TWI432213B - 多功能抗體共軛物類 - Google Patents

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Description

多功能抗體共軛物類
發展雙功能治療劑具有放大組合式治療策略之高度潛力。雙功能治療劑可藉由一種治療實體調節二種不同的途徑以提供組合式治療之好處。此外，雙功能治療劑亦可從不同途徑之間的協同性獲得好處，且相較於單一功能劑顯示增加之活性。另外，雙功能治療劑可提供減少製造、儲存及運送成本方面之好處，同時減少給予病患之治療劑數量及簡化投藥方案。
IGF1R係跨膜異型四聚體蛋白質，其具有呈雙硫鍵接(β-α-α-β)構型之2個胞外α鏈及2個跨膜β鏈。IGF1R以高親和性與IGF1結合。IGF1係70個胺基酸之肽，其主要由肝臟回應生長激素之刺激而生產，但亦可由身體內之幾乎任何組織合成並以100至200奈克/毫升之濃度於血清中循環。IGF1R傳訊可能與許多腫瘤類型有關，特別是肺癌。舉例來說，IGF1之血漿量升高係與肺癌之風險增加有關。此外，IGF1、IGF2及IGF1R係由正常肺細胞表現，但由肺癌細胞過度表現。IGF1R傳訊亦已被認為與乳癌、前列腺癌、結直腸癌、肉瘤、多發性骨髓瘤及其他惡性病有關。WO02053596、WO2005016967、WO2005005635及WO2009032145揭示IGF1R抗體及彼之抗原結合部分。
血管生成素1(Ang1)及血管生成素2(Ang2)係內皮細胞受體Tie2之配體，它們和VEGF及其他血管生成調節劑可媒介血管生成之過程。Ang1刺激Tie2之磷酸化，吸引周細胞至新形成之血管並促進周細胞之成熟。已知Ang2具有血管生成性且在許多癌中過度表現。Ang2與Ang1競爭與Tie2之結合，促進周細胞之脫離並導致不穩定之血管。當VEGF及其他血管生成因子存在時，在這些不穩定血管中之內皮細胞增生並移動以形成新血管。
大約50%之實質腫瘤病患具有增加表現之Ang2，但Ang2於癌組織中之量係高度變異。較高之Ang2表現係與不良存活、較晚期疾病和更具侵入性之癌明顯相關。Ang1和Ang2間之較低之比已知亦與卵巢癌之不良預後有關。報告指出Tie2於肝細胞癌、星狀細胞瘤、卡波西氏肉瘤、皮膚血管肉瘤及非小細胞肺癌中之表現係經上調。Tie2係過度表現於許多腫瘤之血管上。Tie2表現單核球導致腫瘤血管之形成。新發表之資料顯示特別隔離Ang2可抑制腫瘤生長並造成分期腫瘤之消退。WO2008056346揭示Ang2結合肽。
在同一治療中以IGF1R及Ang2二者為目標可能經證實為腫瘤學家在多種治療設置中使用之有效工具。該等方法已被假設(例如於WO2009088805及WO2010040508)，但到目前為止尚未有被證實者。因此有需要提供以IGR-1R及Ang2二者為目標之選擇性腫瘤治療。
在本說明書中提及任何技藝並不是也不應被視為以任何形式承認或建議該提及之技藝形成該普通一般知識之部分。
本發明提供多功能抗體共軛物(MAC)，該MAC包含與至少一個效應基團共軛之抗體或彼之抗原結合部分，及該MAC之醫藥上可接受之鹽、立體異構物、互變異構物、溶劑合物和前藥。本發明亦提供包含本發明之MAC之醫藥組成物及樣本。
本發明亦提供多功能抗體共軛物(MAC)，該MAC包含與至少一個Ang2結合肽共軛之抗體或彼之抗原結合部分。
本發明提供多功能抗體共軛物(MAC)，該MAC包含與至少一個Ang2結合肽共軛之抗IGF1R抗體或彼之抗原結合部分。
在一些實施態樣中，該至少一個Ang2結合肽係經由連接子與該抗體之共軛殘基的側鏈共軛。
在一些實施態樣中，該效應基團係與該抗體或彼之抗原結合部分之Fab區中之離胺酸殘基的側鏈共價連接。在一些實施態樣中，該效應基團係與該重鏈恆定區(CH)或輕鏈恆定區(CL)中之離胺酸殘基的側鏈共價連接。該效應基團與該抗體之CL結構域之反應係特別理想，以最小化或防止對該抗體之Fc部分與Fc受體(諸如FcγR及FcRn)之結合或該抗體與彼之個別標靶之結合之任何干擾。相反地，該個別效應基團與該抗體之Fc部分之共軛可能降低該抗體於活體內之半衰期及/或彼與該免疫系統交互作用之能力(效應功能)。效應基團於抗體之重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)中之共軛帶來減少該抗體與彼之同源物結合之風險。
在一些實施態樣中，該效應基團係與該輕鏈κ恆定區(CLκ)結構域中之離胺酸殘基的側鏈共價連接。該效應基團與該CLκ結構域之優先共軛藉由允許該抗體之CH結構域之同型轉換且不影響該效應基團與該抗體之共軛部位而簡化該MAC同型之產生。
該效應基團可與該輕鏈κ結構域恆定區(CLκ)(SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47)之K80 (根據卡巴編號之K188 )的側鏈共價連接。在一些實施態樣中，該效應基團係與SEQ ID NO：15之K80 共價連接。SEQ ID NO：15之K80 係位於該個別抗體之重要區域以外，諸如對位區、FcRn結合結構域、絞鏈區、FcR結合結構域；此提供好處，即優先地連接這些部位限制當該MAC係與該效應基團共軛時對抗體-抗原交互作用之干擾量。
在某些態樣中，該效應基團係與模體K*HK之K*共價連接。該K*HK模體之K*可對應SEQ ID NO：15之K80 。在某些態樣中，該效應基團係與位於該CLκ區之模體K188 H之K188 共價連接(根據卡巴編號系統)。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47。
在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：45之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：45。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：46之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：46。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：47之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：47。
在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：45或47。當該CLκ區包含部分或完整之SEQ ID NO：45或47，x82 可選自K、R、G、A、V、L、I、S、T、C、M、N、Q、D、E、H、F、W或Y。在某些態樣中，x82 可為G、A、V、L或I。在某些態樣中，x82 可為K、R、N或Q。在某些態樣中，x82 可為D或E。在某些態樣中，x82 可為K、R、G、A、V、L、I、N或Q。在某些態樣中，x82 可為D或E。在某些態樣中，x82 可為K、R、G、A、V、L、I、N、Q、D或E。在某些態樣中，x82 可為D或E。在某些態樣中，x82 可為H、F、W或Y。在某些態樣中，x82 不是脯胺酸。在某些態樣中，(SEQ ID NO：15、45、46及/或47)之X82 係R。在某些態樣中，K190 -CLκ係R。
SEQ ID NO：45及47包含在CLκ中識別之多形性；V/A153 及L/V191 (根據卡巴編號)。因此，該三種多形性係：Km(1)：V153 /L191 、Km(1,2)：A153 /L191 、及Km(3)A153 /V191 。在本發明之某些包含SEQ ID NO：45及/或47之態樣中，x45 係V，且x83 係L(Km(1))。在本發明之某些包含SEQ ID NO：45及/或47之態樣中，x45 係A，且x83 係L(Km(1,2))。在本發明之某些包含SEQ ID NO：45及/或47之態樣中，x45 係A，且x83 係V(Km(3))。
在某些態樣中，該MAC包含與二條輕鏈上之CLκ K188 共軛之效應基團。在某些態樣中，該MAC包含與僅一條輕鏈上之CLκ K188 共軛之效應基團。在某些態樣中，該效應基團係僅與該MAC之K188 CLκ共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之一條輕鏈上之K188 CLκ和該抗體之另一個位置共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之一條輕鏈上之K188 CLκ和該抗體之另二個位置共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之一條輕鏈上之K188 CLκ和該抗體之另三個位置共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之二條輕鏈上之K188 CLκ和另一個位置共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之二條輕鏈上之K188 CLκ和另二個位置共軛。在某些態樣中，該效應基團係與該MAC之二條輕鏈上之K188 CLκ和另三個位置共軛。
本發明之樣本及組成物
在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物或樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體(或彼之抗原結合部分)，其中在該組成物或樣本中至少約50%之效應基團係與K188 -CLκ共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物或樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體(或彼之抗原結合部分)，其中在該組成物或樣本中至少約60%之效應基團係與K188 -CLκ共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物或樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體(或彼之抗原結合部分)，其中在該組成物或樣本中至少約70%之效應基團係與K188 -CLκ共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物或樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體(或彼之抗原結合部分)，其中在該組成物或樣本中至少約80%之效應基團係與K188 -CLκ共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物或樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體(或彼之抗原結合部分)，其中在該組成物或樣本中至少約90%之效應基團係與K188 -CLκ共軛。
在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物(或樣本)，該MAC包含抗體(或彼之抗原結合部分)，其中至少約50%之抗體包含與至少一條輕鏈上之K188 -CLκ共價連接之效應基團。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物(或樣本)，該MAC包含抗體(或彼之抗原結合部分)，其中至少約60%之抗體包含與至少一條輕鏈上之K188 -CLκ共價連接之效應基團。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物(或樣本)，該MAC包含抗體(或彼之抗原結合部分)，其中至少約70%之抗體包含與至少一條輕鏈上之K188 -CLκ共價連接之效應基團。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物(或樣本)，該MAC包含抗體(或彼之抗原結合部分)，其中至少約80%之抗體包含與至少一條輕鏈上之K188 -CLκ共價連接之效應基團。在某些態樣中，本發明提供MAC之組成物(或樣本)，該MAC包含抗體(或彼之抗原結合部分)，其中至少約90%之抗體包含與至少一條輕鏈上之K188 -CLκ共價連接之效應基團。在某些態樣中，該效應基團係與二條輕鏈上之二個K188 -CLκ共價共軛。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分，其中至少約30%之該樣本包含與每抗體約二個位置共軛之效應基團，且其中至少一個效應基團共軛位置係K188 -CLκ。在某些態樣中，該量係約40%。在某些態樣中，該量係約50%。在某些態樣中，該量係約60%。在某些態樣中，該量係約70%。在某些態樣中，該量係約80%。在某些態樣中，該量係約90%。在某些態樣中，該量係約95%。在某些態樣中，該量係約99%。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分，其中至少約30%之該樣本包含與每抗體約三個位置共軛之效應基團，且其中至少二個效應基團共軛位置係在各輕鏈上之K188 -CLκ。在某些態樣中，該量係約40%。在某些態樣中，該量係約50%。在某些態樣中，該量係約60%。在某些態樣中，該量係約70%。在某些態樣中，該量係約80%。在某些態樣中，該量係約90%。在某些態樣中，該量係約95%。在某些態樣中，該量係約99%。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分，其中至少約30%之該樣本包含與每抗體約四個位置共軛之效應基團，且其中至少二個效應基團共軛位置係在各輕鏈上之K188 -CLκ。在某些態樣中，該量係約40%。在某些態樣中，該量係約50%。在某些態樣中，該量係約60%。在某些態樣中，該量係約70%。在某些態樣中，該量係約80%。在某些態樣中，該量係約90%。在某些態樣中，該量係約95%。在某些態樣中，該量係約99%。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，該MAC包含與效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分，其中至少約30%之該樣本包含與每抗體約五個位置共軛之效應基團，且其中至少二個效應基團共軛位置係在各輕鏈上之K188 -CLκ。在某些態樣中，該量係約40%。在某些態樣中，該量係約50%。在某些態樣中，該量係約60%。在某些態樣中，該量係約70%。在某些態樣中，該量係約80%。在某些態樣中，該量係約90%。在某些態樣中，該量係約95%。在某些態樣中，該量係約99%。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少50%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約60%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約65%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約70%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約75%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約80%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約85%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約90%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約95%之輕鏈分子係與至少一個效應基團共軛。
在某些態樣中，本發明提供MAC之樣本，其中至少約70%之重鏈分子不與該效應基團共軛。在某些態樣中，該量係約75%。在某些態樣中，該量係約80%。在某些態樣中，該量係約85%。在某些態樣中，該量係約90%。在某些態樣中，該量係約95%。在某些態樣中，該量係約99%。在某些態樣中，實質上所有重鏈分子皆不與該效應基團共軛。
在某些態樣中，本發明提供一種包含經由連接子與效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分之MAC，其特徵為該抗體或彼之抗原結合部分包含模體KHK，且該效應基團係與該K188 殘基(根據卡巴編號)之側鏈共軛。
在某些態樣中，該未經共軛之個別輕鏈片段之量具有選自約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55%之下限及選自約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60%之上限。在某些態樣中，在一個位置經共軛之個別輕鏈片段之量具有選自約25、30、35、40、45、50或55%之下限及選自約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95%之上限。在某些態樣中，在二個位置經共軛之個別輕鏈片段之量具有選自約1、2、3、4、5、6、7、8、9、5、10、15、20或25%之下限及選自約5、16、7、8、9、5、10、15、20、25、30、35或40%之上限。
在某些態樣中，該未經共軛之個別重鏈片段之量具有選自約50、55、60、65、70、75或80%之下限及選自約60、65、70、75、80、85、90、95或99%之上限。在某些態樣中，在一個位置經共軛之個別重鏈片段之量具有選自約1、2、5、10、15、20或25%之下限及選自約5、10、15、20、25、30、35、40或50%之上限。在某些態樣中，在二個位置經共軛之個別重鏈片段之量具有選自約0、1、2、3、4、5、10或15%之下限及選自約2、3、4、5、10、15或20%之上限。
在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數具有選自約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95或2之下限及選自約1.6、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2.0、2.05、2.1、2.15、2.2、2.25、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5或5之上限。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約1.5至約2.5。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約1.6至約2.4。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約1.7至約2.3。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約1.8至約2.2。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係選自約1.5、約1.55、約1.6、約1.65、約1.7、約1.75、約1.8、約1.85、約1.9、約1.95、約2.0、約2.05、約2.1、約2.15、約2.2、約2.25、約2.3、約2.4或約2.5之量。在某些態樣中，該量係約1.7。在某些態樣中，該量係約1.8。在某些態樣中，該量係約1.9。在某些態樣中，該量係約2。在某些態樣中，該量係約2.1。在某些態樣中，該量係約2.2。在某些態樣中，該量係約2.3。
在本發明之某些態樣中，每抗體之共軛數係小於2，其中該抗體族群中至少50%僅具有每抗體單一共軛。這些樣本係有利的，因為它們允許額外之共軛反應以剩餘之CLκ部位為目標。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約0.5至約1.5。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約0.6至約1.4。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約0.7至約1.3。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約0.8至約1.2。在某些態樣中，在本發明之樣本或組成物中每抗體之共軛數係介於約0.9至約1.1。
本發明的好處之一在於依照試劑及反應條件而定(特別是離去基團酯及連接子：抗體之莫耳比)，MAC之組成物及樣本可經產製為具有相對於訂定數量之抗體之訂定數量之效應基團。此特別可用於當平衡該效應基團及抗體之相對反應性及治療窗時。而且在某些情況中，增加每抗體之肽的數量超過一定閥值可能不會導致增加之標靶結合或治療效應。因此，能夠控制與每抗體共軛之肽的數量係為有用，而且藉此可引導共軛之位置以最小化Fc或結合位點之干擾。因此在某些情況中，允許減少共軛較佳地僅與單一K188 -CLκ共軛之本發明之態樣可具有好處。
在某些態樣中，MAC之樣本可為醫藥組成物。
IGFR抗體
在一些實施態樣中，該至少一個Ang2結合肽係經由在該抗IGF1R抗體上之離胺酸殘基的側鏈共軛。在一些實施態樣中，該至少一個Ang2結合肽係與該CL結構域共價連接。在一些實施態樣中，該至少一個Ang2結合肽係與該抗IGF1R抗體上之F(ab)區共價連接。在一些實施態樣中，該至少一個Ang2結合肽係與該抗IGF1R抗體之輕鏈恆定區共價連接。在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體係經由連接子與該Ang2結合肽共價連接。在一些實施態樣中，該Ang2結合肽不與該抗IGF1R抗體之C'端或N'端融合。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體係選自該些於WO02053596(US7,037,498)及WO2005016967(US7,371,378)中所描述者(各案之內容係併入本發明之中)。在一些實施態樣中，該MAC包含重鏈恆定結構域，該重鏈恆定結構域含有SEQ ID NO：5。
在一些實施態樣中，該MAC包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域係選自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：1之殘基1至122或SEQ ID NO：3之殘基1至122。在一些實施態樣中，該MAC包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域含有SEQ ID NO：3之殘基1至122。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHCDR1區，該VHCDR1區包含選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1之殘基26至35或SEQ ID NO：3之殘基26至35之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHCDR1區，該VHCDR1區含有SEQ ID NO：7。在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHCDR2區，該VHCDR2區包含選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：3之殘基50至64或SEQ ID NO：5之殘基50至64之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHCDR2區，該VHCDR2區含有SEQ ID NO：8。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHCDR3區，該VHCDR3區包含選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：1之殘基99至114或SEQ ID NO：3之殘基99至114之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHCDR3區，該VHCDR3區含有SEQ ID NO：9。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHFR1區，該VHFR1區包含選自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：1之殘基1至25、SEQ ID NO：3之殘基1至25、或SEQ ID NO：11之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHFR1區，該VHFR1區含有SEQ ID NO：11。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHFR2區，該VHFR2區包含選自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：1之殘基36至49或SEQ ID NO：3之殘基36至49之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHFR2區，該VHFR2區含有SEQ ID NO：12。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHFR3區，該VHFR3區包含選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：1之殘基65至98或SEQ ID NO：3之殘基65至98之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHFR3區，該VHFR3區含有SEQ ID NO：13。
在一些實施態樣中，該MAC之重鏈包含VHFR4區，該VHFR4區包含選自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：1之殘基115至122或SEQ ID NO：3之殘基115至122之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VHFR4區，該VHFR4區含有SEQ ID NO：14。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3區分別包含SEQ ID NO：3之殘基26至35、SEQ ID NO：3之殘基50至64及SEQ ID NO：3之殘基99至114之序列。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體之VHFR1、VHFR2、VHFR3及VHFR4區分別包含SEQ ID NO：3之殘基1至25、SEQ ID NO：3之殘基36至49、SEQ ID NO：3之殘基65至98、及SEQ ID NO：3之殘基115至122之序列。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之重鏈。在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含重鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：3。
在一些實施態樣中，該MAC包含輕鏈恆定結構域，該輕鏈恆定結構域含有SEQ ID NO：15。在一些實施態樣中，該MAC包含輕鏈恆定結構域，該輕鏈恆定結構域含有SEQ ID NO：45、46或47。
在一些實施態樣中，該MAC包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域係選自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2之殘基1至108或SEQ ID NO：4之殘基1至108。在一些實施態樣中，該MAC包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域含有SEQ ID NO：4之殘基1至108。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLCDR1區(輕鏈可變區互補決定區1)，該VLCDR1區包含選自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：2之殘基24至34或SEQ ID NO：4之殘基24至34之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLCDR1區，該VLCDR1區含有SEQ ID NO：17。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLCDR2區，該VLCDR2區包含選自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：2之殘基48至54或SEQ ID NO：4之殘基48至54之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLCDR2區，該VLCDR2區含有SEQ ID NO：18。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLCDR3區，該VLCDR3區包含選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：2之殘基89至97或SEQ ID NO：4之殘基89至97之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLCDR3區，該VLCDR3區含有SEQ ID NO：19。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLFR1區，該VLFR1區包含選自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：2之殘基1至23或SEQ ID NO：4之殘基1至23之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLFR1區，該VLFR1區含有SEQ ID NO：21。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLFR2區，該VLFR2區包含選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：2之殘基35至47或SEQ ID NO：4之殘基35至47之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLFR2區，該VLFR2區含有SEQ ID NO：22。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLFR3區，該VLFR3區包含選自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：2之殘基55至88或SEQ ID NO：4之殘基55至88之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLFR3區，該VLFR3區含有SEQ ID NO：23。
在一些實施態樣中，該MAC之輕鏈包含VLFR4區，該VLFR4區包含選自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQID NO：2之殘基98至108或SEQ ID NO：6之殘基98至108之序列。在一些實施態樣中，該MAC包含VLFR4區，該VLFR4區含有SEQ ID NO：25。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3區分別包含SEQ ID NO：4之殘基24至34、SEQ ID NO：4之殘基48至54及SEQ ID NO：4之殘基89至96之序列。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體之VLFR1、VLFR2、VLFR3及VLFR4區分別包含SEQ ID NO：4之殘基1至24、SEQ ID NO：4之殘基35至47、SEQ ID NO：4之殘基55至88、及SEQ ID NO：4之殘基97至108之序列。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含選自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之輕鏈。在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含輕鏈，該輕鏈含有SEQ ID NO：4。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：1且該輕鏈含有SEQ ID NO：2。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：3且該輕鏈含有SEQ ID NO：4。
抗體2.12.1已在WO02053596中被描述。產製對IGF1R具特異性之單株抗體的雜交瘤2.12.1係於2000年12月12日以寄存號PTA-2792被寄存於美國菌種保存中心(ATCC)(20110-2209維吉尼亞州馬納薩斯市大學道10801號)。
在一些實施態樣中，該抗IGF1R抗體包含於CLκ區中之模體K188 H189 x190 ，其中x係G、A、V、I、L、S、T、C、M、N、Q、D、E、F、Y、W、H、R或K(根據卡巴編號)。在一些態樣中，該抗IGF1R抗體係選自WO2009032145(US2009092614)或WO2005005635(US7,579,157)中之一者，二案之內容皆納入本發明。在一些實施態樣中，本發明之MAC包含與至少一個Ang2結合肽共軛之抗IGF1R抗體或彼之抗原結合部分，該共軛之方式不會廢除該抗體之IGF1R結合親和性。
在一些態樣中，該抗體以和該效應基團相同途徑內之不同標靶為目標。在一些態樣中，該抗體以和該效應基團不同之標靶為目標。
在一些態樣中，用來共軛之抗體可能用於腫瘤學之領域中。適當之抗體包括：利妥昔單抗(Rituximab)(RituxanTM )，一種嵌合性IgG1κ 、抗CD20抗體，用於治療癌及特別是非霍奇金氏淋巴瘤還有類風濕性關節炎；西妥昔單抗(Cetuximab)(ErbituxTM )，一種嵌合性IgG1κ 、抗EGF受體抗體，用於治療癌，特別是結腸癌、頭頸癌。
在一些態樣中，用來共軛之抗體可能用於自體免疫及其他免疫疾病之領域中。適當之抗體包括：英利昔單抗(Infliximab)(RemicadeTM )，一種嵌合性IgG1κ 、抗TNFα抗體，用於治療類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、克隆氏(Crohn’s)症、牛皮癬、乾癬性關節炎及關節黏連性脊椎炎；阿達木單抗(Adalimumab)(HumiraTM )，一種人IgG1κ 、抗TNFα抗體，用於治療類風濕性關節炎、克隆氏症、牛皮癬、乾癬性關節炎、幼年型自發性關節炎及關節黏連性脊椎炎；那他珠單抗(Natalizumab)(TysabriTM )，一種人化IgG4κ 、抗α4整合素抗體，用於治療多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬、幼年型自發性關節炎、乾癬性關節炎、關節黏連性脊椎炎、克隆氏症；奧馬珠單抗(Omalizumab)(XolairTM )，一種人化IgG1κ 、抗IgE抗體，用於治療過敏性氣喘；蘭尼單抗(Ranibizumab)(LucentisTM )，一種人化IgG1κ 、抗VEGF抗體，用於治療濕性AMD；及帕利珠單抗(Palivizumab)(SynagisTM )，一種人化IgG1κ 、抗RSV抗體，用於治療感染性疾病，包括呼吸道融合病毒。
在一些態樣中，本發明之化合物及組成物可被用於治療該等上述提及之狀況。
效應基團
該效應基團可為治療劑、蛋白質、肽、核酸、適體、小分子、蛋白質促效劑、蛋白質拮抗劑、代謝調節劑、荷爾蒙、毒素、生長因子或其他調節性蛋白質，或可為診斷劑諸如可被輕易地檢測或看見之酶，諸如辣根過氧化酶。
在一些態樣中，該效應基團可為蛋白質或肽，且可與該連接子經由肽連接殘基連接。該蛋白質或肽可包含胺基端加蓋基團R1 及羧基端加蓋基團R2 中之一或二者。R1 可為CH3 、C(O)CH3 、C(O)CH3 、C(O)CH2 CH3 、C(O)CH2 CH2 CH3 、C(O)CH(CH3 )CH3 、C(O)CH2 CH2 CH2 CH3 、C(O)CH(CH3 )CH2 CH3 、C(O)C6 H5 、C(O)CH2 CH2 (CH2 CH2 O)1-5 Me、二氯苯甲醯基(DCB)、二氟苯甲醯基(DFB)、吡啶基羧酸酯(PyC)或醯胺基-2-PEG、胺基保護基團、脂質脂肪酸基團或碳水化合物。R2 可為OH、NH2 、NH(CH3 )、NHCH2 CH2 、NHCH2 CH2 CH2 、NHCH(CH3 )CH3 、NHCH2 CH2 CH2 CH3 、NHCH(CH3 )CH2 CH3 、NHC6 H5 、NHCH2 CH2 OCH3 、NHOCH3 、NHOCH2 CH3 、羧基保護基團、脂質脂肪酸基團或碳水化合物。
該蛋白質或肽連接殘基可為K、K(SH)、離胺酸同源物、Dap、Dab、Orn、R、C、含硫醇殘基、S、T、Y、D、E、N或Q。該蛋白質或肽可經由該N端胺基酸之胺基端與該連接子連接。該蛋白質或肽可經由該C端胺基酸之羧基端與該連接子連接。額外之胺基酸殘基可被添加至該N或C端以作為連接殘基，不論經由該胺基酸之側鏈或該胺基或羧基端連接。
Ang2結合肽
該效應基團可為Ang2結合肽。在一些實施態樣中，該Ang2結合肽可包含選自該些於WO2008056346(US2008166364)(彼等之內容係納入本發明)中所描述之序列。在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 X9 D10 K11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 (SEQ ID NO：26)其中SEQ ID NO：26之X9 係醯基離胺酸(AcK)或白胺酸(以下稱之為Ang2-X9 )且其中該Ang2結合肽之X9 、K11 、L13 、Q16 、M18 、或L19 係由Ang2連接殘基所取代，該Ang2連接殘基包含與該連接子共價連接之親核性側鏈，該連接殘基係選自K、Y、S、T、H、離胺酸之同源物諸如K(SH)、同半胱胺酸、同絲胺酸、Dap、或Dab。在一些實施態樣中，該Ang2連接殘基可選自K、K(SH)、Y、S、T、H、Dap、或Dab。在一些實施態樣中，該Ang2連接殘基係K。該Ang2連接殘基可為K11 。在一些實施態樣中，該Ang2連接殘基可為K(SH)。該Ang2連接殘基可為K(SH)11 。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 (AcK)9 D10 K11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 (SEQ ID NO：27)其中Ang2-K11 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 L9 D10 K11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 (SEQ ID NO：28)其中Ang2-K11 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：
SEQ ID NO：29　Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 K9 D10 (AcK)11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 其中Ang2-K9 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：SEQ ID NO：30　Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 L9 D10 (AcK)11 T12 L13 Y14 D15 K16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 其中Ang2-K16 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：SEQ ID NO：31 Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 L9 D10 (AcK)11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 K18 L19 Q20 Q21 G22 其中Ang2-K18 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽包含下列序列：SEQ ID NO：32 Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 L9 D10 (AcK)11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 K19 Q20 Q21 G22 其中Ang2-K19 係該Ang2連接殘基。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽另包含N端加蓋基團R1 ，其中R1 係CH3 、C(O)CH3 、C(O)CH3 、C(O)CH2 CH3 、C(O)CH2 CH2 CH3 、C(O)CH(CH3 )CH3 、C(O)CH2 CH2 CH2 CH3 、C(O)CH(CH3 )CH2 CH3 、C(O)C6 H5 、C(O)CH2 CH2 (CH2 CH2 O)1-5 Me、二氯苯甲醯基(DCB)、二氟苯甲醯基(DFB)、吡啶基羧酸酯(PyC)或醯胺基-2-PEG、胺基保護基團、脂質脂肪酸基團或碳水化合物。
在一些實施態樣中，該Ang2結合肽另包含C端加蓋基團R2 ，其中R2 係OH、NH2 、NH(CH3 )、NHCH2 CH2 、NHCH2 CH2 CH3 、NHCH(CH3 )CH3 、NHCH2 CH2 CH2 CH3 、NHCH(CH3 )CH2 CH3 、NHC6 H5 、NHCH2 CH2 OCH3 、NHOCH3 、NHOCH2 CH2 、羧基保護基團、脂質脂肪酸基團或碳水化合物。
在一些實施態樣中，R1 可為C(O)CH3 。在一些實施態樣中，R2 可為NH2 。
該Ang2結合肽加上N端及C端加蓋基團可包含下式：[C(O)CH3 ]-[SEQ ID NO：27]-[NH2 ]：[C(O)CH3 ]-Q1 (Ac K)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 (Ac K)9 D10 K11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q21 G22 -[NH2 ]，其中Ang2-K11 係該Ang2連接殘基。
本發明所描述之Ang2肽可如所述之與多種類型之抗體共軛，特別是用於治療增生性疾病(諸如癌或血管生成增加)之抗體，且亦可與酶催化性抗體諸如h38C2共軛以形成MAC。
連接子
本發明之效應基團(諸如小分子、適體、核酸、蛋白質或肽(例如Ang2結合肽))可藉由連接子以與該抗體或彼之抗原結合部分(例如抗IGF1R抗體)共價連接。該連接子可藉由該肽連接殘基之側鏈的胺基與該肽共價連接。此可為離胺酸殘基。在一些實施態樣中，該連接殘基係硫醇攜帶殘基，諸如Cys或K(SH)且該連接子係經由該連接殘基之末端硫醇基團與該肽共價連接。
該連接子可為直鏈或分歧(以允許每共軛加成與超過一個效應基團共軛)，及可任意選擇地包括一或多個碳環或雜環基。連接子長度可被視為在該效應基團與抗體之間的直鏈原子之數量，有環狀基團諸如芳香環及類似者以採取沿著該環之最短路徑計算。在一些實施態樣中，該連接子具有介於5至15個原子之直鏈片段，在其他實施態樣中15至30個原子，在仍其他實施態樣中30至50個原子，在仍其他實施態樣中50至100個原子，及在仍其他實施態樣中100至200個原子。在一些實施態樣中，該連接子之長度係具有選自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190之下限及選自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200之上限之範圍。
其他連接子考量包括對該形成之化合物之物理或藥物動力學性質之影響，諸如溶解性、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(較穩定或較不穩定及較多或較少之預定降解)、剛性、柔韌性、免疫原性、調節抗體結合、被納入微胞或脂質體之中的能力及類似者。
該連接子可為肽基連接子。在一些實施態樣中，該肽基連接子可為介於3至20個胺基酸長，諸如重複單一胺基酸殘基(例如聚甘胺酸)或胺基酸殘基之組合以得到給予該效應基團之有利表現或藥物動力學之肽連接子。與活化基團之存在最為相容之肽基連接子可能缺乏離胺酸及組胺酸殘基。SEQ ID NO：59係示範性肽基連接子。
或者，該連接子可為非肽基連接子。這種類型之連接子的典型範例將為該些以各種長度之直鏈或支鏈烴或聚乙二醇為基礎者。這些連接子可能併入其他基團以影響溶解性、剛性、等電點，諸如芳香或非芳香環、鹵素、酮、醛、酯、磺醯基、磷酸鹽基等。
在本發明之某些態樣中，該連接子可包含式：-X-Y-Z-；其中X係與該效應基團連接之基團(例如經由肽連接殘基)，Y係間隔子區，且Z係與抗體(例如抗IGF1R抗體)上之離胺酸或半胱胺酸殘基之側鏈連接之基團。在某些態樣中，當未與抗體連接時該連接子可為式XYZ*，其中Z*係離去基團，以使當與該抗體共軛時，該離去基團Z*與抗體之共軛部位反應以形成該經共軛之連接子XYZ。
X可被選擇以使得與該效應基團之連接得以採用特定方向性共價連接策略(例如經由肽連接殘基)。在某些態樣中，X可選自COOH、異氰酸酯、異硫氰酸酯、醯基疊氮、磺酸、磺醯基鹵化物、醛、酮、環氧化物、碳酸酯、芳基化試劑、亞胺酸酯、胺基或順丁烯二醯亞胺基團。舉例來說，當該肽連接殘基包含親核基時，X可為親電子基，且反之亦然。舉例來說，若該肽連接殘基側鏈包含胺基，諸如K、H、鳥胺酸、Dap或Dab，X可為COOH或其他類似之反應性親電子劑，例如異氰酸酯、異硫氰酸酯、醯基疊氮、磺酸、磺醯基鹵化物、醛、酮、環氧化物、碳酸酯、芳基化試劑或亞胺酸酯。若該肽連接殘基係D或E，X可包含親核基，諸如胺基。這些策略中之任一者允許在該X基團與該肽連接殘基之間藉由醯胺鍵形成策略形成共價鍵結。舉例來說，當X係COOH時，其可能被活化成為五氟苯基酯。在此情況中，與肽連接肽上之胺基反應導致醯胺鍵形成，而該五氟苯酚係離去基團(其可被稱為X*)。
箭頭表示與該肽連接殘基連接之點，該平行線代表與該連接子之Y基團連接之點。
當該肽連接基團係C、C之同源物或其他含硫醇基之殘基(諸如K(SH))時，X可包含順丁烯二醯亞胺基，此允許硫醇-順丁烯二醯亞胺添加反應策略得以共價連接該X基團與該肽連接殘基。在某些態樣中，X可為順丁烯二醯亞胺
其中該箭頭表示與該肽連接殘基連接之點，該平行線代表與該連接子之Y基團連接。為了命名之簡單起見，本發明所描述之利用順丁烯二醯亞胺基建構之連接子被稱為含順丁烯二醯亞胺連接子，其可以MAL表示，即使在建構該連接子之後，該順丁烯二醯亞胺基通常被轉換成琥珀醯亞胺環。
在某些態樣中，該連接殘基係K(SH)且該X基團係順丁烯二醯亞胺。
在某些態樣中，X可包含五氟苯基酯活化之羧基官能基，其可與該肽上之離胺酸側鏈形成醯胺。
在某些態樣中，X可包含硫醇基，此允許在該肽連接殘基與X基團之間形成雙硫鍵。
在一些實施態樣中，Y係可生物相容之連接鏈，包括任何選自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br或I之原子，可包含一或多種胺基酸、聚合物或團聯共聚物。Y可被選擇以提供介於2至100個原子之該連接子之整體長度。Y可被選擇以使該連接子之整體長度係介於5至30個原子。Y可被選擇以使該連接子之整體長度係15至25個原子。Y可被選擇以使該連接子之整體長度係介於約17至約19個原子。
在某些態樣中，Y可為胺基聚乙二醇酸，諸如：
其中n=0至10，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，及在某些態樣中1。
在某些態樣中，Y可為聚乙二醇二酸，諸如：
其中n=0至10，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，在某些態樣中1，及在某些態樣中2。
在本發明之某些態樣中，該連接子之Y部分包含下式：
在某些態樣中，Y可為胺基烷酸，諸如：
其中n=0至20，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，在某些態樣中1，及在某些態樣中2。
在某些態樣中，Y可為烷二酸，諸如：
其中n=0至20，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，在某些態樣中1，及在某些態樣中2。
在某些態樣中，Y可為聚甘胺酸，諸如：
其中n=0至10，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，在某些態樣中1，及在某些態樣中2。
在某些態樣中，Y、X-Y、Y-Z及X-Y-Z可選自下列：
其中m、n及j係各自獨立地0至30。在某些態樣中n=1至10，在某些態樣中n=1至5。在某些態樣中，n數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可為1。N可為2。N可為3。N可為4。N可為5。N可為6。在某些態樣中m=1至10，在某些態樣中m=1至5。在某些態樣中，m數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可為1。M可為2。M可為3。M可為4。M可為5。M可為6。在某些態樣中j=1至10，在某些態樣中j=1至5。在某些態樣中，j數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可為1。J可為2。J可為3。J可為4。J可為5。J可為6。在某些態樣中，Y之整體長度不超過200個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過150個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過100個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過50個原子。在某些態樣中，Y之整體鏈長度之範圍以原子數而言具有選自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60之下限及選自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100之上限。在某些態樣中，該XYZ連接子可能與上述之Y基團相同。在某些態樣中，該波狀線與該X基團連接。在某些態樣中，該平行線與該X基團連接。在某些態樣中，該波狀線與該Z基團連接。在某些態樣中，該平行線與該Z基團連接。在某些態樣中，該波狀線與該K188 -CLκ之側鏈連接。在某些態樣中，該平行線與該K188 -CLκ之側鏈連接。在某些態樣中，該波狀線與該效應基團連接。在某些態樣中，該平行線與該效應基團連接。
在某些態樣中，Y、Y-Z及/或X-Y可為順丁烯二醯亞胺PEG酸，諸如：
其中n=1至12，在某些態樣中1至10，在某些態樣中1至5，在某些態樣中1，及在某些態樣中2。
在某些態樣中，Y、Y-Z及/或X-Y可為順丁烯二醯亞胺PEG酸，諸如：
其中n數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可為1。N可為2。N可為3。N可為4。N可為5。N可為6。在某些態樣中，Y、Y-Z及/或X-Y包含下式：
Z*可被選擇以使得與該抗體上之離胺酸側鏈連接得以採用特定方向性共價連接策略。舉例來說，Z可為COOH或另一類似之反應性親電子劑以利用多種可能的醯胺鍵形成策略中之一者與該表面離胺酸側鏈之ε-胺基反應。
在某些態樣中，Z*可被用於形成活性酯。活性酯與胺連接，因此可與該抗體之離胺酸側鏈的ε-胺基共軛。該能使活性酯形成之Z羧基官能基將存在於Y基團之末端。該活性酯之醇基或酚基官能基在共軛反應期間作為離去基團Z*，得以經由產生醯胺以與該抗體上之離胺酸側鏈連接。
在一些實施態樣中，該Z*基團包含下式之結構：
其中R’係脂肪族或芳香族基。
在一些實施態樣中，該Z*基團係為下式：
其中R’=單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且可以介於1至5之量存在。在一些實施態樣中，R1 可為鹵素，且可存在4或5個鹵素原子。在一些實施態樣中，可能有4個R1 原子。在一些實施態樣中，可能有5個R1 原子。在一些實施態樣中，Z*可為四氟苯基。在一些實施態樣中，Z*可包含下式：
其中該平行線代表與該連接子之Y部分連接之點。
在一些態樣中，該Z*基團係為下式：
其中R’=單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且h=1、2、3、4或5。在一些實施態樣中，R1 可為鹵素。在一些實施態樣中，R1 係F或Cl，且h=4或5。在一些實施態樣中，R1 係F或Cl，且h=5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=2、3、4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=3、4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=5。在某些態樣中，Z*可選自下列：
以該等活性酯而言，該離去基團係Z*且該Z基團本身係與該Y基連接之羰基。當與該抗體反應時，該Z*基形成醯胺，如下所示：
在一些實施態樣中，Z係
在一些實施態樣中，該Z*基團包含方酸鹽酯諸如
其中R=脂肪族基或經取代之芳香族基，且可選自：
在一些實施態樣中，該Z基團包含順丁烯二醯亞胺基：
在某些態樣中，該X*YZ*連接子包含下列結構之順丁烯二醯亞胺-PEG-PFP酯：
其中n=1至12。在某些態樣中，n=1至5。在某些態樣中，n=2。在某些態樣中，n=1。
在某些態樣中，該MAC包含下式之XYZ連接子：
其中n=1至12。在某些態樣中，n=1至5。在某些態樣中，n=1至3。在某些態樣中，n=2。在某些態樣中，n=1。
在某些態樣中，該X*YZ*連接子包含選自下列之結構：
其中m、n及j係各自獨立地0至30，R1係F且h=2、3、4或5。在某些態樣中n=1至10，在某些態樣中n=1至5。在某些態樣中，n數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可為1。N可為2。N可為3。N可為4。N可為5。N可為6。在某些態樣中m=1至10，在某些態樣中m=1至5。在某些態樣中，m數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可為1。M可為2。M可為3。M可為4。M可為5。M可為6。在某些態樣中j=1至10，在某些態樣中j=1至5。在某些態樣中，j數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可為1。J可為2。J可為3。J可為4。J可為5。J可為6。在某些態樣中，Y之整體長度不超過200個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過150個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過100個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過50個原子。在某些態樣中，Y之整體鏈長度之範圍以原子數而言具有選自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60之下限及選自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100之上限。
在某些態樣中，該MAC包含下式之XYZ連接子：
在某些態樣中，該X*YZ*連接子包含下式之PEG-雙-五氟苯基酯：
其中n=1至12。在某些態樣中，n=1至10。在某些態樣中，n=1至5。在某些態樣中，n=2。在某些態樣中，n=1。
在某些態樣中，該MAC包含下式之XYZ連接子：
在某些態樣中，該MAC包含下式之XYZ連接子：
在一些實施態樣中，該肽當與該XYZ*連接子繫鏈時包含下式：
在一些實施態樣中，該與XYZ*連接子繫鏈之肽包含下式：
在某些態樣中，該MAC包含下式之化合物：
其中Ang2-K係Ang2結合肽之離胺酸或經修飾之離胺酸殘基，且Ab-K-Ab'係抗IGF1R抗體上之離胺酸殘基。
在某些態樣中，該MAC包含下式之化合物：
其中Ang2-K係Ang2結合肽之離胺酸或經修飾之離胺酸殘基，且Ab-K-Ab'係抗IGF1R抗體上之離胺酸殘基。
在某些態樣中，該MAC包含下式：
其中Ab-K-Ab'係抗體2.12.1.fx之K188 。
在某些態樣中，該MAC包含下式：
其中Ab-K-Ab'係抗體2.12.1.fx之K188 。
在某些態樣中，該MAC包含與每抗體(其可為抗IGF1R抗體)共軛之2個肽(其可為Ang2結合肽)。在某些態樣中，一肽係與該抗體或彼之抗原結合片段(其可為抗體2.12.1.fx)之2個K188 殘基中之各者共軛。
在某些態樣中，該MAC包含選自下列之式：
其中K188 -CLK係與該K188 -CLκ之側鏈的共價連接，Effector Moiety-LR係與該效應基團之共價連接，且m、n及j係各自獨立地0至30。在某些態樣中n=1至10，在某些態樣中n=1至5。在某些態樣中，n數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且n數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。N可為1。N可為2。N可為3。N可為4。N可為5。N可為6。在某些態樣中m=1至10，在某些態樣中m=1至5。在某些態樣中，m數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。M可為1。M可為2。M可為3。M可為4。M可為5。M可為6。在某些態樣中j=1至10，在某些態樣中j=1至5。在某些態樣中，j數值之範圍的下限係選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且j數值之範圍的上限係選自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。J可為1。J可為2。J可為3。J可為4。J可為5。J可為6。在某些態樣中，Y之整體長度不超過200個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過150個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過100個原子。在某些態樣中，Y之整體長度不超過50個原子。在某些態樣中，Y之整體鏈長度之範圍以原子數而言具有選自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60之下限及選自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100之上限。
共軛方法
在某些態樣中，本發明提供製備多功能抗體共軛物(MAC)之方法，該MAC包含抗體或彼之抗原結合部位，該抗體係經由與CLκ-K188 (根據卡巴編號)之側鏈連接之連接子與至少一種效應基團共價共軛，該方法包含：共價連接該效應基團與末端為下式之離去基Z*之連接子：
其中R1 係單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基或三氟甲基且可能以介於1至5之量存在，及使該如此形成之效應基團-連接子-離去基複合體與該抗體以介於約3.5：1至約4.5：1之效應基團：抗體莫耳比反應。在某些態樣中，該莫耳比係約3.7：1至約4.3：1。
在一些態樣中，該Z*基團係為下式：
其中R1 =單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基或三氟甲基，且h=1、2、3、4或5。在一些實施態樣中，R1 可為鹵素。在一些實施態樣中，R1 係F或Cl，且h=4或5。在一些實施態樣中，R1 係F或Cl，且h=5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=2、3、4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=3、4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=4或5。在一些實施態樣中，R1 係F，且h=5。在某些態樣中，Z*可選自下列：
R1 可以介於3至5之量存在。可能有3個R1 基團。R1 可以介於4至5之量存在。可能有4個R1 基團。可能有5個R1 基團。R1 可能是氟。R1 可能是氯。R1 可能是溴。該離去基可包含下式：
在某些態樣中，本發明提供製備MAC之方法，其中該MAC包含與至少一種效應基團共價連接之抗體(或彼之片段)，該效應基團與額外標靶(諸如肽、小分子、適體、核酸分子或蛋白質)結合，其中該效應基團包含具有PFP離去基之連接子，該PFP離去基能與該抗體之表面離胺酸殘基的ε-胺基反應。在某些態樣中，本發明提供用於共軛效應基團(諸如肽)與包含κ輕鏈恆定區之抗體之方法，該κ輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47之殘基62至103，該方法包含使該效應基團與包含下式之離去基團之連接子共軛：
其中R1 係單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基、三氟甲基，且可以介於1至5之量存在，使該離去基團與SEQ ID NO：15之K80 側鏈反應，以提供具有與該輕鏈恆定區共軛之效應基團之抗體。
該抗體可包含實質上與SEQ ID NO：15之殘基74至106同源之輕鏈恆定區。該抗體可包含實質上與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47之殘基62至103同源之輕鏈恆定區。在某些態樣中，該抗體可包含實質上與SEQ ID NO：15之殘基74至90同源之輕鏈區。在某些態樣中，該效應基團係與SEQ ID NO：15之K80 共軛。在某些態樣中，該效應基團係與K82 共軛。在某些形式中，Ang2結合肽係與抗IGF1R抗體之CLκ-K188 (根據卡巴編號)共軛。
在某些態樣中，該方法包含使抗體或彼之抗原結合部分與效應基團組合，其中該效應基團係與包含PFP離去基團之連接子共價連接。
在某些態樣中，本發明提供用於共軛效應基團與蛋白質之方法，其中該效應基團係與末端為下式之離去基團Z*之連接子連接：
其中R’=單獨或經組合之F、Cl、Br或I中之任一者、硝基、氰基、三氟甲基，且可以介於1至5之量存在，該蛋白質包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47之殘基62至103，其中包含K80 以使該效應基團與該K80 殘基之ε-胺基共軛，該方法包含使該效應基團及相連之連接子與該蛋白質以介於約3.7：1至約4.3：1之效應基團：蛋白質莫耳比反應。
在某些態樣中，該效應基團、連接子及離去基團可如本發明所述。在某些態樣中，該蛋白質可包含抗體輕鏈恆定區。在某些態樣中，該蛋白質可包含SEQ ID NO：15且該共軛部位係K80 。
在某些態樣中，該效應基團：抗體之莫耳比(例如ABP：抗IGF1R抗體)係介於約2.5至約4.6：1。在本發明之某些態樣中，該莫耳比係約3.7：1至約4.3：1。在本發明之某些態樣中，該效應基團：抗體之莫耳比係約4：1。在某些態樣中，該莫耳比係介於約2：1至約7：1。在某些態樣中，該莫耳比係介於約3：1至約6：1。在某些態樣中，該莫耳比係介於約3：1至約7：1。在某些態樣中，該莫耳比係介於約3：1至約5：1。
在希望每抗體具有少於1.5共軛之本發明之態樣中(諸如其中需要單一效應基團時)，該莫耳比可介於約1：1至約6：1，其中該緩衝液包含濃度至少為0.02M之HEPES。該HEPES之濃度可介於約0.1M至約1M。該HEPES之濃度可介於約0.1M至約0.5M。在希望每抗體具有少於1.5共軛之本發明之態樣中(諸如其中需要單一效應基團時)，該莫耳比可介於約1：1至約3：1。
在某些態樣中，該較佳之莫耳比係一範圍，該範圍具有選自約1、約1.2、約1.4、約1.5、約1.6、約1.8、約2、約2.2、約2.4、約2.5、約2.6、約2.8、約3、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.8、約6、約6.2、約6.4、約6.5、約6.6、約6.8、約7、約7.3、約7.5、約7.7、約8、約8.5、約9、約9.5或約10比1之下限，及選自約1.5、約1.6、約1.8、約2、約2.2、約2.4、約2.5、約2.6、約2.8、約3、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.8、約6、約6.2、約6.4、約6.5、約6.6、約6.8、約7、約7.3、約7.5、約7.7、約8、約8.5、約9、約9.5、約10或約15比1之上限。
在某些態樣中，本發明另包含使該效應基團與蛋白質一起共軛至少約30分鐘。在某些態樣中，該期間係至少約60分鐘。在某些態樣中，該期間係至少約2小時。在某些態樣中，本發明另包含使該效應基團與抗體在約4℃至約40℃之間共軛。在某些態樣中，本發明另包含使該效應基團與抗體在約10℃至約30℃之間共軛。在某些態樣中，本發明另包含使該效應基團與抗體在約15℃至約30℃之間共軛。在某些態樣中，該反應係於約18℃至約25℃進行。在某些態樣中，該反應係於約22℃進行。在某些態樣中，該反應係於約室溫中進行。
在某些態樣中，該共軛反應發生在介於約pH 6.5至約pH 8.0之間。在某些態樣中，該共軛反應發生在介於約pH 6.75至約pH 8.0之間。在某些態樣中，該共軛反應發生在約pH 7.7。在某些態樣中，該共軛反應發生在約pH 7。在某些態樣中，該共軛反應發生在約pH 7.2。在某些態樣中，該共軛反應發生在約pH 7.5。在某些態樣中，該共軛反應發生在介於pH數值之範圍之間，該範圍之下限係選自5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，該範圍之上限係選自6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.5或9。
在某些態樣中，該pH可為低於6.5；此特別適用於需要每抗體少於約1.5共軛之應用中。在某些態樣中，該pH係介於約5.5至約6.5。
在某些態樣中，該鹽濃度可低於約0.2M。該鹽可為鹵化鹽(F、Cl、Br、I)且可包含金屬諸如Li、Na、K、Be、Mg、Ca。該鹽可為NaCl。該鹽可為KCl。可使用上述之鹽約0.1M之濃度以限制每抗體共軛之速率及/或數量。該鹽濃度可介於約0至約0.1M。該鹽濃度可介於約0至約0.5M。該鹽濃度可介於約0至約0.3M。
在某些態樣中，本發明之方法包含調製該抗體或彼之抗原結合部分於約pH 5.5之調製緩衝液中。該調製緩衝液可為醋酸鈉及海藻糖緩衝液。此緩衝液具有不包含任何一級胺之好處，因此有利於pH之調整。該抗體可以約15至約25毫克/毫升之量存在。在某些態樣中，該抗體可以20毫克/毫升之量存在。
該調製緩衝液之pH可被調整至約pH 7.2至約pH 8.0；在一些實施態樣中，該調製緩衝液可被調整至pH 7.7。該調製緩衝液之pH可利用磷酸鹽緩衝液調整。該磷酸鹽緩衝液可為介於約40mM至約80mM之濃度。該磷酸鹽緩衝液可為介於約10mM至約200mM之濃度。
在某些態樣中，該抗體在該效應基團/連接子與離去基團Z*共軛反應期間之濃度可為一範圍，其中該範圍之下限係選自約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約30或約40毫克/毫升，及該範圍之上限係選自約7、約8、約9、約10、約15、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約150、約200、約500毫克/毫升。
該效應基團(諸如肽或ABP)可被重構為至少約2毫克/毫升之濃度。該效應基團可在使用前於經稀釋之丙二醇中被重構為約5至約20毫克/毫升之濃度，且在一些實施態樣中可為10毫克/毫升之濃度。
該共軛反應可藉由以4莫耳效應基團比1莫耳抗體之莫耳比組合該抗體或彼之抗原結合部分與該效應基團加以進行，並於約18℃至約25℃培養約2至約24小時。在一些實施態樣中，該抗體與效應基團之間的共軛反應係於室溫中進行2小時。在一些實施態樣中，該共軛反應係至少約2小時。在一些實施態樣中，該共軛反應係至少約30分鐘。
該反應可被淬熄及調整至約pH 5.0至約pH 6.0。在一些實施態樣中，該經淬熄之反應可被調整至pH 5.5。此可利用例如約pH 4.0之琥珀酸鹽及甘胺酸緩衝液達成。此緩衝液具有優於其他較常見緩衝液諸如TRIS或其他胺基酸緩衝液之好處。該琥珀酸鹽有助於防止滲濾時之聚集及沉澱(會對該共軛分子施加應力)，甘胺酸含有額外之一級胺(特別是在MAC-1及MAC-2之例中)。
該反應可經濃縮，且未反應之效應基團(例如肽或ABP)、相關物種(諸如其中該連接子藉由與水溶劑之反應被水解之肽)及其他該反應混合物之未反應元件(諸如PFP)可藉由滲濾移除，例如使用50 kDa之膜或大小排除層析至琥珀酸鹽、甘胺酸、氯化鈉及海藻糖緩衝液pH 5.5於30毫克/毫升。
在某些態樣中，該方法可包含共軛效應基團與CLκ-K188 (根據卡巴編號)。在某些態樣中，本發明包含使肽與抗體或彼之抗原結合部分之輕鏈λ結構域共軛，其包含以CLκ區之對應部分取代CLλ區之一部分，使該肽與包含如本發明所定義之離去基團Z*之連接子連接，及使該肽-連接子-離去基團複合體與該抗體反應，其中該經取代至該抗體中之CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基62至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO ：15、45、46或47之至少殘基62至106。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基1至103。在某些態樣中，該CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基1至106。
在某些態樣中，本發明包含使肽與小鼠抗體或彼之抗原結合部分之輕鏈結構域共軛，其包含以人CLκ區之對應部分取代小鼠CL區之一部分，使該肽與包含如本發明所定義之離去基團Z*之連接子連接，及使該肽-連接子-離去基團複合體與該抗體反應，其中該經取代至該抗體中之人CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基62至103。在某些態樣中，該人CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基62至106。在某些態樣中，該人CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基1至103。在某些態樣中，該人CLκ區包含SEQ ID NO：15、45、46或47之至少殘基1至106。本發明之該些態樣可為有利，因為小鼠CLκ區不包含K188 (在小鼠CLκ中之對應序列係RHN；見SEQ ID NO：49之殘基79至81)。
本發明之醫藥組成物
本發明提供包含MAC及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。本發明所使用之“醫藥上可接受之載劑”包括任何和所有溶劑、分散媒質、塗料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收遲延劑、及生理上可互容之類似者。醫藥上可接受之載劑之實例包括一或多種水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇及類似者及彼等之組合和，且可包括等滲劑，例如在該組成物中之糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。醫藥上可接受之材料諸如微量之輔助材料(諸如濕潤劑或乳化劑、保存劑或緩衝劑)，其能增加該抗體或抗體部分之置架時間或有效性。
本發明之組成物可呈現各種形式。這些形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如注射用及輸注用溶液)、分散液、懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。該較佳之形式依所欲之投予模式及治療應用而定。典型較佳之組成物係呈注射或輸注溶液之形式，諸如類似該些用於人之通常以抗體進行被動性免疫接種所使用之組成物。該較佳之投予模式係非經腸投予(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)。在較佳之實施態樣中，該抗體係藉由靜脈內輸注或注射投予。在另一較佳之實施態樣中，該抗體係藉由肌肉內或皮下注射投予。
該醫藥組成物可能另包含其他成分，諸如抗腫瘤劑或顯影劑。本發明之另一態樣提供包含本發明之MAC之套組及包含該等抗體之醫藥組成物。套組除了該MAC或醫藥組成物之外，還可包括診斷劑或治療劑。套組亦可包括於診斷或治療方法中之使用說明。在一些實施態樣中，該套組包括抗體或彼之醫藥組成物及診斷劑。在其他實施態樣中，該套組包括抗體或彼之醫藥組成物及一或多種治療劑，諸如額外之抗腫瘤劑(antineoplastic agent,anti-tumor agent)或化學治療劑。
本發明之該等劑及化合物可與醫藥上可接受之載劑(諸如鹽水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液及類似者)組合。特定投藥配方亦即劑量、時間及重複性將依特定個體及該個體之醫學病史而定。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，可能包括例如緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
含有本發明之化合物之脂質體係以該領域已知之方法製備，諸如美國專利第4,485,045及4,544,545號中所述者。循環時間延長之脂質體係揭露於美國專利第5,013,556號。特別有用之脂質體可利用逆相蒸發方法以包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物產製。脂質體被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
該活性成分亦可被包封於藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化所製備之微膠囊中例如分別於羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊中、於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中。該等技術係揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack Publishing(2000)。
可能製備持續釋放性製劑。持續釋放製劑之適當實例包括含有該抗體之固相疏水性聚合物之半透性基體，該基體係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
欲用於活體內 投予之調製劑必須為無菌。此可輕易地藉由例如無菌過濾膜之過濾達成。本發明之治療性化合物通常被置放於具有無菌接口之容器中，例如具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
適當之乳液可利用自商業途徑獲得之脂質乳液製備，諸如IntralipidTM 、LiposynTM 、InfonutrolTM 、LipofundinTM 及LipiphysanTM 。該活性成分可被溶解於預先混合之乳液組成物中，或者可被溶解於油中(例如大豆油、紅花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。將瞭解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以調整該乳液之張力。適當之乳液通常將含有最高20%例如介於5至20%之油。該脂肪乳液可包含介於0.1至1.0微米特別是0.1至0.5微米之脂肪液滴，且具有介於5.5至8.0之pH。
該乳液組成物可為該些藉由混合本發明之化合物與IntralipidTM 或彼之成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備者。
用於吸入或噴入之組成物包括在醫藥上可接受之水性或有機溶劑或彼等之混合物中之溶液及懸浮液和粉末。該液體或固體組成物可能包含如前述之適當之醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施態樣中，該組成物係以經口或經鼻呼吸途徑投予以提供局部或系統性效應。在醫藥上可接受之較佳無菌溶劑中之組成物可藉由使用氣體加以噴霧化。經噴霧化之溶液可從噴霧裝置直接吸入，或該霧化裝置可與面罩、帷幕或間歇性正壓呼吸器連接。溶液、懸浮液或粉末組成物可自裝置較佳地經口或經鼻投予，該裝置以適當方式遞送調製劑。
本發明之化合物及組成物可與已建立之用於相關適應症之治療一起使用。實例包括用於血管生成疾病特別尤其是癌之5-氟尿嘧啶、伊立替康(irinotecan)、草酸鉑(oxilaplatin)、西妥昔單抗(cetuximab)、舒尼替尼(sunitinib)及利妥昔單抗(rituximab)。其他實例包括蘭尼單抗(ranibizumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、那他珠單抗(natalizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)及帕利珠單抗(palivizumab)。
本發明之治療性方法
本發明亦提供治療性方法。治療性方法包含投予本發明之化合物或組成物至需要該化合物或組成物之個體。
本發明提供本發明之化合物或本發明之醫藥組成物於抑制或減少血管生成之方法之用途或用於治療或預防與血管生成病狀有關之疾病或症狀之用途。本發明提供抑制或減少血管生成或治療或預防與血管生成病狀有關之疾病或症狀之方法，該方法包含投予治療有效劑量之本發明之化合物及組成物至病患。本發明亦提供遞送或投予本發明之化合物及組成物之方法及使用本發明之化合物及組成物之治療方法。本發明亦提供治療癌之方法，該方法包含投予治療有效量之根據本發明之化合物或醫藥組成物至個體。本發明所使用之血管生成媒介之狀況係一種藉由異常血管生成活性所造成之狀況或一種其中調節血管生成活性之化合物具有治療用途之狀況。可利用本發明之化合物及組成物治療及/或診斷之疾病和狀況包括癌、關節炎、高血壓、腎疾病、牛皮癬、與眼疾病、感染或手術介入有關之眼睛的血管生成、黃斑變性、糖尿病視網膜病及類似者。
更特別地，當於此處與本發明有關之使用時，“癌”之實例包括肺癌(NSCLC及SCLC)、頭或頸癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、肛門區域之癌、胃癌、乳癌、腎癌、輸尿管癌、腎盂癌、甲狀腺癌、膀胱癌、腦癌、腎細胞癌、中樞神經系統(CNS)之癌、CNS之腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、脊軸腫瘤、口咽癌、咽下癌、食道癌、胰癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、尿道癌、淋巴瘤、或一或多種前述癌之組合。又更特別地，當於此處與本發明有關之使用時，“癌”之實例包括選自下列之癌：肺癌(NSCLC及SCLC)、乳癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、前列腺癌、肛門區域之癌或一或多種前述癌之組合。
在其他實施態樣中，本發明之醫藥組成物關於非癌性過度增生性疾病諸如但不限於年齡相關性黃斑變性、血管成形術後之再狹窄及牛皮癬。在另一實施態樣中，本發明關於用於治療哺乳動物之醫藥組成物，該哺乳動物需要活化IGF1R及/或Ang2，其中該醫藥組成物包含治療有效量之本發明之活化抗體及醫藥上可接受之載劑。本發明之醫藥組成物可被用於治療骨質疏鬆症、脆弱性(frailty)或其中該哺乳動物分泌太少活性生長激素或無法對生長激素反應之病狀。
此處所使用之藥物、化合物或醫藥組成物之“有效劑量”或“有效量”係指足以影響任一或多種有益或所欲結果之量。就預防性用途而言，有益或所欲結果包括消除或減少疾病之風險、減輕疾病之嚴重性或延遲疾病之開始，包括該疾病之生化學、組織學及/或行為學之症狀、在該疾病發展期間所表現之彼之併發症及中間病理學表型。就治療性用途而言，有益或所欲結果包括諸如減少腫瘤大小、減少擴散、減少腫瘤之血管、減少一或多種癌或其他與增加血管生成有關之疾病之症狀、降低治療該疾病所需之其他藥物之劑量、提高其他藥物之效應、及/或延緩病患之疾病進程之臨床結果。有效劑量可分一或多次投予。就本發明之目的而言，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量係足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如在臨床背景下所了解的，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量可能與或不與另一藥物、化合物或醫藥組成物組合達到。因此，“有效劑量”可在投予一或多種治療劑之情況中被考慮，且單一劑可被考慮給予有效量若與一或多種其他劑組合時可能或係經達成所欲之結果。
「個體」或「對象」係哺乳動物，更佳者係人。哺乳動物亦包括但不限於農場動物、競賽動物、寵物、靈長動物及馬。
有利地，治療性投予本發明之化合物導致減少血管生成及/或在癌之例中穩定或減少之腫瘤體積。較佳地，腫瘤體積相較於投予本發明之MAC之前係至少減少約10%或約15%。更佳地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少約20%。又更佳地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少30%。有利地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少40%。更有利地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少50%。非常有利地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少60%。最佳地，腫瘤體積相較於投予該MAC之前係至少減少70%。
根據本發明之方法投予本發明之化合物可為連續性或間歇性，依例如接受者之生理狀況、該投藥之目的係治療性或預防性、及該領域之技藝人士所知之其他因素而定。本發明之化合物之投予可為實質上連續一段預先決定之時間，或可為一系列之間隔劑量。
抗體
“免疫球蛋白”係四聚體分子。在天然發生之免疫球蛋白中，各四聚體係由二對相同之多肽鏈對組成，各對具有一條“輕鏈”(約25千道爾頓)及一條“重鏈”(約50至70千道爾頓)。各鏈之胺基端部分包括約100至110個或更多胺基酸之可變區，該可變區主要負責辨識抗原。各鏈之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。人輕鏈被分成κ及λ輕鏈。重鏈被分成α、δ、ε、γ及μ，且分別定義該抗體之同型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。在輕鏈及重鏈之內，該可變區及恆定區係由約12或更多個胺基酸之"J"區連接，該重鏈亦包括約10多個胺基酸之"D"區。各輕鏈/重鏈對之可變區形成該抗體結合部位以使完整之免疫球蛋白具有2個結合部位。
免疫球蛋白鏈展現相同之一般性結構，其中相對保守之骨架區(FR)係由3個亦稱為互補決定區或CDR之超變異區連接。來自各對之2條鏈的CDR係由該骨架區排比，使其能與特定表位結合。從N端至C端，輕鏈及重鏈皆包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸之分配至各結構域係根據卡巴(Kabat)之Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))之定義。
在特定抗體中組成CDR之胺基酸殘基之特性可利用該領域廣為周知之方法加以測定。舉例來說，抗體CDR可被識別為最早由卡巴等人定義之超變異區(Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.)。CDR之位置亦可能被識別為最早由柯西亞等人所描述之結構性環圈結構(Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883)。其他識別CDR之方法包括「AbM定義」，該法為卡巴法及柯西亞法之折衷，係源自利用牛津分子(Oxford Molecular)之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys)，或如MacCallum et al.,1996,J. Mol. Biol.,262：732-745所述根據觀察到之抗原接觸之CDR之「接觸定義」。在此處稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可能被鑑別為對抗原結合造成焓貢獻之殘基(Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166)。雖然其他CDR邊界定義可能不嚴格遵守上述方法中之一者，且將與至少部分之卡巴CDR重疊，不過它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用之CDR可能指由該領域已知之任何方法(包括多種方法之組合)所定義之CDR。此處所使用之方法可利用根據這些方法中任一者所定義之CDR。以任何包含超過一種CDR之給定實施態樣而言，該CDR(或該抗體之其他殘基)可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
此處所使用之某些殘基已被給予彼等之卡巴編號，因此K188 -CLκ係指根據卡巴編號之κ輕鏈的殘基188，從該κ輕鏈之開頭計算。當能了解的是，該殘基之編號可能根據所採用之特定編號方式而改變。
「抗體」係指完整之免疫球蛋白或彼之與該完整抗體競爭特異性結合之抗原結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學切割完整抗體加以產製。抗原結合部分包括尤其是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙價抗體、及包含至少一部分之免疫球蛋白之多肽，該部分之免疫球蛋白足以授予特異性抗原結合至該多肽。Fab片段係由VL、VH、CL及CHI結構域組成之單價片段；F(ab')2片段係包含二個由絞鏈區之雙硫鍵連接之Fab片段之雙價片段；Fd片段係由VH及CH1結構域組成；Fv片段係由抗體單臂之VL及VH結構域組成；及dAb片段係由VH結構域VL結構域組成(例如人、駱駝(camelid)或鯊魚)。
通常，指涉抗體被視為亦指涉彼之抗原結合部分，特別是彼之包含CLκ之至少K188 的抗原結合部分。
單鏈抗體(scFv)係其中VL及VH區係經配對以經由合成性連接子形成單價分子之抗體，該合成性連接子使它們得以被產製成為單一蛋白質鏈。雙價抗體係雙價、雙特異性之抗體，其中VH及VL結構域係表現於單一多肽鏈上，但使用過短以防止該同一鏈上之兩個結構域配對之連接子，藉此強迫該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合部位。一或多個CDR可被共價或非共價地併入分子之中以使其成為免疫黏附素。免疫黏附素可納入該CDR以作為較大多肽鏈之部分，可共價連接該CDR與另一多肽鏈，或可非共價地併入該CDR。該等CDR使該免疫黏附素得以與受到關注之特定抗原特異性結合。
抗體可能具有一或多個結合部位。若有一個以上之結合部位，該等結合部位可能彼此相同或可能不同。舉例來說，天然發生之免疫球蛋白具有2個相同之結合部位，單鏈抗體或Fab片段具有一個結合部位，然而「雙特異性」或「雙功能性」抗體具有2個不同的結合部位。
「經分離之抗體」係(1)不與天然相關之成份相關之抗體，包括其他在彼之天然狀態下伴隨彼之天然相關之抗體，(2)不含其他來自該相同物種之蛋白質之抗體，(3)由天然不表現該抗體之細胞表現之抗體，或由來自不同物種之細胞表現之抗體，或(4)不發生於天然中之抗體。
用語「人抗體」包括所有具有一或多種衍生自人免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。在本發明之某些實施態樣中，該抗IGF1R抗體之所有可變及恆定結構域係衍生自人免疫球蛋白序列(全人抗體)。人化抗體係衍生自非人物種之抗體，其中在該重鏈及輕鏈之骨架及恆定結構域中之某些胺基酸係經突變以避免或廢除於人之免疫反應。或者，人化抗體可藉由融合來自人抗體之恆定結構域與非人物種之可變結構域加以產製。
用語「嵌合抗體」係指包含來一種抗體之一或多個區域及來自一或多種其他抗體之一或多個區域之抗體。
用語“表位”包括任何能與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合之蛋白質決定簇。表位決定簇通常係由分子之化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。抗體被稱為與抗原特異性結合，當該解離常數係<1uM，較佳地<100nM且更佳地<10nM。
用語多功能抗體共軛物或MAC係指本發明所定義之與至少一個效應基團共價共軛之抗體或彼之抗原結合部分，該效應基團與標靶結合。該效應基團可為肽、小分子、蛋白質、核酸分子、毒素、適體、或抗原結合抗體或彼之片段。提到與肽之共軛及在本說明書各處所提及之類似者通常適用於與蛋白質及(抗原結合)抗體或彼之片段之共軛。效應基團與抗體(或彼之片段)之間的連接可為共價鍵接。在該效應基團係蛋白質或肽之某些實施態樣中，該效應基團可與該等抗體鏈中之一者之N或C端融合。當瞭解所謂的融合係指該效應基團與抗體藉由彼等各別之肽主鏈之間的肽鍵融合。在某些態樣中，該效應基團係與該抗體經由連接子共價共軛，且不經由連接該2個肽主鏈之肽鍵融合。
在一些實施態樣中，本發明之MAC包含人化抗IGF1R抗體。本發明之MAC可包含全人抗IGF1R抗體，藉由導入人免疫球蛋白基因至鼠以使該鼠產製全人抗體。本發明亦提供全人抗IGF1R抗體。預期全人抗IGF1R抗體可最小化小鼠或小鼠衍生性單株抗體(Mab)所固有之免疫原性及過敏反應，因此增加該投予抗體之療效及安全性。全人抗體之使用可被預期在慢性及復發性人疾病諸如發炎及癌之治療上提供實質好處，其可能需要重複之抗體投予。在另一實施態樣中，本發明提供包含抗IGF1R抗體之MAC，該抗IGF1R抗體不與補體結合。
產製用於本發明之抗IGF1R抗體之方法係於WO02053596及WO2005016967中描述，二者皆以參照方式被併入本發明。
在一些實施態樣中，該經突變之抗IGF1R抗體之VH或VL區相較於在突變前之該抗IGF1R抗體具有不超過10個胺基酸改變。在一些實施態樣中，該經突變之抗IGF1R抗體之VH或VL區中具有不超過5個胺基酸改變。其中可能具有不超過3個胺基酸改變。在其他實施態樣中，在該恆定結構域中具有不超過15個胺基酸改變。在該恆定結構域中可能具有不超過10個胺基酸改變。在該恆定結構域中可能具有不超過5個胺基酸改變。
此外，融合抗體可被產製，其中兩個(或多個)單鏈抗體係彼此相連。這可被用於若想在單一多肽鏈上產製雙價或多價抗體或想產製雙特異性抗體。
一種類型之衍生化抗體係藉由交聯2或多個抗體產製(相同類型或不同類型以產製例如雙特異性抗體之抗體)。適當之交聯劑包括該些具有2個由適當間隔子分開之不同反應基之雜雙官能者(例如m-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)或同型雙官能者(例如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)。
另一類型之衍生化抗體係經標示之抗體。可用於衍生化本發明之抗體或抗體部分之檢測劑包括螢光化合物，包括螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明、5-二甲基胺基-1-萘磺醯基氯化物、藻紅素、鑭系磷光體及類似者。抗體亦可使用可用於檢測之酶標示，諸如辣根過氧化酶、半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及類似者。當抗體係利用可檢測之酶標示時，其係藉由添加額外試劑加以檢測，其中該酶使用該額外試劑以產生可被分辨之反應產物。舉例來說，當該劑辣根過氧化酶存在時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺導致可被檢測之有色反應產物。抗體亦可利用生物素標示，並經由間接測量抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之結合加以檢測。抗體可利用磁性劑標示，諸如釓。抗體亦可利用預先測定之多肽表位標示，該多肽表位係由二級報告子(例如白胺酸拉鍊對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)辨識。在一些實施態樣中，標記係藉由各種長度之間隔臂連接以減少潛在之空間位阻。
該抗體亦可利用化學基團衍生化，諸如聚乙二醇(PEG)、甲基、乙基、或糖基。這些基團可被用於增進該抗體之生物特性，例如增加血清半衰期或增加組織結合。
酶催化抗體
在本發明之某些態樣中，該MAC包含酶催化抗體，或彼之抗原結合部分。在某些態樣中，該抗體可為醛醇縮酶抗體。
專利US2006205670之內容係藉由參照方式併入本發明，特別是段落[0153]至[0233]，其中描述抗體、有用之片段及彼之變體及修飾、結合部位及CDR、抗體製備、表現、人化、胺基酸修飾、醣基化、ADCC、CDC、增加抗體之血清半衰期、表現載體、哺乳動物宿主系統、及摺疊和其他抗體技術之元件。
本發明所使用之「結合位點」(亦稱為抗體結合位點)係指與適當抗原之決定簇(或結構類似蛋白質)結合(或可與之結合)之免疫球蛋白或Ig結構域之區域。該用語通常包括CDR及鄰近之與抗原結合有關之骨架殘基。
本發明所使用之「醛醇縮酶抗體」係指包含當未被阻礙時(例如藉由共軛)，該結合位點部分酶催化在脂肪族酮捐贈者與醛接受體之間的醛醇添加反應之抗體。醛醇縮酶抗體能藉由以包括下式之1,3二酮半抗原之免疫原免疫接種免疫反應性動物加以產製：
該1,3二酮半抗原係與載體蛋白耦合，且該抗體在彼之結合位點另具有含有反應性ε-胺基之離胺酸。醛醇縮酶抗體之其他特徵為彼等之酶催化活性會受到1,3-二酮半抗原之抑制，藉由在該1,3-二酮半抗原與該酶催化抗體之離胺酸的ε-胺基之間形成複合體。
如某些實施態樣中所討論的，可被用於製備本發明之MAC、組成物及樣本之某些抗體可包含在該抗體結合位點中之反應性側鏈。反應性側鏈可為天然存在，或可藉由突變被放置於抗體中。該抗體結合部位之反應性殘基可與該抗體相關，諸如當該殘基係由存在於最先被識別為製備該抗體之淋巴樣細胞中之核酸所編碼。或者，該胺基酸殘基可藉由故意突變該DNA以編碼該特定殘基產生。該反應性殘基可為非天然殘基，藉由例如使用如此處所述之獨特密碼子、tRNA及胺基醯基-tRNA之生物合成性併入產生。在另一方法中，該胺基酸殘基或彼之反應性功能基團(例如親核性胺基或氫硫基)可與該抗體結合部位中之胺基酸殘基連接。因此，本發明所使用之「經由抗體之結合部位中之胺基酸殘基」發生之與抗體之共價鍵接可指與抗體結合部位之胺基酸殘基直接鍵接，或經由與抗體連接部位之胺基酸殘基的側鏈連接之化學基團鍵接。在一些實施態樣中，該胺基酸係半胱胺酸，且該側鏈之反應性基團係氫硫基。在其他實施態樣中，該胺基酸殘基係離胺酸，且該側鏈之反應性基團係該ε-胺基。在一些實施態樣中，該胺基酸係根據卡巴編號之位於重鏈上之K93 。在一些實施態樣中，該胺基酸係根據SEQ ID NO：52及54之編號的HC h38C2上之K99 。
酶催化抗體係具有包含一或多個反應性胺基酸側鏈之適當結合部位之抗體來源。該等抗體包括醛醇縮酶抗體、β內醯胺酶抗體、酯酶抗體、及醯胺酶抗體。
一個實施態樣包含醛醇縮酶抗體，諸如小鼠單株抗體mAb 33F12及mAb 38C2(彼之VL及VH包含SEQ ID NO：56及57)，以及適當之嵌合及人化版本之該等抗體(例如h38C2IgG1：SEQ ID NO：51及52和h38C2-IgG2：SEQ ID NO：53及54)。小鼠mAb 38C2(及h38C2)具有靠近但在HCDR3以外之反應性離胺酸且係新類型之酶催化抗體之原型，該新類型之酶催化抗體係藉由反應性免疫及機械性模擬天然醛醇縮酶加以產製。其他可被使用之醛醇縮酶酶催化抗體包括由下列雜交瘤產製之抗體：雜交瘤85A2(具有ATCC登錄號PTA-1015)、雜交瘤85C7(具有ATCC登錄號PTA-1014)、雜交瘤92F9(具有ATCC登錄號PTA-1017)、雜交瘤93F3(具有ATCC登錄號PTA-823)、雜交瘤84G3(具有ATCC登錄號PTA-824)、雜交瘤84G11(具有ATCC登錄號PTA-1018)、雜交瘤84H9(具有ATCC登錄號PTA-1019)、雜交瘤85H6(具有ATCC登錄號PTA-825)、雜交瘤90G8(具有ATCC登錄號PTA-1016)。經由反應性離胺酸，這些抗體利用天然醛醇縮酶之烯胺機制酶催化醛醇及逆向醛醇反應。
本發明之化合物亦可能藉由連接標靶劑與反應性半胱胺酸形成，諸如該些於硫酯酶及酯酶催化抗體之結合部位中所發現者。含反應性胺基酸之抗體可藉由該領域廣為周知之方法製備，包括使抗體結合部位殘基突變以編碼該反應性胺基酸，或以包含該反應基之連接子化學衍生抗體結合部位中之胺基酸側鏈。
該抗體可為人化抗體。當本發明之化合物係與抗體之結合部位共價連接且該等抗體係經人化時，很重要的是該等抗體經人化以保留對W基之高度連接親和性。各種形式之人化小鼠醛醇縮酶抗體皆被考慮。一種實施態樣使用人化醛醇縮酶酶催化抗體h38c2 IgG1或具有人恆定結構域Cκ 及Cγ1 1之h38c2 Fab。C人種系Vk 基因DPK-9及人Jk 基因JK4被用來作為人化m38c2之κ輕鏈可變結構域之骨架，且人種系基因DP-47及人JH 基因JH4被用來作為人化m38c2之重鏈可變結構域之骨架。圖18A說明在m38c2、h38c2、及人種系中之可變輕鏈與重鏈之間的序列排比。h38c2可利用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定結構域，包括彼等之同種異型中之任一者。另一實施態樣使用嵌合性抗體，其包含h38c2之可變結構域(VL 及VH )(SEQ ID NO：55及56)和包含K188 -CLκ之來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體之恆定結構域。該抗體可為全長抗體、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv 、dsFv 、scFv 、VH 、VL 、雙價抗體、或迷你抗體，其包含來自h38c2之VH 及VL 結構域。該抗體可為包含來自h38c2之VL 及VH 結構域和選自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之恆定結構域之抗體。該抗體可為h38C2 IgG1(SEQ ID NOS：51及52)。該抗體可為h38C2 IgG2(SEQ ID NOS：53及54)。該抗體可為包含來自人IgG、IgA、IgM、IgD、或IgE抗體之恆定區之人化版本之小鼠醛醇縮酶抗體。在另一實施態樣中，該抗體係嵌合性抗體，其包含來自小鼠醛醇縮酶抗體之VL 及VH 區(例如SEQ ID NO：57及58)和來自人IgG、IgA、IgM、IgD、或IgE抗體之恆定區。在其他實施態樣中，該抗體係全人版本之小鼠醛醇縮酶抗體，其包含來自天然或自然人IgG、IgA、IgM、IgD、或IgE抗體之多肽序列。
各種形式之人化醛醇縮酶抗體片段亦被考慮。一種實施態樣使用h38c2F(ab')2 。h38c2F(ab')2 可藉由蛋白水解消化h38c2 IgG1加以產製。另一實施態樣使用h38c2 scFv，該h38c2 scFv包含來自h38c2之VL 及VH 結構域，該等結構域係藉由介入連接子(G1y4 Ser)3 (SEQ ID NO：59)可任意選擇地連接。人抗體可被產製以作為人化抗體之替代品。舉例來說，現在有可能產製能夠在免疫(或以酶催化性抗體為例之反應性免疫)時產製整套人抗體而沒有內源性免疫球蛋白產製之基因轉殖動物(例如小鼠)。
本發明所使用之「藥物動力學」係指經投予之化合物在不同時間之血清濃度。藥物藥效學係指經投予之化合物在標靶及非標靶組織中在不同時間下之濃度，及對該標靶組織(例如療效)及非標靶組織(例如毒性)之影響。在例如藥物動力學或藥物藥效學上之進步可針對特定標靶劑或生物劑設計，諸如藉由使用不穩定鍵接或藉由修飾任何連接子之化學特性(例如改變可溶性、電荷及類似者)。用語「Koff 」係指抗體自該抗體/抗原複合體解離之解離速率常數。用語「Kd 」係指特定抗體-抗原交互作用之解離常數。
在一些實施態樣中，該MAC之抗IGF1R抗體部分對IGF1R之選擇性至少高出彼對胰島素受體之選擇性的50倍。在一些實施態樣中，該MAC之抗IGF1R抗體部分之選擇性係高於彼對胰島素受體之選擇性的100倍。在一些實施態樣中，該MAC之抗IGF1R抗體部分不展現對IGF1R以外之任何其他蛋白質任何可評估之特定結合。
在本發明之某些態樣中，該MAC以高親和性與IGF1R結合。在一些實施態樣中，該MAC以1×10-8 M或更低之Kd 與IGF1R結合。在一些實施態樣中，該MAC以1×10-9 M或更低之Kd 與IGF1R結合。在一些實施態樣中，該MAC以5×10-1 M或更低之Kd 與IGF1R結合。在一些實施態樣中，該MAC以1×10-1 M或更低之Kd 與IGF1R結合。
在本發明之某些態樣中，該MAC具有自IGF1R解離之低解離速率。在一實施態樣中，該MAC具有1×104 s-1 或更低之Koff 。在一些實施態樣中，該Koff 係5×10-5 s-1 或更低。
在某些態樣中，本發明提供醫藥上可接受之鹽、立體異構物、互變異構物、溶劑合物、及本發明之化合物、樣本、組成物及醫藥組成物之前藥。
酶催化性抗體連接子
某些適合用於連接標靶劑與酶催化性抗體之結合部位的連接子(酶催化性抗體連接子：CA連接子)係揭示於US2009098130，彼之內容藉由參照方式併入本發明。用語「標靶劑」係用於本發明以區別用語「效應基團」，但很明顯的是，與CA連接子或MAC連接子之末端連接之分子種類可互相交換。特別是，在US2009098130中關於該(CA)連接子之通式、特定(CA)連接子結構、(CA)連接子之合成、及不同元件P、Q及W之組合(其中分別被分類為X、Y及Z基團)之特定及一般性描述之態樣係包括於本發明中。
該CA連接子可為CA線性或分歧，且可任意選擇地包括一或多個碳環或雜環基團。CA連接子長度可被視為直鏈原子之數量，有環狀基團諸如芳香環及類似者以採取沿著該環之最短路徑計算。在一些實施態樣中，該CA連接子具有介於5至15個原子之直鏈片段，在其他實施態樣中15至30個原子，在仍其他實施態樣中30至50個原子，在仍其他實施態樣中50至100個原子，及在仍其他實施態樣中100至200個原子。其他CA連接子考量包括對該形成之化合物之物理或藥物動力學性質之影響，諸如溶解性、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(較穩定或較不穩定及較多或較少之預定降解)、剛性、柔韌性、免疫原性、調節抗體結合、被納入微胞或脂質體之中的能力及類似者。
在某些態樣中，該CA連接子可與該TA連接殘基之側鏈共價連接。該連接子可包含式P-Q-W；其中P係生物相容性連接鏈，其包括任何選自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br或I之原子且可包含聚合物或團聯共聚物，當該連接子係線性時，P係與該連接殘基共價連接(經由適當之側鏈、胺基端或羧基端)；Q係可任意選擇地存在之辨識基團，其包含至少一環狀結構；且W係連接基團，其包含與抗體之結合部位中之胺基酸側鏈之共價連接。
當存在時，Q可具有可經任意取代之結構：
其中a、b、c、d及e係獨立地碳或氮；f係碳、氮、氧或硫；Q係以任2個足夠價數之環位置獨立地與P及W連接；且a、b、c、d、e或f中不超過4者係同時為氮且較佳地在環結構中之a、b、c、d及e係各自為碳。在某些態樣中，Q可為苯基。雖然不希望被任何理論束縛，當能相信該Q基團可幫助放置(positioning)該反應基至適當之抗體結合部位以使該W基團可與反應性胺基酸側鏈反應。
該CA連接子可經設計以使其包含能夠與巨分子(諸如抗體、蛋白質或彼之片段)共價或非共價地形成鍵接之反應基。該反應基係經選擇以用於與特定結合部位中之反應殘基使用。舉例來說，用於由醛醇縮酶抗體修飾之化學基團可為酮、二酮、β內醯胺、活性酯鹵酮、內酯、酐、順丁烯二醯亞胺、α-鹵乙醯胺、環己基二酮、環氧化物、醛、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環氧化物、氮丙啶、硫環氧化物、經掩蔽或保護之二酮(例如縮酮)、內醯胺、鹵酮、醛及類似者。
在一些實施態樣中，W在與抗體之結合部位中之殘基的側鏈共軛之前包括一或多個C=O基團，該等C=O基團係經排列以形成氮雜環丁酮、二酮、醯基β內醯胺、活性酯、鹵酮、環己基二酮基、醛、順丁烯二醯亞胺、經活化之烯、經活化之炔、或一般而言包含易受親核或親電子取代之離去基之分子。其他基團可包括內酯、酐、α-鹵乙醯胺、亞胺、醯肼或環氧化物。可與抗體之結合部位中之反應性親核基(例如離胺酸或半胱胺酸側鏈)共價結合之示範性連接子親電子反應基包括醯基β-內醯胺、簡單二酮、琥珀醯亞胺活性酯、順丁烯二醯亞胺、含連接子之鹵乙醯胺、鹵酮、環己基二酮、醛、脒、胍、亞胺、烯胺、磷酸酯、膦酸酯、環氧化物、氮丙啶、硫環氧化物、經掩蔽或保護之二酮(例如縮酮)、經掩蔽或保護之內醯胺、經掩蔽或保護之磺酸酯、及經掩蔽或保護之類似者、經掩蔽之C=O基團諸如亞胺、縮酮、縮醛及任何其他已知之親電子基。在某些實施態樣中，該反應基包括一或多個C=O基團，該等C=O基團係經排列以形成醯基β-內醯胺、簡單二酮、琥珀醯亞胺活性酯、順丁烯二醯亞胺、含連接子之鹵乙醯胺、鹵酮、環己基二酮、或醛。W可為經取代之烷基、經取代之環烷基、經取代之芳基、經取代之芳烷基、經取代之雜環基、或經取代之雜環烷基，其中至少一個取代基係1,3-二酮基團、醯基β-內醯胺、活性酯、α-鹵酮、醛、順丁烯二醯亞胺、內酯、酐、α-鹵乙醯胺、胺、醯肼或環氧化物。在某些態樣中，該W基係與巨分子支架共價連接，該巨分子支架可提供本發明之肽增加之半衰期。在某些態樣中，該W基若存在係與抗體之結合部位共價連接。
在某些態樣中，W在共軛之前(例如與抗體之結合部位)具有下列結構：
其中q=0至5。q可為1或2。q可為1。在其他態樣中，q可為2。
在某些態樣中，在與抗體結合部位共軛後，W具有下列結構：
其中q=0至5且Antibody-N-係與抗體之結合部位中之側鏈結合之共價鍵。q可為1或2。q可為1。在其他態樣中，q可為2。
P可為包含三個成份之基團：Pp-Ps-Py，其中Pp係特別適合與該標靶劑結合之基團，Ps係P基團之間隔子區，且Py係適合與該W基結合之基團。在某些態樣中，Py係選自醯胺鍵、烯胺鍵、或胍鹽鍵。可選擇Py以提供鄰近(在二個原子以內)該Q基團之氫分子。雖然不希望被理論束縛，當能相信該H原子可幫助該Q基團經由H-鍵交互作用辨識疏水袋，特別是關於酶催化抗體(諸如h38C2)之結合槽之輸水袋。因此該醯胺鍵舉例來說可具有方向性以使該NH基直接與該Q基結合，使該NH基之H用於氫鍵接。或者，醯胺之C=O基團可與該Q基團結合，其中該NH基之H鄰近該Q基團約2個原子，但仍可被用於H鍵接。在一些實施態樣中，Py係不存在。在一些實施態樣中，該Py基團具有下式：
在某些態樣中，Ps係經選擇以使Ps不提供任何過度反應之基團。Ps可被選擇以提供介於2至15個原子之該P基團之整體長度。Ps可被選擇以使該P基團之整體長度係介於2至10個原子。Xs可被選擇以使該P基團之整體長度係4至8個原子。Ps可被選擇以使該P基團之整體長度係5個原子。Ps可被選擇以使該P基團之整體長度係6個原子。在某些態樣中，Ps可包含下式中之一者：
其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，且m係存在或不存在；n可為1、2、3、4、5、或6；n可為1、2、3、或4；n可為1；n可為2；n可為3；n可為4。
在某些態樣中，Ps包含下式中之一者：
Pp係經理想地選擇以使對標靶分子諸如肽、蛋白質、小分子、核酸或適體之連接殘基(TA連接殘基)採取特定方向性共價連接策略。舉例來說，當該TA連接殘基包含親核基時，Pp可為親電子基，且反之亦然。舉例來說，若該TA連接殘基側鏈包含胺基，諸如K、H、Y、鳥胺酸、Dap、或Dab，Xp可為COOH，或其他類似之反應性親電子劑。若該TA連接殘基係D或E，Pp可包含親核基，諸如胺基。這些策略中之任一者允許在該Pp基團與該TA連接殘基之間藉由醯胺鍵形成策略形成共價鍵結。當該TA連接基團係胺基時，Pp可包含下式：
P可為可任意選擇地存在之生物相容性聚合物或團聯共聚物。P可具有下列結構：
其中p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、32、43、44、或45；w、r、及s係各自獨立地0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；且Rb 每次出現時係獨立地氫、經取代或未經取代之C1-10 烷基、經取代或未經取代之C3-7 環烷基-C0-6 烷基、或經取代或未經取代之芳基-C0-6 烷基。
當該TA連接殘基係C、C之同源物或其他含硫醇基之殘基時，Pp可包含順丁烯二醯亞胺基(或類似者)，此允許硫醇-順丁烯二醯亞胺添加反應策略得以共價連接該Pp基團與該TA連接殘基。在某些態樣中，Pp亦可包含硫醇基，此允許在該TA連接殘基與Pp基團之間形成雙硫鍵。在某些態樣中，Pp可為順丁烯二醯亞胺：
其中該箭頭表示與該標靶分子連接之點，該平行線代表與該連接子之Q基團連接。當與該標靶分子連接之點包含半胱胺酸殘基或其他帶硫醇側鏈時，該共軛之機制可如下圖：
在一些態樣中，該Pp基團包含經取代之順丁烯二醯亞胺：
在一些態樣中，P係
其中v及w係經選擇以使P之主鏈長度係6至12個原子。
在一些態樣中，該TA連接子係為下式：
其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可為1、2、3、4、5、或6；n可為1；n可為2；n可為3；n可為4。M可能不存在。M可能存在。
在一些態樣中，TA連接子係為下式：
其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可為1、2、3、4、5、或6；n可為1；n可為2；n可為3；n可為4。M可能不存在。M可能存在。
在一些態樣中，該CA連接子之P部分可被用來作為Y、X-Y、Y-Z及X-Y-Z(用於本發明之MAC之連接子之部分)。
肽及蛋白質 醯基離胺酸，或 Kac(又名AcK)係指：K(SH)係指：
二胺基丁酸(Dab)　二胺基丙酸(Dap)
同半胱胺酸　同絲胺酸　鳥胺酸
一般來說，與此處所描述之細胞培養、組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因學以及蛋白質及核酸化學和雜交有關所使用之命名法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。本發明之方法及技術通常根據該領域所廣為周知之習用方法進行，除非另外說明否則如同本說明書各處引述及討論之各種一般性及更具體之參考文獻所述。本發明所使用之該20種習用之胺基酸及彼等之縮寫遵照習慣用法。「多肽」、「肽」及「蛋白質」可交換使用，以指涉胺基酸殘基之聚合物。本發明所使用之這些用語適用於胺基酸聚合物，其中一或多種胺基酸殘基係對應之天然發生之胺基酸的人工化學類似物。這些用語亦適用於天然發生之胺基酸聚合物。胺基酸可呈L或D形式，只要該肽之結合及其他所欲特徵係經維持。多肽可為單體或多體。
除非另外以‘‘D”字首(例如D-Ala或N-Me-D-Ile)或小寫字母形式表示(例如a、i、l(Ala、Ile、Leu之D型式))，否則在本說明書及隨附之權利要求中所描述之肽中的胺基酸及胺醯基殘基之α-碳的立體化學係天然或“L”構型。
所有肽序列係根據普遍接受之慣例書寫，其中該α-N端胺基酸殘基係在左側且該α-C端胺基酸係在右側。本發明所使用之用語「N端」係指肽中之胺基酸的游離α-胺基基團，且用語「C端」係指肽中之胺基酸的游離α-羧酸端。在N端具有基團之肽係指在該N端胺基酸殘基之α-胺基氮上帶有基團之肽。在N端具有基團之胺基酸係指在該α-胺基氮上帶有基團之胺基酸。
本發明所使用之「鹵」、「鹵素」或「鹵化物」係指F、Cl、Br或I。
本發明所使用之「生物活性」係指化合物、組成物或其他混合物於活體內之活性，或在活體內投予化合物、組成物或其他混合物時導致之生理反應。因此生物活性包含該化合物、組成物及混合物之治療效應、診斷效應及醫藥活性。用語「具生物活性」或「功能性」係指展現至少一種活性之多肽，該活性係AA標靶劑之特性或類似AA標靶劑。
本發明所使用之用語「生物相容性」係指具有生物惰性或不與細胞內及細胞外生物分子起反應且不具毒性之某物。
用語「經取代之烷基」係指其中一或多個與碳或氫之鍵結係經與非氫及非碳原子之鍵結取代之烷基，該非氫及非碳原子諸如但不限於在鹵化物中之鹵素原子諸如F、Cl、Br、及I；在諸如羥基、烷氧基、芳氧基及酯基之基團中之氧原子；在諸如硫醇基、烷基及芳基硫化物基團、碸基、磺醯基及亞碸基之基團中之硫原子；在諸如胺、醯胺、烷胺、二烷胺、芳胺、烷芳胺、二芳胺、N-氧化物、醯亞胺及烯胺之基團中之氮原子；在諸如三烷基矽烷基、二烷基芳基矽烷基、烷基二芳基矽烷基、及三芳基矽烷基之基團中之矽原子；及其他在各種其他基團中之雜原子。經取代之烷基亦包括其中一或多個與碳或氫原子之鍵結係經與雜原子之鍵結取代之基團，該雜原子諸如在羰基、羧基、及酯基中之氧；在諸如亞胺、肟、腙、及腈之基團中之氮。經取代之烷基包括(除其他者外)其中一或多個與碳或氫原子之鍵結係經一或多個與氟原子之鍵結取代之烷基。經取代之烷基中之一個實例係三氟甲基及其他包含三氟甲基之烷基。其他烷基包括該些其中一或多個與碳或氫原子之鍵結係由與氧原子之鍵結取代者，以使該經取代之烷基包含羥基、烷氧基、芳氧基或雜環氧基。其他烷基還包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、(烷基)(芳基)胺、二芳基胺、雜環基胺、(烷基)(雜環基)胺、(芳基)(雜環基)胺、或二雜環基胺基團之烷基。
用語「未經取代之烷基」係指如上述定義之二價未經取代之烷基。因此亞甲基、伸乙基及伸丙基各自為未經取代之伸烷基之實例。用語「經取代之烷基」係指如上述定義之二價經取代之烷基。經取代或未經取代之低級伸烷基具有自1至約6個碳。
用語「未經取代之環烷基」係指環狀烷基諸如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、及如上述經直鏈及支鏈烷基取代之該等環。該用語亦包括多環烷基諸如但不限於金剛烷基、降冰片基及雙環[2.2.2]辛基、類似者、及如上述經直鏈及支鏈烷基取代之該等環。因此，該用語將包括除其他者外之甲基環己基。該用語不包括含有雜原子之環狀烷基。未經取代之環烷基可與該母體化合物中之一或多個碳原子、氧原子、氮原子、及/或硫原子鍵結。在一些實施態樣中，未經取代之環烷基具有自3至20個碳原子。在其他實施態樣中，該等未經取代之烷基具有自3至8個碳原子，在其他實施態樣中，該等基團具有自3至7個碳原子。
用語「經取代之環烷基」具有和經取代之烷基相對於未經取代之烷基之意義相同的相對於未經取代之環烷基之意義。因此，該用語包括但不限於氧環己基、氯環己基、羥環戊基及氯甲基環己基。
為了使本發明更易於瞭解，提出下列實施例。這些實施例係僅為了說明之目的，不應被視為以任何方式限制本發明之範圍。
 實施例1合成本發明所使用之肽
Rink醯胺樹脂
利用Fmoc化學之固相肽合成(SPPS)之步驟：(i)以20%之哌啶/DMF移除Fmoc，(ii)胺基酸耦合；相對於樹脂胺裝載之HBTU：胺基酸：HOBt：NMM之比係5：5：5：20。使用之溶劑係NMP，(iii)重複用於各胺基酸耦合之步驟。X=不耐酸之側鏈保護基。
完成受到完全保護、與樹脂結合之肽之組合：(i)以20%之哌啶/DMF移除Fmoc，(ii)乙醯化：乙酸酐/NMM/NMP。完成N-乙醯化、受保護、與樹脂結合之肽之組合。
化學反應圖式1利用Fmoc化學固相合成肽鏈(以典型Ang2結合肽(ABP)SEQ ID NO：27為例) 實施例2：自樹脂切割如實施例1中所製備之肽
1.　完成N-乙醯化、受保護、與樹脂結合之肽之組合
2. TFA/水/苯酚/三異丙基矽烷(90：4：4：2)
化學反應圖式2自樹脂切割ABP(SEQ ID NO：27) 實施例3　合成ABP-硫醇-連接子化合物
1.　Ang2結合肽
2.　S-三苯甲基-巰基丙酸/HBTU/NMM(相對於Ang2肽為5：5：10之比)
3.　受三苯甲基保護之硫醇Ang2肽中間物
4.　TFA/DCM/TIPS(比例5：93：2)
5.　帶硫醇Ang2修飾肽
化學反應圖式3ABP-1-ti(3.3)(SEQ ID NO：27之K11 經連接殘基K(SH)取代)之合成
具有不同繫鏈點之Ang-2結合肽(ABP)之類似物係經合成(見實施例1及2)。首先該游離之硫醇ABP中間體係經合成及純化，接著添加順丁烯二醯亞胺-PEG2 -PFP連接子，然後進行終純化步驟以獲得純的、PFP活化之ABP。該肽鏈之組合及切割係如化學反應圖式1及2所示進行以產製該純的ABP。
ABP(284 mg，0.1 mmol)係藉由攪拌溶解於二甲基甲醯胺(0.5 ml)。S-三苯甲基-巰基丙酸(MPA，62 mg，約0.125 mmol)、HBTU(48 mg，0.125 mmol)及N-甲基嗎啉(0.025 ml，0.25 mmol)被分開攪拌於DMF中(0.5 ml)5分鐘直到溶解。該ABP溶液及活化之MPA溶液被混合在一起2小時。該反應之進程係由LCMS監測。2小時後，緩慢添加該溶液至冰冷之醚(40 ml)以沉澱該ABP-S-三苯甲基-MPA產物。過濾收集白色之沉澱物然後乾燥。接著使該固體殘餘物溶解於三氟乙酸之二氯甲烷(1：10，10 ml)溶液中，並添加0.050 ml之三異丙基矽烷(TIPS)攪拌1小時。該溶液在減壓下蒸發至淡黃油狀，接著藉由添加冰冷醚以沉澱該粗硫醇肽。離心收集該產物並於真空中乾燥。將該殘餘物溶解於50%水性乙腈，然後冷凍乾燥以產製該粗硫醇肽(HPLC分析約具80%之純度)。該粗硫醇肽係經半製備HPLC純化以產製145 mg之SEQ ID NO：27。
合成SEQ ID NO：27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP
化學反應圖式4合成SEQ ID NO：27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP 實施例4產製Ang-2結合肽硫醇中間體(ABP-ti)
肽鏈組合係以0.1毫莫耳之等級進行。該使用之樹脂係Fmoc-Rink-PL樹脂(150 mg，0.67 mmol/g取代)。標準Fmoc化學方法被用來合成該肽。以20%之哌啶/DMF移除Fmoc共3×5分鐘，所有樹脂清洗步驟使用DMF。為了併入胺基酸，每個殘基採用單一耦合步驟，使用HBTU/HOBt/NMM活化2小時期間。該連接殘基(K(SH))被併入為Fmoc-Lys(Nε -巰基丙酸酯-S-Trt)-OH。在鏈組合時，該N端Fmoc基團被移除且該肽基樹脂藉由乙醯化加蓋。該終樹脂係以DCM清洗並於真空中隔夜乾燥。所獲得之終樹脂的重量如下：SEQ ID NO：29-K(SH)9 ：627 mg、SEQ ID NO：30-K(SH)16 ：573 mg、SEQ ID NO：31-K(SH)18 ：642 mg、及SEQ ID NO：32-K(SH)19 ：641 mg。
酸解移除保護基及自該樹脂切除該肽係利用TFA/水/二硫蘇糖醇/三異丙基矽烷之混合液(比例90：4：4：2，5 ml)進行2小時。該溶液係自該樹脂過濾，該樹脂利用另外5 ml之純TFA清洗。該經組合之過濾液被蒸發成為漿狀，然後添加冰冷之醚以沉澱白色粉末。離心收集該粉末，接著將之溶解於50%水性乙腈(20 ml)，冷凍及凍乾隔夜。
結果： SEQ ID NO：29-K(SH)9
該獲得之粗產物SEQ ID NO：29-K(SH)9 之量係252 mg。HPLC分析粗產物SEQ ID NO：29-K(SH)9 顯示明顯主峰；5至95%B/30 min，C18，Rt=18.3 min。進一步LCMS分析粗產物SEQ ID NO：29-K(SH)9 顯示該主峰係所欲之產物；觀察到[M+H]+=2930，+2=1465，+3=977。
SEQ ID NO：30-K(SH)16
該獲得之粗產物SEQ ID NO：30-K(SH)16 之量係229 mg。HPLC分析粗產物SEQ ID NO：30-K(SH)16 顯示明顯主峰；5至95%B/30 min，C18，Rt=22.0 min。進一步LCMS分析粗產物SEQ ID NO：30-K(SH)16 顯示該主峰係所欲之產物；觀察到[M+H]+=2915，+2=1458，+3=972。
SEQ ID NO：31-K(SH)18
該獲得之粗產物SEQ ID NO：31-K(SH)18 之量係252 mg。HPLC分析粗產物SEQ ID NO：31-K(SH)18 顯示明顯主峰；5至95%B/30 min，C18，Rt=21.1 min。進一步LCMS分析粗產物SEQ ID NO：31-K(SH)18 顯示該主峰係所欲之產物；觀察到[M+H]+=2912，+2=1456，+3=971。
SEQ ID NO：32-K(SH)19
該獲得之粗產物SEQ ID NO：32-K(SH)19 之量係261 mg。HPLC分析粗產物SEQ ID NO：32-K(SH)19 顯示明顯主峰；5至95%B/30 min，C18，Rt=20.0 min。進一步LCMS分析粗產物SEQ ID NO：32-K(SH)19 顯示該主峰係所欲之產物；觀察到[M+H]+=2930，+2=1465，+3=977。
純化：
製備型HPLC管柱係利用稀釋水性TFA及乙腈預先平衡。將粗產物ABP-硫醇中間體(即以K(SH)作為連接殘基之ABP)溶解於DMF(3 ml)，接著使之吸附至管柱上，施用乙腈之稀釋TFA溶液梯度洗脫。自動收集某質量之組分(M=1465)。來自該管柱之洗脫液係由UV監測，所獲得之組分係由分析型RP-HPLC分析。該最純之組分(分析型HPLC顯示>95%)係經組合及冷凍乾燥以得到下列產量：87 mg之純SEQ ID NO：29-K(SH)9 、50 mg之純SEQ ID NO：30-K(SH)16 、59 mg之純SEQ ID NO：31-K(SH)18 、及39 mg之純SEQ ID NO：32-K(SH)19 。
連接子合成
考慮5種不同的活化策略以共軛ABP與本發明之抗IGF1R抗體，(實施例5至9)(利用SEQ ID NO：27-K(SH)11 顯示示範性結構)：
實施例5　N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)(SEQ ID NO：27-K11 -NHS)
N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)(SEQ ID NO：27-K11 -NHS)
化學反應圖式5　合成SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-NHS 合成SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-NHS
使SEQ ID NO：27(5.1)與雙NHS之PEGx -連接子(5.2)反應，以使該NHS活化之羧基維持在該終活化肽產物(5.3)上，且維持可用於後續共軛。此必須在該ABP上存在4個其他游離之羧基。這些要求阻止簡單之原位活化策略，因為該活化基之位置無法被輕易地控制且有可能使多重羧基側鏈被活化。
在該雙PEG5 -NHS酯與該ABP(SEQ ID NO：27)之間的反應係經檢查。使用10倍過量之連接子DMSO溶液，ABP與N-甲基嗎啉(作為鹼)之DMSO溶液被緩慢滴定至攪拌均勻之溶液中。在不同時間點取樣本並以HPLC及LCMS檢測。在約2小時後，有大量產物形成(大約80%自5.1轉換形成5.3)，此可輕易地與該雙NHS連接子試劑分離。然而，即使在DMSO中，該產物5.3緩慢地隨時間轉換成游離酸形式(其中該NHS-酯基團被轉換成不活化之游離羧基)。同樣地，當該粗反應混合物係經分餾以分離該所欲之產物5.3時，其亦會在純化及後續冷凍乾燥步驟期間受到水解。雖然此方法可成功地合成某些產物，但認為該形成之NHS-酯之水性不穩定性將限制彼在後續共軛反應中之應用。其他關於MAL-PEG2-NHS之檢測係於實施例30中說明(包含Z*基團Z13)。
實施例6順丁烯二醯亞胺(Mal)(SEQ ID NO：27-K11 -Mal)
順丁烯二醯亞胺活化通常與游離硫醇共軛伴一起被使用。雖然在抗體2.12.1.fx上不存在游離之硫醇殘基，有一些方法可被用來導入游離硫醇至蛋白質中以藉此提供用於順丁烯二醯亞胺基底共軛之鍵接位點。
含Mal之肽通常可利用簡單之含順丁烯二醯亞胺/酸之連接子相當簡單地合成。數種SEQ ID NO：27-MAL化合物係如下所示之合成。通常，該順丁烯二醯亞胺活化肽不與缺乏內源性硫醇(源自游離半胱胺酸側鏈)或用其他化學方法(例如經由Traut’s試劑)導入之硫醇之蛋白質或抗體共軛。
SEQ ID NO：27-K11 -4PEG-Mal-2 實施例7　氮雜環丁酮(AZD)(SEQ ID NO：27-K11 -AZD)
SEQ ID NO：27-AZD
AZD活化之ABP係藉由連接AZD-酸連接子與溶液中之ABP加以合成。
AZD活化：
化學反應圖式6合成SEQ ID NO：27-K11 -AZD(6.3)
該AZD活化之ABP非常緩慢地與離胺酸側鏈胺基反應。嘗試在pH 7至9之磷酸鹽緩衝液中進行共軛，藉由降低該抗體表面離胺酸之電荷(該蛋白質表面上之離胺酸的pKa係約9.1至11.2)，以增加彼等之親核性。有關抗體穩定性及AZD水解之問題阻止在pH 9以上使用。在3天的反應時間內，每1莫耳之抗體添加15莫耳之AZD活化之ABP，以產生低量之共軛(平均每抗體2個AZD活化之ABP)。在鹼性pH下，AZD水解發生快速(在24小時後50%)導致該減少量之共軛。
實施例8方形酸之酯(方酸酯)(SEQ ID NO：27-方酸酯)
7.1 SEQ ID NO：27
7.2 R1及R2衍生性方酸酯，在此實施例中，R1及R2皆為CH2 CH3 。
化學反應圖式77.3 SEQ ID NO：27-K11 -方酸酯- 化學反應圖式7方形酸衍生物SEQ ID NO：27-K11 -方酸酯連接子-1->ABP-1-方酸酯-1
由方形酸製備之烷基酯已知會選擇性地與硫醇在中性pH下反應，然而在較高之pH下(約8.5及8.5以上)，它們亦可與胺雖然較為緩慢地反應。方酸酯之反應性可藉由以芳基取代烷基而顯著提高。本發明提供數種ABP之方酸酯衍生物，其中該‘R’之特性有所不同(R係選自乙基、苯基、2-甲氧基羰基苯基、3-氟苯基或3,5-二氟苯基)，本發明亦提供其他其中該連接子位置有所不同之衍生物。該乙基方酸酯與游離硫醇共軛良好，但與蛋白質及抗體上之游離胺共軛不良，除非pH在9以上。該芳基方形酯在中性pH下與本發明之抗體上之游離離胺酸共軛時顯示較佳之效率。
實施例9五氟苯基酯(PFP)(SEQ ID NO：27-PFP)
本發明亦提供使用五氟苯基(PFP)酯以形成相對穩定之活化肽。該方法具有一些優於其他方法之好處，包括該PFP基團可簡單地自穩定活化之肽產物被導入溶液中，該PFP基團本身可利用標準HPLC方法純化，而不會有PFP酯水解。合成與具有能與抗體共軛之反應基的連接子共價連接之ABP的挑戰在於該ABP序列中存在四個酸性側鏈(3個天冬胺酸及1個麩胺酸)。這些阻止使用肽與活化劑之簡單活化策略，因為並沒有已知之簡單方法可確保在一個特定酸性側鏈上之位點特異性活化。
為了解決這個問題，本發明提供一種合成途徑，藉此途徑使活化之酯基團(諸如PFP)可藉由化學選擇性反應(使用硫醇/順丁烯二醯亞胺化學)或藉由使用雙活性酯試劑與在該肽上之側鏈離胺酸直接耦合，該活化之酯基團與該肽側鏈形成醯胺但留下另一端作為活性酯。
在一些實施態樣中，該策略可為雙-酸PEG，其中各酸經活化為PFP酯。在含有某些鹼之有機溶液中，該雙-PFP連接子之末端與該離胺酸之N-ε-胺基側鏈於該所需之繫鏈位置反應以形成穩定之醯胺鍵接，而另一端維持另一PFP基團。此策略之一個可能的問題在於形成肽二聚體之可能性，其中肽將被添加至存在於該連接子各端之各個PFP基團上。在某些態樣中，本發明藉由改變化學計量及加入個別肽與雙-PEG-PFP連接子以克服此添加問題。本發明所提供之一個解決方案係使溶液中含有過量之雙-Pfp連接子，緩慢添加肽至溶液中，以使連接子之量永遠超過肽之量。藉由使連接子與肽之比介於約3.7：1至約4.3：1，或在一些實施態樣中約4：1，該所需之PFP活化之肽可被合成且無二聚體存在。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP之合成係如下化學反應圖式8所示：
化學反應圖式8　SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP 合成雙-dPEG5 -OPfp連接子(8.2)
使雙-dPEG5 -酸(1 mmol，338 mg)溶解於脫水二氯甲烷(5 ml)中，接著添加五氟苯酚(2 mmol，368 mg)與二環己基碳二醯亞胺(1 mmol，208 mg)。該溶液於室溫中攪拌隔夜。之後，過濾去除細白之二環己基脲副產物，該濾液經蒸發乾燥以得到淡黃色輕質油。以TLC及HPLC分析顯示具有正確MS=670之純產物。此產物係用於下一步驟無須進一步純化。該產物在-20℃下可維持數個月之穩定。
合成SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP(8.3)
使SEQ ID NO：27(8.1)(730 mg)溶解於脫水二甲基甲醯胺(8 ml)中，並添加N-甲基嗎啉(0.05 ml)。取一等分純bis-dPEG5 -OPfp試劑(8.2)(0.5 ml)裝入玻璃小瓶(20 ml)。隨著劇烈攪拌，將該SEQ ID NO：27/NMM溶液在2小時內以4×2 ml等分添加至該bis-dPEG5 -OPfp試劑中，接著該終混合物再攪拌1小時。轉換成SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP產物之過程係由分析型HPLC監測。當該反應結束時，該溶液藉由半製備型HPLC在1”C8管柱上過濾及直接純化。該最純之組分(分析型HPLC顯示>95%)係經組合及冷凍乾燥以得到400 mg(產率48%)之終ABP-1-5PEG-PFP肽-連接子-2產物。類似機制可被用於產製SEQ ID NO：27-K(SH)11 -順丁烯二醯亞胺-2PEG-PFP(見化學反應圖式4)。
合成順丁烯二醯亞胺-2PEG-PFP連接子
化學反應圖式9　順丁烯二醯亞胺-dPEG2-酸(9.1)->順丁烯二醯亞胺-2PEG-PFP(9.2)
將順丁烯二醯亞胺-dPEG2 -酸(328 mg，1 mmol，Quanta Biodesign)、五氟苯酚(0.103 ml，1 mmol，PFP)及二環己基碳二醯亞胺(206 mg，1 mmol，DCC)溶解於乾DCM(10 ml)中，在室溫下攪拌1小時。過濾移除該形成之細白沉澱物(DCU副產物)，該濾液在真空中蒸發至乾燥。獲得高產率之細白粉末產物(490 mg，定量)。分析型HPLC顯示純度係>95%；MS顯示[M+H]+ =495。
合成PFP活化之ABP類似物
各種經純化之ABP-硫醇-中間體(即具有K(SH)作為連接殘基之ABP)之樣本(30至40 mg)被溶解於脫水DMF(2 ml)中。添加Mal-PEG2 -PFP(20 mg)與N-甲基嗎啉(5 mL)。該反應在室溫下攪拌進行，以HPLC監測以得知產物形成之時間進程。在前2小時內觀察到起始肽完全轉換成PFP活化之ABP產物。該溶液係經過濾，並由半製備型HPLC直接分離該產物尖峰。在各例中，該產物在冷凍乾燥後被分離至約40%之產率。
SEQ ID NO:27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP: 21 mg
SEQ ID NO:30-K(SH)16 -MAL-2PEG-PFP: 6 mg
SEQ ID NO:31-K(SH)18 -MAL-2PEG-PFP: 9 mg
SEQ ID NO:32-K(SH)19 -MAL-2PEG-PFP: 12 mg 實施例10抗體共軛
MAC-1及MAC-2藥物產品係藉由使2.12.1.fx與Ang2結合肽共軛加以製備。MAC-1包含2.12.1.fx與SEQ ID NO：27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP，MAC-2包含2.12.1.fx與SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP。計算各種MAC之樣本中每個2.12.1.fx分子之肽共軛數(見表1)。
MAC-1之產製
SEQ ID NO:27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP
MAC-1 化學反應圖式10SEQ ID NO：27-K(SH)11 -MAL-2PEG-PFP與抗體之離胺酸側鏈(Ab-K-Ab)反應：其中該抗體係2.12.1.fx，該MAC係MAC-1 MAC-2之產製
SEQ ID NO:27-K11 -5PEG-PFP
MAC-2 化學反應圖式11SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP與抗體之離胺酸側鏈(Ab-K-Ab)反應：其中該抗體係2.12.1.fx，該MAC係MAC-2 實施例11最佳化PFP基底共軛之條件
進行一系列測試以建立引導共軛之理想反應條件。在各反應共軛結束時，該反應係利用琥珀酸鹽及甘胺酸緩衝液淬熄，降低pH值至約5.5並淬熄任何游離之肽或肽/連接子。MAC-2分析係藉由測量該MAC之完整分子量(MW)進行，在經由大小排除層析管柱分離蛋白質與鹽及賦形劑之後，利用電噴灑飛行時間質譜儀檢測該MAC之完整分子量。
溫度
2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。該肽/連接子(SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP)係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在18、22或25℃下進行2小時。結果顯示於表2。
反應pH
2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75或8.0下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP(L2)係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時。結果顯示於表3。
2.12.1.fx抗體係利用HEPES緩衝液在pH 7.0、7.5及8.0下調整至2 mg.ml-1 ，終濃度為0.02M。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP係於DMSO中重構為10 mg.ml-1 。以5：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行隔夜。結果顯示於表4。共軛量在pH 8.0以上下降。
共軛反應之期間
2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。SEQ ID NO：27/5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行30、60、120、180、240、300、或2400分鐘(表5)。
肽與蛋白質之莫耳比
2.12.1.fx抗體係利用HEPES緩衝液在pH 7.5下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.2M HEPES。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以1：1、2：1、3：1、4：1、及5：1之莫耳比添加該肽/連接子至2.12.1.fx抗體(表6)，允許反應在室溫下進行至少2小時，但是高濃度之HEPES緩衝液導致降低之共軛量。
2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以5：1、7：1、10：1、12：1、及15：1之莫耳比添加該肽/連接子至2.12.1.fx抗體(表7)，允許反應在室溫下進行2小時以產製具有較高共軛量之MAC。
為了進一步最佳化2.12.1.fx抗體與SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP之莫耳比，2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。肽/連接子係於丙二醇溶液中重構為10 mg.m1-1 。以2.5、2.8、3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、或4.6：1之莫耳比(表8)添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時。
2.12.1.fx抗體係利用HEPES緩衝液在pH 7.0下調整至2 mg.ml-1 ，終濃度為0.02M之HEPES。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP係於DMSO中重構為10 mg.m1-1 。以5、6、7、8、10：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行隔夜。結果顯示於表9。
不同蛋白質濃度下2.12.1.fx之共軛特性
不同濃度之2.12.1.fx與SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP的共軛特性係經分析。2.12.1.fx係經濃縮至>50mg/mL，利用20mM醋酸鈉、200m海藻糖pH 5.5稀釋至所欲濃度，並添加60mM磷酸鈉pH 7.7。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係利用50%丙二醇重懸，以4.3：1莫耳比與該抗體混合，允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重共軛部位被視為藉由肽之質量差異所分開之不同信號。多重共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表10顯示2.12.1.fx在不同之抗體濃度時與肽之共軛特性。當抗體濃度10 mg/mL至50 mg/mL時，該共軛發生在介於0至5加成之分布，平均為1.8或更高加成。當抗體濃度0.5至5 mg/mL時，該共軛發生在介於0至3加成之分布，平均為1.5或更低加成。
反應緩衝液選擇
2.12.1.fx抗體係利用碳酸鈉、硼酸鈉、或磷酸鈉緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.05M磷酸鈉。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以1、2、3、4、或5：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行隔2小時。低反應pH導致減少之共軛量(表11)。
2.12.1.fx抗體係利用硼酸鈉及磷酸鈉緩衝液在pH 7.5、7.7及8.0下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.04M。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10mg.ml-1 。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時(表12)。
2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.04M、0.06M、或0.08M磷酸鈉。該肽/連接子(SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP)係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時。結果顯示於表13。
緩衝液組成份對共軛之影響
丙二醇：2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液在pH 7.7下調整至18 mg.ml-1 ，終濃度為0.06M磷酸鈉。該肽/連接子(SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP)係於丙二醇溶液中重構為20 mg.ml-1 (5%丙二醇於共軛反應中)。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，並添加額外之0至15%丙二醇(丙二醇之最終百分比為5、10、15、及20%)，允許反應於室溫下進行2小時。結果顯示於表14。
氯化鈉：2.12.1.fx抗體係利用HEPES緩衝液在有或無0.14M氯化鈉存在時之pH 7.0下調整至2 mg.ml-1 ，終濃度為0.02M HEPES。SEQ ID NO：27-K11 5PEG-PFP係於DMSO中重構為10 mg.ml-1 。以5：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行隔夜。結果顯示於表15。在氯化鈉存在時，共軛量降低。
HEPES：2.12.1.fx抗體係利用HEPES緩衝液在pH 7.0下調整至2 mg.ml-1 ，終濃度為0.2M及0.02M HEPES。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係於50%丙二醇中重構為10 mg.ml-1 。以5：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時。結果顯示於表16。共軛量在0.2M HEPES緩衝液中減少。
DMSO：2.12.1.fx抗體係利用磷酸鈉緩衝液在pH 7.7下調整至15 mg.ml-1 ，磷酸鈉終濃度為0.06M，添加DMSO至終濃度30%。SEQ ID NO：27 K11 -5PEG-PFP係於丙二醇溶液中重構為10 mg.ml-1 。以4：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在室溫下進行2小時。結果顯示於表17。
共軛反應參數之討論
當效應基團(在此實施例中為肽)與抗體之莫耳比係降至低於約3.5：1時，共軛量係經減少，如表8所示。另外，表9顯示增加該莫耳比導致增加之共軛量。增加每抗體之肽數通常減少該抗體(本例中為2.12.1fx)與彼之抗原(本例中為IGF1R受體)之結合有效性，因此肽與抗體之莫耳比係經最佳化以最大化抗體與抗原之結合和肽與同源物之結合二者。
也發現改變共軛緩衝液可改變共軛模式。含胺賦形劑通常較不適合，因為它們可與PFP基團反應。緩衝液諸如碳酸鹽及硼酸鹽可被用於共軛，但不被使用，因為它們的pKa(硼酸之pKa約為9，碳酸鹽具有二個pKa為約6及約11)與MAC-1和MAC-2之最佳共軛pH 7.7相差太遠(表11)。共軛量不僅取決該反應之化學條件，也與時間有關。在2小時後，大部分之PFP活化之肽已經與該抗體反應或該PFP Z*已經水解(表5)。
該PFP活化之肽/連接子快速地與離胺酸側鏈胺基反應。在pH 6.5至8之磷酸鹽緩衝液中進行共軛，以藉由降低該抗體表面離胺酸之電荷(該蛋白質表面上之離胺酸的pKa係約9.1至11.2)而增加彼等之親核性，如表3及4所示。
MAC-1及MAC-2之理想共軛條件係如下述：2.12.1.fx抗體係利用磷酸鹽緩衝液調整至pH 7.7，終濃度為0.06M磷酸鈉。該肽/連接子(SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP)係於丙二醇溶液中重構為10 mg.m1-1 (在反應中丙二醇之終濃度為10%)。以4.3：1之莫耳比添加肽/連接子至2.12.1.fx抗體，允許反應在環境室溫下進行2小時。該反應係利用琥珀酸鹽及甘胺酸緩衝液淬熄，降低pH值至約6.0並淬熄任何游離之肽。在一些態樣中，該反應可經濃縮，且肽相關物種(諸如其中該連接子藉由與水溶劑之反應被水解之肽)及該反應混合物之其他元件(諸如PFP)可藉由滲濾移除，例如使用50 kDa之膜或大小排除層析至琥珀酸鹽、甘胺酸、氯化鈉及海藻糖緩衝液pH 5.5於30毫克/毫升。
上列之共軛條件係經變化以決定各方法參數之範圍。參數範圍係根據可能發生在共軛期間之變化設定，及/或經擴張直到觀察到超過10%之物種族群變化。表18摘列導致MAC-2類似共軛特性之參數。
實施例12在抗體上之連接子位點
通常，只有包含鹵素苯基酯之Z*離去基團顯示一致量之方向性共軛，不過方酸酯及NHS酯在某些情況下顯示一些潛在用途。
在5種被提出之連接子中只有2種(PFP酯及方酸酯)能成功地製備MAC。雖然假設親電子連接子通常能使肽(諸如Ang2肽(ABP))與抗體(諸如IGF1R抗體)共軛，但是氮雜環丁酮連接子無法讓肽與抗體以可接受之速率共軛(該反應需要顯著過量之氮雜環丁酮連接子且太過緩慢)。表19列出對於用來製備MAC之各種連接子的一些考量點。
實施例13共軛肽在抗體上之位置
MAC-2藥物製品分子係由1至4個與該2.12.1.fx抗體(α-IGF1R-1)連接之SEQ ID NO：27分子分布組成，該連接使用如化學反應圖式11所示之5PEG-PFP連接子。此係藉由測量該MAC-2之完整分子量(MW)加以測定，在經由大小排除層析管柱分離蛋白質與鹽及賦形劑之後，利用電噴灑飛行時間質譜儀檢測該MAC-2之完整分子量。質譜分析資料顯示該2.12.1.fx抗體及3批MAC-2之完整分子量(MW)係如圖3所示。圖2A顯示在共軛前之2.12.1.fx。此為顯示單一MW之一致分子。該MAC-2批量顯示與2.12.1.fx共軛之肽之分布；觀察到介於1至4個共軛加成(CA)。各種形式之相對量在不同批次之間係為一致，在各批次中最常見之形式具有2個與個別2.12.1.fx抗體連接之肽(SEQ ID NO：27)。
藉由還原2.12.1.fx抗體中之雙硫鍵，輕鏈及重鏈被分開觀察。雙硫鍵還原係藉由以20mM之三(2-羧基乙基)膦(TCEP)處理該完整之2.12.1.fx抗體進行。該形成之重鏈及輕鏈之混合物係如上述分析完整分子量。圖3顯示之資料提供關於ABP在2.12.1.fx上之位置的證據。大部分在MAC-2批次中之輕鏈(>65%)係經共軛。大部分經共軛之輕鏈包含1CA。亦有較低量觀察到2CA。幾乎所有被觀察之重鏈(>90%)係未經修飾，這表示很少經共軛之肽係位於重鏈上。
肽定位被用來測定準確之共軛位置。步驟如下：利用8M鹽酸胍使一等分之MAC-2變性，雙硫鍵係由TCEP還原，該形成之半胱胺酸硫醇基係經碘乙醯胺烷化。此經處理之蛋白質樣本接著利用蛋白酶胰凝乳酶消化(1：125蛋白酶：MAC重量比)。該形成之胰凝乳酶消化肽在經由C8液體層析管柱分離之後，分別藉由質譜分析檢測。藉由此項技術，MAC-2之重鏈及輕鏈在圖4中之序列所示之位置(黑點)被胰凝乳酶消化成片段。接著利用液體層析質譜分析(LC-MS)檢測各肽之MW，以測定哪一個離胺酸係由經共軛之肽所修飾。若片段係經共軛肽連接之修飾，彼之MW將隨之移動。
重鏈之片段Y1、Y6、Y9、Y10、Y20、Y25、Y26、Y29、Y32、Y33、Y34、Y37、Y40及Y43包含Lys殘基。其中，在Y6、Y10、Y25、Y33及Y37檢測到肽共軛。輕鏈之片段Y3、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15及Y16包含Lys殘基。其中，在Y3、Y13及Y15檢測到共軛。
被稱為Y15之輕鏈片段(自輕鏈N端數來第15個胰凝乳酶消化片段)被發現根據圖5所示之資料共軛。在MAC中明顯地檢測到該經修飾之Y15之MW。在未經共軛之2.12.1.fx樣本中，並無經修飾之Y15片段之證據。在MAC與2.12.1.fx兩者中皆觀察到未經修飾之Y15片段。此片段之強度在2.12.1.fx樣本中較高，因為所有此片段完全以未經共軛之形式存在。當此片段被共軛至MAC-2中時，該觀察到之未經修飾之Y15之量降低，即在圖5中可見較小面積之波峰。
在MAC-2中之輕鏈片段Y15上所觀察到之SEQ ID NO：27-5PEG共軛之量係藉由測量未經修飾之Y15之減少波峰面積預測。在正常化該信號強度以使未經共軛之2.12.1.fx顯示100%之後，3個獨立批次之MAC-2分別顯示17%、27%及22%之未經共軛之Y15片段。
該觀察到之Y15於MAC樣本中之強度係經正常化至Y15於2.12.1.fx樣本中之強度。在MAC-2中介於75至85%之Y15片段係經測定為經修飾。由於MAC-2主要包含1至2個共軛加成，這表示大部分在MAC-2中之共軛係位於輕鏈片段Y15的2個K殘基中之一者(K188 或K190 )。片段Y15在2.12.1.fx序列中之位置係如圖4所示。
胰蛋白酶消化被用於區別K188 及K190 (胰蛋白酶對於K及R之C端具有特異性)。由於胰蛋白酶不消化經共軛之K殘基，因此該酶消化依照哪一個K殘基被共軛而產生不同的肽長度。檢查來自經胰蛋白酶消化之MAC-2的LCMS資料提供該肽與K188 特異性連接之證據。未觀察到經修飾之K190 之證據。
MAC-2係如上述利用TCEP還原及鹽酸胍變性。利用Tris消化緩衝液將該蛋白質濃度調整至2mg/ml及pH調整至7.8。經純化之胰蛋白酶以1：125蛋白酶：MAC重量比被添加，並於30℃培養4小時。樣本儲存於-20℃直到LCMS分析。片段樣本係利用水/乙腈+0.1% TFA移動相在C18逆相管柱上分離。片段之檢測係利用UV 214nm及ESI-TOF質譜分析二者進行。所有資料分析皆利用MassLynx軟體進行。
當胰蛋白酶消化MAC-2時所形成的片段係依肽共軛之位點而定。離胺酸係共軛之標靶殘基。圖2至5之資料顯示肽結合之主要位點係K188 或K190 。下面的化學反應圖式顯示當在K188 或K190 之處共軛時所發生之胰蛋白酶消化反應。
該兩個有問題之可能的消化片段之化學結構如下：
圖6顯示當K188 係與該肽共軛時，該胰蛋白酶消化肽之選擇離子LCMS層析資料。圖7顯示當K190 係經共軛肽之修飾時，該胰蛋白酶消化片段之選擇離子LCMS層析資料。這些資料指出，只有K188 係經共軛；此情況導致在MAC-2中檢測到顯著信號，但在2.12.1.fx對照實驗中並無信號存在。來自K190 之修飾的結果不提供任何相較於陰性對照具有獨特性之資料。
和預期不同的是，該肽/連接子似乎優先與2.12.1.fx之輕鏈的K188 (SEQ ID NO：15之K80 )連接。意外的好處是該2.12.1.fx抗體之Fc部分不受影響。測試顯示該導致之MAC-2之PK大約等於未經共軛之2.12.1.fx之PK。混雜、非特異地與抗體上之多重位點共軛可導致PK降低之產物。由MAC-1及MAC-2所示範之本發明之方向性共軛提供最小化一些可由混雜、非特異性共軛造成之可能有害效應(包括降低PK)之好處。
為了建立該方法之可再現性，重複進行該實驗。MAC-2係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重共軛部位被視為藉由經共軛之肽/連接子之質量差異所分開之不同信號。多重共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。圖8顯示MAC-2之代表性圖譜；用於定量之計算係如表20所示。該完整MAC-2之平均共軛加成係利用下式計算為2.11：SUMPRODUCT(共軛加成數(CA)，每CA百分比)。此實施例顯示肽之共軛發生為介於0至4個肽加成之分布，最大形式係2個肽加成，且肽加成之平均數為2.11。由多人重複分析顯示該共軛特性係一致且可再現地。
肽共軛之程度係在2.12.1.fx之輕鏈及重鏈上分開檢測。MAC-2係利用鹽酸胍及二硫蘇糖醇加以變性及還原雙硫鍵。該形成之游離輕鏈及重鏈係利用LCMS分析以測定各自之共軛特性。圖9顯示各鏈之代表性圖譜；用於定量之計算係如表21所示。該經還原之重鏈MAC-2之平均共軛加成(平均CA)係經計算為0.14，且該經還原之輕鏈MAC-2之平均CA係經計算為0.86，使用下式計算：SUMPRODUCT(共軛加成數(CA)，每CA百分比)。這些資料顯示在輕鏈上之共軛位置數較高；最常見之輕鏈形式包含一個肽加成，且該輕鏈包含平均0.86個肽加成。在重鏈上之共軛被觀察到顯著較低之量。由多人重複分析此實驗顯示該共軛特性係一致且可再現地。
MAC-2係經二硫蘇糖醇之還原，且半胱胺酸殘基係由碘乙醯胺之羧基甲基化加以烷化。使用胰凝乳酶進行蛋白水解消化。溶液中經消化之片段係利用液體層析質譜(LCMS)分析。各片段在C18 HPLC管柱中分離，彼等之正確質量係於四級棒飛行時間(Q-ToF)質譜儀中測量。所得到之片段質量被用於識別未經修飾之片段或經共軛肽修飾之片段。此實驗係藉由聚焦於包含離胺酸殘基之胰凝乳酶消化片段加以評估，因為這些是肽共軛之可能位點。表22顯示所有該等片段之表列。空白代表未利用該項技術檢測之片段。被觀察到具有肽修飾物之檢測片段被認為是潛在的共軛位點。
表22之表格欄位解釋如下：
‧片段編號：自N端之胰凝乳酶消化片段編號；聯合片段(例如Y1-2)表示遺失切割位點。
‧開始/結束：自N端之片段位置之編號
‧肽質量(Da)：列示片段之理論質量，單位道爾頓。
‧滯留時間(對照/分析)：在LCMS片段定位實驗中層析滯留/洗脫之時間。
‧MS信號強度(對照/分析)：由MS觀察到之觀察信號之強度。
‧質量誤差-ppm(對照/分析)：片段之理論與觀察質量之比較；數值>10，特別是越接近零(0)顯示越高之質量正確性。
‧修飾物：該片段之潛在共價加成；肽為Lys殘基之抗體結合片段，CAM為半胱胺酸殘基之羧基甲基化。
‧星號表示經修飾(例如共軛)版本之個別片段。
‧Pep表示經共軛之肽。
肽與Y15片段之方向性共軛係藉由定量該共軛量顯示。下列分析在各個被觀察到在該2.12.1.fx參照產物之肽定位實驗中具有共軛之肽片段上進行。該觀察到之未經修飾之肽於該未經共軛之對照(2.12.1.fx抗體支架-無共軛)相較於經共軛之參照產物(MAC-2)之信號強度之比例係顯示於表23。使用該未經修飾之信號是因為可以直接比較各樣本中相同之肽信號。舉例來說，未經共軛之肽將預期在對照與產物樣本中具有相同之觀察信號強度，因此導致(1)之比例。共軛將導致產物樣本中未經修飾肽之觀察量減少，其將以超過(1)之比例表示。表23中之資料進一步被正常化以校正該對照與產物之間的樣本及實驗差異。表23顯示輕鏈肽Y15相較於其他各種共軛肽係以顯著較高之量共軛。這表示共軛以方向性方式發生且不隨機分布在K殘基之間。
實施例13　Ang1至4結合ELISA
高結合性半孔盤係經重組人Ang1、人Ang2、小鼠Ang3或人Ang4(所有試劑來自R&D Systems，250 μg/ml)之50 ul PBS溶液包覆，並於4℃培養隔夜。孔盤以清洗緩衝液清洗3次(0.1% Tween 20，PBS，pH 7.4)，以Superblock 150 μl/孔於室溫中封閉1小時。用清洗緩衝液清洗孔盤3次。在清洗後，準備投藥溶液(dosing solution)(範圍：0.005至50,000ng/ml)，並將其添加至孔盤及培養1小時，以允許該化合物與該孔盤上包覆之Ang家族成員結合。各種血管生成素之陽性對照包括拮抗各家族成員之單株或多株抗體(由R&D Systems供應)。清洗孔盤3次，添加50 μl之HRP共軛之抗人IgG(0.8 μg/mL)(或陽性對照之個別物種)，於室溫中培養1小時。清洗孔盤3次，添加50 μl(25 μl TMB+25 μl H2 O2 )受質溶液，培養1至5分鐘。加入25 μl之2M H2 SO4 以停止發色。測量檢測波長450 nm及校正波長540 nm之吸收值(OD450 nm)。
實施例14　Ang2逆向競爭試驗
在Ang2逆向競爭ELISA中，使用人Tie2-Fc、血管生成素-2蛋白、生物素基化抗人Ang2抗體、鏈黴抗生物素蛋白HRP(R&D Systems)、及來自皮爾斯(Pierce)公司之TMB受質。高結合性半孔盤係經Tie2-Fc(50 ng/孔)之50μl PBS溶液包覆，並於4℃培養隔夜。孔盤以清洗緩衝液清洗3次(0.1% Tween 20，PBS，pH 7.4)，以Superblock 150 μl/孔於室溫中封閉1小時。清洗孔盤3次。在清洗後，添加50 μl之含Ang2結合肽化合物(50 nM，5x連續稀釋)與50 ng/ml(0.83 nM)之Ang2之Superblock溶液，在室溫中培養1小時。清洗孔盤3次，添加50 μl之含1 μg/mL之生物素基化抗Ang2檢測抗體之Superblock溶液，於室溫中培養2小時。清洗孔盤3次，添加50 μl之鏈黴抗生物素蛋白HRP(1：200稀釋於Superblock中)，於室溫中培養20分鐘。清洗孔盤3次，添加50 μl(25 μl TMB+25 μl H2 O2 )受質溶液，培養20至30分鐘。加入25 μl之2M H2 SO4 以停止發色。測量檢測波長450 nm及校正波長540 nm之吸收值(OD450nm)。利用Prism 4軟體中之非線性S形劑量反應曲線擬合功能計算IC50之值(50%抑制Ang2與Tie2之結合)。
在某些實施例中，Ang2-h38C2-IgG1被用來作為對照。Ang2-h38C2之產製及結構在專利WO2008056346中有詳細說明(為化合物43)，該專利之內容併入本發明，特別參照有關化合物43之產製之態樣。簡言之，該結構如下：
其中該連接子係與抗體之結合部位之K99 (根據卡巴編號之K93 )之ε-胺基共價連接，且該抗體係h38C2-IgG1(SEQ ID NO：51及52)(WO2008/056346之SEQ ID NO：189及SEQ ID NO：190)。
實施例15　IGF1R競爭試驗
在IGF1R競爭ELISA中，使用重組人IGF1R(R&D Systems)、生物素基化IGF1(GroPep Ltd.)、鏈黴抗生物素蛋白-聚-HRP20(SDT)、Superblock、及TMB受質(Pierce)。高結合性半孔盤係經IGF1R(62.5 ng/孔)之50 ul PBS溶液包覆，並於4℃培養隔夜。孔盤以清洗緩衝液清洗3次(0.1% Tween 20，PBS，pH 7.4)，以Superblock 150 μl/孔於室溫中封閉1小時。用清洗緩衝液清洗孔盤3次。在清洗後，添加50 μl之含IGF1R結合化合物(1 μM，5x連續稀釋)與100 ng/mL(13.3 nM)之生物素基化IGF1之Superblock溶液，在室溫中培養1小時。清洗孔盤3次，添加50 μl之鏈黴抗生物素蛋白-聚-HRP20(1：5000稀釋於Superblock中)，於室溫中培養20分鐘。清洗孔盤3次，添加50 μl(25 μl TMB+25 μl H2 O2 )受質溶液，培養5至10分鐘。加入25 μl之2M H2 SO4 以停止發色。測量檢測波長450 nm及校正波長540 nm之吸收值(OD450nm)。利用Prism 4軟體中之非線性S形劑量反應曲線擬合功能計算IC50 之值(50%抑制IGF1與IGF1R之結合)。
實施例16IGF1誘發IGF1R自體磷酸化抑制試驗
在IGF1R自體磷酸化抑制試驗中，使用表現人IGF1R之工程化小鼠3T3細胞，且該磷酸化係由細胞信號技術(Cell Signaling Technologies)公司之磷醯基-IGFI受體β(Tyr1131)三明治式ELISA套組#7302測定。人IGF1R表現完整細胞被接種(5.0×104 細胞/孔)於96孔組織培養處理圓底盤，允許其於50 μL之生長培養基中附著隔夜(37℃，5% CO2 ，生長培養基係由含10% FBS、2mM L-麩醯胺酸、青黴素-鏈黴素及500 μg/mL之遺傳黴素(Geneticin)之DMEM組成)。經16小時後，吸取移除該生長培養基，每孔添加50 μL之含有IGF1R結合化合物(1 mM，8x連續稀釋)與100 ng/mL(13.3 nM)重組人IGF1之新的生長培養基，在室溫中培養10分鐘。該盤藉由吸掉液體再添加每孔100 μL之冰冷PBS加以清洗。立刻吸掉該冷PBS，接著添加60 μL之溶胞緩衝液(從溶胞緩衝液開始，所有下列試劑皆為Cell Signaling Technologies所製造供應之商用套組之一部分，該套組係經設計以定量IGF1R之酪胺酸1131之磷酸化)至各孔，於室溫中搖晃培養10分鐘。該孔盤接著在4℃離心5分鐘。該上清液(每孔50 μL)接著被移除並添加至預先包覆磷醯基-IGF1受體β(Tyr1131)兔抗體且含有每孔50 μL之樣本稀釋劑之96孔盤。該孔盤於4℃輕微搖晃培養隔夜16小時。在培養之後，該孔盤以清洗緩衝液清洗4次，在每孔中添加100 μL之人IGF1受體檢測抗體(小鼠來源)以於37℃反應1小時。以清洗緩衝液清洗該孔盤4次，在每孔中添加100 μL之HRP連接小鼠IgG二級抗體以於37℃反應30分鐘。清洗該孔盤4次，在各孔中添加100 μL之TMB受質並培養30分鐘。加入50 μl之2M H2 SO4 以停止發色。測量檢測波長450 nm及校正波長540 nm之吸收值(OD450nm)。不論有無IGF1處理之內部對照組皆證實該磷酸化事件之特異性及測定該跨膜傳訊之抑制%。利用Prism 4軟體中之非線性S形劑量反應曲線擬合功能計算EC50 之值(達到一半最大信號之濃度)。
實施例17　IGF1R下調試驗
在IGF1R下調中，使用人結腸腺癌Colo205細胞，IGF1R於細胞表面之表現係由流式細胞分析測定。組織培養96孔盤接種5×104 細胞/孔於生長培養基(RPMI，10%胎牛血清，麩醯胺酸)係於37℃下以化合物滴定處理3小時。用PBS潤洗細胞，利用CellStripper使細胞脫離，並轉移至新鮮之96孔盤。用含有2.5%胎牛血清之PBS清洗細胞3次。細胞與經藻紅素共軛之小鼠抗人IGFIR單株抗體(R&D FAB391P，10 μl/5×10-5 cells)於暗室中培養1小時。接著用含有2.5%胎牛血清之PBS清洗細胞3次。細胞表面上之IGF1R存在係藉由使用FACSArray之流式細胞分析測定，利用F1oJo軟體分析資料。受體數量藉由套入資料至利用QuantiBRITE PE珠(BD 340495)產製之標準曲線計算。該資料被報告為測試化合物比上陰性對照hIgG2之下調百分比。
結果及討論
MAC-2與人Ang2特異性結合之能力係顯示於圖10。MAC-2及Ang2-h38c2能與人Ang2結合，但無法與人Ang1、人Ang4或小鼠Ang3結合，這顯示對Ang2而非其他血管生成素家族成員之高度特異性。
MAC-1及MAC-2能與Ang2結合以防止Ang2與Tie2結合，如Ang2競爭試驗中所示(圖11及表24)。令人意外的是，相較於Ang2-h38c2，MAC-1及MAC-2二者皆顯示競爭結合Ang2之能力增加。在證實該共軛MAC結合並抑制Ang2與Tie2之結合後，其與IGF1競爭與IGF1R結合之能力係利用IGF1R競爭試驗測定(圖12)。MAC-1及MAC-2和母體抗IGF1R抗體(2.12.1.fx)一樣有效地與IGF1競爭與IGF1R之結合。MAC-1及MAC-2顯示低奈莫耳範圍之IC50 之值。相對地，在某些其他抗IGF1R抗體之測試中，觀察到與肽之共軛干擾該抗體與IGF1R交互作用之能力(資料未顯示)。
為了證實在該競爭試驗中觀察到之IGF抑制，可轉換成抑制IGF誘導之傳訊事件，使用以細胞為基之功能測試來測定在IGF刺激後IGF1R自體磷酸化之抑制(圖13及表24)。MAC-1及MAC-2具有和母體抗IGF1R抗體(2.12.2.fx)類似之活性；因此，與有限Ang2肽共軛似乎並不改變該MAC固有之結合及抑制作用。
除了抑制IGF1R之自體磷酸化之外，抗IGF1R抗體亦造成IGF1R之內化作用及降解，導致受體下調。此行為在處理之2小時內觀察到，並維持24小時。因此測試該MAC下調在人結腸癌細胞系Colo205上之IGF1R量之能力。細胞係於培養基中以MAC化合物滴定處理3小時。收集該些細胞，利用流式細胞分析測定IGF1R之表面表現。測定IGF1R下調相較於陰性對照hIgG2之百分比(表24) 。MAC-1及MAC-2具有和母體IGF1R抗體(2.12.1.fx)類似之IGF1R下調活性。
所顯示的是，每抗體共軛2個肽對於IGF1R自體磷酸化及下調之效應係最佳的，每抗體共軛超過或少於2個肽皆減弱該MAC達成這些功能之能力。
為了評估每抗體之肽的數目對於2.12.1.fx調節IGF1R活性之能力的影響，2個MAC-1樣本係經製備，其中該反應條件係經設定以提供減少之共軛(MAC-1低)或增加之共軛(MAC-1高)(表25)。分析該等樣本下調及磷酸化IGF1R之能力(表25)。MAC-1高相較於MAC-1低在有效調節IGF1R途徑之能力上有顯著差異。相較於每抗體共軛約2個或少於2個肽，每抗體共軛超過約2個肽限制該MAC抑制IGF1R自體磷酸化及誘導IGF1R下調之二種功能活性。因此，為了有效地以一種雙功能實體同時調節二種不同的生物途徑，每抗體共軛約2個肽可能理想(依肽及標靶之藥物動力學特性而定)。
實施例18活體內藥物動力學 實驗方法
經驗證之直接結合酶連接免疫吸附測定(ELISA)方法被用於測量小鼠及猴血清中之血清MAC量。簡言之，在樣本中之MAC與被動吸附在微量盤上之IGF1R或Ang2結合，使用辣根過氧化酶共軛之抗人IgG與發色受質以產生與血清樣本中之MAC-2之濃度成比例之信號。在小鼠血清中MAC-2之定量上限及下限為26.0及1000 ng/ml，馬來猴(cynomolgus monkey)之上限及下限為52.0及2000 ng/ml。
Ang2及IGF1R逆向ELISA
高結合性半孔盤係經IGF1R(62.5 ng/孔)或Ang2(6.25 ng/ml)之50 ul PBS溶液包覆，並於4℃培養隔夜。孔盤以清洗緩衝液清洗3次(0.1% Tween 20，PBS，pH 7.4)，以Superblock 150 μl/孔於室溫中封閉1小時。用清洗緩衝液清洗孔盤3次。在清洗後，準備投藥溶液標準物(範圍：3.91至500ng/ml)，將血清樣本添加至孔盤及培養1小時，以允許該MAC複合體與該孔盤上包覆之Ang2或IGF1R結合。清洗孔盤3次，添加50 μl之 HRP共軛之山羊抗人IgG(0.8 μg/mL)，於室溫中培養1小時。清洗孔盤3次，添加50 μl(25 μl TMB+25 μl H2 O2 )受質溶液，培養1至5分鐘。加入25 μl之2M H2 SO4 以停止發色。測量檢測波長450 nm及校正波長540 nm之吸收值(OD450nm)。該MAC複合體之血清濃度利用標準曲線計算。由ELISA測定之MAC複合體濃度被作成時間函數之圖。利用WinNonlin version 4.1(Pharsight Corporation)進行進一步之資料分析，以測定MAC複合體之β半衰期(T1/2)及曲線下面積(AUC)。
小鼠
PK試驗係利用開始投藥時體重大約20至22克之Swiss Webster公鼠(CFW,Charles River,Hollister,CA)進行。MAC化合物係經靜脈內投予。在下列時間點中之每個時間點向4隻小鼠採集血液樣本：0.08、0.5、1、3、5、7及24小時。採集樣本前，在所有血液試管中加入蛋白酶抑制劑雞尾酒。使血液在冰上凝血30分鐘，接著於4℃以12000 rpm離心5至10分鐘以收集血清，並立刻儲存於-80℃直到經由ELISA分析。投藥溶液被用於建立由Ang2或IGF1R逆向ELISA進行血清樣本分析之標準曲線。各血清樣本之等分利用Ang2或IGF1R逆向ELISA分析。
猴
MAC-2之藥物動力學特性係經測定。2隻公馬來猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis ))被用於本試驗；MAC-2係以10 mg/kg之劑量經靜脈注射(快速濃注)投予。所有動物在第一天投藥後5分鐘、15分鐘、1小時、4小時及8小時觀察，之後每天二次觀察任何對治療之反應。在第1、2、3、4、5、7及14天測量並記錄體重。用於毒理動力學分析之血液樣本在指定之時間點收集，分離血清並儲存於-80℃。
在實驗期間並未觀察到可能與MAC-2治療有關之不良臨床症狀。體重紀錄令人滿意。在各時間點(0.08至504小時)自每隻動物之股靜脈收集大約1.0 mL之血液樣本至空白凝血管。血液樣本收集後靜置於室溫下1小時，接著在4℃下以3000 rpm離心10分鐘。該形成之血清樣本在分析前被儲存於大約-80℃。
結果
探索性非GLP藥物動力學(PK)試驗係於Swiss Webster公鼠及馬來公猴進行(表26及27)。分析MAC之Ang2及IGF1R結合活性。在小鼠中，MAC-1及MAC-2顯示與該母體抗IGF1R抗體類似之駐留時間，β期半衰期為383至397小時。MAC-1及MAC-2 Ang2結合能力顯示與Ang2-h38c2類似之駐留時間，在小鼠單一劑量IV試驗中具有105至120小時之β期半衰期。在馬來猴中，MAC-2顯示比該母體抗IGF1R抗體稍微較短之駐留時間，β期半衰期為100.4小時。MAC-2 Ang2結合能力顯示與Ang2-h38c2類似之駐留時間，β期半衰期為97.8小時。
實施例19活體內藥理學 實驗方法
MAC-2之抗腫瘤活性係於Colo205(人結腸腺癌)或MDA-MB-435(黑色素瘤)異種移植模型中評估。Colo205或MDA-MB-435細胞利用10% FBS RPMI培養基培養，3×106 細胞於0.1 ml Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中被皮下注射至5至7周齡nu/nu母鼠之右上側腹，使其建立200至400 mm3 之體積後才開始治療。一旦腫瘤建立後，小鼠被隨機分配至具有相同腫瘤體積之治療組(n=9至10/組)，MAC-2治療係藉由腹膜內(IP)注射投予一周一次。在組合試驗中，額外之抗癌劑藉由IP注射伴隨MAC-2治療每周一起投予。在治療期間，腫瘤體積每周利用游標卡尺測量一次或二次，體重每周測量一次。在一些試驗中，當載劑治療對照組之腫瘤體積達到2000 mm3 時，所有小鼠皆以CO2 窒息法安樂死，接著切除腫瘤、秤重及處理以供進一步組織學及/或免疫化學評估。在假性存活試驗中，當各治療組之平均腫瘤體積超過2000 mm3 時，小鼠以CO2 窒息法安樂死，接著切除腫瘤及秤重。
結果
在Colo205(人結腸腺癌)異種移植模型中進行之實驗係如圖14A及15A所示。每週投予Ang2-h38c2或抗IGF1R抗體(2.12.1.fx)抑制Colo205腫瘤生長。每周投予Ang2-h38c2與抗IGF1R抗體之組合顯示在抑制Colo205腫瘤生長上之加成好處。每周單獨投予MAC-2顯示與該組合類似之好處(圖14A)。在不同的試驗中，MAC-2劑量依賴性地抑制Colo205腫瘤生長及終腫瘤重量(圖15A、B)。
在第28天，化合物治療小鼠係經犧牲，腫瘤被切除並加以快速冷凍。為了評估MAC-2之抗血管生成效應，在經載劑(PBS)或MAC-2(劑量反應介於0.3 mg/kg至10 mg/kg)治療之Colo205結腸腺癌異種移植腫瘤之冷凍切片上以免疫組織化學評估腫瘤微血管密度。腫瘤係以抗CD31之小鼠特異性單株抗體染色，在每個腫瘤之3個切片中之5個區域定量免疫反應性(圖15C)。MAC-2(10 mg/kg，一周一次)相較於載劑治療組顯著減少腫瘤微血管密度約42%，證實MAC-2治療之抗血管生成活性。
為了探討MAC-2在活體內是否同時以Ang2及IGF1R為標靶，在二個經載劑、Ang2-h38c2、IGF1R抗體(2.12.1.fx)或MAC-2(劑量反應介於0.3 mg/kg至10 mg/kg)治療之獨立Colo205異種移植腫瘤中評估MAC-2對Ang2及IGF1R表現量之影響。自冷凍切除之腫瘤製備溶胞物，以ELISA定量Ang2及IGF1R免疫反應性。相較於載劑治療組，MAC-2治療以劑量依賴方式(1、3及10 mg/kg)顯著減少Ang2及IGF1R免疫反應性(圖14B、15D及15E)。MAC-2對IGF1R量之影響類似在IGF1R拮抗抗體(2.12.1.fx)所觀察到之結果(圖14B)。此外，磷酸化IGF1R之量在經MAC-2治療之動物的腫瘤中係經減少(資料未顯示)。在這些腫瘤之固定切片上之免疫螢光亦證實IGF1R及pIGF1R之減少(資料未顯示)。這些資料顯示MAC-2治療在Colo205異種移植模型中影響Ang2及IGF1R二種途徑。
在3個分開之試驗中，MAC-2治療相較於載劑(PBS)、Ang2-h38c2及IGF1R抗體(2.12.1.fx及2.13.2)導致持續腫瘤抑制(圖16A、16B、16C)。抗IGF1R抗體2.13.1在WO02/053596中被稱為SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：47，含有較少個別信號序列。MAC-2之腫瘤抑制與Ang2-h38c2及2.12.1.fx之組合類似，且高於Ang2-h38c2及2.13.2之組合(圖16C)。MAC-2治療不影響體重增加(資料未顯示)，小鼠在整個試驗期間呈現良好健康狀況。允許各組動物之腫瘤生長至2000 mm3 以作為假性存活試驗。Ang2-h38c2及抗IGF1R抗體兩個治療組必須在第48天停止；然而，MAC-2治療腫瘤(3至10 mpk)到第94天該試驗結束時仍在2000 mm3 以下。
MAC-2之抗腫瘤療效亦在MDA-MB-435黑色素瘤異種移植模型中評估。每周投予MAC-2(3及20 mg/kg IP)導致MDA-MB-435模型中之腫瘤生長顯著減少40%(第67天)(圖17)。因此，MAC-2在二個不同之人異種移植腫瘤模型中顯示顯著抗腫瘤療效。
實施例20各種抗體之肽共軛特性
多種不同抗體與肽之共軛特性係經分析，分別使用SEQ ID NO：27及5PEG作為示範性肽及連接子。所有測試抗體皆為具有清楚抗原交互作用定義及特徵之人或全人化IgG抗體。hAbλ測試包含CLλ，然而2.12.1.fx、mAbKTest1、h28C2-IgG1(SEQ ID NO：51及52)和h38C2-IgG2(SEQ ID NO：53及54)各包含CLκ。各抗體經緩衝液交換為20mM HEPES，pH 7.0，濃縮成5至20mg/mL。SEQ ID NO：27/K11 -5PEG-PFP係利用50%丙二醇重懸，以4.3：1莫耳比與該相關抗體混合，允許在室溫下反應至少2小時。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重肽共軛部位被視為藉由結合肽之質量差異所分開之不同信號。多重肽共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表28顯示各種抗體之肽共軛特性。
以包含CLκ之抗體而言，肽共軛發生在介於0至4個肽加成之分布，最大形式為2至3個肽加成。相對地，以包含CLλ之抗體(hAbλTest)而言，肽之共軛發生在介於0至4個肽加成之分布，最大形式為1至2個肽加成。
肽共軛之程度係在輕鏈及重鏈上分開檢測。各樣本係利用鹽酸胍及二硫蘇糖醇加以變性及還原雙硫鍵。該形成之游離輕鏈及重鏈係利用LCMS分析以測定各自之共軛特性。在各種抗體之輕鏈及重鏈上之肽共軛特性係顯示於表28。在2.12.1.fx和hAbκTest1上之資料顯示共軛位置在輕鏈上較多；含量最多之輕鏈形式包含1個肽加成。在重鏈上之共軛被觀察到顯著較低之量。在h38C2-IgG1及h38C2-IgG2上，輕鏈及重鏈上所觀察到之共軛量類似，稍微偏向輕鏈上之共軛。在含CLλ之抗體(hAbλTest)上，大部分之共軛發生在重鏈上，在輕鏈上觀察到低量之共軛。
抗體2.12.1.fx、hAbλTest及hAbκTest1中之各者係在共軛之後檢測，以測定共軛加成對於抗體支架保留彼之受體結合能力之影響(相較於天然mAb)(表29)。結果顯示肽與測試抗體之方向性共軛似乎不改變該抗體之結合。
實施例21IgG2-κ之代表性抗體之肽共軛特性
具有39聚體肽之IgG2κ抗體(hABκTest2)之共軛特性係經分析。該抗體被濃縮成8mg/mL，並經緩衝液交換至40mM HEPES pH 8.0。該肽係利用100% DMSO重懸，以5.0：1莫耳比與該抗體混合，允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重肽共軛部位被視為藉由肽之質量差異所分開之不同信號。多重肽共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表30顯示具有39聚體肽之hAbκTest2肽共軛特性。肽共軛發生在介於0至4個肽加成之分布，平均為2.03個肽加成，且與CLκ-K188 上之方向性共軛一致。
在分開之實驗中，該39聚體肽係藉由上述之MAL-2PEG-PFP，以不同莫耳濃度與h38C2-IgG2共軛。此外，測定與該39聚體之同源受體之結合。結果(表31)顯示與在K188 -CLκ之方向性共軛一致。另外，增加每抗體之肽平均數不會大幅增加與該標靶之整體結合。此顯示在某些情況中，增加每抗體之共軛可能不會增加標靶結合，這是本發明的好處之一；控制每抗體共軛之肽數目有助於達成每單位肽之最大標靶結合。
實施例22共軛生物素至2.12.1.fx Fab 生物素-2.12.1.fx
2.12.1.fx之Fab區(SEQ ID NO：50及4)與PFP-生物素之共軛特性係經分析。抗體Fab被濃縮至20mg/mL，經緩衝液交換至20mM醋酸鈉+200mM海藻糖pH 5.5，添加60mM磷酸鈉pH 7.7。PFP-生物素係利用100% DMSO重懸，以連續莫耳比與該抗體混合後允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該共軛形式之數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重共軛部位被視為藉由經共軛之肽之質量差異所分開之不同信號。多重共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表32顯示不同莫耳比之2.12.1.fx Fab與PFP-生物素之共軛特性。該共軛隨著莫耳比之增加發生在介於0至2加成之分布。每抗體較低之分子數係與較早結果一致，根據所使用之莫耳比。此有效地顯示該方法藉由改變一或多種反應參數以控制共軛量之彈性。
實施例23共軛生物素至h38C2-IgG1 生物素-h38C2-IgG1
抗體h38C2-IgG1以HEPES緩衝液pH 7.5調整至20mg/mL，終濃度為0.02M。生物素-PFP經水重構為10mg/mL，以5：1之莫耳比被添加至h38C2-IgG1，允許在室溫下反應2小時。該未經反應之PFP-生物素藉由大小排除層析移除，並經緩衝液交換為組胺酸、甘胺酸及蔗糖緩衝液pH 6.5。該樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。表33顯示h38C2-IgG1與生物素-PFP之共軛特性。h38C2-IgG1之共軛發生在介於0至3CA之分布，平均為1.1共軛。在理想化該反應條件後，有可能增加共軛。h38C2-IgG1上之VH-K99 (根據卡巴編號為K93 )當與該酶催化抗體測試化合物CATC-1反應並經由逆向層析分析時，其反應性係經證實為>95%。
CATC-1 實施例242.12.1.fx及K188 、K190 突變物之共軛特性
根據肽定位地圖，在Y15片段上有二個Lys。為了區別活性共軛位點，K188 及K190 被分別或一起突變成R。突變係根據QuickChange定點突變形成套組(斯壯特基(Stratagene)公司)中之說明產製。突變藉由寡核苷酸引子導入並以DNA定序證實。該經突變之單株抗體被暫時表現於HEK 293細胞，利用蛋白質A親和性管柱純化。該經純化之單株抗體可利用MS加以特徵化。SEQ ID NO：33、34及35顯示2.12.1.fx IGF1r突變輕鏈序列。
該抗體經緩衝液交換至0.02M HEPES緩衝液pH 7.5或6.5，濃度為2mg/mL。若pH為6.5，該抗體接著被添加60mM磷酸鈉pH 7.7。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係利用50%丙二醇重懸，以4.3：1莫耳比與該蛋白質混合，允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重共軛部位被視為藉由經共軛之蛋白質之質量差異所分開之不同信號。多重蛋白質共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表34顯示未經修飾之2.12.1.fx、2.12.1.fx-K188 R(輕鏈：SEQ ID NO：33)、2.12.1.fx-K190 R(輕鏈：SEQ ID NO：34)、及2.12.1.fx-K188 R-K190 R(輕鏈：SEQ ID NO：35)之共軛特性。K188 R突變顯示減少共軛。K190 R和未經共軛之2.12.1.fx具有類似共軛。MAC-2之共軛係低於在其他測試中觀察到者，因為使用組合之HEPES/磷酸鹽緩衝液。
實施例25 2.12.1.fx突變物以闡述上K188 之方向性共軛機制
檢查靠近K188 之殘基。H189 側鏈非常靠近K188 之ε-胺基。由於His通常與質子轉移反應有關，因此H189 非常有可能為K188 共軛所需。為了了解H189 在K188 定點共軛之角色，我們用丙胺酸取代組胺酸以消除咪唑環。
D151 A及D151 A/H189 A突變被製備以研究D151 於定點共軛之角色及D151 及H189 之組合效應。
突變係根據QuickChange定點突變形成套組(斯壯特基(Stratagene)公司)中之說明產製。突變藉由寡核苷酸引子導入並以DNA定序證實。該經突變之單株抗體被暫時表現於HEK 293細胞，利用蛋白質A親和性管柱純化。該經純化之單株抗體可利用MS加以特徵化。下列2.12.1.fx輕鏈突變物係經產製：D151 A(SEQ ID NO：36)、K188 A(SEQ ID NO：37)、H189 A(SEQ ID NO：38)、K190 A(SEQ ID NO：39)及D151 A/H189 A(SEQ ID NO：40)。
這些抗體各自經緩衝液交換至20mM醋酸鈉、200m海藻糖pH 5.5，濃度為20mg/ml。該等蛋白質接著被添加60mM磷酸鈉pH 7.7。SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP係利用50%丙二醇重懸，以4.3：1莫耳比與該抗體混合，允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重共軛部位被視為藉由經共軛之肽之質量差異所分開之不同信號。多重共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。
表35顯示2.12.1.fx、2.12.1.fx-D151 A、2.12.1.fx-K188 A、2.12.1.fx-H189 A、2.12.1.fx-K190 A、及2.12.1.fx-D151 A/H189 A突變物之共軛特性。所有突變物相較於該未經修飾之2.12.1.fx抗體皆顯示減少之平均共軛量，除了K190 A以外，其維持方向性共軛。
共軛之程度係在輕鏈及重鏈上分開檢測。各樣本係利用鹽酸胍及二硫蘇糖醇加以變性及還原雙硫鍵。該形成之游離輕鏈及重鏈係利用LCMS分析以測定各自之共軛特性。在2.12.1.fx及突變物之輕鏈及重鏈上之共軛特性係顯示於表35。所有表中列示之突變物顯示相較於該未經修飾之2.12.1.fx在輕鏈上減少之共軛量，除了K190 A以外。該等突變物之重鏈共軛量係與該未經修飾之2.12.1.fx類似。
實施例26 λ/κ取代
在hAbλTest1中之LCλ係經LCκ之取代以測定此是否能增加輕鏈衍生之量、方向性及/或控制。該LCλ/LCκ結構域取代雜合建構體係利用重疊PCR產製。該LVλ及LCκ係分別利用hAbλTest及κ單株抗體輕鏈作為模板以經PCR擴增。這2種PCR產物係經混合以作為模板；在重疊PCR反應中使用hAbλTest1前置引子及LCκ反置引子以擴增該全長hAbλTest LV/LCκ DNA。該雜合抗體建構體被暫時表現於HEK 293細胞，利用蛋白質A親和性管柱純化。該經純化之抗體可利用MS加以特徵化。該hAbλTest LCκ雜合體與彼之同源受體之結合類似該天然之mAb(hAbλTest)(表36)。SEQ ID NO：41、42及43係來自hAbλTest、hAbλTest-λκ(含λJ)、及hAbλTest-λκJ(含κJ)之輕鏈固定區。
實施例27　hAbλTest1突變物：模體修飾
為了了解短模體“KH”是否足以在該CLλ之對應區域中形成MAC，使在hAbλTest中之殘基CLλ188/189 簡單序列交換以製備在K187 旁放進組胺酸之突變物，因此“K187 S188 H189 ”變成“K187 H188 S189 ”。突變係根據QuickChange定點突變形成套組(斯壯特基(Stratagene)公司)中之說明產製。突變藉由寡核苷酸引子導入並以DNA定序證實。該突變抗體建構體被暫時表現於HEK 293細胞，利用蛋白質A親和性管柱純化。該經純化之抗體可利用MS加以特徵化。該hAbλTest-S188 H/H189 S(輕鏈：SEQ ID NO：44)突變物與彼之受體之結合和該母體hAbλTest抗體一樣有效(表37)。
實施例28　hAbλTest1突變物之共軛特性
各種抗體(hAbλTest、hAbλTest-λκ、hAbλTest-λκJ及hAbλTest-S188 H/H189 S)經緩衝液交換至20mM醋酸鈉、200m海藻糖pH 5.5，濃度為20mg/ml。該等蛋白質接著被添加60mM磷酸鈉pH 7.7。SEQ ID NO：27/K11 -5PEG-PFP係利用50%丙二醇重懸，以4.3：1莫耳比與該抗體混合，允許在室溫下反應隔夜。所有樣本係經稀釋至2mg/ml，藉由大小排除層析-質譜分析(SEC-MS)分析完整之共軛蛋白質，以測定該蛋白質之共軛形式的數目及定量。此技術測量各種蛋白質形式之分子量；多重肽共軛部位被視為藉由肽之質量差異所分開之不同信號。多重肽共軛物種之相對定量係由測量該信號強度進行。表38顯示在2種LC交換雜合體(λκ及λκJ-前者包括λ J片段，後者包括κ J片段)中共軛之整體量係經增加。該共軛量隨著hAbλTest對照之平均CA增加，分別自1.66增加至2.19(λκ)及2.53(λκJ)。該突變物相較於天然序列具有很少效應，顯示該“KH”模體不足以用於MAC形成。
肽共軛之程度係在輕鏈及重鏈上分開檢測(表38)。各樣本係利用鹽酸胍及二硫蘇糖醇加以變性及還原雙硫鍵。該形成之游離輕鏈及重鏈係利用LCMS分析以測定各自之共軛特性。在該還原分析中，天然hAbλTest之輕鏈僅具有5%之1CA，但是hAbλTest-λκ及hAbλTest-λκJ分別戲劇性地跳到58% 1CA及63% 1CA。該LC交換對於HC共軛之量的影響很小，維持相對固定(λκJ除外，其中HC共軛呈中度增加)。同樣地，該突變物相較於天然序列具有很少效應，顯示該“KH”模體不足以用於MAC形成。
這些共軛形式之受體結合特性亦經評估以測定與SEQ ID NO：27/K11 -5PEG-PFP共軛對於該些經共軛之抗體仍能與彼等之受體結合之能力的影響(表39)。
實施例29　利用不同離去基團產製MAC
為了探討活性酯離去基團之活化程度及/或結構在定義該方向性共軛效應時是否重要，合成一系列SEQ ID NO：27-K11 (SH)MAC-2PEG-PFP之替代性活化之酯類似物。該共軛產物之分布係由該完整共軛物之MS檢測，且肽加成至輕鏈及重鏈之程度亦在還原該完整共軛物及分開該等輕鏈及重鏈後由MS測定。
該經替代性活化之酯的結構與命名係如下所述。
該經替代性活化之肽係利用和前述實施例1至3中之相同策略及方法合成。簡言之，各種經活化之基團被併入順丁烯二醯亞胺-2PEG-Z*連接子之中，其中Z*代表取代PFP之新的離去基團。為了合成上述化合物，經純化之ABP-硫醇肽(即具有K(SH)作為連接殘基之ABP)之樣本(30至40 mg)被溶解於脫水DMF(2 ml)中。添加MAL-PEG2-Z*(20 mg)與N-甲基嗎啉(5 mL)。該反應在室溫下攪拌進行，以HPLC監測以得知產物形成之時間進程。在2至6小時內觀察到起始肽完全轉換成與活化酯連接之ABP產物。該溶液係經過濾，並由半製備型HPLC直接分離該產物尖峰。該產物係經分離，在冷凍乾燥後產率介於大約30至50%。
該等共軛反應係於標準條件下進行。簡言之，該2.12.1.fx抗體溶液係利用磷酸鈉pH 7.7稀釋2.12.1.fx溶液至終濃度0.06M加以製備。分開地，該肽溶液係藉由溶解該肽於丙二醇至20 mg/ml，接著以水稀釋此溶液至10 mg/ml加以製備。在共軛反應中，該肽與抗體溶液係以4：1莫耳比混合訂明之時間。在時間進程之試驗中，共軛溶液之樣本係在不同之時間點淬熄，藉由混合該共軛反應之樣本與40 mM琥珀酸、200 mM甘胺酸pH 4.0之溶液(1：1,v/v)達成。共軛反應之時間進程由HPLC監測。SEQ ID NO：27被用來作為示範性肽。
SEQ ID NO:27-K11 -MAL-2PEG-Z*
表40顯示在共軛反應開始後24小時該完整共軛物之終產物分布。結果顯示有些酯完全不反應(Z4、Z12)，其他酯反應緩慢(例如Z5)，然而有些達到PFP(Z1)之效果(例如Z3)。
共軛動力學
各種終共軛物於不同時間之加成速率係顯示於表41、42、43及44。0CA代表未經衍生化之2.12.1.fx抗體，而1、2或3CA代表在各個檢測之時間期間加成1、2或3個肽至該2.12.1.fx抗體。
輕鏈及重鏈分布
各種替代性活化之酯的肽共軛程度係在輕鏈及重鏈上分開檢測。各樣本係利用鹽酸胍及二硫蘇糖醇加以變性及還原雙硫鍵。該形成之游離輕鏈及重鏈係利用LCMS分析以測定各自之共軛特性。在2.12.1.fx及突變物之輕鏈及重鏈上之肽共軛特性係顯示於表45。幾乎所有列於表中之經活化之肽相較於使用PFP(Z1)之化合物顯示在輕鏈上減少之共軛量，除了2,3,6-三氟苯基(Z3)以外，其顯示類似之共軛量。衍生自N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之經活化之酯，即N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸醯亞胺及2-羥基-異吲哚啉-1,3-二酮(Z8及Z9)顯示較高傾向之重鏈衍生化。
實施例30
其他替代性活化酯之實例係顯示於表46。一些PFP酯之類似物的共軛時間進程係經檢測。藉由減少在PFP中之氟基團的數目及位置，較少反應性活化酯形式可被合成及檢測。2,3,5,6-四氟苯基酯及2,4,6-三氟苯基酯皆在與SEQ ID NO：27-K11 (SH)MAC-2PEG-PFP共軛後經測試。1-羥基-吡咯啶-2,5-二酮(NHS)係與SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP共軛。
SEQ ID NO:27-K11 (SH)MAC-2PEG-PFP　SEQ ID NO:27-K11 -5PEG-PFP
在2小時共軛後，這些較不活化形式相較於PFP給予2.12.1.fx較低之整體共軛。NHS基團亦顯示較低之整體共軛。NHS及PFP包含肽係與2.12.1.fx共軛。該還原形式係經分析以了解在2小時之分布。PFP顯示遠較高之輕鏈衍生化傾向(77%整體至LC，僅6%至重鏈)，相較於1-羥基-吡咯啶-2,5-二酮(NHS)顯示31%整體至LC，但34%至重鏈。
化合物Z1至Z15代表各種不同結構類型之活性酯。考慮氟化芳香族活性酯之系列，其在該芳香環周圍具有不同的氟原子數目及取代模式(化合物Z1、Z2、Z3、Z11、Z14及Z15)及考慮彼等之結構如何影響彼等對蛋白質衍生化之反應性及傾向當具有啟發性。當該五氟苯基(Z1)反應已到達完成時，這些衍生物之抗體共軛的動力學可被方便地在2小時時間點比較。隨著該環周圍之氟取代之量增加，整體共軛之量增加且未反應抗體隨之減少。反應速率係與該氟化苯酚離去基團之pKa直接相關，最酸之苯酚產生較高之反應速率。共軛速率係Z1>Z14>Z3>Z15>Z2>Z11。氟取代模式之細微效應可藉由比較化合物Z2、Z3及Z15了解。
活性酯之結構亦顯著影響該共軛反應之方向性。通常，該氟化芳香酯顯示對輕鏈衍生化之明顯傾向(主要如前所述之CLκ-K188 )。相反地，有些基於N-羥基琥珀醯亞胺衍生物之酯(Z8、Z9及Z13)顯示較低偏好，通常觀察到較高量之重鏈衍生化。
實施例31
MAC-1(介於該肽與PFP活化基團之間的PEG-2-琥珀醯亞胺-巰丙基連接子)與MAC-2(介於該肽與PFP活化基團之間的直鏈PEG-5連接子)之共軛速率係經檢測。表47比較這些活化肽與2.12.1x。結果顯示該等活化肽在衍生化之速率及程度上之作用非常類似，雖然彼等具有稍微不同之連接子結構。
實施例32連接子長度之效應
具有不同長度之連接子對於終共軛物分布特性之影響係經檢測。利用不同PEG長度之連接子連接該肽與該PFP基團以合成化合物。加成0、1、2、3、及4個肽至2.12.1.fx之結果係顯示於表48。整體而言，改變PEG連接子之長度通常對於所獲得之共軛物之分布很少影響。
實施例33：替代性肽序列之共軛
為了證實本發明對於其他肽序列之適用性，SEQ IDNO：60及SEQ ID NO：61(測試-肽-1，及-2)係經共軛。在先前經理想化之與SEQ ID NO：27-K11 -5PEG-PFP反應之條件下，使SEQ ID NO：60及61與5-PEG-PFP然後與2.12.1.fx抗體共軛。該共軛特性及LC/HC共軛之分析結果係顯示於表49。SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61二者皆顯示與該輕鏈方向性共軛。進一步分析LC/HC分布時，觀察到具有和MAC-2類似之特性，即約70% LC衍生化及少於10%之HC衍生化。
實施例34：
肽定位實驗係於一系列蛋白質/共軛物組合上進行，目的是為了確認導致在抗體輕鏈上之K188 的方向性共軛之重要參數。表50列出該進行之肽定位實驗之結果。每種試驗參數使用先前描述之肽定位方法。“***”表示高量之與K188 -CLκ之方向性共軛。“**”表示較低程度，“*”表示仍有覲察到方向性共軛，但可能顯示差異，諸如較緩慢之反應條件，較少之整體共軛，或平均僅一個輕鏈，因此可能比較適合特殊狀況，諸如產製具有介於每抗體0.5至1.5個肽(舉例來說)之MACs。“-”表示這些反應條件似乎不利於在K188 -CLκ之方向性共軛。
由於K188 -CLκ被觀察到是在MAC-2中之方向性共軛之位置，研究替代性參數之肽定位試驗以此位置為焦點。各種參數之詳細肽定位資料並未包括，但是在其他K殘基之顯著共軛量並未被觀察到，且對於其他MAC之觀察係與在K188 -CLκ之方向性共軛一致。
2.12.1.fx之K188 R及K188 A突變導致喪失在此位點之方向性共軛；顯示此特定殘基之必要角色。K190 R及K190 A突變不阻礙甚至可能增進K188 之方向性共軛。對於所檢測之其他試驗參數而言，至少一部分之輕鏈恆定區亞型被觀察到對於方向性共軛具有顯著影響；至少一部分之該輕鏈亞型K係經測定為必要的。與λ輕鏈亞型共軛(使用示範性λ包含抗體hAbλTest1)並不顯示方向性共軛。當該hAbλTest1之LCλ係經突變成LCκ，恢復在K188 之方向性共軛。
本發明因此已經參考上述之代表性實施態樣加以廣泛地揭示及說明。該領域之技藝人士當能了解，可對本發明進行各種修飾而不背離彼之精神及範圍。所有公開資料、專利申請案及發證專利係以參照方式納入本發明，如同各個分開之公開資料、專利申請案或發證專利特別地且個別地明示以參照方式整體納入。在藉由參照方式納入之文本中所包含之定義若與本揭示中之定義有所衝突者將被排除。
當能了解的是本發明之某些特徵為了清楚說明之目的而在分開之實施態樣之上下文中描述者，亦有可能在單一實施態樣中組合提供。相反地，本發明之各種特徵為了簡便起見而在單一實施態樣之上下文中描述者，亦有可能分開或在任何適當之亞組合中提供。
特別考慮的是關於本發明之一個實施態樣所討論之任何限制可能適用於本發明之任何其他實施態樣。另外，本發明之任何組成物可能被用於本發明之任何方法，且本發明之任何方法可被用於產製或利用本發明之任何組成物。特別是，在申請專利範圍中所描述之本發明之任何態樣，其單獨或與一或多種額外之申請專利範圍及/或該說明書之態樣組合，被了解係可與在其他申請專利範圍及/或說明書及/或序列表及/或圖式之處所列示之本發明之其他態樣組合。
只要在此處說明之特定實例不屬於發明之範圍內，可明確地放棄該特定實例之專利權。
在申請專利範圍中使用用語“或”係用來代表“及/或”，除非明確地指出僅代表選擇性或該選擇性係具有互相排除性，雖然該揭示支持僅代表選擇性及“及/或”之定義。在本說明書所使用之“一”或“一者”可代表一或多者，除非另外清楚地說明。如在本發明之申請專利範圍中所使用者，當與“包含”這個用語一起使用時，用語“一”或“一者”可能代表一者或超過一者。本發明所使用之“另一者”可代表至少第二者或更多。除非此處另外加以定義，關於本發明所使用之科學性及技術性用語應具有該領域之一般技藝人士所通常了解之意義。另外，除非內文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。用語“包含/含有”及用語“具有/包括”當參照本發明用於此處時係用來表明所述之特徵、整數、步驟或成分之存在，但不排除一或多種其他特徵、整數、步驟、成分或彼等之族群之存在或加入。
<110>　愛爾蘭CovX技術有限公司
<120>　多功能抗體共軛物類
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<221>　MISC_FEATURE
<222>　(21)..(21)
<223>　Xaa=I或F
<400>　20
<210>　21
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　21
<210>　22
<211>　12
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　22
<210>　23
<211>　34
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　23
<210>　24
<211>　11
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(10)..(10)
<223>　Xaa=K或I
<400>　24
<210>　25
<211>　11
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　25
<210>　26
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(9)..(9)
<223>　Xaa=AcK或Leu
<400>　26
<210>　27
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(9)..(9)
<223>　Xaa=AcK
<400>　27
<210>　28
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<400>　28
<210>　29
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(11)..(11)
<223>　Xaa=AcK
<400>　29
<210>　30
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(11)..(11)
<223>　Xaa=AcK
<400>　30
<210>　31
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(11)..(11)
<223>　Xaa=AcK
<400>　31
<210>　32
<211>　22
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(2)..(2)
<223>　Xaa=AcK
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(11)..(11)
<223>　Xaa=AcK
<400>　32
<210>　33
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　33
<210>　34
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　34
<210>　35
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　35
<210>　36
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　36
<210>　37
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　37
<210>　38
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　38
<210>　39
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　39
<210>　40
<211>　214
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　40
<210>　41
<211>　116
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　41
<210>　42
<211>　117
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　42
<210>　43
<211>　117
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　43
<210>　44
<211>　116
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　44
<210>　45
<211>　106
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Xaa=V或A
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(82)..(82)
<223>　Xaa=G,A,V,L,I,S,T,C,M,N,Q,F,Y,W,K,R,H,D或E
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa=L或V
<400>　45
<210>　46
<211>　106
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(45)..(45)
<223>　Xaa=V或A
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(83)..(83)
<223>　Xaa=L或V
<400>　46
<210>　47
<211>　106
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<220>
<221>　MISC_FEATURE
<222>　(82)..(82)
<223>　Xaa=G,A,V,L,I,S,T,C,M,N,Q,F,Y,W,K,R,H,D或E
<400>　47
<210>　48
<211>　106
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　48
<210>　49
<211>　106
<212>　PRT
<213>　小鼠(Mus musculus)
<400>　49
<210>　50
<211>　230
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　50
<210>　51
<211>　219
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　51
<210>　52
<211>　448
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　52
<210>　53
<211>　219
<212>　PRT
<213>　智入(Homo sapiens)
<400>　53
<210>　54
<211>　444
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　54
<210>　55
<211>　112
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　55
<210>　56
<211>　118
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　56
<210>　57
<211>　112
<212>　PRT
<213>　小鼠(Mus musculus)
<400>　57
<210>　58
<211>　118
<212>　PRT
<213>　小鼠(Mus musculus)
<400>　58
<210>　59
<211>　15
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　59
<210>　60
<211>　7
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　60
<210>　61
<211>　12
<212>　PRT
<213>　智人(Homo sapiens)
<400>　61
圖1A：抗體2.12.1及2.12.1.fx之重鏈的胺基酸序列之排比，其中顯示可變區之一致序列。圖1B：抗體2.12.1及2.12.1.fx之輕鏈的胺基酸序列之排比，其中顯示可變區之一致序列。CDR以畫底線表示，恆定區以斜體表示。抗體2.12.1及2.12.1.fx之序列係揭示於WO2005016967及WO2005016967。
圖2：MAC之完整分子量質譜分析顯示多重肽係與抗IGF1R抗體2.12.1.fx連接。圖2A：抗IGF1R抗體2.12.1.fx之質譜分析資料。圖2B至2D：MAC-2之質譜分析資料，其顯示3個不同批次之重複試驗。
圖3：2.12.1.fx(IGF1R)及3批MAC-2(MAC)之質譜分析，其中雙硫鍵係經還原。圖3A：2.12.1.fx(IGF1R)輕鏈之質譜分析資料。圖3B：2.12.1.fx(IGF1R)重鏈之質譜分析資料。圖3C：MAC-2輕鏈(批號1)之質譜分析資料。圖3D：MAC-2重鏈(批號1)之質譜分析資料。圖3E：MAC-2輕鏈(批號2)之質譜分析資料。圖3F：MAC-2重鏈(批號2)之質譜分析資料。圖3G：MAC-2輕鏈(批號3)之質譜分析資料。圖3H：MAC-2重鏈(批號3)之質譜分析資料。
圖4A：抗體2.12.1.fx之輕鏈之胺基酸序列，其中胰凝乳酶切割位點以黑點標示。包含Lys殘基(可能共軛之位點)之胰凝乳酶切割片段係以自N端之編號標示。該輕鏈之Y15片段係以底線標示。圖4B：抗體2.12.1.fx之重鏈之胺基酸序列，其中胰凝乳酶切割位點以黑點標示。包含Lys殘基(可能共軛之位點)之胰凝乳酶切割片段係以自N端之編號標示。
圖5A：經共軛之含離胺酸之肽：輕鏈Y15的質譜分析資料，其顯示未經共軛之抗IGF1R抗體2.12.1.fx(IGF1r)與MAC-2(MAC)之質譜分析資料，另顯示Y15片段之圖式。圖5B：未經共軛之輕鏈Y15片段之質譜分析資料，其顯示未經共軛之抗IGF1R抗體2.12.1.fx(IGF1r)與MAC-2(MAC)之質譜分析資料，另顯示Y15片段之圖式。
圖6A：該2.12.1.fx之胰蛋白酶切割片段之選擇離子LCMS層析資料。圖6B：當該胰蛋白酶切割片段之Lys188 經MAC-2之ABP修飾後之選擇離子LCMS層析資料。
圖7A：該2.12.1.fx之胰蛋白酶切割片段之選擇離子LCMS層析資料。圖7B：當該胰蛋白酶切割肽之Lys190 經MAC-2之ABP修飾後之選擇離子LCMS層析資料。
圖8：完整MAC-2之質譜圖。
圖9A：用於MAC-2之經還原之重鏈之質譜圖。圖9B：用於MAC-2之經還原之輕鏈之質譜圖。
圖10：Ang1至4之結合ELISA。MAC與Ang家族成員(Ang1至4)結合之代表圖。
圖11：Ang2競爭性ELISA。MAC與Ang2競爭與Tie2受體之結合的代表圖。
圖12：IGF1R競爭性ELISA。MAC與IGF1競爭與IGF1R之結合的代表圖。
圖13：MAC抑制在3T3-hIGF1R細胞上之IGF1誘導之IGF1R自體磷酸化。
圖14A：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑、Ang2-h38c2、IGF1R抗體(2.12.1.fx)或MAC-2(腹腔注射，一周一次)治療後之腫瘤體積。資料係以0至28天之n=10/組之平均值及SE表示(在28天後所有組別之n=10)。*：P<0.05，IGF1R抗體(2.12.1.fx)10 mg/kg相較於MAC-210 mg/kg；**：P<0.01，Ang2-h38C2相較於MAC-2；二因子變異數分析，邦弗朗尼(Bonferroni)事後比較。圖14B：自經切除及冷凍之腫瘤所製備之溶解物中之相對IGF1R表現量。
圖15A：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑或MAC-2每周IP治療後(腹腔注射一周一次，0.3至10 mg/kg)之腫瘤體積。資料係以n=10/組之平均值及SE表示。***：P<0.001，PBS相較於MAC-2(所有劑量)；二因子變異數分析，邦弗朗尼(Bonferroni)事後比較。圖15B：第28天之終末腫瘤重量。圖15C：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑或MAC-2(IP，一周一次)治療後之腫瘤微血管密度。圖15D：自經切除及冷凍之腫瘤所製備之溶解物中之相對Ang2表現量。圖15E：自經切除及冷凍之腫瘤所製備之溶解物中之相對IGF1R表現量。
圖16A：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑、Ang2-h38c2(10 mg/kg)、IGF1R抗體(2.12.1.fx)(10 mg/kg)或MAC-2(1、3或10 mg/kg)一周一次腹腔注射治療後之腫瘤體積。圖16B：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑、IGF1R抗體(2.13.2)(10 mg/kg)或MAC-2(10 mg/kg)一周一次腹腔注射治療後之腫瘤體積。圖16C：Colo205結腸腺癌異種移植在經載劑、Ang2-h38c2(10 mg/kg)、IGF1R抗體(2.12.1.fx及2.13.2)(10 mg/kg)、MAC-2(1、3或10 mg/kg)、或Ang2-h38c2(10 mg/kg)與2.12.1.fx或2.13.2(10 mg/kg)之組合一周一次腹腔注射治療後之腫瘤體積。所有資料係以n=10/組之平均值及SE表示。
圖17：MDA-MB-435黑色素瘤在經載劑或MAC-2(IP，一周一次)每周治療後之腫瘤體積。**：P<0.05，PBS相較於MAC-2，20mg/kg；***：P<0.01 PBS相較於Ang2-h38c2，10 mg/kg或 MAC-2，3 mg/kg；二因子變異數分析，邦弗朗尼(Bonferroni)事後比較。資料係以n=10/組之平均值及SE表示。
圖18A：m38c2、h38c2及人種系之可變結構域的胺基酸序列排比。骨架區(FR)及互補決定區(CDR)系根據卡巴(Kabat)等人之定義。星號標示在m38c2與h38c2之間或在h38c2與該人種系序列之間的不同。圖18B：小鼠輕鏈K恆定區(mCLκ)、人輕鏈K恆定區(hCLκ)及人輕鏈λ恆定區(hCLλ)之胺基酸序列排比。在mCLκ與hCLκ之間和hCLκ與hCLλ之間的不同係以星號顯示，保守性取代則以十字表示。

Claims (17)

  1. 一種用於製備多功能抗體共軛物(MAC)之方法，該MAC包含：(i)抗體或彼之抗原結合部分，該抗體或彼之抗原結合部分包含至少輕鏈κ恆定區(CLκ)之片段，該片段包含根據卡巴(Kabat)編號之K188 及H189 ；(ii)連接子，該連接子包含式X-Y-Z，其中Z係式基團，且係透過K188 (根據卡巴編號)之側 鏈的ε-胺基與該抗體共價連接，Y係線性或分歧之生物相容性連接鏈，且X係與至少一個效應基團共價連接之基團，及彼之醫藥上可接受之鹽、立體異構物、互變異構物、溶劑合物和前藥，該方法包含共價連接該效應基團至末端為具有下式之離去基Z*之連接子的活化之酯且使該如此形成之效應基團-連接子-Z*複合體與該抗體反應： 其中R1 係F，且h=3、4或5。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中Z*係
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該抗 體或彼之抗原結合部分另包含D151 -CLκ。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該CLκ區包含選自於由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47所組成的群組之至少殘基62至103。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該CLκ區包含選自於由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47所組成的群組之至少殘基1至106。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該效應基團係治療劑、蛋白質、肽、核酸、適體、小分子、蛋白質促效劑、蛋白質拮抗劑、代謝調節劑、荷爾蒙、毒素、生長因子或診斷劑。
  7. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該至少一個效應基團係蛋白質或肽，且其中該連接子之X基團係與該蛋白質或肽之胺基端、羧基端或肽連接殘基的側鏈共價連接。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該肽連接殘基係選自於由K、R、C、T、Y、S、Dap、Dab、K(SH)、K之同源物及C之同源物所組成的群組。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中Y係選自由下列所組成的群組： 其中n=0至10。
  10. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中Y、X-Y、Y-Z或X-Y-Z係選自於由下列所組成的群組： 其中m、n及j係各自獨立之範圍，該範圍之下限係選自於由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20所組成的群組，該範圍之上限係選自於由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30所組成的群組，且其中該連接子之整體長度不超過200個原子。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該連接 子之整體長度不超過60個原子。
  12. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其包含下式： 其中K188 -CLκ係與該K188 -CLκ之側鏈連接之共價鍵接，效應基團-LR係與該效應基團連接之共價鍵接，且m、n及j係各自獨立之範圍，該範圍之下限係選自於由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及20所組成的群組，該範圍之上限係選自於由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29及30所組成的群組，且其中該連接子之整體長度不超過200個原子。
  13. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該抗體係選自由利妥昔單抗(Rituximab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、英利昔單抗(Infliximab)、阿達木單抗(Adalimumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab)及帕利珠單抗(Palivizumab)所組成的群組。
  14. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其另具有下列之一或多者特性：(a)該效應基團：抗體之比在共軛反應開始時係選自於由下列所組成的群組：介於約1：1至約 15：1、介於約2：1至約5：1、介於約3：1至約6：1、介於約3.5：1至約5：1、介於約5：1至約15：1、介於約5：1至約7：1、及介於約3.7：1至約4.3：1；(b)該效應基團：抗體之莫耳比在共軛反應開始時係介於一範圍，該範圍具有選自於由約1、約1.2、約1.4、約1.5、約1.6、約1.8、約2、約2.2、約2.4、約2.5、約2.6、約2.8、約3、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.8、約6、約6.2、約6.4、約6.5、約6.6、約6.8、約7、約7.3、約7.5、約7.7、約8、約8.5、約9、約9.5及約10比1所組成的群組之下限，及選自於由約1.5、約1.6、約1.8、約2、約2.2、約2.4、約2.5、約2.6、約2.8、約3、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.8、約6、約6.2、約6.4、約6.5、約6.6、約6.8、約7、約7.3、約7.5、約7.7、約8、約8.5、約9、約9.5、約10及約15比1所組成的群組之上限； (c)在該共軛反應開始之抗體濃度係選自於由介於約1至約100毫克/毫升、至少約5毫克/毫升、至少約10毫克/毫升、及約5至約50毫克/毫升所組成的群組；(d)該抗體在該效應基團/連接子與離去基團Z*共軛反應開始之濃度係一範圍，其中該範圍之下限係選自於由約5毫克/毫升、約6毫克/毫升、約7毫克/毫升、約8毫克/毫升、約9毫克/毫升、約10毫克/毫升、約15毫克/毫升、約20毫克/毫升、約30毫克/毫升及約40毫克/毫升所組成的群組，及該範圍之上限係選自於由約7毫克/毫升、約8毫克/毫升、約9毫克/毫升、約10毫克/毫升、約15毫克/毫升、約20毫克/毫升、約30毫克/毫升、約40毫克/毫升、約50毫克/毫升、約60毫克/毫升、約70毫克/毫升、約80毫克/毫升、約90毫克/毫升、約100毫克/毫升、約150毫克/毫升、約200毫克/毫升及約500毫克/毫升所組成的群組；(e)該反應係於介於約4℃至約40℃、或介於約4℃至約30℃、或介於約15℃至約25℃之溫度下進行；(f)該反應係於介於約6至約9或介於約6.5至約8之pH下進行；(g)該共軛反應發生在介於pH數值之範圍之間，該 範圍之下限係選自於由5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9及8所組成的群組，該範圍之上限係選自於由6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.5及9所組成的群組；(h)該抗體包含CLλ區，且該方法另包含以由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47所組成的群組中之任一者之至少殘基62至103或至少殘基1至106取代該CLλ區之對應部分(根據卡巴編號)之初始步驟；(i)該效應基團與蛋白質一起共軛之期間係選自於由至少約30分鐘、至少約60分鐘及至少約2小時所組成的群組；(j)該共軛反應的鹽濃度係選自於由介於約0至約0.1M、介於約0至約0.5M、介於約0至約0.3M、及低於約0.2M所組成的群組；(k)該共軛反應包含鹵化鹽，其鹵化物係選自於由F、Cl、Br及I所組成的群組，且其金屬係選自於由Li、Na、K、Be、Mg及Ca所組成的群組；(l)該共軛反應包含含有醋酸鈉及海藻糖之緩衝液；(m)在效應基團-連接子-Z*基團與抗體或彼之抗原 結合部分的共軛後，該反應隨意地利用琥珀酸鹽及甘胺酸緩衝液被淬熄。
  15. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之方法產製的MAC。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之組成物，其另具有下列之一或多者特性：(a)該組成物中與K188-CLκ共軛之效應基團的量係選自於由至少約50%、至少約60%、至少約70%、及至少約80%所組成的群組；(b)該抗體或彼之抗原結合部分包含與K188-CLκ共軛連接之效應基團的量係選自於由至少約50%、至少約60%至少約70%、及至少約80%所組成的群組；(c)不與該效應基團共軛的重鏈分子的量係選自於由至少約70%、至少約80%、及至少約90%所組成的群組；(d)該未經共軛之個別重鏈片段之量具有選自於由約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%及約80%所組成的群組之下限，及選自於由約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%所組成的群組之上限；(e)包含用於該效應基團之單一共軛部位的個別輕鏈片段之量係介於約25至95%； (f)每抗體或彼之抗原結合部分之共軛數係選自於由介於約0.5至約5、介於約0.5至約3、介於約0.5至約1.5、介於約1.5至約5.0、介於約1.5至約3.0、介於約1.5至約2.5、及介於約1.7至約2.3所組成的群組；(g)在該組成物中每抗體或彼之抗原結合部分之共軛數具有選自於由約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.55、約1.6、約1.65、約1.7、約1.75、約1.8、約1.85、約1.9、約1.95及約2所組成的群組之下限，及選自於由約1.6、約1.7、約1.75、約1.8、約1.85、約1.9、約1.95、約2.0、約2.05、約2.1、約2.15、約2.2、約2.25、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5及約5所組成的群組之上限。
  17. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第15至16項中任一項所述之組成物，且另包含可接受之載劑。
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