TWI471312B

TWI471312B - 吡唑衍生物，其製備及治療用途

Info

Publication number: TWI471312B
Application number: TW99121891A
Authority: TW
Inventors: Pierre Yves Abecassis; Pascal Desmazeau; Michel Tabart
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2015-02-01
Also published as: JP2012531466A; CR20110701A; MA33500B1; MX2012000267A; AU2010267824A1; US20120270918A1; FR2947546A1; TW201107298A; NI201200001A; WO2011001122A3; CA2767096A1; EP2448924B1; UY32757A; EA020364B1; SG177463A1; UA106500C2; ECSP12011569A; HK1169387A1; CO6480992A2; IL217300A0

Description

吡唑衍生物，其製備及治療用途

本發明係關於吡唑衍生物，其製備及其治療用途。

更特定言之，根據第一態樣，本發明係關於經由調節蛋白質(特定言之，為激酶)活性而具有抗癌活性之新穎特定之經取代吡唑。

蛋白質激酶係一種催化特定蛋白質殘基(諸如酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基)之羥基進行磷酸化的酵素家族。此等磷酸化可大幅改變蛋白質功能；因此，蛋白質激酶在調節各種細胞過程，尤其包括新陳代謝、細胞增殖、細胞分化、細胞遷移或細胞存活中扮演重要角色。在其中涉及蛋白質激酶活性之多種細胞功能中，某些過程代表特別適合治療癌症及其他疾病之目標。

因此，本發明之一目的係一種特別藉由對激酶之作用而具有抗癌活性之組合物。在需要調節活性之激酶中，可提及KDR、Tie2、VEGFR-1(FLT1)、VEGFR-3(FLT4)、PDGFR及FGFR。以激酶KDR及/或Tie2較佳。

對應於以下通式(I)之化合物係自以WO 08/065282號公開之專利申請案中已知：

其中：

1)　A與Ar係獨立選自由以下構成之群：芳基、雜芳基、經取代之芳基、經取代之雜芳基；

2)　L係選自由以下構成之群：NH-CO-NH及O-CO-NH；

3)　R1係選自由以下構成之群：H、R₆ 、COR₆ 、SO₂ R₆ ，其中R₆ 係選自H、OR₇ 、NR₈ R₉ 、烷基、環烷基、雜環基、經取代之雜環基、芳基、經取代之芳基、雜芳基及經取代之雜芳基，其中R₇ 係選自H、苯基及烷基，及其中R₈ 及R₉ 係獨立地選自由H、烷基、環烷基、雜環基、經取代之雜環基、芳基、經取代之芳基、雜芳基及經取代之雜芳基構成之群，或，R₈ 及R₉ 係連接在一起形成含0至3個選自O、S及N之雜原子的飽和5至8員環；

4)　X係選自由以下構成之群：O及NH；

5)　R₃ 係選自由以下構成之群：H、烷基、經取代之烷基、環烷基、經取代之環烷基；

6)　R₄ a係選自由以下構成之群：H及(C₁ -C₄ )烷基；

7)　R₄ b係選自由以下構成之群：H及(C₁ -C₄ )烷基；

8)　R₅ 係選自由以下構成之群：H、鹵素、R₁₀ 、CN、O(R₁₀ )、OC(O)(R₁₀ )、OC(O)N(R₁₀ )(R₁₁ )、OS(O₂ )(R₁₀ )、N(R₁₀ )(R₁₁ )、N=C(R₁₀ )(R₁₁ )、N(R₁₀ )C(O)(R₁₁ )、N(R₁₀ )C(O)O(R₁₁ )、N(R₁₂ )C(O)N(R₁₀ )(R₁₁ )、N(R₁₂ )C(S)N(R₁₀ )(R₁₁ )、N(R₁₀ )S(O₂ )(R₁₁ )、C(O)(R₁₀ )、C(O)O(R₁₀ )、C(O)N(R₁₀ )(R₁₁ )、C(=N(R₁₁ ))(R₁₀ )、C(=N(OR₁₁ ))(R₁₀ )、S(R₁₀ )、S(O)(R₁₀ )、S(O₂ )(R₁₀ )、S(O₂ )O(R₁₀ )、S(O₂ )N(R₁₀ )(R₁₁ )；其中各R₁₀ 、R₁₁ 、R₁₂ 係獨立地選自由H、烷基、伸烷基、炔基、芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、經取代之烷基、經取代之伸烷基、經取代之炔基、經取代之芳基、經取代之雜芳基、經取代之環烷基、經取代之雜環基構成之群。

在此專利案中，較佳地，X係O，R₃ 係甲基、R₄ a及R₄ b係H；L係NHCONH；A係苯基；Ar係苯基；但在此申請案中，無實例描述Ar之取代及其於藥物動力學上之作用。

本發明之一主題係包括於先前申請案中對應於式(I)之兩種化合物：

其中：X表示Cl或F。

式(I)化合物可呈鹼或酸加成鹽形式存在。此等加成鹽屬於本發明。

呈如下所示兩種互變異構形式的化合物屬於本發明：

此等鹽可由醫藥可接受鹽製備，但例如用於純化或單離式(I)化合物之其他酸的鹽亦屬於本發明。在可使用之該等鹽類中，可尤其提及鹽酸鹽。

式(I)化合物亦可呈水合物或溶劑化物之形式存在，亦即呈與一或多個水分子或與溶劑締合或組合之形式。此等水合物或溶劑化物亦屬於本發明。

在作為本發明主題之式(I)化合物中，可尤其提及下列化合物：

-　4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺及其鹽酸鹽；

-　4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺及其鹽酸鹽。

根據本發明，可根據以下方法製備通式(I)之化合物。

在以下反應圖中，未描述製備方法之起始化合物及反應物係可購得或於文獻中所述，或可根據其中所述方法或熟悉此項技術者所已知之方法製備。

根據本發明之另一態樣，本發明之另一主題係下式化合物：

與

其中X表示F或Cl。

此等化合物可用作式(I)化合物之合成中間物。

以下實例描述根據本發明之化合物之製備。此等實例並非限制且僅用於闡述本發明。

合成方法實例

實例1

4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺鹽酸鹽

在周溫下，於氬氛圍中，攪拌含1.64 g(3.48 mmol)4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺的50 ml乙醇懸浮液。然後，逐滴添加35 ml(35 mmol)含鹽酸之二乙醚(1 N)溶液。反應介質變為澄清溶液。在周溫下攪拌10小時後，在減壓下使用旋轉蒸發器蒸發溶劑。將所獲得殘質於50 ml二乙醚中攪拌30分鐘。

過濾及於烘箱中乾燥後，獲得1.8 g 4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺鹽酸鹽淺黃色晶體。

MS：滯留時間Tr(min)=1.01；[M+H]⁺ m/z=471；[M-H]^- m/z=469

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d )δppm 4.32(s,2 H) 6.89(寬d,J =9.6 Hz,1 H) 7.16(寬s,1 H) 7.18-7.61(m,4 H) 7.68(寬d,J =8.9 Hz,1 H) 7.86(寬s,1 H) 8.44(d,J =8.9 Hz,1 H) 8.81(寬m,1 H) 10.17(寬m,1 H)

熔點(Kofler)=177℃

4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H- 吡唑-3-甲醯胺

於回流下，加熱含5.9 g(9.5 mmol) 4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)與4.5 g(24 mmol)對甲苯磺酸的400 ml甲苯溶液2小時。沉降後，將甲苯溶液與黃色膠分離。以150 ml甲醇與500 ml乙酸乙酯稀釋該膠體。然後加入500 ml水。接著冷卻溶液，然後以100 ml氫氧化鉀水溶液(10 N)鹼化。沉降後，以400 ml乙酸乙酯與100 ml甲醇溶液萃取水相。合併有機相並以100 ml飽和氯化鈉溶液洗滌，經由硫酸鎂乾燥及在減壓下濃縮，得到淺黃色固體，其經200 g矽石純化，以80/10/10(體積比)二氯甲烷/甲醇/乙腈溶液洗脫：得到1.77 g呈白色固體形式之4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺。

MS：滯留時間Tr(min)=4.29；[M+H]⁺ m/z=471；[M-H]^- m/z=469

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d )δppm 4.19(d,J =6.7 Hz,2 H) 5.74(寬m,1 H) 6.80(寬d,J =9.6 Hz,1 H) 6.95-7.11(m,3 H) 7.24(未分辨之寬m,1 H) 7.42(dt,J =11.3,2.3 Hz,1 H)7.67(寬d,J =8.9 Hz,1 H)7.86(寬s,1 H) 8.44(d,J =8.9 Hz,1 H) 8.70(寬s 1 H) 9.92(寬s,1 H) 12.57(寬s,1 H)

熔點(Kofler)：220℃

4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)

在周溫下，於氬氛圍中，攪拌含10 g(32 mmol) 4-胺基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)鹽酸鹽及5.9 ml(35.2 mmol)二異丙基乙胺的300 ml四氫呋喃溶液。添加3.85 g(35 mmol)硫酸鎂及12.70 g(35.2 mmol)1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲。然後在回流下加熱反應混合物14小時。接著將混合物冷卻至25℃，然後緩慢地加入10.08 g(160 mmol)氰基硼氫化鈉。在周溫下攪拌12小時後，使用旋轉蒸發器將混合物濃縮至乾。在300 ml水及500 ml氫氧化鈉水溶液(1 N)下攪拌所得膠體。以1 L二氯甲烷攪拌此懸浮液30分鐘。經3號燒結玻璃過濾後，以2×500 m水沖洗所得固體，接著在40℃烘箱中真空乾燥。然後在高溫下，以800 ml甲醇再結晶固體，得到8.3 g呈白色粉末形式之4-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)。

MS：滯留時間Tr(min)=4.97；[M+H]⁺ m/z=621；[M-H]^- m/z=619

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d )δppm 3.73(s,3 H) 3.81(s,3 H) 4.19(d,J =6.7 Hz,2 H) 4.33(d,J =6.7 Hz,2 H) 5.71(寬t,J =6.7 Hz,1 H) 6.46(dd,J =8.3,2.3 Hz,1 H) 6.55(d,J =2.3 Hz,1 H) 6.80(寬d,J =9.6 Hz,1 H) 7.04(寬s,1 H) 7.08(s,1 H) 7.10(d,J =8.9 Hz,1 H) 7.43(dt,J =11.4,2.3 Hz,1 H) 7.67(寬d,J =8.9 Hz,1 H) 7.86(寬s,1 H) 7.94(寬t,J =6.7 Hz,1 H) 8.45(d,J =8.9 Hz,1 H) 8.62(未分辨之寬m,1 H) 9.79(未分辨之寬m,1 H) 12.60(未分辨之寬m,1 H)

熔點(Kofler)：168℃

1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲

在-10℃下，於氬氛圍中，攪拌含33.15 g(92.68 mmol)1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲之600 ml四氫呋喃溶液。接著，規則地「滴加」230 ml之20%濃度之二異丁基氫化鋁之甲苯溶液。周溫下攪拌反應混合物12小時。接著在-10℃下，添加額外的80 ml二異丁基氫化鋁。在周溫下攪拌14小時後，使用旋轉蒸發器濃縮反應介質至乾，得到稠油，將500 g冰及100 ml 100%乙酸緩慢攪拌加入此油中。過濾所得懸浮液。然後以2×800 ml乙酸乙酯稀釋固體並以600 ml飽和氯化鈉溶液洗滌有機溶劑，經由硫酸鎂乾燥，過濾，使用旋轉蒸發器濃縮至乾，並在40℃烘箱中真空乾燥，得到29.57 g淺黃色粉末形式之1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲。

MS：滯留時間Tr(min)=4.86；[M+H]⁺ m/z=361；[M-H]^- m/z=359

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d )δppm 7.35(ddd,J =8.4,2.3,1.8 Hz,1 H) 7.67-7.75(m,2 H) 7.78(t,J =1.8 Hz,1 H) 7.88(d,J =1.8 Hz,1 H) 8.45(d,J =8.8 Hz,1 H) 8.72(寬s,1 H) 9.98(d,J =1.8 Hz,1 H) 10.07(寬s,1 H)

1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲

在周溫下，於氬氛圍中攪拌含15 g(110.2 mmol) 5-氟-3-氰基苯胺之150 ml四氫呋喃溶液。接著，添加17.5 ml(121.22 mmol) 2-氯-4-三氟甲基苯基異氰酸酯。於回流下加熱反應介質3小時，接著使用旋轉蒸發器濃縮至乾。在高溫下，以60 ml乙酸乙酯再結晶所得固體殘質，以得到33.25 g呈白色固體形式之1-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲。

MS：滯留時間Tr(min)=4.97；[M+H]⁺ ：m/z=356

熔點(Kofler)：286℃

5-氟-3-氰基苯胺為商業產品。

4-胺基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)鹽酸鹽

在周溫下，攪拌含6.12 g(20 mmol)4-硝基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)之340 ml乙醇懸浮液。接著，以5分鐘時間添加15.8 g(70 mmol)氯化錫二水合物。在周溫下攪拌反應混合物14小時，然後使用旋轉蒸發器濃縮至乾。以330 ml飽和碳酸氫鈉水溶液及300 ml二氯甲烷攪拌所得殘質。沉澱後，以2×150 ml二氯甲烷萃取有機相。再合併有機相，以150 ml飽和氯化鈉溶液洗滌並經由硫酸鎂乾燥。使用旋轉蒸發器濃縮後，得到4.57 g略呈紫色之固體形式之4-胺基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)鹽酸鹽。

MS：EI：[M]⁺ . m/z=276；基峰m/z=151

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d )δppm 3.73(s,3 H) 3.81(s,3 H) 4.31(d,J =6.2 Hz,2 H) 4.56(未分辨之寬m,2 H) 6.46(dd,J =8.3,2.9 Hz,1 H) 6.55(d,J =2.9 Hz,1 H) 7.06-7.13(m,2 H) 7.84(t,J =6.2 Hz,1 H) 12.50(未分辨之寬m,1 H)

熔點(Buchi)：186℃

4-硝基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)

在周溫下，攪拌含14.65 g(76.4 mmol) 1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺二水合物及10.32 g(76.4 mmol) 1-羥基苯并三唑之50 ml二甲基甲醯胺溶液。添加11.7 g(70.03 mmol) 2,4-二甲氧基苄基胺，然後以小份添加10.2 g 4-硝基-3-吡唑甲酸。於周溫下攪拌16小時後，將反應介質傾入500 ml水中。過濾懸浮液，然後以2×250 ml水洗滌。在40℃烘箱中真空乾燥所得固體，以得到18.58 g呈白色固體形式之4-硝基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)。

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d) δppm 3.75(s,3 H) 3.80(s,3 H) 4.35(d，J =5.9 Hz,2 H) 6.50(dd,J =8.3,2.4 Hz,1 H) 6.56(d,J =2.4 Hz,1H) 7.21(d,J =8.3 Hz,1 H) 8.71(寬s,1 H)8.88(寬t,J =5.9 Hz,1 H) 14.13(未分辨之寬m,1 H)

MS(ES+/-)滯留時間Tr(min)=3.23；[M+H]⁺ m/z=307；[M-H]^- m/z=305

熔點(Kofler)：192℃

4-硝基-3-吡唑甲酸係商業產品。

實例2

4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺鹽酸鹽

在周溫下，於氬氛圍中，攪拌含1.85 g(0.40 mmol) 4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺之40 ml乙醇懸浮液。然後逐滴添加20 ml(40 mmol)鹽酸之二乙醚溶液(1 N)。反應介質變為澄清溶液。於周溫下攪拌12小時後，使用旋轉蒸發器減壓蒸發溶劑。在200 ml二乙醚中攪拌所得殘質30分鐘。

過濾及在烘箱中乾燥後，得到1.75 g淺黃色晶體形式之4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺鹽酸鹽。

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d6 ).δppm 4.24(s,2 H) 6.83(d,J =9.0 Hz,1 H) 7.08(s 1 H) 7.18(br. s.,1 H) 7.23(s,1 H) 7.35(br. s.,2 H) 7.42(dt,J =11.3,2.0 Hz,1 H) 7.54(d,J =8.8 Hz,1 H) 7.69(dd,J =11.2,1.5 Hz,1 H) 8.41(t,J =8.2 Hz,1 H) 8.99(s,1 H) 9.54(s,1 H)

MS：滯留時間Tr(min)=0.97；[M+H]⁺ m/z=455

熔點(Kofler)：184℃(伴隨分解)

4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺

在回流下加熱含22.3 g(36.89 mmol) 4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)及17.54 g(92.22 mmol)對甲苯磺酸之600 ml甲苯溶液14小時。沉降後，將甲苯溶液與黃色膠質分離。在280 ml水及100 ml氫氧化鈉(10 N)中攪拌該膠質2小時。過濾懸浮液。以3×350 m水沖洗所得固體，接著乾燥以得到乳狀固體，其經350 g矽石純化，以95/2.5/2.5(體積比)二氯甲烷/甲醇/乙腈溶液洗脫：得到3.85 g呈白色固體形式之4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-甲醯胺。

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d 6)δppm 4.18(d,J =5.9 Hz,2 H) 5.68-5.77(m,1 H) 6.80(d,J =8.8 Hz,1 H) 7.01-7.08(br. s.,1 H) 7.04(s,1H) 7.06(s,1 H) 7.24(br. s.,1 H) 7.40(dt,J =11.4,2.0 Hz,1 H) 7.54(d,J =8.3 Hz,1 H) 7.69(d,J =11.5 Hz,1 H)8.41(t,J =8.4 Hz,1 H) 8.92(br. s.,1 H) 9.40(br. s.,1 H) 12.55(br. s.,1 H)

MS：滯留時間Tr(min)=4.09；[M+H]⁺ m/z=455；[M-H]^- m/z=453

熔點(Kofler)：233℃

4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)

在周溫下，於氬氛圍中攪拌含11.40 g(36.45 mmol)4-胺基-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)鹽酸鹽及6.65 ml(40.09 mmol)二異丙基乙胺之360 ml四氫呋喃溶液。添加4.35 g(36.45 mmol)硫酸鎂及13.80 g(35.2 mmol)1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲。然後在回流下加熱反應混合物14小時。接著將混合物冷卻至25℃，然後緩慢地添加11.46 g(182.25 mmol)氰基硼氫化鈉。於周溫下攪拌72小時後，使用旋轉蒸發器將混合物濃縮至乾。使用400 ml水及500 ml氫氧化鈉溶液(1 N)攪拌所得膠。將此懸浮液攪拌1小時，然後經3號燒結玻璃過濾，以3×500 ml水沖洗所得固體，接著在40℃烘箱中真空乾燥，得到22.45 g呈粉紅色固體形式之4-{3-[3-(2-氟-4-三氟甲基苯基)脲基]-5-氟苄基胺基}-1H-吡唑-3-(2,4-二甲氧基苄基醯胺)。

¹ H NMR(500 MHz,DMSO-d 6)δppm 3.73(s,3 H)3.81(s,3 H) 4.18(d,J =6.3 Hz,2 H) 4.33(s,2 H)-5.70(t,J =6.2 Hz,1 H) 6.47(d,J =8.2 Hz,1 H) 6.55(s,1 H) 6.79(d,J =9.1 Hz,1 H) 7.05(s,1 H) 7.07-7.12(m,2 H) 7.41(d,J =11.3 Hz,1 H) 7.53(d,J =8.2 Hz,1 H) 7.68(d,J =11.3 Hz,1 H) 7.95(br. s.,1 H)-8.40(t,J =8.2 Hz,1 H) 9.25(br. s.,2 H) 12.52(br. s.,1 H)

MS：滯留時間Tr(min)=4.79；[M+H]⁺ m/z=605；[M-H]^- m/z=603

熔點(Kofler)：152℃

1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲

在-2℃下，於氬氛圍中攪拌含11.90 g(34.87 mmol) 1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲之150 ml四氫呋喃溶液。接著，規則地「滴加」86 ml之20%濃度之二異丁基氫化鋁之己烷溶液。在周溫下攪拌反應混合物12小時。接著，在-2℃下添加額外的60 ml二異丁基氫化鋁。在周溫下攪拌3小時後，使用旋轉蒸發器將反應介質濃縮至乾，以得到稠油，將500 g冰及300 ml 100%乙酸緩慢地加入此油中，同時攪拌。過濾所得懸浮液。以4×150 ml水洗滌所得固體，離心並在40℃烘箱中真空乾燥，以得到13.95 g呈淺黃色固體形式之1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氟-5-甲醯基苯基)脲。

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d 6)δppm 7.33-7.38(m,1 H) 7.57(d,J =8.8 Hz,1 H) 7.69-7.75(m,2 H)-7.79(s,1 H) 8.41(t,J =8.3 Hz,1 H) 9.05(br. s.,1 H) 9.65(s,1 H) 9.98(d,J =1.7 Hz,1 H)

MS：滯留時間Tr(min)=4.62；[M+H]⁺ m/z=345；[M-H]^- m/z=343

熔點(Kofler)：247℃

1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲

在周溫下，於氬氛圍中，攪拌含6.15 g(45.18 mmol) 5-氟-3-氰基苯胺之90 ml四氫呋喃溶液。滴加4.3 ml(36.14 mmol)雙光氣，然後加入30 ml(135.54 mmol)三乙胺。反應混合物回流3小時後，緩慢地加入含7.10 g(39.64 mmol) 4-胺基-3-氟三氟甲基苯之10 ml四氫呋喃溶液。再回流2小時。然後將介質於100 ml水中攪拌，接著以100 ml乙酸乙酯萃取。以100 ml飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，經由硫酸鎂乾燥並使用旋轉蒸發器濃縮至乾。在高溫下，於90 ml乙腈中使所得固體殘質再結晶，以得到10.35 g呈乳狀固體形式的1-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-(3-氰基-5-氟苯基)脲。

¹ H NMR(400 MHz,DMSO-d 6)δppm 7.47(d,J =8.3 Hz,1 H) 7.57(d,J =8.6 Hz,1 H) 7.69(s,1 H) 7.70-7.75(m,2 H) 8.37(t,J =8.4 Hz,1 H) 9.17(br. s.,1 H) 9.63(br. s.,1 H)

MS：滯留時間Tr(min)=1.1；[M+H]⁺ ：m/z 341。

熔點(Kofler)：253℃

本發明之產物可用作藉由激酶催化之一或多種反應之抑制劑。本發明產物尤其適用作KDR及/或Tie2激酶之抑制劑。

選擇此等激酶之原因係如下：

KDR

KDR(激酶插入功能域受體)，亦稱為VEGF-R2(血管內皮生長因子受體2)係主要於內皮細胞中表現。此受體結合促血管生長因子VEGF，並因此經由其細胞內激酶功能域之活化用作轉導信號介體。在外源VEGF(血管內皮生長因子)之存在下，直接抑制VEGF-R2激酶活性可減少血管生成之現象(Strawn等人，Cancer Research，1996，第56卷，第3540-3545頁)。使用VEGF-R2突變體可尤其證明此過程(Millauer等人，Cancer Research，1996，第56卷，第1615-1620頁)。VEGF-R2受體在成年人中似乎除了與VEGF血管生成活性相關之功能以外不具有其他功能。除了其在動態血管生成過程中之此重要角色以外，最近結果顯示，VEGF之表現有助於腫瘤細胞於化療及放療後之存活，強調了KDR抑制劑與其他製劑之潛在協同作用(Lee等人， Cancer Research，2000，第60卷，第5565-5570頁)。

Tie2

Tie-2(TEK)係針對內皮細胞之酪胺酸激酶受體家族之成員之一。Tie2係具有酪胺酸激酶活性之第一受體，刺激受體自體磷酸化及細胞信號傳導之其激動劑(血管生長素1或Ang1)[S. Davis等人(1996) Cell 87,1161-1169]及其拮抗劑(血管生長素2或Ang2)[P.C. Maisonpierre等人(1997) Science 277,55-60]兩者為已知。血管生長素1在血管新生之最後階段與VEGF具有協同作用[Asahara T.,Circ. Res.(1998) 233-240]。Tie2或Ang1表現之剔除基因實驗及轉基因操作導致動物出現血管形成缺陷[D.J. Dumont等人(1994) Genes Dev. 8,1897-1909及C. Suri(1996) Cell 87,1171-1180]。Ang1結合於其受體導致Tie2激酶功能域之自體磷酸化，其係新血管生成及血管募集外皮細胞及平滑肌細胞並與其相互作用時所必需；此等現象有助於新形成血管的成熟及穩定[P.C. Maisonpierre等人(1997) Science 277,55-60]。Lin等人(1997) J. Clin. Invest. 100,8: 2072-2078及Lin P.(1998) PNAS 95,8829-8834已顯示在感染腺病毒或將Tie-2(Tek)之胞外功能域注入黑素瘤及乳腺瘤異種移植模型期間，抑制腫瘤生長及血管形成，及減少肺轉移。

由於以下原因，Tie2抑制劑可用於不當發生新血管形成或血管新生作用之情況中，亦即常見於癌症中，及特定言之諸如卡波西氏肉瘤或嬰幼兒血管瘤、風濕性關節炎、骨關節炎及/或其相關疼痛、諸如出血性直腸結腸炎或克隆氏病之腸炎、諸如與年齡相關之黃斑變性、糖尿病性視網膜病變之眼睛病變，慢性炎症及牛皮癬之癌症。

血管新生作用係自既有血管產生新毛細血管之過程。腫瘤生長所必需之腫瘤血管新生(形成新血管)亦係其到處轉移之一個重要因素(Oncogene. 2003 May 19;22(20):3172-9;Nat. Med. 1995 Jan;1(1):27-31)。

新血管形成歸因於內皮細胞在癌細胞與基質細胞所分泌血管新生因子的影響下之遷移及隨後之增殖及分化(Recent Prog. Horm. Res. 2000;55:15-35;35-6)。

血管生長素1/Tie2受體系統藉由募集周圍血管內皮細胞以穩定血管，而在血管成熟中扮演主要角色(Cell. 1996 Dec. 27;87(7): 1161-9,Recent Prog. Horm. Res. 2004;59:51-71)。因此，已顯示投與Tie-2受體之胞外功能域(exTek)之可溶性重組體形式可抑制鼠科腫瘤模型中之腫瘤血管生成及轉移性生長(Pengnian Lin,Jake A. Buxton,Ann Acheson,Czeslaw Radziejewski,Peter C. Maisonpierre,George D. Yancopoulos,Keith M. Channon,Laura P. Hale,Mark W. Dewhirst,Samuel E. George and Kevin G. Peters,Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998 Jul 21;95(15): 8829-34;Cecilia Melani,Antonella Stoppacciaro,Chiara Foroni,Federica Felicetti,Alessandra Carand Mario P. Colombo,Cancer Immunol Immunother. 2004 Jul;53(7): 600-8)。培養內皮細胞期間，刺激Tie-2會激活細胞增殖及遷移中所涉及之p42/p44路徑之PI3激酶路徑；激活PAF之合成之PI3激酶路徑(Cell Signal. 2006 Apr 14;ahead of print)，其係涉及促炎活性之路徑。刺激Tie2會激化Akt路徑並抑制細胞凋亡(Laura M DeBusk,Dennis E Hallahan,Pengnian Charles Lin,Exp. Cell Res. 2004 Aug. 1;298(1): 167-77)，因其係已知對細胞存活具有重要性的轉導路徑。

添加exTek(Tie2之可溶性受體)可抑制內皮細胞於基質膠(Matrigel)上形成偽小管(Cecilia Melani,Antonella Stoppacciaro,Chiara Foroni,Federica Felicetti,Alessandra Carand Mario P. Colombo,Cancer Immunol Immunother. 2004 Jul;53(7): 600-8)。此等研究顯示，在成人組織中形成血管芽的第一階段期間需要Tie-2/血管生長素系統，且Tie-2受體之功能之一係在血管形成期間提高內皮細胞之存活。此外，血管生長素-1刺激淋巴內皮細胞增生及淋巴管形成(新淋巴管的形成)，其係有利於轉移生長之入侵路徑(Tohru Morisada,Yuichi Oike,Yoshihiro Yamada,Takashi Urano,Masaki Akao,Yoshiaki,Kubota,Hiromitsu Maekawa,Yoshishige Kimura,Masako Ohmura,Takeshi Miyamoto,Shiro Nozawa,Gou Young Koh,Kari Alitalo and Toshio Suda,Blood. 2005 Jun 15;105(12): 4649-56)。

可影響血管新生作用之酶亦可提及PDGFRβ(Guzman and Laurence H. Hurley,Univ. of Arizona,Molecular Cloning of the Human PDGFR-beta Promoter and Targeting the G-Quadruplex-Forming Region to Control Gene Expression;Biomedical Drug Discovery,Genomics/Gentics,Therapeutic)、FGFR1(Somaia Elbauomy Elsheikh,Andrew R Green,¹ Maryou BK Lambros,Nicholas C Turner,Matthew J Grainge,³ Des Powe,1 Ian O Ellis,and Jorge S Reis-Filho,FGFR1 amplification in breast carcinomas: a chromogenic in situ hybridization analysis)；FLT1(Shibuya M(2007),「Vascular endothelial growth factor receptor-1(VEGFR-1/Flt-1): a dual regulator for angiogenesis」,Angiogenesis,9(4): 225-30;discussion 231)及VEGFR3(Tamela,T等人，Blocking VEGFR-3 suppresses angiogenic sprouting and vascular network formation,Nature 454,656-660(20058))。

在多種實體腫瘤的進展中，血管新生過程亦扮演主要角色。此外，已顯示當原發性腫瘤之血管化增加時，轉移發作之機率會極大幅增加(Br. J. Cancer. 2002 May 20;86(10): 1566-77)。

最近亦記錄促血管生成劑於白血病及淋巴瘤中之潛在作用。具體言之，通常已報導在此等病理中之細胞純系可被免疫系統天然破壞，或恢復為有利於其存活及隨後增生之血管新生表現型。表現型之此變化係由血管生成因子之過度表現(尤指巨噬細胞)及/或胞外基質之此等因子之移動引起(Thomas DA,Giles FJ,Cortes J,Albitar M,Kantarjian HM.,Acta Haematol.,(2001),vol. 207,106-190頁)。

在CML(慢性髓性單細胞性白血病)中，骨髓之血管新生過程與「髓質外疾病」之間存在相關性。各種研究證實，抑制血管新生作用可能代表一種針對此病理之治療選擇(Leuk. Res. 2006 Jan;30(1): 54-9;Histol. Histopathol. 2004 Oct.;19(4): 1245-60)。此外，已強烈顯示，患有多發性骨髓瘤之病患中之骨髓血管新生作用之發展涉及Tie2/血管生長素系統之活化(Blood,2003 Jul 15;102(2): 638-45)。

測定化合物活性-實驗方案

1. KDR

化合物之抑制作用係在受質之活體外磷酸化測試中經由閃爍技術(基本快速分析板型96孔板)測定。

人類KDR酶之細胞質功能域(殘基790至1356)係以GST融合之形式選殖至pFastBac桿狀病毒表現載體中。蛋白質係在SF21細胞中表現、純化並藉由自體磷酸化活化。受質係由呈GST融合蛋白質之形式表現及純化之PLCγ的殘基658至850構成。

KDR激酶活性係在20 mM MOPS、10 mM MgCl₂ 、10 mM MnCl₂ 、1 mM DTT的pH=7.4之緩衝液中測定。先以100% DMSO稀釋化合物，然後於30% DMSO/70%緩衝液中製成10X溶液。添加10 μl 10X溶液，然後在4℃下添加70 μl含150 ng(1.6 pmol) KDR酶之緩衝液。藉由加入20 μl含2 μg(41 pmol)PLCγ受質、0.5 μCiγ³³ P[ATP]及2 μM低溫ATP之溶液而開始反應。攪拌該分析板。在37℃下培養30分鐘後，排除培養緩衝液，並以300 μl PBS洗滌該等孔三次。利用Trilux-βWallac放射性計數器測定每一孔之放射性。

藉由測定含ATP(放射性標記及低溫)與受質且不含酶與化合物之四個不同孔之放射性測定背景雜訊。測定含所有試劑但沒有化合物之四個不同孔之對照活性。

本發明化合物對KDR活性的抑制性係以相對於無化合物下所測定對照活性的抑制百分比來表示。

2. Tie2

在受質之活體外磷酸化測試中，經由閃爍技術(基本快速分析板型96孔板)測定化合物之抑制作用。

將對應於胞內功能域774-1124之胺基酸的人類Tie2編碼序列呈GST融合蛋白質之形式引入pFastBacGT桿狀病毒表現載體中。藉由自體磷酸化純化及活化GST-Tie2。受質係由呈GST融合蛋白質之形式表現及純化的PLCγ之殘基658至850構成。

Tie2激酶活性係在含10 mM MgCl₂ 、10 mM MnCl₂ 及1 mM DTT的MOPS 20 mM pH 7.4緩衝液中測定。先以100% DMSO稀釋化合物，然後於30% DMSO/70%緩衝液中製成10X溶液。添加10 μl 10X溶液，然後在4℃下添加70 μl含100 ng(1.5 pmol)Tie2酶之緩衝液。藉由加入20 μl含2 μg(41 pmol)PLCγ受質、0.5 μCi γ³³ P[ATP]及2 μM低溫ATP之溶液而開始反應。攪拌該分析板。在37℃下培養30分鐘後，排除培養緩衝液，並以300 μl PBS洗滌該等孔三次。利用Trilux-βWallac放射性計數器測定每一孔之放射性。

計算Tie2活性之抑制性並以相對於無化合物下測定之對照活性之抑制百分比表示。

3.　藉由在PFCγ受質之存在下測定、放射性標記FLT1激酶自體磷酸化活性來篩選分子

FLT1之激酶活性係依抑制Tie2之相同方法，以每孔含13 nM FLT1酶之70 μl激酶組成的反應混合物測定。

計算FLT1活性之抑制性，並以相對於無化合物下測定之對照活性之抑制百分比表示。

分子之各濃度之抑制百分比係如下計算：

抑制%=(經處理孔之平均CPM-對照孔之平均CPM)/(未經處理孔之CPM-對照組之平均CPM)×100。

4.　藉由在PLCγ受質存在下測定、放射性標記PDGFR激酶自體磷酸化活性來篩選分子

類似FLT1酶之方法，但改用16 nM PDGFR酶替代13 nM Flt1，且在96孔板中混合18 μl(純度為80%)之GST-PDGFR酶(4 mg/ml，批次VLT802)測試。

5.　藉由在PLCγ受質存在下測定、放射性標記FGFR激酶磷酸化活性來篩選分子

類似FLT1酶之方法，但改用27 nM FGFR酶替代13 nM Flt1，且在96孔板中混合18 μl(純度為100%)之GST-FGFR酶(1.1 mg/ml，批次JCE3666)進行測試。

結果：

本發明實例之化合物針對KDR及/或TIE2抑制50%激酶活性時之濃度通常介於0.1 nM與2 μM之間，較佳介於0.1 nM與500 nM之間，及更佳介於0.1 nM與50 nM之間。提供下表1之數值以供說明。

根據本發明之化合物係可測定其等肝清除率之藥理學測試之主體。

利用人類肝細胞評估化合物之內在清除率：實驗方案。

NB：採用下述針對人類肝細胞之活體外試驗預測重要之藥物動力學參數：指定化合物投與人類時之該指定化合物之肝臟代謝。

培養條件：

人類肝細胞之低溫保存製劑(來自IVT：IVT-TLN-180608來自In Vitro Technologies,inc. Baltimore,Maryland,USA)之培養及人類肝細胞之新鮮製劑(來自Biopredic: HEP200239)之培養係在包含48個經膠原蛋白塗覆之孔之分析板中進行。

實驗條件：

藉由將含或不含10 μM酮康唑(ketoconazole)(CYP3A4抑制劑)之最終濃度為5 μM之化合物加入培養基中而開始動力學。培養體積為100 μl，培養時間：0-24小時(標準動力學點：0-0.5-1-2-4-6-8-24小時)。

藉由添加乙腈/水停止動力學，以皮質酮作為內標準物。分離細胞，然後溶解。合併胞內與胞外介質，並冷凍(-20℃)儲存直至進行LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析方法：

解凍合併之胞外與胞內介質，進行超音波作用，渦流攪拌並於3000 g離心20分鐘。注入上清液並藉由LC-MS/MS分析。

數據處理及「分類」

計算P450細胞色素之特異性代謝物之最大初始活體外速率，並以nmol/小時/百萬個細胞表示。

V=[T(n)時之濃度-T(n-1)時之濃度]/[T(n)-T(n-1)]

測定內在清除率，並以ml/小時/百萬個細胞表示

Cl_int =劑量/AUC_{0-24 h}

劑量=T(0)時之用量(nmol/百萬個細胞)

AUC_{0-24 h} ：由WinNonlin計算，以經靜脈注射團藥之模型進行非區間式分析。

內在清除率之分類係定義如下：

Cl_int <0.040 ml.h^-1 .10^-6 個細胞：低內在清除率

0.040<Cl_int <0.120 ml.h^-1 .10^-6 細胞：中等內在清除率

Cl_int >0.040 ml.h^-1 .10^-6 細胞：高內在清除率

捐贈者之統計資料：

低溫保存之人類肝細胞之製劑：

來自IVT：‧IVT，TLN群：男性，白種人，25歲

新鮮人類肝細胞之製劑：

來自Biopredic：‧HEP200239：女性，未知，58歲

在此測試中，實例1所述化合物之內在清除率值係0.057 ml/小時/百萬細胞(該數值歸類為中等值，個體間之變化性低)。

實例2所述化合物之內在清除率值係0.055 ml/小時/百萬個細胞(數值歸類為中間值，個體間之變化性低)。

其他測試包括測定本發明化合物對結腸腫瘤之活體內活性。

針對B16黑素瘤研究本發明化合物對結腸腫瘤之此活性。以來自申請案WO 08/065282之實例19之產物進行對照試驗。

可藉由各種標準物於活體內測定產物有效性，其可藉由腫瘤抑制之百分比% T/C來決定，其代表在第12治療日或第13治療日時，治療組(T)之腫瘤平均重量與對照組(C)之腫瘤平均重量比例。當T/C比小於42%時，認為該產物具活性，且當T/C小於10%時，則該產物具有高抗腫瘤活性。(Corbett TH等人，Cancer Research,42,1707-1715(1982))。

為證實化合物之有效性，亦可測定log₁₀ 細胞死亡率，其係根據以下公式進行測定：

log₁₀ 細胞死亡率=T-C(天數)/3.32×T_d

其中T-C表示治療組(T)之腫瘤與對照組(C)之腫瘤的細胞生長達到預設定值(例如750 mg)之延遲程度，其係以天數計之平均時間表示，而T_d 表示對照組動物之腫瘤體積達到兩倍時所需之天數時間[T.H. Corbett等人，Cancer,40 ,2660.2680(1977);F.M. Schabel等人，Cancer Drug Development,Part B,Methods in Cancer Research,17 ,3-51,New York,Academic Press Inc.(1979)]。若log₁₀ 細胞死亡率大於或等於0.7，則認為該產物具活性。若log₁₀ 細胞死亡率大於2.8，則認為該產物極具活性。

化合物對實體腫瘤之有效性可依下列方式實驗測得：進行實驗之動物(通常為C57BL/6雌性小鼠)係在第0日，於雙側皮下植入30至60 mg B16(參考腫瘤)人類腫瘤片段。將長有腫瘤之動物隨機分組後，才進行各種治療及對照處理。本發明之腫瘤治療法中，治療係自移植3至4天後之初期開始治療。接受該化合物治療之動物之體重為約20 g。長有腫瘤的動物亦接受僅使用賦形劑之相同處理，以使賦形劑之毒性效應與化療對腫瘤之實際效應分離。依列表中標示之劑量經口投與化合物及列表中標示之賦形劑，每日投與兩次。此等投藥法隨研究而定，在腫瘤移植後進行8至11天。

每週測定腫瘤兩至三次，直至腫瘤達到約2 g或直至動物死亡(若在腫瘤達到2 g前即死亡時)。在動物死亡時，進行驗屍。

根據所記錄之各種參數測定抗腫瘤活性。

例如，下表出示本發明化合物在最適宜劑量下獲得之結果。

因此，本發明之一主題係一種包含式(I)化合物或其與醫藥可接受酸的加成鹽之藥劑。

根據本發明之另一態樣，本發明係關於以對應式(I)之化合物在治療癌症中作為藥劑之用途。根據本發明之化合物可用於製備藥劑，特定言之抑制血管新生之藥劑。

此等藥劑特別適用於癌症腫瘤，尤其實體腫瘤之治療用途。

根據本發明之另一態樣，本發明係關於含有作為有效成份之根據本發明化合物的醫藥組合物。此等醫藥組合物含有有效劑量之至少一種根據本發明化合物，或該化合物之醫藥可接受鹽，及至少一種醫藥可接受賦形劑。

根據醫藥劑型及所需投與模式，自熟習此項技術者所已知之常用賦形劑中選擇該等賦形劑。

在用於經口、舌下、皮下、肌內、靜脈內、外用、局部、經氣管內、經鼻內、經皮或直腸投與的本發明醫藥組合物中，上式(I)之有效成份或其鹽可與標準醫藥賦形劑形成混合物，呈單位投藥形式投與動物及人類，用於治療上述病症或疾病。

適宜單位投藥形式包括諸如錠劑、軟式或硬式膠囊、粉劑、顆粒及口服溶液或懸浮液之經口形式，舌下或頰內投藥形式及經皮、皮下、肌內或靜脈內投藥形式。

就舉例而言，呈錠劑形式的根據本發明化合物之單位投藥形式可包含以下組份：

根據本發明化合物　50.0 mg

甘露醇　223.75 mg

交聯羧甲基纖維素鈉　6.0 mg

玉米澱粉　15.0 mg

羥基丙基甲基纖維素　2.25 mg

硬脂酸鎂　3.0 mg

當經口給予時，每天投與之有效成份劑量可達到1200 mg/kg，可服用一或多次。

可能出現需要較高或較低劑量才適宜之特定情況；該等劑量仍不脫離本發明之內容。依據一般操作法，每位患者之適宜劑量可由醫師依據投與方法及該患者之體重及反應而決定。

根據本發明之另一態樣，本發明亦係關於一種用於治療以上所指示病理之方法，其包括向病患投與有效劑量根據本發明之化合物或其醫藥可接受鹽。

實例1對B16早熟小鼠黑素瘤之評估

BCM-1948。腫瘤倍增時間=0.8天。調配物：實例1=98% PEG200、2% PS80。所用縮寫：BWC=體重變化，HNTD=最高無毒劑量，HDT=最高測試劑量。^a 第9及第10天時每天一次。^b 第7天劑量意外減少7%。^c 第8天因一隻意外死亡而以9隻小鼠進行計算。

p.o.=經口

實例2對B16早熟小鼠黑素瘤之評估

BCM-1979。腫瘤倍增時間=0.9天。賦形劑組之腫瘤達到740 mg之平均時間=11.9天。調配物：實例2=20%辛酸癸酸聚乙二醇甘油脂、5%聚乙二醇硬脂酸酯、75%葡萄糖、5%水。所用縮寫：BWC=體重變化，HNTD=最高無毒劑量，HDT=最高測試劑量。

p.o.=經口

來自WO 08/065282之實例19對B16早熟小鼠黑素瘤之評估

BCM-1755。腫瘤倍增時間=1.1天。調配物：實例3=40%Captisol水溶液，pH=3。

治療時間：實例3=11天。所用縮寫：HDT=最高測試劑量。^a 第3天，每日治療一次小鼠。^b 第3、4及11至13天，藉由HPLC分析母液後再評估總劑量。

^c 意外死亡，計算6隻動物之效力。

Claims

一種呈鹼或酸加成鹽形式之式(I)化合物：其中：X表示氯或氟。
如請求項1之呈鹼或酸加成鹽形式之式(I)化合物，其特徵為X表示氯。
一種製備如請求項1及2中任一項之式(I)化合物之方法，其特徵為由以下化合物：與化合物：在含二異丙基乙胺之惰性介質存在下反應，然後在第二步驟中，藉由對甲苯磺酸脫除胺之保護基。
如請求項3之方法，其特徵為該惰性介質係非極性非質子惰性介質。
如請求項4之方法，其特徵為該惰性介質係四氫呋喃。
一種下式化合物：其中X表示氯或氟。
一種下式化合物：其中X表示氯或氟。
一種藥劑，其特徵為其包含如請求項1及2中任一項之式(I)化合物或此化合物與醫藥可接受酸之加成鹽。
一種醫藥組合物，其特徵為其包含如請求項1及2中任一項之式(I)化合物或此化合物之醫藥可接受鹽及至少一種醫藥可接受賦形劑。
如請求項1及2中任一項之式(I)化合物，其係於治療癌症中用作藥劑。