TWI422389B - 人類抗ｋｉｒ抗體 - Google Patents

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Mariella Della Chiesa
Pascale Andre
Laurent Gauthier
Francois Romagne
Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Ivan Svendsen
Stefan Zahn
Anders Svensson
Matthias Thorolfsson
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Novo Nordisk As
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Description

人類抗KIR抗體
本發明係關於人類抗體、以及其片段和衍生物，它們會與存在於NK細胞表面上的兩個或更多抑制性KIR受體交互反應及/或阻斷該受體，並且在哺乳動物個體或在生物樣本中造成NK細胞細胞毒性。本發明也關於製造此抗體、片段、變異體、以及衍生物的方法；包含上述物質的醫藥組成物；以及這些分子和組成物的用途，尤其是用於治療，以增加個體中NK細胞活性或細胞毒性。
自然殺手(NK)細胞是淋巴細胞的亞群，牽涉到免疫以及宿主免疫監督系統。
NK細胞是來自淋巴原始細胞在骨髓中發育的單核細胞，其型態學特徵以及生物性質典型的包括群集決定基(cluster determinant；CD)CD16、CD56、及/或CD57的表現；細胞表面缺乏阿法/貝塔或加瑪/德耳他TCR複合物；可以結合至無法表現「自我」主要組織適應性複合物(MHC)/人類白血球抗原(HLA)蛋白質的標的細胞並且殺死之；以及可以殺死表現用以活化NK受體之配體的腫瘤細胞或其他不健全的細胞。NK細胞的特徵在於它不需要先行免疫或活化就可以結合並且殺死一些種類的腫瘤細胞系。NK細胞也可以釋放對免疫系統有調節作用的可溶性蛋白質以及細胞激素；以及可以經歷多次的細胞分裂並產生與親代細胞具有相似生物性質的子細胞。一旦受到干擾素及/或細胞激素的活化，NK細胞藉由NK細胞和標的細胞直接、物理性接觸的機制調控腫瘤細胞以及受細胞內病原體感染之細胞的溶解作用。標的細胞的溶解作用牽涉到細胞毒性粒子從NK細胞釋放到所結合之標的的表面，以及牽涉到作用蛋白(諸如穿孔素(perforin)以及顆粒酶B(granzyme B))穿透標的細胞膜並誘發細胞凋亡或計劃性細胞死亡。通常，健康的細胞會被保護以避免受到NK細胞的溶解。
根據它們的生物性質，技藝中已提出各種依賴NK細胞調節作用的醫療以及疫苗對策。然而，NK細胞的活性是受涉及刺激以及抑制兩者訊號的複合物機制所控制的。
簡單來說，NK細胞的溶解作用活性是受到各種細胞表面受體所控制，當與標的細胞上的配體交互反應時，該受體會轉換陽性或陰性的細胞內訊號。經由這些受體所傳送的陽性以及陰性訊號之間的平衡決定了標的細胞是否該被NK細胞溶解(殺死)。NK細胞刺激性訊號可以被自然細胞毒性受體(NCR)諸如NKp30、NKp44、以及NKp46所調控；還有被NKG2C受體、NKG2D受體、一些活化殺手類Ig受體(KIR)、以及其他活化NK受體(Lanier,Annual Review of Immunology 2005；23：225-74)所調控。NK細胞抑制性訊號可以被像是Ly49、CD94/NKG2A的受體以及一些抑制性KIR所調控，其辨識主要組織適應性複合物(MHC)第一型分子(Krre等人，Nature 1986；319：675-8；hln等人，Science 1989；246：666-8)。這些抑制性受體結合至存在於其他細胞的MHC第一型分子(包括HLA第一型)多型性決定基以及抑制NK細胞調控的溶解作用。
KIR有時也被稱為殺手抑制性受體，已在人類以及非人類的靈長動物中被描繪其特徵，並且是存在於一些淋巴細胞(包括NK細胞以及一些T細胞)亞群的多型性第1型穿膜分子。KIR與MHC第一型分子的阿法1以及2功能部位的決定基交互反應，如上所述，不同的KIR是NK細胞的刺激因子或抑制因子。
KIR的命名是根據細胞外功能部位(KIR2D以及KIR3D分別具有兩個以及三個細胞外Ig-功能部位)的數目以及細胞質中的尾端是否是長的(KIR2DL或KIR3DL)或短的(KIR2DS或KIR3DS)。單一個體中NK族群內特定KIR的存在或缺乏會因NK細胞而異。在人類，也有相當高度的KIR基因多型性，一些KIR基因存在於一些但不是全部的個體中。NK細胞上KIR等位基因的表現是受到隨機的調控，意思是在一特定的個體中，特定淋巴細胞可表現一、二、或更多不同的KIR，取決於個體的基因型。單一個體的NK細胞典型的表現不同的KIR組合，提供一個具有對MHC第一型分子的不同專一性的NK細胞庫。
當結合至一適當的配體時，一些KIR基因產物會造成淋巴細胞活性的刺激。用於活化的KIR都具有一個短的細胞質中的尾端，該尾端具有一與接頭(adapter)分子結合的帶電荷穿膜殘基，該接頭分子具有免疫受體酪胺酸為基的活化主體結構(ITAM)，其轉換刺激訊號到NK細胞。相反的，當與其MHC第一型配體遭遇時，用於抑制的KIR具有長的細胞質中的尾端，該尾端含有免疫受體酪胺酸為基的抑制主體結構(ITIM)，轉換抑制訊號至NK細胞。已知的抑制性KIR包括KIR2DL以及KIR3DL亞家族成員。具有兩個Ig功能部位(KIR2DL)的抑制性KIR辨認HLA-C同種異型(allotype)：KIR2DL2(以前被稱為p58.2)以及密切相關的等位基因產物KIR2DL3，都被稱為「第1群」HLA-C同種異型(包括HLA-Cw1、-3、-7、以及-8)，而KIR2DL1(p58.1)辨認「第2群」HLA-C同種異型(諸如HLA-Cw2、-4、-5、以及-6)。KIR2DL1的辨識作用是受到存在於HLA-C等位基因位置80的Lys殘基所指揮。KIR2DL2以及KIR2DL3的辨識作用是受到存在於HLA-C位置80的Asn殘基所指揮。重要的，大部分HLA-C等位基因在位置80具有Asn或Lys殘基。所以，KIR2DL1、-2、以及-3合在一起可辨認幾乎所有人類的HLA-C同種異型。一個具有三個Ig功能部位的KIR，KIR3DL1(p70)，可辨認由HLA-Bw4等位基因所分享的抗原決定基。最後，一種具有三個Ig功能部位的同質二聚體分子KIR3DL2(p140)辨認HLA-A3以及-A11。
雖然多重抑制性KIR及/或其他MHC第一型專一性抑制性受體(Moretta等人，Eur J Immunogenet. 1997；24(6)：455-68；Valiante等人，Immunol Rev 1997；155：155-64；Lanier，Annu Rev Immunol 1998；16：359-93)可以被NK細胞共表現，但在任何特定個體的NK庫中，有細胞只表現單一的KIR，所以只被特定MHC第一型等位基因(或屬於同一群之MHC第一型同種異型等位基因)抑制。人類MHC第一型分子常稱為人類組織相容性抗原(HLA)第一型。
與其標的KIR-配體錯誤配對的(即表現了不會辨認任何宿主HLA分子的KIR)NK細胞族群或選殖株已被顯示在同種異體骨髓移植的白血病病患中可調控有效的、救命的抗腫瘤反應(Ruggeri等人，Science 2002，295：2097-2100)。背後的機制被認為是HLA錯誤配對的造血移植造成源自捐贈者的NK細胞的擴大，該NK細胞在受贈者中表現不會辨認任何的HLA配體的KIR，因此不會經由KIR所抑制。這些同種異體的NK選殖株具有有效的抗腫瘤活性。在診斷有急性骨髓性白血病(AML)以及受KIR-MHC錯誤配對之單倍型相同(haplo-identical)移植治療的病人中，這個反應是非常強的。利用藥理學治療患者以重現這個影響的一個方法是施用阻斷KIR/HLA交互反應的藥劑以活化患者的內生NK細胞。
一些對KIR2DL1專一的單株抗體已被顯示來阻斷KIR2DL1與「第2群」HLA-C同種異型諸如HLA-Cw4(Moretta等人，J Exp Med 1993；178：597-604)的交互反應，以及增進NK-調控的表現那些HLA-C同種異型之標的細胞的溶解。阻斷KIR2DL2/3與HLA-Cw3或相似之同種異型之交互反應的KIR2DL2/3的單株抗體也已被描述(Moretta等人，J Exp Med 1993；178：597-604)。此抗體並不適合用於臨床，因為必需開發兩種治療上的單株抗體(mAbs)以及施用這兩抗體或選擇這些抗體之一(在適當的診斷之後)以治療所有潛在患者，取決於任何特定患者是否表現第1群或第2群HLA-C同種異型。
Watzl等人(Tissue Antigens 2000；56：240-247)製造了交互反應的鼠類抗體，該抗體辨認多種KIR的同種型(isotype)，但那些抗體並不造成NK細胞的溶解活性。此外，Spaggiari等人(Blood 2002；99：1706-1714以及Blood 2002；100：4098-4107)進行實驗，利用各種鼠類單株抗體對抗各種KIRs。那些抗體之一，NKVSF1(也稱為Pan2D)，被報導可辨認一KIR2DL1(CD158a)、KIR2DL2(CD158b)以及KIR2DS4(p50.3)常見的抗原決定基。Shin等人(Hybridoma 1999；18：521-7)也報導生產兩個單株抗體，稱為A210以及A803g，能夠結合至所有的KIR2DL1、KIR2DL3、以及KIR2DS4。然而，抗體於治療上的用途以阻斷患者NK細胞的抑制性KIR時，抗體與越少的活化KIR分子交互反應越好，因為活化受體的阻斷會減弱NK細胞的刺激作用。因此，具有NKVSF1、A210、或A803g抗原結合特性的抗體不會是臨床上最理想的。此外，使用鼠類單株抗體來治療人類患者可能會導致對抗該抗體的宿主免疫反應抗體，因而損及治療的效果。
所以，技藝中仍未存在有治療上可調節抑制性KIR的實用以及有效的方法。
發明簡述
本發明提出新穎及有用的人類抗體，其可專一性的結合至KIR2DL1以及至少KIR2DL2以及KIR2DL3之一、或結合至所有這三種KIR，及/或藉由阻斷一或更多此KIR以及HLA-C之間的交互反應以誘發NK-cell溶解活性的人類抗體。也提供此抗體的片段以及衍生物。本發明也關於新穎及有用的抗體、抗體片段、以及抗體衍生物，其包含實質上與那些本文所述的人類抗體1-7F9以及1-4F1相同的VH以及VL序列，如此處所述。本發明也提供包含編碼有此抗體之核苷酸序列的核酸；包含此核酸的載體；包含此核酸及/或載體的宿主細胞以及生物；和組成物，諸如醫藥上可接受的組成物以及套組，其包含此蛋白質、核酸、載體、及/或細胞以及典型的一或更多額外成分，該成分可以是促進組成物配製、遞送、安定性、或其他性質的活性成分或非活性成分(例如各種載劑)。本發明進一步提供各種製造以及使用此抗體、核酸、載體、細胞、生物、及/或組成物之新且有用的方法，諸如調節KIR調控的生物活性，例如其相關的疾病治療。
在一方面，本發明提供一種人類或人化抗體，其可以結合至KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3每一者，但不結合至KIR2DS4。在一具體實例中，該抗體進一步不會結合至KIR2DS3。在另一個具體實例中，該人類或人化抗體阻斷至少KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3之一與HLA-C第一型分子的結合。在進一步具體實例中，抗體可阻斷HLA-Cw4分子結合至KIR2DL1、以及阻斷HLA-Cw3分子結合至至少KIR2DL2或KIR2DL3之一。例如，該抗體可阻斷HLA-Cw4分子結合至KIR2DL1細胞外部分(SEQ ID NO：23)的殘基M44、F45以及D72。在另一具體實例中，該抗體對於表現HLA-C第一型分子的人類標的細胞誘發NK細胞的溶解活性。
在另一方面，本發明提供人類或人化抗體，其會與包括包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的輕鏈可變區域以及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈可變區域的抗體競爭結合至KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3至少之一。在一具體實例中，該抗體與包括包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之輕鏈可變區域以及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之重鏈可變區域的抗體競爭結合至KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3每一者。在另一具體實例中，該抗體含有一輕鏈可變區域，該區域包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗體包含(a)對應至SEQ ID NO：17殘基31-35的重鏈CDR1胺基酸序列；(b)對應至SEQ ID NO：17殘基50-65之重鏈CDR2胺基酸序列；以及(c)對應至SEQ ID NO：17殘基99-112的重鏈CDR3胺基酸序列。例如，該抗體可包含一重鏈可變區域，該區域包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列。
在另一其他方面，本發明提供一種經分離的人類或人化抗體，其結合至實質上包含胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、與Y88的KIR2DL1抗原決定基。
在另一方面，本發明提供一種經分離的人類或人化抗體，其具有對KIR2DL1的解離常數(Kd)不大於約0.45 nM及/或對KIR2DL3的Kd不大於約0.025 nM。
本發明也提供一種人類或人化抗體或抗體片段、或其衍生物，其單獨或在任何合適的組合中具有任何上述性質。在一具體實例中，該抗體是單株抗體。在另一具體實例中，該抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體。例如，該抗體可以是IgG4抗體。
本發明也提供一種編碼有具有任何上述性質之該人類或人化抗體或抗體片段的核酸，包含此核酸的載體、包含此載體的細胞、以及製造人類抗KIR抗體的方法，該方法包含於適合表現該抗KIR抗體的條件下培養此細胞。
本發明也提供一種醫藥組成物，其包含有效量可誘發患者的NK細胞細胞毒性之具有一或更多前述性質或以任何方法產生的人類或人化抗體或抗體片段，以及醫藥上可接受的載劑或賦形劑。組成物可以(例如)包含聚山梨糖醇酯80、蔗糖、或聚山梨糖醇酯80以及蔗糖兩者。
本發明也提供一種在需要NK細胞活性的個體中誘發NK細胞活性的方法，該方法包含給藥給該個體有效量的任何前述組成物。在一具體實例中，該個體是患有癌症的患者。例如，該患者可以是患有選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、以及非霍奇金氏淋巴瘤的癌症。或者，患者可以是患有選自結腸直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、以及惡性黑色素瘤的癌症。在另一具體實例中，該個體是患有傳染性疾病的患者。在另一具體實例中，該方法進一步包含給藥以治療上的藥劑，該藥劑選自免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結合至抑制性KIR的第二抗體、抗傳染藥劑、標的藥劑、以及附屬化合物。
應了解，本發明所「提供的」抗體或本發明「相關的」抗體等描述也暗示意指可用於實施本文所述之本發明方法的抗體，除非另有說明或與本文明確違背。
這些以及本發明其他方面以及特徵係於下面進一步詳細說明。
定義
為了方便起見，在此定義一些術語。然而，此處所定義的術語並非排外的。其他術語可以由整篇本發明的描述所定義。
在本發明的內文中「活性」NK細胞是指生物活性的NK細胞，包括能夠溶解標的細胞或增進其他細胞之免疫功能的NK細胞。例如，「活性」NK細胞可以殺死表現活化NK受體之配體的細胞及/或無法表現由NK細胞上之KIR所辨識的MHC/HLA抗原的細胞。NK細胞可由技藝中已知的各種方法所得到，諸如從血液樣本、血球分離、組織或細胞收集等等中分離出。涉及NK細胞之分析的有用實驗操作可以在Natural killer Cells Protocols(由Campbell KS以及Colonna M所編輯)中找到。Human Press. pp. 219-238(2000)。
這裡所用的「殺手類Ig受體」、「殺手抑制性受體」、或「KIR」是指由KIR基因家族成員的基因或由此基因所製備之cDNA所編碼的蛋白質或多肽。KIR基因家族詳細的回顧，包括KIR基因的命名和KIR基因產物、以及例示之KIR的Genbank編號在M. Carrington以及P. Norman的「The KIR Gene Cluster」中，可自NCBI名為「Bookshelf」的網頁取得(可由www.ncbi.nlm.nih.gov/books取得)。人類KIR基因以及cDNA的序列、還有其蛋白質產物都可在公開的資料庫中取得，包括GenBank。非限制用的例示之GenBank中人類KIR具有下述編號：KIR2DL1：Genbank編號U24076、NM_014218、AAR16197、或L41267；KIR2DL2：Genbank編號U24075或L76669；KIR2DL3：Genbank編號U24074或L41268；KIR2DL4：Genbank編號X97229；KIR2DS1：Genbank編號X89892；KIR2DS2：Genbank編號L76667；KIR2DS3：Genbank編號NM_012312或L76670(剪接變異體)；KIR3DL1：Genbank編號L41269；以及KIR2DS4：Genbank編號AAR26325。KIR可以包含自1至3個細胞外功能部位，且可以具有長(即多於40個胺基酸)或短(即少於40個胺基酸)的細胞質中的尾端。如前面所述，這些特徵決定了KIR的命名。例示的KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、以及KIR2DS4分子分別包含下面的胺基酸序列：
KIR2DL1細胞外功能部位：
HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ ID NO：23)，其中位置16的「X」是P或R，且其中位置114的「X」是P或L，代表等位變異體。
KIR2DL2細胞外功能部位：
HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ ID NO：24)
KIR2DL3細胞外功能部位：
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH(SEQ ID NO：25)
KIR2DS4細胞外功能部位：
QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIGEHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV(SEQ ID NO：38)
術語「KIR2DL2/3」係指KIR2DL2及KIR2DL3受體之一或兩者。這兩個受體具有非常高的相似性，它們是相同基因的等位形式，且在技藝中被認為是功能上相似的。
除非另有說明，否則術語「MHC」涵蓋所有哺乳動物的MHC分子，而「HLA」分子係指人類MHC分子。
在本發明的文中，說一抗體「結合」一決定基(即用語「結合」在抗體：決定基交互反應的上下文中)係指抗體結合至決定基有專一性及/或親和性。例如，GL183是習知結合至KIR2DL2/3的單株抗體。EB6是習知結合至KIR2DL1的單株抗體。EB6以及GL183兩者是商業上可獲得的(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,CA)。
「交互反應」的抗KIR抗體是與多於一個KIR分子有專一性及/或親和性結合的抗體。例如，DF200以及1-7F9是與KIR2DL1、-2、以及-3交互反應的單株抗體。生產抗體DF200的融合瘤已存於CNCM培養收集中心，辨識編號為「DF200」，註冊號碼為CNCM I-3224，於2004年六月10日註冊，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25,Rue du Docteur Roux,F-75724 Paris Cedex 15,法國。NKVSF1在本文也稱為「Pan2D」與KIR2DL1、-2、以及-3和KIR2DS4交互反應。此抗體可自Serotec(Cergy Sainte-Christophe，法國)獲得的，產品編號MCA2243。
「專一結合」或「專一性」係指一抗體或其他試劑與存在於抗原(諸如KIR)上的抗原決定基結合的可測得的能力，但是與其他蛋白質或結構(諸如存在於NK細胞、或其他細胞種類上的其他蛋白質)有相當低的可測得的活性。專一性可以相對性的藉由結合或競爭結合試驗決定，使用(例如)Biacore儀器，如本文別處所述。專一性可以表示為結合至專一抗原對非專一結合至其他不相關分子(例如)約10：1、約20：1、約50：1、約100：1、10.000：1或更大的親和性/親合力比例，在這個例子中，專一抗原是KIR。結合KIR的抗體對存在於特定生物(諸如人類)之NK細胞上的KIR有專一性，該抗體有時也可與其他物種相似的KIR結合(即結合KIR的抗體或其他結合KIR的試劑可與多物種的KIR交互反應)。
「選擇性」係指蛋白質優先結合至特定區域、標的、或胜肽，相對於一或更多其他生物分子、結構、細胞、組織等等。結合KIR的抗體也可以對特定生物(例如人類相對於靈長類)所產生的KIR、及/或對特定種類的KIR(例如具有長細胞質中的尾端的KIR)有選擇性，尤其是當該抗體與特定生物所產生的多於一種的KIR、及/或與KIR的特定部位(諸如特定的抗原決定基或抗原決定基區域)交互反應。例如，選擇性可以由競爭ELISA或Biacore分析決定。標示選擇性的親和性/親合力的差異可以是任何可測得的偏好(例如，若可測得的話，大於1：1.1、或大於約1：5的比例會是合適的，包括1：10、1：100、1：1000或更大)。除非另有說明，否則任何本文「親和性」計量的數據係指測量二價(而不是一價)結合。
「抗原決定基」或「結合區」是抗原上結合抗原的胜肽(諸如抗體)專一結合的地方或區域。蛋白質抗原決定基可包含直接涉及結合(也稱為抗原決定基的免疫優勢組成)的胺基酸殘基以及其他沒有直接涉及結合的胺基酸殘基，諸如被專一性抗原結合胜肽有效阻斷的胺基酸殘基(換句話說，該胺基酸殘基是在專一性抗原結合胜肽的「足跡(footprint)」中)。本文的術語抗原決定基包括KIR任何特定區域中的兩種類的胺基酸結合區，該結合區專一的結合至抗KIR抗體、或根據本發明的另一個KIR專一性的試劑，除非另有說明(例如，在本發明的一些上下文中係關於直接結合至特定胺基酸殘基的抗體)。KIR可包含一些不同的抗原決定基，可包括(不限於)(1)線性胜肽抗原決定基；(2)構形抗原決定基，其在成熟的KIR構形中由一或更多位置彼此相近之非連續的胺基酸所組成；以及(3)後轉譯抗原決定基，其由全部或部分之共價結合至KIR的分子結構，諸如碳水化合物基團所組成。
第一抗體與第二抗體結合至「實質上」或「至少部分」相同的抗原決定基是指抗原上第一抗體的抗原決定基結合區包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更多胺基酸殘基組成第二抗體的抗原決定基結合區。還有，第一抗體與第二抗體結合至實質上或部分相同的抗原決定基是指第一和第二抗體競爭結合至抗原，如上所述。因此，與單株抗體1-7F9「結合至實質上相同的抗原決定基或決定基」是指抗體與1-7F9「競爭」。通常，抗體與感興趣的單株抗體(例如DF200、NKVSF1、1-7F9)「結合至實質上相同的抗原決定基或決定基」是指抗體與該感興趣的抗體「競爭」結合至一或更多的KIR分子，較佳的是選自由KIR2DL1及KIR2DL2/3所組成之群組的KIR分子。在其他例子中，與感興趣的抗體結合至KIR2DL1分子上實質上相同的抗原決定基或決定基的抗體是與感興趣的抗體「競爭」結合至KIR2DL1。與感興趣的抗體結合至KIR2DL2/3分子上實質上相同的抗原決定基或決定基的抗體是與感興趣的抗體「競爭」結合至KIR2DL2/3。
與感興趣的抗體「結合至基本上相同的抗原決定基或決定基」是指抗體與感興趣的抗體「競爭」至少一、或任何以及所有感興趣的抗體專一性結合的KIR分子。與單株抗體1-7F9「結合至基本上相同的抗原決定基或決定基」是指抗體與1-7F9「競爭」至少一個(較佳的為任何以及所有的)1-7F9專一性結合的KIR分子。例如，與單株抗體1-7F9或NKVSF1結合至基本上相同的抗原決定基或決定基的抗體可分別與該1-7F9或NKVSF1「競爭」結合至KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DS1以及KIR2DS2。
抗KIR抗體「阻斷」KIR分子以及HLA分子結合的能力是指抗體在使用可溶性或細胞表面連結的KIR及HLA分子的分析中可以可測得的減少KIR分子結合到HLA分子(是以劑量依賴的方式)，其中缺乏抗體下KIR分子可測得的結合至HLA分子。實施例8提供一個例示的分析，用以決定抗KIR抗體是否能夠有此阻斷的能力。
抗KIR抗體「減少KIR的抑制活性」、「促進NK細胞活性」、「促進NK細胞的細胞毒性」、「促進NK細胞」、「誘發NK細胞活性」、「誘發NK細胞的細胞毒性」、或「誘發NK細胞」的能力是指當與抗體接觸時，表現KIR的NK細胞能夠溶解標的細胞，該標的細胞係在其表面表現出該KIR配體的特定MHC或HLA第一型。例如，「誘發NK細胞毒性」是指任何實質上的誘發，或至少5%、10%、20%、30%或更強的誘發NK細胞毒性，例如至少約50%的誘發NK細胞毒性，例如與控制組相比至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%。這包括與控制組相比(例如)約55-100%、約65-100%、約75-100%、約80-100%、或約90-100%誘發NIK細胞的細胞毒性。也包括增加細胞毒性為大於約100%、大於約500%、大於約1000%、大於約2000%、或更高。這可以由(例如)分析而測得，諸如標準細胞毒性分析，其中較高的數值相當於在NK誘發因子(諸如抗KIR mAb)存在下比缺乏誘發因子(即控制組)有較高百分比的標的細胞被NK細胞溶解掉。
本文所說「中和NK細胞之細胞毒性的KIR調控的抑制作用」或「中和KIR的抑制活性」是指增加專一性溶解至大於約20%，較佳的至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約100%、或更大的專一性溶解的能力，其是在有未被其KIR阻斷的NK細胞或NK細胞系、在相同的作用因子：標的細胞比例下獲得的，如細胞毒性之典型的鉻釋放測試所測得的。「中和KIR調控的抑制作用」也可以是指在鉻釋放分析或其他細胞毒性分析中，使用表現一或一些抑制性KIR的NK細胞選殖株或轉染株以及表現至少一個HLA第一型等位基因的標的細胞，該HLA第一型等位基因是由NK細胞上的其中一個KIR所辨識的，由抗體所得到的專一性溶解作用是大於約100%，較佳的至少約101%、至少約150%、至少約200%、或更多(例如約101-150%、約120-150%、約120-200%、約150-200%、或約200-1000%)、或更多由相同濃度的NKVSF1(可自Serotec購得)所得到的專一性溶解，使用相同的NK細胞以及標的細胞，相同的作用因子：標的細胞比例。
本文所用的術語「人類抗體」是指包括具有一致(基本上一致)或源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變以及固定區域的抗體。此人類抗體可包括不是由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如由試管內隨機或區域專一性突變作用或或體內體細胞突變所置入的突變)。然而，本文所用的術語「人類抗體」不包括源自另一個哺乳動物物種(諸如鼠)生殖系之CDR序列已被嫁接到人類框架序列上的抗體。
在本發明的上下文中，除非另外有說明，除非與內文矛盾，否則「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指防止、減輕、控制、治癒或降低疾病或失調的一或更多症狀或臨床相關表徵。例如，「治療」一沒有被驗出有疾病或失調的症狀或臨床相關表徵的患者，為預防治療，而「治療」一已被驗出有疾病或失調的症狀或臨床相關表徵的患者，通常不構成預防治療。然而，應了解本發明的各種治療及預防的方法和使用面都在許多方面彼此不同(例如遞送到個體的化合物劑量、施用的時間、施用的推動力等等)且各自可視為本發明的一個獨特面。
本發明文中的「癌症」係指任何腫瘤疾病，包括(但不限於)細胞失調如肉瘤、癌、黑色素瘤、白血病、以及淋巴瘤，可包括胸部、頭部以及頸部、卵巢、膀胱、肺部、咽頭、喉頭、食道、胃部、小腸、肝、胰臟、結腸、女性生殖道、男性生殖道、前列腺、腎臟以及中央神經系統的癌症。
本文所用的術語「生物樣本」包括(但不限於)源自人類或非人類之哺乳動物的生物液體(例如血清、淋巴液、以及血液)、細胞樣本或組織樣本(例如骨髓或腫瘤組織)。
在兩個胺基酸序列上下文中的術語「實質上一致」是指序列在最適排列時(例如經由GAP或BESTFIT程式，使用預設的缺口重要性評量(gap weight))有至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約95、至少約98、或至少約99百分比的序列一致性。在一具體實例中，不一致的殘基位置與保守性胺基酸取代不同(於本文別處進一步描述)。序列一致性典型的是以序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用相似性的測量來配對相似的序列，該相似性的測量是派定給各種取代、刪除以及其他修飾，包括保守性胺基酸的取代。例如，公眾可得的GCG軟體含有諸如「Gap」以及「BestFit」程式，可以預設參數用於決定相當相關之多肽之間的序列同源性或序列一致性，諸如來自不同生物物種的同源多肽或野生種類蛋白質及其突變之間。參見例如GCG第6.1版。多肽序列也可以用FASTA來進行比較，使用預設的或建議的參數。在GCG第6.1版的程式FASTA(例如FASTA2以及FASTA3)提供所詢問以及搜尋之序列之間最佳重疊區域的排列以及序列一致性百分比(Pearson，Methods Enzymol. 1990；183：63-98；Pearson，Methods Mol. Biol. 2000；132：185-219)。當比較一序列與含有來自各種生物的大量序列之資料庫時，另一個較佳的演算系統是電腦程式BLAST，尤其是blastp，使用預設參數。參見(例如)Altschul等人，J. Mol. Biol. 1990；215：403-410；Altschul等人，Nucleic Acids Res. 1997；25：3389-402(1997)；各自併入本文作為參考。兩個實質上一致的胺基酸序列中「相應的」胺基酸位置是指由任何上述蛋白質分析軟體使用預設參數所排列的位置。
本文所說的「類1-7F9」或「類1-4F1」抗體是指(1)與分別包含1-7F9或1-4F1之VH以及VL序列的抗體(諸如(例如)分別為單株抗體1-7F9或1-4F1)實質上結合到相同抗原決定基的抗體，及/或(2)包含分別與1-7F9或1-4F1之VH以及VL序列一致或實質上一致之VH及VL序列的抗體。
「保守性」胺基酸取代是指一胺基酸殘基被另一個具有相似化學性質(例如帶電性或疏水性)的支鏈(「R-基團」)的胺基酸殘基所取代。通常，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能性質。當胺基酸序列彼此相異處為保守性取代時，序列一致性的百分比可以向上調整以修正該取代基的保守性本質。進行此修正的方法是習於此項技藝者所熟知的。參見(例如)Pearson，Methods Mol. Biol. 1994；243：307-31。具有相似化學性質支鏈的胺基酸族群的例子包括1)脂肪族支鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、以及異白胺酸；2)脂肪族-羥基支鏈：絲胺酸以及羥丁胺酸；3)含醯胺支鏈：天門冬醯胺酸以及麩醯胺酸；4)芳香族支鏈：苯丙胺酸、酪胺酸、以及色胺酸；5)鹼性支鏈：離胺酸、精胺酸、以及組胺酸；6)酸性支鏈：天門冬胺酸以及麩胺酸；以及7)含硫支鏈：半胱胺酸以及甲硫胺酸。例示的保守性胺基酸取代基包括：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸、以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。
發明詳述
本發明係基於產生新穎的交互反應及中和抗體，該抗體結合至抑制性KIR，使人類族群大多數或全部個體的NK細胞有效活化。
本文所描述的是(例如)抗體結合至所有的KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3並且藉由阻斷這些KIR與HLA-C之間的交互反應來誘發NK細胞的溶解活性。此抗體在本文中稱為「交互反應以及中和抗KIR mAb」。
在一特定方面，本發明係關於新穎的交互反應、中和、或交互反應及中和兩者、全人類抗KIR抗體、以及包含此抗體的組成物和使用此抗體或組成物之方法。這些抗體包括人類抗體1-7F9以及1-4F1，其係描述在PCT/DK2004/000470中，於2004年7月1日申請，全文併入本文作為參考。
本文所描述的抗體、組成物、以及方法可以(除此之外)解決當前與KIR之治療上調節和與醫療性NK細胞活化相關的限制、並且提供額外優勢特徵及好處。例如，該抗體可以與多個抑制性KIR交互反應以及減少或中和其抑制訊號，而藉由表現此抑制性KIR受體的NK細胞使得NK細胞之細胞毒性誘發。與多個KIR基因產物交互反應的能力使本發明的抗體可有效的被用於大多數或所有人類個體來增加NK細胞活性，而不需要有預先決定個體KIR或HLA種類的負擔或支出。在一具體實例中，抗體不會結合KIR2DS4，因此避免了刺激潛力的減少，該潛力是與活化KIR2DS4受體中和作用有關。額外的或二者擇一的，該抗體不與KIR2DS3結合。
從這些抗體，各種抗體片段及衍生物可被產生和被使用於本發明所述抗體之相同或相似的目的，且本發明相關於抗體的方面也同樣適用於抗體片段以及衍生物，除非另有說明或明顯與上下文相違背。換句話說，本文相關於抗體所描述之本發明特徵(除非另有指明)也隱含描述(以專一性的觀點)具有相似功能之抗體片段或衍生物之相似特徵，然而，有鑑於其生物以及物化性質可能有相當大的差異，應理解「全長」抗體以及抗體「片段」可被視為本發明的不同方面。
有些本發明的抗體具有「人類」的特徵，被給藥之人類個體典型的對於該抗體具有較低的免疫反應風險。在一例示的方面，在幾乎所有人類中促進人類NK細胞活化的一種經分離的抗體被描述。在一例示的具體實例中，該抗體是人類抗體1-7F9或人類類1-7F9抗體。
抗體、片段、或其一的衍生物可與NK細胞表面至少兩個抑制性KIR受體交互反應，減少或中和NK細胞的抑制訊號，以及誘發NK細胞活性。例如，抗體、抗體片段、或衍生物可與人類KIR2DL受體的常見決定基結合，使抗體、抗體片段、或衍生物與至少KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3受體結合。為了本發明的目的，術語「KIR2DL2/3」係指KIR2DL2以及KIR2DL3受體之一或兩者。
如本文所述，抗KIR mAb 1-7F9以及1-4F1比先前生產的抗KIR抗體有一些優點。例如，1-7F9及1-4F1是完全人類的，因此當一旦施用至個體中可減少或減低任何對抗該抗體的免疫反應。此外，1-7F9以及1-4F1兩者如下所述是治療性抗KIR抗體(分別為IgG4及IgG2)合適的同型(isotype)。比起鼠類mAbs EB6、GL183、DF200、以及NKVSF1(Pan2D)，1-7F9也更能有效的誘導藉由表現KIR2DL1、-2、及/或-3的NK細胞之毒殺作用。例如圖5及6所示，1-7F9比EB6、DF200或NKVSF1(Pan2D)誘導更大量的專一性溶解，該專一性溶解係藉由表現KIR2DL1的NK細胞對表現HLA-Cw4之標的細胞的專一性溶解。1-7F9比已知的抗KIR mAb進一步對KIR具有較高的親和性。例如，1-7F9結合至KIR2DL1以及KIR2DL3的解離常數(Kd)分別為為0.43 nM以及0.025 nM，表示比(例如)DF200(參見實施例3及8)對兩抗原有更高的親和性。與鼠類抗體NKVSF1(Pan2D)、A210、以及A208g相反，1-7F9和1-4F1都不會結合至KIR2DS4，使其較適合於治療上的目的。就像NKVSF1(Pan2D)以及DF200，1-7F9和1-4F1也結合至KIR2DS1及KIR2DS2，但KIR2DS1以及KIR2DS2不被認為在抗白血病的功效上是重要的。因此，根據本發明之特定抗體具有與1-7F9及/或1-4F1相同或相似的抗原專一性。例如，包含與1-7F9相同或相似VH以及VL區域的抗體可以與1-7F9具有相同或相似的抗原結合及/或NK刺激性質；以及包含與1-4F1相同或相似VH以及VL區域的抗體可以與1-4F1具有相同或相似的抗原結合性質。
如圖14所示，1-7F9之VL以及VH區域的胺基酸序列已被決定：
1-7F9VL區域(SEQ ID NO：15)：
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT
1-7F9 VH區域(SEQ ID NO：17)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS
1-4F1 VL以及VH區域的胺基酸序列分別提供在SEQ ID NO：39以及41，且編碼有1-4F1 VL以及VH區域的核苷酸序列分別提供在SEQ ID NO：40以及42。在一特定的具體實例中，SEQ ID NO：39的殘基3、4、9、24、32、41、47、50、55、71、以及74分別是Q、L、S、R、A、G、L、D、E、F、以及A。在另一個特定的具體實例中，SEQ ID NO：39的殘基3、4、9、24、32、41、47、50、55、71、以及74分別是R、M、F、W、Y、A、F、Y、Q、Y、以及T。
如圖15所示，1-7F9 CDR的胺基酸序列被鑑認為如下：輕鏈CDR1胺基酸序列相當於SEQ ID NO：15的殘基24-34；輕鏈CDR2的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：15的殘基50-56；輕鏈CDR3的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：15的殘基89-97；重鏈CDR1的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：17的殘基31-35；重鏈CDR2的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：17的殘基50-65；以及重鏈CDR3的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：17的殘基99-112。1-4F1 CDR的胺基酸序列被鑑認為如下：輕鏈CDR1的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：39的殘基24-34；輕鏈CDR2的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：39的殘基50-56；輕鏈CDR3的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：39的殘基89-97；重鏈CDR1的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：41的殘基31-35；重鏈CDR2的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：41的殘基50-66；以及重鏈CDR3的胺基酸序列相當於SEQ ID NO：41的殘基99-113。
整個1-7F9輕鏈及重鏈的胺基酸序列分別提供在SEQ ID NO：36以及37。
所以，例如各種人類抗體亞群的其他抗體；抗體片段、抗體衍生物、以及其他結合KIR的胜肽都可以根據這些資訊而容易的藉由(例如)重組技術產生。例如，在一方面，本發明提供具有基本上分別由SEQ ID NO：15以及SEQ ID NO：17所組成的VL及VH序列之抗體，及/或具有基本上分別由SEQ ID NO：39以及SEQ ID NO：41所組成的VL及VH序列的抗體。在另一個方面，本發明提供包含基本上由上述1-7F9或1-4F1 VH CDR1-3以及VL CDR1-3所組成的CDR區域之抗體。在另一個方面，本發明提供包含如下列CDR區域的抗體：輕鏈CDR1胺基酸序列相應於SEQ ID NO：15的約殘基24-34；輕鏈CDR2胺基酸序列相應於SEQ ID NO：15的約殘基50-56；輕鏈CDR3胺基酸序列相應於SEQ ID NO：15的約殘基89-97；重鏈CDR1胺基酸序列相應於SEQ ID NO：17的約殘基31-35；重鏈CDR2胺基酸序列相應於SEQ ID NO：17的約殘基50-65；以及重鏈CDR3胺基酸序列相應於SEQ ID NO：17的約殘基99-112。在另一個方面，本發明提供包含如下列CDR區域的抗體：輕鏈CDR1胺基酸序列相應於SEQ ID NO：39的約殘基24-34；輕鏈CDR2胺基酸序列相應於SEQ ID NO：39的約殘基50-56；輕鏈CDR3胺基酸序列相應於SEQ ID NO：39的約殘基89-97；重鏈CDR1胺基酸序列相應於SEQ ID NO：41的約殘基31-35；重鏈CDR2胺基酸序列相應於SEQ ID NO：41的約殘基50-66；以及重鏈CDR3胺基酸序列相應於SEQ ID NO：41的約殘基99-113。在另一個方面，本發明提供一抗體，其包含基本上由SEQ ID NO：15之殘基24-34所組成的輕鏈CDR1胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：15之殘基50-56所組成的輕鏈CDR2胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：15之殘基89-97所組成的輕鏈CDR3胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：17之殘基31-35所組成的重鏈CDR1胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：17之殘基50-65所組成的重鏈CDR2胺基酸序列；以及基本上由SEQ ID NO：17之殘基99-112所組成的重鏈CDR3胺基酸序列。在另一個方面，本發明提供一種包含下列CDR區域的抗體：基本上由SEQ ID NO：39之殘基24-34所組成的輕鏈CDR1胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：39之殘基50-56所組成的輕鏈CDR2胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：39之殘基89-97所組成的輕鏈CDR3胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：41之殘基31-35所組成的重鏈CDR1胺基酸序列；基本上由SEQ ID NO：41之殘基50-66所組成的重鏈CDR2胺基酸序列；以及基本上由SEQ ID NO：41之殘基99-113所組成的重鏈CDR3胺基酸序列。
本發明也涵蓋抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結合KIR的多肽，其包含至少一變異胺基酸序列實質上與1-7F9或1-4F1 VH或VL序列、或與其CDR區域一致。變異胺基酸序列可包含或由基本上至少約百分之50、80、90、95、98、或99(例如約50-99、約65-99、約75-99、或約85-99)與1-7F9或1-4F1 CDR、VH、或VL區域一致的胺基酸序列所組成。變異胺基酸序列也可以或二者擇一地包含1、2、或3個CDR，該CDR包含或由至少約80%、至少約90%、或至少約95%與1-7F9或1-4F1 CDR一致的胺基酸序列所組成。因此，在一方面，本發明提供一種人類抗體，其包含一輕鏈CDR1胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39殘基24-34一致；一輕鏈CDR2胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39殘基50-56一致；一輕鏈CDR3胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39殘基89-97一致；一重鏈CDR1胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41殘基31-35一致；一重鏈CDR2胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：17殘基50-65或與SEQ ID NO：41殘基50至66一致；以及一重鏈CDR3胺基酸序列至少約80%、至少約90%、或至少約95%與SEQ ID NO：17殘基99-112或與SEQ ID NO：41殘基99至113一致。保留在此變異胺基酸序列之衍生自1-7F9或1-4F1之結合KIR胺基酸序列的基本性質理想的包括了1-7F9或1-4F1序列對一或更多KIR的專一性及/或親合力，而且也可以或二者擇一地包括1-7F9阻斷KIR/HLA-C交互反應以及誘發NK細胞溶解活性的能力。
在另一個方面，本發明提供一種抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結合KIR的多肽，其包含一結合KIR的胺基酸序列，該序列係藉由一或更多個殘基的插入、刪除、及/或取代而與1-7F9或1-4F1的結合KIR序列有一或更多個胺基酸殘基不同(例如至少2、3、5、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約50、或更多個胺基酸殘基)。在一具體實例中，此變異的KIR結合序列具有較佳的親和性；較佳的或不同的專一性；較少的免疫產生(就宿主對序列的反應而言)；較佳的體內安定性；及/或其他變異序列比包含天然1-7F9或1-4F1序列之基本上一致的胺基酸序列較佳的性質。適合的序列變異進一步描述在本文其他地方。抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結合KIR的多肽之KIR結合部位也可包含任何合適數目之促進KIR結合及/或提供其他有益之物化或免疫學性質的非胺基酸成份或取代，諸如非胺基酸的有機部分。
本發明的一些抗體也可以或二者擇一地由其對一或更多個KIR的結合親和性來定性。例如，如實施例3及8中所示，就二價結合而言，DF200對KIR2DL1的Kd為約11 nM、以及對KIR2DL3的Kd為約2.0 nM，而1-7F9對KIR2DL1的Kd為約0.43 nM、以及對KIR2DL3的Kd為約0.025 nM。所以，在一方面，本發明提供人類或非人類(例如鼠類、嵌合、或人化)的抗體，其具有對KIR2DL1的二價結合Kd不大於約20 nM、不大於約11 nM、不大於約5 nM、不大於約1 nM、不大於約0.5 nM、或不大於約0.43 nM。此外或二者擇一地，本發明之人類或非人類(例如鼠類、嵌合、或人化)抗體可具有對KIR2DL3的Kd為不大於約20 nM、不大於約2 nM、不大於約1 nM、不大於約0.1 nM、或不大於約0.05 nM、或不大於約0.025 nM。在一特定方面，抗體具有與1-7F9約相同的二價結合至KIR2DL1及KIR2DL3之Kd值。如實施例13所示，以一價結合而言，1-7F9以及1-4F1對KIR2DL3的Kd值分別為約3.5以及7 nM。所以，在一方面，本發明提供人類或非人類(例如鼠類、嵌合、或人化)的抗體，其具有一價結合至KIR2DL3的Kd為不大於約20 nM、不大於約10 nM、不大於約7 nM、或不大於約3.5 nM。
在合適的條件下(例如關於溫度、pH等等典型的會反映正常或NK細胞相關疾病的人類生理狀況，以及在包含該序列或組合的合適蛋白質之上下文中)，抗KIR抗體、抗體片段、或抗體衍生物、或結合KIR的多肽選擇性的及/或專一性的(典型的為專一性的)與至少一個KIR結合，尤其是至少一KIR的抗原決定基區域或抗原決定基。例如，在一方面，本發明係關於抗體，其特徵在於(除了別的特徵之外)有能力與1-7F9、1-4F1或類1-7F9或類1-4F1抗體競爭，並且關於涉及上述之各種方法。本發明的其他抗體(及/或本文所述有用於實施本發明的方法者)也可以或二者擇一地特徵在於具有與一或更多的抗體DF200、抗體NKVSF1、抗體EB6、以及抗體GL183競爭的能力。
本發明交互反應的以及中和的抗KIR抗體、抗體片段、或衍生物減少或中和KIR的抑制活性，其係藉由專一性抑制MHC及/或HLA分子與至少兩個抑制性KIR受體結合並促進NK細胞活性，也就是說此抗體、片段或衍生物使得表面表現了抑制性KIR受體的NK細胞能夠溶解表現了相應於該特定抑制性KIR受體(例如特定HLA抗原)的HLA配體之細胞。在一方面，本發明提供專一性抑制HLA-C分子與KIR2DL1以及KIR2DL2/3受體結合的抗體。在另一方面，本發明提供抑制KIR2DL1及/或KIR2DL2/3與HLA-C結合的抗體。在另一方面，本發明提供體內及/或試管內促進NK細胞活性的抗體。
至少一個KIR2DL1或KID2DL2/3是存在於至少約90%或更多的人類族群中，且本發明更佳的抗體能夠誘發表現了這些KIR之一或兩者的NK細胞活性。所以，本發明的組成物可被用於大多數人類個體以有效的活化或誘發NK細胞，典型的是約90%人類個體或更多。所以，根據本發明之單一抗體組成物可被用於治療大部分人類個體，而且不太需要決定KIR-或HLA-等位基團或使用兩個或更多種抗KIR mAb之混合物或混合(cocktail)。
在一方面，抗體專一性的結合至KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者人類受體並且逆轉由這些KIR所調控之NK細胞細胞毒性的抑制作用。抗體也可以是人類的及與單株抗體1-7F9及/或1-4F1競爭。當指特定一組抗體(例如一或更多選自DF200、NKVSF1(Pan2D)、1-7F9、EB6、以及GL183的抗體)時，術語「競爭」是指第一抗體在結合分析中與第二抗體(或其他分子)可測得的競爭，該結合分析使用重組KIR分子或細胞表面表現的KIR分子。例如，在一方面，當對一些抗體對(pair)的抑制百分比高於約20%、高於約30%、高於約40%、高於約50%(不管用哪一個抗體作為第一抗體)時，抗體會競爭。或者，當對一些抗體對(pair)的抑制百分比平均為至少約29%、至少約30%、至少約40%、或至少約50%時，抗體會競爭。第二抗體藉由第一抗體結合至KIR2D蛋白質的抑制百分比可以如下計算：100*(1-(偵測到的結合第二抗體)/(偵測到的第一抗體結合))。同樣適用於抗體片段以及抗體衍生物。除非另有指明，否則與1-7F9、1-4F1或類1-7F9或類1-4F1抗體「競爭」的抗體可與1-7F9、1-4F1或類1-7F9或類1-4F1抗體競爭結合至人類KIR2DL1、人類KIR2DL2/3、或人類KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者。例如，抗體DF200與1-7F9以及1-4F1競爭結合至KIR2DL3。
視需要的，與1-7F9或1-4F1競爭的抗體分別不是1-7F9或1-4F1本身(即本發明提供1-7F9以及1-4F1以外的抗體，其特徵在於(除了別的特徵之外)與1-7F9及/或1-4F1競爭結合至一或這些KIR兩者的能力)。
在另一方面，抗體與KIR2DL1以及KIR2DL2/3人類受體兩者結合，減少或中和或逆轉由這些KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，並與1-7F9競爭結合至KIR2DL1人類受體、KIR2DL2/3人類受體、或KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩人類受體。視需要的，該抗體是嵌合的、人類的、或人化的抗體。
在另一方面，抗體與KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩人類受體結合，減少、中和或逆轉由這些KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，並與EB6競爭結合至KIR2DL1人類受體、或與GL183及/或DF200競爭結合至KIR2DL2/3人類受體；或與EB6競爭結合至KIR2DL1人類受體並與GL183及/或DF200競爭結合至KIR2DL2/3人類受體。在一具體實例中，抗體不是NKVSF1(Pan2D)、不是A210、不是A803g、及/或不是DF200。抗體可以是(例如)鼠類、嵌合、人類、或人化抗體。
在另一方面，抗體包含與1-7F9或1-4F1的VH及/或VL區域至少實質上一致的VH、VL、或VH以及VL兩區域。抗體可以是任何亞群，包括IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4。在一特定的方面，抗體是人類IgG4抗體。在另一特定方面，抗體是人類IgG2抗體。抗體可以是嵌合、人類、或人化抗體。
在另一方面，抗體是人類的、與1-7F9或1-4F1競爭、以及與單株抗體1-7F9或1-4F1一樣會辨別、結合至、或對KIR分子上的至少部分相同(或相同)的抗原決定基或「抗原決定基區域」具有免疫專一性。較佳的，該KIR分子是人類KIR2DL1或KIR2DL2/3受體。
在另一方面，抗體與存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩人類受體上常見的決定基結合並減少、中和或逆轉由這些KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用。抗體較專一的可與單株抗體1-7F9一樣與KIR上至少部分相同、實質上相同、或相同的抗原決定基結合。
在一特定方面，抗體是可顯現一或更多上述特徵的單株抗體。
在另一方面，可製備本文所述的功能性片段以及抗體衍生物，其具有實質上相似的抗原結合性、專一性及/或活性，包括(不限於)Fab片段、Fab’2片段、免疫黏附素、微型雙功能抗體(diabodies)、camelized抗體、Janusins、微型抗體(minibodies)、CDR、以及ScFv片段。
除非另有指明，否則抗體或二價片段或其衍生物係單專一的，即抗體、片段、或衍生物的兩「臂」係與相同的抗原結合。
在另一方面，包含本發明抗體的抗體衍生物可以被製備，其係與毒素、放射性核素、可測得的部分(例如螢光)、或固體支持物接合或共價結合。
本發明也涵蓋包含上述抗體的醫藥組成物、其片段、或其各自的衍生物。所以，本發明也關於本文所描述之抗體用於製造醫藥品之方法中的用途。在一較佳的具體實例中，該醫藥品或醫藥組成物是用於治療癌症或其他增生失調、感染、或用於移植。
在一方面，本發明係關於包含抗體的組成物(例如經配製以用於醫藥施用的組成物、用於製備此組成物的套組、分析套組或介質、純化介質、等等)，該抗體與至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合，以及能夠藉由表現該兩個不同人類抑制性KIR受體至少其一的NK細胞來中和KIR所調控的抑制細胞毒性，其中該抗體是進入到脂質體中。脂質體可也包含其他物質諸如(例如)在基因治療中用於遞送基因之核酸分子；用於遞送反義RNA、RNAi、或siRNA以抑制NK細胞中的基因的核酸分子；或用於NK細胞的標的毒殺作用的毒素或藥物。
本文也描述在試管內、體外、或體內調控人類NK細胞活性的方法，包含將人類NK細胞與有效量的本發明抗體、此抗體的片段、其一的衍生物、或包含至少任何其一的醫藥組成物相接觸。較佳的方法包含施用有效量的本發明醫藥組成物於具有癌症、感染性疾病、或免疫疾病的個體，並且係關於增加人類NK細胞的細胞活性，最佳的是在體外或體內。例如，給藥的進行可以藉由將在合適的緩衝液中的抗體靜脈注入具有癌症或感染性疾病(諸如病毒疾病)的患者。
本發明也提供包含抗體的組成物，該抗體與至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合，其中該抗體能夠在NK細胞中中KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，該NK細胞表現至少兩個不同人類抑制性KIR受體之一，該抗體是以可有效測得患者或包含NK細胞之生物樣本中誘發NK細胞細胞毒性的含量存在；以及醫藥上可接受的載劑或賦形劑。較佳的，該抗體與存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3上常見的決定基結合。包含本發明抗體之組成物可視需要的進一步包含第二個治療上的藥劑(該藥劑誘導、促進、及/或增進宿主的治療上功效，該宿主具有需施用該抗體的症狀或失調，例如關於癌症、移植、感染性疾病、病毒感染等等的症狀)。在一方面，在此組合組成物中可以與本發明的抗體共同施用的第二個治療上藥劑可以是選自(例如)免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、對非KIR抗原具專一性的第二抗體(視需要的為結合至及抑制且中和抑制性KIR、或減少來自抑制性KIR之訊號的第二抗體)、抗感染藥劑、標的藥劑、或附屬化合物。較佳的免疫調節劑可以是選自IL-1阿法、IL-1貝塔、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-貝塔、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-阿法、TNF-貝塔、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-阿法、IFN-貝塔、或IFN-加瑪。化學治療劑的例子包括烷化藥劑、抗代謝藥、細胞毒性抗生素、阿德力黴素、更生黴素、絲裂黴素、洋紅黴素(carminomycin)、道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、三苯氧胺(tamoxifen)、紫杉醇、泰素帝(taxotere)、醛基長春鹼(vincristine)、長春花鹼、長春瑞賓(vinorelbine)、依託泊甙(etoposide；VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、胞嘧啶阿拉伯糖、環磷醯胺、塞替派(thiotepa)、甲氨喋呤、喜樹鹼、放線菌素-D、絲裂黴素C、順鉑(cisplatin；CDDP)、胺喋呤、康布瑞塔卡汀(combretastatin)、其他植物鹼藥物(vinca alkyloid)以及其衍生物或前趨藥物。荷爾蒙劑的例子包括亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、布舍瑞林(buserelin)、三苯氧胺(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拂它邁(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、cyproterone bicalutamid anastrozole、依西美坦(exemestane)、來曲唑(letrozole)、fadrozole medroxy、氯地孕酮(chlormadinone)、甲地孕酮(megestrol)、其他LHRH激動劑、其他抗動情素、其他抗雄性激素、其他芳香酶抑制劑、以及其他雌激素。較佳的，結合至以及抑制抑制性KIR受體的第二抗體是結合至抑制性KIR受體之抗原決定基的抗體或其衍生物或片段，該抗原決定基不同於與存在於至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物上常見之決定基結合的抗體所結合的抗原決定基。在另一方面，第二抗體可以是針對與疾病狀態相關的標的(例如癌症相關的抗原、病毒感染相關的抗原等等)，該疾病狀態是可藉由施用本發明之抗體而至少被部分治療的。
本發明進一步提供在需要的患者中可測得的誘發NK細胞活性的方法，該方法包含將根據本發明的組成物給藥給患者的步驟。需要誘發NK細胞活性的患者可以是任何被診斷具有疾病或失調的患者，其中此誘發可促進、增進、及/或誘導治療上的功效者(或在至少大部分的有疾病或失調之患者中以及在藉由(例如)臨床試驗所決定之實質上相似特徵的患者中促進、增進、及/或誘導此功效)。需要此治療的患者可以是患有(例如)癌症、另一個增生失調、感染性疾病或免疫失調者。較佳的，該方法包含給藥給患者適當的額外治療藥劑的額外步驟，該額外治療藥劑係選自免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、對不同於KIR的抗原具專一性的第二抗體、(視需要的)結合至及抑制和中和抑制性KIR受體、或減少來自抑制性KIR之訊號的第二抗體、抗感染藥劑、標的藥劑或附屬化合物，其中該額外的治療上藥劑是以一次劑量的形式或分離的劑量形式與該抗體一起給藥給患者。抗體(或抗體片段/衍生物)的劑量以及額外的治療上藥劑的劑量共同可足夠地可測得的誘導、促進、及/或增進患者治療上的反應，包含NK細胞活性的誘發。當分開給藥時，抗體、片段、或衍生物以及額外的治療上藥劑理想上是以對患者有可測得的綜合治療上益處的條件下(例如時間、給藥次數等等)進行給藥。
本發明進一步涵蓋能夠與非人類靈長類(較佳的為猴子)NK細胞及/或KIR受體專一性結合的抗體。也涵蓋評估本發明候選醫藥品抗體之毒性、劑量及/或活性或功效的方法。在一方面，本發明涵蓋決定對動物或標的組織有毒性的抗體劑量的方法，該方法係將本發明的抗體給藥至具有NK細胞的非人類靈長類接受動物，以及評估藥劑對該動物(或較佳的對標的組織)的任何有毒或有害或負面影響。在另一方面，本發明是用於鑑認對動物或標的組織有毒性之抗體的方法，該方法係將本發明的抗體給藥至具有NK細胞的非人類靈長類接受動物，以及評估藥劑對該動物(或較佳的對標的組織)的任何有毒或有害或負面影響。在另一方面，本發明是用於鑑認可有效治療感染、疾病或腫瘤之抗體的方法，該方法係將本發明的抗體給藥至具有感染、疾病或癌症的非人類靈長類模式中，以及鑑認可改善感染、疾病或癌症、或其症狀的抗體。在一具體實例中，本發明的抗體是(a)與人類NK細胞表面至少兩個抑制性人類KIR受體交互反應的、以及(b)與非人類靈長類NK細胞或KIR受體交互反應的抗體。
本發明進一步涵蓋偵測生物樣本或活生物中NK細胞存在的方法，該NK細胞的細胞表面上有抑制性KIR，該方法包含步驟：
a)將該生物樣本或活生物與本發明的抗體接觸，其中該抗體是與可偵測的部分接合(conjugated)或共價的結合；以及
b)偵測該生物樣本或活生物中該抗體的存在。
本發明也提供從樣本中純化NK細胞的方法，該NK細胞的細胞表面係含有抑制性KIR，該方法包含步驟：
a)將樣本與本發明的抗體接觸，其係在可該使細胞表面含有抑制性KIR的NK細胞結合至該抗體的條件下，其中該抗體是接合的或共價的結合至一固體支持物(例如小珠、基質等等)；以及
b)從接合或共價結合至固體支持物的該抗體上洗提出結合的NK細胞。
頃發現抗體NKVSF1(Pan2D)也結合至來自獼猴的NK細胞，參見圖10。
因此，本發明提供抗體、以及其片段和衍生物，其中該抗體、片段或衍生物與人類NK細胞表面至少兩個抑制性人類KIR受體交互反應，以及進一步結合至來自獼猴的NK細胞。在一具體實例中，抗體不是抗體NKVSF1、不是A210、及/或不是A802g。本發明也提供測試抗體、以及其片段和衍生物毒性的方法，其中該抗體、片段或衍生物與人類NK細胞表面至少兩個抑制性人類KIR受體交互反應，其中該方法包含在獼猴測試抗體。
在一進一步方面，本發明提供抗體、抗體片段、或其一之衍生物，其包含抗體1-7F9或1-4F1的輕可變區域或一或更多個輕可變區域CDR。在另一方面，本發明提供抗體、抗體片段、或其一的衍生物，其包含與所有或基本上所有的1-7F9或1-4F1輕鏈可變區域序列高度相似的序列。
在一進一步方面，本發明提供抗體、抗體片段、或其一的衍生物，其包含抗體1-7F9或1-4F1的重鏈可變區域或一或更多個重鏈可變區域CDR。在另一方面，本發明提供抗體、抗體片段、或其一的衍生物，其包含與所有或基本上所有的1-7F9或1-4F1重鏈可變區域序列高度相似的序列。
抗體
本發明提供新穎的抗體以及其片段或衍生物，其與人類抑制性KIR受體保守的常見決定基結合，較佳的包括存在於至少兩個不同的KIR2DL基因產物上的決定基，但不在KIR2DS4上，且導致表現至少一個那些KIR受體的NK細胞誘發。本發明第一次揭露此交互反應以及中和的抗體可以被產生，且可有效的被用於調節NK細胞活性，代表著一個意想不到的結果以及開啟了通往新穎的以及有效的NK相關之治療的大道，尤其是對人類個體。
在本發明上下文中，「常見的決定基」是指人類抑制性KIR受體的一些基因產物所共有的決定基或抗原決定基。較佳的，該常見的決定基是被KIR2DL受體族群中的至少兩個成員所共有。更佳的，該決定基是被至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3所共有。除了辨識KIR2DL種類的多基因產物，本發明的一些抗體也可以辨識存在於其他抑制性KIR上的決定基，諸如KIR3DL受體族群的基因產物；例如KIR3DL1及/或KIR3DL2。決定基或抗原決定基可代表由該些成員所共有的胜肽片段或構形抗原決定基。在一更特定的具體實例中，本發明的抗體與實質上相同於被單株抗體DF200所辨識之抗原決定基專一性的結合。此決定基是存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者上。在另一個較佳的具體實例中，本發明的抗體與實質上相同於被人類mAb 1-7F9所辨識之抗原決定基或被人類mAb 1-4F1所辨識之抗原決定基專一性的結合，該抗原決定基存在於KIR2DL1、-2以及-3上，但不存在於KIR2DS4上。
除非另有說明或明顯與上下文矛盾，否則本文所用的術語「抗體」是指多株以及單株抗體、以及該多株和單株抗體的片段與衍生物。取決於重鏈固定功能部位的種類，全長抗體典型的被分類為五個主要類別之一：IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM。有的這些被進一步分為亞群或同型(isotype)，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、以及相似者。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈固定功能部位分別被稱為「阿法」、「德耳他」、「艾希隆」、「加瑪」以及「繆」。不同類別的免疫球蛋白之次單元結構以及三次元構形是習知的。IgG及/或IgM是用於本發明較佳的抗體類別，因為它們是生理狀況下最常見的抗體以及因為它們最容易在實驗室中製造。典型的，本發明文中的「抗體」係指單株抗體，較佳的是「人類」單株抗體。
本發明的一具體實例提供體內阻斷抑制性KIR與其相應HLA配體的交互反應的方法，其係用於治療上涉及內生NK細胞活化的目的。在這樣的背景下，可以有避免NK細胞耗盡的優點，因為如果耗盡了，NK細胞就不能發揮其治療上的效益了。所以，具有與Fc-受體些微結合的、以及不活化補體系統的抗體同型諸如IgG4以及IgG2是典型較佳的。1-7F9的同型是IgG4。IgG2抗體通常被認為非耗盡的，而且也可以是比IgG4抗體更安定的分子，因此在體內具有較長的半衰期。1-4F1是IgG2的同型。
抗體的生產
本發明的抗體可以由許多技藝中所知的技術來製造。典型的，抗體是用包含抑制性KIR多肽(較佳的是KIR2DL多肽，更佳的是人類KIR2DL多肽)的免疫原來免疫非人類之動物(較佳的是鼠類)而產生。抑制性KIR多肽可包含人類抑制性KIR多肽的全長序列、或其片段或衍生物，典型的是免疫原性片段，即多肽含有抗原決定基的部分，該抗原決定基係曝露於表現抑制性KIR受體之細胞表面。此片段典型的含有成熟多肽序列至少約7個連續的胺基酸，更佳的至少約10個連續胺基酸。片段典型的是基本上源自受體的細胞外功能部位。更佳的是人類KIR2DL多肽，該多肽包括全長KIRDL多肽的至少一個(更佳的兩個)細胞外Ig功能部位，以及能夠模仿存在於KIR2DL受體的至少一個構形抗原決定基。在其他的具體實例中，該多肽包含KIR2DL1多肽胺基酸位置1-224的細胞外Ig功能部位之至少約8個連續胺基酸(胺基酸編號根據Wagtmann等人，Immunity 1995；2：439-449，在此全文併入作為參考，或根據在World Wide Web(www)找到的PROW網頁網址ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm)。
在一具體實例中，免疫原包含在脂質膜中的野生型人類KIR2DL多肽，典型的是在細胞表面。在一特定的具體實例中，免疫原包含完整的NK細胞，尤其是完整的人類NK細胞。在另一個具體實例中，細胞被溶解或以其他方式處理使其不完整。免疫原可以在給藥至非人類哺乳動物諸如鼠、兔、山羊、馬、狗、綿羊、天竺鼠、大鼠、倉鼠等等之前(例如)懸浮或溶於緩衝液中，視需要的含有佐劑諸如弗氏完全佐劑。
以抗原免疫非人類哺乳動物的步驟可以由技藝中所熟知的任何在鼠中刺激產生抗體的方式來進行(參見例如E. Harlow以及D. Lane，Antibodies：A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))。然後免疫原被懸浮或溶於緩衝液中，視需要的含有佐劑諸如弗氏完全佐劑。決定免疫原含量、緩衝液種類以及佐劑含量的方法是熟習此項技藝者所熟知的，而且不作為對本發明的限制。不同的免疫原可以有不同的這些參數，但是是容易闡示的。
類似的，關於選擇位置以及免疫頻率以有效刺激抗體產生的原則也是技藝中所熟知的。在一例示的免疫操作中，在第一天將抗原以腹腔注射注射入非人類的動物中，然後於約一週後再次注射。接著約在第20天時進行抗原的回憶注射(recall injection)，視需要的包含佐劑諸如弗氏不完全佐劑。回憶注射是在靜脈進行，而且可以重複多個連續日。然後在第40天在靜脈或腹腔進行追加(booster)注射，典型的不含佐劑。這個操作在約40天之後會產生抗原專一之產生抗體的B細胞。也可以使用其他操作，只要該操作可以產生表現抗體的B細胞，該抗體係針對用於免疫之抗原者。
關於多株抗體的製備，血清是得自經免疫的非人類之動物，而存在於其中的抗體是藉由熟知的技術分離的。血清可以用任何上述的免疫原親和純化的，該免疫原係連接至一固體支持物以獲得與抑制性KIR受體反應的抗體。
在另一個具體實例中，來自未經免疫的非人類之哺乳動物的淋巴細胞被分離、生長於試管內，然後在細胞培養物中與免疫原接觸。接著回收淋巴細胞以及進行下述的融合步驟。
對單株抗體而言，下一個步驟是自經免疫的非人類哺乳動物分離脾細胞以及接著將該些脾細胞與永生細胞(immortalized cell)融合以形成產生抗體的融合瘤。自非人類哺乳動物分離脾細胞是技藝中所熟知的，且典型的涉及自經麻醉的非人類哺乳動物移除脾臟、將之切成小塊以及自脾囊擠出脾細胞並且透過細胞篩網的尼龍篩進入一適當的緩衝液中以產生單一細胞懸浮。細胞經清洗、離心以及再懸浮於溶解任何紅血球細胞的緩衝液中。溶液再次經離心，且團塊中留下的淋巴細胞最後再懸浮於新鮮緩衝液中。
一旦經分離並存在於單一細胞懸浮中，淋巴細胞可以與永生細胞系相融合。雖然許多用於製造融合瘤的其他永生細胞系是技藝中已知的，這典型的是鼠骨髓癌細胞系。較佳的鼠類骨髓癌系包括(但不限於)源自MOPC-21以及MPC-11鼠腫瘤者(得自美國加州聖地牙哥Salk Institute Cell Distribution Center)、或X63 Ag8653以及SP-2細胞系(得自美國馬里蘭州洛克維爾American Type Culture Collection)。細胞融合的產生是使用聚乙二醇或相似者。所得的融合瘤接著在選擇培養基中生長，該培養基含有一或更多抑制未融合、親代骨髓癌細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓癌細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤的培養基典型的會包括次黃嘌呤、胺喋呤、以及胸腺嘧啶(HAT培養基)，這些物質會防止缺乏HGPRT的細胞生長。
融合瘤典型的是生長在巨噬細胞滋養層(feeder layer)上。巨噬細胞較佳的是來自用於分離脾細胞之非人類哺乳動物的同窩出生者，且典型的是在塗佈融合瘤之前以弗氏不完全佐劑或相似者預致敏(primed)數天。融合的方法描述在Goding的「Monoclomal Antibodies：Principles and Practice」第59-103頁(Academic Press，1986)，其揭露在此併入作為參考。
使細胞生長在選擇培養基中足夠的時間使菌落生成以及抗體產生。這通常是介於約7以及約14天之間。然後分析融合瘤菌落的與多個抑制性KIR受體基因產物交互反應之抗體生成。雖然可以使用許多其他種類的分析，包括免疫沉澱法以及放射線免疫分析、或FACS、Biacore、快速磷光閃爍標記測定法(Scintillation-proximity assay，SPA)、或其他種類技藝中所熟知的分析，但該分析典型的是比色ELISA種類分析。檢測含有想要之專一性抗體的槽(well)以決定是否存在有一或更多個不同的融合瘤細胞菌落。如果存在有多於一個菌落，則細胞可經再選殖並生長以確認只有單一細胞產生了想要之抗體的菌落。具有單一明顯菌落的陽性槽典型的經再選殖以及再分析以確認只有一種單株抗體被偵測到以及產生。
在一較佳的具體實例中，用於產生根據本發明可用之方法來產生抗體的非人類動物是哺乳動物，諸如齧齒類(例如鼠、大鼠等等)、牛、豬、馬、兔、山羊、綿羊等等。非人類之哺乳動物也可以是經基因改造或基因工程以產生「人類」抗體者，諸如下述的XenomouseTM (Abgenix)或HuMAb-鼠TM (Medarex)。
抗體也可以是基因轉殖產生的，其係藉由經基因轉殖以產生想要的免疫球蛋白重鏈以及輕鏈序列之脊索動物(諸如哺乳動物或鳥類)或植物，並且抗體的生成是可恢復的(recoverable)形式(參見例如Ma等人的Nature Rev. Genetics 4：794-805(2003)；Nolke等人的Expert Opin Biol Ther. 2003 Oct；3(7)：1153-62；Schillberg等人的Cell Mol Life Sci. 2003 Mar；60(3)：433-45；Tekoah等人的Arch Biochem Biophys. 2004年6月15日；426(2)：266-78；Fischer等人的Eur. J. of Biochem.,262(3)：810(1999)；以及美國專利申請案第20030084482號，關於在植物中生成抗體以及類抗體蛋白質)。結合在哺乳動物中的基因轉殖產生，抗體以及其他蛋白質可以由山羊、乳牛、或其他哺乳動物的乳汁中產生及獲得。參見例如美國專利5,827,690、5,756,687、5,750,172、以及5,741,957。抗體也可以自鳥類的蛋產生以及獲得。參見例如Tini等人的Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2002 Mar；131(3)：569-74以及美國專利4,550,019。
抗體可也藉由選擇免疫球蛋白的組合庫(combinatorial libraries)來產生，如(例如)Ward等人在Nature,341(1989)p. 544中所揭示。
根據另一個具體實例，本發明提供源自非人類宿主B細胞的融合瘤，其中該B細胞產生會與存在於至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物上之決定基結合的抗體，且該抗體能夠中和該受體的抑制活性。更佳的，本發明此方面的融合瘤不是產生單株抗體NKVSF1、不是A210、及/或不是A802g的融合瘤。根據本發明此方面的融合瘤可以被如上所述而製造，藉由將來自經免疫的非人類哺乳動物之脾細胞與永生細胞系融合。以此融合所產生的融合瘤可以如本文其他處所描述的篩選此交互反應抗體的存在。較佳的，融合瘤會產生可辨識存在於至少兩個不同KIR2DL的基因產物上之決定基的抗體、以及引起表現至少該些KIR受體之一的NK細胞誘發。更佳的，融合瘤會產生抗體，該抗體與1-7F9一樣，結合至實質上相同的抗原決定基或決定基，並誘發NK細胞活性，或與1-4F1一樣，結合至實質上相同的抗原決定基。最佳的，融合瘤是產生單株抗體1-7F9的融合瘤1-7F9、或產生單株抗體1-4F1的融合瘤1-4F1。
確認可產生本發明之單珠抗體的融合瘤可在適當的培養基諸如DMEM或RPMI-1640中生長至較大量。或者，融合瘤細胞可以被生長在體內，如同動物中的腹水腫瘤。
經過足夠的生長以產生想要的單株抗體之後，含有單株抗體的生長培養基(或腹水液)可以與細胞分離，並且純化單株抗體。純化典型的是藉由使用蛋白質A或蛋白質G瓊脂糖凝膠層析法來達成、或連接到固體支持物(諸如洋菜膠或瓊脂糖凝膠珠粒)的抗鼠Ig來達成(都描述在例如Antibody Purification Handbook,Amersham Biosciences,發行號18-1037-46,Edition AC，其揭示併入本文作為參考)、或藉由其他已知技術諸如電泳或透析來達成。被結合的抗體典型的是使用低pH的緩衝液(pH 3.0或更低之甘胺酸或醋酸緩衝液)自蛋白質A/蛋白質G管柱中洗提出來，立即中和含有抗體的餾份。這些餾份依需要而被倒在一起、透析、以及濃縮。
人類抗體
在一方面，本發明提供人類抗KIR抗體。「人類」抗體與「人化」抗體是可區別的(會於後面分述)。此「人類」抗體可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或區域專一突變或藉由體內體突變而置入的突變)，例如在CDR，諸如在CDR3。然而此處所用的術語「人類抗體」不包括人化抗體或源自另一個哺乳動物物種(諸如鼠)生殖系的CDR序列已被嫁接至人類框架序列的人類/鼠嵌合抗體。
基因轉殖動物可以且已被發展可含有人類Ig基因，一旦經免疫可產生完整全套的人類抗體而沒有鼠免疫球蛋白產生。此人類Ig基因轉殖鼠可被用來產生人類抗體。此人類抗體可以在含有人類免疫球蛋白基因座以及天生的免疫球蛋白基因刪除的人類Ig基因轉殖動物(例如鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、馬等等)諸如Xeno 鼠TM 中產生(Abgenix-Fremont,CA,USA)(參見例如Green等人的Nature Genetics 7：13-21(1994)；Mendez等人的Nature Genetics 15：146-156(1997)；Green以及Jakobovits J. Exp. Med. 188：483-495(1998)；歐洲專利第EP 0 463 151 B1號；國際專利申請案WO 94/02602、WO 96/34096；WO 98/24893、WO 99/45031、WO 99/53049、以及WO 00/037504；和美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、5,994,619、6,075,181、6,091,001、6,114,598以及6,130,364)或在含有人類編碼Ig基因的微小基因座的基因轉殖動物諸如HuMab-鼠TM 中產生(Medarex-Princeton,NJ,USA)(參見例如EP 0546073、EP0546073；美國專利5,545,807、5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215、5,643,763；以及國際專利申請案WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852、以及WO 98/24884)。來自此基因轉殖鼠的脾細胞可根據已知的技術被用於產生分泌人類單株抗體的融合瘤，如本文所述。相似的技術以及原則描述在例如Jakobovits等人的Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90：2551-255(1993)；Jakobovits等人的Nature,362：255-258(1993)；以及Bruggemann等人的Year in Immuno.,7：33(1993))。
此外，人類抗體或來自其他物種的抗體可以藉由展示種類(display-type)技術產生，該技術包括(不限於)噬菌體展示、反轉錄病毒展示、核糖體展示、以及其他相關的技術，使用技藝中所熟知的方法，而且所得到的分子可以被進行額外的成熟方法，諸如親和力成熟，這技術也是熟知的(參見例如(Hoogenboom等人的J. Mol. Biol. 227：381(1991)(噬菌體展示)；Vaughan等人的Nature Biotech 14：309(1996)(噬菌體展示)；Hanes以及Plucthau PNAS USA 94：4937-4942(1997)(核糖體展示)、Parmley and Smith Gene 73：305-318(1988)(噬菌體展示)、Marks等人的J. Mol. Biol.,222：581(1991)、Scott TIBS 17：241-245(1992)、Cwirla等人的PNAS USA 87：6378-6382(1990)、Russel等人的Nucl. Acids Research 21：1081-1085(1993)、Hoganboom等人的Immunol. Reviews 130：43-68(1992)、Chiswell and McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)、以及美國專利5,733,743)。如果展示技術被用來產生不是人類的抗體，則此抗體可以(例如)如本文中其他地方所述被人化。
所以，如本文所述，抗KIR mAb是用於治療癌症以及病毒感染和其他疾病與失調之有前景的藥劑。抗KIR mAb可以用各種方法產生，諸如人化鼠類mAbs或藉由融合來自人類Ig基因轉殖鼠(XenoMouse、或HuMab鼠)的脾細胞、藉由噬菌體展示、或藉由永生化人類產生Ab的B細胞、或藉由其他方法。不管哪一種方式，抗體都可以由細胞系產生並純化成適合調配、包裝以及注射入所需患者之含量。
重組生產
抗KIR抗體也可以使用標準技術藉由單細胞生物(諸如酵母菌)；或細菌細胞培養(諸如E. coli)；或真核細胞培養(例如哺乳動物細胞培養)的重組表現而製備。
所以，根據另一個具體實例，編碼有交互反應以及中和抗KIR抗體重以及輕鏈的DNA被分離自本發明的融合瘤並放置於適當的表現載體以轉染進適當的宿主中，其中該抗體係會與存在於至少兩個不同人類抑制性KIR上的決定基結合。然後宿主被用於重組產生抗體、或其變異體，諸如該單株抗體的人化形式、抗體的活性片段、或包含抗體之抗原辨識部位的嵌合抗體。較佳的，用於本具體實例的DNA係編碼有能辨識存在於至少兩個不同KIR2DL基因產物(但不是KIR2DS3或-4)上之決定基的抗體，且引起表現至少該些KIR2DL受體之一的NK細胞的誘發。更佳的，DNA係編碼有與1-7F9所結合之實質上相同抗原決定基或決定基的抗體並誘發NK細胞活性。最佳的，DNA編碼有單株抗體1-7F9。
編碼有本發明之單株抗體的DNA是容易用習知方法分離以及序列的(例如藉由使用能夠與編碼有鼠類或人類抗體之重鏈以及輕鏈基因專一結合的寡核苷酸探針)。一旦經分離，DNA可以被放入表現載體中，然後被轉染進不產生免疫球蛋白之宿主細胞諸如E. coli細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓癌細胞中，以在重組宿主細胞中獲得單株抗體的合成。在細菌中重組表現編碼有抗體片段之DNA是技藝中所熟知的(參見例如Skerra等人的Curr. Opinionin Immunol.,5,pp. 256(1993)；以及Pluckthun的Immunol. Revs. 130,pp. 151(1992)。
此外，自已知的可變重鏈(VH)以及可變輕鏈(VL)、和人類固定區域重組產生抗體已被描述於(例如)Ruker等人(Annals of the New York Academy of Sciences. 1991；646：212-219)，他報導了人類單株抗HIV-1抗體在CHO細胞中的表現；Bianchi等人(Biotechnology and Bioengineering. 2003；84：439-444)，他描述了高量的全長抗體表現，使用反式互補(trans-complementing)表現載體；No Soo Kim等人(Biotechnol. Prog. 2001；17：69-75)，他描述了在二氫葉酸還原酶所調控之基因放大時，CHO細胞人化抗體表現發生選殖變異(clonal variation)的關鍵決定因子；King等人(Biochemical Journal. 1992；281：317-323)，他報導了鼠-人類嵌合抗體以及嵌合Fab’片段的表現、純化以及特徵；WO 2003064606描述了經分離的包含人類重鏈以及人類輕鏈可變區域之人類單株抗體，兩者都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4序列；以及WO 2003040170描述了嵌合或人類單株抗體以及專一結合至並活化人類CD40的抗原結合部位。
編碼有人類IgG固定區域的完整cDNA序列可以由下列GenBank入口找到，各自完整併入作為參考，2005年1月6日入口為：
人類IgG1固定重鏈區域：GenBank編號：J00228
人類IgG2固定重鏈區域：GenBank編號：J00230
人類IgG3固定重鏈區域：GenBank編號：X04646
人類IgG4固定重鏈區域：GenBank編號：K01316
人類加巴輕鏈固定區域：GenBank編號：J00241。
在一例示的具體實例中，自1-7F9或1-4F1 VH以及VL序列產生重組mAb產物，可以使用下列操作。步驟1-3描述了自產生1-7F9或1-4F1的融合瘤或其他細胞取得VH以及VL區域。然而，用於步驟4中之編碼有1-7F9或1-4F1 VH以及VL序列(或其突變株或衍生物)的cDNA也可以由圖14或15提供的序列資訊使用已建立的合成cDNA片段技術來製備。或者，1-7F9或1-4F1的VH以及VL片段、或其突變株或衍生物可以被選殖入科學文獻所描述或商業上可獲得的諸多表現載體中任何一個，該表現載體含有想要的Ig亞類別之固定區域以表現全長抗體。此外，1-7F9或1-4F1的VH以及VL片段、或其突變株或衍生物可以被選殖入編碼有被截短之固定區域以表現抗體片段(例如Fab片段)的載體。一個商業上可獲得的載體例子是pASK84，得自ATCC(American Type Culture Collection，目錄編號87094)。
(1)自融合瘤細胞分離出全部RNA：
4x106 個分泌人類KIR抗體的融合瘤細胞(諸如1-7F9或1-4F1)被用來分離全部RNA，其係使用Qiagen的RNeasy Mini Kit，根據操作說明，並且簡述如下：於1000 rpm離心5分鐘使細胞沉澱，並添加350微升含有10微升/毫升β-硫醇乙醇之RLT緩衝液將細胞破裂。將溶解產物轉換到Qiagen的QIAshredder管柱，並於最高速離心2分鐘。濾出物與等體積的70%乙醇混合。每根Rneasy旋轉管柱(Qiagen)至多使用700微升樣本，並於14000 rpm離心，將濾出物丟棄。每根管住使用700微升RW1緩衝液，於14000 rpm離心15秒以清洗管柱。用500微升RPE緩衝液以及於14000 rpm離心15秒以清洗管柱兩次。於14000 rpm額外離心2分鐘以乾燥管柱。將管柱換到一個新的收集管中，並以50微升不含核酸酶的水以及於14000 rpm離心1分鐘流洗出RNA。RNA濃度係藉由於OD=260nm的吸光值測得。將RNA儲存於-80℃直到需要。
(2)cDNA的合成：
1微克RNA被用於第一股cDNA的合成，其係使用Clontech的SMART RACE cDNA放大套組。為了製備5’-RACE-Ready cDNA，製備一含有如上述分離的RNA、逆轉引子5’-CDS反向引子、以及SMART II A oligo的反應混合物，將此混合物培養於72℃約2分鐘，然後在添加1x第一股緩衝液、DTT(20mM)、dNTP(10mM)以及PowerScript反轉錄酶之前於冰上冷卻約2分鐘。將反應混合物於42℃培養1.5小時，並加入Tricine-EDTA緩衝液，於72℃培養7分鐘。此時的樣本可以被儲存於-20℃。
(3)人類可變輕鏈(VL)以及人類可變重鏈(VH)的PCR放大以及選殖：
建立含有1xAdvantage HF 2 PCR緩衝液、dNTP(10mM)以及1xAdvantage HF 2聚合酶混合物的PCR(聚合酶鏈鎖反應)反應混合物以自上述製得之cDNA分別放大VL以及VH的可變區域。
用下列引子放大VL：
UPM(通用引子混合物)：
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(SEQ ID NO：26)
5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：27)
VK RACE2：
5’-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3’(SEQ ID NO：28)
用下列引子放大VH：
UPM(通用引子混合物)：
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(SEQ ID NO：29)
5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：30)
AB90RACE：
5’-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3’(SEQ ID NO：31)
進行三回合PCR。第1回合：PCR跑五個循環，於94℃跑5秒以及72℃跑3分鐘。第2回合：PCR跑五個循環，於94℃跑5秒、70℃跑10秒、以及72℃跑1分鐘。第3回合：PCR跑28個循環，於94℃跑5秒、68℃跑10秒、以及72℃跑1分鐘。
分析PCR產物，其係藉由於1%洋菜膠凝膠中電泳，並使用Qiagen的QIAEX11洋菜膠凝膠萃取套組自凝膠中純化出DNA。
將純化的PCR產物用Invitrogen的TOPO TA選殖套組送入PCR4-TOPO載體中，並用於轉型(transformation)TOP10勝任細胞。
以菌落PCR分析適當量的菌落，其係使用Taq聚合酶、1xTaq聚合酶緩衝液、dNTP(10mM)以及下列引子和PCR程式：
M13前行引子：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID NO：32)
M13反向引子：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO：33)
PCR程式：
於94℃ 30秒、55℃ 30秒、以及72℃ 1分鐘跑25個循環。
使用上述之引子M13前行以及M13反向來取得並定序來自分別包含VL以及VH插入之選殖株的質體DNA。在人類抗KIR mAb 1-7F9的例子中’編碼有重鏈以及輕鏈可變區域的序列顯示於圖15。
(4)將抗體基因次選殖入哺乳動物的表現載體中
根據編碼有mAb之重鏈以及輕鏈可變區域的cDNA序列資料，分別設計用以放大可變輕鏈(VL)以及可變重鏈(VH)基因的引子。可變區域經PCR而被編排成包括Kozak序列、領導序列以及獨特限制酵素區。以VL來說，係藉由設計5’PCR引子以置入HindIII區、Kozak序列並使其與可變輕鏈區域之領導序列的5’端一致。3’引子與可變區域的3’端一致，並且在可變區域的3’邊界置入一BsiWI區。VH區域是以相似的方法產生，但是係分別置入NotI以及NheI區於5’以及3’端，而非HindIII和BsiWI。
使用標準技術將經放大的基因產物各自選殖入一含有輕鏈以及重鏈固定區域的真核表現載體中。用HindIII以及BsiWI切割VL DNA片段並將其連接到一真核表現載體中，該真核表現載體含有編碼有對安比西林的抗性的貝塔內醯胺酶基因以及E. coli複製起點(pUC)；所得到的質體稱為VLCL。用NotI以及NheI切割VH DNA片段並將其置入依上述置入VL片段而得到之VLCL載體中。所得到的質體含有在同一質體上編碼有抗體的重鏈以及輕鏈兩者的功能性表現匣。經連接的質體被用來轉型E. coli。質體DNA係製備自這些對安比西林有抗性的細菌族群，並且被用於轉染進中國倉鼠卵巢細胞、或其他哺乳動物細胞系。轉染以及細胞培養是以標準方法進行的，如(例如)Sambrook等人在「Molecular Cloning」中所描述。結果經轉染的細胞系會穩定的表現以及分泌感興趣的抗體分子，諸如1-7F9或1-4F1人類抗KIR mAb或包含1-7F9或1-4F1之VH以及VL區域的mAb、或另一人類抗KIR mAb。
抗體的變異可以被容易的產生。例如分別與1-7F9或1-4F1有完全相同之專一性但與IgG4或IgG2不同型的抗體可以藉由將編碼有1-7F9或1-4F1之VL以及VH的cDNA次選殖進入質體中來獲得，該質體含有編碼有加巴(kappa)輕鏈固定區域以及重固定鏈區域之cDNA，該重固定鏈區域係選自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4固定重鏈區域。因此，所形成的抗體可具有任何的同型(isotype)，且抗體然後可以使用技藝中習知的技術轉換其同型。此技術包括使用直接重組技術(參見例如美國專利第4,816,397號)、細胞-細胞融合技術(參見例如美國專利第5,916,771)、以及其他技藝中已知的合適技術。所以，本發明所提供之抗體的作用因子功能可以關於親代抗體的同型而被「改變」，其係藉由同型轉換成(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM抗體，以用於各種用途，包括治療上的用途。
因此，進一步方面，本發明提供融合瘤，其包含：(a)B細胞，其係來自經抗原免疫的哺乳動物宿主(典型的是非人類哺乳動物宿主)，該抗原含有存在於抑制性KIR多肽上之抗原決定基，該B細胞係與(b)永生細胞(例如骨髓癌細胞)融合，其中該融合瘤會產生與至少兩個不同之人類抑制性KIR受體結合的單株抗體，且該抗體能夠在表現該至少兩個不同之人類抑制性KIR受體的NK細胞族群中至少實質上中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用。在一具體實例中，哺乳動物宿主是能夠產生人類抗體的基因轉殖動物。視需要的，該融合瘤不產生單株抗體NKVSF1、A210、及/或A802g。在各種具體實例中，抗體與KIR2DL1以及KIR2DL2/3受體或存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者上之常見決定基結合。融合瘤可產生抗體，該抗體會抑制於位置80具有Lys殘基之HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL1受體結合，以及抑制於位置80具有Asn殘基之HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體結合。例如，融合瘤可產生抗體，該抗體與單株抗體1-7F9或1-4F1結合至KIR2DL1或KIR2DL2/3或KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者上實質上相同之抗原決定基。
本發明也提供產生抗體的方法，該抗體與多個KIR2DL基因產物會交互反應以及會減少或中和此KIR的抑制活性，該方法包含步驟：
(a)用包含KIR2DL多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
(b)自該經免疫的哺乳動物製備抗體，其中該抗體與該KIR2DL多肽結合；
(c)選擇(b)中至少與兩個不同的KIR2DL基因產物交互反應的抗體；以及
(d)選擇(c)中誘發NK細胞的抗體。在一具體實例中，該非人類哺乳動物是經基因工程以表現人類抗體庫的基因轉殖動物(例如包含人類免疫球蛋白基因座以及天生免疫球蛋白基因刪除的非人類哺乳動物，諸如XenomouseTM (Abgenix-Fremont,CA,USA)或包含編碼有人類Ig基因之微小基因座的非人類哺乳動物，諸如HuMab-mouseTM (Medarex-Princeton,NJ,USA))。視需要的，步驟a以及b可以由替代的方法所取代來獲得抗KIR mAb，包括但不限於使用噬菌體展示法或人類B細胞的病毒轉換(viral transduction)、或技藝中已知的其他方法。視需要的，該方法進一步包含選擇與靈長類(較佳的是獼猴)中之KIR、NK細胞或KIR多肽會結合的抗體。視需要的，本發明進一步包含評估抗KIR抗體的方法，其中係將根據上述方法所產生的抗體給藥到靈長類(較佳的是獼猴)中，其中較佳的觀察猴子是否有抗體毒性的跡象。
本發明也提供產生至少與兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合之抗體的方法，其中抗體能夠中和KIR所調控的細胞毒性抑制作用(或誘發NK細胞毒性)，該細胞毒性藉由表現至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物的NK細胞族群，該方法包含步驟：
a)用包含抑制性KIR多肽的免疫原免疫非人類哺乳動物；
b)自該經免疫的動物製備抗體，其中該抗體與該KIR多肽結合；
c)選擇(b)中至少與兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物交互反應的抗體；以及
d)選擇(c)中能夠對表現至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物之NK細胞族群中和KIR所調控之NK細胞細胞毒性抑制作用的抗體，其中步驟(c)以及(d)的順序視需要的可調換且任何步驟可視需要的重複一或更多次。在一具體實例中，用於免疫的抑制性KIR多肽可以是一或更多KIR2DL多肽，且步驟(c)中所選擇的抗體與至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3交互反應。較佳的，抗體會辨識存在於至少兩個不同KIR受體基因產物上常見的決定基；最佳的，KIR是KIR2DL1以及KIR2DL2/3。在一具體實例中，步驟(c)包含選擇與至少一KIR2DL以及一KIR3DL受體基因產物反應的抗體。例如，被選擇的抗體可與KIR2DL1以及KIR2DL2/3和KIR3DL1及/或KIR3DL2反應。視需要的，該方法進一步包含選擇與靈長類(較佳的是獼猴)NK細胞或KIR多肽結合的抗體。視需要的，本發明進一步包含評估抗體的方法，其中將根據上述方法所產生的抗體給藥到靈長類(較佳的是獼猴)中，其中較佳的觀察猴子是否有抗體毒性的跡象。
視需要的，在上述方法中，步驟c)或d)所選擇的抗體不是NKVSF1、不是A210、及/或不是A802g。較佳的，在上述方法之步驟(b)所製備的抗體是單株抗體。較佳的，在上述方法之步驟(c)所選擇的抗體會抑制一或更多在位置80具有Lys殘基之HLA-C同種異型(allotype)與人類KIR2DL1受體結合，以及抑制一或更多於位置80具有Asn殘基之HLA-C同種異型與人類KIR2DL2/3受體結合。較佳的，在上述方法之步驟(d)所選擇的抗體會引起NK細胞毒性的誘發、或中和KIR所調控的NK細胞毒性的抑制作用。較佳的，抗體與單株抗體1-7F9結合至KIR2DL1及/或KIR2DL2/3上實質上相同的抗原決定基。視需要的，該方法也或二者擇一地包含額外的步驟：製造所選之單株抗體的片段、製造所選之單株抗體的衍生物(例如藉由與放射性核素、細胞毒性藥劑、報導分子、或相似者接合)、或製造從該單株抗體序列所產生之(或包含與該單株抗體序列一致的)抗體片段的衍生物。在另一方面，此抗體的變異體可藉由製備包含變異胺基酸序列的抗體而產生，該變異胺基酸序列是來自使用上述已知的基因工程方法所得到之抗體(例如序列被修飾使改變其抗體結合性質、增加或降低抗體的安定性、增進抗體純化、增進抗體的偵測、及/或針對所要施用之宿主改變抗體的免疫學性質)。
本發明進一步提供產生與至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合之抗體的方法，其中抗體能夠對表現至少一種不同人類抑制性KIR受體基因產物之NK細胞族群中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用(或誘發NK細胞毒性)，該方法包含步驟：
(a)從資料庫(library)或庫(repertoire)中選擇會與至少兩個不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物交互反應的單株抗體或抗體片段，以及
(b)選擇(a)中在表現至少兩個不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物之NK細胞族群裡能夠中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用的抗體。較佳的，抗體與存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3上之常見的決定基結合。視需要的，步驟(b)中所選擇的抗體不是NKVSF1。較佳的，步驟(b)中所選擇的抗體會抑制於位置80具有Lys殘基之HLA-c等位基因分子與人類KIR2DL1受體結合、以及抑制於位置80具有Asn殘基之HLA-C等位基因分子與人類KIR2DL2/3受體結合。較佳的，步驟(b)中所選擇的抗體會引起NK細胞毒性誘發。較佳的，抗體與單株抗體1-7F9結合至KIR2DL1及/或KIR2DL2/3上實質上相同的抗原決定基。或者，抗體與單株抗體1-4F1結合至實質上相同的抗原決定基。視需要的，該方法包含額外步驟：製造所選之單株抗體的片段、製造所選之單株抗體的衍生物、或製造所選之單株抗體片段的衍生物。
此外，本發明提供產生與至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合之抗體的方法，其中該抗體能夠在表現兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物中至少一種之NK細胞族群裡中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，該方法包含步驟：
a)在可產生單株抗體的條件下培養本發明的融合瘤；以及
b)自融合瘤細胞分離出單株抗體。視需要的，該方法包含額外的步驟：製造單株抗體的片段、製造單株抗體的衍生物、或製造此單株抗體片段的衍生物。較佳的，抗體與存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3上的常見的決定基結合。
本發明也提供產生與至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物結合之抗體的方法，其中該抗體能夠在表現兩個不同人類抑制性KIR受體基因產物中至少其一的NK細胞族群裡中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，該方法包含步驟：
a)自本發明的融合瘤中分離出編碼有單株抗體的核酸；
b)視需要修改核酸以得到經修改的核酸，該核酸包含編碼有經修改或經衍生之抗體的序列，該抗體包含一胺基酸序列與單株抗體的功能序列一致或實質上相似(例如與此序列至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約95%(諸如約70-99%)一致)，其係選自人化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、抗體的免疫反應性片段、或包含此免疫反應性片段之融合蛋白質；
c)將核酸或經修改的核酸(或編碼有相同胺基酸序列之相關核酸)插入一表現載體中，其中當表現載體處於生長在適當條件下的宿主細胞中時，所編碼的抗體或抗體片段能夠被表現；
d)用表現載體轉染宿主細胞，其中宿主細胞不產生其他免疫球蛋白；
e)在會引起抗體或抗體片段表現的條件下培養經轉染的宿主細胞；以及
f)分離由經轉染之宿主細胞所產生的抗體或抗體片段。較佳的，抗體與存在於KIR2DL1以及KIR2DL2/3上常見的決定基結合。
抗體篩選及選擇
本發明的特定抗體能夠減少或中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用；尤其是由KIR2DL受體所調控的抑制作用，更尤其是至少KIR2DL1-以及KIR2DL2/3-兩者所調控的抑制作用。這些抗體因此是「中和」、「阻斷」、或「抑制性」抗體，因為當與MHC第一型分子交互作用時，它們會減少、中和及/或阻斷(至少部分及可測得的)KIR受體所調控的抑制訊號路徑。更重要的是，此中和活性展示在許多種類的抑制性KIR受體上，較佳的在一些KIR2DL受體基因產物，更佳的在至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者，使得這些抗體可以被用於大多數的或所有人類個體，有高效能。中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用可以藉由本文所述的各種分析或試驗來評估，諸如標準試管內細胞細胞毒性分析。
一旦與多個抑制性KIR受體交互反應的抗體被鑑認出來，就可以測試抗體在完整NK細胞中減少或中和該些KIR受體之抑制功效的能力。在一特定的變異體中，中和活性可以被描述為該抗體恢復表現KIR2DL的NK細胞對表現HLA-C之標的之溶解作用的能力。在另一個特定的具體實例中，抗體的中和活性是藉由抗體阻斷或減少HLA-C分子與KIR2DL1以及KIR2DL3(或密切相關的KIR2DL2)受體結合的能力來定義的，進一步較佳的是抗體改變KIR2DL2/3與HLA-C分子結合的能力，該HLA-C分子係選自Cw1、Cw3、Cw7、以及Cw8(或另一個於位置80具有Asn殘基的HLA-C分子)，及/或 KIR2DL1與HLA-C分子結合的能力，該HLA-C分子係選自Cw2、Cw4、Cw5以及Cw6(或另一個於位置80具有Lys殘基之HLA-C分子)。
在另一個變異體中，本發明抗體的中和活性可用以細胞為基礎的細胞毒性分析來評估，如實施例中所揭露。
在另一個變異體中，本發明抗體的中和活性可用細胞激素釋放分析來評估，其中NK細胞是與測試抗體以及標的細胞系培養在一起以刺激NK細胞細胞激素產生(例如IFN-γ及/或GM-CSF產生)，該標的細胞系係表現被NK族群的KIR分子所辨識的一HLA-C等位基因。在一例示的操作中，生產自PBMC的IFN-γ的是藉由細胞表面及細胞質內(intracytoplasmic)染色來評估的，並且在約4天的培養之後藉由流式細胞儀分析。簡單來說，可以添加Brefeldin A(Sigma Aldrich)使其最終濃度約5微克/毫升用於至少約4小時的培養。然後，在通透性(permeabilization)(IntraPrepTM ；Beckman Coulter)處理之前，細胞可以與抗CD3以及抗CD56 mAb培養在一起，並以PE-抗IFN-γ或PE-IgG1(Pharmingen)染色。產生自多株活化NK細胞的GM-CSF以及IFN-γ可以在上清液中用ELISA(GM-CSF：DuoSet Elisa，R&D系統，Minneapolis，MN；IFN-γ：OptE1A組，Pharmingen)測得。
本發明的抗體可部分(即減少)或完全中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性的抑制作用。例如，本發明較佳的抗體能夠誘導或加強HLA-相配對的、或HLA-相容的、或自體移植的標的細胞族群之溶解，即在缺乏該抗體時不能有效被NK細胞溶解的細胞族群。所以，本發明的抗體也可以定義為體內、及/或試管內促進NK細胞活性。
在一特定的具體實例中，抗體所結合的抗原決定基實質上和單株抗體DF200(由融合瘤DF200所產生)、1-7F9、或1-4F1所結合者相同。此抗體在本文可以分別被稱為「類DF200抗體」、「類1-7F9抗體」、以及「類1-4F1抗體」。在一進一步較佳的具體實例中，該抗體是單株抗體。本發明更佳的「類DF200抗體」是除了單株抗體NKVSF1以外的抗體。最佳的是單株抗體1-7F9或1-4F1，以及包含1-7F9或1-4F1之VH及/或VL區域的抗體。
使用可評估抗體競爭性之多種免疫學篩選分析中任何一種來容易地決定鑑認一或更多本文所述的抗體，該抗體所結合之抗原決定基實質上或基本上與單株抗體所結合者相同。這些分析都經常被使用且是技藝中所熟知的(參見例如於1997年8月26日所頒發的美國專利第5,660,827號，在此併入作為參考)。應了解，鑑定一抗體(該抗體所結合之抗原決定基與本文所述之單株抗體所結合者相同或實質上相同)並不需要實際去決定本文所述之抗體所結合的抗原決定基。
例如，當被受測的測試抗體是得自於不同來源的動物、或甚至不同的Ig同型時，可以進行簡單的競爭分析，在該分析中，將控制組抗體(例如DF200)與測試抗體混合在一起，然後將抗體施用到含有KIR2DL1及/或KIR2DL2/3(都已知會與DF200結合)之一或兩者的樣本中。基於ELISA、放射免疫分析、西方點墨法的操作、以及使用BIACORE分析(例如如本文實施例部分所述)都適用於此簡單競爭分析中。
在一些具體實例中，在施用於KIR抗原樣本前，會先將控制組抗體(例如1-7F9或1-4F1)與各種含量的測試抗體(例如比例約1：1、1：2、1：10或約1：100)預混合在一起一段時間。在其他具體實例中，控制組以及各種含量的測試抗體可以分開添加並在暴露於KIR抗原樣本時混合。只要能區分已結合與自由的抗體(例如藉由使用分離或清洗技術來除去未結合的抗體)以及區分控制組抗體與測試抗體(例如藉由使用物種專一或同型專一的第二抗體或藉由專一地用可測得的標示來標示控制組抗體)，就能決定該測試抗體是否減少了控制組抗體與不同KIR2DL抗原的結合，顯示測試抗體會辨識的抗原決定基實質上與1-7F9所辨識者相同。在完全不相關的抗體(不與KIR結合的)的存在下，(標示的)控制組抗體的結合可作為控制組高數值。控制組低數值的獲得是藉由將經標示的控制組抗體與相同但未標示的控制組抗體培養在一起，則會產生競爭並減少了經標示之抗體的結合。在測試分析中，在測試抗體存在下，經標示的抗體反應性明顯減少，表示測試抗體所辨識的抗原決定基實質上與經標示的抗體所辨識者相同，即與經標示的控制組抗體相競爭。例如，任何會使1-7F9或1-4F1與KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩抗原的結合減少至少約50%，諸如至少約60%，或更佳的至少約70%(例如約65-100%)，於1-7F9：測試抗體或1-4F1：測試抗體介於約1：1或1：10以及約1：100之間任何比例的的測試抗體被認為抗體所結合的抗原決定基或決定基是分別與1-7F9或1-4F1所結合者實質上相同。較佳的，此測試抗體會使1-7F9與至少一種其他的(較佳的每一種)KIR2DL抗原的結合減少較佳的至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90%(例如約95%)，與在缺乏測試抗體時所觀察到的1-7F9或1-4F1的結合相比。當然，此方法可被修改以鑑認及/或評估與其他抗體及/或KIR抗原競爭的抗體。
競爭也可以或二者擇一地藉由(例如)流式細胞儀測試來評估。在此測試中，具有特定KIR的細胞可以先與控制組抗體(例如1-7F9或1-4F1)培養在一起，然後與標示有螢光團或生物素(biotin)的測試抗體培養在一起。當與飽和量之控制組抗體一起預培養所得到的結合是沒有與控制組抗體一起預培養之測試抗體所得到的結合(如螢光方法所測得)的約80%、較佳的約50%、約40%或更低(例如約30%)時，稱該抗體與控制組抗體競爭。或者，當細胞(與飽和量之測試抗體預培養之細胞)經標示之控制組抗體(藉由螢光團或生物素)所得到的結合是沒有與測試抗體預培養所得到之結合的約80%、較佳的約50%、約40%、或更低(例如約30%)，稱該抗體與控制組抗體競爭。
也可以有利的使用簡單競爭分析，其中測試抗體以飽和濃度被預吸附及被塗覆在一表面上，該表面上固定有KIR2DL1或KIR2DL2/3之一或兩者。簡單競爭分析中的表面較佳的是BIACORE晶片(或其他適合表面電漿共振分析的介質)。測量控制組抗體(例如1-7F9或1-4F1)與塗覆有KIR之表面的結合。單獨只有控制組抗體與含KIR的表面之結合係與存在有測試抗體之控制組抗體的結合相比較。在有測試抗體的存在下，控制組抗體與含有KIR2DL1以及KIR2DL2/3之表面的結合顯著降低，這表示測試抗體所辨識的抗原決定基與控制組抗體所辨識者實質上是相同的，因此測試抗體與控制組抗體相「競爭」。任何可使控制組抗體(諸如1-7F9或1-4F1)與KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者抗原之結合降低至少約20%或更多、至少約40%、至少約50%、至少約70%、或更多的測試抗體，可被視為該抗體所結合的抗原決定基或決定基與控制組抗體(例如1-7F9或1-4F1)所結合者實質上相同。較佳的，此測試抗體會使控制組抗體(例如1-7F9或1-4F1)與各KIR2DL抗原的結合減少至少約50%(例如至少約60%、至少約70%、或更多)。吾人應可理解，控制組以及測試抗體的順序可以調換；即在競爭分析中，可先將控制組抗體結合至表面，然後使測試抗體接觸表面。較佳的，對KIR2DL1以及KIR2DL2/3抗原具有較高親和性的抗體被先結合到含有KIR2DL1以及KIR2DL2/3的表面，因為此預期在第二抗體(假設抗體相競爭)會看到較大程度的結合性降低。此分析的另一個例子提供在本文的實施例中，以及在例如Saunal以及Regenmortel,(1995)J. Immunol. Methods 183：33-41，其揭示併入本文作為參考。
當為了例示的目的而描述於1-7F9或1-4F1的上下文時，吾人會理解上述的篩選分析也可以用於鑑認與根據本發明之一或更多的NKVSF1、DF200、EB6、GL183、以及其他抗體、抗體片段、和抗體衍生物競爭的抗體。
當在脊椎動物或細胞中免疫以及產生抗體時，可使用特定的選擇步驟以分離所主張的抗體。因此，在一特定的具體實例中，本發明也關於產生此抗體的方法，其包含：
(a)用含有抑制性KIR多肽的免疫原來免疫非人類哺乳動物；
(b)自該經免疫的動物製備抗體，其中該抗體與該KIR多肽結合；
(c)選擇(b)中會與至少兩個不同的抑制性KIR基因產物交互反應的抗體；以及
(d)選擇(c)中能夠在表現該兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物中至少一種的NK細胞族群裡中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用的抗體。
在一些具體實例中，在上述步驟(c)以及(d)之間進行額外的步驟以選擇不與KIR2DS4反應的抗KIR mAb。
選擇會與至少兩個不同的抑制性KIR基因產物交互反應的抗體可以藉由以兩個或更多不同抑制性KIR抗原篩選抗體來達成。在更佳的具體實例中，步驟(b)中所製備的抗體是單株抗體。所以，本文所用的術語「自該經免疫的動物製備抗體」包括自經免疫的動物取得B細胞，以及使用那些B細胞來產生會表現抗體的融合瘤，還有直接自經免疫的動物血清中取得抗體。在另一個較佳的具體實例中，步驟(c)中所選擇的抗體是與至少KIR2DL1以及KIR2DL2/3交互反應的抗體。
在另一個較佳的具體實例中，步驟(d)中所選擇的抗體會造成至少約10%由NK細胞所調控之更多專一性溶解，該NK細胞展示有至少一種抗體可辨識的KIR，較佳的至少約40%更多的專一性溶解、至少約50%更多的專一性溶解、或更佳的至少增加約70%專一性溶解(例如增加約60-100%專一性溶解)，如標準鉻釋放分析中所測得的，其係對於表現同源HLA第一型分子的標的細胞，與不含抗KIRmAb時專一性溶解相較。或者，當步驟(d)中所選擇的抗體被用於鉻釋放分析時，該分析使用表現一或一些抑制性KIR的NK細胞選殖株以及表現至少一種被NK選殖株上的一個KIR所辨識之HLA等位基因的標的細胞，用抗體所得到的細胞毒性程度應該是以相同濃度的DF200或以阻斷抗MHC第一型抗體所得到的專一性細胞毒性的至少約20%(較佳的至少約30%或更多)，在相同的作用因子：標的細胞的比例下。
上面所描之方法的步驟(c)以及(d)的順序可以改變。視需要的，該方法也可以或二者擇一地進一步包含額外的步驟：製造單株抗體的片段或單株抗體的衍生物或(例如)本文其他處所描述的片段。
在另一個變異中，本發明提供獲得抗體的方法，其包含：
(a)自資料庫(library)或庫(repertoire)中選擇與至少兩個不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物交互反應的單株抗體、單株抗體的片段、或其一的衍生物；以及
(b)選擇(a)中能夠中和表現該至少兩個不同的人類抑制性KIR2DL受體基因產物的NK細胞族群上之KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用的抗體、片段、或衍生物。
庫可以是任何其抗體或其片段的(重組)庫，視需要的由任何合適的結構(例如噬菌體、細菌、合成的複合物等等)所展示。選擇抑制性抗體的進行可以如上述以及進一步描述於實施例中。
根據已發表的結晶結構(Maenaka等人的Structure with Folding and design 1999；7：391-398；Fan等人的Nature Immunology 2001；2：452-460；Boyington等人的Nature,2000；405：537-543)，KIR2DL1、-2以及-3(KIR2DL1-3)之細胞外功能部位的電腦模擬顯示KIR2DL1、-2以及-3的一些區域涉及這些KIR和抗KIR2DL交互反應性鼠類單株抗體DF200與NKVSF1之間的交互反應。所以，在一具體實例中，本發明提供抗體，該抗體專有的與KIR2DL1中由胺基酸殘基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、以及192)所定義之區域結合。在另一個具體實例中，本發明提供與KIR2DL1以及KIR 2DL2/3結合的抗體，但不與殘基(105、106、107、108、109、110、111、127、129、130、131、132、133、134、135、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、181、以及192)所定義之區域以外的胺基酸殘基交互作用。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DL1結合，以及不與R131(即、於KIR2DL1突變株位置131的Arg殘基)係(即、以以下取代)Ala殘基的KIR2DL1突變株結合。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DL1結合但不與R157是Ala的KIR2DL1突變株結合。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DL1結合但不與R158是Ala的KIR2DL1突變株結合。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DL1的殘基131、157、以及158結合。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DS3(R131W)結合但不與野生型KIR2DS3結合。
在一特定的具體實例中，抗體專有的與KIR2DL1中胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88所定義的區域結合，其中英文字母表示胺基酸的單一字母縮寫，而數字是殘基在KIR2DL1(SEQ ID NO：23)中的位置，其係使用Wagtmann等人在Immunity 1995；2：439-449中所描述的編號系統。這些殘基已被鑑認為1-7F9 KIR2DL1抗原決定基(參見實施例11)。
在另一個具體實例中，抗體與KIR2DL1序列中的由SEQ ID NO：23之片段L38至Y88所組成的抗原性抗原決定基結合。在另一個具體實例中，抗體與包含SEQ ID NO：23片段L38至Y88之KIR2DL1序列的抗原性抗原決定基結合。
在另一個具體實例中，本發明提供抗體，該抗體與KIR2DL1以及KIR2DL2/3結合但不與由殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88所定義之區域以外的胺基酸殘基結合。
在另一個具體實例中，抗體與KIR2DL1中包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多之胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88區域結合。在一特定的具體實例中，抗體的KIR2DL1抗原決定基係包含胺基酸殘基M44以及F45(參見實施例9以及11)。
在另一個具體實例中，抗體與KIR2DL1的一區域結合，該區域包含至少1、2、4、6、8、10、或12個或所有的胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88。在一特定的具體實例中，該區域包含胺基酸殘基M44以及F45，且視需要的包含至少1、2、4、6、8、10、或所有的L38、R41、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88(參見實施例9以及11)。在另一個特定的具體實例中，該區域包含至少胺基酸殘基M44、F45、以及D72，其是在1-7F9抗原決定基以及HLA-C結合區相重疊的KIR2DL1區域中。
在另一個具體實例中，本發明提供與KIR2DL1、KIR2DL2/3、以及KIR2DS4結合的抗體。
在另一個具體實例中，本發明提供與KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者結合但不與KIR2DS4結合的抗體。
在另一個具體實例中，本發明提供與KIR2DL1以及KIR2DL2/3結合但不與KIR2DS3或KIR2DS4結合的抗體。
決定抗體、抗體片段、或抗體衍生物是否與上述所定義之抗原決定基區域之一結合可以由習於此項技藝者所知的方式來進行。參見例如實施例9以及11。在另一個此定位/定性(mapping/characterization)方法的例子中，抗KIR抗體的抗原決定基區域可以藉由抗原決定基「足跡法(foot-printing)」來決定，其對KIR2DL1或KIR2DL2/3蛋白質所曝露出來的胺/羧基化學修飾。此足跡法技術的一個特定例子是使用HXMS(用質譜儀偵測氫氘交換)，其中發生受體和配體蛋白質醯胺質子氫氘交換、結合、以及背交換(back exchange)，其中參與蛋白質結合的骨架醯胺基團被保護以免於背交換，所以會維持氘化。相關的區域可於此時被鑑認，其係藉由消化蛋白質水解法、快速微徑高效液相層析分離法、及/或電噴霧離子化質譜法。參見例如Ehring H的Analytical Biochemistry,Vol. 267(2)pp. 252-259(1999)及/或Engen,J.R.以及Smith,D.L. (2001)Anal. Chem. 73,256A-265A。另一個合適的抗原決定基鑑認技術的例子是核磁共振抗原決定基定位(NMR)，其中典型的會比較自由抗原以及複合有抗原結合胜肽(諸如抗體)之抗原在二次元NMR圖譜中的位置訊號。抗原典型的是選擇性的以15N同位素標示，使得只有關於抗原的訊號會在NMR圖譜上被看到，而沒有來自與抗原結合之胜肽的訊號。源自會與抗原結合胜肽交互反應之胺基酸抗原訊號典型的複合物圖譜相較於自由抗原的圖譜會有位置偏移，而涉及結合的胺基酸可因此被鑑認出來。參見例如Ernst Schering Res Found Workshop. 2004；(44)：149-67；Huang等人的Journal of Molecular Biology,Vol. 281(1)pp. 61-67(1998)；以及Saito和Patterson的Methods. 1996 Jun；9(3)：516-24。
抗原決定基的定位/定性也可利用質譜儀的方法來進行。參見例如Downward,J Mass Spectrom. 2000 Apr,35(4)：493-503；以及Kiselar和Downard,Anal Chem. 1999 May 1,71(9)：1792-801。
蛋白酶切割技術對於抗原決定基的定位以及鑑認也是有用的。抗原性決定基相關的區域/序列可以藉由蛋白酶切割而被決定，例如使用胰蛋白酶對KIR2DL1或KIR2DL2/3的比例約1：50，於37℃以及pH 7-8隔夜切割，然後藉由質譜法(MS)分析作胜肽鑑認。接著，被抗KIR抗體保護而免於受胰蛋白酶切割的胜肽可以被鑑認，該鑑認係藉由比較受到胰蛋白酶切割的樣本以及與抗體一起培養然後被(例如)胰蛋白酶切割(因此顯現出對於該抗體的足跡)的樣本。其他酵素像是胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等等也可以或二者擇一地被用於相似的抗原決定基定性方法中。此外，酵素切割可提供一個快速的方法以分析潛在的抗原性決定基序列是否在結合KIR的多肽中KIR2DL1區域內。如果多肽並非曝露於表面的，則該多肽較有可能是與免疫產生/抗原性無關的。相似技術的討論參見例如Manca,Ann Ist Super Sanita. 1991；27(1)：15-9。
定點突變是另一個說明結合之抗原決定基的有用技術。例如，在「丙胺酸掃描」時，蛋白質片段中的各殘基被丙胺酸殘基所取代，並測量結合親和性的結果。如果突變導致結合親和性顯著的降低，該突變處相當有可能涉及結合作用。對結構上的抗原決定基有專一性的單株抗體(即不與未摺疊的蛋白質結合的抗體)可被用來證實丙胺酸取代沒有影響蛋白質整體的摺疊。參見例如Clackson以及Wells,Science 1995；267：383-386；以及Wells,Proc Natl Acad Sci USA 1996；93：1-6。
電子顯微鏡也可以被用於作抗原決定基的「足跡」。例如Wang等人在Nature 1992；355：275-278合併使用冷凍電子顯微鏡術、三次元影像重建術、以及X射線結晶學來決定天生豇豆嵌紋病毒外殼(capsid)表面上的Fab片段物理足跡。
抗原決定基評估的其他形式之「無標示」分析包括表面電漿共振(SPR,BIACORE)以及反射干擾光譜學(RifS)。參見例如Fgerstam等人的Journal Of Molecular Recognition 1990；3：208-14；Nice等人的J. Chromatogr. 1993；646：159-168；Leipert等人的Angew. Chem. Int. Ed. 1998；37：3308-3311；Krger等人的Biosensors and Bioelectronics 2002；17：937-944。
抗體片段以及衍生物
本發明抗體的片段以及衍生物(在本文中以術語「抗體(antibody)」以及「抗體(antibodies)」來涵蓋，除非另有指明或明顯與上下文矛盾)，較佳的是類1-7F9或類1-4F1抗體，可以藉由技藝中已知的技術來產生。「免疫反應性片段」包含完整抗體的一部分，通常是抗原結合區或可變區域。抗體片段的例子包括「加巴體(kappa bodies)」(參見例如Ill等人的Protein Eng 10：949-57(1997))以及「janusins」(在本文其他地方會進一步描述)。Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab)2、F(ab')2、dAb(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；基本上由VH功能部位所組成)、Fd(基本上由VH以及CH1功能部位所組成)、以及Fv(基本上由VL以及VH功能部位所組成)片段；微型雙功能抗體(diabodies)；加巴體；以及janusins。例如，抗體片段包括一級結構是由連續胺基酸殘基的不間斷序列所組成之多肽(在本文稱為「單鏈抗體片段」或「單鏈多肽」)，其包括但不限於(1)單鏈Fv(scFv)分子；(2)只含有一個輕鏈可變功能部位的單鏈多肽，或含有輕鏈可變功能部位的三個CDR而沒有相關的重鏈部分的片段；以及(3)只含有一個重鏈可變區域的單鏈多肽，或含有重鏈可變區域的三個CDR而沒有相關的輕鏈部分的片段；以及形成自抗體片段的多重專一性抗體。例如，Fab或F(ab’)2片段可以根據習知的技術將經分離的抗體蛋白酶切割而產生。
吾人可理解，免疫反應性片段可以用已知的方法修改，例如體內緩慢清除並獲得更理想的醫藥動力學模式。例如，片段可以用聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙基化多元醇修改。偶合以及點專一的將PEG結合至Fab’片段的方法描述在例如Leong等人的Cytokine 16(3)：106-119(2001)以及Delgado等人的Br. J. Cancer 73(2)：175-182(1996)，其揭示併入本文作為參考。
在一特定方面，本發明提供抗體、抗體片段、以及抗體衍生物，其含有1-7F9或1-4F1的輕鏈及/或重鏈可變區域序列，如圖14。在另一方面，本發明提供抗體、抗體片段、以及其衍生物，其包含1-7F9或1-4F1之一或更多的輕鏈及/或重鏈可變區域CDR，如圖15或前述。此序列的功能性變異體/相似物可藉由使用標準技術在這些揭示的胺基酸序列中進行合適的取代、添加、及/或刪除來產生，可輔以序列比較。從1-7F9/KIR2DL1複合物以及KIR2DL1/MHC第一型複合物(Fan等人，Nat. Immunol. 2001；2：452-460)，PDB-編碼1IM9結晶結構的重疊，可推斷1-7F9的scFv衍生物能夠阻斷MHC第一型與KIR2DL1結合。此外，當與KIR2DL1結合時，1-7F9的單L-鏈或1-7F9的單一VL功能部位會阻斷MHC第一型的結合。
此序列的功能性變異體/相似物可藉由使用標準技術在這些揭示的胺基酸序列中進行合適的取代、添加、及/或刪除來產生，可輔以序列比較。在另一方面，當殘基是存在於其中一個這些抗體的序列中而不在另一個時，該位置可適合被刪除、取代、及/或插入。
或者，編碼有本發明抗體(諸如類1-7F9或類1-4F1抗體)的DNA可以被修改以編碼有本發明的片段。然後，經修改的DNA被插到表現載體中並用於轉型或轉染一適當的細胞，然後表現出想要的片段，如本文其他處所述。
在一替代的具體實例中，產生本發明鼠類抗體(諸如類DF200抗體)之融合瘤DNA可以在被插入表現載體之前就經修改，例如用編碼有人類重鏈以及輕鏈固定功能部位的序列取代同源的非人類序列(如例如Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,81,pp. 6851(1984)所述)。在另一個具體實例中，編碼有本發明抗體的可變區域可藉由重組DNA工程與編碼免疫球蛋白的序列全部或部分編碼有非免疫球蛋白多肽的序列連接在一起。藉此，可製備具有原始抗體之結合專一性的「嵌合的」或「雜交的」抗體。典型的，此非免疫球蛋白多肽取代了本發明抗體的固定功能部位。
所以，根據另一個具體實例，本發明的抗體(較佳的是類DF-200抗體)是人化的。根據本發明之「人化」形式的抗體是專一嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、或其他與抗原結合的抗體次序列)，其含有最少的源自鼠類免疫球蛋白序列。大多時候，人化抗體是人類免疫球蛋白(接受者的抗體)，其中來自接受者互補決定區域(CDR)的殘基被來自原始抗體(捐者抗體)CDR的殘基取代，維持原始抗體理想的專一性、親和性、以及能力。在一些例子中，人類免疫球蛋白的Fv框架殘基可以被相應的非人類殘基取代。此外，人化抗體可包含沒有在接受者抗體或在引進的CDR或框架序列中出現的殘基。造成這些修飾是為了進一步改善以及最適化抗體的表現。通常，人化抗體會包含實質上所有至少一個(以及典型的兩個)可變功能部位，其中所有的或實質上所有的CDR區域是相應於原始抗體的CDR區域，且所有的或實質上所有的FR區域是人類免疫球蛋白一致序列的那些。人化抗體理想上也包含至少一部分的免疫球蛋白固定區域(Fc)，典型的是人類免疫球蛋白的。進一步細節參見Jones等人，Nature,321,pp. 522(1986)；Reichmann等人，Nature,332,pp. 323(1988)；以及Presta,Curr. Op. Struct. Biol.,2,pp. 593(1992)。
人化本發明之抗體的方法是技藝中所熟知的。通常，根據本發明的人化抗體具有一或更多個胺基酸殘基從原始抗體被置入其中。這些鼠類或其他非人類胺基酸殘基通常稱為「引進的」殘基，其典型的是得自「引進的」可變功能部位。人化可以基本上由根據Winter以及共事者的方法來進行(Jones等人，Nature,321,pp. 522(1986)；Riechmann等人，Nature,332,pp. 323(1988)；Verhoeyen等人，Science,239,pp. 1534(1988))。所以，此「人化」抗體是嵌合抗體(Cabilly等人，美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於一完整的人類可變功能部位是被來自原始鼠類抗體之相應序列所取代的。實施時，根據本發明的人化抗體典型的是人類抗體，其中一些CDR殘基以及也許一些FR殘基是被來自原始鼠類抗體相似區域的殘基所取代。
為了減少抗原性，選擇人類可變功能部位(輕以及重兩者)以用於製造人化抗體是非常重要的。根據所謂的「最適(best-fit)」法，本發明抗體之可變功能部位的序列是由整個已知的人類可變功能部位序列庫篩選的。最接近鼠的人類序列被接受成為人化抗體的人類框架(FR)(Sims等人，J. Immunol.,151,pp. 2296(1993)；Chothia以及Lesk,J. Mol. Biol.,196,pp. 901(1987))。另一個方法係使用來自特定輕鏈或重鏈亞群之所有人類抗體一致序列的特定框架。相同的框架可被用於一些不同的人化抗體(Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,89,pp. 4285(1992)；Presta等人，J. Immunol.,51,pp. 1993))。
更重要的是，人化抗體仍對多個抑制性KIR受體保留高度的親和性以及保留其他有利的生物性質。為了達到這個目標，根據一較佳的方法，人化抗體係藉由親代序列以及各種概念上的人化產物的分析方法來製備，其使用親代以及人化序列的三次元模型。三次元免疫球蛋白模型對熟習此項技藝者而言是常可獲得的且熟悉的。有電腦程式可說明及展示所選之候選免疫球蛋白序列可能的三次元構形結構。審視這些展示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中可能的角色，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。藉此，可自一致且引進的序列中選擇FR殘基並將之結合，以達到想要的抗體特徵，諸如增加對標的抗原的親和性。通常，CDR殘基是直接的且最實質上涉及影響抗原的結合。
如上述，製造人類單株抗體的方法是使用XenoMouse(Abgenix,Fremont,CA)作為免疫的鼠。XenoMouse是根據本發明的鼠類宿主，其免疫球蛋白基因已被功能性人類免疫球蛋白基因所取代。因此，產生自此鼠的或由此鼠B細胞製得之融合瘤中的抗體已被人化。XenoMouse被描述於美國專利第6,162,963號，在此併入作為參考。相似的方法可以用HuMAb-鼠TM (Medarex)達成。
人類抗體可也根據各種其他技術來產生，諸如使用其他已被基因工程以表現人類抗體庫的基因轉殖動物於免疫(Jakobovitz等人，Nature 362(1993)255)，或藉由使用噬菌體展示方法選擇抗體庫來產生。此技術是係此項技藝者所熟知的，且可以如本申請案所揭示從單株抗體利用起。
本發明的抗體(較佳的是類1-7F9或類1-4F1抗體)也可以衍生成「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中部分重鏈及/或輕鏈是與原始抗體相應的序列一致或同源，而鏈的剩餘部分是與源自另一個物種或屬於另一個抗體類別或亞類別之抗體及此抗體片段之相應序列一致或同源，只要其展現想要的生物活性(Cabilly等人，如前述；Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,81,pp. 6851(1984))。
其他涵蓋在本發明範疇中的衍生物包括功能化抗體，即與毒素諸如蓖麻毒蛋白(ricin)、白喉毒素、相思豆毒素(Abrin)以及綠膿桿菌外毒素接合或共價結合的抗體，或與治療上的放射性核素諸如(例如)90Y或131I接合或共價結合；與可測得的部分諸如螢光部分、診斷放射性同位素或顯影藥劑接合或共價結合；或與固體支持物諸如洋菜膠珠粒或相似者接合或共價結合。將這些其他藥劑與抗體接合或共價結合的方法是技藝中所熟知的。
與毒素接合對於NK細胞的標的性毒殺作用是有用的，該NK細胞係在其細胞表面展示了其中一種交互反應的KIR受體。一旦本發明的抗體與此細胞的細胞表面結合，就會被內化且毒素會釋放到細胞內部，選擇性的殺死該細胞。此用途是本發明另一個具體實例。
與可測得的部分接合對於將本發明的抗體用於診斷目的是有用的。此目的包括但不限於分析生物樣本中是否存在有細胞表面具有交互反應之KIR的NK細胞，以及偵測活生物中是否存在有具有交互反應KIR的NK細胞。此分析以及偵測方法也是本發明的另一個具體實例。
將本發明的抗體與一固體支持物接合可有效作為自一來源(諸如生物液)親和性純化出細胞表面具有交互反應性KIR之NK細胞的工具。此純化方法是本發明的另一個具體實例，所得到的經純化之NK細胞族群也是。
醫藥組成物以及應用
本發明也提供包含人類的或人化的抗體、或其片段及衍生物之醫藥組成物，其中該抗體、片段或衍生物與NK細胞表面至少兩抑制性KIR受體交互反應、減少或中和其抑制訊號並誘發該些細胞的活性，在任何合適的基礎劑中以有效的量來對患者或含有NK細胞生物之樣本可測得的誘發NK細胞的細胞毒性。用於本發明之包含人類或人化抗KIR mAb的醫藥組成物(視需要的含有另一個活性藥劑)可以根據習知技術與醫藥上可接受的載劑或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑調配在一起，該技術係諸如那些揭示在Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第19版,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995者。組成物可以習知的形式存在，例如膠囊、錠劑、氣霧劑、溶液或懸浮液、或冷凍乾燥粉末。
所以，本發明的一方面係提供包含人類或人化抗體、或其片段或衍生物的醫藥調配物，其係以自1毫克/毫升至500毫克/毫升的濃度存在，且其中該調配物具有pH自2.0至10.0。調配物可進一步包含一緩衝液系統、保存劑、張力劑、螯合劑、安定劑以及界面活性劑。在一本發明的具體實例中，醫藥調配物是水性調配物，即調配物包含水。此調配物典型的是溶液或懸浮液。在一本發明的進一步具體實例中，醫藥調配物是水性溶液。本文所用的術語「水性調配物」是包含至少50%w/w水的調配物。同樣的，術語「水性溶液」是包含至少50%w/w水的溶液，以及術語「水性懸浮液」是包含至少50%w/w水的懸浮液。
在另一個具體實例中，醫藥調配物是冷凍乾燥的調配物，在使用前醫生或患者添加溶劑及/或稀釋劑於其中。
在另一個具體實例中，醫藥調配物是乾燥的調配物(例如冷凍乾燥或噴霧乾燥)，是即時可用不需任何預先的溶解。
在一進一步方面，本發明係關於包含本文所述之抗體的水性溶液以及緩衝液的醫藥調配物，其中該抗體是以自1毫克/毫升或以上的濃度存在，且其中該調配物具有pH自約2.0至約10.0。
在另一個具體實例中，調配物的pH是選自由2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、以及10.0所組成之列。
在一進一步具體實例中，緩衝液是選自由醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、以及三羥甲基氨基甲烷、二羥乙甘胺酸、三羥甲基甘胺酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、丁烯二酸、酒石酸、天門冬胺酸或其混合物所組成的族群。各個這些特定的緩衝液構成本發明另外的具體實例。
在一進一步具體實例中，調配物也包含醫藥上可接受的保存劑。在另一個具體實例中，保存劑是選自酚、o-甲酚、m-甲酚、p-甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、三氯叔丁醇、以及硫柳汞(thiomerosal)、布羅包爾(bronopol)、苯甲酸、咪唑烷脲(imidurea)、氯己啶、脫氫醋酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、陽性皂(benzethonium chloride)、chlorphenesine(3p-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)或其混合物所組成的族群。在一具體實例中，保存劑是以自0.1毫克/毫升至20毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，保存劑是以自0.1毫克/毫升至5毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，保存劑是以自5毫克/毫升至10毫克/毫升的濃度存在。在又另一個具體實例中，保存劑是以自10毫克/毫升至20毫克/毫升的濃度存在。各個所列的特定保存劑構成本發明另外的具體實例。雖然在醫藥組成物中使用保存劑是習此項技藝者所熟知的；為了方便，可以參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在一進一步的具體實例中，調配物也包含等張劑。在一具體實例中，等張劑是選自由鹽(例如氯化鈉)、糖、糖醇、胺醣、胺基酸(例如、L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、羥丁胺酸)、醛醣醇(例如甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、以及聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物所組成之族群。任何合適的糖都可以被使用，包括但不限於單-、雙-、或聚糖；以及水溶性聚葡萄糖，諸如(例如)果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、類糊精(dextran)、聚三葡萄糖、糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥乙基澱粉以及羥甲基纖維素鈉。在一具體實例中，糖類添加物是蔗糖。糖醇是定義為C4-C8具有至少一個-OH基團的碳水化合物，及包括(例如)甘露醇、山梨醇、環己六醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇、以及阿拉伯膠醇。在一具體實例中，糖醇添加物是甘露醇。上述的糖類或糖醇可以單獨使用或組合使用。沒有固定的使用量，只要糖類或糖醇可溶於液體製劑中且不會負面影響使用本發明方法所達成的安定功效即可。在一具體實例中，糖類或糖醇的濃度是介於約1毫克/毫升以及約150毫克/毫升之間。在另一個具體實例中，等張劑是以自1毫克/毫升至50毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，等張劑是以自1毫克/毫升至7毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，等張劑是以自8毫克/毫升至24毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，等張劑是以自25毫克/毫升至50毫克/毫升的濃度存在。各個上述所列的特定等張劑組成了本發明另外的具體實例。雖然於醫藥組成物中使用等張劑是熟習此項技藝者所熟知的；為了方便，可以參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在進一步具體實例中，調配物也包含螯合劑。在一具體實例中，螯合劑是選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、以及天門冬胺酸的鹽類、以及其混合物。在另一個具體實例中，螯合劑是以自0.1毫克/毫升至5毫克/毫升的濃度存在。在另一個具體實例中，螯合劑是以自0.1毫克/毫升至2毫克/毫升的濃度存在。在本發明進一步的具體實例中，螯合劑是以自2毫克/毫升至5毫克/毫升的濃度存在。各個這些特定的螯合劑組成了本發明另外的具體實例。雖然於醫藥組成物中使用螯合劑是熟習此項技藝者所熟知的。為了方便，可以參照The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在進一步具體實例中，調配物也包含安定劑。雖然於醫藥組成物中使用安定劑是熟習此項技藝者所熟知的；為了方便，可以參照The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本發明的組成物可以(例如)是經安定化的液體醫藥組成物，其治療上活性成分包括多肽，其可能會在儲存時於液體醫藥調配物中有聚集物形成。「聚集物形成」是指多肽分子之間的物理交互反應導致形成可維持可溶性的寡聚合物，或從溶液中沉澱出來之大的可見的聚集物。「在儲存時」是指液體醫藥組成物或調配物一旦配製好之後，沒有立即給藥給個體。反之，製備之後，其被包裝成液體形式、冷凍狀態、或乾燥形式(於後重建成合適於施用給個體的液體形式或其他形式)以儲存。「乾燥形式」是指液體醫藥組成物或調配物是藉由冷凍乾燥(即冷凍乾燥法；參見例如Williams以及Polli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59)、噴霧乾燥(參見Masters(1991)在Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical,Essez,U.K.),pp. 491-676；Broadhead等人(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；以及Mumenthaler等人(1994)Pharm. Res. 11：12-20)、或空氣乾燥(Carpenter以及Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；以及Roser(1991)Biopharm. 4：47-53)來乾燥者。液體醫藥組成物儲存時因多肽而形成的聚集物可負面的影響該多肽的生物活性，造成醫藥組成物治療上效果損失。此外，聚集物形成可造成其他問題，諸如使用注入系統施用含有多肽的醫藥組成物時會阻斷管道、膜、或泵。
本發明的醫藥組成物也可包含胺基酸鹼，其含量係足以在組成物儲存時降低因多肽而形成聚集物。「胺基酸鹼」是指胺基酸或胺基酸的組合，其中任何指定的胺基酸是以自由鹼形式或其鹽形式存在。當使用胺基酸組合時，所有的胺基酸可以其自由鹼形式存在，所有的都可以其鹽形式存在，或一些可以其自由鹼而其他的以其鹽形式存在。在一具體實例中，用於製備本發明組成物的胺基酸是帶有電荷支鏈的胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、以及麩胺酸。特定胺基酸(例如甲硫胺酸、組胺酸、咪唑、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天門冬胺酸、色胺酸、羥丁胺酸以及其混合物)的任何立體異構物(即L、D、或其混合物)或這些立體異構物的組合可存在於本發明的醫藥組成物中，只要該特定胺基酸是以其自由鹼形式或其鹽形式存在。在一具體實例中係使用L-立體異構物。本發明的組成物也可以用這些胺基酸的類似物來調配。「胺基酸類似物」是指天然產生之胺基酸的衍生物，其會引起想要的功效，在本發明液體醫藥組成物儲存時會減少因多肽而形成的聚集物。合適的精胺酸類似物包括(例如)胺基胍、鳥胺酸以及N-單乙基L-精胺酸，合適的甲硫胺酸類似物包括乙硫胺酸(ethionine)以及丁硫胺酸(buthionine)，以及合適的半胱胺酸類似物包括S-甲基-L半胱胺酸。至於其他胺基酸，胺基酸類似物是以其自由鹼形式或其鹽形式併入組成物中的。在本發明進一步的具體實例中，胺基酸或胺基酸類似物所用的濃度是足以防止或延遲蛋白質聚集的濃度。
在一進一步的具體實例中，當作為治療藥劑的多肽是包含至少一個可能會受到此種氧化作用的甲硫胺酸殘基的多肽時，可以添加甲硫胺酸(或其他含硫胺基酸或胺基酸類似物)以抑制甲硫胺酸殘基氧化成甲硫胺酸亞碸。「抑制」是指經過一段時間最少的經氧化之甲硫胺酸種類累積。抑制甲硫胺酸氧化會使得多肽維持其較適分子形式較久。任何甲硫胺酸的立體異構物(L或D)或其組合都可以被使用。添加量必須足以抑制甲硫胺酸殘基的氧化，使得甲硫胺酸亞碸的量對管理機構而言是可接受的。典型的，這是指組成物含有不大於約10%至約30%的甲硫胺酸亞碸。通常，可以藉由添加甲硫胺酸來達成，使所添加的甲硫胺酸對甲硫胺酸殘基的比例為自約1：1至約1000：1，諸如10：1至約100：1。
在一進一步的具體實例中，調配物也包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物的安定劑。在一具體實例中，安定劑是選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L以及HPMC)、環糊精、含硫有物質如單硫甘油、硫醇基乙酸以及2-甲基硫基乙醇、以及不同的鹽(例如氯化鈉)。各個這些特定的安定劑構成本發明的另外具體實例。
醫藥組成物也可包含額外的安定劑，進一步增進當中治療上活性多肽的安定性。本發明尤其關注的安定劑包括但不限於甲硫胺酸以及EDTA，可保護多肽不被甲硫胺酸氧化，以及非離子界面活性劑，可保護多肽於冷凍解凍或機械剪切時不聚集。
在一進一步的具體實例中，調配物也包含界面活性劑。在一具體實例中，界面活性劑係選自清潔劑、乙氧基化的蓖麻油、聚乙二醇化的甘油酯、乙醯化的單甘酯、脂肪酸山梨醇酐酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯阻斷聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)諸如PluronicF68、泊洛沙姆188以及407、Triton X-100)、聚氧乙烯脂肪酸山梨醇酐酯、聚氧乙烯以及聚氧乙烯衍生物諸如烷化和烷氧化衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80以及Brij-35)、單甘酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇類、甘油、凝集素以及磷脂質(例如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯環己六醇、二磷脂醯甘油以及神經鞘磷脂)、磷脂質衍生物(例如二棕櫚醯磷脂酸)以及溶血磷脂質(例如棕櫚酸溶血磷脂醯-L-絲胺酸以及乙醇胺、膽鹼、絲胺酸或羥丁胺酸的1-醯基-sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂醯和磷脂醯膽鹼的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧(烷基醚)衍生物例如溶血磷脂醯膽鹼的月桂酸基以及荳蔻酸基衍生物、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、以及極性基團的修飾、膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲胺酸、羥丁胺酸、甘油、環己六醇、以及帶正電DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂醯絲胺酸以及溶血磷脂醯羥丁胺酸、和甘油磷脂質(例如腦磷脂)、甘油糖脂(例如galactopyransoide)、抱合醣脂質(例如腦醯胺、神經節苷脂)、十二烷基磷脂醯膽鹼、雞蛋溶血卵磷脂、褐黴菌酸衍生物(例如sodium tauro-dihydrofusidate等等)、長鏈脂肪酸及其鹽C6-C12(例如油酸以及辛酸)、醯基肉鹼以及衍生物、離胺酸、精胺酸或組胺酸的Nα-醯化衍生物、或離胺酸或精胺酸的支鏈醯化衍生物、包含離胺酸、精胺酸或組胺酸以及中性或酸性胺基酸任何組合之雙肽的Nα-醯化衍生物、包含中性胺基酸以及兩個帶電胺基酸任何組合之三肽的Nα-醯化衍生物、DSS(多庫酯鈉，CAS編號[577-11-7])，多庫酯鈣，CAS編號[128-49-4])，多庫酯鉀，CAS編號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或十二烷硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸以及其鹽和甘胺酸或牛磺酸共軛物、熊去氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、牛膽酸鈉、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)一價界面活性劑、兩性離子界面活性劑(例如N-烷基-N,N-二甲基銨基-1-丙磺酸鹽、3-cholamido-1-丙基二甲基銨基-1-丙磺酸鹽、陽離子界面活性劑(四級銨基)(例如十六烷基三甲基溴化銨、氯化十六烷基吡啶)、非離子界面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃葡糖苷)、保麗視明(poloxamine)(例如Tetronic’s)，衍生自相繼將環氧丙烷以及環氧乙烷添加至乙二胺中的四功能性阻斷共聚合物，或者界面活性劑可以選自咪唑咻衍生物、或其混合物。各個這些特定的界面活性劑是本發明另外的具體實例。
雖然於醫藥組成物中使用界面活性劑是熟習此項技藝者所熟知的；為了方便，可以參照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在一進一步具體實例中，調配物也包含蛋白酶抑制劑諸如EDTA(乙二胺四乙酸)以及苯甲脒HCl，雖然其他商業上可獲得的以及合適的蛋白酶抑制劑可也被使用。使用蛋白酶抑制劑尤其對包含蛋白酶前驅酵素的醫藥組成物有用，以抑制自動催化。
其他成分也可存在於本發明的醫藥調配物中。額外的成分可包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、增體劑、張力修飾劑、螯合劑、金屬離子、油質基礎劑、蛋白質(例如人類血清白蛋白、凝膠或蛋白質)以及兩性離子(例如胺基酸諸如甜菜鹼、牛磺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸以及組胺酸)。此額外成分較佳的不會負面影響本發明醫藥調配物的整體安定性。
含有根據本發明之抗體的醫藥組成物可以被給藥到需要此治療之患者的許多部位中，例如局部區域如皮膚以及黏膜區，於越過(bypass)吸收作用的區域，例如給藥在動脈、靜脈、心臟，以及涉及吸收作用的區域，例如給藥在皮膚、皮膚下、肌肉或腹部。
根據本發明的醫藥組成物可以經由許多方式：例如舌、舌下、頰、經口、口服、胃以及腸、鼻、肺、例如經由細支氣管和肺泡或其組合、表皮、皮的、皮膚、陰道、直腸、眼睛、例如經由結膜、輸尿管、以及非經腸給藥給需要此治療的患者。
本發明的組成物可以許多劑量形式給藥，例如溶液、懸浮液、乳劑、微乳劑、複合型乳劑、泡沫、軟膏、糊劑、膏藥、油膏、錠劑、經包覆的錠劑、洗劑、膠囊例如硬明膠膠囊以及軟性明膠膠囊、栓劑、直腸栓劑、滴劑、凝膠、噴劑、粉末、噴霧劑、吸入劑、眼部滴劑、眼部油膏、眼部洗劑、陰道栓劑、陰道環、陰道油膏、注射液、原位轉型溶液例如原位凝膠、原位設置、原位沉澱、原位結晶、注入液、以及植入物。
本發明的組成物可例如透過共價、疏水以及靜電交互反應進一步與藥物載劑、藥物遞送系統以及進一步的藥物遞送系統化合在一起或與之連結，以進一步增進抗體的安定性、增加生物可利用性、增加溶解性、降低副作用、達成熟習此項技藝者所熟知的時間療法、以及增加患者順從性或任何其組合。載劑、藥物遞送系統以及進一步藥物遞送系統的例子包括但不限於聚合物例如纖維素以及衍生物、多醣類例如類糊精以及衍生物、澱粉以及衍生物、聚乙烯醇、丙烯酸以及丙烯酸甲酯聚合物、聚乳酸以及聚羥基乙酸以及其阻斷共聚合物、聚乙二醇、載劑蛋白質例如白蛋白、凝膠例如熱凝膠系統、例如熟習此項技藝者所熟知的阻斷共聚合物系統、微胞、脂質體、微球、奈米微粒、液體結晶以及其分散懸劑、L2相以及其分散懸劑、熟習此項技藝者所熟知的液體-水系統中的相變化、聚合微胞、複合型乳劑、自乳化、自微乳化、環類糊精以及其衍生物、和樹枝狀聚合物。
本發明的組成物有益於調配用於肺給藥抗體之固體、半固體、粉末以及溶液，其係使用例如定劑量吸入器、乾燥粉末吸入器以及噴霧器，都是熟習此項技藝者所熟知的裝置。
本發明的組成物尤其有益於調配控制的、維持的、延長的、延遲的、以及緩慢的釋放藥物遞送系統。尤其(但不限於)，組成物係有益於調配熟習此項技藝者所熟知的非經腸的控制釋放以及維持釋放系統(兩系統使給藥的次數減少數倍)。更佳的是控制釋放以及維持釋放系統是以皮下給藥。有用的控制釋放系統以及組成物的例子是(不限制本發明的範圍)水凝膠、油質凝膠、液體結晶、聚合微胞、微球、奈米微粒。
產生有益於本發明組成物之控制釋放系統的方法包括但不限於結晶法、濃縮法、共結晶法、沉澱法、共沉澱法、乳化法、分散懸劑法、高壓均質法、包埋法、噴霧乾燥法、微包埋法、凝聚法、相分離法、溶劑蒸發以產生微球、擠壓法以及超臨界流體製程法。一般可參照Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise,D.L.,ed. Marcel Dekker,New York,2000)以及Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99：Protein Formulation and Delivery(MacNally,E.J.,ed. Marcel Dekker,New York,2000)。
非經腸的給藥可以藉由皮下、肌肉內、腹腔或靜脈注射，透過注射器注射的方式，視需要的是筆狀注射。或者，非經腸的給藥可以藉由注入泵的方式。進一步選擇是組成物可以是溶液或懸浮液，以用於鼻部或肺部噴霧的形式給藥抗體。另一個選擇是，含有本發明抗體的醫藥組成物也可以被調整成皮膚給藥，例如藉由無針注射或貼片，視需要的是離子電滲貼片，或黏膜例如頰給藥。
抗體可以在一基礎劑(如溶液、懸浮液或乾燥粉末)中經由肺的途徑被給藥，使用任何合適肺部藥物遞送的已知種類的裝置。這些例子包含但不限於三種常見種類的用於肺部藥物遞送的氣霧產生，且可包括噴氣式或超音波式噴霧器、定劑量吸入器、或乾燥粉末吸入器(Cf. Yu J,Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
根據標準化的測試方法學，粒子的氣動直徑(da)是定義為單位密度(1克/立方公分)的參照之標準球狀顆粒的幾何當量直徑。在最簡單的例子中，以球狀顆粒來說，da是與參考直徑(d)相關，是密度比之平方根的函數，如下所述：
對於非球狀顆粒則需對此關係式做修飾(cf. Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。術語「MMAD」以及「MMEAD」在技藝中已被詳述且係已知的(cf. Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R且表現了氣動顆粒大小分布的中值量測。近來在肺部藥物遞送使用大的、孔狀的吸入顆粒有所進步。J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。質量中位數氣動粒徑(MMAD)以及質量中位數有效氣動粒徑(MMEAD)係互換使用，是統計參數，且依經驗描述氣霧顆粒的大小與其儲存在肺部之潛力的相關性，與實際形狀、大小、或密度無關，參見Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。MMAD通常是計算自撞擊器(impactor)(測量顆粒在空氣中慣性動作的儀器)的量測。
在一進一步具體實例中，調配物可以藉由任何已知的氣霧化技術(諸如霧化)氣霧化，以使氣霧化顆粒的MMAD少於10微米，更佳的是介於1-5微米，以及最佳的是介於1-3微米。較佳的顆粒大小是根據最效的遞送藥物至肺部深處的大小，其中蛋白質最適的是被吸收(cf. Edwards DA,Ben-Jebria A,Langer A,Recent advances in pulmonary drug delivery using large,porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。
可視需要的進一步用吸入技術(例如但不限於：緩慢吸入流(例如30公升/分鐘)、屏住呼吸以及行動之計時)修改來最適化包含抗體的肺調配物之肺部深處沉積。
術語「安定化的調配物」係指增加的物理安定性、增加的化學安定性或增加的物理以及化學安定性的調配物。
本文所用的術語蛋白質調配物的「物理安定性」係指當蛋白質曝露於熱-機械應力及/或與不安定的界面和表面(諸如疏水表面及界面)交互反應時，蛋白質形成生物不活性及/或不可溶性蛋白質聚集物的傾向。水性蛋白質調配物的物理安定性是藉由在不同溫度不同時間長度下，使放在合適容器(例如匣或瓶)中的調配物受到機械/物理應力(例如攪拌)，然後以視覺檢驗及/或濁度測量的方式來評估的。調配物的視覺檢驗是在一暗色背景以敏銳的聚光來進行的。調配物的濁度係特徵在於藉由視覺評分濁度等級，例如級別自0至3(沒有顯現濁度的調配物相當於視覺評分為0，而在日光下顯現視覺濁度的調配物相當於視覺評分為3)。當調配物在日光下顯現視覺濁度時，有蛋白質聚集，該調配物被認為是物理上不安定的。或者，調配物的濁度可以被藉由熟習此項技藝者所熟知的簡單的濁度測量來評估。水性蛋白質調配物的物理安定性也可以藉由使用光譜劑或蛋白質構形狀態的探針來評估。探針較佳的是優先與蛋白質之非天生構型結合的小分子。蛋白質結構的小分子光譜探針的一個例子是硫磺素T。硫磺素T是螢光染劑，已被廣泛用於偵測澱粉樣纖維蛋白。在纖維蛋白(以及也許有其他蛋白質結構)的存在下，當硫磺素T與纖維蛋白形式結合時，硫磺素T會於約450奈米產生出新的激發極大值以及於約482奈米有增強的發射。未結合的硫磺素T在該波長基本上是非螢光的。
其他的小分子可被作為蛋白質結構從天生變成非天生狀態的探針。例如「疏水區」探針優先與蛋白質之曝露的疏水區結合。疏水區通常被埋在蛋白質天生狀態的三級結構中，但會在當蛋白質開始展開或變性時被曝露出來。這些小分子、光譜探針的例子是芳香族、疏水性染劑，諸如蒽、吖啶、菲羅啉(phenanthroline)或相似者。其他的光譜探針是金屬-胺基酸複合物，諸如疏水胺基酸(諸如苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、以及纈胺酸、或相似者)的鈷金屬複合物。
本文所用的術語蛋白質調配物的「化學安定性」係指蛋白質結構中化學共價的改變，導致化學降解產物的生成，與天生蛋白質結構相較，該產物具有可能較低的生物效力及/或可能增加的免疫原性。根據天生蛋白質的本質以及種類和蛋白質所處的環境，可形成各種化學降解產物。如熟習此項技藝者所熟知的，消除化學降解極可能無法被完全避免掉，而且常可在蛋白質調配物儲存以及使用時看到化學降解產物的量增加。大部分蛋白質有易於脫醯胺的傾向，這是一個麩醯胺基或天門冬醯胺基殘基中的支鏈醯胺基團水解形成自由羧酸的過程。其他的降解路徑涉及到高分子量轉型產物的形成，其中兩個或更多個蛋白質分子是透過轉醯胺作用及/或雙硫交互反應而彼此共價結合，導致形成共價結合的二聚體、寡聚合物以及聚合物降解產物(Stability of Protein Pharmaceuticals,Ahern. T.J. & Manning M.C.,Plenum Press,New York 1992)。氧化(例如甲硫胺酸殘基的氧化)可以被認為是化學降解的另一個變化型。可以藉由在曝露於不同環境條件後於各時間點測量化學降解產物的量來評估蛋白質調配物的化學安定性(通常可以藉由例如增加溫度來加速降解產物的形成)。各個個別的降解產物之量通常是藉由使用各種層析技術(例如SEC-HPLC及/或RP-HPLC)依據分子大小及/或帶電性分離降解產物來決定的。
所以，如上所述，「安定化的調配物」係指具有增加之物理安定性、增加之化學安定性或增加之物理以及化學安定性的調配物。通常，調配物必須在使用以及儲存(依照所建議的使用及儲存條件)時是安定的，直到到達保存期限。
在本發明的一個具體實例中，含有抗體的醫藥調配物可安定的使用超過6星期以及保存超過3年。
在本發明的另一個具體實例中，含有抗體的醫藥調配物可安定的使用超過4星期以及保存超過3年。
在本發明進一步具體實例中，含有抗體的醫藥調配物可安定的使用超過4星期以及保存超過2年。
在本發明更進一步的具體實例中，含有抗體的醫藥調配物可安定的使用超過2星期以及保存超過2年。
所以，如上所述，可用於這些組成物中的醫藥上可接受的載劑包括但不限於離子交換劑；鋁；硬脂酸鋁；卵磷脂；血清蛋白質諸如人類血清白蛋白；緩衝物質諸如磷酸及甘胺酸；山梨酸；山梨酸鉀；飽和的植物性脂肪酸的部分甘油酯混合物；水；鹽或電解質諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、以及鋅鹽；矽酸膠；三矽酸鎂；聚乙烯吡咯烷酮；纖維素為基的物質；聚乙二醇；羧甲基纖維素鈉；聚丙烯酸酯；蠟；聚乙烯-聚丙烯-阻斷聚合物；聚乙二醇；以及羊毛脂。
本發明的組成物可以被用於誘發患者或生物樣本中NK細胞活性的方法中。本方法包含將該組成物與該患者或生物樣本接觸的步驟。此方法在診斷以及治療目的上是有用的。
當用於生物樣本時，抗體組成物可根據樣本的本質(液體或固體)藉由簡單的混合或直接施用於樣本而被使用。生物樣本可在任何合適的裝置(平盤、小袋、燒瓶等等)中直接與抗體接觸。當用於患者時，組成物必須經調配以給藥於患者。
如上所述，本發明的組成物可以經由口、非經腸的、藉由吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、經頰、經陰道或經植入的儲囊來給藥。本文所用的術語「非經腸的」包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、關節滑液內、胸骨內、椎管內、肝內、病灶內以及顱內注射或注入技術。較佳的，組成物是經口、腹腔或靜脈給藥。
本發明組成物之無菌的可注射形式可以是水性或油性懸浮液。這些懸浮液可以根據技藝中已知的技術來配製，使用合適的分散劑或潤濕劑以及懸浮劑。無菌的可注射製劑也可以是在無毒之非經腸的可接受之稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如是1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受之基礎劑以及溶劑是水、林格氏溶液以及等張的氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油習慣上常被用作為溶劑或懸浮媒介。為此目的，任何溫和的固定油都可以被使用，包括合成的單-或雙酸甘油酯。脂肪酸諸如油酸以及其甘油酯衍生物可用於可注射的製劑中，而天然的醫藥可接受的油亦是如此，諸如橄欖油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙基化形式。這些油性溶液或懸浮液也可含有長鏈的醇稀釋劑或分散劑，諸如常用於調配醫藥上可接受之劑量形式(包括乳劑以及懸浮液)中的羧甲基纖維素或相似的分散藥劑。其他常用於製備醫藥上可接受的固體、液體、或其他劑量形式之常用的界面活性劑諸如吐溫、Spans以及其他乳化劑或生物可利用性增進劑也可被用於調配物中。
本發明的組成物可以任何口服可接受的劑量形式經口給藥，包括(但不限於)膠囊、錠劑、水性懸浮液或溶液。用於口服錠劑的例子中，常用的載劑包括乳糖以及玉米澱粉。潤滑劑諸如硬脂酸鎂也典型的被添加。用於口服給藥的膠囊形式中，有益的稀釋劑包括乳糖以及乾燥玉米澱粉。當需要水性懸浮液用於口服時，活性成分係與乳化劑以及懸浮劑混合在一起。若需要，也可添加一些甜味劑、風味劑或著色劑。
或者，本發明的組成物可以栓劑的形式用於直腸給藥。這些可以藉由將藥劑與合適的非刺激性賦形劑混合來製備，該賦形劑於室溫時固體但在直腸溫度是液體，因此會在直腸中融化釋放出藥物。此物質包括可可脂、蜜蠟以及聚乙二醇。
本發明的組成物也可以經局部給藥，尤其當治療標的包括可藉由局部施用而容易接近的區域或器官時，包括眼，皮膚，或下消化道疾病。合適的局部調配物可容易地被配製以用於各個這些區域或器官。
用於下消化道之局部施用可以用直腸栓劑調配物(參見上述)或合適的灌腸調配物來進行。也可使用局部皮膚貼片。
用於局部施用時，組成物可以是調配在一合適的油膏中的，該油膏含有懸浮或溶於一或更多載劑中的活性成分。用於將本發明化合物局部給藥的載劑包括但不限於礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟以及水。或者，組成物可以被調配在一合適的乳液或乳霜中，該乳液或乳霜含有懸浮或溶於一或更多醫藥上可接受的載劑中的活性成分。合適的載劑包括但不限於礦物油、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨糖醇酯60、十六醇酯蠟、十六醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇以及水。
用於眼部時，組成物可以被調配成在等張、調整過pH的無菌鹽溶液中的微粒化懸浮液，或較佳的為含有或不含保存劑諸如氯化苯二甲羥銨的在等張、調整過pH的無菌鹽溶液中的溶液。或者，用於眼部時，組成物可以調配在油膏(諸如凡士林)中。
本發明的組成物也可以藉由鼻氣霧劑或吸入來給藥。此組成物係根據醫藥調配物技藝中熟知的技術製備的，且可以製備成鹽水中的溶液，使用苯甲醇或其他合適的保存劑、吸收促進劑以增進生物可利用性、氟碳化合物、及/或其他習知的溶解劑或分散劑。
在臨床狀況下，有許多單株抗體已被顯示是有效的，諸如Rituxan(Rituximab)、Herceptin(Trastuzumab)或Xolair(Omalizumab)、以及相似的給藥攝生法(即調配物及/或劑及/或給藥操作)可以與本發明的抗體一起使用。本發明醫藥組成物中的抗體給藥計劃及劑量可以根據已知的方法來決定，例如使用製造商的說明書。例如，本發明醫藥組成物中所存在的抗體可以100毫克(10毫升)或500毫克(50毫升)單一使用瓶中10毫克/毫升的濃度供應。產物是調配成IV給藥的，在9.0毫克/毫升的氯化鈉、7.35毫克/毫升檸檬酸鈉二水合物、0.7毫克/毫升聚山梨糖醇酯80、以及無菌水中，以用於注射。將pH調整成6.5。本發明醫藥組成物中的抗體之例示的合適劑量範圍可以介於約10 mg/m2以及500 mg/m2。然而，應了解這些計劃是例示的，且最適計劃及療法可以考慮醫藥組成物中特定抗體的親和性以及耐受度來調整之，必須於臨床試驗來決定。飽和NK細胞24小時、48小時、72小時或一週或一個月的本發明醫藥組成物中的抗體注射量以及計劃會考慮其在人類和非人類哺乳動物中的抗體親和性以及其藥物動力學參數來決定。
根據另一個具體實例，本發明的抗體組成物可進一步包含另一個治療上的藥劑，包括常被使用於特定治療目的之使用抗體的藥劑。額外的治療藥劑通常在組成物中的含量典型的是治療特定疾病或症狀之單一治療所用的藥劑含量。此治療上的藥劑包括但不限於用於治療癌症的治療藥劑、用於治療感染性疾病的治療藥劑、用於其他免疫治療的治療藥劑、細胞激素(諸如IL-2或IL-15)、其他抗體以及其他抗體的片段。
在一另外的具體實例中，與出現在至少兩個不同的人類抑制性KIR受體基因產物上的常見決定基結合的抗體可以單獨的或與另一個用於標的遞送至人類或其他非人類哺乳動物的腫瘤或感染區的物質一起被送進脂質體(「免疫脂質體」)中，其中該抗體能夠中和KIR所調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，該NK細胞表現本發明兩個不同的人類抑制性KIR受體的至少一種。此種其他物質包括核酸，於基因治療時用於遞送基因或用於遞送反義RNA、RNAi或siRNA以抑制NK細胞中的基因，或用於標的毒殺NK細胞的毒素或藥物。
例如，許多治療上的藥劑可用於治療癌症。本發明的抗體組成物以及方法可以與任何其他常用於治療患者所有顯現之特定疾病(尤其是腫瘤、癌症疾病、或其他疾病或失調)的方法合併使用。只要特定治療上的方法本身不會對患者的症狀有害、且不會顯著抵消本發明醫藥組成物中的抗體活性，則可考慮與本發明合併使用。
當用於固體腫瘤治療時，本發明的醫藥組成物可以與傳統的方法(諸如手術、放射線治療、化學治療、以及相似者)合併使用。因此，本發明提供了合併的治療，其中本發明的醫藥組成物可在手術或放射線治療的同時、之前、或之後使用；或在習知的化學治療、放射線治療或抗血管生成劑、或標的免疫毒素或共凝結配體(coaguligand)同時、之前、或之後給藥給患者。
當在治療療法上有一或更多種藥劑是與本發明的含抗體組成物一起使用時，合併的結果並不需要是各治療分開實施所觀察到的加成(additive)功效。雖然至少加成功效通常是令人想要的，但是任何增加的抗癌功效超過一種單一治療就是有優點的。此外，並沒有特定要求合併的結果顯現有協同(synergistic)的功效，雖然這是可能的且是有利的。
實施合併的抗癌治療，吾人可簡單的將本發明的抗體組成物與另一個抗癌藥劑以可有效的達成其在動物中合併的抗癌作用的方式來給藥至一患者。因此，藥劑會以有效量提供並存續一段時間，以有效使得其共同存在於腫瘤微管結構中以及在腫瘤環境中合併作用。為了達成這個目標，本發明的抗體組成物及抗癌藥劑可以同時給藥至患者，以單一的合併組成物或以兩種不同的組成物，使用相同或不同的給藥途徑。
或者，本發明抗體組成物的施用可以在抗癌藥劑治療之前或之後，例如間隔範圍自分鐘到星期及月。吾人可確保抗癌藥劑與本發明抗體組成物中的抗體對癌症展現了優異的合併功效。作為一例子，本發明的mAb可以給藥給患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的患者。此患者典型的是以Rituximab的組合以及稱為CHOP之化學治療藥劑的組合來治療的。所以，本發明的抗KIR抗體可以用於治療受到Rituximab以及CHOP治療的NHL患者，藉由在治療計劃中合併給藥所有的藥劑，其中藥劑是在同一天、或不同天施用，有較長的治療期間。
其他的抗癌藥劑可以在本發明的抗KIR抗體組成物給藥之前、同時、或之後施用。然而，當抗體的免疫交聯物被用於本發明的抗體組成物中時，各抗癌藥劑可同時或隨後給藥。
在一些狀況下，可能需要大大的延長治療的期間，其中抗癌藥劑或抗癌治療與本發明抗體組成物的給藥相隔數天(2、3、4、5、6或7)、數星期(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至數個月(1、2、3、4、5、6、7或8)。這在當抗癌治療實質上是要摧毀腫瘤(諸如手術或化學治療)而施用本發明的抗體組成物是要防止微量轉移或腫瘤再生的情況下可能是有利的。
可想像會進行多於一次的本發明抗KIR抗體為基的組成物或抗癌藥劑給藥。這些藥劑可以是交替的給藥，於間隔的天或週；或一個使用本發明抗KIR抗體組成物的循環治療，接著一個抗癌藥劑治療的循環。在任何情況下，為了達到腫瘤退化而使用合併治療時，所需要的是遞送兩藥劑的合併含量係能有效展現抗腫瘤功效的量，不管給藥的時間。
關於手術，任何的手術介入都可以結合本發明而被實施。至於放射線療法，任何誘發癌症細胞內DNA局部破損的機制可被考慮，諸如加瑪射線、X射線、UV射線、微波以及甚至電子射線以及相似者。將放射線同位素經導引的遞送至癌症細胞中也可考慮，且這可以與定標的用的抗體或其他定標的用的方法一起使用。
在其他方面，免疫調節化合物或攝生法可以與本發明的抗體組成物合併給藥或作為本發明抗體組成物的一部分。免疫調節化合物較佳的例子包括細胞激素。各種細胞激素可以被用於此合併的方法中。有益於與本發明合併之可考慮的細胞激素的例子包括IL-1阿法、IL-1貝塔、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-貝塔、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-阿法、TNF-貝塔、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-阿法、IFN-貝塔、IFN-加瑪。用於與本發明治療或組成物合併的細胞激素是根據標準攝生法給藥，與臨床徵兆諸如患者的症狀以及細胞激素相關的毒性一致。其他可以與本發明的抗體組成物合併給藥或作為本發明抗體組成物一部分的免疫調節化合物包括與淋巴細胞上其他抑制性受體專一結合的抗體，包括(不限於)抗體諸如抗CTLA4抗體、或抗CD94/NKG2A抗體(參見例如美國公開的專利申請案20030095965)。技藝中已知的這些分子的變異體以及衍生物也或二者擇一地可以被用於此方法，且適當的併入本發明的組成物中。
在一些具體實例中，本發明交互反應的、阻斷的、及/或含抑制性抗KIR抗體之治療上組成物可以與化學治療或荷爾蒙治療藥劑合併給藥或進一步包含化學治療或荷爾蒙治療藥劑。許多種荷爾蒙治療及化學治療劑可以被用於本文所揭示的合併療法中。作為例示的化學治療劑包括但不限於烷化藥劑、抗代謝藥、細胞毒性抗生素、植物鹼、例如阿德力黴素、更生黴素、絲裂黴素、洋紅黴素、柔紅黴素、多柔比星(doxorubicin)、三苯氧胺、紅豆杉醇、泰索帝(Taxotere)、長春新鹼、長春花鹼、長春瑞賓、依託泊甙(Etoposide；VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、胞嘧啶阿拉伯糖、環磷醯胺、塞替派(thiotepa)、甲氨喋呤、喜樹鹼、放線菌素-D、絲裂黴素C、順鉑(cisplatin)(CDDP)、胺喋呤、康布瑞塔卡汀(combretastatin)以及其衍生物和前趨藥物。
荷爾蒙劑包括但不限於例如LHRH激動劑，諸如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、以及布舍瑞林；抗動情素，諸如三苯氧胺以及托瑞米芬；抗雄性激素，諸如拂它邁(Flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、環丙孕酮以及白卡羅他邁(Bicalutamide)；芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦、來曲唑(letrozole)以及法倔唑；以及雌激素，諸如甲孕酮、氯地孕酮以及甲地孕酮。
如熟習此項技藝者所理解的，化學治療劑的適當劑量接近那些已用於臨床治療的劑量，其中化學治療劑是單獨給藥或與其他化學治療劑一起給藥。僅用於例示，可以使用藥劑諸如順鉑、以及其他DNA烷化。順鉑已廣泛被用於治療癌症，用於臨床使用的有效劑量為20 mg/m2五天每三個星期全部三個療程。順鉑無法經口吸收且因此必須經由靜脈內、皮下、腫瘤內或腹腔注射來遞送。
進一步有用的化學治療劑包括干擾DNA複製、有絲分裂以及染色體分離的化合物、以及中斷聚核苷酸前趨物合成和精確性的藥劑。許多用於合併治療之例示的化學治療劑列於美國專利第6,524,583號的表C，其所揭示之藥劑以及指示係特別併入本文作為參考。各個所列的藥劑是作為例示而非作為限制。熟習此項技藝者可參照「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版第33章第624-652頁。劑量可以根據所治療的症狀來改變。實施治療的醫師能夠決定用於個別個體之適當劑。
本發明的交互反應的、阻斷的、及/或抑制性抗KIR抗體組成物可以與任何一種或更多的抗血管新生治療一起使用或可進一步包含抗血管生成藥劑。此藥劑的例子包括中和抗體、反義RNA、siRNA、RNAi、RNA適合體(aptamer)以及核酶，各自都是針對VEGF或VEGF受體(美國專利第6,524,583號，其揭示併入本文作為參考)。有拮抗性質的VEGF變異體也可以被使用，如WO 98/16551中所描述，特別併入本文作為參考。有益於合併治療的進一步例示的抗血管生成劑列於美國專利第6,524,583號的表D，其揭示之藥劑以及指示特別併入本文作為參考。
本發明的抗KIR抗體組成物也可以與誘導細胞凋亡的方法合併使用或可包含凋亡劑。例如，許多致癌基因已被鑑認會抑制細胞凋亡或程式化的細胞死亡。這類型的例示的致癌基因包括但不限於bcr-abl、bcl-2(不同於bcl-1、細胞週期素D1；GenBank編號M14745、X06487；美國專利第5,650,491號；以及第5,539,094號；各併入本文作為參考)以及家族成員包括Bcl-x1、Mcl-1、Bak、A1、以及A20。bcl-2的過度表現最先是在T細胞淋巴瘤中被發現的。致癌基因bcl-2藉由結合以及去活化Bax(細胞凋亡路徑中的蛋白質)而作用。抑制bcl-2的功能會防止Bax去活化，以及使得細胞凋亡路徑繼續進行。抑制此類的致癌基因，例如使用反義核苷酸序列、RNAi、siRNA或小分子化學化合物，可用於本發明來增進細胞凋亡(美國專利第5,650,491號；第5,539,094號；以及第5,583,034號；各併入本文作為參考)。
本發明的抗KIR抗體組成物也可包含或與含有定標的用的部位的分子(例如抗體、配體、或其結合)合併使用，該分子(「定標的用的藥劑」)係針對標的細胞(例如標的腫瘤細胞)上的一特定標誌。一般來說，用於本發明這些額外方面之定標的用的藥劑較佳係辨識優先地、或專一地表現在腫瘤區之可接近的腫瘤抗原。定標的用的藥劑通常會與腫瘤細胞的表現在表面的、表面可接近的或位於表面的成分結合。定標的用的藥劑也較佳的會顯現高親和性的性質；且不會對維持生命的正常組織產生顯著的體內副作用，諸如一或更多組織係選自心臟、腎臟、腦、肝臟、骨髓、結腸、胸部、前列腺、甲狀腺、膽囊、肺臟、腎上腺、肌肉、神經纖維、胰臟、皮膚、或其他人體維持生命的器官或組織。本文所說的術語「不會產生顯著的體內副作用」是指當定標的用的藥劑給藥至體內後只會產生無關緊要的或臨床上可控制的副作用，諸如那些常在化學治療時會遇到的。
治療腫瘤時，本發明的抗體組成物可額外包含或可以與附屬(adjunct)化合物合併使用。附屬化合物可包括(例如)止吐劑諸如血清素拮抗劑及治療諸如吩噻嗪、經取代的苯甲醯胺、抗組織胺、苯丁酮、皮質類固醇、苯二氮平以及大麻；雙磷酸化合物諸如唑來瞵酸以及帕米膦酸；以及造血生長因子諸如紅血球生成素和G-CSF，例如非格司亭(filgrastim)、雷諾格拉斯蒂姆(lenograstim)以及達比波廷(Darbepoietin)。
在另一個具體實例中，會辨識不同的抗原決定基或決定基的本發明之兩個或更多抗體，包括NKVSF1、DF200、1-4F1及/或1-7F9，可以合併成一個單一的組成物，以儘可能減少或中和KIR基因產物的抑制性效果。含有本發明交互反應抑制性KIR抗體、或其片段或衍生物組合的組成物可具有更廣的用途，因為可能存在有小比例的人類族群缺乏被單一交互反應之抗體所辨識的各個抑制性KIR基因產物。類似的，本發明的抗體組成物可進一步包含一或更多會辨識單一抑制性KIR亞種類的抗體。此組合會再提供治療上更廣泛的用途。所以，本發明的抗體可以與另一個抗KIR抗體合併使用，該抗KIR抗體係與一或更多的例如KIR2DL1、KIR2DLK2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、以及KIR3DL3結合。
本發明也提供在需要的患者中誘發NK細胞活性的方法，該方法包含施用本發明的組成物給該患者的步驟。該方法更特定的係針對增加患者的NK細胞活性，該患者所患的疾病是需要增加NK細胞活性的，該疾病涉及、影響易受NK細胞溶解的細胞或是由易受NK細胞溶解的細胞所造成的，或是由不足夠的NK細胞活性所造成或特徵在於不足夠的NK細胞活性，諸如癌症、另一個增生失調、感染性疾病或免疫失調。更特定而言，本發明的方法係用於治療各種癌症及其他增生疾病，包括(但不限於)癌症，包括膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌以及皮膚癌，包括鱗狀細胞癌；淋巴系統的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金症淋巴瘤、非霍奇金症淋巴瘤、毛細胞型淋巴瘤以及伯基特氏淋巴瘤；骨髓系統的造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病和前骨髓性白血病；間葉來源的腫瘤，包括纖維肉瘤以及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精母細胞瘤、畸形癌細胞、神經母細胞瘤以及神經膠質瘤；中樞及週邊神經系統的腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、以及神經鞘瘤；間葉來源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、以及骨肉瘤；以及其他腫瘤，包括黑素瘤、色素性乾皮病、角化棘皮瘤、精母細胞瘤、甲狀腺濾泡癌以及畸胎癌。
其他可以根據本發明而被治療的較佳的失調包括淋巴系統的造血腫瘤，例如T細胞以及B細胞腫瘤，包括但不限於T細胞失調，諸如T前淋巴細胞白血病(T-PLL)，包括小細胞以及腦細胞種類；大顆粒淋巴細胞白血病(LGL)，較佳的是T細胞種類的；Sezary症候群(SS)；成人T細胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；週邊/後胸腺T細胞淋巴瘤(多形性以及免疫母細胞性亞種類)；血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤；血管中心性(鼻)T細胞淋巴瘤；間變性(Ki 1+)大細胞淋巴瘤；小腸T細胞淋巴瘤；T淋巴細胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
其他增生失調也可以根據本發明而被治療，包括例如增生、纖維化(尤其是肺，但也有其他類的纖維化，諸如腎臟纖維化)、血管新生、牛皮癬、動脈硬化以及血管中平滑肌增殖，諸如血管成形術之後的狹窄或再阻塞。本發明的交互反應之抑制性KIR抗體可以被用於治療或防止感染性疾病，較佳的包括任何由病毒、細菌、原生動物、黴菌或真菌所引起的感染。此病毒感染性生物包括但不限於A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、第1型單純疱疹(HSV-1)、第2型單純疱疹(HSV-2)、牛瘟、鼻病毒、伊科病毒、輪狀病毒、呼吸道融合病毒、乳突病毒、巨細胞病毒、棘病毒、蟲媒病毒、漢他病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小兒麻痺病毒、伊波拉病毒、以及人類免疫缺乏病毒第I型或第2型(HIV-1、HIV-2)。
可以根據本發明而被治療的細菌感染包括但不限於由下列所引起的感染：葡萄球菌；鏈球菌，包括化膿性鏈球菌；腸球菌；桿菌，包括炭疽桿菌、以及乳酸菌；李斯特菌；白喉棒狀桿菌；加德納氏菌，包括陰道加德納菌；諾卡菌；鏈黴菌；普通高溫放線菌；螺旋體；弧形桿菌；假單胞菌，包括Raeruginosa；退伍軍人桿菌；奈瑟菌，包括淋病雙球菌以及腦膜炎雙球菌；黃桿菌，包括腦膜炎膿毒性黃桿菌以及F. odoraturn；布魯氏桿菌；博德氏菌，包括百日咳桿菌以及支氣管敗血性博德氏桿菌；埃希菌，包括大腸桿菌、克雷伯士氏桿菌；腸桿菌；沙雷氏菌，包括黏質沙雷氏桿菌以及液化沙雷氏菌；愛德華氏菌；變形桿菌，包括奇異變形桿菌以及普通變形桿菌；鏈桿菌；立克次體，包括R. fickettsfi；衣原體，包括鸚鵡熱衣原體以及沙眼衣原體；分支桿菌，包括結核桿菌、胞內分枝桿菌、M. folluiturn、痲瘋分枝桿菌、鳥型分枝桿菌、牛性分枝桿菌、非洲結核菌、堪薩斯結核分枝桿菌、胞內分支桿菌、和M. lepraernurium；以及諾卡菌。
可以根據本發明而被治療的原生動物感染包括但不限於由利甚曼原蟲、kokzidioa、以及錐蟲所引起的感染。感染性疾病的完整列表可以在國家感染性疾病中心(NCID)疾病控制中心(CDC)的網頁上找到(www.cdc.gov/ncidod/diseases/)，該列表併入本文作為參考。所有該些疾病係使用本發明之交互反應抑制性KIR抗體治療的候選疾病。
治療各種感染性疾病的方法可使用本發明的抗體組成物，單獨的或與其他已知用於治療此疾病的治療及/或治療上的藥劑合併使用，包括抗病毒藥劑、抗真菌藥劑、抗細菌藥劑、抗生素、抗寄生藥劑以及抗原生動物藥劑。當這些方法涉及需要額外治療藥劑的額外治療時，這些藥劑與本發明的抗體一起給藥，以單一劑量形式或分開的、多重的劑量形式。當以分開的劑量形式給藥時，該額外藥劑可以在施用本發明之抗體之前、同時、或之後給藥。
本發明的進一步方面以及優點會在下面的實驗章節中揭示，該揭示應被認為是本發明範圍的例示說明，而不得作為限制。
實施例1：純化PBL以及產生多株或選殖的NK細胞系
PBL係源自健康的捐者，係藉由Ficoll-Hypaque梯度並去除貼壁細胞。為了得到濃縮的NK細胞，將PBL於4℃與抗CD3、抗CD4以及抗HLA-DR mAb培養在一起30分鐘，然後與山羊抗鼠磁珠(Dynal)(30分鐘於4℃)一起培養，以及用技藝中習知的方法進行免疫磁性選擇(Pende等人，J Exp Med 1999；190：1505-1516)。CD3- 、CD4- 、DR- 細胞係培養在放射狀(irradiated)的餵養細胞和100 U/ml的介白素2(Proleukin，Chiron Corporation)以及1.5毫微克/毫升的植物性凝血球素A(Gibco BRL)中以得到多株NK細胞族群。NK細胞係藉由限制性稀釋來選殖的，而NK細胞選殖株係用流式細胞儀定性其細胞表面受體的表現。
所用的mAb是JT3A(IgG2a，抗CD3)、EB6以及GL183(IgG1，分別抗KIR2DL1和KIR2DL3)、XA-141(IgM，與EB6有相同專一性的抗KIR2DL1)、抗CD4(HP2.6)、以及抗DR(D1.12，IgG2a)。可以使用其他商業上可獲得之有相同專一性的mAb來取代JT3A、HP2.6、以及DR1.12。EB6與GL183是商業上可獲得的(Beckman Coulter Inc.,Fullerton,CA)。XA-141不是商業上可獲得的，但mAb EB6可同樣好地被用在溶解的控制重建上，如本文實施例及圖式所示，如Moretta等人在J Exp Med 1993；178：597-604中所描述。
用適當的抗體染色細胞(30分鐘，於4℃)，然後以PE-或FITC-接合的多株抗鼠抗體(Southern Biotechnology Associates Inc)。樣本是在FACScan儀器(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上藉由細胞螢光測定術(流式細胞儀)分析。
下面的NK細胞選殖株係被用於本研究中。CP11、CN5以及CN505是KIR2DL1陽性選殖株，且被EB6(IgG1，抗KIR2DL1)或XA-141(IgM，與EB6抗體有相同專一性的抗KIR2DL1)染色了。CN12和CP502是表現KIR2DL3的NK選殖株，且被GL183抗體(IgG1，抗KIR2DL2/3)染色。
NK選殖株的細胞溶解活性是藉由標準4小時51 Cr釋放分析來評估的，其中作用NK細胞係被測試其殺死已知對NK細胞溶解有敏感性，表現有HLA-Cw3或-Cw4，HLA陽性細胞系之標的細胞的能力。所有使用的標的係每個微量滴定96孔盤之槽孔有5000個細胞，且作用：標的的比例係顯示在圖式中(通常每個標的細胞4個作用細胞)。細胞溶解分析使用或不用指定單株抗體的融合瘤上清液(以(1：1)稀釋)來進行。步驟基本上與Moretta等人在J Exp Med 1993；178：597-604所描述的相同。
實施例2：產生新mAb
mAb是用活化的多株或單株人類NK細胞系免疫5週大的Balb/C鼠而產生的，如Moretta等人在J Exp Med 1990；172：1589-1598所描述的。經過不同的細胞融合之後，先選擇與EB6-以及GL183-陽性NK細胞系和選殖株有交互反應能力的mAb。進一步篩選能夠重建EB6-陽性或GL183-陽性NK選殖株對Cw4或Cw3陽性標的之溶解的陽性單株抗體。
細胞染色係如下進行。細胞係用一組抗體(1微克/毫升或50微升上清液，30分鐘，4℃)染色，然後用PE-接合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)或PE-接合的山羊F(ab’)2片段抗人類IgG(Fc加瑪)抗體(Beckman Coulter)。細胞螢光測定術係在Epics XL.MCL儀器(Beckman Coulter)上進行。
其中一種單株抗體DF200 mAb被發現會與許多KIR家族(包括KIR2DL1、以及KIR2DL2/3)的成員反應。KIR2DL1-陽性以及KIR2DL2/3-陽性NK細胞兩者都明顯的被DF200mAb染色(圖1)。
會表現這些HLA第一型專一抑制性受體之一或另一個(或甚至兩者)的NK選殖株被用來作為作用細胞，相對於會表現一或更多HLA-C等位基因的標的細胞。細胞毒性分析係如下進行。YTS-KIR2DL1或YTS-Eco(KIR陰性)細胞系的細胞溶解活性係藉由標準4小時Cr-51釋放分析來評估。標的細胞是HLA-Cw4-陽性或-陰性B-EBV細胞系、或HLA-Cw4-轉染的721.221細胞。所有標的係每個微量滴定盤之槽孔有3000個細胞。作用因子/標的的比例顯示於圖式中。細胞溶解分析是用或不用指定的單株鼠或人類抗體全長或F(ab’)2片段來進行的。如預期的，KIR2DL1-陽性(KIR2DL1+)NK選殖株對表現HLA-Cw4的標的細胞展示幾乎沒有的細胞溶解活性，以及KIR2DL3+ NK選殖株對Cw3陽性標的展示一點點或沒有活性。然而，當有DF200mAb(用於遮蔽其KIR2DL受體)存在時，NK選殖株變得無法辨識其HLA-C配體並對表現Cw3或Cw4的標的展現強的細胞溶解活性(結果的例子顯示於圖2至6)。
例如，表現HLA-Cw4(但沒有第1群HLA-C同種異型)的C1R細胞系(CW4+ EBV細胞系，ATCC No. CRL-1993)並沒有被KIR2DL1-陽性NK選殖株(CN5/CN505)殺死，但該抑制作用可以藉由使用DF200或習知的抗KIR2DL1 mAb有效逆轉。另一方面，表現KIR2DL2/3+ KIR2DL1-表型(CN12)的NK選殖株會有效的殺死C1R細胞，且這毒殺作用不受DF200mAb影響(圖2)。KIR2DL2-或KIR2DL3-陽性NK選殖株Cw3-陽性標的得到相似的結果。
類似的，Cw4+ 221 EBV細胞系沒有被KIR2DL1+轉染的NK細胞殺死，但該抑制作用可以藉由使用DF200 mAb、DF200的Fab片段、或習知的抗KIR2DL1 mAb EB6或XA141有效逆轉。此外，Cw3-陽性721.221-轉染株沒有被KIR2DL2+ NK細胞殺死，但該抑制作用可以藉由使用DF200或DF200 Fab片段有效逆轉。最後，Cw3+ 721.221-轉染株沒有被KIR2DL3+ NK細胞殺死，但該抑制作用可以藉由使用DF200 Fab片段或習知的抗KIR2DL3 mAb GL183或Y249有效逆轉。結果顯示於圖3。
也測試F(ab’)2片段重建對Cw4陽性標的溶解的能力。DF200以及EB6 Ab的F(ab’)2片段都能夠逆轉針對KIR2DL1-轉染NK細胞對Cw4轉染的221細胞系以及Cw4+ TUBO EBV細胞系的溶解抑制作用。結果顯示於圖4。
實施例3：Biacore分析DF200 mAb/KIR2DL1以及DF200 mAb/KIR2DL3交互作用
重組蛋白質的產生以及純化。KIR2DL1和KIR2DL3重組蛋白質被產生在E. coli中。藉由PCR分別自pCDM8選殖株47.11載體(Biassoni等人，Eur J Immunol. 1993；23：1083-7)以及RSV.5(gpt)183選殖株6載體(Wagtmann等人，Immunity 1995；2：439-49以及1995：3：801-809)放大出編碼有KIR2DL1(SEQ ID NO：23)以及KIR2DL3(SEQ ID NO：25)完整細胞外功能部位的cDNA，使用下列引子：
意義股：5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3’(SEQ ID NO：13)
反義股：5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’(SEQ ID NO：14)
cDNA被選殖入pML1表現載體’在讀框內(in frame)，具有編碼有生物素化訊號的序列(Saulquin等人，J Exp Med. 2003；197：933-8)。
蛋白質表現係在BL21(DE3)菌株(Invitrogen)中進行。使經轉染的細菌於37℃在含有安比西林(100微克/毫升)的培養基中生長到OD600=0.6，並以1 mM IPTG誘導表現。
在變性條件(8 M尿素)下從包涵體中回收蛋白質。重組蛋白質的再摺疊係在20 mM Tris、pH 7.8、含有L-精胺酸(400 mM，Sigma)以及β-硫醇乙醇(1 mM)的NaCl 150 mM緩衝液中進行，於室溫中，藉由六步驟透析減少尿素濃度(分別是4、3、2、1、0.5以及0 M尿素)。在0.5以及0 M尿素透析步驟中添加還原的以及氧化的麩胺基硫(分別是5 mM以及0.5 mM，Sigma)。最後，蛋白質以10 mM Tris、pH 7.5、NaCl 150 mM的緩衝液作透析。可溶性的、再摺疊的蛋白質被濃縮然後用Superdex 200尺寸排除管柱(Pharmacia；KTA系統)純化。
用Biacore儀器(Biacore)進行表面電漿共振測量。在所有Biacore實驗中，用含有0.05%界面活性劑P20的HBS緩衝液係作為緩衝液(running buffer)。
固定蛋白質 。如上述所產生的重組KIR2DL1以及KIR2DL3蛋白質被共價固定在感應晶片CM5(Biacore)上類糊精層的羧基上。感應晶片的表面經EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以及N-羥琥珀硫亞氨，Biacore)活化。注入在耦合緩衝液(10 mM醋酸，pH 4.5)中的蛋白質。用100 mM乙醇胺pH 8(Biacore)去活化其餘活化的基團。
親和性的測量。為了進行動力測量，將多種濃度的可溶性抗體(1 x 10-7 至4 x 10-10 M)放進經固定化的樣本中。測量是在20微升/分鐘持續流速下進行。在每個循環中，注射5微升的10 mM NaOH pH 11以再生感應晶片的表面。BIAlogue動力評估程式(BIAevaluation 3.1，Biacore)被用來作數據分析。將可溶性待測物(40微升，於各種濃度)，在HBS緩衝液中以流速20微升/分鐘注入分別含有500或540反射單位(reflectance unit；RU)、以及1000或700 RU的KIR2DL1和KIR2DL3類糊精層。數據6個獨立實驗的代表。結果顯示在下表1。
表1
BIAcore分析DF200 mAb與固定化之KIR2DL1以及KIR2DL3的結合。KD ：解離常數。
實施例4：產生新的人類抗KIR mAb
人類單株抗KIR mAb是用重組、可溶性KIR蛋白質免疫經基因工程以表現人類抗體庫之基因轉殖鼠而產生的。經過不同的細胞融合建立融合瘤之後，先篩選能與固定化之KIR2DL1以及KIR2DL3蛋白質(如前面實施例3所述產生)交互反應的mAb。一些人類單株抗體(包括1-7F9、1-4F1、1-6F5以及1-6F1)被發現可與KIR2DL1和KIR2DL2/3交互反應。
進一步篩選能重建KIR2DL1-陽性NK轉染株對Cw4-陽性標的細胞之溶解的陽性單株抗體。表現HLA第一型專一抑制性受體的NK細胞被用作為作用細胞，係針對表現一或更多HLA-C等位基因之標的細胞(圖5以及6)。細胞毒性分析係如上述進行。作用細胞/標的的比例顯示於圖式說明，且係使用10微克/毫升或30微克/毫升的抗體。
如預期的，KIR2DL1+ NK細胞幾乎不展示對表現HLA-Cw4的標的細胞的細胞溶解活性。然而，當有1-7F9 mAb時，NK細胞變得無法辨識其HLA-C(即不再被HLA-C分子抑制)，且此時對Cw4-陽性標的展現強的細胞溶解活性。例如，兩測試的細胞系(HLA-Cw4轉染的721.221以及CW4+EBV細胞系)沒有被KIR2DL1+NK細胞殺死，但可藉由使用mAb 1-7F9或習知的抗KIR2DL1 mAb EB6有效逆轉抑制作用。鼠類mAb DF200以及Pan2D(NKVSF1)係與人類mAb 1-7F9相比，且在所有實驗中，1-7F9比任何其他測試的mAb更有效誘發NK細胞的細胞毒性。另一方面，抗體1-4F1、1-6F5以及1-6F1則無法重建NK細胞對Cw4-陽性標的的細胞溶解。
實施例5：鼠類以及人類抗KIR抗體的Biacore競爭結合分析
抗原決定基定位分析是根據先前描述的方法(Gauthier等人，Journal of Immunology 1999；162：41-50；Saunal以及van Regenmortel，Journal of Immunology 1995；183：33-41)，對經固定的KIR2DL1(900 RU)、KIR 2DL3(2000 RU)以及KIR2DS1(1000 RU)，用鼠抗KIR 2D抗體DF200、NKVSF1(Pan2D)、gl183以及EB6、和人類抗KIR2D抗體1-4F1、1-6F1、1-6F5與1-7F9進行分析。
所有的實驗是在流速5微升/分鐘下進行，在HBS緩衝液中，2分鐘注射不同的15微克/毫升的抗體。在每一組抗體中，競爭結合分析都是以兩步驟進行。在第一步驟中，將第一單株抗體(mAb)注射到KIR2D標的蛋白質上，然後注射第二mAb(不移除第一mAb)，並監看第二mAb RU值(RU2)。在第二步驟中，先將第二mAb直接注射到裸KIR2D蛋白質上，並監看mAb RU值(RU1)。第二mAb與KIR2D蛋白質的結合被第一mAb抑制的百分比係藉由下列計算：100*(1-RU2/RU1)。
結果顯示於表2、3以及4，其中標示「第一抗體」的抗體被列在垂直的欄位中，而‘第二抗體’則列在水平的欄位中。在每組測試的抗體中，抗體直接結合至晶片的程度值(RU)被列在表中，其中第二抗體直接結合至KIR2D晶片的值是列在各格的上半部，而當第一抗體存在時，第二抗體與KIR2D晶片結合的值列在各格的下半部。列在各格右邊的是第二抗體結合被抑制的百分比。表2顯示與KIR2DL1晶片的結合，表3顯示抗體與KIR2DL3晶片的結合，以及表4顯示抗體與KIR2DS1晶片的結合。
評估鼠類抗體DF200、NKVSF1以及EB6、和人類抗體1-4F1、1-7F9與1-6F1和固定化之KIR2DL1、KIR2DL2/3以及KIR2DS1的競爭結合。從抗KIR抗體與KIR2DL1結合實驗所得到的抗原決定基定位(圖7)中顯示(a)抗體1-7F9與EB6以及1-4F1是相競爭的，但不與NKVSF1以及DF200相競爭；(b)抗體1-4F1則是與EB6、DF200、NKVSF1以及1-7F9相競爭；(c)NKVSF1與DF200、1-4F1以及EB6相競爭，但不與1-7F9相競爭；且(d)DF200是與NKVSF1、1-4F1以及EB6相競爭，但不與1-7F9相競爭。從抗KIR抗體與KIR2DL3結合實驗所得到的抗原決定基定位(圖8)顯示(a)1-4F1是與NKVSF1、DF200、gl183以及1-7F9相競爭；(b)1-7F9是與DF200、gl183以及1-4F1相競爭，但不與NKVSF1相競爭；(c)NKVSF1是與DF200、1-4F1以及GL183相競爭，但不與1-7F9相競爭；且(d)DF200是與NKVSF1、1-4F1以及1-7F9相競爭，但不與GL183相競爭。從抗KIR抗體與KIR2DS1結合實驗所得到的抗原決定基定位(圖9)顯示(a)1-4F1是與NKVSF1、DF200以及1-7F9相競爭；(b)1-7F9是與1-4F1相競爭，但不與DF200以及NKVSF1相競爭；(c)NKVSF1是與DF200以及1-4F1相競爭，但不與1-7F9相競爭；且(d)DF200是與NKVSF1以及1-4F1相競爭，但不與1-7F9相競爭。
表2
用第一及第二抗體競爭結合之KIR2DL1抗原決定基定位(ND=未測定)
表3
用第一及第二抗體競爭結合之KIR2DL3抗原決定基定位(ND=未測定)
表4
用第一及第二抗體競爭結合之KIR2DS1抗原決定基定位(ND=未測定)
實施例6：以獼猴(cynomolgus)NK細胞滴定抗KIR mAb
測試抗KIR抗體NKVSF1結合至來自獼猴NK細胞的能力。
純化猴子PBMC以及產生多株NK細胞團。獼猴PBMC係自檸檬酸鈉CPT管中(Becton Dickinson)製備。NK細胞的純化是以陰性去除法(negative depletion)(彌猴NK細胞增富集套組，幹細胞技術)來進行的。NK細胞被培樣在放射狀的人類餵養細胞上，其中含有300 U/毫升的介白素2(Proleukin，Chiron Corporation)以及1毫微克/毫升的植物血球凝集素A(Invitrogen，Gibco)，以得到多株NK細胞族群。
以獼猴NK細胞滴定Pan2D mAb。將獼猴NK細胞(第16天的NK團)與不同量的Pan2D mAb培養在一起，然後與PE-接合的山羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗體培養在一起。陽性細胞的百分比是用同型(isotypic)控制組(經純化的鼠IgG1)來決定的。樣本做二重複。平均螢光強度=MFI。
抗體與猴子NK細胞的結合顯示在圖10。
實施例7：篩選人類抗KIRmAb
人類單株抗KIR Ab是藉由用重組的KIR蛋白質來免疫經基因工程以表現人類抗體庫的基因轉殖鼠而產生的，如實施例4中所述。為了產生交互反應的抗KIR抗體，動物相繼以不同的KIR免疫，該KIR是如實施例3所述之可溶性形式，或者是表現於細胞表面的。
接著，經過不同的細胞融合之後，先篩選與經固化之KIR2DL1以及KIR2DL3蛋白質有交互反應能力的mAb，其係藉由ELISA，使用標準方法。透過ELISA，發現一些人類單株抗體包括1-7F9、1-4F1、1-6F5以及1-6F1會與所有的KIR2DL1、KIR2DL2以及KIR2DL3反應。會與KIR2DL1以及KIR2DL2/3兩者反應的mAb稱為「KIR2DL-交互反應mAb」。
然後，藉由流式細胞儀測試該KIR2DL交互反應mAb與細胞表面KIR反應的能力。簡單來說，人類抗KIRmAb的結合測試是藉由將其與穩定過度表現KIR(例如YTS-2DL1、BWZ-KIR2DL2以及BWZ-KIR2DS4)或不表現KIR(例如YTS以及BWZ)的各種細胞系培養在一起。簡單地說，細胞是與各種濃度(典型的是0-50微克/毫升)的人類抗KIRmAb1-7F9培養在含有2% FCS的DMEM培養基中。經過培養之後，清洗細胞並將細胞與對人類IgG專一性的APC-接合的二級抗體培養在一起。所有的培養以及清洗步驟都是在0-4℃進行的。然後，清洗細胞，將之再懸浮於PBS中，以及藉由流式細胞儀在FACScalibur或FACScanto(兩者皆來自Beckton Dickinson)分析該細胞。典型的實施例顯示在圖16。例如，發現1-7F9與1-4F1並不會與經KIR2DS4轉染的細胞結合，但是NKVSF1(Pan2D)會(圖16)。
接下來，測試人類抗KIR mAb阻斷KIR與其HLA-C配體之間交互反應的能力，該測試係藉由1)生化的，直接結合實驗以及2)溶解功能重建分析。
在生化結合分析中，人類抗KIR mAb(包括1-7F9)阻斷HLA-C以及KIR-分子之間交互反應能力的評估是藉由競爭可溶性、重組KIR-Fc融合蛋白質與表現HLA-C之細胞的結合。KIR-Fc蛋白質是如所述而產生的(Wagtmann等人，Immunity 1995；3(6)：801-9)，但是人類Fc置換成鼠類IgG1 Fc。可溶性KIR-Fc會結合至表現被KIR2DL1辨識之特定HLA-C同種異型的細胞，且這個結合可以藉由流式細胞儀，使用對鼠類KIR-Fc蛋白質的Fc部分有專一性的二級螢光團-接合的Ab觀測到。例如，KIR2DL1-Fc會結合至經HLA-Cw*0402轉染的細胞(LCL 721.221-Cw4轉染株)(Litwin等人，J Exp Med. 1993；178：1321-36)，但不會結合至未經轉染的LCL 721.221細胞(參見圖11A)。為了測試抗KIR mAb是否會可防止KIR2DL1-Fc以及HLA-Cw4之間的交互反應，將KIR2DL1-FC蛋白質與增加濃度的抗KIR mAb預培養在一起，然後添加到LCL 721.221-Cw4細胞中，培養於4℃，清洗，與APC-接合的抗鼠類IgG1 Fc培養在一起，清洗，以及用標準方法藉由流式細胞儀在FACScalibur、或FACScanto(Beckton Dickinson)上分析之。一些鼠類抗KIR mAb(諸如DF200)以及一些人類抗KIR mAb(即1-7F9和1-4F1)會防止KIR2DL1-Fc結合至表現HLA-Cw4的細胞，顯示這些mAb會阻斷KIR2DL1以及HLA-Cw4之間的交互反應。作為一實施例，圖17A顯示DF200會防止KIR2DL1-Fc結合至表現HLA-Cw4的細胞。圖17B顯示1-7F9 mAb會防止KIR2DL1結合至HLA-Cw4。相似的，測試抗KIR mAb防止KIR2DL2結合至HLA-Cw3的能力。會以劑量依賴模式防止KIR2DL-Fc結合至表現HLA-C的細胞之抗體(如圖17所例示)係被稱為「阻斷mAb」，且進一步如下以功能性細胞毒性分析測試。
人類抗KIR mAb治療上的用途是與其誘導表現KIR的NK細胞殺死腫瘤細胞的能力相連的，其係藉由預防透過KIR之抑制性訊號。所以，評估人類KIR2DL交互反應以及阻斷mAb是否能夠藉由表現KIR2DL的NK細胞誘導表現HLA-C的標的細胞溶解是重要的。為了這個目的，進行下列實驗：在51 Cr-釋放細胞毒性分析中，表現KIR2DL1的YTS細胞(YTS-2DL1)能殺死LCL 721.221-Cw3，但不能殺死LCL 721.221-Cw4細胞(圖18A)。相反的，缺乏KIR的YTS作用細胞(YTS)會有效殺死兩細胞系。因此，因為透過KIR2DL1之HLA-Cw4-誘導的抑制性訊號，所以YTS-2DL1作用細胞不能殺死LCL 721.221-Cw4細胞。當YTS-2DL1細胞在51 Cr-釋放細胞毒性分析中係與1-7F9預培養在一起時，LCL 721.221-Cw4細胞會被殺死，該毒殺作用與1-7F9濃度相關(圖18B)。3-1F13是可與KIR2DL1高親和性結合的人類交互反應抗KIR mAb，但不能防止KIR2DL1以及HLA-Cw4之間的交互反應，不能誘導YTS-2DL1細胞殺死LCL 721.221-Cw4細胞。所以，1-7F9會藉由防止NK細胞和標的細胞之間的KIR-HLA-C交互反應來誘導NK調控的標的細胞毒殺作用。
實施例8：1-7F9的親和性測量
1-7F9結合至KIR2DL1以及KIR2DL3的親和性是藉由Biacore分析測量的，使用如實施例3中所述而產生的可溶性重組KIR蛋白質。Biacore實驗是如實施例3中所述進行的，但是所使用的抗體是人類mAb 1-7F9。
這些1-7F9結合至KIR2DL1以及-3的親和性決定結果顯示在表5。
表5
BIAcore分析1-7F9 mAb結合至固定化的KIR2DL1以及KIR2DL3
KD ：解離常數
實施例9：定位KIR2DL1上1-7F9的抗原決定基
當合適的X射線結構/同源模型存在於抗體以及抗原兩者時，可以藉由電腦(in silico)方法進行蛋白質-蛋白質停靠(docking)法獲得特定單株抗體抗原之決定基在在一特定抗原上的定位。
抗體的同源模型可以藉由分別將輕鏈及重鏈序列與一群經選擇之有3D結構的抗體排列在一起而獲得。六個互補決定區(CDR)的長度可以被計算並自具有相同CDR長度的抗體中選出最佳的模板。自所選的模版中可以使用標準技術產生一同源模型。
在蛋白質-蛋白質停靠法中，近期回顧(Schneidman-Duhovny等人，Curr Med Chem 2004；11：91-107)，兩個表面係由表面的特徵所表現。特徵包括氫鍵結能力、帶電性以及疏水性。在以網柵為基的方法中，空間被分為多個立方體且各個立方體根據其相對於表面的位置被給定一個值(裡面、表面、外面)以及被指派相關的特徵組合。以評分函數表現表面蠻力(Brute force)配對現在可以藉由搜尋全部的3平移以及3轉動自由度來進行。平移是由快速傅利葉轉換處理的，而轉動是在轉動空間的標準判斷中個別計算的。從最高得分的複合物中，藉由一些方法，例如形狀互補、凡得瓦交互作用、疏水性、靜電、去溶劑、氫鍵、原子接觸能、殘基-殘基配對統計以及親水基團配對，過濾出並評分出結果。最高得分的複合物可以被詳細評估，而交互作用的殘基以及抗原決定基可以被鑑認出來。
方法以及分析
KIR殘基和功能部位的命名是根據Fan等人(Nature 1997；389：96-100)，所以功能部位1包含殘基6-101，且功能部位2包含胺基酸殘基105-200。
1-7F9的同源模型是使用1OM3作為模版而建立的。由Calarese等人(Science 2003；300：2065以及下列等等)所產生的1OM3結構是從PDB(蛋白質資訊銀行www.rcsb.org/pdb/；1OM3 VL序列：SEQ ID NO：34；1OM3 VH序列：SEQ ID NO：35)擷取的。使用Kabat Numbering以及CDR派定。整體的排列是好的且CDR長度是一致的，所以同源模型有足夠的正確度可用於蛋白質-蛋白質停靠實驗中。
從1-7F9抗體同源模型對KIR2DL1結構之蛋白質-蛋白質停靠，會得到1NKR.pdb 2000結果。過濾出該結果中對D183(原子<6，自CD)以及R131(原子<12，自CZ)的接近性，並且詳細分析133所得到的結果。
分析所形成的最高得分複合物，以及鑑認並限制R131(KIR)與D100C(重鏈)之間可能的交互反應。篩選到一新的對於F181的旋轉異構體(rotamer)，且最小化了能量。這個模型預測抗體會與KIR2DL1(SEQ ID NO：23)的下列殘基交互作用：S20(Hyd,CB)(HydAcceptor,OG)、E21(Hyd,CB,CG)、M44(Hyd,SD,CE)、F45(Hyd,CD1,CD1,CZ,CE2)、R68(HydDonor,NH2)、T70(Hyd,CB,CG2)、Q71(Hyd,CG)、L104(Hyd,CB,CG,CD1,CD2)、Y105(Hyd,CG,CD2,CE2)、R131(Ion,NH2)(HydDonor,NH2)、S133(Hyd,CA,CB)(HydDonor/Acceptor,OG)、Y134(Hyd,CD1,CE1)、F181(Hyd,CB,CG,CD1,CD2,CE1,CE2,CZ)、以及D183(Hyd,CB)。
實施例10：鼠類以及人類抗KIR抗體的Biacore競爭結合分析
1-7F9、Pan2D(NKVSF1)、以及DF200的競爭結合是根據與實施例5描述相同的方法評估的。
結果顯示在表6以及7，其中標示為「第一抗體」的抗體列在垂直的欄位中，而‘第二抗體’則列在水平的欄位中。對每一個測試的抗體組合來說，列出第二抗體結合的抑制百分比。不管使用哪一種抗體作為第一抗體，當一些抗體對(pair)抑制百分比大於40%時，該些抗體被認為是相競爭的。表6顯示與KIR2DL1晶片的結合，而表7顯示抗體與KIR2DL3晶片的結合。
簡單來說，以KIR2DL1的結合而言，結果顯示DF200和Pan2D是相競爭的，但是1-7F9不與DF200或Pan2D其中之一相競爭。以KIR2DL3的結合而言，DF200以及Pan2D是相競爭的，但是1-7F9不與Pan2D競爭，但與DF200競爭。
表6
第一及第二抗體之間的KIR2DL1競爭結合
表7
第一及第二抗體之間的KIR2DL3競爭結合
實施例11：KIR2DL1與HuKIR1-7F9-Fab’複合之結晶結構
KIR2DL1與1-7F9之Fab’片段複合的結晶結構被以X射線結晶法解析和精鍊到2.35解析度。結果確認了當抗體與KIR2DL1結合，抗體能夠阻斷結合至MHC第一型分子(圖19)。
材料及方法
將細胞外KIR2DL1(SEQ ID NO：23的胺基酸1-223，第16個殘基是精胺酸(R)以及第114個殘基是白胺酸(L)，且包括一額外的N-端甲硫胺酸(M)殘基)與HuKIR1-7F9 Fab’(有SEQ ID NO：36的輕鏈序列以及SEQ ID NO：37殘基1-221的重鏈序列)混合，KIR2DL1稍微多一點，以及複合物以膠體過濾管柱純化。然後複合物被濃縮到約13.5毫克/毫升。用懸滴法(hanging drop technique)長出結晶，於10% PEG6000以及500 mM檸檬酸緩衝液中，pH為4.2。將結晶急速冷凍於液態氮中，於100 K使用光束線(beam-line)BL711I(瑞典隆德MAX實驗室)取得解析度2.35的結晶資料。將資料用XDS程式(Kabsch，J. Appl. Crystallogr. 1993；26：795-800)積分。對結構決定分子置換，使用CCP4系列的MOLREP程式(Bailey,Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1994；50：760-763)，以及使用PDB存放的結構1RZJ(Fab第1部分)和1NKR(KIR)。相位改善是用ARP/WARP程式(Lamzin以及Wilson,Acta Crytallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1993；49：129-147)進行，以及用QUANTA程式(可得自美國加州聖地牙哥的Accelrys Inc.)對源自X射線結構的模型進行手動修飾。修飾是在CCP4系列的REFMAC5電腦程式中進行的。藉由ARP/WARP程式添加水分子。該模型包含KIR2DL1的殘基6-114以及124-200、1-7F9輕鏈的1-212和1-7F9重鏈的1-136與143-224。此外，放置了330的水分子。該模型的R以及無R分別是0.191以及0.253。
結果
藉由CCP4系列的接觸(CONTACT)電腦程式，Fab’與KIR2DL1分子之間的截斷半徑(cut-off distance)為4.0來鑑認接觸。結果發現人類1-7F9的KIR2DL1抗原決定基包含KIR2DL1(SEQ ID NO：23)的下列殘基：L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88(表8和9)。涉及與KIR2DL1交互作用的殘基1-7F9包括1-7F9變異輕(VL)鏈(SEQ ID NO：15，表8)的S28、V29、S30、Y32、S92、N93、以及W94，還有變異重(VH)鏈(SEQ ID NO：17)的T28、F29、S30、F31、I54、F55、E74、S77、G102、S103、Y105、Y106、D107、以及Y108。KIR2DL1抗原決定基以及涉及氫鍵結合的殘基也顯示在圖20之KIR2DL1胺基酸序列中。得自協調修飾(coordinate refinement)的等向性原子位移因子(isotropic displacement factor)(也稱為「溫度因子」或「B值」)顯示KIR2DL1的N端功能部位以及1-7F9抗體Fab’片段的可變功能部位有相當低的值，所有功能部位都直接涉及分子間的結合。這顯示結晶複合物兩個分子之間的結合力是強且安定的，也支持了結晶結構描繪了一個安定的KIR2DL1/1-7F9 Fab’複合物。
1-7F9 Fab’分子係結合至KIR2DL1分子功能部位D1之C’CFGA’β-折疊片(β-sheet)一側，但此外也也與同一功能部位之一個Eβ-股殘基側鏈接觸。與D1功能部位之環狀(loop)殘基的連接對結合也很重要(拓樸學命名常規參見Fan等人，Nature 1997；389：96-100)。更特定而言，與KIR2DL1的下列拓樸部位有連接：β-股C(胺基酸L38以及R41)、β-股C和C’之間的環狀、L2(M44、F45以及N46)、β-股C’(D47、T48、L49、R50和I52)、β-股E(F64)、E以及Fβ-股之間的環狀、L3(D72)、β-股F(Y80)以及F和Gβ-股之間的環狀(P87與Y88)。
雖然HLA-Cw4分子與KIR2DL1分子的D1以及D2兩者的功能部位結合(Fan等人Nat. Immunol. 2001；2：452-460)，但1-7F9抗體只與KIR2DL1 D1功能部位結合。然而，在結合的1-7F9以及結合的HLA-Cw4分子之間有空間上的重疊，大到足以使1-7F9抗體成功的取代HLA-Cw4。使用KIR2DL1與HLA-Cw4複合之公開結構(PDB編號1IM9)，可以用接觸程式計算出KIR2DL1以及HLA-Cw4之間的接觸殘基。在使用截斷半徑為4.0的計算中，可以看到有三個與HLA-Cw4殘基接觸的KIR2DL1殘基常會與1-7F9/KIR2DL1複合物的殘基接觸(表8及9)。這三個KIR2DL1殘基是M44、F45以及D72。
不受限於任何特定的學說，結晶結果也顯示1-7F9不會與活化的NK受體KIR2DS4結合，因為KIR2DS4序列(SEQ ID NO：38)細胞外部的胺基酸N47以及V72。
表8
KIR2DL1-1-7F9 Fab’ VL鏈交互作用。使用截斷半徑4.0。藉由CCP4系列的接觸電腦程式鑑認出接觸。在最後一欄中，「***」表示於此接觸有強的氫鍵可能性(距離<3.3)，如接觸程式所計算的，「*」表示小的可能性(距離>3.3)。空白表示程式認為那裡不可能有氫鍵。
表9
KIR2DL1-1-7F9 Fab’ VH鏈交互作用。使用截斷半徑4.0。藉由CCP4系列的接觸電腦程式鑑認出接觸。在最後一欄中，「***」表示於此接觸有強的氫鍵可能性(距離<3.3)，如接觸程式所計算的，「*」表示小的可能性(距離>3.3)。空白表示程式認為那裡不可能有氫鍵。
實施例12：1-7F9的物理安定性
研究人類抗體1-7F9的生物物理性質以及安定性。以旋光分光儀(circular dichroism；CD)研究蛋白質的摺疊和二級結構，以及藉由動態光散射(DLS)研究寡聚合和聚集。為了模擬於5℃儲存兩年的狀況，將蛋白質置於37℃震盪培養14天。
材料及方法
樣本製備。2毫克/毫升的1-7F9是製備在(a)50 mM磷酸鈉、0.001%聚山梨糖醇酯80(Sigma，P8074)、pH 7.0；(b)50 mM磷酸鈉、0.001%聚山梨糖醇酯80、pH 7.0、0.5 mM蔗糖；(c)50 mM檸檬酸、0.001%聚山梨糖醇酯80、pH 3.0；以及d)50 mM Tris、0.001%聚山梨糖醇酯80、pH 8.5中。
旋光分光儀(CD)。CD測量是在25℃進行的，蛋白質濃度為2.0毫克/毫升，在配備有珀爾帖元件(peltier element)以控制溫度的Chirascan旋光分光光譜儀(Applied Photophysics)上。1-7F9樣本是在通道長度0.1 mm的圓柱形石英槽(quartz cell)中。紀錄緩衝掃描並於各個樣本光譜中扣除。
動態光散射(DLS)。DLS是在25℃中進行的，蛋白質濃度為2.0毫克/毫升，使用Dynapro 99溫度控制DLS儀器(Protein Solutions Inc.)。資料分析是使用儀器所附的Dynamics軟體進行的。
結果
雖然於pH 7.0經過14天培養之樣本分子大小並沒有改變，如DLS所評估的，但是於pH 3.0以及pH 8.5配製的樣本皆在14天的期間中嚴重聚集。
CD測量顯示了所有貝塔結構的特徵，並且顯示於pH 7.0配製的樣本在整個加速研究中會維持其二級結構，雖然只含有聚山梨糖醇酯80作為賦形劑的樣本訊號有些微落差。這可能是由於樣本稍微的沉澱，因為整體光譜形式並未改變。含有蔗糖的樣本在經過一段時間之後則沒有顯示此降低。以CD測量於pH 3.0以及8.5配製的樣本顯示經過一段時間之後光譜特徵有強烈的改變，可能是起因於展開(unfolding)或其他構形改變，這可能會導致無功能的1-7F9蛋白質。這改變是立即被觀察到的而且在pH 3.0最顯著。
總體而言，pH 7.0含聚山梨糖醇酯80以及蔗糖作為賦形劑的1-7F9在壓力環境(37℃震盪)下會維持其物理性質及維持安定。
實施例13：1-7F9以及1-4F1的親和性決定(一價結合)
1-7F9以及1-4F1一價結合至KIR2DL1和KIR2DL3抗原的親和性(相對於實施例3及8的二價結合親和性決定)是藉由表面電漿共振技術決定的，使用Biacore 3000。
簡單來說，抗人類IgG(Dako RAHIgG，# 0423)是與HBS-EP緩衝液一同使用的，流速20微升/分鐘。將經純化的抗體稀釋至10微克/毫升。對每一種抗體都注射KIR2DL1或KIR2DL3以及緩衝液。抗原的測試濃度為2000、500、200、50或20nM。流速維持在20微升/分鐘。表面再生是藉由單次30s注射甘胺酸-HCl pH 1.8達成的。
結果顯示於表10。對1-4F1與KIR2DL1的結合，基線有顯著的偏移。不受限於任何特定學說，這可能是代表了基質(matrix)所引起的緩衝效果，或者結合反應事實上涉及了2個步驟，例如因為抗原的構形改變。
表10
1-7F9及1-4F1一價結合至KIR2DL1及KIR2DL3的親和性。*)表示與普遍相合的RI(基質的反應)相容。
本發明的例示方面
1.一種抗體，其包含含有至少50%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及/或含有至少50%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
2.一種抗體，其包含含有至少80%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及/或含有至少80%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
3.一種抗體，其包含含有至少90%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及/或含有至少90%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
4.一種抗體，其包含含有至少95%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及/或含有至少95%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
5.一種抗體，其包含含有至少98%與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及/或含有至少98%與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
6.根據前述任一項方面的抗體，其中輕鏈可變區域包含至少一個保守性胺基酸取代，各胺基酸取代相較於SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：39中相應位置的胺基酸是保守性的。
7.根據前述任一項方面的抗體，其中重鏈可變區域包含至少一個保守性胺基酸取代，各胺基酸取代相較於SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：41中相應位置的胺基酸是保守性的。
8.根據前述任一項方面的抗體，其包含至少下列一項
a)一輕鏈CDR1胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：15的殘基24-34一致；
b)一輕鏈CDR2胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：15的殘基50-56一致；
c)一輕鏈CDR3胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：15的殘基89-97一致；
d)一重鏈CDR1胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：17的殘基31-35一致；
e)一重鏈CDR2胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：17的殘基50-65一致；以及
f)一重鏈CDR3胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：17的殘基99-112一致。
9.根據前述任一項方面的抗體，其包含至少下列一項
a)一輕鏈CDR1胺基酸序列與SEQ ID NO：15的殘基24-34相當；
b)一輕鏈CDR2胺基酸序列與SEQ ID NO：15的殘基50-56相當；
c)一輕鏈CDR3胺基酸序列與SEQ ID NO：15的殘基89-97相當；
d)一重鏈CDR1胺基酸序列與SEQ ID NO：17的殘基31-35相當；
e)一重鏈CDR2胺基酸序列與SEQ ID NO：17的殘基50-65相當；以及
f)一重鏈CDR3胺基酸序列與SEQ ID NO：17的殘基99-112相當。
10.根據前述任一項方面的抗體，其包含至少下列一項
a)一輕鏈CDR1胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：15的殘基24-34所組成；
b)一輕鏈CDR2胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：15的殘基50-56所組成；
c)一輕鏈CDR3胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：15的殘基89-97所組成；
d)一重鏈CDR1胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：17的殘基31-35所組成；
e)一重鏈CDR2胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：17的殘基50-65所組成；以及
f)一重鏈CDR3胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：17的殘基99-112所組成。
11.根據第8至10方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少2項。
12.根據第8至10方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少3項。
13.根據第8至10方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少4項。
14.根據第8至10方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少5項。
15.根據第8至10方面中任一項的抗體，其包含所有(a)至(f)。
16.根據前述任一項方面的抗體，其包含一含有SEQ ID NO：15胺基酸序列的輕鏈可變區域、以及一含有SEQ ID NO：17胺基酸序列的重鏈可變區域。
17.根據第1至7方面中任一項的抗體，其包含至少下列一項
g)一輕鏈CDR1胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：39的殘基24-34一致；
h)一輕鏈CDR2胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：39的殘基50-56一致；
i)一輕鏈CDR3胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：39的殘基89-97一致；
j)一重鏈CDR1胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：41的殘基31-35一致；
k)一重鏈CDR2胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：41的殘基50-66一致；以及
l)一重鏈CDR3胺基酸序列至少90%與SEQ ID NO：41的殘基99-113一致。
18.根據第1至7以及17方面中任一項的抗體，其包含至少下列一項
g)一輕鏈CDR1胺基酸序列與SEQ ID NO：39的殘基24-34相當；
h)一輕鏈CDR2胺基酸序列與SEQ ID NO：39的殘基50-56相當；
i)一輕鏈CDR3胺基酸序列與SEQ ID NO：39的殘基89-97相當；
j)一重鏈CDR1胺基酸序列與SEQ ID NO：41的殘基31-35相當；
k)一重鏈CDR2胺基酸序列與SEQ ID NO：41的殘基50-66相當；以及
1)一重鏈CDR3胺基酸序列與SEQ ID NO：41的殘基99-113相當。
19.根據第1至7以及17至18方面中任一項的抗體，其包含至少下列一項
g)一輕鏈CDR1胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：39的殘基24-34所組成；
h)一輕鏈CDR2胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：39的殘基50-56所組成；
i)一輕鏈CDR3胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：39的殘基89-97所組成；
j)一重鏈CDR1胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：41的殘基31-35所組成；
k)一重鏈CDR2胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：41的殘基50-66所組成；以及
1)一重鏈CDR3胺基酸序列，其基本上係由SEQ ID NO：41的殘基99-113所組成。
20.根據第17至19方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少2項。
21.根據第17至19方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少3項。
22.根據第17至19方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少4項。
23.根據第17至19方面中任一項的抗體，其包含(a)至(f)至少5項。
24.根據第17至19方面中任一項的抗體，其包含所有(a)至(f)。
25.根據第1至7以及17至24方面中任一項的抗體，其包含一含有SEQ ID NO：39胺基酸序列的輕鏈可變區域、以及一含有SEQ ID NO：41胺基酸序列的重鏈可變區域。
26.根據前述任一方面的抗體，其中抗體不與KIR2DS4以及KIR2DS3中至少一者結合。
27.根據第1至15以及26方面中任一項的抗體，其中抗體阻斷KIR2DL1以及KIR2DL2/3結合至HLA-C第一型分子。
28.根據第1至15以及26至27方面中任一項的抗體，該抗體會誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子之人類標的細胞的溶解活性。
29.根據第1至15以及26至28方面中任一項的抗體，該抗體比DF200更能有效誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子之人類標的細胞的溶解活性。
30.根據第1至15以及26至28方面中任一項的抗體，該抗體比NKVSF1(Pan2D)更能有效誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子之人類標的細胞的溶解活性。
31.根據第1至15以及26至28方面中任一項的抗體，該抗體比EB6更能有效誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子之人類標的細胞的溶解活性。
32.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體是人類或人化抗體。
33.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體。
34.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體是人類IgG4抗體。
35.根據第1至34方面中任一項的抗體，其中該抗體是人類IgG2抗體。
36.一種人類IgG4抗體，其包含一含有SEQ ID NO：15胺基酸序列的輕鏈可變區域、以及一含有SEQ ID NO：17胺基酸序列的重鏈可變區域。
37.一種人類IgG2抗體，其包含一含有SEQ ID NO：39胺基酸序列的輕鏈可變區域、以及一含有SEQ ID NO：41胺基酸序列的重鏈可變區域。
38.一種與1-7F9競爭結合至KIR2DL1或KIR2DL2/3的抗體，其中該抗體不是1-4F1、DF200、gl183、A210、A803(g)、或EB6。
39.一種與1-4F1競爭結合至KIR2DL1或KIR2DL2/3的抗體，其中該抗體不是1-7F9、DF200、gl183、A210、A803(g)、或EB6。
40.根據第38方面的抗體，其中該抗體不是1-4F1。
41.根據第39方面的抗體，其中該抗體不是1-7F9。
42.根據第38至39方面中任一項的抗體，其中該抗體不是DF200。
43.根據第38至39方面中任一項的抗體，其中該抗體不是gl183。
44.根據第38至39方面中任一項的抗體，其中該抗體不是EB6。
45.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL1的Kd不大於約20 nM。
46.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL1的Kd不大於約10.9 nM。
47.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL1的Kd不大於約0.45 nM。
48.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL3的Kd不大於約20 nM。
49.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL3的Kd不大於約2.0 nM。
50.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體對KIR2DL3的Kd不大於約0.025 nM。
51.根據前述任一方面的抗體，其中該抗體是人類的。
52.一種與1-7F9競爭結合至KIR2DL1的人類或人化抗體。
53.一種與1-4F1競爭結合至KIR2DL1的人類或人化抗體。
54.一種與1-7F9競爭結合至KIR2DL2的人類或人化抗體。
55.一種與1-4F1競爭結合至KIR2DL2的人類或人化抗體。
56.一種與1-7F9競爭結合至KIR2DL3的人類或人化抗體。
57.一種與1-4F1競爭結合至KIR2DL3的人類或人化抗體。
58.一種與1-7F9競爭結合至KIR2DL1以及KIR2DL2/3的人類或人化抗體。
59.一種與1-4F1競爭結合至KIR2DL1以及KIR2DL2/3的人類或人化抗體。
60.根據第52至59方面中任一項的人類或人化抗體，其中該抗體不與KIR2DS4以及KIR2DS3中至少一者結合。
61.根據第52至60方面中任一項的人類或人化抗體，其中該抗體阻斷KIR2DL1或KIR2DL2/3結合至HLA-C第一型分子。
62.根據第52至47方面中任一項的人類或人化抗體，其中該抗體誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子之人類標的細胞的溶解活性。
63.根據第52至62方面中任一的人類或人化抗體，其中該抗體包含含有至少90%與SEQ ID NO：15一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及含有至少90%與SEQ ID NO：17一致的胺基酸序列的重鏈可變區域，或含有至少90%與SEQ ID NO：39一致的胺基酸序列的輕鏈可變區域、及含有至少90%與SEQ ID NO：41一致的胺基酸序列的重鏈可變區域。
64.根據第52至63方面中任一項的人類或人化抗體，其中該抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體。
65.根據第64方面中的人類或人化抗體，其中該抗體是IgG4抗體。
66.根據第64方面中的人類或人化抗體，其中該抗體是IgG2抗體。
67.一種人類或人化抗體，其結合至各KIR2DL1、-2、和-3，且其阻斷KIR2DL1、-2、或-3結合至HLA-C第一型分子。
68.一種抗體，其與KIR2DL1的殘基M44以及F45交互作用。
69.根據第68方面中的抗體，其中該抗體進一步與一或更多的KIR2DL1殘基L38、R41、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88交互作用。
70.一種抗體，其專有結合至KIR2DL1由胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88所定義之區域內。
71.一種抗體，其結合至KIR2DL1以及KIR2DL2/3而不會與由殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88所定義之區域以外的胺基酸殘基交互作用。
72.根據第67至71方面中任一項的抗體，其中該抗體是人類抗體1-7F9。
73.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少一個輕鏈CDR。
74.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少兩個輕鏈CDR。
75.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少三個輕鏈CDR。
76.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的VL區域。
77.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少一個重鏈CDR。
78.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少兩個重鏈CDR。
79.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的至少三個重鏈CDR。
80.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的VH區域。
81.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的所有CDR。
82.一種抗體片段或抗體衍生物，其包含根據前述任一方面之抗體的VH以及VL區域。
83.一種產生根據前述任一方面之抗體的融合瘤。
84.一種編碼有根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段的核酸。
85.一種包含根據第84方面中之核酸的載體。
86.一種包含根據第85方面中之載體的細胞。
87.根據第86方面中的細胞，其中該細胞是選自猴COS細胞、CHO細胞、以及人類骨髓癌細胞。
88.一種產生抗KIR抗體或抗體片段的方法，該方法包含在適合分別表現抗KIR抗體、抗體片段的條件下培養根據第86方面中的細胞。
89.一種產生抗KIR抗體或抗KIR抗體片段衍生物的方法，該方法包含提供一抗KIR抗體或抗體片段，以及將至少一個衍生物部分(moiety)結合於其上。
90.一種治療個體之癌症的方法，該方法包含將有效量的根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物給藥給患有癌症的個體。
91.根據第90方面中的方法，其進一步包含給藥給患者一藥劑，該藥劑係選自化學治療劑、放射線治療劑、抗血管新生劑、免疫調節劑、以及荷爾蒙劑。
92.一種治療個體由病毒所引起之疾病或失調的方法，該方法包含將有效量的根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物給藥給患有由病毒所引起之疾病或失調的個體。
93.一種根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物的用途，其係用於製備用於治療癌症的醫藥品。
94.一種根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物的用途，其係用於製備用於治療由病毒所引起之疾病或失調的醫藥品。
95.一種組成物，其包含根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物、以及醫藥上可接受的載劑或賦形劑。
96.根據第95方面中的組成物，其包含聚山梨糖醇酯80。
97.根據第95方面中的組成物，其包含蔗糖。
98.根據第95方面中的組成物，其包含聚山梨糖醇酯80以及蔗糖。
99.根據第95至98方面中任一項之組成物，其進一步包含選自化學治療劑、放射線治療劑、抗血管新生劑、免疫調節劑、以及荷爾蒙劑的藥劑。
100.根據第95至99方面中任一項之組成物，其中抗體、抗體片段、或抗體衍生物是共價接合至腫瘤標的藥劑。
101.根據第95至99方面中任一項之組成物，其中抗體、抗體片段、或抗體衍生物是裝入脂質體中的。
102.根據第95至99方面中任一項之組成物，進一步包含結合至KIR的抗體，其中該KIR不是KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS1、或KIR2DS2。
103.一種增加細胞溶解活性的方法，該細胞係選自淋巴細胞以及NK細胞，該方法包含將細胞與根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物接觸。
104.一種降低由選自淋巴細胞、T細胞、和NK細胞之細胞所表現的KIR以及由標的細胞所表現之HLA-C第一型分子之間的交互作用的方法，該方法包含將細胞與根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物接觸。
105.一種中和由NK細胞所表現的KIR之抑制活性的方法，該方法包含將NK細胞與根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物接觸。
106.一種結合至KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3每一者的人類抗體，該抗體阻斷HLA-Cw4分子結合至KIR2DL1，且阻斷HLA-Cw3分子結合至KIR2DL2或KIR2DL3至少一者。
107.根據第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物，其中KIR2DL1包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，KIR2DL2包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列、及/或KIR2DL3包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列。
108.一種化合物，其結合至實質上與第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物相同的KIR2DL1抗原決定基。
109.一種化合物，其結合至基本上與第1至82方面中任一項之抗體或抗體片段或衍生物相同的KIR2DL1抗原決定基。
110.一種抗體或抗體衍生物，其包含含有SEQ ID NO：36序列的輕鏈。
111.一種抗體或抗體衍生物，其包含含有SEQ ID NO：37序列的重鏈。
112.一種抗體或抗體衍生物，其包含第109方面的輕鏈以及第110方面的重鏈。
113.一種由含有SEQ ID NO：36序列的輕鏈以及由SEQ ID NO：37序列組成的重鏈所組成的抗體。
本文所引用的所有參考資料，包括出版品、專利申請案以及專利，被以相同的程度在此併入作為參考，就如同各參考文獻個別的以及特定的被指明併入本文作為參考，且是以其全文提出。
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用於描述本發明之上下文的術語「一(a)」和「一(an)」以及「該(the)」與相似的指示對象應被理解為涵蓋單數及複數，除非本文另有指明或明顯與上下文相違背。
本文所列舉的數值範圍只是作為個別論及落於此範圍中的各獨立數值的簡略表達方式，除非本文另有指明，且各獨立數值是包含在本說明書中的，就如同該數值在本文中被個別的指明出來。除非本文另有指明，否則所有本文提供的實際數值代表了對應的近似數值(例如以特定因子或測量所提供的所有實際例示的數值可以被認為是也提供了對應的近似測量，當合適時以「約」來修飾)。
所有本文所描述的方法可以用任何合適的順序進行，除非本文另有指明或明顯與上下文相違背。
任何和所有本文所用的實施例、或例示的語言(例如「諸如」)只是為了更佳的說明本發明，而不該作為對本發明範圍的限制，除非另有指明。說明書中沒有用語應被視為指出任何元件是對於實施本發明是必要的，除非有明確的指明。
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本發明包括所有本文所列之方面以及申請專利範圍所舉之標的的修飾以及均等物以最大化專利法所准許的範圍。
圖1繪示結合到各種人類KIR2DL受體常見的決定基之鼠類單株抗體DF200。(A)選殖株CP11、KIR2DL1+、DF200。(B)選殖株CP502、KIR2DL3+。(C)選殖株CP11、KIR2DL1+、抗KIR2DL1。(D)選殖株CP502、KIR2DL3+、抗KIR2DL2/3。
圖2繪示鼠類單株抗體DF200，該抗體中和對表現Cw4之標的細胞的KIR2DL1-調控的NK細胞細胞毒性抑制作用，顯示了以抗KIR mAb於C1R-Cw4標的的溶解重建，作用子/標的(E/T)比例為4/1。
圖3繪示鼠類單株抗體DF200、DF200的Fab片段、以及習知的鼠類抗體，其對KIR2DL1(mAbs EB6以及XA-141)或KIR2DL2/3(mAbs GL183以及Y249)有專一性，中和對Cw4-陽性標的細胞的KIR2DL1-調控的細胞毒性抑制作用、以及中和對Cw3-陽性標的細胞的KIR2DL2/3-調控的NK細胞細胞毒性抑制作用。(A)以及(C)KIR2DL1+、標的細胞721.221-Cw4+。(B)KIR2DL2+、標的細胞721.221-Cw3+。(D)KIR2DL3+、標的細胞721.221-Cw3+。
圖4繪示表現KIR2DL1的NK細胞對HLA-Cw4陽性標的細胞之細胞溶解的重建，其在DF200以及EB6抗體的F(ab’)2片段存在下，該細胞表現對抗。(A)標的細胞721.221-Cw4；E/T比例=1。(B)標的細胞B-EBV細胞表現Cw4，E/T比例=2。
圖5繪示NK調控的毒殺作用的誘導，其係藉由交互反應的鼠類(DF200以及NKVSF1(Pan2D))和人類(1-7F9、1-4F1、1-6F5以及1-6F1)mAbs、以及鼠類習知的KIR2DL1-專一性mAb(EB6)。藉由被HLA-Cw4轉染之721.221標的細胞的表現KIR2DL1的NK細胞(YTS-KIR2DL1)，該mAb誘導(重建)毒殺作用。E/T比例=1。(A)30微克/毫升mAb。(B)10微克/毫升mAb。
圖6繪示由如圖5中的同一抗體之NK調控的毒殺作用誘導。藉由表現內生HLA-Cw4之B-EBV細胞的表現KIR2DL1的NK細胞(YTS-KIR2DL1)，該mAb誘導(重建)毒殺作用。E/T比例=2。(A)30微克/毫升mAb。(B)10微克/毫升mAb。
圖7繪示一抗原決定基圖譜，其顯示競爭結合實驗的結果，該結果的獲得是藉由表面電漿共振子(BIAcore)分析，以抗KIR抗體對KIR2DL1，其中重疊的圈圈表示mAb之間結合至KIR2DL1的重疊。結果顯示，在KIR2DL1，1-7F9是與EB6以及1-4F1競爭，但不是與NKVSF1(Pan2D)以及DF200競爭。抗體1-4F1則與EB6、DF200、NKVSF1(Pan2D)、以及1-7F9競爭。在KIR2DL1，抗體NKVSF1(Pan2D)與DF200、1-4F1、以及EB6競爭，但不與1-7F9競爭。在KIR2DL1，DF200與NKVSF1(Pan2D)、1-4F1、以及EB6競爭，但不與1-7F9競爭。
圖8繪示一抗原決定基圖譜，其顯示競爭結合實驗的結果，該結果的獲得是藉由BIAcore分析，以抗KIR抗體對KIR2DL3，其中重疊的圈圈表示與KIR2DL3結合重疊。結果顯示，在KIR2DL3，1-4F1是與NKVSF1(Pan2D)、DF200、gl183、以及1-7F9競爭。在KIR2DL3，1-7F9是與DF200、gl183、以及1-4F1競爭，但不是與NKVSF1(Pan2D)競爭。在KIR2DL3，NKVSF1(Pan2D)與DF200、1-4F1、以及GL183競爭，但不是與1-7F9競爭。在KIR2DL3，DF200是與NKVSF1(Pan2D)、1-4F1、以及1-7F9競爭，但不是與GL183競爭。
圖9繪示一抗原決定基圖譜，其顯示競爭結合實驗的結果，該結果的獲得是藉由BIAcore分析，以抗KIR抗體對KIR2DS1，其中重疊的圈圈表示與KIR2DS1結合重疊。結果顯示，在KIR2DS1，抗體1-4F1是與NKVSF1(Pan2D)、DF200、以及1-7F9競爭。在KIR2DS1，抗體1-7F9是與1-4F1競爭，但不是與DF200以及NKVSF1(Pan2D)競爭。在KIR2DS1，NKVSF1是與DF200以及1-4F1競爭，但不是與1-7F9。在KIR2DS1，DF200是與NKVSF1以及1-4F1競爭，但不是與1-7F9。
圖10繪示Pan2D(NKVSF1)mAb滴定，證明mAb結合至獼猴(cynomolgus)NK細胞。獼猴NK細胞(NK團第16天)係與不同量的NKVSF1(Pan2D)mAb培養，然後與PE-接合的羊F(ab’)2片段抗鼠IgG(H+L)抗體培養。陽性細胞的百分比係以同型(isotypic)控制(經純化的鼠IgG1)來決定。樣品經重複實驗。平均螢光強度=MFI。
圖11顯示可溶性KIR2DL1以及KIR2DL1(R131W)突變株結合至細胞。(A)增加濃度的可溶性KIR2DL1-Fc、以及KIR2DL1(R131W)-hFc突變株結合至表現HLA-Cw3或-Cw4的細胞。所結合的KIR-Fc蛋白質是用二級螢光團接合的抗體來偵測，以及由流式細胞儀顯示。平均螢光顯示在y軸。(B)所指的抗KIR mAbs(GL183、EB6、DF200、以及Pan2D(NKVSF1))結合至KIR2DL1-Fc以及2DL1(R131W)突變株蛋白質，使用人類Ig作為控制組。該圖顯示DF200以及Pan2D(NKVSF1)與突變株的結合比與野生型KIR2DL1-Fc的結合差，顯示兩mAb都被R131W突變所影響。所以，R131是KIR2DL1中組成DF200以及Pan2D之抗原決定基的其中一個殘基。
圖12提供一個輕鏈可變區域以及抗體DF200和Pan2D(NKVSF1)的輕鏈CDR之胺基酸序列的相比較的排列。(A)DF200(SEQ ID NO：1)以及Pan-2D(SEQ ID NO：2)之抗KIR可變輕(VL)區域的排列。胺基酸序列上面的數字係指出在未成熟(非分泌性的)免疫球蛋白中相關於起始轉譯Met(+1)的位置。(B)CDR-L1序列的排列。之前的殘基：正常的Cys。之後的殘基：Trp。典型是Trp-Tyr-Leu。長度：10-17 aa。(C)CDR-L2序列的排列。之前的殘基：一般是Ile-Tyr。長度：7 aa。起始：在CDR-L1尾端之後大約16個胺基酸。起始：從分泌蛋白質的起始大約24個胺基酸。(D)CDR-L3序列的排列。之前的殘基：Cys。之後的殘基：Phe-Gly-XXX-Gly。長度：7-11 aa。起始：在CDR-L2尾端之後大約33個胺基酸。
圖13提供抗體DF200之重鏈可變區域以及重鏈CDR。(A)DF-200 VH區域，未成熟的蛋白質。分泌的、成熟的VH開始在位置20：殘基Q。VH區域以殘基S結束並且之後繼續為固定區域(未顯示)。(B)CDR-H1。之前的殘基：Cys-XXX-XXX-XXX。之後的殘基：Trp。一般是Trp-Val或Trp-Ile。長度：10-14 aa。起始：在分泌的蛋白質起始之後大約22-26個胺基酸。(C)CDR-H2。之前的殘基：Leu-Glu-Trp-Ile-Gly但可以是其他改變。之後的殘基：Lys或Arg/Leu或Ile或Val或Phe或Thr或Ala/Thr或Ser或Ile或Ala。長度：16-20 aa。起始：在CDR-H1尾端後大約15個胺基酸。(D)CDR-H3。之前的殘基：Cys-XXX-XXX(典型是Cys-Ala-Arg)。之後的殘基：Trp-Gly-XXX-Gly。長度：3-25 aa。起始：在CDR-H2尾端後大約33個胺基酸。
圖14繪示人類抗體1-7F9之VH以及VL序列的核苷酸以及胺基酸序列。(A)HuKIR 1-7F9成熟可變輕鏈的轉譯。(B)編碼有HuKIR 1-7F9成熟可變輕鏈的苷酸序列。(C)HuKIR 1-7F9成熟可變重鏈的轉譯。(D)編碼有HuKIR 1-7F9成熟重鏈的苷酸序列。
圖15顯示單株抗體1-7F9、DF200(VH序列：SEQ ID NO：19；VL序列：SEQ ID NO：21)、以及Pan2D(NKVSF1；VH序列：SEQ ID NO：20；VL序列：SEQ ID NO：22)的胺基酸序列之VH以及VL序列。CDR以框框標出。
圖16繪示流式細胞儀數據，顯示鼠類抗體、Pan2D(NKVSF1)以及人類mAbs 1-7F9和1-4F1結合至被KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3或KIR2DS4轉染的細胞，如所示(純化的抗體：1微克/毫升)。(A)-(R)NKVSF1(pan2D)、1-7F9、以及1-4F1都結合至KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS1、以及KIR2DS2。沒有抗體結合至KIR2DS3。NKVSF1(但不是1-7F9或1-4F1)結合至KIR2DS4。
圖17繪示FACS的分析結果。(A)可溶性KIR-Fc結合至細胞上之HLA-Cw4的抗體調控之中和作用，其係以流式細胞儀(FACS)偵測。FACS測量KIR2DL1-mFc結合至LCL721.221-Cw4細胞，其係在以各種濃度之交互反應的mAb DF200、或KIR2DL2/3-專一性mAb GL183預培養之後。DF200(但不是GL183)減低了KIR2DL1對HLA-Cw4的結合。測量係繪製為在缺乏抑制性抗體下KIR2DL1-hFc-結合的百分比。(B)FACS-測量KIR2DL1-mFc結合至LCL721.221-Cw4細胞，其係在以各種濃度之1-1F4以及1-7F9預培養之後。測量係繪製為在缺乏抑制性抗體下KIR2DL1-mFc-結合的百分比。
圖18繪示51 Cr-釋放細胞毒性分析的結果。(A)LCL 721.221-Cw3細胞在各種E：T比例下被YTS細胞(菱形)以及YTS-2DL1細胞(三角形)有效的殺死。相反的，LCL 721.221-Cw4細胞被YTS細胞(正方形)有效的殺死，但不能被YTS-2DL1細胞(叉叉)殺死，其係因為KIR-限制。(B)在缺乏抗體下，YTS-2DL1細胞不能殺死LCL-721.221-Cw4(E：T比例12：1)。1-7F9藉由YTS-2DL1細胞誘導LCL 721.221-Cw4細胞的毒殺作用，以劑量依賴的形式。
圖19繪示兩個結晶複合物結構的疊合；KIR2DL1/1-7F9 Fab’以及KIR2DL1/MHC第一型、PDB-code 1IM9(Fan等人，Nat. Immounol. 2001；2：452-460)，使用一般KIR分子的Cα-原子(標示為‘KIR’)作為模板。KIR2DL1/1-7F9 Fab’是以灰色彩帶表示，而KIR2DL1/MHC第一型是以深色管狀表示。1-7F9 Fab’標示為‘1-7F9’，而MHC第一型標示為‘MHC’。MHC與Fab’的重疊處在疊合處，證明1-7F9 Fab’有妨礙MHC第一型結合至KIR2DL1受體的能力。見實施例11。
圖20顯示KIR2DL1上1-7F9抗原決定基的結合，如KIR2DL1序列所示。與1-7F9相距4.0的胺基酸以灰色及黑色底標出。被黑色底標示的胺基酸涉及與1-7F9氫鍵結合。
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<221>　雜項特徵
<222>　(1)..(109)
<223>　Xaa 3是Q或R。Xaa 4是L或M。Xaa 9是S或F。Xaa 24是R或W。Xaa 32是A或Y。Xaa 41是G或A。Xaa 47是L或F。Xaa 50是D或Y。Xaa 55是E或Q。Xaa 71是F或Y。Xaa 74是A或T。
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<221>　雜項特徵
<222>　(1)..(153)
<223>　n8是a或g。n10是t或a。n26是c或t。n70是c或t。n75是a或c。n94是g或t。n95是c或a。n114是g或a。n122是g或c。n123是g或a。n129是t或c。n139是c或t。n141是g或c。n148是g或t。n153是c或a。
<220>
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<222>　(154)..(327)
<223>　n162是g或a。n163是g或c。n207是a或g。n212是t或a。n220是g或a。
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Claims (27)

  1. 一種經分離的人類、人化、或嵌合抗體或其抗原結合片段，其結合至KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3每一者，但不與KIR2DS4結合，且誘發NK細胞對表現HLA-C第一型分子的人類標的細胞的溶解作用活性。
  2. 根據申請專利範圍第1項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其進一步不與KIR2DS3結合。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體阻斷了KIR2DL1、KIR2DL2、以及KIR2DL3至少一者與HLA-C第一型分子的結合。
  4. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體阻斷了HLA-Cw4分子與KIR2DL1的結合，及阻斷HLA-Cw3分子與KIR2DL2或KIR2DL3至少一者的結合。
  5. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體與包含含有具有SEQ ID NO：15中提出的序列的胺基酸的輕鏈可變區域、以及含有具有SEQ ID NO：17中提出的序列的胺基酸的重鏈可變區域的抗體競爭結合至KIR2DL1、KIR2DL2、及KIR2DL3中至少一者。
  6. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體與包含含有具有SEQ ID NO：15中提出的序列的胺基酸的輕鏈可變區域、以及含有 具有SEQ ID NO：17中提出的序列的胺基酸的重鏈可變區域的抗體競爭結合至KIR2DL1、KIR2DL2、及KIR2DL3每一者。
  7. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體包含含有具有SEQ ID NO：15中提出的序列的胺基酸的輕鏈可變區域、及含有具有SEQ ID NO：17中提出的序列的胺基酸的重鏈可變區域。
  8. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體包含：(a)一具有對應至SEQ ID NO：17的殘基31-35的胺基酸序列的重鏈CDR1功能部位；(b)一具有對應至SEQ ID NO：17的殘基50-65的胺基酸序列的重鏈CDR2功能部位；(c)一具有對應至SEQ ID NO：17的殘基99-112的胺基酸序列的重鏈CDR3功能部位；(d)一具有對應至SEQ ID NO：15的殘基24-34的胺基酸序列的輕鏈CDR1功能部位；(e)一具有對應至SEQ ID NO：15的殘基50-56的胺基酸序列的輕鏈CDR2功能部位；以及(f)一具有對應至SEQ ID NO：15的殘基89-97的胺基酸序列的輕鏈CDR3功能部位。
  9. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體對KIR2DL1的解離常數(Kd)為不大於約0.45nM。
  10. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體對KIR2DL3的解離常數(Kd)為不大於約0.025nM。
  11. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體結合至實質上包含胺基酸殘基L38、R41、M44、F45、N46、D47、T48、L49、R50、I52、F64、D72、Y80、P87、以及Y88的KIR2DL1抗原決定基。
  12. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體阻斷HLA-Cw4分子結合至KIR2DL1(SEQ ID NO：23)細胞外部份的殘基M44、F45以及D72。
  13. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體是單株抗體。
  14. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體。
  15. 根據申請專利範圍第1或2項之經分離的人類或人化抗體或其抗體片段，其中該抗體是IgG4抗體。
  16. 一種核酸，其編碼根據申請專利範圍第1至15項中任一項中之人類或人化抗體或其抗體片段。
  17. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第16項之核酸。
  18. 一種細胞，其包含根據申請專利範圍第17項之載 體。
  19. 一種產生人類或人化抗KIR抗體或其抗體片段的方法，該方法包含將根據申請專利範圍第18項的細胞培養在適合表現該抗KIR抗體的條件下。
  20. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至15項中任一項中之人類或人化抗體或其抗體片段、或由根據申請專利範圍第19項之方法所產生的人類或人化抗體或其抗體片段，以及醫藥上可接受的載劑或賦形劑，其中該抗體的含量是有效於誘發可測得的患者的NK細胞細胞毒性。
  21. 根據申請專利範圍第20項的醫藥組成物，其包含聚山梨糖醇酯80、蔗糖、或聚山梨糖醇酯80以及蔗糖兩者。
  22. 根據申請專利範圍第20或21項的醫藥組成物，其中該醫藥組成物是用於在需要誘發NK細胞活性的個體中誘發NK細胞活性。
  23. 根據申請專利範圍第22項的醫藥組成物，其中該個體是患有癌症的患者。
  24. 根據申請專利範圍第23項的醫藥組成物，其中該患者是患有選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、以及非霍奇金氏淋巴瘤的癌症。
  25. 根據申請專利範圍第23項的醫藥組成物，其中該患者是患有選自結腸直腸癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、以及惡性黑色素瘤的癌症。
  26. 根據申請專利範圍第22項的醫藥組成物，其中該個 體是患有感染性疾病的患者。
  27. 根據申請專利範圍第22項的醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含選自免疫調節劑、荷爾蒙劑、化學治療劑、抗血管生成劑、凋亡劑、結合至抑制性KIR的第二抗體、抗感染藥劑、定標的用的藥劑、以及附屬化合物的治療上藥劑。
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