基胺甲醯基]-十九烷酸第三丁酯(0.25g)於DCM(8ml)及DIPEA(0.05ml)中之溶液。攪拌120分鐘，之後用DCM(100ml)稀釋混合物，且添加1N HCl(50ml)。分離各層。經硫酸鎂使有機層脫水且在真空中濃縮。將殘餘物與乙醇共濃縮，得到固體化合物。產量為225mg(76%)。
LCMS3：理論質量：1084.2；實驗值：1084.8。
步驟3：19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸：
用TFA(10ml)處理19-{(S)-1-第三丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基-胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基-胺甲醯基}-十九烷酸第三丁酯(225mg)歷時90分鐘。在真空中濃縮混合物，且與甲苯共濃縮兩次。利用HPLC純化殘餘物，其中使用A緩衝液：0.1% TFA之水溶液，及B緩衝液：0.1% TFA之乙腈溶液。梯度為10-80% B，45分鐘。流速：20ml/min，C18管柱30mm×250mm，110。產量為45mg(22%)。
LCMS3：理論質量：971.98；實驗值：972.6。
用以下試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之S71C Met-FGF21類似物(具有S71C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基：
一般程序A
將自NH4 HCO3 冷凍乾燥之[Cys71]Met-FGF21(7.53mg，385nmol)溶解於3×350μl 0.02M Tris(pH 7.8)中，且經由PD 10管柱將緩衝液更換成0.02M Tris(pH 7.8)。收集約3.5ml。將如上所述而製備之19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸(1.5mg)溶解於0.02M Tris(pH 7.8)緩衝液/乙腈1:1(0.75ml)中。向[Cys71]Met-FGF21之溶液中添加碘乙醯胺溶液(0.561ml，3當量)。乙腈濃度為7%。使混合物在室溫下靜置70小時。在Amicon Ultra-4離心裝置MWCO 10000中在4000g下超濾混合物10分鐘。將使用約4ml A緩衝液之超濾再重複4次以移除試劑。利用陰離子交換在monoQ 5/50 GL管柱上純化樣品，其中使用A緩衝液：20mM TRIS，pH 7.8；B緩衝液：20mM TRIS、50mM NaCl，pH 7.8；流量：0.5ml，且梯度為0-100% B，60CV。彙集含產物之分離洗提份，且利用超離心在Amicon Ultra-4離心裝置MWCO 10000中在6000rpm下濃縮2×10分鐘。
使用PD 10(GE 179851-01)管柱將緩衝液更換成50mM NH4 HCO3 。收集約4.0ml洗出液。經Millex GV無菌0.22μm過濾器過濾該洗出液且冷凍乾燥。產量為2.18mg。
LCMS1：理論質量：20400.2；實驗值：20400.13。
實施例7：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化 製備(K56R,K59R,K69R,K122R)Met-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Arg56,Arg59,Arg69,Arg122]Met-FGF21(化合物V)
用以下試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之K56R,K59R,K69R,K122R Met-FGF21類似物(具有K56R、K59R、K69R及K122R及N端M之SEQ ID NO:1)之N端Met殘基的α胺基：
將[Arg56,Arg59,Arg69,Arg122]Met-FGF21(凍乾)溶解於DPBS緩衝液中，且使用PD-10管柱(GE Healthcare170851-01)將緩衝液更換成DPBS緩衝液，得到3.5ml(4.3mg/ml，0.77μmol)。用DPBS緩衝液(10.5ml)稀釋樣品，且添加如實施例4中一般所描述而製備之17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十七烷酸(6.2μmol)於乙腈(7.5ml)中之溶液。在室溫下1小時，之後冷卻混合物至0℃，且添加冷0.2 M NaOH(21ml)。在0℃下30分鐘，之後用鹽酸中和混合物。使用Amicon Centriprep ultracel YM10離心過濾器(10000 MWCO)濃縮混合物，隨後用5ml 20mM Tris緩衝液(pH 7.5)稀釋，且再濃縮兩次(最終體積為約5ml)。經0.22μm過濾器過濾溶液混合物，利用離子交換層析進行純化且如實施例4所述進行凍乾。
LCMS1：理論質量：20368.1；實驗值：20367.2。
實施例8：效能檢定-3T3-L1脂肪細胞之葡萄糖攝取
使用以下檢定來測定本發明之FGF21化合物之生物活性或效能。
將小鼠3T3-L1纖維母細胞(例如可獲自ATCC，目錄號CL-173)維持在基礎培養基(含10%胎牛血清(FBS)及青黴素/鏈黴素之DMEM(4500mg/l葡萄糖))中。不使細胞達到匯合，且應在達到約60%匯合(目測檢查)之前進行傳遞(轉移至新小瓶中)。
在葡萄糖攝取檢定中，將細胞以80,000個細胞/孔塗鋪於24孔板中，或以20,000個細胞/孔塗鋪於96孔板中，且當其達到匯合(高密度，以產生分化之脂肪細胞為目的)時，將培養基由基礎培養基換成含曲格列酮(Troglitazone)、IBMX、地塞米松(Dexamethasone)(可購自例如Sigma)及人類胰島素(可購自例如Novo Nordisk A/S)之基礎培養基。
在分化開始後7-14天、較佳7-10天，使用細胞。在基礎培養基中，用遞增濃度(0-300nM)之本發明之FGF21多肽或衍生物刺激細胞歷時20小時。在溫(約37℃)檢定緩衝液(含1mM MgCl2 及2mM CaCl2 之PBS、HEPES及0.1%人類血清白蛋白)中洗滌細胞，接著添加3H-脫氧-葡萄糖(下文稱為示蹤物)，且將細胞與示蹤物一起培育1小時。藉由在冰冷檢定緩衝液中洗滌兩次來終止該培育。用Triton X-100溶解細胞，且將溶解產物轉移至96孔板中，添加microscint-40(可購自例如Perkin Elmer)，且在TOP計數器(例如來自Perkin Elmer之Packard top counter)中計數示蹤物之量。計算所討論多肽之EC50 。下表1中所示之結果指示本發明之FGF21化合物的EC50 (效能)，相對於Met-FGF21之EC50 (效能)。
由表1之結果可知，與Met-FGF21之效能相比，本發明之FGF21化合物具有可接受的效能，一些甚至具有極佳效能。
實施例9：FGF21化合物之氧化穩定性
在加速實驗中，使用過氧化氫來確定若干本發明之FGF21化合物之氧化穩定性。
在25℃下，在300mM H2 O2 存在下培育以51μM(1mg/ml)濃度溶解於PBS(pH 7.2)中之所討論化合物(例如Met-FGF21)歷時1小時。以相同方式處理對照組(未氧化之Met-FGF21)，但無H2 O2 。藉由在以PBS達到平衡之凝膠過濾管柱(Zeba或Superose 12)上脫鹽來終止反應。
在37℃下，利用肽圖譜(peptide mapping)使用消化酶胰蛋白酶(參見例如Patten,SMV等人,Journal of biological chemistry,274,10268-10276,1999)，以1:100(w/w)酶：受質(亦即胰蛋白酶：FGF21)比率來確定兩個Met殘基(野生型Met-FGF21(具有N端met之SEQ ID NO:1)之N端met，下文稱為「Met1」；及SEQ ID NO:1中之Met168，下文稱為「Met168」)之氧化狀態及動力學，歷時2-18小時。用1% TFA來中止所得消化物，且利用逆相UPLC(Waters)在C18管柱上定位。根據214nm下之吸光度監測肽洗提。收集肽，在speed-vac中乾燥，且在50%乙腈、0.1%甲酸中復原。利用MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics,autoflex II,ToF/ToF)及NanoES-MS(Q-ToF Ultima,Waters)，使用NanoES噴霧毛細血管來進行所收集的肽、消化物及完整蛋白質之質譜分析。
利用UPLC對未氧化及氧化的Met-FGF21樣品進行之分析證實，在300mM H2 O2 (1h，25℃)下，消化物中之Met1及Met168殘基完全被氧化成Met硫氧化物(亞碸)。對所收集的肽進行之MALDI分析證實含Met1及Met168之肽之氧化位點，且使用肽之MS/MS測序顯示Met殘基被氧化成Met硫氧化物。使用MALDI及UPLC分析，在多種過氧化氫濃度存在下(在0℃下，與25、50、100、200及300mM H2 O2 一起培育30分鐘)觀察到該兩個殘基具有類似的氧化動力學。利用UPLC所測定的肽1-18及肽137-176之半生期分別為36.3分鐘及40.3分鐘。使用NanoES-MS對完整蛋白質直接進行分析，亦觀察到氧化產物。
在實施例8之脂肪細胞檢定中，與未氧化Met-FGF21相比，氧化之Met-FGF21之活性降低10%。
以類似方式，確定若干本發明之FGF21化合物之氧化穩定性，且結果顯示於下表2中。氧化條件為300mM H2 O2 ，1h，25℃。
實施例10：FGF21化合物之活體內測試-藥效學
db/db小鼠為第2型糖尿病之小鼠模型。小鼠缺乏瘦素受體，且其特性在於高血糖症、胰島素抵抗、攝食過量及肥胖症。
使用雄性db/db小鼠(9-11週齡)來量測以下FGF21化合物對血糖之影響：(1)野生型FGF21(具有N端Met之SEQ ID NO:1)，(2)具有N端Met之FGF21之K122C類似物，如實施例4中所述用白蛋白結合子在Cys122處衍生化(兩種劑量)，及(3)具有N端Met之FGF21之S71C類似物，如實施例6中所述用白蛋白結合子在Cys71處衍生化。如實施例1-2中所述使該等類似物表現於大腸桿菌中，且如實施例3中所述進行純化。
每天一次皮下投予0.2-1.0mg/kg於PBS中之化合物(第1天、第2天及第3天給藥)。每天一次用PBS(每50公克小鼠250μl)皮下處理媒劑處理組(對照組)。在第0天、第1天、第3天、第4天及第5天，使用葡萄糖分析儀(Biosen 5040)基於葡萄糖氧化酶方法量測血糖含量。第0天，量測血糖以將小鼠分成4個不同組，每組8-10隻小鼠，彼此之間平均血糖未存在顯著不同。第1天，第一劑之後2小時，量測血糖。第3天，第三劑之後2小時，量測血糖。第4天，第三劑之後24小時，量測血糖。第5天取血液樣品，且因此在最後一(第三)劑之後48小時，量測血糖。
結果顯示於下表3中，其中血糖以mM表示(平均值±S.E.M(n=8或10))。
結果顯示，本發明之FGF21衍生物具有活體內生物活性，即與媒劑相比，其有效降低血糖。關於血液降低能力以及作用持續時間，本發明衍生物甚至似乎比野生型FGF21有效。
實施例11：FGF21化合物之活體內測試-藥物動力學 db/db小鼠
在雄性db/db小鼠中評估本發明之FGF21化合物(分別如實施例4、5及6中所述而製備之化合物F、H及O)之藥物動力學特徵。包括3個不同劑量(即皮下0.125、0.5及1mg/kg)之Met-FGF21(化合物A)以進行比較。
測試一個劑量(即皮下0.5mg/kg，約24nm/kg)之本發明化合物。監測比較化合物之血漿量歷時6小時，而監測本發明化合物之血漿量歷時48小時。
據估算，比較化合物之血漿T為1.3-1.7小時(當以0.5mg/kg給藥時，為1.4小時，如測試化合物)，化合物F之血漿為8.2小時，化合物H之血漿為15.9小時，且化合物O之血漿為14.6小時。
迷你豬
在正常雄性格廷根迷你豬(n=3-4)(12-15月齡，25kg)中測試Met-FGF21(化合物A)及本發明之FGF21化合物(如實施例4中所述而製備之化合物F)之藥物動力學特徵。監測化合物A之血漿濃度歷時一週，而監測化合物F之血漿濃度歷時兩週。以0.1mg/kg(約5nmol/kg)之單次靜脈內劑量進行該兩種化合物之給藥。
比較化合物(化合物A)之平均半生期()為10.4小時，標準偏差為3.1小時；而本發明化合物(化合物F)之平均為91.9小時，標準偏差為17.1小時。
使用纖維母細胞生長因子-21人類ELISA(可獲自BioVendor，目錄號RD191108200R)來測定FGF21化合物之血漿量。
該等結果強有力地證實本發明之FGF21衍生物具有延長效應。
實施例12：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備S71C Met-FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[Cys71]Met-FGF21(化合物O)
用以下試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之S71C Met-FGF21類似物(具有S71C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基：
一般程序B
將自NH4 HCO3 中冷凍乾燥之[Cys71]Met-FGF21(21.8mg，1.1μmol)溶解於20mM TRIS、0.5NaC1(pH 8.0)(4.36ml)中。將如上所述而製備之19-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基-胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十九烷酸(5.4mg，5當量)溶解於0.02M TRIS、0.5M NaCl(pH 8.0)緩衝液/乙腈1:1(1.09ml)中，且添加至[Cys71]Met-FGF21溶液中。2小時15分鐘後，在HiPrep 26/10上於A緩衝液(1.5CV)中使混合物脫鹽。利用陰離子交換在monoQ 5/50 GL管柱上純化所彙集之洗提份，其中使用A緩衝液:20mM TRIS，pH 7.8；B緩衝液：20mM TRIS、50mM NaCl，pH 7.8；流量：0.5ml，且梯度為0-100% B，60CV。彙集含產物之分離洗提份，且使用PD 10(GE 179851-01)管柱將緩衝液更換成50mM NH4 HCO3 。收集洗出液，且經Millex GV無菌0.22μm過濾器過濾，並冷凍乾燥。產量為6.7mg。
LCMS1：理論質量：20400.2；實驗值：20402.3。
實施例13：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備S71C Met-FGF21衍生物S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys71]Met-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之S71C Met-FGF21類似物(具有S71C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例5之一般程序A製備化合物，但不進行尺寸排阻純化。產量為2.88mg。
LCMS1：理論質量：20483.3；實驗值：20483。
實施例14：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備S71C Met-FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[Cys71]Met-FGF21 製備17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十七烷酸 步驟1：17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]-十七烷酸
向乙醇(10ml)及乙二胺(1ml)之溶液中添加17-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-甲氧基)-乙氧基]-乙基胺甲醯基}-丙基胺甲醯基)-十七烷酸(500mg)。在室溫下攪拌隔夜，之後在40℃下在真空中濃縮混合物。利用製備型HPLC(10-65%乙腈，0.1% TFA，20mL/min，C18，30mm×250mm，110)純化殘餘物。產量為332mg(70%)。
LCMS3：理論質量：776.0。實驗值：776.6(M+1)。
步驟2：17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基胺甲醯基}-十七烷酸
向碘乙酸(92mg)於乙腈(1ml)中之溶液中添加TSTU(142mg)及DIPEA(0.085ml)。在室溫下攪拌60分鐘，之後添加17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-胺基-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-甲氧基]-乙氧基}-乙基胺甲醯基)-1-羧基-丙基胺甲醯基]-十七烷酸(0.320g)於0.1M Na2 CO3 (12ml)中之溶液。攪拌120分鐘，之後用1N HCl調整混合物之pH值至1。濾出沈澱，用水洗滌並在真空中乾燥。產量為350mg(90%)。
LCMS3：理論質量：943.9；實驗值：944.6(M+1)。
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例2及3中一般所描述而製備之S71C Met-FGF21類似物(具有S71C及N端M之SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
一般程序B(NaCl)
使用實施例12之一般程序B，在pH 7.5下製備化合物，但不進行尺寸排阻純化。產量為15.9mg(38%)。
LCMS1：理論質量：20372.19；實驗值：20372.34。
實施例15：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1G,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1G,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
一般程序B(NaCl)
使用實施例12之一般程序B製備化合物。在20mM TRIS、0.5 NaCl(pH 7.5)與DPBS緩衝液之1:1混合物中進行反應。不進行尺寸排阻純化。產量為19.5mg(58%)。
LCMS1：理論質量：20511；實驗值：20511。
實施例16：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21 一般程序C：
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21類似物(SEQ ID NO: 1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
向(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21(33.8mg，1.7μmol)之DPBS緩衝液溶液(2.7mg/ml)中添加TRIS(3mg)及氯化鈉(29mg)。將如上所述而製備之17-{(S)-1-羧基-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基-胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基胺甲醯基]-丙基-胺甲醯基}-十七烷酸(8mg，5當量)溶解於0.02M TRIS、0.5M NaCl(pH 7.5)緩衝液(0.2ml)及乙腈(0.3ml)中，且添加至(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21溶液中。5小時後，經Millex GV無菌0.22μm過濾器過濾混合物，且在兩個串聯HiPrep 26/10上以A緩衝液(1.5 CV)使其脫鹽。利用陰離子交換在Source 15Q 4,6/100 PE管柱上純化彙集之洗提份，其中使用A緩衝液：20mM TRIS，pH 7.5，B緩衝液：20mM TRIS、50mM NaCl，pH 7.5；流量為2.5ml；且梯度為5-40% B，40 CV。彙集含產物之分離洗提份，且在HiPrep 26/10管柱上將緩衝液更換成DBPS緩衝液。使用Vivaspin 20離心過濾器(10000 MWCO)濃縮洗出液，收集且經Millex GV無菌0.22μm過濾器過濾。產量為10.9mg(31%)。
LCMS1：理論質量：20525；實驗值：20525。
實施例17：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之一般程序C製備化合物。產量為11.4mg(33%)。
LCMS1：理論質量：20539.4；實驗值：20539.5。
實施例18：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1S,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ser-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1S,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之一般程序C製備化合物，使用MonoQ 5/50 G1管柱進行純化。產量為20.9mg(58%)。
LCMS1：理論質量：20541；實驗值：20541。
實施例19：製備FGF21類似物之另一N端衍生物 製備(-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L) FGF21衍生物N-α-3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基(-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L) FGF21
製備17-{羧基甲基-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基)-乙基]-胺甲醯基}-十七烷酸
用95% TFA處理如WO2005/012347中所述而製備之17-{第三丁氧羰基甲基-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基)-乙基]-胺甲醯基}-十七烷酸第三丁酯(240mg)歷時1小時，且在真空中濃縮。使殘餘物與乙腈共濃縮，得到白色固體，定量產量為為200mg。LCMS3：理論質量：540.7；實驗值：541.3(M+1)。
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之N端位置：
使用實施例7之程序製備化合物，使用MonoQ 5/50 G1管柱進行純化。
LCMS3：理論質量：20301.9；實驗值：1451,2(M+14)。
可類似地製備以下實施例中之本發明之FGF21衍生物：
實施例20：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1G,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
實施例21：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
實施例22：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
實施例23：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1S,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ser-FGF21
實施例24：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1G,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
實施例25：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1G,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
實施例26：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
製備以下實施例：
實施例27：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1A,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1A,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之一般程序C製備化合物，使用MonoQ 5/50 G1管柱進行純化，但向緩衝液中添加5%乙醇。產量為18.2mg(43%)。
LCMS1：理論質量：20553.39；實驗值：20552.88。
可類似地製備以下實施例中之本發明之FGF21衍生物：
實施例28：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K,182G) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K,182G]G1y-FGF21
製備以下實施例：
實施例29：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E]A1a-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之一般程序C製備化合物，使用MonoQ 4,6/100 PE管柱進行純化，但向緩衝液中添加5%乙醇。產量為19.8mg(46%)。
LCMS1：理論質量：20498.40；實驗值：20498.07。
實施例30：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181)FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181K]Ala-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181)FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之一般程序C製備化合物，使用MonoQ 4,6/100 PE管柱進行純化，但向緩衝液中添加5%乙醇。產量為11.3mg(40%)。
LCMS1：理論質量：20411.32；實驗值：20410.90。
可類似地製備以下實施例中之本發明之FGF21衍生物：
實施例31：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,143V,145E,146E,148aD,149L,150R,152H,153aE,153bS,153cD,153dM,154F,155S,156S,158L,159E,160T,161D,163M,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基.-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[71C,N121Q,143V,145E,146E,148aD,149L,150R,152H,153aE,153bS,153cD,153dM,154F,155S,156S,158L,159E,160T,161D,163M,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E]Ala-FGF21
實施例32：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,28R,56R,59R,69R,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T) FGF21衍生物S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[28R,56R,59R,69R,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T]Ala-FGF21
實施例33：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1G,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21 製備17-(羧基甲基-{2-[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-乙基}-胺甲醯基)-十七烷酸 步驟1：17-{[2-(2-胺基-乙基胺甲醯基)-乙基]-羧基甲基-胺甲醯基}-十七烷酸
向乙二胺(0.3ml)於THF(4ml)中之溶液中添加如實施例19中所述而製備之17-{羧基甲基-[2-(2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基氧基羰基)-乙基]-胺甲醯基}-十七烷酸(190mg)溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜，且用製備型HPLC使用0.1% TFA之水溶液及0.1% TFA之乙腈溶液作為洗提劑直接進行純化。彙集含產物之洗提份且凍乾。產量為60mg(35%)。
LCMS3：理論質量：485.67；實驗值：486.38(M+1)。
步驟2：17-(羧基甲基-{2-[2-(2-碘-乙醯基胺基)-乙基胺甲醯基]-乙基}-胺甲醯基)-十七烷酸
向碘乙醯胺(35mg)於乙腈(0.50ml)中之溶液中添加TSTU(56mg)及DIPEA(0.032ml)。攪拌混合物1小時，接著添加17-{[2-(2-胺基-乙基胺甲醯基)-乙基]-羧基甲基-胺甲醯基}-十七烷酸(60mg)於0.1M Na2 CO3 (5ml)中之溶液。攪拌混合物2小時，且用1N HCl酸化至pH 1。離心混合物。傾析出上清液，用水洗滌沈澱兩次且在真空中乾燥。產量為75mg(93%)。
LCMS3：理論質量：653.60；實驗值：654.27(M+1)。
可用以下如上文所述使用一般程序A、B或C而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1G,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21類似物之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
實施例34：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1G,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-[(2-(3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K] Gly-FGF21
製備以下實施例：
實施例35：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物 製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基-甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
用如上所述而製備之試劑修飾如實施例56中一般所描述而製備之(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21類似物(SEQ ID NO:1)之位置71處的Cys殘基之硫醇基(位置71)：
使用實施例16之程序製備化合物。產量為9.3mg(33%)。
LCMS1：理論質量：20249.05；實驗值：20249.58。
可類似地製備以下實施例中之本發明之FGF21衍生物：
實施例36：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1S,71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K) FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ser-FGF21
實施例37：製備FGF21類似物之另一Cys衍生 物
製備(-1G,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Gly-FGF21
實施例38：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行進一步衍生化 製備(Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-(2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T]Ala-FGF21
可如實施例7中所述來修飾如實施例56中一般所描述而製備之(Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21類似物(具有Q28R、K56R、K59R、K69R、D102T、N121Q、K122R、L166F、S167G、M168L、G170T)FGF21及N端Ala之SEQ ID NO:1)之N端Met殘基的α胺基。
實施例39：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,102E,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
實施例40：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基-甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K]Ala-FGF21
實施例41：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K,182G-FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181K,182G]Ala-FGF21
實施例42：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E)FGF21衍生物S-71-[([(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E],Ala-FGF21
實施例43：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181K)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基-甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des 181K]Ala-FGF21
實施例44：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,71C,121Q,143V,145E,146E,148aD,149L,150R,152H,153aE,153bS,153cD,153dM,154F,155S,156S,158L,159E,160T,161D,163M,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][71C,121Q,143V,145E,146E,148aD,149L,150R,152H,153aE,153bS,153cD,153dM,154F,155S,156S,158L,159E,160T,161D,163M,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E]Ala-FGF21
實施例45：製備FGF21類似物之另一Cys衍生物
製備(-1A,28R,56R,59R,69R,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T)FGF21衍生物S-71-[(2-{3-[(17-羧基-十七醯基)-羧基甲基-胺基]-丙醯基胺基}-乙基胺甲醯基)-甲基][28R,56R,59R,69R,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T]Ala-FGF21
實施例46：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,K59R,K69R,K122R]Gly-FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20293.9；實驗值：20294.2。
實施例47：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(28R,K56R,59R,69R,102T,121Q,122R,168L,179F,180E,181R)Gly-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][28R,K56R,59R,69R,102T,121Q,122R,168L,179F,180E,181R]Gly-FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20415.1；實驗值：20415.3。
實施例48：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(K56R,59R,69R,122R,168L)Gly-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,59R,69R,122R,168]Gly-FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20275.9；實驗值：20276.1。
實施例49：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(K56R,59R,69R,122R,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181R)Gly-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,59R,69R,122R,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181R]Gly-FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20535.2；實驗值：20535.6。
實施例50：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(K56R,59R,69R,122R,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181R)Ser-FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,59R,69R,122R,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,181R]Gly-FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20565.2；實驗值：20565.5。
實施例51：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(-14E,-13E,-12A,-11E,-10A,-9G,-8G,-7A,-6G,-5G,-4S,-3G,-2G,-1S,K56R,59R,69R,122R)FGF21衍生物N-α-1-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基][-14E,-13E,-12A,-11E,-10A,-9G,-8G,-7A,-6G,-5G,-4S,-3G,-2G,-1S,K56R,59R,69R,122R]FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：21063.6；實驗值：21063.8。
實施例52：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化
製備(-5G,-4S,-3G,-2S-,1G,K56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L)FGF21衍生物N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,K56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L]FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例7中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20592.2；實驗值：20592.9。
實施例53：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化 製備(K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21衍生物N-α-1-(2-{2-[2-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙醯基)[K56R,K59R,K69R,K122R]Gly-FGF21
用4 NAP-5-管柱將10mg(511nmol)(K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21之緩衝液(1.72ml)溶液中之緩衝液更換成DPBS緩衝液。測定蛋白質濃度為2.5mg/ml。向溶液中添加400μl 20% HPβCD(羥基丙基β環糊精)及400μl 10% N-乙醯基-L-甲硫胺酸，pH 7.5。在7℃下，向該溶液中添加8當量(0.004086mmol)活性{2-[2-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基-胺基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸丁二醯亞胺酯之NMP(200μl)溶液。該丁二醯亞胺酯由N,N-二丁二醯亞胺基碳酸酯(CAS 74124-79-1)1:1歷時20分鐘產生。90分鐘後，添加4ml冷0.2M NaOH，且使反應物在4℃下靜置30分鐘。隨後，添加4ml 0.2M HCl，且調整pH值至7.3。
經0.22μm過濾器過濾反應混合物，利用離子交換層析進行純化且如實施例4中所述進行凍乾。
LCMS1：理論質量：20029.66；實驗值：20029.82。
實施例54：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化 製備(K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21衍生物N-α1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁醯基][K56R,K59R,K69R,K122R]Gly-FGF21
將139mg 4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁酸及115mg N-羥基丁二醯亞胺溶解於1ml DMF(用熱水溫熱數秒鐘)中，藉此產生4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁酸之丁二醯亞胺酯。添加145mg(3-二甲基胺基丙基)乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，且在室溫下攪拌混合物20分鐘。3.5小時後，將混合物傾入8ml水中並進行離心。移除上清液，重複懸浮及離心2次。
洗提之後，將10mg(K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21之DPBS(1.72ml)溶液中之緩衝液更換成DPBS(4ml)。添加400μl 10% N-乙醯基甲硫胺酸(pH值調整至約8)及400μl 20%環糊精。添加200μl之330μg 4-(16-(四唑-5-基)十六醯基胺磺醯基)丁酸丁二醯亞胺酯於1400μl NMP中之溶液。使反應混合物在7℃下靜置隔夜。在4℃下，向反應混合物中添加4ml 0.2M NaOH。30分鐘後，用3.9ml 0.2M HCl中和混合物。
經0.22μm過濾器過濾溶液混合物，利用離子交換層析進行純化且如實施例4中所述進行凍乾。
LCMS1：理論質量：20033.67；實驗值：20033.72。
實施例55：用白蛋白結合子在FGF21化合物之N端進行衍生化 製備(-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,K56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L)FGF21衍生物N-α-1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁醯基][-5G,-4S,-3G,-2S,-1G,K56R,59R,69R,102E,121Q,122R,168L]FGF21
製備FGF-21衍生物，且以類似於實施例54中所述之方式進行純化。
LCMS1：理論質量：20331.94；實驗值：20332.39。
實施例56：選殖及表現FGF21類似物
如實施例2及3中所述來製備及純化以下化合物：
56a) (K56R,K59R,K69R,K122R)Gly-FGF21；
56b) (K56R,K59R,K69R,K122R,M168L)Gly-FGF21；
56c) (Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,M168L,Y179F,A180E,S181R)Gly-FGF21；
56d) (K56R,K59R,K69R,D102E,N121Q,K122R,M168L)GSGSG-FGF21；
56e) (S71C,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Gly-FGF21；
56f) (K56R,K59R,K69R,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181R)Ser-FGF21；
56g) (K56R,K59R,K69R,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181R)Gly-FGF21；
56h) (K56R,K59R,K69R,K122R)EEAEAGGAGGSGGS-FGF21；
56i) (S71C,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Ser-FGF21；
56j) (S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Gly-FGF21；
56k) (S71C,D102E,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Gly-FGF21；
56l) (S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Ala-FGF21；
56m) (S71C,D102E,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Ala-FGF21；
56n) (Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21；
56o) (S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E)Ala-FGF21；
56p) (S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181G)Ala-FGF21；
56q) (S71C,N121Q,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181)Ala-FGF21；
56r) (D102N)Met-FGF21；
56s) (Q15F)Met-FGF21；
56t) (D24K)Met-FGF21；
56u) (V16K)Met-FGF21；
56v) (S71C,M168I)Gly-FGF21；
56x) (S71C,M168L)Gly-FGF21；
56y) (K56R,K59R,K69R,K122R)FGF21；
56z) (N121Q)Met-FGF21；
56aa) (des N121)Met-FGF21；
56ab) (S71C)Gly-FGF21；
56ac) (P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Met-FGF21；
56ad) (145aP,145bM,L146V,P149E,G151E,I152D,A154R,P155G,Q156H,P157L,P158E,D159S,V160D,G161M,S162F,D164S,S167E,M168T,V169D,G170S,P171M,S172D,Q173P,G174F,R175G,S176L,P177V,S178T,Y179G,A180L,S181E,182A,183V,184R,185S,186P,187S,188F,189E,190K)Met-FGF21；
56ae) (Q27E,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,Y179F,A180E,S181R)Gly-FGF21；
56af) (Q15F,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,Y179F,A180E,S181R)Gly-FGF21；
56ag) (S71C,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Gly-FGF21；
56ah) (L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181K)Ser-FGF21；
56ai) (M168A)Met-FGF21；
56aj) (M168S)Met-FGF21；
56ak) (K56R,K59R,K69R,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181R)FGF21；
56al) (M168S)Ser-FGF21；
56am) (Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,D159E,M168L,G174A,Y179F)Gly-FGF21；
56an) (K56R,K59R,K69R,K122R)EESAASGAAAGSAAA-FGF21；
56ao) (Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Gly-FGF21；
56ap) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,S181R)FGF21；
56aq) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,desS181)FGF21；
56ar) (N121D)Met-FGF21；及
56as) (A26E,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,Y179F,A180E,S181R)Gly-FGF21。
實施例57：選殖及表現FGF21類似物
可類似於實施例2及3中所述來製備以下FGF21衍生物：
57a) (Q28R,K56R,K59R,K69R,S71C,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21；
57b) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Gly-FGF21；
57c) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ala-FGF21；
57d) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ser-FGF21；
57e) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)FGF21；
57f) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Gly-FGF21；
57g) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21；
57h) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ser-FGF21；
57i) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)FGF21；
57j) P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；
57k) (S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；
57l) (S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；
57m) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；
57n) (K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；
57o) (S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；
57p) (S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；
57q) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；
57r) (K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；
57s) (S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；
57t) (S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；
57u) (K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；
57v) (K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21。
實施例58：HEK293/β-klotho Erk磷酸化檢定
在經人類β-Klotho穩定轉染之HEK293細胞中進行Erk磷酸化檢定。在96孔板上，以30000個細胞/孔接種HEK293T/b-klotho穩定細胞。兩天之後，添加新鮮培養基，且2小時之後再添加FGF21蛋白。培育板12分鐘。且，使用AlphaScreen SureFire磷酸基-ERK1/2檢定套組(Perkin Elmer,Waltham,MA)根據製造商之說明書來評估總ERK磷酸化，且使用具有AlphaScreen HTS Turbo選項之EnVision Multilabel Microplate Reader Model 2103(Perkin Elmer)來進行信號偵測。數據以平均值+/-S.E.M.表示。由四參數邏輯非線性回歸分析使用GraphPad Prism 5.02版來確定EC50值。參考文獻：Yie,J.等人,FGF21 N- and C-termini play different roles in receptor interaction and activation,FEBS Letters 583(2009)19-24；及Micanovic R.等人,Different roles of N- and C- termini in the functional activity of FGF21.J. Cell. Physiol. 2009年5月；219(2):227-34。

Claims (8)

  1. 一種纖維母細胞生長因子21(FGF21)化合物之衍生物，其具有透過N-端胺基酸殘基的胺基基團或透過FGF21化合物之位置71或122上的半胱胺酸殘基之硫醇基團共價連接的式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子，其中位置編號是參照SEQ ID NO：1，其中該FGF21化合物與SEQ ID NO：1具有至少90%的一致性，其中A-為式I或II的單元： 其中n為12、13、14、15、16、17、18或19，且*為與-B-之連接點；-B-為-B2-，其中-B2-為式IIX、IX或XXVIII的單元： 其中b為0、1或2，c為0、1或2，其限制條件為當c為0時，b為1或2，且當c為1或2時，b為0，*為與-C-之連 接點，且#為與A-之連接點；或 其中d為1或2，e為0、1或2，*為與-C-之連接點，且#為與A-之連接點；或#-NH-SO2 -(CH2 )u -CO-*(式XXVIII)其中u為2、3或4，*為與-C-之連接點，且#為與A-之連接點；-C-不存在，表示一鍵或為式X或XI的單元： 其中p為1、2或3，q為1、2、3或4，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；或 其中k為1、2或3，m為1、2、3或4，*為與-D-、-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-B-之連接點；-D-不存在，表示一鍵或為式XII或XIII的單元：#-NH-(CH2 )r -NH-CO-(CH2 )s -*(式XII)，或 #-NH-(CH2 )t -*(式XIII)，其中r為2、3、4或5，s為1、2、3或4，t為1、2、3、4、5或6，*為與-E-或FGF21化合物之連接點，且#為與-C-之連接點；-E-不存在，表示一鍵或為式XXII的單元： 其中*為與FGF21化合物之連接點，且#為與-D-或-C-之連接點；或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項之衍生物，其中-B-及-C-存在且不表示一鍵。
  3. 如申請專利範圍第1項之FGF21化合物之衍生物，其具有共價連接的式A-B-C-D-E-之白蛋白結合子，其中A-B-C-D-E-係選自以下式(1)-(14)： ；或任一相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如申請專利範圍第1項之衍生物，其係選自：S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys122]-Met-FGF21；S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-乙基)-2,5-二側氧基-吡咯啶-3-基][Cys71]Met-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(19-羧基-十九醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基) [Cys71]Met-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Arg56,Arg59,Arg69,Arg122]-Met-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)[71C,121Q,166F,167G,168L,169aT,171L,172E,173A,174V,179F,180E,des181K]Ala-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)[28R,56R,59R,69R,S71C,102T,121Q,122R,166F,167G,168L,170T]Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T]Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基][K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181]Ala-FGF21；N-α-1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基胺磺醯基)-丁醯基][K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des S181] Ala-FGF21；N-α-1-[4-(16-1H-四唑-5-基-十六醯基-胺磺醯基)-丁醯基][Q28R,K56R,K59R,K69R,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T]Ala-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)(Q28R,K56R,K59R,K69R,S71C,D102T,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Gly-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)Ser-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R)FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Gly-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧 基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)Ser-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,L166F,S167G,M168L,G170T)FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基-胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基-胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；N-α -1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基-胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ala-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E, 148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)Ser-FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)(S71C,121Q,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E, des181)FGF21；S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基-胺基]-乙基胺甲醯基}-甲基)(S71C,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,N121Q,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；及N-α-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七醯基胺基)-丁醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基胺基]-乙氧基}-乙氧基)-乙醯基](K56R,K59R,K69R,K122R,P143V,A145E,L146E,148aD,P149L,P150R,I152H,153aE,153bS,153cD,153dM,A154F,P155S,Q156S,P158L,D159E,V160T,G161D,S163M,L166F,S167G,M168L,169aT,P171L,S172E,Q173A,G174V,Y179F,A180E,des181)FGF21；或該等化合物中任一者之醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如申請專利範圍第1項之FGF21化合物之衍生物，其具有共價連接的式A-B-C-之白蛋白結合子，其中A-B-C- 係選自以下式(15)-(21)： ；或任何相應衍生物之醫藥學上可接受之鹽。
  6. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之衍生物及醫藥學上可接受之載劑。
  7. 一種如申請專利範圍第1至5項中任一項之FGF21衍生物之用途，其係用於製備供治療展現心血管疾病、代 謝症候群、及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之患者之醫藥品。
  8. 一種如申請專利範圍第1至5項中任一項之FGF21衍生物之用途，其係用於製備供治療展現糖尿病、血脂異常及/或肥胖症之患者之醫藥品。
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