TWI484906B - 在植物中表現由化學物質所誘導之外源基因的方法 - Google Patents

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Description

在植物中表現由化學物質所誘導之外源基因的方法
本發明係關於在植物中表現由化學物質所誘導之外源基因的方法。
當標的外源基因(foreign gene)被導入及表現於植物中時，通常使用隨時表現的組成型啟動子(constitutive promoter)，如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)35S啟動子(如Benfey PN & Chua NH, 1990, Science 250, 959-966)。然而，使用該等組成型啟動子之例中，在轉錄及轉譯系統上造成沈重的負擔，且依賴於一種標的外源基因，有時會造成對植物的有害效果諸如發芽及生長之抑制。針對避免該等有害效果之方法，可提及於所欲時間誘導及表現標的外源基因之方法。藉由使用該等誘導表現方法，更有效的表現標的外源基因變為可能，因此實現使包含於該外源基因之構造基因區域(structural gene region)所編碼之標的外源蛋白質等增產，以此自由控制植物生長及生理，其產業利用價值係為無價。
在所欲時間誘導表現外源基因之方法可依據誘導條件之不同而大致區分為兩種方法，即，藉由非化學物質如溫度、光、或植物病原體誘導表現之方法；及藉由化學物質誘導表現之方法。
藉由非化學物質誘導表現之方法之實例包含熱誘導系統(如美國專利案第5447858號)、低溫誘導系統(如美國專 利案第5847102號)、及藉由植物病原體攻擊所誘導之系統(如美國專利案第5942662號)。該等系統僅使用具有此種非常簡單結構的基因構築體(construct)，其係將誘導型啟動子(inducible promoter)連結至標的外源基因之上游區域。然而，在藉由非化學物質如溫度、光、或植物病原體誘導表現之例中，風險為標的外源基因會因未預期之環境改變、植物病原體之攻擊等而突然表現。
另一方面，藉由化學物質誘導表現之方法之實例包含銅離子誘導系統(如Mett VL et al, 1993, Proc Natl Acad Sci 90, 4567-4571)、類固醇激素誘導系統(如Aoyama T & Chua NH,1997, Plant J. 11, 605-612；美國專利案第6063985號)、乙醇誘導系統(如Caddick MX et al,1998,Nature Biotech. 16, 177-180；國際專利申請號WO93/21334)及四環素誘導系統(如Weinmann P et al,1994,Plant J.5,559-569)。上述已由Moore I等人(Moore I et al,2006,Plant J 45,651-683)及Padidam M(Padidam M,2003,Current Opin Plant Bio 6,169-177)詳細解釋，而標的外源基因之表現可依賴特定化學物質之濃度而被控制。即，標的外源基因可於所欲時間被誘導表現至必需量。
以往為了在重組植物中產生包含於標的外源基因之構造基因區域所編碼之標的外源蛋白質(累積於植物中)，有一些方法可使用，其係使用煙草嵌紋病毒(TMV)之Ω序列(如Gallie D et al,1987, Nucleic Acid Res 15, 3257-3273；美國專利案第5489527號)或煙草醇去氫酶基因之5'-非轉 譯區(5'-untranslated region)(如Satoh J et al,2004,J Biosci Bioeng 98(1):1-8；日本專利公開案第2003-079372 A號)，使其位於標的外源基因所包含之構造基因區域之上游。另一方面，亦有報導顯示連結至Ω序列之mRNA容易被核酸酶降解(如Gallie D et al, 1988, Nucleic Acid Res 16, 8675-8694)。因而，使用5'-非轉譯區序列會帶來何種結果不容易預測。另外，在特定誘導系統(舉例言之，銅離子誘導系統等)中，藉由化學物質所誘導之標的外源基因之表現會帶來何種影響全為未知。
在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因的理想方法中，於誘導期間，標的外源基因之非常高的表現量係為所欲，而於非誘導期間，標的外源基因的表現量應為非常低。於非誘導期間，標的基因表現量越低，對宿主植物的負擔就越小。另外，控制少量即具功能之單一因子等係為可能。又，於誘導期間，標的外源基因的表現量越高，則生產該標的外源基因所包含之構造基因區域所編碼之標的外源蛋白質等就可能變得更有效率，而需要用於誘導之刺激更少亦為所要求者。
在上述誘導系統表現由化學物質所誘導之標的外源基因中，關於銅離子誘導系統之問題係為該系統具有誘導表現之低誘導率(如Padiam M, 2003, Current Opin Plant Biol 6, 169-177)。本發明之目的在於提供可改善在銅離子誘導系統中標的外源基因誘導表現之誘導率，以實現在植物中 表現由銅離子所誘導之標的外源基因的理想方法。
亦即本發明提供：1.在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因的方法，其包括以銅離子活化由不同於標的外源基因之外源基因所編碼之轉錄因子，以藉由該標的外源基因所包含的具有啟動子功能之區域來誘導標的外源基因轉錄之活化之步驟，其中，編碼該轉錄因子之核苷酸序列係包含於基因構築體中，該基因構築體係經建構成包括位於標的外源基因所包含的具有啟動子功能之區域下游之任意外源基因之5'-非轉譯區的核苷酸序列(以下有時簡稱本發明誘導表現方法)；2.如上述第1項之方法，其中，該5'-非轉譯區之核苷酸序列係選自由下列關於5'-非轉譯區之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於5'-非轉譯區之核苷酸序列群組＞
(1)自病毒基因或植物誘導性基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；(2)自煙草嵌紋病毒屬(Tobamovirus genus)之病毒基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；(3)自蕃茄嵌紋病毒(tomato mosaic virus)之基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；及(4)自蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；3.如上述第1或2項之方法，其中，編碼該轉錄因子 之核苷酸序列係選自由下列關於轉錄因子之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於轉錄因子之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼真核細胞(eukaryote)轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼酵母菌(yeast)轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(3)自編碼酵母菌ACE1之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；4.如上述第1、2或3項之方法，其中，該基因構築體係經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列下游之編碼轉錄活化區域(transcriptional activation region)之核苷酸序列，且其中，該轉錄活化區域係為不同於該轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域；5.如上述第4項之方法，其中，編碼該轉錄活化因子之核苷酸序列係選自由下列關於轉錄活化區域之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於轉錄活化區域之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼單純疱疹病毒屬(Simplexvirus genus)之病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(3)自編碼單純性疱疹病毒(Herpes simplex virus)轉錄因 子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(4)自編碼單純性疱疹病毒轉錄因子VP16之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；6.如上述第1、2、3、4或5項之方法，其中，該基因構築體係經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列上游之任意(arbitrary)啟動子；7.在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因的基因構築體(以下有時簡稱為本發明之基因構築體)，其係可建構地製備以具有：(a)標的外源基因，包括具有啟動子功能之區域及編碼標的外源蛋白質之構造基因區域；(b)編碼由不同於該標的外源基因之外源基因所編碼之轉錄因子的核苷酸序列，其中，該轉錄因子可被銅離子活化；及(c)位在具有該標的外源基因所包含之啟動子功能區域(以下有時簡稱為本發明啟動子區域)下游之任意外源基因之5'-非轉譯區之核苷酸序列；8.如上述第7項之基因構築體，其中，該5'-非轉譯區之核苷酸序列係選自由下列關於5'-非轉譯區之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於5'-非轉譯區之核苷酸序列群組＞
(1)自病毒基因或植物誘導性基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列； (2)自煙草嵌紋病毒屬之病毒基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；(3)自蕃茄嵌紋病毒之基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；及(4)自蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；9.如上述第7或8項之基因構築體，其中，該轉錄因子之核苷酸序列係選自由下列關於轉錄因子之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於轉錄因子之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼真核細胞轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼酵母菌轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(3)自編碼酵母菌ACE1之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；10.如上述第7、8或9項之基因構築體，其係經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列下游之編碼轉錄活化區域之核苷酸序列，其中，該轉錄活化區域係為不同於該轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域；11.如上述第10項之基因構築體，其中，編碼該轉錄活化區域之核苷酸序列係選自由下列關於轉錄活化區域之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於轉錄活化區域之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼單純疱疹病毒屬之病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(3)自編碼單純性疱疹病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(4)自編碼單純性疱疹病毒VP16轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；12.如上述第7、8、9、10或11項之基因構築體，其係為經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列上游之任意啟動子之基因構築體；13.轉形植物(transformed plant)，其中，係導入如上述第7至12項中任一項之基因構築體(以下有時簡稱為本發明轉形植物)；及14.獲得外源蛋白質之方法，其係包括自如上述第13項之轉形植物中回收標的外源蛋白質(以下有時簡稱為用於獲得外源蛋白質之本發明方法)。
依據本發明，在銅離子誘導系統中，提供可改善在植物中標的外源基因之經誘導表現之誘導率的方法係為可能。
以下將詳細說明本發明。
本發明之基因構築體可用以在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因。該基因構築體係可建構地製備以 具有：(a)標的外源基因，包括具有啟動子功能之區域及編碼標的外源蛋白質之構造基因區域；(b)編碼不同於標的外源基因之外源基因所編碼之轉錄因子的核苷酸序列，其中，該轉錄因子可被銅離子活化(以下有時稱做本發明轉錄因子)；及(c)位在具有該標的外源基因所包含之啟動子功能之區域(以下有時稱做本發明啟動子區域)下游之任意外源基因之5'-非轉譯區之核苷酸序列(以下有時稱做本發明5'-非轉譯區)。
本發明之基因構築體之較佳實例包含基因構築體，其係經建構以額外包括位於編碼本發明轉錄因子之核苷酸序列下游之編碼轉錄活化區域之核苷酸序列，其中，該轉錄活化區域(以下有時稱做本發明轉錄活化區域)係為不同於該轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域。
本發明之基因構築體可建構地製備以具有上述(a)、(b)及(c)各別成分。亦即，該基因構築體可經建構為具有上述成分(a)、(b)及(c)各一之表現組合體(expression cassette)。另外，其可經建構為該等兩個表現組合體，舉例言之，一個具有上述成分(a)及(c)，而另一個具有上述成分(b)。
可利用習知基因工程技術建構此種表現組合體。另外，於建構兩個表現組合體之例中，第一表現組合體可具有上述成分(a)及(c)，而第二表現組合體具有上述成分(b)。
本發明之基因構築體之較佳實例包含基因構築體，其 係經建構以額外包括位於編碼上述轉錄因子之核苷酸序列上游之任意啟動子。
又，針對本發明之較佳基因構築體，可提及基因構築體，其係經建構以額外包括位於編碼上述轉錄因子之核苷酸序列下游之任意終結子(terminator)。終結子之實例包含NOS終結子、CR16終結子(JP 2000-166577A)、及大豆種子大豆素(glycinin)終結子(JP 06-189777A)。
本發明之基因構築體係被導入至，例如宿主植物如植物或培養的細胞，以實施該基因構築體之誘導表現。可藉由根據應用於特定宿主植物之適當方法之習知基因工程技術，進行將本發明之基因構築體導入宿主植物。
特別是，例如標的外源基因可以被包含於基因構築體中而導入，其中，第一表現組合體及第二表現組合體係於載體上連接。另外，第一表現組合體及第二表現組合體可不連接而導入宿主植物，以於活體內(in vivo )形成本發明之基因構築體。例如，該等表現組合體可藉由混合但不連接而導入。又，可導入第一表現組合體或第二表現組合體至宿主植物，接著再導入另一個表現組合體。
又，可進行已導入第一表現組合體之個體及已導入第二表現組合體之個體間的雜交(crossbreeding)。亦可藉由導入複數種之第一表現組合體進行複數種之外源基因的誘導表現。
針對導入本發明基因構築體之方法，可利用不同已知方法如農桿菌法(Agrobacterium method )、粒子槍法、電穿 孔法、磷酸鈣法、病毒載體法等。
宿主植物之實例包含對農藝及園藝重要的種類、或對基因學如基因體分析上有用之種類。又，宿主植物包含任意植物種類。其實例包含大豆、豌豆、芸豆、紫花苜蓿(alfalfa)、百脈根(Lotus japonicus )、苜蓿(clover)、花生、甜豌豆、胡桃、茶、棉、胡椒、黃瓜、西瓜、南瓜、絲瓜、哈密瓜、辣根、油菜籽、芥花(canolla)、甜菜、萵苣、甘藍菜、球花甘藍、花椰菜、阿拉伯芥、煙草、茄子、馬鈴薯、蕃薯、芋頭、朝鮮薊、蕃茄、菠菜、蘆筍、胡蘿蔔、芝麻、菊苣(endive)、菊(chrysanthemum)、天竺葵(geranium)、金魚草(antirrhinum)、康乃馨、石竹(pink)、夾竹桃(sweet oleander)、寒丁子屬(Bouvardia )、大花滿天星屬(Gypsophila )、非洲菊(gerbera)、羅素洋桔梗(Russellprairie gentian )、鬱金香(tulip)、紫羅蘭(Matthiola incana )、補血草屬(Limonium )、櫻草(cyclamen)、虎耳草(Saxifraga stolonifera )、空心菊(swamp chrysanthemum)、紫蘿蘭(violet)、玫瑰、櫻桃、蘋果、草毒、日本梅(Japanese apricot)、柳橙、貼梗海棠(Japanese quince)、杜鵑、臭油桐(Barbados nut)、龍膽(gentian)、大波斯菊(cosmos)、牽牛花(morning-glory)、向日葵、銀杏、日本柳杉(Japanese cedar)、日本扁柏(Japanese cypress)、白楊(poplar)、松樹、紅杉(Sequoia)、橡樹、蓮花(water lily)、杜仲屬(Eucommia )、山毛櫸(beech)、稻米、小麥、大麥、裸麥、燕麥、玉米(corn)、玉蜀黍(maize)、蔥、大蒜、百合、卷 丹(tiger lily)、蘭花、唐菖蒲(gladiolus)及鳳梨。
在本發明之誘導表現方法中，例如，本發明之轉形植物必須接觸銅離子、或必須施用銅離子至本發明之轉形植物。針對接觸或施用方法，於本發明之轉形植物係為培養細胞之案例中，例如，可提及將銅離子與培養基或營養溶液混合(如銅離子濃度：1μM至24mM)。又，於例如，本發明之轉形植物本身係為植物之案例中，將土壤或植物的莖或葉以銅離子處理、或將銅離子噴灑於植物的莖或葉(如銅離子的量為1nmol至24mmol，銅離子濃度：1μM至24mM)。較佳地，係依據宿主植物之特定種類及特定狀況選擇適當方法。在本發明之誘導表現方法中，需要使銅離子穿透植物細胞，其中，應當得到標的外源基因之誘導表現。對於此穿透之目的，例如，可使用欲施用之銅離子的錯合物之穿透。另外，藉由調整成所欲濃度，可利用農業應用如Bordeaux (Sumitomo Chemical Co., Ltd.)、G-fine (Yashima Chemical Industry Co., Ltd.)、Tomono Z-Bordeaux (Tomono Agrica Co., Ltd.)、Ridomilpulus (Nihon Nohyaku Co., Ltd.)、Highcopper (Sumitomo Chemical Co., Ltd.)、CUPRAVIT forte (Bayer CropScience Corporation)、Kocide Bordeaux (DuPont Corporation)、Kinondo (Agro Kanesho Co., Ltd.)、或Yonepon (Yonezawa Chemical Co., Ltd.)之銅劑；或做為食品添加劑如葡糖酸銅(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)之銅劑。又，當施用製劑或試劑(agent)時，可混合擴展劑(spreading agent)。
所使用之本發明轉錄因子係由銅離子活化以誘導標的外源基因所包含之具有啟動子功能之區域(即本發明啟動子區域)的轉錄活性。
轉錄因子在缺乏銅離子時為不活化類型，且其無法誘導具有啟動子功能之區域(即本發明啟動子區域)的轉錄活性；當銅離子存在時，其轉變為活化類型，此活化類型可誘導具有啟動子功能之區域(即本發明啟動子區域)的轉錄活性。通常，轉錄因子具有DNA鍵結區域及轉錄活化區域。於此時，連接不同於本發明轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域至本發明轉錄因子、或將原本轉錄因子的轉錄活化區域以不同於本發明轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域取代係為可能。另外，在宿主植物的細胞中，本發明轉錄活化區域具有聚集(recruit)RNA聚合酶錯合物之傳遞者(mediator)之功能，及增進轉錄活化能力。
本發明轉錄因子之較佳核苷酸序列之實例，如上所述，包含選自由下列關於轉錄因子之核苷酸序列所組成之群組者：
＜關於轉錄因子之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼真核細胞轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼酵母菌轉錄因子之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(3)自編碼酵母菌ACE1之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列。
又，其實例包含自Candida glabrata 之AMT1所衍生之核苷酸序列(Thorvaldsen JL et al,1993,J Biol Chem 268,12512-12518)、自Yarrowa lipolytica 之CRF1所衍生之核苷酸序列(Garcia S,2002, J Biol Chem 277, 37359-37369)、自造成銅離子依賴之玉米SOD基因組誘導表現之轉錄因子所衍生之核苷酸序列(Ruzza SM et al, 2003, Biochemistry 42, 1508-1516)等。
該等所衍生的核苷酸序列包含其部分序列、其與其他核苷酸序列之嵌合序列(chimeric sequence)、及突變序列，其中，該突變如缺失、插入、取代等係被導入。
所用的本發明啟動子區域包括，可在銅離子存在下，誘導上述本發明轉錄因子之轉錄活性之核苷酸序列。只要標的外源基因可在誘導性條件下表現於宿主細胞內，任何區域皆可用作為本發明啟動子區域。較佳地，例如可提及包含酵母菌MRE序列者(Mett VL et al,1993,Proc Natl Acad Sci 90, 4567-4571)等。特別是，可提及在具有習知使用之啟動子功能的區域中所存在的TATA序列上游，重複座落酵母菌MRE序列者。
上述具有習知使用之啟動子功能之區域可為組成型啟動子、組織特異性啟動子、或轉錄活性被特定刺激所誘導之誘導型啟動子。依特定用途適當選擇啟動子係為所欲。
組成型啟動子之實例包含CaMV 35S啟動子、PG10-90 (JP 09-131187 A)、泛素啟動子(WO 01/094394)、肌動蛋白啟動子(WO 00/070067)等。又，組織特異性啟動子之實例 包含大豆種子大豆素啟動子(JP 06-189777 A)、醇溶蛋白啟動子(WO 2004/056993)、芸豆種子芸豆素(phaseolin)啟動子(WO 91/013993)、油菜籽油菜蛋白(napin)啟動子(WO 91/013972)、阿拉伯芥Sultr2;2啟動子(Takahashi H et al, 2000,Plant J 23,171-182)、農桿菌rolC啟動子(Almon E et al, 1997,Physiol 115,1599-1607)等。
所用之5'-非轉譯區係座落於本發明啟動子之下游，並包括經轉錄但未經轉譯之核苷酸序列。然而，在案例中，例如，標的外源基因編碼反義RNA (antisense RNA)、或其編碼RNA誘導RNAi，該5'-非轉譯區係定義為自轉錄起始點至恰好於編碼RNA區域之前者。5'-非轉譯區序列可衍生自病毒基因或植物的誘導性基因。衍生自病毒之5'-非轉譯區序列包含煙草嵌紋病毒(TMV)之Ω序列(如Gallie D et al, 1987,Nucleic Acid Res 15,3257-3273；美國專利案第5489527號)、煙草蝕刻病毒(tobacco etch virus，TEV)之L序列(如Linbo JA,2007, BMC Biotechnol 7,52)、RSV之Φ序列(如Mori M et al, 2006,Plant Biotechnology 23(1),55-61)等。植物的誘導性基因意指表現量會受特定刺激而增加之基因，且其實例包含煙草醇去氫酶基因(Satoh J et al,2004,J Biosci Bioeng 98(1):1-8;JP 2003-79372 A)、煙草PR1a基因(Ohshima M et al,1990,Plant Cell 2(2),95-106)、玉米In2-2基因之In2-1基因(WO 90/11361;De Veylder L et al,1997,Plant Cell Physiol 38(5),568-577)、玉米GST27基因(Jepson I et al,1994,Plant Mol Biol 26(6),1855-1856;WO 97/11189)、阿拉伯芥RD29基因(Yamaguchi-Shinozaki K,1993,Mol Gen Genet 236(2-3), 331-340)、阿拉伯芥、大豆或向日葵之熱休克蛋白質基因(Yoshida K et al,1995,Appl Microbiol Biotechnol 44(3-4): 466-472;Nagao RT et al,1985,Mol cell Biol 5(12), 3417-3428;Almoguera C et al,2002, J Biol Chem, 277(46): 43866-43872)等。
本發明5'-非轉譯區域之較佳核苷酸序列之實例，包含下列關於5'-非轉譯區之核苷酸序列所組成之群組：
＜關於5'-非轉譯區之核苷酸序列群組＞
(1)自病毒基因或植物的誘導性基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；(2)自煙草嵌紋病毒屬之病毒基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列(如Gallie D et al,1987,Nucleic Acid Res 15, 3257-3273；美國專利案第5489527號)；(3)自蕃茄嵌紋病毒之基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列；及(4)自蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區所衍生之核苷酸序列。
該等衍生之核苷酸序列包含其部分序列、其與其他核苷酸序列之嵌合序列、及突變序列，其中，該突變如缺失、插入、取代等係被導入。
又，在該5'-非轉譯區係為具有48 bp或更多之序列、或在25℃條件下以二級結構預測程式： (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-forml-2.3.cgi，由Rensselaer及Wadsworth之Bioinformatics Center所提供，如見於Zuker M, 2003, Nucleic Acids Res 31(13),3406-3415)預測之二級結構之例子中，其亦可提及具有11bp或更多之最長鹼基連續之核苷酸序列，其在分子內的交互作用係無法預測。
如上所述，編碼本發明轉錄活化區域之較佳核苷酸序列之實例包含下列關於轉錄活化區域之核苷酸序列之群組：
＜關於轉錄活化區域之核苷酸序列群組＞
(1)自編碼病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(2)自編碼單純疱疹病毒屬之病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；(3)自編碼單純性疱疹病毒轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列；及(4)自編碼單純性疱疹病毒VP16轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列(如Triezenberg SJ et al, 1988, Genes Dev 2(6), 718-729)。
又，其實例亦包含GAL4轉錄因子(Gill G, Ptashne M,1987, Cell 51(1),121-126)、人工合成之具有轉錄活化能力的胜肽AH(Ansari AZ et al,2001,Chem Biol 8(6),583-592)等。
該等衍生之核苷酸序列包含其部分序列、其與其他核 苷酸序列之嵌合序列、及突變序列，其中，該突變如缺失、插入、取代等係被導入。
在本發明之誘導表現方法所用的轉錄因子係為如上所述之本發明轉錄因子，及不同於標的外源基因之外源基因所編碼的轉錄因子。該轉錄因子係由銅離子所活化。又，在本發明中之誘導表現方法中所用的基因構築體係為，例如，上述本發明之基因構築體。又，在本發明之誘導表現方法中所用的外源基因之5'-非轉譯區係為上述5'-非轉譯區，及任意外源基因之5'-非轉譯區。又，在本發明之誘導表現方法中所用的具有啟動子功能之區域係為上述本發明之啟動子區域，及包含於標的外源基因具有啟動子功能之區域。
如上所述，在本發明之轉形植物中，導入本發明之基因構築體。在本發明之獲得外源蛋白質之方法中，可依據習知蛋白質工程技術自該轉形植物中回收標的外源蛋白質。
本發明應用之實例將如下所說明，但並非依此特別限制應用。
過量表現FT基因之阿拉伯芥具有早期開花時間(如JP 2000-139250 A)。在本發明誘導表現之標的外源基因係為FT基因之例子中，於所欲時間誘導開花係為可能。於此等方法中，係在藉由將突變導至開花加速基因(flowering-accelerating gene)或誘導開花加速基因之RNAi、過量表現開花減速基因(flowering-decelerating gene) 使得開花變得困難的植物中，導入及表現本發明之FT基因，使得更嚴格控制開花變得可能。
附帶一提，FT基因為開花位置T基因(Flowering Locus T gene)之縮寫，且意指編碼對開花控制明確作用之因子的基因。FT基因具有對白畫長度產生反應而在維管束的篩管部分增加表現量、移動至莖頂、與表現於莖頂之bZIP型轉錄因子(又稱FD)交互作用之功能，從而誘導開花(如Kobayashi Y及Weigel D,2007, Genes Dev 21, 2371-2384)。
被導入膠原(collagen)基因之煙草製造膠原(如美國專利案第6617431號)。於本發明誘導表現中之標的外源基因係為膠原基因之例子中，高產量係為可能。
被導入PPO基因之玉米變成對殺草劑有抗性(如美國專利案第6307129號)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為PPO基因之例子中，其僅在所欲時間變成對殺草劑具抗性。當栽種植物為非必須時，其可被相同殺草劑殺死。
被導入EPSPS基因之大豆變成對殺草劑有抗性(如WO 92/00377)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為EPSPS基因之例子中，其僅在所欲時間變成對殺草劑具抗性。當栽種植物為非必須時，其可被相同殺草劑殺死。
被導入△15脂肪酸不飽和酵素基因之大豆會增加高度不飽和脂肪酸之含量(如WO 2005/047479)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為△15脂肪酸不飽和酵素基因之例子中，在所欲時間控制脂肪與油中的脂肪酸組 成係為可能。
被導入聚戊烯基二磷酸酯(polyprenyl diphosphate)合成基因之稻米會增加CoQ10之含量(如JP 2006-212019 A)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為聚戊烯基二磷酸酯合成基因之例子中，在所欲時間增加CoQ10含量係為可能。
被抑制可可鹼(theobromine)合成基因表現之咖啡降低咖啡因之含量(如JP 2002-112785 A;Ogita S et al, 2004, Plant Mol Biol 54(6), 931-941)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為可可鹼合成基因之反義基因，在所欲時間控制種子中的咖啡因含量係為可能。
於花藥表現核糖核酸酶(ribonuclease)基因之十字花科會變成雄不孕(如Mariani C et al,1990,Nature 347,737-741)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為核糖核酸酶基因之例子中，僅轉換所欲個體為雄不孕係為可能。另一方面，當S醣蛋白(S glycoprotein)基因之表現受抑制時，自交不親和性(self-incompatibility)係被破壞(如JP 08-322412 A)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為S醣蛋白基因之反義基因之例子中，僅轉換所欲個體成為自交不親和性係為可能。因此，可有效收集雜合(hybrid)種子。
又，針對類固醇激素誘導系統(steroid hormone inducible system)已有下列報導(如Zuo J et al, 2006, Methods Mol Biol 323, 329-342)。
(1)藉由CRE DNA重組酶基因之誘導表現，被兩個loxP位置夾住的抗藥性基因等之表現組合體被切出。
(2)藉由RNA啟動RNAi之誘導表現，所欲基因之表現係受抑制。
(3)藉由包含內含子(intron)之供給位置(donor site)及接收位置(acceptor site)之mRNA之誘導表現，所欲cDNA被單離出、或以隨機方式單離出cDNA。
(4)藉由染色體上基因之誘導表現(該基因係偶然嵌入5'-未轉錄區之下游，而在第一表現組合體之5'-未轉錄區下游未排列基因或終結子)，單離出功能基因。
如上所述，藉由製造相似構造，本發明誘導表現方法可應用於所有該等技術。
又，有一些報導顯示其中編碼外殼蛋白之區域係以標的外源基因之構造基因區域所取代之雀麥嵌紋病毒(brome mosaic virus)cDNA或蕃茄嵌紋病毒cDNA，係藉由類固醇激素誘導表現以產生高量外源蛋白質(如JP 2005-102652 A; Mori M et al, 2001, Plant Journal 27(1),79-86; Dohi K et al,2006, Arch Virol 151, 1075-1084)。於本發明誘導表現方法中之標的外源基因係為外殼蛋白等之構造編碼區域經其他基因所取代之病毒cDNA的例子中，該經取代之構造基因可於高轉錄量被誘導。
於下，本發明將參照實例詳細描述。
實施例1(製備導入載體) (1)轉錄因子基因表現組合體之構築體
對30℃震盪培養於YPD培養基(1%酵母萃取物、2%聚蛋白腖(polypeptone)、2%葡萄糖)2天的出芽酵母菌(Saccharomyces cerevisiae 菌株AH22)，使用基因體DNA抽取套組『Gen-torukun』(Takara Bio, Inc.)抽取基因體DNA。使用所抽出的基因體DNA做為模版，利用兩種特定引子(ACE1-1F、ACE1-1RC)以PCR放大ACEI轉錄因子基因。放大的ACEI轉錄因子基因經pB1221(Clontech)的GUS基因取代以製備p35S-ACE1-NOS。接著，將包含於p35S-ACE1-NOS中的NOS終結子以CR16終結子(JP 2000-166577 A)取代以製備p35S-ACE1-CR。
購自NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre)的重組阿拉伯芥種子(NO. N70016)播種於改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)。自生長於23℃達3週的重組阿拉伯芥的真葉，使用植物基因體DNA抽取套組『DNeasy Plant Kit』(QIAGEN)抽取基因體DNA。
使用抽出的基因體DNA做為模版，利用兩種特定引子(VP16-1F、VP16-1RC)以PCR放大單純性皰疹病毒之VP16AD轉錄因子之轉錄活化區段(domain)(VP16AD)基因。放大的VP16AD基因經TA選殖至pCR2.1(Invitrogen)以製備pCR2.1-VP16AD。使用pCR2.1-VP16AD做為模版，利用兩種特定引子(VP16-2F、VP16-2RC)進行PCR，並於VP16AD基因的SacI位置導入突變以製備pCR2.1-VP16AD (dSacI)。接著，使用pCR2.1-VP16AD(dSacI)做為模版，利 用兩種特定引子(VP16-3F、VP16-3RC)進行PCR以於VP16AD(dSacI)基因的5'端添加XhoI位置及3'端添加SacI位置。
使用p35S-ACE1-CR做為模版，利用兩種特定引子(ACE1-1F、ACE1-1RC)進行PCR以移除該ACE1轉錄因子基因之終止密碼子並於該處添加XhoI位置。VP16AD (dSacI)基因連接至已加入3'端XhoI位置之ACE1轉錄因子基因之下游，以符合讀取框(reading frame)而製備p35S-ACE1/VP16AD-CR。
ACE1-1F: 5'-atggatccatggtcgtaattaacggg-3' (SEQ ID NO: 1)
ACE1-1RC: 5'-tggagctcttattgtgaatgtgagttatg-3' (SEQ ID NO: 2)
ACE1-2RC: 5'-aactcgagttgtgaatgtgagttatgcg-3' (SEQ ID NO: 3)
VP16-1F: 5'-acggctccaccgaccgacgtc-3' (SEQ ID NO: 4)
VP16-1RC: 5'-ctacccaccgtactcgtcaattc-3' (SEQ ID NO: 5)
VP16-2F: 5'-ggacgaactccacttagacgg-3' (SEQ ID NO: 6)
VP16-2RC: 5'-ccgtctaagtggagttcgtcc-3' (SEQ ID NO: 7)
VP16-3F: 5'-tactcgagtcaacggctccaccgaccgacgt-3' (SEQ ID NO: 8)
VP16-3RC: 5'-aagagctcttacccaccgtactcgtcaattccaag-3' (SEQ ID NO: 9)
(2)sGFP基因表現組合體之構築體
自質體CaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'("Experimental Protocol Viewing Plant Cells", FuKuda Hiroo等人編輯,1997,Shujunsha Co., Ltd.,出版ISBN 4-87962-170-6)將sGFP基因切出，其利用轉接子(adapter)(NS-1F、NS-1RC)以pBI221之GUS基因取代以製備p35S-sGFP。p35S-sGFP所包含之CaMV35S啟動子的-830bp至-91 bp之區域以合成的寡核苷酸(MRE-1F、MRE-1RC)取代以製備pMRE/35S (-90)-sGFP。
將pMRE/35S(-90)-sGFP以限制酵素EcoRV處理，接著以『小牛腸鹼性磷酸酶』(Takara Bio, Inc.)去磷酸化。利用『平端化磷酸化連接套組(Blunting Kination Ligation Kit)』(Takara Bio, Inc.)將平端化及磷酸化的合成寡核苷酸(MRE-1F、MRE-1RC)插入該處，以往順向重複排列MRE序列兩次。因此所得之MRE序列重複兩次的部分被切除，並以如上述之相同方式而平端化該部分，並再次地將該部分插入至EcoRV位置，藉此製備pMRE4/35S(-90)-sGFP，其中MRE序列往順向重複排列4次。
又，使用pBI221為模版，利用兩種特定引子(46bp-1F、46bp-1RC)以PCR放大包含CaMV35S啟動子之-46 bp至-1 bp區域的DNA片段。該放大的DNA片段以位於pMRE4/35S(-90)-sGFP中重複排列4次之MRE序列下游的CaMV35S啟動子之-90 bp至-1 bp區域所取代，以製備pMRE/35S (-46)-sGFP。
另一方面，以存在於CaMV35S啟動子之-90 bp至-1 bp區域中之as-1位置導入突變的序列(Benfey PN & Chua NH, 1990,Science 250,959-966)取代該DNA片段。
首先，從購自NASC的重組阿拉伯芥種子(NO. N70016)抽取基因體DNA。使用抽出的基因體DNA做為模版，利用兩種特定引子(90m-1F、90m-1RC)進行PCR，因此在as-1位置具有突變的35S(-90m)序列經TA選殖至pCR2.1 (Invitrogen)以製備pCR2.1-35S(-90m)。使用pCR2.1-35S (-90m)做為模版，利用兩種特定引子(90m-2F、90m-2RC)進行PCR以添加EcoRV位置至5'端及添加XbaI位置至3'端。所獲得的DNA片段以位於pMRE4/35S(-90)-sGFP中重複排列4次之MRE序列下游的CaMV35S啟動子之-90 bp至-1 bp區域所取代，以製備pMRE4/35S(-90m)-sGFP。
另外，使用質體piL.erG3(Tamai A et al,2001,Mol Plant Microbe Interact 14(2),126-134)做為模版，利用兩種特定引子(71bp-1F、71bp-1RC)進行PCR以放大蕃茄嵌紋病毒的130k/180k基因之5'-非轉譯區(To71序列)。將放大的5'-非轉譯區序列插入pMRE4/35S(-46)-sGFP及pMRE4/35S (-90m)-sGFP之各sGFP構造基因之上游以製備pMRE4/35S (-46)-To71sGFP及pMRE4/35S(-90m)-To71sGFP。
NS-1F: 5'-ggccgcgagctcagt-3' (SEQ ID NO: 10)
NS-1RC: 5'-gactgagctcgc-3'(SEQ ID NO: 11)
MRE-1F: 5'-agcttagcgatgcgtcttttccgctgaaccgttccagcaaaaaagactagat-3' (SEQ ID NO: 12)
MRE-1RC: 5'-atctagtcttttttgctggaacggttcagcggaaaagacgcatcgcta-3' (SEQ ID NO: 13),
46bp-1F:5'-tagatatcgcaagacccttcctctatataagg-3' (SEQ ID NO: 14)
46bp-1RC: 5'-atcctctagagtcccccgtgttc-3' (SEQ ID NO: 15)
90m-1F: 5'-gctatgaccatgattacgccaagcttg-3' (SEQ ID NO: 16)
90m-1RC: 5'-cattgttatatctccttggatccgtcg-3' (SEQ ID NO: 17)
90m-2F:5'-tagatatctccacgtccataagggac-3' (SEQ ID NO: 18)
90m-2RC: 5'-aatctagactgcaggtcgtcctctcca-3' (SEQ ID NO: 19)
71bp-1F: 5'-tgtctagagtatttttacaacaattaccaacaac-3' (SEQ ID NO: 20)
71bp-1RC:5'-aaggatcctgtagttgtagaatgtaaaatgtaatg-3' (SEQ ID NO: 21)
(3)轉錄因子基因表現組合體與sGFP基因表現組合體間之連接
包含轉錄因子基因表現組合體的p35S-ACE1-CR及p35S-ACE1/VP16AD-CR以限制酵素HindⅢ及EcoRI處理，將各轉錄因子基因表現組合體切出。
在含有sGFP基因表現組合體之pMRE/35S(-90)-sGFP、pMRE4/35S(-46)-sGFP、pMRE4/35S (-46)-To71sGFP及pMRE4/35S(-90m)-To71sGFP以限制酵素HindⅢ處理之 後，利用『平端化磷酸化連接套組』執行平端形成及磷酸化，將合成的寡核苷酸(KXS-1F、KXS-1RC)插入以製備pKXS-MRE/35S(-90)-sGFP及pKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP、pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP及pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFP。該等製備之質體係以限制酵素KpnI及EcoRI處理，且將各sGFP基因表現組合體切出。
另一方面，pBI121(Clontech)所包含的GUS基因表現組合體係以合成的寡核苷酸(HEK-1、HEK-1RC)取代以製備pBI121-HEK。pBI121-HEK係以限制酵素HindⅢ及KpnI處理。
切出的轉錄因子基因表現組合體及切出的sGFP基因表現組合體係連接(ligated)至經限制酵素HindⅢ及KpnI處理的pBI121-HEK以獲得載體，在該載體上，轉錄因子基因表現組合體及sGFP基因表現組合體會連接於各自的終結子端(見第1圖)。衍生自p35S-ACE1-CR及pKXS-MRE/35S (-90)-sGFP之載體稱為載體A。衍生自p35S-ACE1-CR及pKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP之載體稱為載體B。衍生自p35S-ACE1/VP16AD-CR及pKXS-MRE/35S (-46)-sGFP之載體稱為載體C。衍生自p35S-ACE1/VP16AD-CR及pKXS-MRE4/35S(-46)-To71s GFP之載體稱為載體D。衍生自p35S-ACE1/VP16AD-CR及pKXS-MRE/35S(-90m)-To71sGFP之載體稱為載體E。
KXS-1F: 5'-ggtacctcgagtcgac-3' (SEQ ID NO: 22)
KXS-1RC: 5'-gtcgactcgaggtacc-3' (SEQ ID NO: 23)
HEK-1F: 5'-agcttgaattcgtcgacggtacctaggacgagctc-3' (SEQ ID NO: 24)
HEK-1RC: 5'-aattgagctcgtcctaggtaccgtcgacgaattca-3' (SEQ ID NO: 25)
實施例2(sGFP在重組阿拉伯芥中的表現量分析) (1)重組阿拉伯芥之製備及選擇
將實例1所產生的各載體A至E分別導入農桿菌(榕樹細菌性癌腫病菌(Agrobacterium tumefaciens )菌株C58C1)。將所得農桿菌培養於含有50mg/L卡那黴素(kanamycin)、100mg/L安比西林(ampicillin)、及100mg/L立汎黴素(rifampicin)的LB瓊脂培養基(0.5%酵母菌萃取物、1.0%蛋白腖(Bactotriptone)、0.5%氯化鈉、1%瓊脂)，並篩選抗藥性菌落以獲得重組農桿菌。依描述於Model Plant Laboratory Manual(Iwabuchi Masaki et al編輯,2000, Springer-Verlag Tokyo Co., Ltd., ISBN 4-431-70881-2 C3045)之方法，以所獲得的重組農桿菌感染阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana 生態型Columbia)以導入基因。自經基因導入之阿拉伯芥收集T1種子後，將種子播種及栽培於含有20mg/L苯來特(Benlate)、200mg/mL頭孢噻肟(Claforan)、25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、1%蔗糖、0.8%瓊脂)以篩選抗卡那黴素之植物個體。所選擇的植物個體轉栽至已先置入培養土壤之盆內，於人工氣候箱栽培以獲得T2種子。將所得T2種子播種及栽培於含有25mg/L卡那黴素之改質的 MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)之後，基於χ2 測試之顯著水準為5%、以3:1比例出現的具有卡那黴素抗性之植物個體之植物品系被篩選出。栽種植物個體之培養條件為光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃。
(2)利用即時PCR (real-time PCR)進行sGFP的表現量分析
關於所選擇的植物品系，播種後10天的6株植物個體轉栽至改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)，培養基中含有100μM CuSO4 作為誘導表現處理組以進行藉銅離子誘導表現標的外源基因之處理(以下有時稱為誘導表現處理)。另外，針對非誘導表現處理組，係使用不含CuSO4 之改質的MS瓊脂培養基。
接著，使用植物RNA抽取套組『RNeasy Plant Mini Kit』(QIAGEN)自6小時的誘導表現處理後之植物個體抽取全RNA。使用cDNA合成套組『ReverTra Ace』(TOYOBO)自抽出的全RNA合成cDNA。使用合成的cDNA做為模版，利用7500 Fast Real-time PCR設備(Applied Biosystems)藉由即時PCR進行mRNA量的定量測試。兩種特定引子(S01F、S01R)及TaqMan探針(S01)係用於sGFP基因的mRNA量的定量測試。阿拉伯芥肌動蛋白基因(AtACT2，GenBank Accession Number NM180280)係用作內標(internal standard)。兩種特定引子(S03F、S03R)及TaqMan探針(S03)係用於AtACT基因的mRNA量的定量測試。
S01F: 5'-tccgccctgagcaaagac-3' (SEQ ID NO: 26)
S01R: 5'-gaactccagcaggaccatgtg-3' (SEQ ID NO: 27)
S01: 5'-FAM-ccaacgagaagcgcga-MGB-3' (SEQ ID NO: 28)
S03F: 5'-cggtggttccattcttgctt-3' (SEQ ID NO: 29)
S03R: 5'-cggccttggagatccacat-3' (SEQ ID NO: 30)
S03: 5'-VIC-cctcagcacattcc-MGB-3' (SEQ ID NO: 31)
結果，關於被誘導之導入載體A的重組阿拉伯芥，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的4.6倍(之後有時稱為載體A導入之重組阿拉伯芥的誘導率)。關於導入載體B的重組阿拉伯芥，其中，載體B的MRE序列係重複排列4次並具有縮短的-90bp至-46bp的CaMV35S啟動子，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的8.6倍(之後有時稱為載體B導入之重組阿拉伯芥的誘導率)，且與載體A導入之重組阿拉伯芥的誘導率相比，確認具有1.9倍之改善。
另一方面，關於導入載體C的重組阿拉伯芥，其中，載體C中係為將VP16AD添加至ACE1轉錄因子，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的273.0倍(之後有時稱為載體C導入之重組阿拉伯芥的誘導率)，且與載體B導入之重組阿拉伯芥的誘導率相比，確認具有31.7倍之改善。
又，關於導入載體D的重組阿拉伯芥，其中，載體D係經插入蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區序列，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘 導表現處理組sGFP基因的mRNA量的628.6倍(之後有時稱為載體D導入之重組阿拉伯芥的誘導率)，且與載體C導入之重組阿拉伯芥的誘導率相比，確認具有2.3倍之改善。
又，關於導入載體E的重組阿拉伯芥，其中，係使用於as-1位置具有突變的35S(-90m)序列之載體E，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的325.6倍(之後有時稱為載體E導入之重組阿拉伯芥的誘導率)(見第2圖)。
實施例3(sGFP在重組煙草中的表現量分析) (1)重組煙草之製備及選擇
將實施例1所產生的載體B及載體E分別導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens 菌株LBA4404)。將所得農桿菌培養於含有50mg/L卡那黴素、300mg/L鏈黴素(streptomycin)、及100mg/L立汎黴素(rifampicin)的LB瓊脂培養基(0.5%酵母菌萃取物、1.0%蛋白腖(Bactotriptone)、0.5%氯化鈉、1%瓊脂)，並篩選抗藥性菌落以獲得重組農桿菌。依描述於Plant Gene Manipulation Manual(Uchimiya Hirofumi著,1992, Kodansha Scientific Corporation)之方法，以所得重組農桿菌感染煙草(Nicotiana tabacum 品種SR1)以導入基因。自經基因導入之煙草葉片選擇表現對100mg/L卡那黴素具抗性之不定芽(adventitious bud)，並自所選擇的不定芽再生植物個體。自所得的植物個體收集T1種子後，將種子播種及栽培於 含有50mg/L卡那黴素之MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、MS維生素、3%蔗糖、0.8%瓊脂)，篩選出基於χ2 測試之顯著水準為5%、以3:1比例出現的顯示卡那黴素抗性之植物個體之植物品系。栽種植物個體之培養條件為光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃。
(2)利用即時PCR (real-time PCR)進行sGFP的表現量分析
關於所選擇的植物品系，播種後12天的3株植物個體轉栽至經修改的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、MS維生素、3%蔗糖、0.8%瓊脂)，培養基中含有100μM CuSO4 作為誘導表現處理組以進行藉銅離子誘導表現標的外源基因(以下有時稱為誘導表現處理)。另外，針對非誘導表現處理組，係使用不含CuSO4 之改質的MS瓊脂培養基。
接著，自誘導表現處理後6小時之植物個體，使用植物RNA抽取套組『RNeasy Plant Mini Kit』(QIAGEN)抽取全RNA。使用cDNA合成套組『ReverTra Ace』(TOYOBO)自抽出的全RNA合成cDNA。使用合成的cDNA做為模版，利用7500 Fast Real-time PCR設備(Applied Biosystems)，藉由即時PCR進行mRNA量的定量測試。兩種特定引子(S01F、S01R)及TaqMan探針(S01)係用於sGFP基因的mRNA量的定量測試。煙草泛素基因(NtUBI，GenBank Accession Number U66264)係用作內標(internal standard)。兩種特定引子(S06F、S06R)及TaqMan探針(S06)係用於NtUBI基因的mRNA量的定量測試。
S06F: 5'-gaagcagctcgaggatggaa-3' (SEQ ID NO: 32)
S06R: 5'-gacgggttgactctttctggat-3' (SEQ ID NO: 33)
S06: 5'-VIC-accttggctgactacaa-MGB-3' (SEQ ID NO: 34)
結果，關於被導入載體B的重組煙草，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的9.6倍(之後有時稱為載體B導入之重組煙草的誘導率)。
另一方面，關於被導入載體E的重組煙草，其中，於載體E中係將VP16AD添加至ACE1轉錄因子，且將蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區序列插入sGFP構造基因之上游，於誘導表現處理組中sGFP基因的mRNA量係為非誘導表現處理組sGFP基因的mRNA量的40.8倍(之後有時稱為載體E導入之重組煙草的誘導率)，且與載體B導入之重組煙草的誘導率相比，確認具有4.2倍之改善(見第3圖)。
實施例4(於重組煙草培養細胞中GFP的累積量分析) (1)製備及篩選重組煙草培養細胞
依粒子槍方法(Morikawa Hiromichi et al,1992,Plant Cell Engineering, Vol.4 No.1 p.47-52, Shujunsha Co., Ltd.)，利用各載體塗覆於直徑1.0μm之金粒子，將實施例1所產生的各載體A、B及E導入煙草培養細胞(BY-2)。每1.0mg金粒子之DNA的量調整至0.1μg。在操作基因導入後第3天至第5天，經基因導入之煙草細胞懸浮培養液係塗佈於含有30mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、3%蔗糖、1μM 2,4-D、1mg/L硫胺素 (thiamin)鹽酸鹽、100mg/L肌醇、200mg/L KH2 PO4 、0.8%瓊脂)。培養一個月後，選擇呈現對30mg/L卡那黴素具抗性之細胞團塊，並將所選之細胞團塊培養4至8週，且每1至2週次培養至新的瓊脂培養基。該培養係於黑暗條件下、23至25℃進行。
(2)利用盤式螢光讀取機進行累積量分析
將所獲得的細胞團塊轉植至改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、3%蔗糖、1μM 2,4-D、1mg/L硫胺素鹽酸鹽、100mg/L肌醇、200mg/L KH2 PO4 、0.8%瓊脂)，培養基中含有100μM CuSO4 作為誘導表現處理組以進行藉銅離子誘導表現標的外源基因之處理(以下有時稱為誘導表現處理)。另外，針對非誘導表現處理組，係使用不含CuSO4 之改質的MS瓊脂培養基。
然後關於誘導表現處理後經過3天的細胞團塊，利用螢光顯微鏡(Nikon)檢驗GFP的螢光發光狀態。
將觀察到螢光發光增加的細胞團塊以液態氮冷凍。接著將玻璃珠(0.25至0.5mm)及萃取緩衝液(1x PBS(-)、5mM DTT、1mM PMSF、0.1%蛋白酶抑制劑混合物)添加至該冷凍物質，以研磨設備『Mixermill』(QIAGEN)磨碎。將所得磨碎產物以桌上型離心機於15000rpm、4℃離心5分鐘以回收上清液後，所得上清液係用作蛋白質萃取溶液。接著，將蛋白質萃取溶液以1x PBS(-)適當稀釋，而該稀釋溶液經多標記計數器(Multilabel counter)『wallac 1420 ARVOMX』(Perkin-Elmer)測量螢光強度。以1x PBS(-)稀 釋重組GFP (Cosmo Bio)獲得稀釋溶液作為標準樣本。由測得的螢光強度計算每可溶性蛋白質量之GFP轉換量，其中，扣除作為背景值的對照組野生型細胞團塊之對應值，以計算GFP的累積量。蛋白質萃取溶液中的蛋白質濃度可藉Bradford方法定量測定。
結果，關於導入載體A的重組煙草培養細胞，於誘導表現處理組中GFP的累積量係為非誘導表現處理組GFP的累積量的1.6倍(之後有時稱為載體A導入之重組煙草培養細胞的誘導率)。關於導入載體B的重組煙草培養細胞，其中，載體B的MRE序列係重複排列4次並具有縮短的-90bp至-46bp的CaMV35S啟動子，於誘導表現處理組中GFP的累積量係為非誘導表現處理組GFP的累積量的1.9倍(之後有時稱為載體B導入之重組煙草培養細胞的誘導率)。
另一方面，關於導入載體E的重組煙草培養細胞，其中，於載體E中係為將VP16AD添加至ACE1轉錄因子且將蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之5'-非轉譯區序列插入sGFP基因之上游，於誘導表現處理組中GFP的累積量係為非誘導表現處理組GFP的累積量的21.9倍(之後有時稱為載體E導入之重組煙草培養細胞的誘導率)，且與載體B導入之重組煙草培養細胞的誘導率相比，確認具有11.5倍之改善(見第4圖)。
實施例5(誘導表現系統的暫時分析) (1)樣本製備，且以粒子槍導入基因
阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana )、煙草(Nicotiana tabacum )、大豆(Glycine max 'Jack')、康乃馨(Dianthus caryophyllus 'True Love', Killin Green and Flower Corp.)、米(Oryza sativa ssp japonica cv Nipponbare)及卷丹(Lilium lancifolium )的葉片各自剪下，將葉片(葉盤(leaf disc))置於0.6%瓊脂培養基，其含有100μM CuSO4 作為誘導表現處理組以進行藉銅離子誘導表現標的外源基因的處理(以下有時稱為誘導表現處理)。針對非誘導表現處理組，係使用不含CuSO4 之0.6%瓊脂培養基。
接著，將於實施例1所製備的載體E與pBI221 (Clontech)等量混合以獲得組成物，使用上述組成物塗覆於直徑1.0μm之金粒子，藉由粒子槍方法將該組成物導入誘導處理後經過1天的葉盤。每1.0mg金粒子之DNA量調整至0.1μg。混入pBI221係為了校準基因導入作用之效能。使用於實施例1所產生的p35S-sGFP與pBI221等量混合所得組成物取代上述組成物作為對照組。
(2)報導子基因(reporter gene)的暫時表現分析
關於基因導入之葉盤，於基因導入後經過1天，以螢光顯微鏡(Nikon)計算觀察到之GFP螢光發光之斑點數量。接著，基因導入之葉盤係浸於GUS染色溶液(0.5mg/ml X-Gluc、0.5mM K3 Fe(CN)6 、0.5mM K4 Fe(CN)6 、0.01% Triton X-100、100mM磷酸鈉)，其經400mm Hg真空處理10分鐘，接著於37℃染色1天。經染色之葉盤以70%乙醇脫色，接著，以顯微鏡(Nikon)計數觀察到之GUS染色之斑點數量。
結果，在導入p35S-sGFP之葉盤中，根據誘導表現處理組及非誘導表現處理組間的GFP螢光，得知斑點數量並無顯著差異。另一方面，在導入載體E之葉盤中，與根據非誘導表現處理組的GFP螢光而得知之斑點數量相比，根據誘導表現處理組中觀察到的GFP螢光，得知斑點數量較多。GUS染色所造成之斑點數量在處理組中可穩定觀察到，故確認在基因導入效能上並未有太大差異(見表1)。
實施例6(重組阿拉伯芥之開花誘導) (1)導入載體製備
阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana 生態型Columbia)播種於改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)並栽培於23℃達3週。所得植物轉栽至已先置入培養土壤之盆內，栽培於人工氣候箱。自轉栽後經過2週的花苞及真葉，使用植物RNA抽取套組『RNeasy Plant Mini Kit』(QIAGEN)抽取全RNA。自抽出的全RNA，利用cDNA合成套組『ReverTra Ace』(TOYOBO)合成cDNA。使用合成的cDNA做為模版，利用兩種特定引子(FT-1F、FT-1RC)以PCR放大FT基因(GenBank Accession Number AB027504)。放大的FT基因以pBI221(Clontech)之GUS基因取代。以藉此獲得的質體做為模版，利用六種特定引子(FT-2F、FT-2RC、FT-3F、FT-3RC、FT-4F、FT-1RC)進行融合PCR，將未伴隨胺基酸取代之突變導入FT基因之BamHI位置及EcoRI位置，並將5'端的XbaI位置以BamHI位置取代。將藉此獲得的修飾FT基因以於實施例1所製備的pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFP之sGFP基因所取代，以製備pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71FT。依據如實施例1所述之相同方法，藉由將包含於pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71FT之FT基因表現組合體及包含於p35S-ACE1/VP16AD-CR之轉錄因子基因表現組合體連接於終結子端而獲得載體F(見第5圖)。
FT-1F: 5'-taatctagaatgtctataaatataagagaccctc-3' (SEQ ID NO: 35)
FT-1RC: 5'-atagagctcctaaagtcttcttcctccg-3' (SEQ ID NO: 36)
FT-2F: 5'-taaggatccatgtctataaatataagagaccctc-3' (SEQ ID NO: 37)
FT-2RC: 5'-gaacatctggatcgaccataaccaaagta-3' (SEQ ID NO: 38)
FT-3F: 5'-tactttggttatggtcgatccagatgttc-3' (SEQ ID NO: 39)
FT-3RC: 5'-gacacgatgaatacctgcagtggga-3' (SEQ ID NO: 40)
FT-4F: 5'-tcccactgcaggtattcatcgtgtc-3' (SEQ ID NO: 41)
(2)重組阿拉伯芥之製備及選擇，及開花誘導
將所產生的載體F導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens 菌株C58C1)。將所得農桿菌培養於含有50mg/L卡那黴素、100mg/L安比西林、及100mg/L立汎黴素的LB瓊脂培養基(0.5%酵母菌萃取物、1.0%蛋白腖(Bactotriptone)、0.5%氯化鈉、1%瓊脂)，並篩選抗藥性菌落以獲得重組農桿菌。依描述於Model Plant Laboratory Manual(Iwabuchi Masaki et al編輯,2000, Springer-Verlag Corporation, ISBN 4-431-70881-2 C3045)之方法，以所得重組農桿菌感染阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana 生態型Columbia)以導入基因。自經基因導入之阿拉伯芥收集T1種子後，將種子播種及栽培於含有20mg/L苯來特、200mg/mL頭孢噻肟、25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、1%蔗糖、0.8%瓊脂)以篩選抗卡那黴素之植物個體。所選擇的植物個體轉栽至已先置入培養土壤之盆內，栽培於人工氣候箱以獲得T2種 子。之後將所得T2種子播種及栽培於含有25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)；基於χ2 測試之顯著水準為5%、以3:1比例出現的具有卡那黴素抗性之植物個體之植物品系被篩選出。將所選品系之植物個體轉栽至已先置入培養土壤之盆內，栽培於人工氣候箱以獲得T3種子。所得T3種子播種於含有25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)。接著選擇全部展現卡那黴素抗性之同型合子。栽種植物個體之培養條件為光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃。
關於所選擇的同型合子，T3種子播種於改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)。在其栽培於光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃的條件3天後，將其進一步栽培於光週期12小時、黑暗週期12小時，且溫度為23至25℃之條件下。播種後經過10天的植物個體轉栽至改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)，培養基中含有100μM CuSO4 作為誘導表現處理組以進行藉銅離子誘導表現標的外源基因之處理(以下有時稱為誘導表現處理)。針對非誘導表現處理組，係使用不含CuSO4 之改質的MS瓊脂培養基。
誘導表現處理3天後的植物個體(播種後經過13天)轉栽至改質的不含100μM CuSO4 之MS瓊脂培養基(MS 無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)。以誘導表現處理後經過11天的植物個體(播種後經過24天)進行檢驗。結果，與非誘導表現處理組相比，在誘導表現處理組中被誘導提早開花(見第6圖)。
實施例7(重組煙草之殺草劑抗性誘導) (1)導入載體之製備
利用限制酵素BamHI及SacI將rSt-1609soy基因自pSUM-35S-rSt-1609soy(JP 2006-001921A)切出。切出的rSt-1609soy基因係以於實施例1中所製備的pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71sGFP之sGFP基因所取代，以製備pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71rSt-1609soy。依據如實施例1所述之相同方法，藉由將包含於pKXS-MRE4/35S(-90m)-To71rSt-1609soy之rSt-1609soy基因表現組合體及包含於p35S-ACE1/VP16AD-CR之轉錄因子基因表現組合體連接於終結子端而獲得載體G(見第5圖)。
(2)重組煙草之製備及選擇，及殺草劑抗性誘導
將所製備之載體G導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens 菌株LBA4404)。將所得農桿菌培養於含有50mg/L卡那黴素、300mg/L鏈黴素、及100mg/L立汎黴素的LB瓊脂培養基(0.5%酵母菌萃取物、1.0%蛋白腖(Bactotriptone)、0.5%氯化鈉、1%瓊脂)，並篩選抗藥性菌落以獲得重組農桿菌。依描述於Plant Gene Manipulation Manual(Uchimiya Hirofumi著,1992, Kodansha Scientific Corporation)之方法，以所獲得的重組農桿菌感染煙草 (Nicotiana tabacum 品種SR1)以導入基因。自經基因導入之煙草葉片選擇表現對100mg/L卡那黴素具抗性之不定芽，並自所選擇的不定芽再生植物個體。自所得植物個體收集之T1種子播種及栽培於含有50mg/L卡那黴素之MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、MS維生素、3%蔗糖、0.8%瓊脂)之後，基於χ2 測試之顯著水準為5%、以3:1比例出現的顯示卡那黴素抗性之植物個體之植物品系被篩選出。栽種植物個體之培養條件為光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃。
關於所選擇的植物品系，將播種後經過數天的植物個體轉栽至已先置入培養土壤之盆內，接著，將含有CuSO4 之水溶液噴灑至植物個體作為誘導表現處理組。不含CuSO4 之水溶液則用於非誘導表現處理組。
又，將PPO抑制型殺草劑噴灑至上述植物個體。
與非誘導表現處理組相比，誘導表現處理組對於較高濃度殺草劑產生抗性。
實施例8(使用其他5'-非轉譯區序列) (1)導入載體之製備
使用實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP做為模版，利用兩種特定引子(EV46-1F、o46-1RC)進行PCR以放大46o片段。又，使用質體CaMV35S-sGFP (S65T)-NOS3'("Experimental Protocol Viewing Plant Cell"，Fukuda Hiroo等人編輯,1997, Shujunsha Co., Ltd., ISBN 4-87962-170-6)做為模版，利用兩種特定引子 (omg-1F、omg-1RC)進行PCR以放大Ω序列片段。又，使用實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP做為模版，利用兩種特定引子(oGFP-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大oGFP片段。使用所得三種DNA片段(46o、Ω序列、oGFP)做為模版，利用兩種特定引子(EV46-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大Ω sGFP片段。所得Ω sGFP片段以於實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP在EcoRV及SacI位置所切出之片段置換，以製備pKXS-MRE4/35S (-46)-Ω sGFP。使用所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-Ω sGFP做為模版，利用兩種特定引子(Xo-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大xΩ sGFP片段。所得xΩ sGFP片段以於實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP在XbaI及SacI位置所切出之片段置換，以製備pKXS-MRE4/35S (-46)-xΩ sGFP。
使用實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71s GFP做為模版，利用兩種特定引子(EV46-1F、a46-1RC)進行PCR以放大46a片段。又，以實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71sGFP做為模版，利用兩種特定引子(aGFP-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大aGFP片段。將所得兩種DNA片段(46a、aGFP)及合成的寡核苷酸(A94-1F、A94-1RC)混合。使用該混合物做為模版，利用兩種特定引子(EV46-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大A94sGFP片段，其具有衍生自煙草醇去氫酶之5'-非轉譯區。所得A94sGFP片段以於實施例1所製備之pKXS-MRE4 /35S(-46)-To71sGFP在EcoRV及SacI位置所切出之片段置換，以製備pKXS-MRE4/35S(-46)-A94sGFP。使用所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-A94sGFP做為模版，利用兩種特定引子(Xa-1F、SIGFP-1RC)進行PCR以放大xA94sGFP片段。所得xA94sGFP片段以於實施例1所製備之pKXS-MRE4/35S(-46)-To71Sgfp在XbaI及SacI位置所切出之片段置換，以製備pKXS-MRE4/35S (-46)-xA94sGFP。
依據如實施例1所述之相同方法，藉由將所製備之四種sGFP基因表現組合體及包含於p35S-ACE1/VP16AD-CR之轉錄因子基因表現組合體連接於終結子端而獲得載體(見第7圖)。衍生自pKXS-MRE4/35S(-46)-Ω sGFP之載體稱為載體H。衍生自pKXS-MRE4/35S(-46)-xΩsGFP之載體稱為載體I。衍生自pKXS-MRE4/35S(-46)-A94sGFP之載體稱為載體J，而衍生自pKXS-MRE4/35S(-46)-xA94sGFP之載體稱為載體K。
EV46-1F: 5'-ctagatatcgcaagacccttcctct-3' (SEQ ID NO: 42)
o46-1RC: 5'-gtaaaaataccctctccaaatgaaatgaacttc-3' (SEQ ID NO: 43)
omg-1F: 5'-ggtatttttacaacaattaccaacaacaac-3' (SEQ ID NO: 44)
omg-1RC: 5'-cattgtaattgtaaatagtaattgtaatgt-3' (SEQ ID NO: 45)
oGFP-1F: 5'-acaattacaatggtgagcaagggcga-3' (SEQ ID NO: 46)
SIGFP-1RC: 5'-ttagagctcttacttgtacagctcgtcc-3' (SEQ ID NO: 47)
Xo-1F: 5'-gactctagagtatttttacaacaattaccaac-3' (SEQ ID NO: 48)
a46-1RC: 5'-gttaaatagaccctctccaaatgaaatgaacttc-3' (SEQ ID NO: 49)
aGFP-1F: 5'-gaaaaataaatggtgagcaagggcgag-3' (SEQ ID NO: 50)
A94-1F: 5'-gtctatttaactcagtattcagaaacaacaaaagttcttctctacataaaattttcct attttagtgatcagtgaaggaaatcaagaaaaataaatg-3' (SEQ ID NO: 51)
A94-1RC: 5'-catttatttttcttgatttccttcactgatcactaaaataggaaaattttatgtagaga agaacttttgttgtttctgaatactgagttaaatagac-3' (SEQ ID NO: 52)
Xa-1F: 5'-actctagagtctatttaactcagtattcag-3' (SEQ ID NO: 53)
(2)重組阿拉伯芥之製備及選擇，及表現量分析
將所製備的載體H至K導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens 菌株C58C1)。將所得農桿菌培養於含有50mg/L卡那黴素、100mg/L安比西林、及100mg/L立汎黴素的LB瓊脂培養基(0.5%酵母菌萃取物、1.0%蛋白腖(Bactotriptone)、0.5%氯化鈉、1%瓊脂)，並篩選抗藥性菌落以獲得重組農桿菌。依描述於Model Plant Laboratory Manual(Iwabuchi Masaki et al編輯,2000, Springer-Verlag Tokyo Co.,Ltd., ISBN 4-431-70881-2 C3045)之方法，以所獲得的重組農桿菌感染阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana 生態型Columbia)以導入基因。自經基因導入之阿拉伯芥收集T1種子後，將種子播種於含有20mg/L苯來特、200mg/mL頭孢噻肟、25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、1%蔗糖、0.8%瓊脂)並栽培11天，以篩選抗卡那黴素之植物個體。將所選擇的植物個體轉栽至含有20mg/L苯來特、200mg/mL頭孢噻肟、25mg/L卡那黴素之改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、1%蔗糖、0.8%瓊脂)且額外栽培6天。將播種後經過17天的植物個體轉栽至改質的MS瓊脂培養基(MS無機鹽類、維生素B5、2%蔗糖、0.8%瓊脂)，培養基中含有100μM CuSO4 以進行標的外源基因之誘導表現處理(以下有時稱為誘導表現處理)。在誘導表現處理後一小時內(0天)，利用宏觀螢光顯微鏡VB-G05(KEYENCE)觀察植物個體之GFP之螢光發光狀態，並利用高度敏感冷CCD相機VB-7010(KEYENCE)獲得螢光曬印影像(printed image)。結果，在導入載體H至K的重組阿拉伯芥中，在誘導表現處理後第0天未觀察到螢光，而在誘導表現處理後經過第3天觀察到強烈GFP螢光(見第8圖)。栽種植物個體之培養條件為，栽種後至第11天為光週期23小時、黑暗週期1小時，且溫度為23至25℃；而之後為光週期12小時、黑暗週期12小時，且溫度為23至25℃。
(產業利用性)
根據本發明，在銅離子誘導系統中，提供能夠改善在植物中標的外源基因之誘導表現之誘導率之方法係為可能。
序列表文字 SEQ ID NO:1
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:2
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:3
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:4
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:5
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:6
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:7
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:8
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:9
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:10
為轉接子所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:11
為轉接子所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:12
為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:13
為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:14
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:15
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:16
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:17
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:18
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:19
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:20
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:21
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:22
為被插入之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:23
為被插入之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
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為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
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為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:27
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:28
為TaqMan探針所設計之寡核苷酸
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:30
為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為TaqMan探針所設計之寡核苷酸
SEQ ID NO:32
為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為TaqMan探針所設計之寡核苷酸
SEQ ID NO:35
為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:46
為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:47
為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:49
為PCR所設計之寡核苷酸引子
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為PCR所設計之寡核苷酸引子
SEQ ID NO:51
為PCR所設計之寡核苷酸
SEQ ID NO:52
為PCR所設計之寡核苷酸
SEQ ID NO:53
為PCR所設計之寡核苷酸引子
第1圖係為說明銅離子誘導性sGFP基因表現載體之T-DNA區域之構造的概略圖。第1圖中的標記「*」顯示as-1位置之突變導入區域。
第2圖係為顯示在已導入銅離子誘導性sGFP基因表現載體之重組阿拉伯芥(Arabidopsis )中，以即時PCR測定sGFP基因之mRNA量所得之結果圖。圖中之數值顯示了在誘發表現處理組中sGFP基因之mRNA的量與在未誘發表現處理組中sGFP基因之mRNA的量之比例。
第3圖係為顯示在已導入銅離子誘導性sGFP基因表現載體之重組煙草中，以即時PCR測定sGFP基因之mRNA量所得之結果圖。圖中之數值顯示了在誘發表現處理組中sGFP基因之mRNA的量與在未誘發表現處理組中sGFP基因之mRNA的量之比例。
第4圖係為顯示在已導入銅離子誘導性sGFP基因表現載體之重組煙草培養細胞中，測定GFP的累積程度(就從GFP之螢光強度所計算之GFP累積程度而論)所得之結果圖。圖中之數值顯示了在誘發表現處理組中GFP的累積程度與在未誘發表現處理組中GFP的累積程度之比例。
第5圖係為說明銅離子誘導性FT基因表現載體及誘導性rSt-1609大豆基因表現載體之T-DNA區域中之構造的概略圖。第5圖中的標記「*」顯示as-1位置之突變導入區域。
第6圖係顯示已導入銅離子誘導性FT基因表現載體之重組阿拉伯芥開花時間之不同的圖。
第7圖係為說明銅離子誘導性sGFP基因表現載體之T-DNA區域之構造的概略圖。
第8圖係顯示已導入銅離子誘導性sGFP基因表現載體之重組阿拉伯芥中的GFP之螢光發光狀態之圖。於各案例中，左圖顯示誘導表現處理後第0天之狀態，右圖顯示誘導表現處理後第3天之狀態。
<110>住友化學股份有限公司<120>在植物中表現由化學物質所誘導之外源基因的方法<130>551744 <150>JP 2007-058307 <151>2007-03-08 <150>JP 2007-195782 <151>2007-07-27 <150>JP 2008-001027 <151>2008-01-08 <160>53 <210>1 <211>26 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>1<210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>2<210>3 <211>28 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>3<210>4 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>4<210>5 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>5<210>6 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>6<210>7 <211>21 (212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>7<210>8 <211>31 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>8<210>9 <211>35 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>9<210>10 <211>15 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為轉接子所設計之寡核苷酸引子<400>10<210>11 <211>12 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為轉接子所設計之寡核苷酸引子<400>11<210>12 <211>51 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子<400>12<210>13 <211>48 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子<400>13<210>14 <211>32 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>14<210>15 <211>23 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>15<210>16 <211>27 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>16<210>17 <211>27 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>17<210>18 <211>26 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>18<210>19 <211>27 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>19<210>20 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>20<210>21 <211>35 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>21<210>22 <211>16 <212>DNA <213>人工序列<220> <223>為被插入之DNA片段所設計之寡核苷酸引子<400>22<210>23 <211>16 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為被插入之DNA片段所設計之寡核苷酸引子<400>23<210>24 <211>35 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為被取代之DNA片段所設計之寡核苷酸引子<400>24<210>25 <211>35 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為被取代之DNA片段所統計之寡核苷酸引子<400>25<210>26 <211>18 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>26<210>27 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>27<210>28 <211>16 <212>DNA <213>人工序列<220> <223>為TaqMan探針所設計之寡核苷酸<400>28<210>29 <211>20 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>29<210>30 <211>19 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>30<210>31 <211>14 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為TaqMan探針所設計之寡核苷酸<400>31<210>32 <211>20 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>32<210>33 <211>22 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>33<210>34 <211>17 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為TaqMan探針所設計之寡核苷酸<400>34<210>35 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>35<210>36 <211>28 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>36<210>37 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>37<210>38 <211>29 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>38<210>39 <211>29 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>39<210>40 <211>25 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>40<210>41 <211>25 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>41<210>42 <211>25 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>42<210>43 <211>33 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>43<210>44 <211>30 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>44<210>45 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>45<210>46 <211>26 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>46<210>47 <211>28 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>47<210>48 <211>32 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>48<210>49 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<220>.<223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>49<210>50 <211>27 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>50<210>51 <211>97 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸<400>51<210>52 <211>97 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸<400>52<210>53 <211>30 <212>DNA <213>人工序列<220><223>為PCR所設計之寡核苷酸引子<400>53
無元件符號

Claims (5)

  1. 一種在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因的方法，其包括以銅離子活化由不同於該標的外源基因之外源基因所編碼之轉錄因子，以藉由該標的外源基因所包含的具有啟動子功能之區域來誘導該標的外源基因轉錄之活化，其中，編碼該轉錄因子之核苷酸序列係包含於基因構築體中，該基因構築體係經建構成包括位於該標的外源基因所包含的具有啟動子功能之區域下游之任意外源基因之5’-非轉譯區的核苷酸序列，及位於編碼該轉錄因子之該核苷酸序列之下游之編碼轉錄活化區域之核苷酸序列，且其中，該轉錄活化區域係為不同於該轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域，其中，該5’-非轉譯區之該核苷酸序列係選自由下列關於5’-非轉譯區之核苷酸序列所組成之群組者：(1)自煙草嵌紋病毒屬之病毒基因之Ω序列所衍生之核苷酸序列；及(2)自蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之To71序列所衍生之核苷酸序列，編碼該轉錄因子之該核苷酸序列係：自編碼酵母菌ACE1之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列，以及編碼該轉錄活化區域之該核苷酸序列係：自編碼單純性疱疹病毒轉錄因子VP16之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該基因構築體係經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列上游之任意啟動子。
  3. 一種在植物中表現由化學物質所誘導之標的外源基因的基因構築體，其係可建構地製備以具有：(a)標的外源基因，包括具有啟動子功能之區域及編碼標的外源蛋白質之構造基因區域；(b)編碼由不同於該標的外源基因之外源基因所編碼之轉錄因子的核苷酸序列，其中，該轉錄因子可被銅離子活化；(c)位在具有該標的外源基因所包含之啟動子功能之區域下游之任意外源基因之5’-非轉譯區之核苷酸序列；以及(d)位於編碼該轉錄因子之該核苷酸序列之下游之編碼轉錄活化區域之核苷酸序列，其中，該轉錄活化區域係為不同於該轉錄因子之轉錄因子的轉錄活化區域，其中，該5’-非轉譯區之該核苷酸序列係選自由下列關於5’-非轉譯區之核苷酸序列所組成之群組者：(1)自煙草嵌紋病毒屬之病毒基因之Ω序列所衍生之核苷酸序列；及(2)自蕃茄嵌紋病毒之130k/180k基因之To71序列所衍生之核苷酸序列， 該轉錄因子之該核苷酸序列係：自編碼酵母菌ACE1之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列，以及編碼該轉錄活化區域之該核苷酸序列係：自編碼單純性疱疹病毒VP16轉錄因子之轉錄活化區域之核苷酸序列所衍生之核苷酸序列。
  4. 如申請專利範圍第3項之基因構築體，其係為經建構成額外包括位於編碼該轉錄因子之核苷酸序列上游之任意啟動子之基因構築體。
  5. 一種獲得外源蛋白質之方法，其係包括自轉形植物中回收標的外源蛋白質，其中該轉形植物係導入有如申請專利範圍第3或4項中之基因構築體。
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