TWI434852B - 調控硬骨魚類免疫反應之胜肽及其相關應用 - Google Patents

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調控硬骨魚類免疫反應之胜肽及其相關應用

本發明係關於一種調控免疫反應之胜肽及其相關應用，特別關於一種調控硬骨魚類免疫反應之胜肽及其相關應用。

過去控制魚類疾病發生的方法主要以治療為主，在疾病發生之後，診斷可能的病原，以藥物如抗生素投餵或藥物藥浴等方式提供療效。其他控制疾病的手段還包括輔以適當的環境控制，如大量換水、加大換氣或控制藻相等。

然而使用藥物治療疾病時，常觀察到許多患有較為嚴重細菌性急性感染症的魚類，會因其食慾迅速減低，使得藥物無法透過口服途徑投予。此外，另一個問題是當發現魚類有疾病症狀時，往往病情已經嚴重擴散，此時即使投予藥物，仍難以有效治療疾病。

另外，針對病毒性疾病而言，由於目前該疾病尚無經濟有效的藥物可資使用，故一旦魚隻發生疾病，僅能以消極的方式，減低死亡率，靜待魚隻康復。

據上可推知，現今養殖漁業以藥物治療疾病的各項方法均不完善，且有許多副作用。另一方面，由於藥物的大量使用，甚至濫用還容易造成病原菌抗藥性的產生，以及藥物殘留於水產品中，影響食品安全等問題。

若論及動物疾病預防，習知技術的主要手段有兩種：一、透過注射疫苗誘發特異性免疫反應(adaptive immune response)；或是二、透過免疫促進劑的投予誘發非特異性免疫反應(innate immune response)，並在調控因子如細胞激素(cytokine)的作用下，引起不同的免疫反應，達到去除病原的目的。

據上可知，在動物體內使用細胞激素等這類調控因子，將可以調控免疫反應，達到增強免疫效果的目的。在過去哺乳動物的研究中，以重組的細胞激素做為疫苗佐劑，也證實能夠同時引起特異性免疫反應以及提升細胞及體液免疫。然而，魚類在類似主題上尚未有相關的研究成果。

因此，為增強魚類抵抗力以有效預防或治療疾病之不適，如何提供一種能調控魚類免疫反應的胜肽，特別是調控硬骨魚免疫反應的胜肽，以及上述胜肽的應用，已成為目前產業中的重要課題之一。

有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種能調控魚類免疫反應的胜肽，特別是調控硬骨魚免疫反應的胜肽，以及上述胜肽的應用，以增強魚類抵抗力，並達到有效預防或治療疾病之不適之目的。

因此，為達上述目的，本發明提供一種調控硬骨魚類免疫反應之胜肽，其含有半胱胺酸-X₁ -X₂ -X₃ -X₄ -X₅ -X₆ -X₇ -X₈ -X₉ -半胱胺酸-X₁₀ -X₁₁ -X₁₂ -X₁₃ -X₁₄ -X₁₅ -甘胺酸-X₁₆ -X₁₇ -X₁₈ -酪胺酸-X₁₉ -X₂₀ -白胺酸之胺基酸序列。

在本發明一實施例中，胜肽之X₁ 係為脯胺酸、或絲胺酸，X₂ 係為絲胺酸、賴胺酸、或酪胺酸，X₃ 係為絲胺酸、丙胺酸、或蘇胺酸，X₄ 係為天冬醯胺或白胺酸，X₅ 係為苯丙胺酸或半胱胺酸，X₆ 係為絲胺酸、或甘胺酸，X₇ 係為賴胺酸、甲硫胺酸、或丙胺酸，X₈ 係為穀胺酸或天門冬胺酸，X₉ 係為絲胺酸或丙胺酸，X₁₀ 係為白胺酸，X₁₁ 係為組胺酸、穀胺醯酸、或精胺酸，X₁₂ 係為精胺酸或穀胺酸，X₁₃ 係為白胺酸或異白胺酸，X₁₄ 係為纈胺酸、丙胺酸、白胺酸、或絲胺酸，X₁₅ 係為穀胺醯酸、穀胺酸、或精胺酸，X₁₆ 係為纈胺酸、或白胺酸，X₁₇ 係為白胺酸、組胺酸、脯安酸、或穀胺醯酸，X₁₈ 係為賴胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、或纈胺酸，X₁₉ 係為蘇胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、或穀胺醯酸，X₂₀ 係為纈胺酸、丙胺酸、或白胺酸。

在本發明一實施例中，胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5其中之一。

在本發明一實施例中，SEQ ID NO：1之胺基酸序列係由含有SEQ ID NO：6之核苷酸序列編碼、SEQ ID NO：2之胺基酸序列係由含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3之胺基酸序列係由含有SEQ ID NO：8之核苷酸序列編碼、或SEQ ID NO：4之胺基酸序列係由含有SEQ ID NO：9之核苷酸序列編碼、或上述之組合。

在本發明一實施例中，編碼胜肽之SEQ ID NO：6之核苷酸序列係分離並純化自石斑魚科。

在本發明一實施例中，硬骨魚類係為鱸形目。

在本發明一實施例中，硬骨魚類係為石斑魚科、鱸魚科、刺蓋鱸科、軍曹魚科、鰺科、鯕鰍科、鰏科、石鱸科、石鲷科、鲷科、慈鲷科、笛鯛科、鲭科、鲳科、劍魚科、鸚哥魚科。

在本發明一實施例中，胜肽之胺基酸序列係屬於介白素-6、顆粒球群落刺激因子或骨髓單核細胞生長因子家族之胺基酸序列。

在本發明一實施例中，胜肽調控免疫反應係包括提升血清中抗體含量、誘發免疫細胞分化、誘發急性期反應或誘發或抑制促發炎細胞激素產生。

在本發明一實施例中，誘發免疫細胞分化係為誘發初生T細胞分化為第二型T輔助細胞。

在本發明一實施例中，誘發急性期反應係為誘發急性期蛋白分泌。

本發明亦提供一種硬骨魚類免疫反應之調控方法，其係藉由提供硬骨魚類上述之胜肽。

本發明又提供一種硬骨魚類飼料添加劑、一種疫苗佐劑以及一種免疫促進劑，其均係含有上述之胜肽。

另外，本發明提供之一種重組載體，其所含有之核苷酸序列係包括上述之核苷酸序列。

綜上所述，本發明所提供之胜肽，具有之胺基酸序列於硬骨魚類中所展現之特性與哺乳類動物之細胞激素IL-6、顆粒球群落刺激因子或骨髓單核細胞生長因子家族相似，其具有調控免疫反應包括提升血清中抗體含量、誘發免疫細胞分化、誘發急性期反應或誘發或抑制促發炎細胞激素產生以及刺激第二型T輔助細胞之分化等。另外，本發明又再藉由此特性，提供包含本發明之胜肽之一種免疫促進劑、飼料添加劑及疫苗佐劑，藉以達到提升硬骨魚類之免疫系統及有效預防病原菌的感染或減緩疾病所造成之不適。除此之外，本發明另提供一種重組載體，具有能編碼成本發明之胜肽之核苷酸序列，以擴大應用於其他生物體中。

以下將參照相關圖式，說明依本發明提供一種用以調控魚類免疫反應之胜肽及其應用。

本發明係研究分析硬骨魚類所得一胜肽，將其胺基酸序列比對之後發現，與哺乳類動物之一細胞激素介白素-6(interleukin-6，簡稱IL-6)序列及結構相近似。具體而言，該胜肽之胺基酸序列係包含半胱胺酸-X₁ -X₂ -X₃ -X₄ -X₅ -X₆ -X₇ -X₈ -X₉ -半胱胺酸-X₁₀ -X₁₁ -X₁₂ -X₁₃ -X₁₄ -X₁₅ -甘胺酸-X₁₆ -X₁₇ -X₁₈ -酪胺酸-X₁₉ -X₂₀ -白胺酸(C-X₁ -X₂ -X₃ -X₄ -X₅ -X₆ -X₇ -X₈ -X₉ -C-X₁₀ -X₁₁ -X₁₂ -X₁₃ -X₁₄ -X₁₅ -G-X₁₆ -X₁₇ -X₁₈ -Y-X₁₉ -X₂₀ -L)序列，其中X₁ ~X₂₀ 係可為任意一胺基酸殘基(residue)。

在一實施例中，X₁ 係為脯胺酸、或絲胺酸，X₂ 係為絲胺酸、賴胺酸、或酪胺酸，X₃ 係為絲胺酸、丙胺酸、或蘇胺酸，X₄ 係為天冬醯胺或白胺酸，X₅ 係為苯丙胺酸或半胱胺酸，X₆ 係為絲胺酸、或甘胺酸，X₇ 係為賴胺酸、甲硫胺酸、或丙胺酸，X₈ 係為穀胺酸或天門冬胺酸，X₉ 係為絲胺酸或丙胺酸，X₁₀ 係為白胺酸，X₁₁ 係為組胺酸、穀胺醯酸、或精胺酸，X₁₂ 係為精胺酸或穀胺酸，X₁₃ 係為白胺酸或異白胺酸，X₁₄ 係為纈胺酸、丙胺酸、白胺酸、或絲胺酸，X₁₅ 係為穀胺醯酸、穀胺酸、或精胺酸，X₁₆ 係為纈胺酸、或白胺酸，X₁₇ 係為白胺酸、組胺酸、脯安酸、或穀胺醯酸，X₁₈ 係為賴胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、或纈胺酸，X₁₉ 係為蘇胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、或穀胺醯酸，X₂₀ 係為纈胺酸、丙胺酸、或白胺酸。在一實施態樣中，以上述X₁ ~X₂₀ 可於本發明胜肽之胺基酸序列中進一步組合成如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5其中之一序列。另外，本發明胜肽之結構與哺乳類動物的IL-6蛋白同樣具有5個阿法-螺旋(α-helix)結構。

本發明之胜肽產生之方式可不限於自硬骨魚類活體分離或純化而得，或是透過人工合成，或是以能對應編碼之核苷酸序列於生物體內或生物體外表現產生。其中，所述的核苷酸序列可有多種，且在一實施例中至少包括對應轉譯成SEQ ID NO：1胺基酸序列的SEQ ID NO：6核苷酸序列、SEQ ID NO：2胺基酸序列的SEQ ID NO：7核苷酸序列、SEQ ID NO：3胺基酸序列的SEQ ID NO：8核苷酸序列、或SEQ ID NO：4胺基酸序列的SEQ ID NO：9核苷酸序列或上述之組合於生物體中表現等手段。在一實施例中，編碼SEQ ID NO：1胺基酸序列之SEQ ID NO：6之核苷酸序列係分離並純化自石斑魚科。

進一步說明，在本實施例中所指之生物體係包括脊椎動物或其細胞，或細菌等原核生物，或病毒如噬菌體等，而有特別限制，惟以具有能將核苷酸進行轉錄、轉譯能力者或依據他種生物體為宿主而進行轉錄、轉譯者均可。

在本發明中，硬骨魚類係泛指在演化分類上，具有鈣化硬骨之所有魚類。在一實施例中，硬骨魚類係較佳係被分類為鱸形目之魚類，如石斑魚科、鱸魚科、刺蓋鱸科、軍曹魚科、鰺科、鯕鰍科、鰏科、石鱸科、石鲷科、鲷科、慈鲷科、笛鯛科、鲭科、鲳科、劍魚科、或鸚哥魚科，更佳係為石斑魚科之魚類。除此之外，本發明所述之硬骨魚類較佳係為包含具有上述之胺基酸序列之魚種，如比目魚、河豚、多紀魨、黃錫鯛等，本發明在此不限。

在哺乳類動物的免疫系統中，IL-6係為分化為第二型T輔助(T helper 2，簡稱Th2)細胞所必須的細胞激素其中之一，其在特異性免疫反應中扮演著重要的角色，包括能夠刺激免疫細胞如B細胞或T細胞之增生或分化、刺激急性期蛋白(acute phase protein，簡稱APP)、C反應蛋白(C-reactive proteins，簡稱CRP)以及血清澱粉A蛋白(serum amyloid A，簡稱SAA)的產生、巨噬細胞的吞噬作用(phagocytosis)以及調節發炎反應，其中調節發炎反應包括調升或調降發炎反應。除此之外，IL-6能更進一步促進T細胞分化成第二型T輔助細胞以進行後續之免疫反應等功能。

而本發明在一實驗例中給予本發明之胜肽予硬骨魚類，並證實能使該硬骨魚類引發之免疫反應，經由分子層次之免疫相關基因檢測後發現，本發明之胜肽亦具有調控硬骨魚類之免疫反應之功效，其可包括提升血清中抗體的含量、誘發免疫細胞分化、誘發急性期反應如誘發APP等表現或抑制或誘發促發炎之細胞激素的產生以及其他透過誘發初生T細胞分化為第二型T輔助(T helper 2，簡稱Th2)細胞以產生特定免疫效果等功效。

結合上述研究成果發現，本發明所提供之胜肽與哺乳類之IL-6極為相似，蓋可為硬骨魚類之IL-6。另又經下述實驗例確認後，硬骨魚類之IL-6蛋白至少可為石斑魚之IL-6蛋白；詳細而言，至少可為點帶石斑魚之IL-6蛋白。然而，又根據相關研究，本發明之胜肽(即硬骨魚類之IL-6)與顆粒球群落刺激因子(G-CSF)/骨隨單核細胞生長因子(MGF)家族也有著相似的序列，因此本發明之胜肽亦可在硬骨魚類細胞中扮演著G-CSF/MGF家族之角色。在本發明一實施例及實驗例中，上述硬骨魚類係為石斑魚，特別是點帶石斑魚(Epinephelus coioides )。

由於本發明之胜肽提供諸多調節免疫功能，因此，本發明亦提供一種硬骨魚類免疫反應之調控方法，係藉由提供如上所述之胜肽於硬骨魚類。相關具體說明將結合實驗例，於後進一步說明。

本發明之胜肽係能作為一免疫促進劑，並係可以口服、注射、或敷用等方式給予硬骨魚類。依照服用途徑或需求而可例如將上述胜肽以錠劑、乾燥塊狀體、咀嚼錠、快速溶解錠、發泡錠、粉末、液劑、懸浮液劑、乳液劑、錠劑、多層錠、雙層錠、膠囊劑、軟明膠膠囊、硬明膠膠囊、口含錠、散劑、或粒劑等形式提供，本發明在此不限。當然，作為免疫促進劑時，亦不限於是以藥劑、藥物、輔助成份、飼料或飼料添加劑的方式提供。而關於本發明之胜肽作為免疫促進劑時所使用之劑量或比例，端看欲達到的免疫反應程度而定。

本發明又提供一種硬骨魚類之飼料添加劑，其係含有上述之胜肽，與硬骨魚類之飼料相混合，主要係能藉由硬骨魚類口器攝入，以使本發明之胜肽於硬骨魚類體內達到上述調控免疫反應之作用，而本發明所提供之飼料添加劑係適用於預防健康個體受到病原菌感染、或治療受病原菌感染但未出現不適症狀之個體、或治療受到病原菌感染而有顯著症狀產生之個體等目的。另外，本發明所提供之飼料添加劑係適用於各個發育階段之硬骨魚類，因此，受限於施用之硬骨魚類口器之大小，而可以將本發明之飼料添加劑以不同形式來提供，例如但不限於塊狀、粉狀、粒狀、液狀、或氣霧狀等形式進行餵食。而關於投餵之時間則係依照施用之個體體型大小或欲達到之成效而決定。假設飼料中含有之胜肽為一定量且作為預防之用時，投餵時間點可同時隨該個體飼料補給之時間進行給予，如一天一次、一天兩次、或一天三次等頻率，而對於因受感染而出現嚴重症狀者，則更可以增加投餵次數，本發明在此不限。而本發明之飼料添加劑若為固態形式時，其中所含有之胜肽含量係佔飼料總重量之10 ppm至1,000 ppm之間，較佳係為佔飼料總重量之25 ppm至500 ppm，更佳係為佔飼料總重量之0.05%～0.5%之間。而若係為液狀或氣霧狀時，其中所含有之胜肽含量係佔總溶液介於0.1 ppm至10 ppm之間，較佳係佔總溶液介於0.25 ppm至5 ppm之間，更加係為佔總溶液介於0.5 ppm至2.5 ppm之間。

本發明之飼料添加劑除直接使用外，亦適於與其他成份混合製成飼料後應用，是以，製成的硬骨魚類飼料除含有本發明之胜肽外，更可以包含魚類食用之載體，如緩衝溶液、麩皮、魚粉、蛋白質、胺基酸、維生素或魚油等脂質，又或者包含其他有助於保護抗氧化劑的活性到達魚類腸胃道等酸性環境之添加物、膨鬆劑、填充劑、碎裂劑、結著劑、或能維持飼料特定形狀之包覆材料。關於飼料之製作方式係為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知，惟製程中各項條件係需考量保持本發明之胜肽活性不受到破壞。

本發明之胜肽係更能作為一疫苗佐劑，用以刺激個體的免疫反應及抗體之產生。在此所謂之個體較佳係為硬骨魚類，而更佳係為石斑魚，又更佳係為點帶石斑魚。當本發明之胜肽作為疫苗佐劑時，可與抗原以及醫藥上可接受之載劑共同混合而製成一疫苗。其中，抗原可係為但不限於病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲之多胜肽、胜肽、胺基酸小片段、或不活化或減毒之病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲等，而載劑可包括溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑(decomposer)、賦形劑、穩定劑、螯合劑、稀釋液、增黏劑、防腐劑、潤滑劑、或介面活性劑等。除此之外，本發明之胜肽亦能與其他種佐劑共同作用，其他佐劑可例如油性佐劑(oleaginous adjuvant)，其包括礦物油、植物油、動物油、弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑等、水性佐劑、二相油性佐劑(two-phase oleaginous adjuvant)，其包括界面活性劑及油性物質、或生物性佐劑，其包括寡核苷酸、或類毒素等，本發明在此不限。

以本發明之胜肽作為佐劑之疫苗較佳係以注射途徑提供於硬骨魚類。而注射途徑可以係為靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、或腹腔注射等方式提供。當然，注射的時期非本發明所限制者，而可於幼苗或成魚階段注射。

除此之外，本發明又提供一重組載體，係包括能轉譯成上述胜肽之核苷酸序列。在一實施例中，核苷酸序列係選自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、或SEQ ID NO：9至少其中之一。除上述核苷酸序列外，重組載體可包括一啟動子、一轉譯起始碼、一轉譯終止碼、或一篩選標誌之核苷酸序列。其中，啟動子係視欲表現的器官或生物體不同而有所不同，另外，篩選標誌係為便於進行篩選具有轉殖片段的群落，篩選標誌可以係為但不限於抗生素篩選基因、報導基因、或色素基因等。而本發明之重組載體所選用之生物體可於原核生物如細菌、酵母菌或其他真菌、真核生物如哺乳類、昆蟲、植物、魚類等的細胞或胚胎中表現，本發明在此不限。關於重組載體之構築、轉殖方法以及係為本技術領域具有通常知識者所能理解者，故在此不再贅述。

基於前述各種特徵可知，點帶石斑魚之IL-6蛋白即符合本發明提供之胜肽，故以下將以點帶石斑魚之IL-6為例，就本發明之胜肽之序列以及其所能達到之免疫反應功效以複數實驗例進行說明及驗證。

實驗例一：點帶石斑魚IL-6蛋白能刺激免疫反應相關基因 表現 實驗用之點帶石斑魚

點帶石斑魚(Epinephelus coioides )係取自國立成功大學海洋生物科技實驗室(台南，台灣)。飼養於含有過濾循環的海水槽中，水溫控制於27±1℃，並定時監測水中之胺、氮、氮鹽量及水中總菌量。飼養期間每天以乾燥飼料(Uni-president,Tainan,Taiwan)餵食兩次。

取得IL-6基因全長

抽取點帶石斑魚之全RNA，並利用商業化套組GeneRacerTM kit(Invitrogen)進行RACE以得到點帶石斑魚之IL-6基因全長，其操作流程及相關參數可參照廠商之操作手冊。

構築IL-6重組載體

於點帶石斑魚介白素-6基因開放閱讀框架(open reading frame)之序列5’端及3’端設計專一性引子，其序列係分別為GGATCCGGCTCCAGTGGAGGACGCG及AAGCTTTTAGATACCGATGGGTGC，並分別在5’端引子及3’端引子接上Bam HI切位及Hind III切位。之後以點帶石斑魚介白素-6基因做為模板，利用PCR方式以pfu Ultra^TM High-Fidelity DNA Polymerase擴增基因片段，再將PCR產物及載體進行限制酶Bam HI和Hind III於37℃作用4小時。以1%瓊膠電泳確認後，進行DNA膠上純化，接著利用T4 DNA ligase(3 U/μL)將基因接入經相同限制酶作用之pET-28b載體，於4℃進行接合反應20至24小時，之後經轉型作用送入大腸桿菌(E. coli )BL21(DE3)中，挑選成功接合上基因於表現載體之菌株。

表現IL-6重組蛋白及純化

將含有表現載體之菌株接種至1 mL含有康黴素(kanamycin)之LB培養液中於37℃震盪培養16至20小時後，以1：50的稀釋比例接種至50 mL含有康黴素之新鮮LB培養液中，於37℃震盪培養約1~2小時至吸光值(OD₆₀₀ )約至0.6至0.8後，加入IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至最終濃度為1.0 mM，以誘導蛋白表現，並以12% SDS-PAGE確認表現結果。最後利用His-taq column(HisTrap^TM FF)純化重組IL-6蛋白。

IL-6活體試驗及免疫相關基因之檢測

取60隻約20至30克的點帶石斑魚，並將純化後之重組IL-6蛋白(rIL-6)50 ng/g以腹腔注射方式注入魚體。其中實驗組為注射有rIL-6蛋白之30隻點帶石斑魚，而控制組係為注射磷酸緩衝溶液(PBS)的30隻點帶石斑魚。每組在注射後各時間點(0、2、8、24、72、144、216、288、360小時)進行犧牲採集各免疫器官包括鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟。並萃取這些器官之RNA並合成cDNA。利用定量及時偵測PCR系統(Quantitative real time PCR)偵測相關基因的表現情形。偵測之基因可包括內生性il-6 基因表現、促發炎反應基因：tnf-α1 、tnf-α2 及il-1β 、急性期反應基因：crp 及第二型T輔助細胞專一性轉錄因子：gata3 、c -maf 及t-bet 。進行重組魚類IL-6的功能分析。

結果一：點帶石斑魚之IL-6蛋白能調升魚體內之 il - 6 基因表現

點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性il-6 基因表現結果係如圖1A至1F所示。注射rIL-6後，所有的免疫器官及肝臟中的il-6 基因之mRNA都有明顯的上升。而在肝臟及鰓更於288小時又再次出現調升的情形。顯示，rIL-6能刺激內生性的il-6 基因表現。故可知本發明之胜肽更具有自我調節的功能。

結果二：點帶石斑魚之IL-6蛋白能調控魚體內之發炎相關基因表現

點帶石斑魚注射rIL-6後，其鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟器官中的tnf-α1 基因表現結果係分別如圖2A至2F所示，而tnf-α2 基因表現結果係分別如圖3A至3F所示(各圖分別表示鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟)。注射rIL-6後，除鰓及體腎外所有的免疫器官及肝臟中的tnf -α1 及tnf -α2 基因之mRNA於注射後2小時都有明顯的上升。

而各器官中(鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟)il-1β 基因表現結果係分別如圖4A至4F所示。其表現情形大致係如tnf -α1 及tnf -α2 基因表現情形相似。除鰓及體腎外所有的免疫器官及肝臟中的il-1β 基因之mRNA於注射後2小時都有明顯的上升，部分器官如胸腺或體腎可延續高表現量至24小時。然而，於上述時間點之後，基因表現量則開始逐漸下降，甚至低於控制組之情形可知，rIL-6可影響硬骨魚類促發炎基因表現的調升及/或調降。

結果三：點帶石斑魚之IL-6蛋白能調控T細胞分化相關基因表現

點帶石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的c -maf 表現係分別如圖5A至5F所示。在大部分之免疫器官均於注射後24~72小時明顯上升，其中，脾臟則是於注射後約216及288小時有較明顯之調升。而非免疫器官之肝臟，則沒有明顯受到調升的情形。而關於t -bet 基因表現結果係如圖6A至6E所示(各圖分別表示鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟)，於注射rIL-6蛋白後約2小時開始表現，而鰓、胸腺及頭腎係約於8小時候有顯著的標線上升之趨勢，且表現增加之趨勢維持到24小時。而關於gata3 基因表現結果係如圖7A至7E所示(各圖分別表示鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟)，鰓、頭腎、體腎及脾臟於注射rIL-6蛋白後約8小時有顯著表現，並且於注射後24小時有最高量的表現，且持續至注射後360小時。另外，體腎及脾臟維持最高量的表現亦持續到注射後360小時。

以此結果來看，注射rIL-6蛋白後，刺激第二型T輔助細胞分化的相關基因c-maf 、t-bet 及gata3 等基因的表現均明顯上升，顯示rIL-6蛋白能刺激第二型T輔助細胞的分化，亦可知，本發明之胜肽係具有刺激第二型T輔助細胞的分化之功效。

結果四：點帶石斑魚之IL-6蛋白能調控急性期蛋白表現

注射rIL-6蛋白後肝臟急性期蛋白基因表現結果係如圖8所示，約於注射後2小時開始表現crp 基因，並且於注射後24小時有相對較高的表現量，且於24小時後，表現逐漸下降，而隨後又逐漸上升直到注射後第288小時。

以此結果可知，雖然急性期蛋白crp 基因表現於肝臟中的量並不固定，但普遍均有較控制組明顯增加之趨勢。因此可知，本發明之胜肽係具有調升急性期蛋白表現之功效。

實驗例二：點帶石斑魚之IL-6蛋白能刺激免疫球蛋白表現量上升 非特異性免疫球蛋白表現量之檢測

選取60隻大小約20至30克的點帶石斑魚，並將純化後之重組介白素-6蛋白(rIL-6)，利用腹腔注射的方式注入魚體，其劑量為50 ng/隻，實驗組為使用IL-6，另以使用PBS做為對照組，每組各30隻。經單次使用後每隔一週抽血一次，血清經分離後用於表現量的偵測。

取96孔微量培養盤(NUNC-immuno plate)，以coating buffer將待測血清稀釋10,000倍及含各濃度純化之Ig蛋白的coating buffer(繪製標準曲線用)，每孔各加入100 μL後，靜置於4℃放隔夜後，每孔以200 μL PBST清洗3次，每次10分鐘，加入200 μL含3%脫脂牛奶之PBST，靜置於37℃一小時或4℃放隔夜，再以200 μL PBST清洗3次，每次10分鐘。加入100 μL一級抗體(兔抗純化之Ig蛋白血清，稀釋4,000倍)，靜置於37℃一小時，再以200 μL PBST清洗3次，每次10分鐘；加入100μL二級抗體(接合鹼性磷酸酶AP之山羊抗兔IgG抗體，稀釋4,000倍)，靜置於37℃一小時，再以200μL PBST清洗3次，每次10分鐘，之後進行呈色反應。先將p-nitrophenyl phosphate(pNPP)呈色液溶於10% diethanolamine buffer(pH9.8)中使其最終濃度為1mg/mL，即配置完成呈色液(使用前配置需避光)。每孔加入100 μL之呈色液，避光靜置室溫30分鐘，利用ELISA reader讀取OD₄₀₅ 之吸光值，以標準曲線圖計算出其濃度依各讀值繪製成圖。

結果如圖9A所示，免疫球蛋白表現總量於絕大多數之免疫器官中，於rIL-6注射後第九天的表現量有明顯增加的情形，且持續至第15天的高表現量。因此可知IL-6蛋白具有提升免疫球蛋白總量表現之功效，亦即言本發明之胜肽具有提升免疫球蛋白總量表現之功效。

特異性免疫球蛋白表現量之檢測

選取60隻大小約20至30克的點帶石斑魚，並將純化後之重組介白素-6蛋白(rIL-6)於特異性抗原混合後使用，以證明其對於特異性抗體(牛血清白蛋白，簡稱BSA)表現量的影響。實驗共分三組，利用腹腔注射的方式注入魚體，實驗組為使用rIL-6混合BSA(劑量IL-6 100 ng/fish;BSA 100 μg/隻)，另以單讀使用BSA(100 μg/隻)以及使用PBS做為對照組，每組各30隻。經單次使用後每隔一週抽血一次，血清經分離後用於表現量的偵測。表現量偵測與非特異性抗體測定法相近，以coating buffer混合BSA(1 μg/well)作為抗原，以免疫後各組魚隻血清做為一次抗原，以兔抗純化之Ig蛋白血清作為二次抗體，以接合鹼性磷酸酶AP之山羊抗兔IgG抗體作為三次抗體，其餘操作與本實驗例前述實驗步驟相同。

結果如圖9B所示，注射PBS及BSA兩組控制組，於注射後，點帶石斑魚體內之抗-BSA免疫球蛋白量沒有顯著增加的趨勢，惟注射本發明之rIL-6蛋白之點帶石斑魚有明顯隨天數增加之情形，蓋為體內抗-BSA免疫球蛋白量有逐漸上升之趨勢。顯示IL-6蛋白具有具有調控特異性免疫球蛋白產生之功效，亦即言本發明之胜肽具有調控特異性免疫球蛋白產生之功效。

實驗例三：點帶石斑魚之IL-6蛋白能增加魚隻面對疾病侵襲時的存活

實驗分成注射rIL-6蛋白後第1天及第7天進行進行病原攻擊試驗，共進行三次。每次試驗共需魚隻二十隻，分為三組進行，實驗組以腹腔注射投予rIL-6蛋白(100 ng/隻)，並於一天後進行病源攻擊，對照組以同樣方式投予PBS。經過一段時間(第1天或第7天)，以不同劑量(半致死量LD₅₀ 及99%致死量LD₉₉ )的強毒株坎式弧菌(Vibrio campbellii )將魚隻浸泡1.5小時後，置回原魚缸飼養。一般而言，正常個體受到感染後將於第2天到第6天出現死亡魚隻，因此將於注射rIL-6蛋白後觀察存活率觀察至注射後第6天並計算其存活率。

結果係如圖10A至圖10C所示。如圖10A所示，實驗組魚隻注射rIL-6蛋白一天後以LD₅₀ 劑量之株坎式弧菌感染，魚隻於第2至3天開始出現死亡，到第6天則僅剩半數魚隻存活。如圖10B所示，實驗組魚隻注射rIL-6蛋白一天後以LD₅₀ 劑量之株坎式弧菌感染，魚隻於第1至2天開始出現死亡，到第6天則仍有70%魚隻存活。如圖10C所示，實驗組魚隻注射rIL-6蛋白七天後以LD₉₉ 劑量之株坎式弧菌感染，魚隻於第1至2天開始出現死亡，到第6天則仍有50%魚隻存活。

由此可知，注射rIL-6蛋白後，能使硬骨魚類對於病原菌的感染具有抵抗能力且有效提升其存活率，且相較於沒有注射rIL-6蛋白的魚隻，注射有rIL-6蛋白之魚隻提升之存活率可高達至少50%以上，具有顯著的提升免疫系統之防禦效果。亦即言本發明之胜肽具有此等功效。

本發明所提供之所有實驗的統計數據，係使用GraphPad prism 5.0軟體分析，並均採Student’st 檢定(student’st test)進行統計。其中，*表示p <0.005，即統計上視為兩數據間具有顯著差異。

綜上所述，本發明所提供之胜肽，具有之胺基酸序列於硬骨魚類中所展現之特性與哺乳類動物之細胞激素IL-6、顆粒球群落刺激因子或骨髓單核細胞生長因子家族相似，其具有調控免疫反應包括提升血清中抗體含量、誘發免疫細胞分化、誘發急性期反應或誘發或抑制促發炎細胞激素產生以及刺激第二型T輔助細胞之分化等。另外，本發明又再藉由此特性，提供包含本發明之胜肽之一種免疫促進劑、飼料添加劑及疫苗佐劑，藉以達到提升硬骨魚類之免疫系統及有效預防病原菌的感染或減緩疾病所造成之不適。除此之外，本發明另提供一種重組載體，具有能編碼成本發明之胜肽之核苷酸序列，以擴大應用於其他生物體中。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

<110>　國立成功大學

<120>　調控硬骨魚類免疫反應之胜肽及其相關應用

<160>　9

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　199

<212>　PRT

<213>　Epinephelus coioides

<220>

<221>　PEPTIDE

<222>　(1)..(199)

<400>　1

<210>　2

<211>　230

<212>　PRT

<213>　Paralichthys olivaceus

<220>

<221>　PEPTIDE

<222>　(1)..(230)

<400>　2

<210>　3

<211>　227

<212>　PRT

<213>　Takifugu rubripes

<220>

<221>　PEPTIDE

<222>　(1)..(227)

<400>　3

<210>　4

<211>　225

<212>　PRT

<213>　Sparus aurata

<220>

<221>　PEPTIDE

<222>　(1)..(225)

<400>　4

<210>　5

<211>　26

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<221>　PEPTIDE

<222>　(1)..(26)

<400>　5

<210>　6

<211>　600

<212>　DNA

<213>　Epinephelus coioides

<400>　6

<210>　7

<211>　693

<212>　DNA

<213>　Paralichthys olivaceus

<400>　7

<210>　8

<211>　684

<212>　DNA

<213>　Takifugu rubripes

<400>　8

<210>　9

<211>　678

<212>　DNA

<213>　Sparus autata

<400>　9

圖1A至圖1F依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性il -6 基因表現結果數據圖；

圖2A至圖2F依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性tnf -α1 基因表現結果數據圖；

圖3A至圖3F依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性tnf-α2 基因表現結果數據圖；

圖4A至圖4F依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性il-1 β 基因表現結果數據圖；

圖5A至圖5F依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性c-maf 基因表現結果數據圖；

圖6A至圖6E依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性t-bet 基因表現結果數據圖；

圖7A至圖7E依序為點帶石斑魚注射rIL-6後，石斑魚之鰓、胸線、體腎、頭腎、脾臟及肝臟中的內生性gata3 基因表現結果數據圖；

圖8為注射rIL-6蛋白後點帶石斑魚肝臟中急性期蛋白基因表現量數據圖；

圖9A為注射rIL-6蛋白後點帶石斑魚體內非特異性免疫球蛋白表現總量數據圖；

圖9B為注射rIL-6蛋白後點帶石斑魚體內特異性免疫球蛋白表現總量數據圖；以及

圖10A至10C依序為點帶石斑魚經注射rIL-6蛋白後以病原菌感染之存活率統計數據圖。

Claims (12)

1. 一種調控硬骨魚類免疫反應之胜肽，其中該胜肽的胺基酸序列係為SEQ ID NO：1。
2. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中SEQ ID NO：1之胺基酸序列係由含有SEQ ID NO：6之核苷酸序列編碼。
3. 如申請專利範圍第2項所述之胜肽，其中該含有SEQ ID NO：6之核苷酸序列係分離並純化自石斑魚科。
4. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中該硬骨魚類係為石斑魚科。
5. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中該胺基酸序列係屬於介白素-6、顆粒球群落刺激因子或骨髓單核細胞生長因子家族之胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中調控免疫反應包括提升血清中抗體含量、誘發免疫細胞分化、誘發急性期反應或誘發或抑制促發炎細胞激素產生。
7. 如申請專利範圍第6項所述之胜肽，其中誘發免疫細胞分化係為誘發初生T細胞分化為第二型T輔助細胞。
8. 如申請專利範圍第6項所述之胜肽，其中誘發急性期反應係為誘發急性期蛋白分泌。
9. 一種硬骨魚類飼料添加劑，其含有如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之胜肽。
10. 一種疫苗佐劑，其含有如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之胜肽。
11. 一種免疫促進劑，其含有如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之胜肽。
12. 一種重組載體，其含有如申請專利範圍第2項所述之該些核苷酸序列至少其中一。