BRPI0512911B1 - Anticorpo humano isolado, ácido nucleico, vetor, célula, método de produzir um anticorpo anti-kir humano, composição farmacêutica, e, método de potenciar a atividade da célula nk em um paciente em necessidade do mesmo - Google Patents

Anticorpo humano isolado, ácido nucleico, vetor, célula, método de produzir um anticorpo anti-kir humano, composição farmacêutica, e, método de potenciar a atividade da célula nk em um paciente em necessidade do mesmo Download PDF

Info

Publication number
BRPI0512911B1
BRPI0512911B1 BRPI0512911-7A BRPI0512911A BRPI0512911B1 BR PI0512911 B1 BRPI0512911 B1 BR PI0512911B1 BR PI0512911 A BRPI0512911 A BR PI0512911A BR PI0512911 B1 BRPI0512911 B1 BR PI0512911B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
kir
antibodies
binding
human
Prior art date
Application number
BRPI0512911-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Alessandro Moretta
Mariella Della Chiesa
Pascale Andre
Laurent Gauthier
François Romagné
Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Ivan Svendsen
Stefan Zahn
Anders Svensson
Matthias Thòrólfsson
S0Ren Berg Padkaer
Kristian Kjaergaard
Pieter Spee
Original Assignee
University Of Genoa
Novo Nordisk A/S
Innate Pharma S.A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/IB2004/002464 external-priority patent/WO2005003172A2/en
Application filed by University Of Genoa, Novo Nordisk A/S, Innate Pharma S.A.S. filed Critical University Of Genoa
Priority claimed from PCT/EP2005/053122 external-priority patent/WO2006003179A2/en
Publication of BRPI0512911A publication Critical patent/BRPI0512911A/pt
Publication of BRPI0512911B1 publication Critical patent/BRPI0512911B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B7/00—Special arrangements or measures in connection with doors or windows
    • E06B7/02—Special arrangements or measures in connection with doors or windows for providing ventilation, e.g. through double windows; Arrangement of ventilation roses
    • E06B7/08—Louvre doors, windows or grilles
    • E06B7/084—Louvre doors, windows or grilles with rotatable lamellae
    • E06B7/086—Louvre doors, windows or grilles with rotatable lamellae interconnected for concurrent movement
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0615—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the closing elements
    • E06B9/0638—Slats or panels
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0653—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored side by side in the closing plane
    • E06B9/0661—Lazy tongue, pantograph or scissor-like systems in the plane of the opening
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/24—Screens or other constructions affording protection against light, especially against sunshine; Similar screens for privacy or appearance; Slat blinds
    • E06B9/26—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds
    • E06B9/28—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable
    • E06B9/30—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable liftable
    • E06B9/302—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable liftable without ladder-tape, e.g. with lazy-tongs, with screw spindle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0653—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored side by side in the closing plane
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0676—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored in a stacked configuration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Civil Engineering (AREA)
  • Architecture (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Blinds (AREA)

Abstract

ANTICORPO HUMANO ISOLADO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA, MÉTODO DE PRODUZIR UM ANTICORPO ANTI-KIR HUMANO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO DE POTENCIAR A ATIVIDADE DA CÉLULA NK EM UM PACIENTE EM NECESSIDADE DO MESMO Composições e métodos para regular uma resposta imune em um paciente são descritos. Mais particularmente, são descritos anticorpos humanos que regulam a atividade de células NK e possibilitam uma potenciação da citotoxicidade de célula NK em pacientes mamíferos e anticorpos tendo propriedades de ligação de antígeno similares àquelas do anticorpo monoclonal humano 1-7F9 ou 14F1. Também são descritos fragmentos e derivados de tais anticorpos, assim como composições farmacêuticas que compreendem os mesmos e seus usos, particularmente para o uso em terapia, para aumentar a atividade ou citotoxicidade da célula NK em pacientes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito a anticorpos humanos, assim como aos seus fragmentos e derivados, que reagem cruzados com e/ou bloqueiam dois ou mais receptores de KIR inibidores presentes na superfície de células NK e potenciam a citotoxicidade da célula NK em pacientes mamíferos ou em uma amostra biológica. A invenção também diz respeito a métodos de fabricar tais anticorpos, fragmentos, variantes e derivados; às composições farmacêuticas que os compreendem; e ao uso de tais moléculas e composições, particularmente em terapia, para aumentar a atividade da célula NK ou a citotoxicidade em pacientes. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] As células matadoras naturais (NK) são uma subpopulação de linfócitos, envolvidos na imunidade e no sistema vigilância imune do hospedeiro.
[0003] As células NK são células mononucleares que desenvolvem na medula óssea a partir de progenitores linfóides e características morfológicas e propriedades biológicas tipicamente incluem a expressão dos determinantes de grupo (CDs) CD16, CD56, e/ou CD57; a ausência do complexo TOR alfa/beta ou gama/delta na superfície celular; a capacidade para ligar e matar as células alvo que falham em expressar as “auto” proteínas do complexo da histocompatibilidade principal (MHC)/antígeno de leucócito humano (HLA); e a capacidade para matar células de tumor ou outras células doentes que expressem ligandos para ativar receptores NK. As células NK são caracterizadas pela sua capacidade para ligar e matar diversos tipos de linhagens de célula de tumor sem a necessidade quanto a imunização ou ativação anteriores. As células NK também podem liberar proteínas e citocinas solúveis que exercem um efeito regulador no sistema imune; e pode passar por rodadas múltiplas de divisão celular e produzir células filhas com propriedades biológicas similares como a célula precursora. Na ativação pelos interferons e/ou citocinas, as células NK medeiam a lise de células de tumor e de células infectadas com patógenos intracelulares pelos mecanismos que requer contatos físicos, diretos entre a célula NK e a célula alvo. A lise de células alvo envolve a liberação de grânulos citotóxicos da célula NK sobre a superfície do alvo ligado e proteínas efetoras tais como perforina e granzima B que penetram a membrana plasmática alvo e induzem a apoptose ou morte celular programada. As células normais, saudáveis são protegidas da lise pelas células NK.
[0004] Com base nas suas propriedades biológicas, várias estratégias terapêuticas e de vacina foram propostas na técnica que contam com uma modulação de células NK. Entretanto, a atividade da célula NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve sinais tanto estimuladores quanto inibidores.
[0005] Em resumo, a atividade lítica de células NK é regulada pelos vários receptores de superfície celular que transduzem sinais intracelulares positivos ou negativos na interação com ligandos na célula alvo. O equilíbrio entre os sinais positivos e negativos transmitidos por intermédio destes receptores determina se uma célula alvo é lisada ou não (morta) por uma célula NK. Os sinais estimuladores de célula NK podem ser mediados pelos Receptores de Citotoxicidade Natural (NCR) tais como NKp30, NKp44 e NKp46; assim como receptores NKG2C, receptores NKG2D, certos Receptores como Ig Matador ativador (KIRs) e outros receptores NK ativadores (Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23: 225-74). Os sinais inibidores de célula NK podem ser mediados pelos receptores como Ly49, CD94/NKG2A, assim como certos inibidores KIR, que reconhecem as moléculas de classe I do complexo da histocompatibilidade principal (MHC) (Kãrre et al., Nature 1986; 319: 675-8; Õhlén et al, Science 1989; 246: 666-8). Estes receptores inibidores se ligam a determinantes polimórficos de moléculas de classe I de MHC (incluindo a classe I de HLA) presentes em outras células e inibem a lise mediada pela célula NK.
[0006] KIRs, algumas vezes também aludidas como Receptores Inibidores Matadores, foram caracterizados em seres humanos e primatas não humanos e são moléculas de transmembrana tipo 1 polimórficas presentes em certos subconjuntos de linfócitos, incluindo células NK e algumas células T. As KIRs interagem com determinantes nos domínios alfa 1 e 2 das moléculas classe I de MHC e, como descrito acima, KIRs distintas são estimuladores ou inibidores para as células NK.
[0007] A nomenclatura para KIRs está fundamentada no número de domínios extracelulares (KIR2D e KIR3D tendo dois e três domínios Ig extracelulares, respectivamente) e se a cauda citoplásmica é longa (KIR2DL ou KIR3DL) ou curta (KIR2DS ou KIR3DS). A presença ou ausência de um dado KIR é variável de uma célula NK para uma outra dentro da população de NK presente em um único indivíduo. Entre seres humanos, existe também um nível relativamente alto de polimorfismo de genes KIR, com certos genes KIR estando presentes em alguns, mas não todos indivíduos. A expressão dos alelos de KIR em células NK é estocasticamente regulada, significando que, em um dado indivíduo, um dado linfócito pode expressar um, dois ou mais KIRs diferentes, dependendo do genótipo do indivíduo. As células NK de um único indivíduo tipicamente expressa combinações diferentes de KIRs, fornecendo um repertório de células NK com especificidades diferentes para as moléculas da classe I de MHC.
[0008] Certos produtos de gene de KIR causam a estimulação da atividade linfocítica quando ligados a um ligando apropriado. As KIRs ativadoras todas têm uma cauda citoplásmica curta com um resíduo de transmembrana carregado que se associa com uma molécula adaptadora tendo Motivos de Ativação com base na Tirosina Imunorreceptora (ITAMs) que transduzem sinais estimuladores para a célula NK. Ao contrário, KIRs inibidores têm uma cauda citoplásmica longa contendo Motivo Inibidor com base na Tirosina Imunorreceptora (ITIM), que transduzem sinais inibidores para a célula NK no recrutamento de seus ligandos da classe I de MHC. Os inibidores KIRs conhecidos incluem membros das subfamílias KIR2DL e KIR3DL. Os inibidores KIRs tendo dois domínios Ig (KIR2DL) reconhecem alotipos HLA-C: KIR2DL2 (antigamente designado p58.2) e o produto de gene alélico, intimamente relacionado KIR2DL3 ambos reconhecem os alotipos HLA-C do “grupo 1” (incluindo HLA-Cw1, -3, -7 e - 8), ao passo que KIR2DL1 (p58.1) reconhece alotipos HLA-C do “grupo 2” (tal como HLA-Cw2, -4, -5 e -6). O reconhecimento pelo KIR2DL1 é ditado pela presença de um resíduo de Lys na posição 80 de alelos HLA-C. O reconhecimento de KIR2DL2 e KIR2DL3 é ditado pela presença de um resíduo Asn na posição 80 em HLA-C. De modo importante, a enorme maioria de alelos HLA-C tem um resíduo Asn ou um Lys na posição 80. Portanto, KIR2DL1, -2 e -3 coletivamente reconhecem essencialmente todos os alotipos HLA-C encontrados em seres humanos. Um KIR com três domínios Ig, KIR3DL1 (p70), reconhece um epítopo compartilhado pelos alelos HLA-Bw4. Finalmente, KIR3DL2 (p140), um homodímero de moléculas com três domínios Ig, reconhece HLA-A3 e -A11.
[0009] Embora inibidores KIRs múltiplos e/ou outros receptores inibidores específicos da classe I de MHC (Moretta et al, Eur J Immunogenet. 1997; 24(6): 45568; Valiante et al, Immunol Rev 1997; 155: 155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998; 16: 359-93) possam ser co-expressados pelas células NK, em qualquer repertório de NK do indivíduo dado existem células que expressam apenas um único KIR e assim são inibidos apenas pelos alelos de classe I MHC específicos (ou alelos que pertencem ao mesmo grupo de alotipos da classe I de MHC). As moléculas da classe I de MHC humanas freqüentemente são aludidas como classe I do Antígeno da Histocompatibilidade Humana (HLA).
[0010] As populações de célula NK ou clones que são desemparelhados com o ligando de KIR com respeito aos seus alvos, isto é, que expressam KIRs que não reconhecem nenhuma molécula do HLA de um hospedeiro, mostraram mediar respostas antitumor que salvam vidas, potentes depois do transplante de medula óssea alogênico em pacientes com leucemia (Ruggeri et al., Science 2002, 295: 2097-2100). Acredita-se que o mecanismo subjacente seja que o transplante hematopoiético desemparelhado HLA leva à expansão de células NK derivadas de doador que expressam KIR que não reconhecem quaisquer ligandos HLA no receptor e assim não são inibidos por intermédio de KIR. Estes clones NK alogênico exercem atividade antitumor potente. Esta resposta é muito forte em pacientes diagnosticados com leucemia mielóide aguda (AML) e tratados com transplantes haploidênticos desemparelhados KIR-MHC. Um meio de reproduzir este efeito pelo tratamento farmacológico de um paciente pode ser administrar reagentes que bloqueiem a interação de KIR/HLA para ativar as células NK endógena do paciente.
[0011] Certos anticorpos monoclonais específicos para KIR2DL1 mostraram bloquear a interação de KIR2DL1 com alotipos de HLA-C do “grupo 2”, tal como HLA-Cw4 (Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604) e promover a lise mediada por NK de células alvo que expressem aqueles alotipos HLA-C. Os anticorpos monoclonais contra KIR2DL2/3 que bloqueiam a interação de KIR2DL2/3 com HLA- Cw3 ou alotipos similares também foram descritos (Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604). Tais anticorpos não são ideais para o uso em situações clínicas, como o desenvolvimento de dois anticorpos monoclonais terapêuticos (mAbs) e a administração de ambos de tais anticorpos ou uma seleção de um de tais anticorpos (depois da diagnose apropriada) seria requerido para tratar todos os pacientes potenciais, dependendo de se qualquer paciente dado expressou os alotipos de HLA-C do grupo 1 ou grupo 2.
[0012] Watzl et al. (Tissue Antigens 2000; 56: 240-247) produziram isótipos múltiplos que reconhecem anticorpos de murino que reagem cruzado de KIRs, mas estes anticorpos não potenciam a atividade lítica das células NK. Além disso, Spaggiari et al. (Blood 2002; 99: 1706-1714 e Blood 2002; 100: 4098-4107) realizaram experimentos utilizando numerosos anticorpos monoclonais de murino contra vários KIRs. Um destes anticorpos, NKVSF1 (também conhecido como Pan2D), foi relatado reconhecer um epítopo comum de KIR2DL1 (CD158a), KIR2DL2 (CD158b) e KIR2DS4 (p50.3). Shin et al. (Hybridoma 1999; 18: 521-7) também relataram a produção de dois anticorpos monoclonais, denotados A210 e A803g, capazes de ligar a todos de KIR2DL1, KIR2DL3 e KIR2DS4. Entretanto, para o uso terapêutico de um anticorpo no bloqueio dos inibidores KIRs de uma células NK do paciente, as moléculas de KIR menos ativadoras um anticorpo reage cruzado com, o melhor, visto que o bloqueio de receptores ativadores prejudicaria o estímulo de células NK. Assim, um anticorpo tendo as características de ligação de antígeno de NKVSF1, A210 ou A803g não seria ideal em um cenário clínico. Adicionalmente, o uso de anticorpos monoclonais de murino no tratamento de um paciente humano pode resultar em uma resposta imune do hospedeiro contra os anticorpos, comprometendo assim a eficácia do tratamento.
[0013] Conseqüentemente, métodos práticos e eficazes para a modulação terapêutica de inibidores KIRs não foram até agora disponibilizados na técnica. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] Esta invenção fornece anticorpos humanos novos e úteis que especificamente ligam o KIR2DL1 e pelo menos um de KIR2DL2 e KIR2DL3 ou a todos os três destes KIRs, e/ou anticorpos humanos que potenciam a atividade lítica da célula NK pelo bloqueio das interações entre um ou mais de tais KIRs e HLA-C. Fragmentos e derivados de tais anticorpos também são fornecidos. A invenção também diz respeito a anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpos novos e úteis, que compreendem seqüências VH e VL substancialmente idênticas àquelas dos anticorpos humanos 1-7F9 e 1-4F1, como aqui descrito. A invenção também fornece ácidos nucléicos que compreendem seqüências de nucleotídeo que codificam tais anticorpos; vetores que compreendem tais ácidos nucléicos; células e organismos hospedeiros que compreendem tais ácido nucléicos e/ou vetores; e composições, tais como composições e kits farmaceuticamente aceitáveis, que compreendam tais proteínas, ácidos nucléicos, vetores e/ou células e tipicamente um ou mais ingredientes adicionais que podem ser ingredientes ativos ou ingredientes inativos que promovam a formulação, liberação, estabilidade ou outras características da composição (por exemplo, vários carregadores). A invenção ainda fornece vários métodos novos e úteis de fabricar e usar tais anticorpos, ácido nucléicos, vetores, células, organismos e/ou composições, tais como na modulação de atividades biológicas mediadas pelo KIR, por exemplo no tratamento de doenças relacionadas a estas.
[0015] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano ou humanizado que se liga a cada um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, mas que não se liga a KIR2DS4. Em uma forma de realização, o anticorpo além disso não se liga a KIR2DS3. Em uma outra forma de realização, o anticorpo humano ou humanizado bloqueia a ligação de pelo menos um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 a uma molécula de HLA-C de classe I. Em uma outra forma de realização, o anticorpo pode bloquear a ligação de uma molécula de HLA-Cw4 ao KIR2DL1 e a ligação de uma molécula de HLA-Cw3 a pelo menos um de KIR2DL2 ou KIR2DL3. Por exemplo, o anticorpo pode bloquear a ligação de uma molécula de HLA-Cw4 aos resíduos M44, F45 e D72 da porção extracelular de KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23). Já em uma outra forma de realização, o anticorpo potencia a atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expresse uma molécula de HLA-C de classe I.
[0016] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano ou humanizado que compete com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, na ligação a pelo menos um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Em uma forma de realização, o anticorpo compete com um anticorpo que compreende a região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, na ligação a cada um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15. Já em uma outra forma de realização, o anticorpo compreende (a) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; (b) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada que corresponde os resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e (c) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17.
[0017] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano ou humanizado isolado que se liga a um epítopo de KIR2DL1 que substancialmente compreende os resíduos de aminoácido L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88.
[0018] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano ou humanizado isolado que tenha uma constante de dissociação (Kd) para KIR2DL1 de não mais do que cerca de 0,45 nM e/ou um Kd para KIR2DL3 de não mais do que cerca de 0,025 nM.
[0019] A invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanos ou humanizados ou um derivado destes, que tenham qualquer uma das propriedades precedentes, sozinhos ou em qualquer combinação adequada. Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo de IgG4.
[0020] A invenção também fornece um ácido nucléico que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo humanos ou humanizados tendo qualquer uma das propriedades precedentes, um vetor que compreenda um tal ácido nucléico, uma célula que compreenda um tal vetor e um método de produzir um anticorpo anti-KIR humano, que compreende cultivar uma tal célula sob condições adequadas para a expressão do anticorpo anti-KIR.
[0021] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanos ou humanizados tendo uma ou mais das propriedades precedentes ou produzidas por qualquer método, em uma quantidade eficaz para potenciar detectavelmente a citotoxicidade da célula NK em um paciente, junto com um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. A composição, por exemplo, pode compreender Polissorbato 80, sacarose ou tanto Polissorbato 80 quanto sacarose.
[0022] A invenção também fornece um método de potenciar a atividade da célula NK em um paciente em necessidade disso, método este que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de qualquer uma das composições precedentes. Em uma forma de realização, o paciente é um paciente que sofre de câncer. Por exemplo, o paciente pode estar sofrendo de um câncer selecionado de leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, mieloma múltiplo e linfoma de não Hodgkin. Alternativamente, o paciente pode estar sofrendo de um câncer selecionado de câncer colorretal, câncer renal, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer mamário e melanoma maligno. Em uma outra forma de realização, o paciente é um paciente que sofre de uma doença infecciosa. Já em uma outra forma de realização, o método compreende ainda administrar um agente terapêutico selecionado de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente antiangiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a um inibidor de KIR, um agente antiinfeccioso, um agente alvejador e um composto adjunto.
[0023] Deve ser entendido que a descrição de anticorpos “fornecidos” pela invenção ou anticorpos aos quais a invenção “diz respeito”, etc., também, por implicação, refere-se aos anticorpos que podem ser úteis na prática dos métodos da invenção aqui descritos, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contraditado pelo contexto.
[0024] Estes e outros aspectos e características da invenção são descritas aqui em mais detalhes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] A Figura 1 representa o anticorpo monoclonal de murino DF200 ligando a um determinante comum de vários receptores de KIR2DL humanos. (A) Clone CP11, KIR2DL1+, DF200. (B) Clone CP502, KIR2DL3+. (C) Clone CP11, KIR2DL1+, Anti- KIR2DL1. (D) Clone CP502, KIR2DL3+, Anti-KIR2DL2/3.
[0026] A Figura 2 representa o anticorpo monoclonal de murino DF200 neutralizando a inibição mediada pelo KIR2DL1 da citotoxicidade da célula NK contra as células alvo que expressam Cw4, mostrando a reconstituição da lise com o mAb anti-KIR no alvo de C1R-Cw4 nas relações de efetora/alvo (E/T) de 4/1.
[0027] A Figura 3 representa o anticorpo monoclonal de murino DF200, um fragmento Fab de DF200 e anticorpos de murino convencionais específicos para KIR2DL1 (mAbs EB6 e XA-141) ou KIR2DL2/3 (mAbs GL183 e Y249) neutralizando a inibição mediada por KIR2DL1 da citotoxicidade contra células alvo positivas em Cw4 e a inibição mediada por KIR2DL2/3 da citotoxicidade da célula NK contra células alvo positivas em Cw3. (A) e (C) KIR2DL1+, células alvo 721.221Cw4+. (B) KIR2DL2+, células alvo 721.221-Cw3+. (D) KIR2DL3+, células alvo 721.221Cw3+.
[0028] A Figura 4 representa a reconstituição da lise de célula pelas células NK que expressam KIR2DL1 contra células alvo positivas em HLA-Cw4 na presença de fragmentos F(ab’)2 dos anticorpos DF200 e EB6. (A) Células alvo 721.221-Cw4; relação E/T = 1. (B) Células alvo B-EBV células que expressam Cw4, relação E/T = 2.
[0029] A Figura 5 representa a indução da morte mediada pelo NK reagindo-se cruzado mAbs de murino (DF200 e NKVSF1 (Pan2D)) e de ser humano (1-7F9, 1- 4F1, 1-6F5 e 1-6F1) e um mAb específico de KIR2DL1 convencional de murino (EB6). Os mAbs induzem (reconstituem) a morte pelas células NK que expressam KIR2DL1 (YTS-KIR2DL1) de 721.221 células alvo transfectadas com HLACw4. Relação E/T = 1. (A) 30 μ g/ml de mAb. (B) 10 μ g/ml de mAb.
[0030] A Figura 6 representa a indução da morte mediada por NK pelos mesmos anticorpos como na Figura 5. Os mAbs induzem (reconstituem) a morte pelas células NK que expressam KIR2DL1 (YTSKIR2DL1) de células B-EBV que expressam HLA- Cw4 endógeno. Relação E/T = 2. (A) 30 μ g/ml de mAb. (B) 10 μ g/ml de mAb.
[0031] A Figura 7 representa um mapa de epítopo mostrando os resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos pela análise de ressonância de plasma de superfície (BIAcore®) com anticorpos anti-KIR para KIR2DL1, onde círculos em sobreposição designam a sobreposição entre os mAbs na ligação a KIR2DL1. Os resultados mostram que 1-7F9 é competitivo com EB6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 (Pan2D) e DF200, on KIR2DL1. O anticorpo 1-4F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1 (Pan2D) e 1-7F9. O anticorpo NKVSF1 (Pan2D) compete com DF200, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9, em KIR2DL1. DF200 compete com NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9, em KIR2DL1.
[0032] A Figura 8 representa um mapa de epítopo mostrando os resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos pela análise BIAcore® com anticorpos anti-KIR para KIR2DL3, onde os círculos de sobreposição designam sobreposição na ligação a KIR2DL3. Os resultados mostram que 1-4F1 é competitivo com NKVSF1 (Pan2D), DF200, g1183 e 1-7F9 em KIR2DL3. 1-7F9 é competitivo com DF200, g1183 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 (Pan2D), em KIR2DL3. NKVSF1 (Pan2D) compete com DF200, 1-4F1 e GL183, mas não 1-7F9, em KIR2DL3. DF200 compete com NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1 e 1-7F9, mas não com GL183, no KIR2DL3.
[0033] A Figura 9 representa um mapa de epítopo mostrando resultados de experimentos de ligação competitiva obtidos pela análise BIAcore® com anticorpos anti-KIR para KIR2DS1, onde círculos de sobreposição designam sobreposição na ligação a KIR2DS1. Os resultados mostram que o anticorpo 1-4F1 é competitivo com NKVSF1 (Pan2D), DF200 e 1-7F9 no KIR2DS1. O anticorpo 1-7F9 é competitivo com 1-4F1, mas não competitivo com DF200 e NKVSF1 (Pan2D) no KIR2DS1. NKVSF1 compete com DF200 e 1-4F1, mas não com 1-7F9, no KIR2DS1. DF200 compete com NKVSF1 e 1-4F1, mas não com 1-7F9, no KIR2DS1.
[0034] A Figura 10 representa a titulação de mAb Pan2D (NKVSF1) demonstrando a ligação do mAb às células NK de cinomolgo. As células NK de cinomolgo (volume de NK dia 16) foram incubadas com quantidades diferentes de mAb de NKVSF1 (Pan2D) seguido pelos anticorpos de IgG anti-camundongo (H+L) de fragmentos de F(ab’)2 de cabra conjugado a PE. A porcentagem de células positivas foi determinada com um controle isotópico (IgG1 de camundongo purificado). As amostras foram feitas em duplicata. Intensidade de fluorescência média = MFI.
[0035] A Figura 11 mostra a ligação de KIR2DL1 solúvel e mutante KIR2DL1(R131W) às células. (A) Ligação de concentrações crescentes de KIR2DL1- Fc solúvel e um mutante KIR2DL1(R131W)-hFc, às células que expressam HLA- Cw3 ou -Cw4. A ligação de proteínas KIR-Fc foi detectada usando um anticorpo conjugado a fluorocromo secundário e revelado pela citometria de fluxo. A fluorescência média é mostrada no eixo y. (B) Ligação dos mAbs anti-KIR indicados (GL183, EB6, DF200 e Pan2D (NKVSF1)) ao KIR2DL1-Fc e à proteína mutante 2DL1(R131W), usando Ig humano como controle. A figura mostra que DF200 e Pan2D (NKVSF1) liga menos bem ao mutante do que o KIR2DL1-Fc tipo selvagem, indicando que ambos mAbs são afetados pela mutação R131W. Portanto, R131 é um dos resíduos que constitui o epítopo para DF200 e Pan2D no KIR2DL1.
[0036] A Figura 12 fornece um alinhamento comparativo das seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve e CDRs de cadeia leve de anticorpos DF200 e Pan2D (NKVSF1). (A) Alinhamento de regiões leves variáveis (VL) anti-KIR de DF200 (SEQ ID NO: 1) e Pan-2D (SEQ ID NO: 2). Os números acima das seqüências de aminoácido indica a respectiva posição para iniciação da tradução. Met (+1) na imunoglobulina imatura (não secretada). (B) Alinhamento de seqüências CDR-L1. Resíduo antes: Normalmente Cys. Resíduos depois: Trp. Tipicamente Trp-Tyr-Leu. Comprimento: 10 a 17 aa. (C) Alinhamento de seqüências CDR-L2. Resíduos antes: No geral Ile-Tyr. Comprimento: 7 aa. Início: aproximadamente 16 aa depois do final de CDR-L1. Início: aproximadamente 24 aa do início da proteína secretada. (D) Alinhamento de seqüências CDR-L3. Resíduos antes: Cys. Resíduos depois: Phe-GIy-XXX-Gly. Comprimento: 7 a 11 aa. Início: aproximadamente 33 aa depois do final de CDR-L2.
[0037] A Figura 13 fornece a região variável de cadeia pesada e as CDRs de cadeia pesada de anticorpo DF200. (A) DF-200 região VH, proteína imatura. A VH secretada, madura inicia na posição 20: resíduo Q. As extremidades da região VH com resíduo S e depois disso a região constante (não mostrada) continua. (B) CDR- H1. Resíduos antes: Cys-XXX-XXX-XXX. Resíduos depois: Trp. No geral Trp-Val ou Trp-Ile. Comprimento: 10 a 14 aa. Início: Aproximadamente 22 a 26 aa do início da proteína secretada. (C) CDR-H2. Resíduos antes: Leu-Glu-Trp-Ile-Gly mas outras variações possíveis. Resíduos depois: Lys ou Arg / Leu ou Ile ou Val ou Phe ou Thr ou Ala / Thr ou Ser ou Ile ou Ala. Comprimento: 16 a 20 aa. Início: Aproximadamente 15 aa depois do final de CDR-H1. (D) CDR-H3. Resíduos antes: Cys-XXX-XXX (Tipicamente Cys-Ala-Arg). Resíduos depois: Trp-GIy-XXX,-GIy. Comprimento: 3 a 25 aa. Início: Aproximadamente 33 depois do final de CDR-H2.
[0038] A Figura 14 representa o nucleotídeo e as seqüências de aminoácido das seqüências VH e VL de anticorpo humano 1-7F9. (A) Tradução da cadeia leve madura variável de HuKIR 1-7F9. (B) Seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia leve madura variável de HuKIR 1-7F9. (C) Tradução da HuKIR 1-7F9 cadeia pesada madura variável. (D) Seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada madura de HuKIR 1-7F9.
[0039] A Figura 15 mostra as seqüências de aminoácido das seqüências VH e VL de anticorpos monoclonais 1-7F9, a seqüência DF200 (VH: SEQ ID NO: 19; seqüência VL: SEQ ID NO: 21) e Pan2D (NKVSF1; seqüência VH: SEQ ID NO: 20; seqüência VL: SEQ ID NO: 22). as CDRs estão em caixas.
[0040] A Figura 16 representa os dados de citometria de fluxo, mostrando a ligação do anticorpo de murino, Pan2D (NKVSF1) e as mAbs 1-7F9 e 1-4F1 às células transfectadas com KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3 ou KIR2DS4, como indicado (anticorpo purificado: 1 μ g/ml). (A) - (R) NKVSF1 (pan2D), 1-7F9 e 1-4F1 todos ligam o KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DS1 e KIR2DS2. Nenhum anticorpo se liga a KIR2DS3. NKVSF1, mas não 1-7F9 ou 14F1, liga-se a KIR2DS4.
[0041] A Figura 17 representa os resultados de análise FACS. (A) Neutralização mediada por anticorpo da ligação de KIR-Fc solúvel a HLA-Cw4 nas células, detectada pela citometria de fluxo (FAGS). A medição de FACS da ligação KIR2DL1- mFc às células LCL721.221-Cw4, depois pré incubação com várias concentrações do mAb DF200 que reage cruzado ou o mAb GL183 específico de KIR2DL2/3. DF200, mas não GL183, reduz a ligação de KIR2DL1 a HLA-Cw4. As medições são plotadas como uma porcentagem da ligação de KIR2DL1-hFc na ausência de anticorpos inibidores. (B) a medição de FACS da ligação KIR2DL1-mFc às células LCL721.221-Cw4, depois da pré incubação com várias concentrações de 1-1F4 e 1- 7F9. As medições são plotadas como uma porcentagem da ligação de KIR2DL1- mFc na ausência de anticorpos inibidores.
[0042] A Figura 18 representa os resultados de ensaios de citotoxicidade que liberam 51Cr. (A) as células LCL 721.221-Cw3 são eficientemente mortas tanto pelas células YTS (diamantes) quanto pelas células YTS-2DL1 (triângulos) nas várias razões E:T. Ao contrário, as células LCL 721.221-Cw4 são eficientemente mortas pelas células YTS (quadrados), mas não podem ser mortas pelas células YTS-2DL1 (cruzes) devido às restrições KIR. (B) Na ausência de anticorpo, as células YTS- 2DL1 não podem matar LCL-721.221-Cw4 (razão E:T 12:1). 17F9 induz a morte de células LCL 721.221-Cw4 pelas células YTS-2DL1 em uma maneira dependente da dose.
[0043] A Figura 19 representa uma superposição de duas estruturas complexas cristalinas; a KIR2DL1/1-7F9 Fab’ e a KIR2DL1/MHC classe I, código PDB 11M9 (Fan et al., Nat. Immunol. 2001; 2452-460), usando os átomos Cα da molécula KIR comum (rotulado ‘KIR’) como padrão. KIR2DL1/1-7F9 Fab’ é indicada no estilo de fita de linha cinza enquanto que a KIR2DL1/MHC classe I no estilo de um tubo escuro. 1-7F9 Fab’ é rotulado ‘1-7F9’ enquanto MHC classe I é rotulado ‘MHC’. Uma sobreposição entre o MHC e o Fab’ é observada na superposição, demonstrando a capacidade de 1-7F9 Fab’ para obstruir a ligação de MHC classe I ao receptor KIR2DL1. Ver o Exemplo 11.
[0044] A Figura 20 mostra o epítopo de ligação de 1-7F9 na KIR2DL1, como indicado na seqüência KIR2DL1. Os aminoácidos dentro de 4,0 A de distância de 1- 7F9 são salientados em cinza e fundo preto. Os aminoácidos salientados por um fundo preto estão envolvidos na ligação de hidrogênio a 1-7F9.
DEFINIÇÕES
[0045] Por conveniência, diversos termos são aqui definidos. Entretanto, a lista de termos definidos aqui fornecidos não é exclusiva. Outros termos podem ser definidos por toda a descrição da invenção.
[0046] Dentro do contexto desta invenção as células NK “ativas” designam células NK biologicamente ativas, incluindo as células NK tendo a capacidade de lisar as células alvo ou realçar a função imune de outras células. Por exemplo, uma célula NK “ativa” pode ser capaz de matar células que expressem um ligando para um receptor de NK ativador e/ou falha em expressar antígenos MHC/HLA reconhecidos por um KIR na célula NK. As células NK podem ser obtidas por várias técnicas conhecidas no ramo, tal como a isolação de amostras de sangue, citaferese, coleções de tecido ou célula, etc. Os protocolos úteis para os ensaios que envolvem células NK podem ser encontrados em Natural Killer Cells Protocols (editado por Campbell KS e Colonna M), Human Press. pp. 219-238 (2000).
[0047] Como aqui usado, um “Receptor como Ig Matador”, “Receptor Inibidor Matador” ou “KIR”, referem-se a uma proteína ou polipeptídeo codificado por um gene que é um membro da família de gene KIR ou por um cDNA preparado a partir de um tal gene. Uma revisão detalhada da família de gene KIR, incluindo a nomenclatura de genes de KIR e produtos de gene de KIR e os números de acesso no Genbank para KIRs exemplares, é “The KIR Gene Cluster” por M. Carrington e P. Norman, disponível no sítio da web da NCBI chamado de “Bookshelf” (acessível por intermédio do endereço da World Wide Web (WWW) ncbi.nlm.nih.gov/books). As seqüências de genes KIR humanos e cDNAs, assim como seus produtos de proteína, são disponíveis nas bases de dados públicas, incluindo GenBank. As entradas do GenBank exemplares não limitantes de KIRs humanos têm os seguintes números de acesso: KIR2DL1: número de acesso do Genbank U24076, NM_014218, AAR16197 ou L41267; KIR2DL2: número de acesso do Genbank U24075 ou L76669; KIR2DL3: número de acesso do Genbank U24074 ou L41268; KIR2DL4: número de acesso do Genbank X97229; KIR2DS1: número de acesso do Genbank X89892; KIR2DS2: número de acesso do Genbank L76667; KIR2DS3: número de acesso do Genbank NM_012312 ou L76670 (variante de união); KIR3DL1: número de acesso do Genbank L41269; e KIR2DS4: número de acesso do Genbank AAR26325. Um KIR pode compreender de 1 a 3 domínios extracelulares e pode ter uma cauda citoplásmica longa (isto é, mais do que 40 aminoácidos) ou curta (isto é, menos do que 40 aminoácidos). Como anteriormente aqui descrito, estas características determinam a nomenclatura de um KIR. As moléculas de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 e KIR2DS4 exemplares compreendem as seguintes seqüências de aminoácido respectivas:
[0048] Domínio extracelular de KIR2DL1: HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHH DGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQ XGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGP ATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHL H (SEQ ID NO: 23), onde “X” na posição 16 é P ou R e onde “X” na posição 114 é P ou L, representando variantes alélicas.
[0049] Domínio extracelular de KIR2DL2: HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHHD GVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQP GPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPA THGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO: 24)
[0050] Domínio extracelular de KIR2DL3: HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHH DGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQ PGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGP ATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHL H (SEQ ID NO: 25).
[0051] Domínio extracelular de KIR2DS4: QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIGEHH DGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV (SEQ ID NO: 38).
[0052] O termo “KIR2DL2/3” refere-se a cada um ou ambos dos receptores KIR2DL2 e KIR2DL3. Estes dois receptores têm uma homologia muito alta, estes são formas alélicas do mesmo gene e são considerados pela técnica como sendo funcionalmente similares.
[0053] A menos que de outro modo especificado, o termo “MHC” abrange moléculas de MHC em todos os mamíferos, ao passo que uma molécula “HLA” refere-se a uma molécula MHC humana.
[0054] Dentro do contexto desta invenção, que estabelece que um anticorpo “liga” um determinante (isto é, a palavra “liga” no contexto de interação anticorpo:determinante) designa que o anticorpo liga o determinante com especificidade e/ou afinidade. Por exemplo, GL183 é um anticorpo monoclonal convencional que se liga a KIR2DL2/3. EB6 é um anticorpo monoclonal convencional que se liga a KIR2DL1. EB6 e GL183 são ambos comercialmente disponíveis (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA).
[0055] Um anticorpo anti-KIR “reativo cruzado” é um anticorpo que se liga a mais do que uma molécula KIR com especificidade e/ou afinidade. Por exemplo, DF200 e 1-7F9 são anticorpos monoclonais que reagem cruzado com KIR2DL1, -2 e -3. O anticorpo que produz hibridoma DF200 foi depositado na coleção de cultura da CNCM, sob a identificação no “DF200”, registro no CNCM 1-3224, registrado em 10 de Junho de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, França. NKVSF1, também aludido como “Pan2D” aqui, é reagido cruzado com KIR2DL1, -2 e -3 e KIR2DS4. Este anticorpo é comercialmente disponível da Serotec (Cergy Sainte- Christophe, França), Catálogo ref no MCA2243.
[0056] “Ligação Específica” ou “especificidade” referem-se à capacidade de um anticorpo ou outro agente para ligar detectavelmente um epítopo apresentado em um antígeno, tal como um KIR, enquanto tem relativamente pouca reatividade detectável com outras proteínas ou estruturas (tais como outras proteínas apresentadas nas células NK ou em outros tipos de célula). A especificidade pode ser relativamente determinada pela ligação ou ensaios de ligação competitivos, usando, por exemplo, instrumentos Biacore, como descrito aqui em outro lugar. A especificidade pode ser exibida, por exemplo, por uma razão de cerca de 10:1, de cerca de 20:1, de cerca de 50:1, de cerca de 100:1, 10.000:1 ou maior de afinidade/avidez na ligação ao antígeno específico versus ligação não específica a outras moléculas irrelevantes (neste caso o antígeno específico é um KIR). Um anticorpo de ligação a KIR, específico para um KIR apresentado nas células NK de um organismo particular, tal como um ser humano, pode algumas vezes exibir ligação às KIRs similares de outras espécies (isto é, um anticorpo de ligação de KIR ou outro agente de ligação de KIR, podem reagir cruzado com KIRs de várias espécies).
[0057] “Seletividade” refere-se à ligação preferencial de uma proteína a uma região particular, alvo ou peptídeo como oposto a uma ou mais outras moléculas biológicas, estruturas, células, tecidos, etc. Um anticorpo de ligação de KIR também pode ser seletivo para um KIR produzido em um organismo particular (por exemplo, em um ser humano como oposto a em um primata), e/ou para um tipo particular de KIR (por exemplo, um KIR com uma cauda citoplásmica longa), particularmente onde o anticorpo reage cruzado com mais do que um tipo de KIR produzido em um organismo particular, e/ou uma porção particular de um KIR (tal como um epítopo particular ou região determinante antigênica). Por exemplo, a seletividade pode ser determinada pelos ensaios de ELISA ou Biacore competitivos. A diferença na afinidade/avidez que marca a seletividade pode ser qualquer preferência detectável (por exemplo, uma relação de mais do que 1:1,1 ou mais do que cerca de 1:5, se detectável, seria adequado, incluindo 1:10, 1:100, 1:1000 ou mais). A menos que de outro modo especificado, quaisquer dados quantitativos na “afinidade” aqui apresentada referem-se às medições de ligação bivalente (como oposto a monovalente).
[0058] Um “epítopo” ou “sítio de ligação” é uma área ou região em um antígeno ao qual um peptídeo de ligação de antígeno (tal como um anticorpo) especificamente se liga. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácido diretamente envolvidos na ligação (também chamados de componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácido, que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácido que são eficazmente bloqueados pelo peptídeo que se liga especificamente ao antígeno (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da “área de cobertura” do peptídeo que se liga especificamente a antígeno). O termo epítopo aqui inclui ambos os tipos de sítios de ligação de aminoácido em qualquer região particular de um KIR que especificamente se liga a um anticorpo anti-KIR ou um outro agente específico de KIR de acordo com a invenção, a menos que de outro modo estabelecido (por exemplo, em alguns contextos a invenção diz respeito a anticorpos que se ligam diretamente a resíduos de aminoácido particulares). Os KIRs podem compreender vários epítopos diferentes, que podem incluir, sem limitação, (1) determinantes antigênicos de peptídeo linear, (2) determinantes antigênicos conformacionais que consistem de um ou mais aminoácidos não contíguos localizados próximos um do outro em uma conformação KIR madura; e (3) determinantes antigênicos pós traducionais que consistem, no todo ou parte, de estruturas moleculares covalentemente ligadas a um KIR, tal como grupos carboidrato.
[0059] A frase que um primeiro anticorpo liga “substancialmente” ou “pelo menos parcialmente” o mesmo epítopo como um segundo anticorpo significa que o sítio de ligação de epítopo para o primeiro anticorpo compreende pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais dos resíduos de aminoácido no antígeno que constitui o sítio de ligação de epítopo do segundo anticorpo. Também, que um primeiro anticorpo se liga substancial ou parcialmente ao mesmo epítopo como um segundo anticorpo significa que os anticorpos primeiro e segundo competem na ligação ao antígeno, como descrito acima. Assim, o termo “liga-se substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como” o anticorpo monoclonal 1-7F9 significa que um anticorpo “compete” com 1-7F9. No geral, um anticorpo que “liga-se substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como” o anticorpo monoclonal de interesse (por exemplo DF200, NKVSF1, 1-7F9) significa que o anticorpo “compete” com o dito anticorpo de interesse quanto a ligação a uma ou mais moléculas KIR, preferivelmente uma molécula KIR selecionada do grupo que consiste de KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em outros exemplos, um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante em uma molécula KIR2DL1 como o anticorpo de interesse “compete” com o anticorpo de interesse quanto a ligação ao KIR2DL1. Um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante em uma molécula KIR2DL2/3 como o anticorpo de interesse “compete” com o anticorpo de interesse quanto a ligação a KIR2DL2/3.
[0060] A frase “liga-se essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante como” um anticorpo de interesse significa que um anticorpo “compete” com o dito anticorpo de interesse quanto a pelo menos uma ou quanto a qualquer e todas as moléculas KIR às quais o dito anticorpo de interesse especificamente se liga. A frase “liga-se essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante como” o anticorpo monoclonal 17F9 significa que um anticorpo “compete” com 1-7F9 quanto a pelo menos um, preferivelmente qualquer e todas as moléculas KIR, às quais 1-7F9 especificamente se liga. Por exemplo, um anticorpo que se liga essencialmente ao mesmo epítopo ou determinante como os anticorpos monoclonais 1-7F9 ou NKVSF1 pode “competir” com o dito 1-7F9 ou NKVSF1 respectivamente quanto a ligação ao KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 e KIR2DS2.
[0061] A capacidade de um anticorpo anti-KIR para “bloquear” a ligação de uma molécula de KIR e uma molécula de HLA significa que o anticorpo, em um ensaio usando moléculas KIR e HLA solúvel ou associadas à superfície celular, pode detectavelmente reduzir a ligação de uma molécula KIR a uma molécula HLA em uma maneira dependente da dose, onde a molécula de KIR detectavelmente se liga à molécula HLA na ausência do anticorpo. Um ensaio exemplar para determinar se um anticorpo anti-KIR é capaz de tal bloqueio é fornecido no Exemplo 8.
[0062] A capacidade de um anticorpo anti-KIR para “reduzir a atividade inibidora de um KIR”, “facilitar a atividade da célula NK,” “facilitar a citotoxicidade da célula NK,” “facilitar as células NK,” “potenciar a atividade da célula NK,” “potenciar a citotoxicidade da célula NK,” ou “potenciar as células NK” significa que uma célula NK que expressa um KIR, quando contatada com o anticorpo, é capaz de lisar as células alvo que expressam na sua superfície um MHC ou HLA classe I particulares que são um ligando para o dito KIR. Por exemplo, o termo “potenciação na citotoxicidade de NK” significa qualquer potenciação substancial ou pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou potenciação maior na citotoxicidade de NK, por exemplo pelo menos cerca de 50 % de potenciação de citotoxicidade de NK (por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % quando comparado a um controle. Isto inclui, por exemplo, de cerca de 55 a 100 %, de cerca de 65 a 100 %, de cerca de 75 a 100 %, de cerca de 80 a 100 % ou de cerca de 90 a 100 % de potenciação de citotoxicidade da célula NK, quando comparada a um controle. Isto também inclui mais do que cerca de 100 %, mais do que cerca de 500 %, mais do que cerca de 1000 %, mais do que cerca de 2000 % ou aumento maior na citotoxicidade. Isto pode ser medido, por exemplo, em um ensaio, tal como um ensaio de citotoxicidade padrão, onde um número mais alto, corresponde a uma porcentagem mais alta, de células alvo são lisadas pelas células NK na presença de um potenciador de NK (tal como um mAb anti-KIR) do que na ausência do potenciador (isto é, o controle).
[0063] O termo “neutraliza a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK” ou “neutraliza a atividade inibidora de um KIR,” como aqui usado significa a capacidade para aumentar a lise específica a mais do que cerca de 20 %, preferivelmente com pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 100 % ou mais da lise específica obtida na mesma razão efetor:célula alvo, com as células NK ou linhagens de célula NK que não são bloqueadas pela sua KIR, como medido por um teste de liberação de cromo clássico de citotoxicidade. “Neutraliza a inibição mediada por KIR” também pode significar que em um ensaio de liberação de cromo ou outro ensaio de citotoxicidade, usando um clone ou transfectante de célula NK que expressa um ou diversos KIRs inibidores e uma célula alvo que expressa pelo menos um alelo de HLA classe I que é reconhecido por um dos KIRs na célula NK, a lise específica obtida com o anticorpo é de mais do que cerca de 100 %, preferivelmente pelo menos de cerca de 101 %, pelo menos de cerca de 150 %, pelo menos de cerca de 200 % ou mais (por exemplo, de cerca de 101 a 150 %, de cerca de 120 a 150 %, de cerca de 120 a 200 %, de cerca de 150 a 200 % ou de cerca de 200 a 1000 %) ou mais da lise específica obtida com a mesma concentração de NKVSF1 (comercialmente disponível da Serotec), usando as mesmas células NK e células alvo, na mesma razão efetor:célula alvo.
[0064] O termo “anticorpo humano”, como aqui usado, é intencionado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes idênticas às, essencialmente idênticas às ou derivadas das seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Tais anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é intencionado a incluir anticorpos em que as seqüências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foi enxertado em seqüências da matriz humana.
[0065] No contexto da presente invenção, a menos que de outro modo estabelecido, “tratamento” ou “tratar” referem-se a prevenir, aliviar, controlar, curar ou reduzir um ou mais sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou distúrbio, a menos que contradito pelo contexto. Por exemplo, o “tratamento” de um paciente no qual nenhum sintoma ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou distúrbio foram identificadas é terapia preventiva, ao passo que o “tratamento” de um paciente no qual sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma doença ou distúrbio foram identificados no geral não constituem terapia preventiva. Não obstante, deve ser entendido que os vários métodos terapêuticos e profiláticos e facetas de uso da invenção são distintos entre si em muitos aspectos (por exemplo, a dosagem de composto(s) a ser(em) liberado(s) a um paciente, o controle do tempo de aplicação, incentivo para aplicação, etc.) e podem ser cada um considerados uma única faceta da invenção.
[0066] No contexto da presente invenção “câncer” refere-se a qualquer distúrbio neoplástico, incluindo, mas não limitado a, distúrbios celulares tais como sarcoma, carcinoma, melanoma, leucemia e linfoma, que podem incluir cânceres na mama, cabeça e pescoço, ovários, bexiga, pulmão, faringe, laringe, esôfago, estômago, intestinos delgado, fígado, pâncreas, cólon, trato reprodutivo feminino, trato reprodutivo masculino, próstata, rins e sistema nervoso central.
[0067] O termo “amostra biológica” como aqui usado inclui mas não é limitado a um fluido biológico (por exemplo soro, linfa e sangue), amostra de célula ou amostra de tecido (por exemplo medula óssea ou tecido de tumor) derivado de um mamífero humano ou não humano.
[0068] O termo “substancialmente idêntica” no contexto de duas seqüências de aminoácido significa que as seqüências, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo padrão, compartilham pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 98 ou pelo menos cerca de 99 por cento de identidade de seqüência. Em uma forma de realização, as posições de resíduo que não são idênticas diferem pelas substituições de aminoácido conservativas (descrito ainda aqui em outro lugar). A identidade de seqüência é tipicamente medida usando o software de análise de seqüência. O software de análise de proteína emparelha seqüências similares usando medidas de similaridade designadas às várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, o software GCG publicamente disponível contém programas tais como “Gap” e “BestFit” que podem ser usados com parâmetros básicos para determinar a homologia de seqüência ou identidade de seqüência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. As seqüências de polipeptídeo também podem ser comparadas usando FASTA, aplicando parâmetros básicos ou recomendados. Um programa em GCG Versão 6.1., FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências dúvidas e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132: 185-219). Um outro algoritmo preferido quando da comparação de uma seqüência com uma base de dados contendo um grande número de seqüências de vários organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp, usando parâmetros básicos. Ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acid Res. 1997; 25: 3389-402 (1997); cada um aqui incorporado por referência. As posições de aminoácido “correspondentes” em duas seqüências de aminoácido substancialmente idênticas são aquelas alinhadas por qualquer um dos software de análise de proteína aqui mencionados, usando parâmetros básicos.
[0069] Um anticorpo “equivalente a 1-7F9” ou “equivalente a 1-4F1” como aqui usado significa (1) um anticorpo que liga substancialmente o mesmo epítopo como um anticorpo que compreende as seqüências VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1, respectivamente, tal como, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1-7F9 ou 1-4F1, respectivamente, e/ou (2) um anticorpo que compreende as seqüências VH e VL idênticas ou substancialmente idênticas às seqüências VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1, respectivamente.
[0070] Uma substituição de aminoácido “conservativa” é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (“grupo R”) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). No geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde as seqüências de aminoácido diferem uma da outra pelas substituições conservativas, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir quanto a natureza conservativa da substituição. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Ver, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 1994; 243: 307-31. Os exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácido conservativos exemplares incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
DESCRIPÇÃO DA INVENÇÃO
[0071] Esta invenção está fundamentada na geração de novos anticorpos reativos cruzados e neutralizadores que se ligam aos inibidores KIRs, os anticorpos possibilitando a ativação eficaz de células NK na maioria ou em todos os indivíduos em populações humanas.
[0072] São aqui descritos, por exemplo, anticorpos que se ligam a todos de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 e potenciam a atividade lítica da célula NK pelo bloqueio das interações entre estes KIRs e HLA-C. Tais anticorpos são aludidos aqui como “reativos cruzados e neutralizadores de anti-mAbs KIR”.
[0073] Em um aspecto particular, a presente invenção diz respeito a novos anticorpos completamente reativos cruzados, neutralizadores ou tanto que reagem cruzado quanto neutralizadores, anti-KIR humanos, assim como composições que compreendem tais anticorpos e métodos de usar tais anticorpos ou composições. Estes anticorpos incluem os anticorpos humanos 1-7F9 e 1-4F1, descritos na PCT/DK2004/000470, depositada em 1 de julho de 2004, que é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade.
[0074] Os anticorpos, composições e métodos aqui descritos, entre outras coisas, podem superar as limitações correntes associadas com a modulação terapêutica de KIR e com a ativação terapêutica de célula NK e fornecem características e benefícios vantajosos adicionais. Por exemplo, os anticorpos podem reagir cruzados com inibidores de KIRs múltiplos e reduzir ou neutralizar seus sinais inibidores, resultando na potenciação da citotoxicidade da célula NK pelas células NK que expressam tais receptores de KIR inibidores. A capacidade para reagir cruzado com produtos de gene múltiplos de KIR pode possibilitar que os anticorpos da invenção sejam eficazmente usados para aumentar a atividade da célula NK na maioria ou todos os pacientes humanos, sem a carga ou despesa da pré determinação do tipo de KIR ou HLA do paciente. Em uma forma de realização, os anticorpos não ligam KIR2DS4, evitando assim a redução no potencial estimulatório que estaria associada com a neutralização da ativação do receptor de KIR2DS4. Adicional ou alternativamente, os anticorpos não ligam KIR2DS3.
[0075] A partir de tais anticorpos, vários fragmentos de anticorpo e derivados também podem ser gerados e usados para os mesmos ou propósitos similares como são aqui descritos com respeito aos anticorpos da invenção e aspectos da invenção descritos com respeito aos anticorpos aplicam-se igualmente aos fragmentos de anticorpo e derivados, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto. Em outras palavras, uma característica da invenção aqui descrita com respeito a um anticorpo também deve ser, a menos que de outro modo indicado, implicitamente entendido descrever uma característica similar com respeito a um fragmento ou derivado de anticorpo tendo funcionalidade similar em termos de especificidade. Deve ser reconhecido, entretanto, que anticorpos de “tamanho natural” e “fragmentos” de anticorpo podem ser caracterizados como aspectos distintos da invenção, visto que as suas propriedades biológicas e físico-químicas podem diferir significantemente.
[0076] Alguns anticorpos da invenção podem ser caracterizados como “humanos”, que são tipicamente associados com um risco mais baixo para uma resposta imune contra os anticorpos por um paciente humano ao qual ao mesmos são administrados. Em um aspecto exemplar, um anticorpo isolado que facilite a ativação de células NK humanas virtualmente em todos os seres humanos é descrito. Em uma forma de realização exemplar, o anticorpo é o anticorpo humano 1-7F9 ou um anticorpo humano equivalente ao 1-7F9.
[0077] Anticorpos, fragmentos ou derivados de cada um destes podem reagir cruzado com pelo menos dois receptores de KIR inibidores na superfície de células NK, reduzir ou neutralizar os sinais inibidores das células NK e potenciar a atividade das células NK. Por exemplo, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado podem ligar um determinante comum de receptores KIR2DL humanos, de modo que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado ligue pelo menos os receptores de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3. Para os propósitos desta invenção, o termo “KIR2DL2/3” refere-se a cada um ou a ambos dos receptores KIR2DL2 e KIR2DL3.
[0078] Como aqui descrito, os mAbs anti-KIR 1-7F9 e 1-4F1 têm diversas vantagens em relação aos anticorpos anti-KIR anteriormente produzidos. Por exemplo, 1-7F9 e 1-4F1 são totalmente humanos, reduzindo assim ou minimizando qualquer resposta imune contra o anticorpo uma vez administrado a um paciente. Além disso, tanto 1-7F9 quanto 1-4F1 são de isótipos adequados para os anticorpos anti-KIR terapêuticos (IgG4 e IgG2, respectivamente), como descrito abaixo. 1-7F9 também é mais eficaz na indução da matança pelas células NK que expressam KIR2DL1, -2, e/ou -3 do que os mAbs de murino EB6, GL183, DF200 e NKVSF1 (Pan2D). Por exemplo, como mostrado nas Figuras 5 e 6, 1-7F9 induziu níveis mais altos de lise específica pelas células NK que expressam KIR2DL1 de células alvo que expressaram HLA-Cw4 do que EB6, DF200 ou NKVSF1 (Pan2D). 17F9 tem ainda uma afinidade mais alta para KIR comparado com os mAbs anti-KIR anteriormente conhecidos. Por exemplo, 1-7F9 liga-se a KIR2DL1 e KIR2DL3 com constantes de dissociação (Kd's) de 0,43 nM e 0,025 nM, respectivamente, representando uma afinidade mais alta para ambos os antígenos do que, por exemplo, DF200 (ver os Exemplos 3 e 8). Como oposto aos anticorpos de murino NKVSF1 (Pan2D), A210 e A208g, nenhum de 1-7F9 e 1-4F1 liga-se ao KIR2DS4, tornando-os melhor adaptados para propósitos terapêuticos. Como NKVSF1 (Pan2D) e DF200, 1-7F9 e 1-4F1 também se ligam o KIR2DS1 e KIR2DS2, mas acredita-se que KIR2DS1 e KIR2DS2 não sejam importantes na eficácia antileucemia. Os anticorpos particulares de acordo com a invenção portanto têm as mesmas ou especificidades de antígeno similares como 1-7F9 e/ou 1-4F1. Por exemplo, anticorpos que compreendem as mesmas ou regiões VH e VL similares como 1-7F9 podem ter as mesmas ou ligação de antígeno e/ou propriedades estimulatórias de NK similares como 1-7F9; e anticorpos que compreendam as mesmas ou regiões VH e VL similares como 1-4F1 podem ter a mesma ou propriedades de ligação de antígeno similares como 1-4F1
[0079] Como mostrado na Figura 14, as seqüências de aminoácido das regiões VL e VH de 1-7F9 foram determinadas:
[0080] Região VL de 1-7F9 (SEQ ID NO: 15): EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATG IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLE I KRT
[0081] Região VH 1-7F9 (SEQ ID NO: 17): QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIF GAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMD VWGQGTTVTVSS
[0082] As seqüências de aminoácido das regiões VL e VH de 1-4F1 são fornecidas nas SEQ ID NOS: 39 e 41, respectivamente e as seqüências de nucleotídeo que codificam as regiões VL e VH de 1-4F1 são fornecidas nas SEQ ID NOS: 40 e 42, respectivamente. Em uma forma de realização particular, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 e 74 da SEQ ID NO: 39 são Q, L, S, R, A, G, L, D, E, F e A, respectivamente. Em uma outra forma de realização particular, os resíduos 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 e 74 da SEQ ID NO: 39 são R, M, F, W, Y, A, F, Y, Q, Y e T, respectivamente.
[0083] Como mostrado na Figura 15, as seqüências de aminoácido das CDRs de 1-7F9 foram identificadas como segue: a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve corresponde aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve corresponde aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve corresponde aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. As seqüências de aminoácido das CDRs de 1-4F1 foram identificadas como segue: a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve corresponde aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve corresponde aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve corresponde aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada corresponde aos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41.
[0084] As seqüências de aminoácido para as cadeias pesadas e leve de 1-7F9 inteiras são fornecidas nas SEQ ID NOS: 36 e 37, respectivamente.
[0085] Conseqüentemente, anticorpos adicionais, por exemplo, de várias subclasses de anticorpo humano; fragmentos de anticorpo, derivados de anticorpo e outros peptídeos da ligação de KIR, podem ser facilmente produzidos, por exemplo, pelas técnicas recombinantes, com base nesta informação. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo tendo uma seqüência VL e uma VH consistindo essencialmente da SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, respectivamente, e/ou um anticorpo tendo uma seqüência VL e uma VH consistindo essencialmente da SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41, respectivamente. Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende regiões de CDR consistindo essencialmente da CDR1-3 de VH e CDR1-3 de VL de 1-7F9 ou 1-4F1 descritas acima. Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende as regiões de CDR como seguem: uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15; a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende regiões de CDR como segue: uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve que corresponde a cerca dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada que corresponde a cerca dos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41. Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15; uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15; uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende as regiões de CDR como segue: uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41.
[0086] A invenção também abrange um anticorpo, fragmento de anticorpo ou anticorpo derivado anti-KIR ou um polipeptídeo de ligação de KIR, que compreende pelo menos uma seqüência de aminoácido variante substancialmente idêntica às seqüências VH ou VL de 1-7F9 ou 1-4F1 ou a uma região nestas. Um seqüência de aminoácido variante pode compreender ou consiste essencialmente de uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 50, 80, 90, 95, 98 ou 99 (por exemplo, de cerca de 50 a 99, de cerca de 65 a 99, de cerca de 75 a 99 ou de cerca de 85 a 99) por cento idêntica a uma região de CDR de 1-7F9 ou 1-4F1, VH ou VL. Uma seqüência de aminoácido variante também pode compreender ou alternativamente compreende 1, 2 ou 3 CDRs que compreendem ou consistem de seqüências de aminoácido que são pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idênticas às CDRs de 1-7F9 ou 1-4F1. Assim, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humano que compreende uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39; uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41; uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17 ou aos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 % idêntica aos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17 ou aos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41. As propriedades básicas das seqüências de aminoácido de ligação a KIR derivadas de 1-7F9 ou 1-4F1 que são retidas em tais seqüências de aminoácido variantes desejavelmente incluem a especificidade e/ou avidez das seqüências de 1-7F9 ou 1- 4F1 quanto a um ou mais KIRs e também podem incluir ou alternativamente incluem a capacidade de 1-7F9 em bloquear a interação KIR/HLA-C e potenciar a atividade lítica das células NK.
[0087] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo anti-KIR ou um polipeptídeo de ligação de KIR, que compreende uma seqüência de aminoácido de ligação de KIR que difere de uma seqüência de ligação de KIR de 1-7F9 ou 1-4F1 em um ou mais resíduos de aminoácido (por exemplo, pelo menos 2, 3, 5, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50 ou mais resíduos de aminoácido) por via de uma ou mais inserções, deleções e/ou substituições de resíduo. Em uma forma de realização, uma tal seqüência de ligação de KIR variante confere maior afinidade; especificidade maior ou diferente; menos imunogenicidade (em termos de resposta do hospedeiro à seqüência); maior estabilidade in vivo; e/ou outras propriedades benéficas para a seqüência variante em uma seqüência de aminoácido essencialmente idêntica que compreende a seqüência 1-7F9 ou 1-4F1 nativa. As variações de seqüência adequadas são ainda descritas aqui em outro lugar. Uma porção de ligação de KIR de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo anti-KIR ou um polipeptídeo de ligação de KIR, também pode compreender qualquer número adequado de componentes ou substituintes não aminoácidos, tais como porções orgânicas não aminoácidos, que facilitam a ligação de KIR e/ou fornecem outras propriedades físico-químicas ou imunológicas vantajosas.
[0088] Alguns anticorpos da invenção também ou alternativamente podem ser caracterizados pela sua afinidade de ligação a um ou mais KIRs. Por exemplo, como mostrado nos Exemplos 3 e 8, em termos de ligação bivalente, DF200 tem um Kd para KIR2DL1 de cerca de 11 nM e um Kd para KIR2DL3 de cerca de 2,0 nM e 1- 7F9 tem um Kd para KIR2DL1 de cerca de 0,43 nM e um Kd para KIR2DL3 de cerca de 0,025 nM. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece anticorpos humanos ou não humanos (por exemplo, de murino, quimérico ou humanizado) tendo um Kd na ligação bivalente ao KIR2DL1 de não mais do que cerca de 20 nM, não mais do que cerca de 11 nM, não mais do que cerca de 5 nM, não mais do que cerca de 1 nM, não mais do que cerca de 0,5 nM ou não mais do que cerca de 0,43 nM. Adicional ou alternativamente, os anticorpos da invenção humano ou não humano (por exemplo, de murino, quimérico ou humanizado) pode ter um Kd para KIR2DL3 de não mais do que cerca de 20 nM, não mais do que cerca de 2 nM, não mais do que cerca de 1 nM, não mais do que cerca de 0,1 nM ou não mais do que cerca de 0,05 nM ou não mais do que cerca de 0,025 nM. Em um aspecto particular, os anticorpos têm cerca dos mesmos valores de Kd para a ligação bivalente ao KIR2DL1 e KIR2DL3 como 1-7F9. Como mostrado no Exemplo 13, em termos de ligação monovalente, 1-7F9 e 1-4F1 têm valores Kd para KIR2DL3 de cerca de 3,5 e 7 nM, respectivamente. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção fornece anticorpos humanos ou não humanos (por exemplo, de murino, quimérico ou humanizado) tendo um Kd na ligação monovalente ao KIR2DL3 de não mais do que cerca de 20 nM, não mais do que cerca de 10 nM, não mais do que cerca de 7 nM ou não mais do que cerca de 3,5 nM.
[0089] Um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo anti-KIR ou um polipeptídeo de ligação de KIR seletiva e/ou especificamente (de modo típico especificamente) liga pelo menos um KIR e mais particularmente uma região determinante antigênica ou epítopo de pelo menos um KIR, sob condições apropriadas (por exemplo, com respeito à temperatura, pH, etc., que tipicamente refletirá as condições fisiológicas humanas em um estado normal ou de doença associada com a célula NK e no contexto de uma proteína adequada compreendendo a seqüência ou combinação). Por exemplo, em um aspecto, a invenção diz respeito a anticorpos que podem ser caracterizados (entre outras coisas) a capacidade para competir com anticorpo 1-7F9, 1-4F1 ou um equivalente a 1-7F9 ou 1-4F1 e vários métodos envolvendo os mesmos. Outros anticorpos da invenção (e/ou que são úteis na prática dos métodos inventivos aqui descritos) também ou alternativamente podem ser caracterizados por terem a capacidade para competir com um ou mais de anticorpo DF200, anticorpo NKVSF1, anticorpo EB6 e anticorpo GL183.
[0090] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo ou derivados anti-KIR que reagem cruzado e neutralizadores da invenção reduzem ou neutralizam os inibidores da atividade de KIR inibindo-se especificamente a ligação de moléculas MHC e/ou HLA a pelo menos dois receptores de KIR inibidores e facilitar a atividade da célula NK, significa que tais anticorpos, fragmentos ou derivados permitem que as células NK que expressam um receptor de KIR inibidor na sua superfície sejam capazes de lisar células que expressam um ligando de HLA correspondente para aquele receptor de KIR inibidor particular (por exemplo, um antígeno de HLA particular). Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que especificamente inibem a ligação de moléculas de HLA-C aos receptores de KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em um outro aspecto, a invenção fornece anticorpos que inibem a ligação de KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3 a HLAC. Já em um outro aspecto, a invenção fornece anticorpos que facilitam a atividade da célula NK in vivo, e/ou in vitro.
[0091] Pelo menos um de KIR2DL1 ou KID2DL2/3 está presente em pelo menos cerca de 90 % ou mais da população humana e os anticorpos mais preferidos desta invenção são capazes de potenciar a atividade de células NK que expressam cada um ou ambos destes KIR. Portanto, as composições desta invenção podem ser usadas para ativar ou potenciar eficazmente as células NK na maioria dos indivíduos humanos, tipicamente em cerca de 90 % dos indivíduos humanos ou mais. Conseqüentemente, uma única composição de anticorpo de acordo com a invenção pode ser usada para tratar a maioria dos pacientes humanos e existe rara necessidade para determinar os grupos alélicos KIR ou HLA ou para usar misturas ou coquetéis de dois ou mais mAbs anti-KIR.
[0092] Em um aspecto, o anticorpo especificamente se liga tanto ao receptor humano KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 e reverte a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada por estes KIRs. O anticorpo também pode ser humano e competir com o anticorpo monoclonal 1-7F9 e/ou 1-4F1. O termo “competir com” quando da alusão a um par particular de anticorpos (por exemplo, um ou mais anticorpos selecionados de DF200, NKVSF1 (Pan2D), 1-7F9, EB6 e GL183), significa que um primeiro anticorpo detectavelmente compete com um segundo anticorpo (ou outra molécula) em um ensaio de ligação usando moléculas KIR recombinantes ou moléculas KIR expressadas na superfície celular. Por exemplo, em um aspecto, onde as porcentagens de inibição para um certo par de anticorpo estão acima de cerca de 20 %, acima de cerca de 30 %, acima de cerca de 40 %, acima de cerca de 50 %, independente de qual anticorpo é usado como primeiro anticorpo, os anticorpos competem. Alternativamente, se as porcentagens de inibição para um certo par de anticorpo dão em média pelo menos cerca de 29 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 % ou pelo menos cerca de 50 %, o anticorpo compete. A porcentagem de inibição de uma segunda ligação de anticorpo à proteína KIR2D por um primeiro anticorpo pode ser calculada como: 100*(1-(ligação detectada do segundo anticorpo)/(ligação detectada do primeiro anticorpo)). O mesmo se aplica aos fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo. A menos que de outro modo especificado, um anticorpo que “compete” com 1-7F9, 1-4F1 ou um anticorpo equivalente a 1-7F9 ou 1-4F1 pode competir com 1-7F9, 1-4F1 ou o anticorpo equivalente a 1-7F9- ou 1-4F1 quanto a ligação ao KIR2DL1 humano, KIR2DL2/3 humano ou tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 humano. Por exemplo, o anticorpo DF200 compete com 1-7F9 e 1-4F1 quanto a ligação ao KIR2DL3.
[0093] Opcionalmente, um anticorpo que compete com 1-7F9 ou 1-4F1 não é o próprio 1-7F9 ou 1-4F1, respectivamente (isto é, a invenção fornece anticorpos outros que não 1-7F9 e 1-4F1 que são caracterizados, entre outras coisas, pela capacidade para competir com 1-7F9 e/ou 1-4F1 na ligação a um ou a ambos destes KIRs).
[0094] Em um outro aspecto, o anticorpo liga-se tanto ao receptor humano KIR2DL1 quanto ao KIR2DL2/3, reduz ou neutraliza ou reverte a inibição de citotoxicidade da célula NK mediada pelos KIRs e compete com 1-7F9 para a ligação ao receptor humano KIR2DL1, o receptor humano KIR2DL2/3 ou receptores humanos tanto de KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3. Opcionalmente, o dito anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
[0095] Em um outro aspecto, o anticorpo liga-se tanto ao receptor humano KIR2DL1 quanto ao KIR2DL2/3, reduz, neutraliza ou reverte a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada por estes KIRs e compete com EB6 quanto a ligação ao receptor humano KIR2DL1 ou compete com GL183 e/ou DF200 quanto a ligação ao receptor humano KIR2DL2/3; ou este compete tanto com EB6 quanto a ligação ao receptor humano KIR2DL1 quanto com GL183 e/ou DF200 quanto a ligação ao receptor humano KIR2DL2/3. Em uma forma de realização, o anticorpo não é NKVSF1 (Pan2D), nem A210, nem A803g, e/ou nem DF200. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo de murino, quimérico, humano ou humanizado.
[0096] Em um outro aspecto, o anticorpo compreende as regiões VH, VL ou tanto VH quanto VL que são pelo menos substancialmente idênticas às regiões VH e/ou VL de 1-7F9 ou 1-4F1. O anticorpo pode ser de qualquer subclasse, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um aspecto particular, o anticorpo é um anticorpo de IgG4 humano. Em um outro aspecto particular, o anticorpo é um anticorpo de IgG2 humano. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
[0097] Em um outro aspecto, o anticorpo é humano, compete com 1-7F9 ou 1- 4F1 e reconhece, liga-se a ou tem imunoespecificidade pelo menos parcialmente quanto ao mesmo ou ao mesmo, epítopo ou “sítio epitópico” em uma molécula KIR como o anticorpo monoclonal 1-7F9 ou 1-4F1. Preferivelmente, a dita molécula de KIR é um receptor de KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 humano.
[0098] Em um outro aspecto, o anticorpo liga-se a um determinante comum presente tanto em receptores humanos KIR2DL1 quanto em KIR2DL2/3 e reduz, neutraliza ou reverte a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada por estes KIRs. O anticorpo mais especificamente pode ligar-se pelo menos parcialmente ao mesmo, substancialmente ao mesmo ou ao mesmo epítopo em KIR como anticorpo monoclonal 1-7F9.
[0099] Em um aspecto particular, o anticorpo é um anticorpo monoclonal que exibe uma ou mais das características descritas acima.
[00100] Em um outro aspecto, fragmentos e derivados funcionais dos anticorpos aqui descritos podem ser preparados de modo que tenham ligação, especificidade e/ou atividade de antígeno substancialmente similares, incluindo, sem limitação, fragmentos Fab, fragmentos Fab'2, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos camelizados, Janusins, minicorpos, CDRs e fragmentos de ScFv.
[00101] A menos que de outro modo especificado, os anticorpos ou fragmentos bivalentes ou derivados destes são monoespecíficos, isto é, ambos os “ramos” dos anticorpos, fragmentos ou derivados ligam o(s) mesmo(s) antígeno(s).
[00102] Já em um outro aspecto, derivados de anticorpo que compreendem um anticorpo da invenção conjugado ou covalentemente ligado a uma toxina, um radionuclídeo, uma porção detectável (por exemplo, um flúor) ou um suporte sólido, podem ser preparados.
[00103] A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo como divulgado acima, um fragmento deste ou um derivado de cada um destes. Conseqüentemente, a invenção também diz respeito ao uso de um anticorpo como aqui divulgado em um método para a fabricação de um medicamento. Em formas de realização preferidas, o medicamento ou composição farmacêutica é para o tratamento de um câncer ou outro distúrbio proliferativo, uma infecção ou para o uso em transplante.
[00104] Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição (por exemplo, uma composição formulada para a administração farmacêutica, um kit para preparar uma tal composição, um kit de ou meio de ensaio, meio de purificação, etc.) que compreenda um anticorpo que se liga a pelo menos a dois produtos de gene do receptor de KIR inibidores humanos diferentes e é capaz de neutralizar a inibição mediada pela citotoxicidade de KIR pelas células NK que expressa pelo menos um dos ditos dois receptores humanos de inibidores de KIR diferentes, em que o anticorpo é incorporado em um lipossoma. O lipossoma também pode compreender uma substância adicional tal como, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico para a liberação de genes para a terapia de gene; uma molécula de ácido nucléico para a liberação de RNA de anti-sentido, RNAi ou siRNA para suprimir um gene em uma célula NK; ou uma toxina ou um medicamento para a morte alvejada de células NK.
[00105] São também aqui descritos métodos de regular a atividade da célula NK humana in vitro, ex vivo ou in vivo, que compreende contatar células NK humanas com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, um fragmento de um tal anticorpo, um derivado de cada um deste ou uma composição farmacêutica que compreenda pelo menos um de qualquer um deste. Os métodos preferidos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de uma das composições farmacêuticas desta invenção e são direcionados a aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas, mais preferivelmente ex vivo ou in vivo, em um paciente tendo um câncer, uma doença infecciosa ou uma doença imune. Por exemplo, a administração pode ser efetuada pela infusão intravenosa do anticorpo em um tampão adequado a um paciente com câncer ou uma doença infecciosa (tal como uma doença viral).
[00106] A invenção também fornece uma composição que compreenda um anticorpo que se liga pelo menos a dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em células NK que expressam pelo menos um dos dois receptores humanos de KIR inibidores diferentes, o anticorpo estando presente em uma quantidade eficaz para potenciar detectavelmente a citotoxicidade da célula NK em um paciente ou em uma amostra biológica que compreenda células NK; e um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente o anticorpo liga um determinante comum presente em KIR2DL1 e KIR2DL2/3. As composições que compreendem um anticorpo da invenção podem opcionalmente compreender ainda um segundo agente terapêutico (um agente que induza, promova, e/ou realce um efeito terapêutico em um hospedeiro que esteja relacionado a uma condição ou distúrbio para o qual o anticorpo é administrado - por exemplo, uma condição relacionada com um câncer, transplante, uma doença infecciosa, uma infecção viral, etc.). Em um aspecto, um segundo agente terapêutico que pode ser co-administrado com um anticorpo da invenção em uma tal composição de combinação pode ser selecionado, por exemplo, de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente antiangiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo específico para um antígeno que não KIR, opcionalmente um segundo anticorpo que se liga a e inibe e neutraliza um KIR inibidor ou reduz a sinalização de um KIR inibidor, um agente antiinfeccioso, um agente alvejador ou um composto adjunto. Os agentes imunomoduladores vantajosos podem ser selecionados de IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta ou IFN- gama. Os exemplos dos agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifeno, taxol, taxotere, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etoposida (VP-16), 5-fluorouracila (5FU), citosina arabinosida, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s) outros alcalóides vinca e derivados ou pró medicamentos destes. Os exemplos de agentes hormonais incluem leuprorelina, goserelina, triptorelina, buserelina, tamoxifeno, toremifeno, flutamida, nilutamida, ciproterona bicalutamid anastrozol, exemestano, letrozol, fadrozol medróxi, clormadinona, megestrol outros agonistas de LHRH outros anti- estrogênios outros anti-androgênios outros inibidores de aromatase e outros progestágenos. Preferivelmente, o segundo anticorpo que se liga a e inibe um receptor de KIR inibidor é um anticorpo ou um derivado ou fragmento deste que se liga a um epítopo de um Receptor de KIR inibidor que difere do epítopo ligado pelo anticorpo que se liga a um determinante comum presente em pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes. Em um outro aspecto, um segundo anticorpo pode ser direcionado a um alvo associado com o estado de doença que seja pelo menos parcialmente tratável pela administração do anticorpo da invenção (por exemplo, um antígeno associado a câncer, um antígeno associado à infecção viral, etc.).
[00107] A invenção ainda fornece um método de potenciar detectavelmente a atividade da célula NK em um paciente em necessidade disso, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma composição de acordo com a invenção. Um paciente em necessidade de potenciação da atividade da célula NK pode ser qualquer paciente diagnosticado como tendo uma doença ou distúrbio em que tal potenciação possa promover, realçar, e/ou induzir um efeito terapêutico (ou promove, realça, e/ou induz um tal efeito em pelo menos uma proporção substancial de pacientes com a doença ou distúrbio e características substancialmente similares como o paciente - como pode ser determinado, por exemplo, pelos testes clínicos). Um paciente em necessidade de tal tratamento pode estar sofrendo, por exemplo, de câncer, um outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune. Preferivelmente, o método compreende a etapa adicional de administrar ao paciente um agente terapêutico adicional apropriado selecionado de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente antiangiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo específico para um antígeno distinto de KIR, opcionalmente um segundo anticorpo que se liga a e inibe e neutraliza um receptor de KIR inibidor ou reduz a sinalização de um KIR inibidor, um agente antiinfeccioso, um agente alvejador ou um composto adjunto em que o dito agente terapêutico adicional é administrado ao dito paciente como uma forma de dosagem única junto com o dito anticorpo ou como forma de dosagem separada. A dosagem do anticorpo (ou fragmento/derivado de anticorpo) e a dosagem do agente terapêutico adicional coletivamente são suficientes para induzir, promover, e/ou realçar detectavelmente uma resposta terapêutica no paciente que compreende a potenciação da atividade da célula NK. Onde separadamente administrado, o anticorpo, fragmento ou derivado e o agente terapêutico adicional são desejavelmente administrados sob condições (por exemplo, com respeito ao controle de tempo, número de doses, etc.) que resultem em um benefício terapêutico combinado detectável ao paciente.
[00108] Ainda abrangido pela presente invenção são anticorpos que são capazes de ligar especificamente células NK e/ou receptores KIR em um primata não humano, preferivelmente um macaco. Também abrangido são métodos para avaliar a toxicidade, dosagem e/ou atividade ou eficácia de anticorpos da invenção que são medicamentos candidatos. Em um aspecto, a invenção abrange um método para determinar uma dose de um anticorpo que seja tóxica a um animal ou tecido alvo pela administração de um anticorpo da invenção a um animal receptor primata não humano tendo células NK e avaliado quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos ou adversos do agente sobre o animal ou preferivelmente sobre um tecido alvo. Em um outro aspecto, a invenção é um método para identificar um anticorpo que seja tóxico a um animal ou tecido alvo pela administração de um anticorpo da invenção a um animal receptor primata não humano tendo células NK e avaliando quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos ou adversos do agente sobre o animal ou preferivelmente sobre um tecido alvo. Em um outro aspecto, a invenção é um método para identificar um anticorpo que seja eficaz como tratamento de uma infecção, doença ou tumor pela administração de um anticorpo da invenção a um modelo primata não humano de infecção, doença ou câncer e identificar o anticorpo que melhore a infecção, doença ou câncer ou um sintoma destes. Em uma forma de realização, o dito anticorpo da invenção é um anticorpo que (a) reage cruzado com pelo menos dois receptores de KIR inibidor humano na superfície de células NK humanas e (b) reage cruzado com células NK ou um receptor de KIR do primata não humano.
[00109] Ainda abrangido pela presente invenção é um método de detectar a presença de células NK que portam um KIR inibidor na sua superfície celular em uma amostra biológica ou um organismo vivo, os dito método compreendendo as etapas de: a) contatar a dita amostra biológica ou organismo vivo com um anticorpo da invenção, em que o dito anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a uma porção detectável; e b) detectar a presença do dito anticorpo na dita amostra biológica ou organismo vivo.
[00110] A invenção também fornece um método de purificar a partir de uma amostra de células NK que portam um KIR inibidor na sua superfície celular que compreende as etapas de: a) contatar a dita amostra com um anticorpo da invenção sob condições que possibilitem as ditas células NK que portam um KIR inibidor na sua superfície celular ligar-se ao dito anticorpo, em que o dito anticorpo é conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido (por exemplo, uma pérola, uma matriz, etc.); e b) eluir as ditas células NK ligadas do dito anticorpo conjugado ou covalentemente ligado a um suporte sólido.
[00111] Foi descoberto que o anticorpo NKVSF1 (Pan2D) também se liga às células NK de macacos cinomolgos, ver a Figura 10.
[00112] A invenção, portanto, fornece um anticorpo, assim como fragmentos e derivados destes, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reagem cruzado com pelo menos dois receptores de KIR inibidor humano na superfície de células NK humanas e que além disso se ligam às células NK de macacos cinomolgos. Em uma se suas formas de realização, o anticorpo não é o anticorpo NKVSF-1, nem o A210, e/ou nem o A802g. A invenção também fornece um método de testar a toxicidade de um anticorpo, assim como fragmentos e derivados destes, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reagem cruzado com pelo menos dois receptores de KIR inibidor humano na superfície de células NK humanas, em que o método compreende testar o anticorpo em um macaco cinomolgo.
[00113] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de cada um destes, que compreende a região variável leve ou uma ou mais CDRs da região variável leve de anticorpo 1-7F9 ou 1-4F1. Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de cada um destes que compreende uma seqüência que seja altamente similar a toda ou essencialmente todas as seqüências da região variável de cadeia leve de 1-7F9 ou 1-4F1.
[00114] Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de cada um destes, que compreende a região variável de cadeia pesada ou uma ou mais CDRs da região variável de cadeia pesada de anticorpo 1-7F9 ou 1-4F1. Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de cada um destes que compreendem uma seqüência que seja altamente similar a todas ou essencialmente todas as seqüências da região variável de cadeia pesada de 1-7F9 ou 1-4F1.
[00115] Anticorpos
[00116] A presente invenção fornece novos anticorpos e fragmentos ou derivados destes que se ligam a determinantes comuns conservados entre os receptores humanos de KIR inibidores, preferivelmente incluindo um determinante presente em pelo menos dois produtos de gene de KIR2DL diferentes, mas não em KIR2DS4 e que causa potenciação de células NK que expressa pelo menos um daqueles receptores de KIR. A invenção divulga, pela primeira vez, que tais anticorpos que reagem cruzado e neutralizadores podem ser produzidos e eficazmente usados na modulação de atividade da célula NK, que representa um resultado inesperado e abre uma avenida na direção de terapias com base em NK novas e eficazes, particularmente em pacientes humanos.
[00117] Dentro do contexto desta invenção, um “determinante comum” designa um determinante ou epítopo que é compartilhado pelos diversos produtos de gene dos receptores humanos de KIR inibidores. Preferivelmente, o determinante comum é compartilhado por pelo menos dois membros do grupo receptor de KIR2DL. Mais preferivelmente, o determinante é compartilhado por pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Certos anticorpos desta invenção, além de reconhecer produtos de gene múltiplos do tipo KIR2DL, também podem reconhecer determinantes presentes em outros inibidores de KIR, tais como produto de gene do grupo receptor de KIR3DL; por exemplo, KIR3DL1 e/ou KIR3DL2. O determinante ou epítopo podem representar um fragmento de peptídeo ou um epítopo conformacional compartilhado pelos ditos membros. Em uma forma de realização mais específica, o anticorpo desta invenção especificamente liga-se substancialmente ao mesmo epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal DF200. Este determinante está presente tanto no KIR2DL1 quanto no KIR2DL2/3. Em uma outra forma de realização preferida, o anticorpo desta invenção especificamente liga-se substancialmente ao mesmo epítopo reconhecido pelo mAb humano 1-7F9 ou ao epítopo reconhecido pelo mAb humano 1-4F1, os ditos epítopos estando presentes no KIR2DL1, -2 e -3, mas não no KIR2DS4.
[00118] O termo “anticorpos,” como aqui usado, refere-se a anticorpos policlonais e monoclonais, assim como aos fragmentos e derivados dos ditos anticorpos policlonais e monoclonais a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, anticorpos de tamanho natural tipicamente são designados a uma das cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Diversas destas são divididas ainda em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e outras. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamadas de “alfa,” “delta,” “épsilon,” “gama” e “mu,” respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidos. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos utilizadas nesta invenção porque estes são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e porque estes são mais facilmente fabricados em um cenário de laboratório. Tipicamente, um “anticorpo” no contexto desta invenção refere-se a um anticorpo monoclonal, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal “humano”.
[00119] Uma forma de realização da invenção fornece um método de bloquear a interação de um KIR inibidor e o seu ligando HLA correspondente in vivo, para propósitos terapêuticos que envolvam a ativação de células NK endógenas. Em um tal cenário, pode ser vantajoso evitar esgotar as células NK, visto que, se esgotadas, as células NK não podem exercer seus efeitos terapeuticamente benéficos. Portanto, isótipos de anticorpo tais como IgG4 e IgG2 que exibem pouca ligação aos receptores Fc e que não ativam o sistema de complemento, são tipicamente preferidos. O isótipo de 1-7F9 é IgG4. Os anticorpos IgG2 também são no geral considerados não serem esgotados e também podem ser moléculas mais estáveis do que os anticorpos IgG4, conferindo deste modo uma meia-vida mais longa in vivo. 1-4F1 é do isótipo IgG2.
[00120] Produção de Anticorpo
[00121] Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas no ramo. Tipicamente, estes são produzidos pela imunização de um animal não humano, preferivelmente um camundongo, com um imunógeno que compreende um polipeptídeo de KIR inibidor, preferivelmente um polipeptídeo de KIR2DL, mais preferivelmente um polipeptídeo de KIR2DL humano. O polipeptídeo KIR inibidor pode compreender a seqüência de tamanho natural de um polipeptídeo KIR inibidor humano ou um fragmento ou derivado destes, tipicamente um fragmento imunogênico, isto é, uma porção do polipeptídeo que compreende um epítopo exposto na superfície da célula que expressa um receptor de KIR inibidor. Tal fragmentos tipicamente contém pelo menos cerca de 7 aminoácidos consecutivos da seqüência de polipeptídeo madura, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos destes. Os fragmentos de modo típico são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor. Ainda mais preferido é um polipeptídeo KIR2DL humano que inclui pelo menos um, mais preferivelmente ambos, os domínios de Ig extracelulares, do polipeptídeo KIRDL do tamanho natural e é capaz de imitar pelo menos um epítopo conformacional presente em um receptor de KIR2DL. Em outras formas de realização, o dito polipeptídeo compreende pelo menos cerca de 8 aminoácidos consecutivos de um domínio Ig extracelular das posições de aminoácido 1 a 224 do polipeptídeo KIR2DL1 (numeração de aminoácido de acordo com Wagtmann et al., Immunity 1995; 2: 439-449, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade ou de acordo com o website da internet PROW encontrado no endereço da World Wide Web (www) ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm).
[00122] Em uma forma de realização, o imunógeno compreende um polipeptídeo KIR2DL humano do tipo selvagem em uma membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Em uma forma de realização específica, o imunógeno compreende células NK intactas, particularmente células NK humanas intactas. Em uma outra forma de realização, as células são lisadas ou de outro modo tratadas de modo a não estarem intactas. O imunógeno pode ser, por exemplo, colocado em suspensão ou dissolvido em um tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo, antes da administração a um mamífero não humano, tal como um camundongo, coelho, cabra, cavalo, cão, ovelha, porquinho da Índia, rato, hamster, etc.
[00123] A etapa de imunizar um mamífero não humano com um antígeno pode ser realizada em qualquer maneira bem conhecida na técnica para estimular a produção de anticorpos em um camundongo (ver, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). O imunógeno é depois colocado em suspensão ou dissolvido em um tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo. Métodos para determinar a quantidade de imunógeno, tipos de tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica e não são limitantes de nenhum modo na presente invenção. Estes parâmetros podem ser diferentes para imunógenos diferentes, mas são facilmente elucidados.
[00124] Similarmente, os princípios relevantes para a seleção da localização e freqüência de imunização suficiente para estimular a produção de anticorpos também são bem conhecidos na técnica. Em um protocolo de imunização exemplar, os animais não humanos são injetados intraperitonealmente com antígeno no dia 1 e novamente em cerca de uma semana mais tarde. Isto é seguido pelas injeções de rechamada do antígeno em torno do dia 20, opcionalmente com adjuvante tal como adjuvante de Freund incompleto. As injeções de rechamada são realizadas intravenosamente e podem ser repetidas por vários dias consecutivos. Isto é seguido por uma injeção de reforço no dia 40, intravenosamente ou intraperitonealmente, tipicamente sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B que produzem anticorpo específicas de antígeno depois de cerca de 40 dias. Outros protocolos também podem ser utilizados contanto que resultem na produção de células B que expressam um anticorpo direcionado ao antígeno usado na imunização.
[00125] Para a preparação de anticorpo policlonal, soro é obtido a partir de um animal não humano imunizado e os anticorpos aí presentes isolados pelas técnicas bem conhecidas. O soro pode ser purificado por afinidade usando qualquer um dos imunógenos apresentados acima ligados a um suporte sólido de modo a obter anticorpos que reajam com receptores de KIR inibidores.
[00126] Em uma forma de realização alternativa, os linfócitos de um mamífero não humano não imunizado são isolados, cultivados in vitro e depois exposto ao imunógeno na cultura de célula. Os linfócitos são depois colhidos e a etapa de fusão descrita abaixo é realizada.
[00127] Para os anticorpos monoclonais, a etapa seguinte é a isolação de esplenócitos do mamífero não humano imunizado e a fusão subsequente daqueles esplenócitos com uma célula imortalizada de modo a formar um hibridoma que produza anticorpo. A isolação de esplenócitos de um mamífero não humano é bem conhecida na técnica e tipicamente envolve remover o baço de um mamífero não humano anestesiado, cortá-lo em pedaços pequenos e espremer os esplenócitos da cápsula esplênica e através de uma malha de náilon de uma peneira de célula em um tampão apropriado de modo a produzir uma única suspensão de célula. As células são lavadas, centrifugadas e recolocadas em suspensão em um tampão que lise quaisquer células sangüíneas vermelhas. A solução é mais uma vez centrifugada e os linfócitos remanescentes na pelota são finalmente recolocados em suspensão em tampão fresco.
[00128] Uma vez isolados e presentes em suspensão de célula única, os linfócitos podem ser fundidos a uma linhagem de célula imortal. Esta é tipicamente uma linhagem de célula de mieloma de camundongo, embora muitas outras linhagens de célula imortal úteis para criar hibridomas são conhecidas na técnica. Linhagens de mieloma de murino preferidas incluem, mas não são limitadas àquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 (disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA.) ou as linhagens de célula X63 Ag8653 e SP-2 (disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA.). A fusão celular é efetuada usando polietileno glicol ou semelhante. Os hibridomas resultantes são depois cultivados em meios seletivos que contenham uma ou mais substâncias que inibam o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras, não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
[00129] Os hibridomas são tipicamente cultivados em uma camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos são preferivelmente de ninhadas do mamífero não humano usado para isolar os esplenócitos e são tipicamente preparadas com adjuvante de Freund incompleto ou semelhante vários dias antes de plaquear os hibridomas. Os métodos de fusão são descritos em Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,” pp. 59-103 (Academic Press, 1986), a divulgação dos quais é aqui incorporada por referência.
[00130] As células são possibilitadas crescer nos meios de seleção por tempo suficiente para a formação de colônia e produção de anticorpo. Isto é usualmente entre cerca de 7 e cerca de 14 dias. As colônias de hibridoma são depois ensaiadas quanto a produção de anticorpos que reagem cruzado com produtos de gene de receptor de KIR inibidor múltiplos. O ensaio é tipicamente um ensaio tipo ELISA colorimétrico, embora diversos outros tipos de ensaios possam ser utilizados, incluindo imunoprecipitação e radioimunoensaio ou FACS, Biacore, ensaios de proximidade de cintilação (SPA) ou outros tipos de ensaios bem conhecidos na técnica. Os reservatórios contendo anticorpos da especificidade desejada são examinados para determinar se uma ou mais colônias de célula de hibridoma distintas estão presentes. Se mais do que uma colônia está presente, as células podem ser re-clonadas e cultivadas para garantir que apenas uma única célula deu origem à colônia que produz o anticorpo desejado. Os reservatórios positivos com uma única colônia evidente são tipicamente re-clonados e re-ensaiados para garantir que apenas um anticorpo monoclonal esteja sendo detectado e produzido.
[00131] Em uma forma de realização preferida, o animal não humano usado para produzir anticorpos de acordo com os métodos aplicáveis da invenção é um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, etc.), bovino, porcino, cavalo, coelho, cabra, ovelha, etc. Também, o mamífero não humano pode ser geneticamente modificado ou engendrado para produzir anticorpos “humanos”, tais como o Xenomouse® (Abgenix) ou HuMAb-Mouse® (Medarex), como descritos abaixo.
[00132] Os anticorpos também podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um cordato (tal como um mamífero ou pássaro) ou uma planta que seja transgênica para as seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de interesse e a produção do anticorpo em uma forma recuperável a partir destes (ver, por exemplo, Ma et al., Nature Rev. Genetics 4: 794-805 (2003); Nolke et al., Expert Opin Biol Ther. Out de 2003; 3(7): 1153-62; Schillberg et al., Cell Mol Life Sci. Mar de 2003; 60(3): 433-45; Tekoah et al., Arch Biochem Biophys. 15 de Jun de 2004; 426(2): 266-78; Fischer et al., Eur. J. of Biochem., 262(3): 810 (1999); e Pedido de Patente US 20030084482 com respeito à produção de anticorpos e proteínas equivalentes a anticorpo em plantas). Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, anticorpos e outras proteínas podem ser produzidos e recuperados a partir do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, as Patentes US 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957. Os anticorpos também podem ser produzidos nos ovos de pássaros e recuperados a partir destes. Ver, por exemplo, Tini et al., Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. Mar de 2002; 131(3): 569-74 e Patente US 4.550.019.
[00133] Os anticorpos também podem ser produzidos pela seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como divulgado por exemplo em Ward et al., Nature, 341 (1989) p. 544.
[00134] De acordo com uma outra forma de realização, a invenção fornece um hibridoma derivado de uma célula B de um hospedeiro não humano, em que a dita célula B produz um anticorpo que liga um determinante presente em pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes e o dito anticorpo é capaz de neutralizar a atividade inibidora dos ditos receptores. Mais preferivelmente, o hibridoma deste aspecto da invenção não é um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal NKVSF1, nem o A210, e/ou nem o A802g. O hibridoma de acordo com este aspecto da invenção pode ser criado como descrito acima pela fusão de esplenócitos do mamífero não humano imunizados com uma linhagem de célula imortal. Os hibridomas produzidos por esta fusão podem ser triados quanto a presença de um tal anticorpo que reage cruzado como descrito aqui em outro lugar. Preferivelmente, o hibridoma produz um anticorpo que reconhece um determinante presente em pelo menos dois produtos de gene KIR2DL diferentes e causa a potenciação de células NK que expressam pelo menos um daqueles receptores de KIR. Ainda mais preferivelmente, o hibridoma produz um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como 1-7F9 e que potencia a atividade da célula NK ou que liga substancialmente o epítopo saem como 14F1. Mais preferivelmente, o hibridoma é o hibridoma 1-7F9 que produz o anticorpo monoclonal 1-7F9 ou o hibridoma 1-4F1 que produz o anticorpo monoclonal 1-4F1.
[00135] Os hibridomas que são confirmados produzir um anticorpo monoclonal desta invenção podem ser cultivados em quantidades maiores em um meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites em um animal.
[00136] Depois de cultivo suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, o meio de cultivo contendo anticorpo monoclonal (ou o fluído de ascites) pode ser separado das células e o anticorpo monoclonal é purificado. A purificação é tipicamente obtida pela cromatografia usando a proteína A ou proteína G-Sepharose ou um Ig anti-camundongo ligado a um suporte sólido tal como agarose ou pérolas de Sepharose (todos descritos, por exemplo, no Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publicação No 18-1037-46, Edição AC, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência) ou por outras técnicas conhecidas tais como eletroforese ou diálise. O anticorpo ligado é tipicamente eluído das colunas de proteína A/proteína G usando-se tampões de pH baixo (tampões de glicina ou acetato de pH 3,0 ou menos) com a neutralização imediata de frações contendo anticorpo. Estas frações podem ser reunidas, dialisadas e concentradas como necessário.
[00137] Anticorpos Humanos
[00138] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos anti-KIR humanos. Os anticorpos “humanos” são distinguíveis dos anticorpos “humanizados” (que são descritos separadamente abaixo). Tais anticorpos “humanos” podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas pela mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou pela mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs, tal como na CDR3. Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, é intencionado não incluir anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos de humano/camundongo em que as seqüências de CDR derivadas da linha germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas seqüências da matriz humana.
[00139] Os animais transgênicos podem e foram desenvolvidos de modo que abrigassem genes Ig humanos e, na imunização, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção da imunoglobulina de camundongo. Tais camundongos transgênicos em Ig humana podem ser utilizados para produzir anticorpos humanos. Tais anticorpos humanos podem ser gerados em animais transgênicos em Ig humana (por exemplo, camundongos, ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado, cavalos, etc.) que compreende locais de imunoglobulina humana e deleções de gene de imunoglobulina nativa, tais como em um XenoMouse® (Abgenix - Fremont, CA, USA) (ver, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994); Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997); Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998); Patente Européia No EP 0 463 151 B1; Pedidos de Patente Internacional Nos WO 94/02602, WO 96/34096; WO 98/24893, WO 99/45031, WO 99/53049 e WO 00/037504; e Patentes US 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 5.994.619, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 e 6.130.364) ou animais transgênicos que compreendem um minilocal de genes que codificam a Ig humana tal como o HuMab-Mouse® (Medarex - Princeton, NJ, USA) (ver, por exemplo, EP 0546073, EP0546073; Patentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, 5.643.763; e Pedidos de Patente Internacionais Nos WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884). Os esplenócitos de tais camundongos transgênicos podem ser usados para produzir hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos de acordo com técnicas bem conhecidas, como aqui descritas. Técnicas e princípios similares são descritas, por exemplo, em Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); e Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)).
[00140] Além disso, anticorpos humanos ou anticorpos de outras espécies podem ser gerados através das tecnologias do tipo demonstração, incluindo, sem limitação, a demonstração de fago, demonstração retroviral, demonstração ribossômica e outras técnicas relacionadas, usando métodos bem conhecidos na técnica e as moléculas resultantes podem ser submetidos aos métodos de maturação adicional, tal como a maturação por afinidade, visto que tais técnicas também são bem conhecidas (ver, por exemplo, (Hoogenboom et al ., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991) (demonstração de fago); Vaughan, et al., Nature Biotech 14: 309 (1996) (demonstração de fago); Hanes e Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997) (demonstração ribossômica), Parmley e Smith Gene 73: 305-318 (1988) (demonstração de fago), Marks et al., J. MoI. Biol., 222: 581 (1991), Scott TIBS 17: 241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87: 6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130: 4368 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992) e Patente US 5.733.743). Se as tecnologias de demonstração são utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados, por exemplo, como aqui descrito em outro lugar.
[00141] Consequentemente, como aqui descrito, mAbs anti-KIR são agentes promissores para o tratamento de câncer e infecções virais e outras doenças e distúrbios. Os mAbs anti-KIR podem ser gerados por vários métodos, tais como humanização de mAbs de murino ou pela fusão de esplenócitos de camundongos transgênicos em Ig humana (camundongos XenoMouse ou HuMab), pela demonstração de fago ou pela imortalização de células B que produzem Ab humano ou por outros métodos. Em cada caso, o anticorpo pode ser produzido pelas linhagens de célula e purificado em quantidades adequadas para a formulação, empacotamento e injeção em pacientes em necessidade disso.
[00142] Produção Recombinante
[00143] Os anticorpos anti-KIR também podem ser preparados pela expressão recombinante em organismos de célula única, tais como levedura; ou em culturas de célula bacteriana (tal como na E. coli); ou em cultura de célula eucariótica (por exemplo, em uma cultura de células de mamífero) usando técnicas padrão.
[00144] Assim, de acordo com uma forma de realização alternativa, o DNA que codifica as cadeias pesada e leve de um anticorpo anti-KIR reativo cruzado e neutralizador, que liga um determinante presente em pelo menos dois KIRs inibidores humanos diferentes, é isolado do hibridoma desta invenção e colocado em um vetor de expressão apropriado para a transfecção em um hospedeiro apropriado. O hospedeiro é depois usado para a produção recombinante do anticorpo ou variantes deste, tais como uma versão humanizada deste anticorpo monoclonal, fragmentos ativos do anticorpo ou anticorpos quiméricos que compreendam a porção de reconhecimento de antígeno do anticorpo. Preferivelmente, o DNA usado nesta forma de realização codifica um anticorpo que reconhece um determinante presente em pelo menos dois produtos de gene de KIR2DL diferentes, mas não no KIR2DS3 ou -4 e que cause a potenciação de células NK que expressam pelo menos um destes receptores de KIR2DL. Ainda mais preferivelmente, o DNA codifica um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como 1-7F9 e que potencia a atividade da célula NK. Mais preferivelmente, este DNA codifica o anticorpo monoclonal 1-7F9.
[00145] O DNA que codificam os anticorpos monoclonais da invenção é facilmente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando- se sondas de oligonucleotídeo que sejam capazes de ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino ou humanos). Uma vez isolados, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são depois transfectados nas células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS símeas, células do ovário do hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem a proteína da imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam fragmentos do anticorpo é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); e Pluckthun, Immunol. Revs. 130, pp. 151 (1992).
[00146] Adicionalmente, a produção recombinante de anticorpos de cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) conhecidas e regiões constantes humanas foram descritas, por exemplo, por Ruker et al. (Annals of the Nova Iorque Academy of Sciences. 1991; 646: 212-219), que reporta a expressão de um anticorpo anti- HIV-1 monoclonal humano em células CHO; Bianchi et al. (Biotechnology and Bioengineering. 2003; 84: 439-444), que descreve a expressão de alto nível de anticorpos de tamanho natural usando vetores de expressão de trans- complementação, No Soo Kim et al. (Biotechnol. Prog. 2001; 17: 69-75), que descreve determinantes chave na ocorrência de variação clonal na expressão de anticorpo humanizado de células CHO durante a amplificação de gene mediado pela diidrofoliato reductase; King et al. (Biochemical Journal. 1992; 281: 317-323), que relata a expressão, purificação e caracterização de um anticorpo quimérico de camundongo-humano e fragmento de Fab’ quimérico; WO 2003064606 que descreve anticorpos isolados monoclonais humanos que compreende uma região variável humana de cadeia pesada e uma de cadeia leve, ambas as quais compreende as seqüências FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR e FR4; e a WO 2003040170 que descreve anticorpos monoclonais quiméricos ou humanos e porções de ligação de antígeno que especificamente liga e ativa CD40 humano.
[00147] As seqüências de cDNA inteiras que codificam as regiões constantes de IgG humana podem ser encontradas nas seguintes entradas do GenBank, cada uma das quais incorporadas por referência em sua totalidade, admitido em 6 de Janeiro de 2005:
[00148] Região de cadeia pesada constante de IgG1 humana: Acesso no GenBank #: J00228
[00149] Região de cadeia pesada constante da IgG2 humana: Acesso no GenBank #: J00230
[00150] Região de cadeia pesada constante de IgG3 humana: Acesso no GenBank #: X04646
[00151] Região de cadeia pesada constante de IgG4 humana: Acesso no GenBank #: K01316
[00152] Região constante de cadeia leve capa humana: Acesso no GenBank #: J00241.
[00153] Em uma forma de realização exemplar, para produzir a produção de mAb recombinante de seqüências VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1, o seguinte protocolo pode ser aplicado. As etapas de 1 a 3 descrevem a recuperação das regiões VH e VL de um hibridoma ou outra célula que produz 1-7F9 ou 1-4F1. Entretanto, o cDNA que codifica as seqüências VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1 (ou mutantes ou derivados deste), a ser usado na etapa 4, também pode ser preparado a partir da informação de seqüência fornecida nas Figuras 14 ou 15, usando técnicas bem estabelecidas para sintetizar fragmentos de cDNA. Alternativamente, os fragmentos de VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1 ou mutantes ou derivados destes, podem ser clonados em qualquer um de vários vetores de expressão descritos na literatura científica ou vetores de expressão comercialmente disponíveis, contendo uma região constante da subclasse Ig desejada, de modo a expressar um anticorpo de tamanho natural. Adicionalmente, fragmentos VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1 ou mutantes ou derivados destes podem ser clonados em vetores que codificam regiões constantes truncadas de modo a expressar fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos Fab). Um exemplo de um vetor comercialmente disponível é pASK84, disponível da ATCC (American Type Culture Collection, número de catálogo 87094).
[00154] (1) Isolação de RNA total a partir de células de hibridoma:
[00155] 4 x 106 células de hibridoma (tais como 1-7F9 ou 1-4F1) que secretam anticorpos contra KIR humano são usadas para a isolação de RNA total usando RNeasy Mini Kit da Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante e resumidamente aqui esboçado: As células são pelotizadas pela centrifugação por 5 min a 1000 rpm e rompidas pela adição de 350 μ l de tampão RLT contendo 10 μ l/ml de β-mercaptoetanol. O lisado é transferido em uma coluna QlAshredder da Qiagen e centrifugada por 2 min na velocidade máxima. O fluxo é misturado com um volume igual de etanol a 70 %. Até 700 μ l de amostra são aplicados por coluna giratória de RNeasy (Qiagen) e centrifugados a 14000 rpm e o fluxo descartado. 700 μ l de tampão RW1 são aplicados por coluna que é centrifugada a 14000 rpm por 15 s para lavar a coluna. A coluna é lavada duas vezes com 500 μ l de tampão RPE e centrifugada em 14000 rpm por 15 s. Para secar a coluna, a mesma é centrifugada adicionalmente por 2 min a 14000 rpm. A coluna é transferida a um novo tubo de coleta e o RNA é eluído com 50 μ l de água isenta de nuclease e centrifugada por 1 min a 14000 rpm. A concentração de RNA é medida pela absorbância na OD = 260 nm. O RNA é armazenado a -80°C até necessário.
[00156] (2) Síntese de cDNA:
[00157] 1 μ g de RNA é usado para a síntese de cDNA do primeiro filamento usando o kit de Amplificação de cDNA SMART RACE da Clontech. Para a preparação de 5’-RACE-Ready cDNA, uma mistura de reação é preparada contendo RNA isolado como descrito acima, o iniciador reverso 5'-CDS retro iniciador e SMART II A oligo e esta mistura é incubada a 72°C por cerca de 2 min. e subseqüentemente esfriada em gelo por cerca de 2 min. antes de adicionar 1 x o tampão do Primeiro-Filamento, DTT (20 mM), dNTP (10 mM) e a Transcriptase Reversa PowerScript. A mistura de reação é incubada a 42°C por 1,5 hora e tampão de Tricina-EDTA é adicionado e incubado a 72°C por 7 min. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20°C.
[00158] (3) Amplificação e clonagem pela PCR de cadeias leve variável humana (VL) e pesada variável humana (VH):
[00159] Uma mistura de reação da PCR (Reação de Cadeia da Polimerase) contendo 1 x tampão de PCR Advantage HF 2, dNTP (10 mM) e 1 x mistura da polimerase Advantage HF 2 é estabelecida para a amplificação separada de regiões variável tanto de VL quanto VH de cDNA feita como acima. Para a amplificação de VL os seguintes iniciadores são usados:
[00160] UPM (Mistura de Iniciador Universal):
[00161] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGC AGAGT- 3' (SEQ ID NO: 26)
[00162] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO: 27)
[00163] VK RACE2:
[00164] 5’-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3’ (SEQ ID NO: 28)
[00165] Para a amplificação de VH os seguintes iniciadores são usados:
[00166] UPM (Mistura de Iniciador Universal):
[00167] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACG CAGAGT- 3’ (SEQ ID NO: 29)
[00168] 5’-CTAATACGACTCACTATAGGG-3’ (SEQ ID NO: 30)
[00169] AB9ORACE:
[00170] 5’-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3’ (SEQ ID NO: 31)
[00171] Três rodadas de PCR são conduzidas. Rodada 1: A PCR é conduzida por 5 ciclos a 94°C por 5 s e 72°C por 3 min. Rodada 2: A PCR é conduzida por 5 ciclos a 94°C por 5 s, 70°C por 10 s e 72°C por 1 min. Rodada 3: A PCR é conduzida por 28 ciclos a 94°C por 5 s, 68°C por 10 s e 72°C por 1 min.
[00172] Os produtos de PCR são analisados pela eletroforese em um gel de agarose a 1 % e o DNA purificado a partir do gel usando o kit de extração em gel de agarose QIAEX11 da Qiagen.
[00173] Os produtos de PCR purificados são introduzidos no vetor PCR4-TOPO usando o kit de Clonagem TOPO TA da Invitrogen e usados para a transformação de células competentes TOP10.
[00174] Uma quantidade adequada de colônias são analisadas pela PCR de colônia usando Taq polimerase, tampão 1xTaq polimerase, dNTP (10 mM) e os seguintes iniciadores e programa de PCR:
[00175] Iniciador avançado M13: 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ (SEQ ID NO: 32)
[00176] Iniciador reverso M13: 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO: 33)
[00177] Programa de PCR:
[00178] 25 ciclos são conduzidos a 94°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 1 min.
[00179] O DNA plasmídico de clones que compreendem insertos VL e VH, respectivamente, é extraído e seqüenciado usando os iniciadores avançado M13 e reverso M13 listados acima. No caso do mAb anti-KIR humano 1-7F9, as seqüências que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve são mostradas na Fig 15.
[00180] (4) Subclonagem de genes de anticorpo em vetores de expressão de mamífero
[00181] Com base nos dados de seqüência para cDNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do mAb, os iniciadores são designados para a amplificação dos genes de cadeia variável leve (VL) e variável pesada (VH), respectivamente. As regiões variáveis são formatadas pela PCR para incluir uma seqüência Kozak, seqüência líder e sítios de enzima de restrição únicos. Para a VL, isto é obtido designando-se iniciadores de PCR 5’ para introduzir um sítio HindIII, a seqüência Kozak e para serem homólogos à extremidade 5’ da seqüência líder da região da cadeia leve variável. O iniciador 3’ é homólogo à extremidade 3’ da região variável e introduzido um sítio BsiW I do limite 3’ da região variável. A região VH é gerada em uma maneira similar exceto que um sítio NotI e um NheI são introduzidos nas extremidades 5’ e 3’ ao invés de HindIII e BsiW I, respectivamente.
[00182] Os produtos de gene amplificados são cada um clonados em um vetor de expressão eucariótica contendo as regiões constantes de cadeia leve e pesada, usando técnicas padrão. Os fragmentos de DNA VL são digeridos com HindIII e BsiWI e ligados em um vetor de expressão eucariótica contendo o gene da betalactamase que codificam a resistência à ampicilina e uma origem de replicação (pUC) da E. coli; o plasmídeo resultante é designado VLCL. Os fragmentos de DNA VH, são digeridos com NotI e NheI e introduzidos no vetor VLCL resultante da introdução de fragmento VL como descrito acima. O plasmídeo resultante contém cassetes de expressão funcionais que codificam tanto a cadeia pesada quanto a leve, do anticorpo no mesmo plasmídeo. O plasmídeo ligado é usado para transformar E. coli. O DNA plasmídico é preparado a partir destas populações bacterianas resistentes à ampicilina e usadas para a transfecção em células do Ovário do Hamster Chinês ou outras linhagens de célula de mamífero. A transfecção e cultura de célula é realizada pelos métodos padrão, como descrito por exemplo em “Molecular Cloning”, Sambrook et al. O resultado são linhagens de célula transfectadas que estavelmente expressam e secretam a molécula de anticorpo de interesse, tal como o mAb anti-KIR humano 1-7F9 ou 1-4F1 ou um mAb que compreende as regiões VH e VL de 1-7F9 ou 1-4F1 ou um outro mAb anti-KIR humano.
[00183] As variantes do anticorpo podem ser facilmente gerados. Por exemplo, um anticorpo com a mesma especificidade exata como 1-7F9 ou 1-4F1 mas de um isotipo diferente do que IgG4 ou IgG2, respectivamente, pode ser obtido pela sub- clonagem do cDNA que codifica VL e VH de 1-7F9 ou 1-4F1 em plasmídeos contendo cDNA que codificam as regiões constantes de cadeia leve capa e uma região de cadeia constante pesada selecionada das regiões constantes de cadeia pesada IgG1 ou IgG2 ou IgG3 ou IgG4. Assim, um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isotipo e o anticorpo pode ser depois intercalado no isotipo usando técnicas convencional no ramo. Tais técnicas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver, por exemplo, a Patente US 4.816.397), técnicas celulares de fusão celular (ver por exemplo, a Patente US 5.916.771) e outras técnicas adequadas conhecidas no ramo. Consequentemente, a função efetora de anticorpos fornecidos pela invenção pode ser “mudada” com respeito ao isotipo de um anticorpo precursor pela intercalação, por exemplo, a um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos, incluindo aqueles terapêuticos.
[00184] Assim, em outros aspectos, a invenção fornece um hibridoma que compreende: (a) uma célula B de um hospedeiro mamífero (tipicamente um hospedeiro mamífero não humano) que tenha sido imunizado com um antígeno que compreende um epítopo presente em um polipeptídeo de KIR inibidor, fundido a (b) uma célula imortalizada (por exemplo, uma célula de mieloma), em que o dito hibridoma produza um anticorpo monoclonal que se ligue a pelo menos dois receptores humanos de KIR inibidor diferentes e seja capaz de neutralizar pelo menos substancialmente a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em uma população de células NK que expressa os ditos pelo menos dois receptores humanos de KIR inibidores diferentes. Em uma forma de realização, o hospedeiro mamífero é um animal transgênico capaz de produzir anticorpos humanos. Opcionalmente, o dito hibridoma não produz o anticorpo monoclonal NKVSF1, nem A210, e/ou nem A802g. Em várias formas de realização, o anticorpo liga os receptores KIR2DL1 e KIR2DL2/3 ou um determinante comum presente tanto em KIR2DL1 quanto em KIR2DL2/3. O hibridoma pode produzir um anticorpo que iniba a ligação de uma molécula de alelo HLA-C tendo um resíduo Lys na posição 80 para um receptor de KIR2DL1 humano e a ligação de uma molécula de alelo HLA-C tendo um resíduo Asn na posição 80 para receptores KIR2DL2/3 humanos. Por exemplo, o hibridoma pode produzir um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal 1-7F9 ou 1-4F1 on KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 ou tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3.
[00185] A invenção também fornece métodos de produzir um anticorpo que reage cruzados com produtos de gene de KIR2DL múltiplos e que reduz ou neutraliza a atividade inibidora de tais KIRs, o dito método compreendendo as etapas de: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunógeno que compreende um polipeptídeo de KIR2DL; (b) preparar anticorpos a partir do dito mamífero imunizado, em que os ditos anticorpos ligam o dito polipeptídeo KIR2DL, (c) selecionar anticorpos de (b) que reagem cruzado com pelo menos dois produtos de gene de KIR2DL diferentes, e (d) selecionar anticorpos de (c) que potenciem células NK. Em uma forma de realização, o dito mamífero não humano é um animal transgênico engendrado para expressar um repertório de anticorpo humano (por exemplo, um mamífero não humano que compreende locais de imunoglobulina humana e deleções de gene da imunoglobulina nativa, tal como um Xenomouse® (Abgenix - Fremont, CA, USA) ou mamífero não humano que compreende um minilocal de genes que codificam a Ig humana, tais como o HuMabmouse® (Medarex - Princeton, NJ, USA)). Opcionalmente, as etapas a e b podem ser substituídas pelos métodos alternativos para obter mAbs anti-KIR, incluindo, sem limitação, o uso de demonstração de fago ou transdução viral de células B humanas ou outros métodos conhecidos na técnica. Opcionalmente, o método compreende ainda selecionar um anticorpo que se liga a KIR em um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, célula NK ou polipeptídeo de KIR. Opcionalmente, a invenção compreende ainda um método de avaliar um anticorpo anti-KIR, em que um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, preferivelmente em que o macaco é observado quanto a presença ou ausência de uma indicação de toxicidade do anticorpo.
[00186] A invenção também fornece um método de produzir um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade (ou potenciar a citotoxicidade de NK) por uma população de células NK que expresse os pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, o método compreendendo as etapas de: a) imunizar um mamífero não humano com um imunógeno que compreende um polipeptídeo de KIR inibidor; b) preparar anticorpos do animal imunizado, em que os anticorpos ligam o polipeptídeo KIR, c) selecionar anticorpos de (b) que reagem cruzado com pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, e d) selecionar anticorpos de (c) que sejam capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em uma população de células NK que expressam o pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que a ordem das etapas (c) e (d) é opcionalmente invertida e qualquer número das etapas são opcionalmente repetidas 1 ou mais vezes. O polipeptídeo inibidor de KIR usado para a imunização, em uma forma de realização, pode ser um ou mais polipeptídeos de KIR2DL e os anticorpos selecionados na etapa (c) reagem cruzado com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Preferivelmente o anticorpo reconhece um determinante comum presente em pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR diferentes; mais preferivelmente os KIRs são KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Em uma forma de realização, a etapa (c) compreende selecionar anticorpos que reajam com pelo menos um produtos de gene de receptor de KIR2DL e um KIR3DL. Por exemplo, o anticorpo selecionado pode reagir com KIR2DL1 e KIR2DL2/3 assim como KIR3DL1 e/ou KIR3DL2. Opcionalmente, o método compreende ainda selecionar um anticorpo que liga uma célula NK ou polipeptídeo de KIR de primata, preferivelmente de um macaco cinomolgo. Opcionalmente, a invenção compreende ainda um método de avaliar um anticorpo, em que um anticorpo produzido de acordo com o método acima é administrado a um primata, preferivelmente um macaco cinomolgo, preferivelmente em que o macaco é observado quanto a presença ou ausência de uma indicação de toxicidade do anticorpo.
[00187] Opcionalmente, nos métodos descritos acima, o anticorpo selecionado na etapa c) ou d) não é NKVSF1, nem A210, e/ou nem A802g. Preferivelmente, o anticorpo preparado na etapa (b) nos métodos acima é um anticorpo monoclonal. Preferivelmente o anticorpo selecionado na etapa (c) nos métodos acima inibe a ligação de um ou mais alotipos HLA-C tendo um resíduo de Lys na posição 80 para um receptor KIR2DL1 humano e a ligação de um ou mais alotipos HLA-C tendo um resíduo Asn na posição 80 para receptores KIR2DL2/3 humanos. Preferivelmente, os anticorpos selecionados na etapa (d) nos métodos acima causam uma potenciação na citotoxicidade de NK ou uma neutralização da inibição mediada por KIR da citotoxicidade de NK. Preferivelmente, o anticorpo liga-se substancialmente ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal 1-7F9 no KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Opcionalmente os métodos também ou alternativamente compreendem a etapa adicional de fabricar fragmentos dos anticorpos monoclonais selecionados, fabricando derivados dos anticorpos monoclonais selecionados (por exemplo, pela conjugação com um radionuclídeo, agente citotóxico, molécula repórter ou semelhante) ou fabricando derivados de fragmentos de anticorpo produzidos a partir de ou que compreenda as seqüências que correspondem às seqüências de tais anticorpos monoclonais. Em um outro aspecto, uma variante de um tal anticorpo pode ser produzida preparando-se um anticorpo que compreenda uma seqüência de aminoácido variante do anticorpo obtido pelos métodos descritos acima pelo uso de métodos de engenharia genética conhecidos (por exemplo, uma seqüência que é modificada de modo a mudar as propriedades de ligação do anticorpo, aumenta ou diminui a estabilidade do anticorpo, realça a purificação do anticorpo, realça a detecção do anticorpo, e/ou muda as propriedades imunológicas do anticorpo com respeito a um hospedeiro ao qual o mesmo deva ser administrado).
[00188] A invenção fornece ainda um método de produzir um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em (ou potenciar a citotoxicidade de NK por) uma população de células NK que expressam pelo menos um dos produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, o método compreendendo as etapas de: (a) selecionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo que reajam cruzados com pelo menos dois produtos de gene do receptor de KIR2DL inibidor humano diferentes, e (b) selecionar um anticorpo de (a) que seja capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em uma população de células NK que expressem os pelo menos dois produtos de gene do receptor de KIR2DL inibidor humano diferentes. Preferivelmente o anticorpo liga um determinante comum presente em KIR2DL1 e KIR2DL2/3. Opcionalmente, o anticorpo selecionado na etapa (b) não é NKVSF1. Preferivelmente, o anticorpo selecionado na etapa (b) inibe a ligação de uma molécula do alelo HLA-c tendo um resíduo Lys na posição 80 para um receptor de KIR2DL1 humano e a ligação de uma molécula do alelo HLA-C tendo um resíduo Asn na posição 80 para receptores KIR2DL2/3 humanos. Preferivelmente, o anticorpo selecionado na etapa (b) causa uma potenciação na citotoxicidade de NK. Preferivelmente, o anticorpo liga-se substancialmente ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal 17F9 em KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3. Alternativamente, o anticorpo liga substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal 1-4F1. Opcionalmente o método compreende a etapa adicional de fabricar fragmentos dos anticorpos monoclonais selecionados, fabricar derivados dos anticorpos monoclonais selecionados ou fabricar derivados de fragmentos de anticorpo monoclonal selecionados.
[00189] Adicionalmente, a invenção fornece um método de produzir um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em uma população de células NK que expressa pelo menos um dos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, o método compreendendo as etapas de: a) cultivar um hibridoma da invenção sob condições permissivas quanto a produção do anticorpo monoclonal; e b) separar o anticorpo monoclonal das células de hibridoma. Opcionalmente o método compreende a etapa adicional de fabricar fragmentos do anticorpo monoclonal, fabricar derivados do anticorpo monoclonal ou fabricar derivados de tais fragmentos de anticorpo monoclonal. Preferivelmente o anticorpo liga um determinante comum presente em KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[00190] Também é fornecido pela presente invenção um método de produzir um anticorpo que se liga a pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK em uma população de células NK que expressa pelo menos um dos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, o método compreendendo as etapas de: a) isolar de um hibridoma da invenção um ácido nucléico que codifique o anticorpo monoclonal; b) opcionalmente modificar o ácido nucléico de modo a obter um ácido nucléico modificado que compreenda uma seqüência que codifique um anticorpo modificado ou derivatizado que compreenda uma seqüência de aminoácido que corresponda a uma seqüência funcional do anticorpo monoclonal ou seja substancialmente similar a esta (por exemplo, seja pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % (tal como cerca de 70 a 99 %) idêntica a uma tal seqüência) selecionada de um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um fragmento imunorreativo de um anticorpo ou uma proteína de fusão que compreenda um tal fragmento imunorreativo; c) inserir o ácido nucléico ou ácido nucléico modificado (ou ácido nucléico relacionado que codifique a mesma seqüência de aminoácido) em um vetor de expressão, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo codificados sejam capazes de serem expressados quando o vetor de expressão está presente em uma célula hospedeiro cultivada sob condições apropriadas; d) transfectar uma célula hospedeira com o vetor de expressão, em que a célula hospedeira de outro modo não produz proteína de imunoglobulina; e) cultivar a célula hospedeira transfectada sob condições que causem a expressão do anticorpo ou fragmento de anticorpo; e f) isolar o anticorpo ou fragmento de anticorpo produzidos pela célula hospedeira transfectada. Preferivelmente o anticorpo liga-se a um determinante comum presente em KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[00191] Triagem e Seleção de Anticorpo
[00192] Os anticorpos particulares desta invenção são capazes de reduzir ou neutralizar a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade da célula NK; particularmente a inibição mediada pelos receptores de KIR2DL e mais particularmente pelo menos a inibição mediada tanto por KIR2DL1 quanto por KIR2DL2/3. Estes anticorpos são assim anticorpos “neutralizadores”, “bloqueadores” ou “inibidores”, no sentido de que eles reduzem, neutralizam e/ou bloqueiam, pelo menos parcial e detectavelmente, o caminho de sinalização inibidor mediado pelos receptores de KIR quando estes interagem com moléculas classe I de MHC. Mais importantemente, esta atividade de neutralização é demonstrada com respeito aos diversos tipos de receptores de KIR inibidores, preferivelmente diversos produtos de gene de KIR2DL receptor e mais preferivelmente pelo menos tanto KIR2DL1 quanto KIR2DL2/3 de modo que estes anticorpos podem ser usados na maior parte ou todos pacientes humanos com alta eficácia. A neutralização da inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK pode ser avaliada pelos vários ensaios ou testes, tais como os ensaios de citotoxicidade celular in vitro padrão, como aqui descritos.
[00193] Uma vez que um anticorpo que reage cruzado com receptores de KIR inibidor múltiplos é identificado este pode ser testado quanto a sua capacidade para reduzir ou neutralizar o efeito inibidor daqueles receptores de KIR em células NK intactas. Em uma variante específica, a atividade neutralizadora pode ser ilustrada pela capacidade do dito anticorpo para reconstituir a lise pelas células NK que expressam KIR2DL de alvos que expressam HLA-C. Em uma outra forma de realização específica, a atividade neutralizadora do anticorpo é definida pela capacidade do anticorpo para bloquear ou reduzir a ligação de moléculas HLA-C para receptores KIR2DL1 e KIR2DL3 (ou o KIR2DL2 intimamente relacionado), mais preferivelmente como é a capacidade do anticorpo para alterar a ligação de KIR2DL2/3 a uma molécula de HLA-C selecionada de Cwt, Cw3, Cw7 e Cw8 (ou de uma outra molécula de HLA-C tendo um resíduo Asn na posição 80), e/ou a ligação de KIR2DL1 a uma molécula de HLA-C selecionada de Cw2, Cw4, Cw5 e Cw6 (ou de uma outra molécula de HLA-C tendo um resíduo Lys na posição 80).
[00194] Em uma outra variante, a atividade neutralizadora de um anticorpo desta invenção pode ser avaliada em um ensaio de citotoxicidade com base em célula, como divulgado nos Exemplos aqui fornecidos.
[00195] Em uma outra variante, a atividade neutralizadora de um anticorpo desta invenção pode ser avaliada em um ensaio de liberação de citocina, em que as células NK são incubadas com o anticorpo de teste e uma linhagem de célula alvo que expressa um alelo de HLA-C reconhecido por uma molécula KIR da população de NK, para estimular a produção de citocina de célula NK (por exemplo produção de IFN-Y e/ou GM-CSF). Em um protocolo exemplar, a produção de IFN-Y a partir de PBMC é avaliada pelo manchamento da superfície celular e intracitoplasmático e análise pela citometria de fluxo depois de cerca de 4 dias em cultura. Em resumo, Brefeldin A (Sigma Aldrich) pode ser adicionado em uma concentração final de cerca de 5 μ g/ml por no mínimo cerca de 4 horas de cultura. As células pode ser depois incubadas com mAb anti-CD3 e anti-CD56 antes da permeabilização (IntraPrep®; Beckman Coulter) e manchamento com PE-anti-IFN-Y ou PE-IgG1 (Pharmingen). Produção de GM-CSF e IFN a partir de células NK ativadas policlonais pode ser medida em sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-Y: OptE1A set, Pharmingen).
[00196] Os anticorpos desta invenção podem neutralizar parcialmente (isto é, reduzir) ou totalmente a inibição mediada pelo KIR da citotoxicidade da célula NK. Por exemplo, os anticorpos preferidos desta invenção são capazes de induzir ou aumentar a lise de populações de célula alvo emparelhadas com HLA ou compatíveis com HLA ou autólogas, isto é, populações de célula que não seriam eficazmente lisadas pelas células NK na ausência do dito anticorpo. Consequentemente, os anticorpos desta invenção também podem ser definidos como facilitadores da atividade da célula NK in vivo, e/ou in vitro.
[00197] Em uma forma de realização específica, o anticorpo liga substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal DF200 (produzido pelo hibridoma DF200), 1-7F9 ou 1-4F1. Tais anticorpos podem ser aludidos aqui como “anticorpos equivalentes a DF200”, “anticorpos equivalentes a 1-7F9” e “anticorpos equivalentes a 1-4F1”, respectivamente. em uma outra forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Mais preferido, os “anticorpos equivalentes a DF200” desta invenção são anticorpos outros que não o anticorpo monoclonal NKVSF1. Mais preferido é anticorpo monoclonal 1-7F9 ou 1-4F1 e anticorpos que compreendam as regiões VH e/ou VL de 1-7F9 ou 1-4F1.
[00198] A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam substancial ou essencialmente ao mesmo epítopo como os anticorpos monoclonais aqui descritos pode ser facilmente determinada usando qualquer de uma variedade de ensaios de triagem imunológica em que a competição de anticorpo pode ser avaliada. Vários de tais ensaios são rotineiramente praticados e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Patente US 5.660.827, concedida em 26 de agosto de 1997, que é especificamente aqui incorporada por referência). Será entendido que de fato determinar o epítopo ao qual um anticorpo aqui descrito se liga não é de nenhum modo requerido identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal aqui descrito.
[00199] Por exemplo, onde os anticorpos de teste a serem examinados são obtidos de animais de fonte diferente ou são ainda de um isotipo Ig diferente, um ensaio de competição simples pode ser utilizado em que o anticorpo de controle (DF200, por exemplo) é misturado com o anticorpo de teste e depois aplicado a uma amostra contendo cada um ou ambos de KIR2DL1 e/ou KIR2DL2/3, cada um dos quais é conhecido estar ligado por DF200. Os protocolos com base em ELISAs, radioimunoensaios, Western Blotting e o uso de análise BIACORE (como descrito, por exemplo, na seção de Exemplos aqui) são adequadas para o uso em tais estudos de competição simples.
[00200] Em certas formas de realização, poder-se-ia pré misturar o anticorpo de controle (1-7F9 ou 1-4F1, por exemplo) com quantidades variáveis do anticorpo de teste (por exemplo, em relações de cerca de 1:1, 1:2, 1:10 ou de cerca de 1:100) por um período de tempo antes de aplicar à amostra de antígeno de KIR. Em outras formas de realização, as quantidades de controle e variáveis de anticorpo de teste podem ser simplesmente adicionados separadamente e misturados durante a exposição à amostra de antígeno de KIR. Contanto que se possa distinguir anticorpos ligados de livres (por exemplo, usando-se técnicas de separação ou lavagem para eliminar anticorpos não ligados) e anticorpo de controle do anticorpo de teste (por exemplo, usando-se anticorpos secundários específicos de espécies ou específicos de isótipo ou rotulando-se especificamente o anticorpo de controle com um rótulo detectável) uma pessoa será capaz de determinar se o anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle aos antígenos de KIR2DL diferentes, indicando que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo como 1-7F9. A ligação do anticorpo de controle (rotulado) na presença de um anticorpo completamente irrelevante (que não liga KIR) pode servir como o valor alto de controle. O valor baixo de controle pode ser obtido pela incubação do anticorpo de controle rotulado com o mesmo anticorpo de controle porém não rotulado, onde a competição ocorreria e reduziria a ligação do anticorpo rotulado. Em um ensaio de teste, uma redução significante na reatividade do anticorpo rotulado na presença de um anticorpo de teste é indicativo de um anticorpo de teste que reconhece substancialmente o mesmo epítopo, isto é, um que compete com o anticorpo de controle rotulado. Por exemplo, qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação de 1-7F9 ou 1-4F1 a ambos dos antígenos de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em pelo menos cerca de 50 %, tal como pelo menos cerca de 60 % ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 % (por exemplo, de cerca de 65 a 100 %), em qualquer relação de 1-7F9:anticorpo de teste ou 1-4F1:anticorpo de teste entre cerca de 1:1 ou 1:10 e cerca de 1:100 é considerado ser um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como 1-7F9 ou 1- 4F1, respectivamente. Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação de 1- 7F9 a pelo menos um outro, preferivelmente a cada um dos antígenos KIR2DL preferivelmente em pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 80 % ou pelo menos cerca de 90 % (por exemplo, em cerca de 95 %) da ligação de 1-7F9 ou 1-4F1 observada na ausência do anticorpo de teste. Naturalmente, tais métodos podem ser adaptados para identificar e/ou avaliar anticorpos que competem com outros anticorpos e/ou antígenos de KIR.
[00201] A competição também ou alternativamente pode ser avaliada, por exemplo, por um teste de citometria de fluxo. Em um tal teste, as células que portam um dado KIR podem ser incubadas primeiro com um anticorpo de controle (1-7F9 ou 1-4F1, por exemplo) e depois com o anticorpo de teste rotulado com um fluorocromo ou biotina. O anticorpo é dito competir com anticorpo de controle se a ligação obtida na pré incubação com quantidade saturante de anticorpo de controle for de cerca de 80 %, preferivelmente de cerca de 50 %, de cerca de 40 % ou menos (por exemplo, de cerca de 30 %) da ligação (como medida pela média de fluorescência) obtida pelo anticorpo de teste sem a pré incubação com anticorpo de controle. Alternativamente, um anticorpo é dito competir com o anticorpo de controle se a ligação obtida com um anticorpo de controle rotulado (por um fluorocromo ou biotina) nas células preincubadas com quantidade saturante de anticorpo de teste for de cerca de 80 %, preferivelmente de cerca de 50 %, de cerca de 40 % ou menos (por exemplo, de cerca de 30 %) da ligação obtida sem a pré incubação com o anticorpo de teste.
[00202] Um ensaio de competição simples em que um anticorpo de teste é pré adsorvido e aplicado na concentração de saturação a uma superfície sobre a qual KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 ou ambos, são imobilizados também pode ser vantajosamente utilizado. A superfície no ensaio de competição simples é preferivelmente um chip BIACORE (ou outros meios adequados para a análise de ressonância de plasma de superfície). A ligação de um anticorpo de controle (por exemplo, 1-7F9 ou 1-4F1) à superfície revestida com KIR é medida. Esta ligação à superfície contendo KIR do anticorpo de controle sozinho é comparada com a ligação do anticorpo de controle na presença de um anticorpo de teste. Uma redução significante na ligação à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 pelo anticorpo de controle na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo de controle tal que o anticorpo de teste “compete” com o anticorpo de controle. Qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação de anticorpo de controle (tal como 1-7F9 ou 1-4F1) a ambos dos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 em pelo menos cerca de 20 % ou mais, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 70 % ou mais, pode ser considerado ser um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como o anticorpo de controle (por exemplo, 1-7F9 ou 1-4F1). Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação do anticorpo de controle (por exemplo, 1-7F9 ou 1-4F1) a cada um dos antígenos de KIR2DL em pelo menos cerca de 50 % (por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 % ou mais). Será avaliado que a ordem de anticorpos de controle e de teste pode ser invertida; isto é o anticorpo de controle pode ser primeiro ligado à superfície e depois o anticorpo de teste é levado depois disso em contato com a superfície em um ensaio de competição. Preferivelmente, o anticorpo tendo afinidade mais alta quanto aos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL2/3 é ligado à superfície contendo KIR2DL1 e KIR2DL2/3 primeiro, visto que será esperado que a diminuição na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos serão competitivos) será de maior magnitude. Outros exemplos de tais ensaios são fornecidos nos Exemplos aqui e por exemplo, em Saunal e Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, a divulgação dos quais é aqui incorporada por referência.
[00203] Embora descritos no contexto de 1-7F9 ou 1-4F1 para os propósitos de exemplificação, será avaliado que os ensaios de triagem descritos acima também podem ser usados para identificar anticorpos que competem com um ou mais de NKVSF1, DF200, EB6, GL183 e outros anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo de acordo com a invenção.
[00204] Na imunização e produção de anticorpos em um vertebrado ou célula, as etapas de seleção particulares podem ser realizadas para isolar anticorpos como reivindicados. A este respeito, em uma forma de realização específica, a invenção também diz respeito a métodos de produzir tais anticorpos, que compreende: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunógeno que compreende um polipeptídeo de KIR inibidor; (b) preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado, em que os ditos anticorpos ligam o dito polipeptídeo de KIR, (c) selecionar anticorpos de (b) que reajam cruzado com pelo menos dois produtos de gene de KIR inibidor diferentes, e (d) selecionar anticorpos de (c) que são capazes de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK on uma população de células NK que expressa pelo menos um dos ditos dois produtos de gene do receptor de KIR inibidor humanos diferentes.
[00205] Em certas formas de realização, uma etapa adicional é realizada entre as etapas (c) e (d) acima, para selecionar mAbs anti-KIR que não reagem com KIR2DS4.
[00206] A seleção de um anticorpo que reage cruzados com pelo menos dois produtos de gene de KIR inibidor diferentes podem ser obtidos triando-se o anticorpo contra dois ou mais antígenos de KIR inibidor diferentes. Em uma forma de realização mais preferida, os anticorpos preparados na etapa (b) são anticorpos monoclonais. Assim, o termo “preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado,” como aqui usado, inclui obter células B a partir de um animal imunizado e usar estas células B para produzir um hibridoma que expresse anticorpos, assim como obter anticorpos diretamente do soro de um animal imunizado. Em uma outra forma de realização preferida, os anticorpos selecionados na etapa (c) são aqueles que reagem cruzado com pelo menos KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[00207] Já em uma outra forma de realização preferida, os anticorpos selecionados na etapa (d) causam lise pelo menos cerca de 10 % mais específica mediada pelas células NK que demonstram pelo menos um KIR reconhecido pelo anticorpo e preferivelmente lise pelo menos cerca de 40 % mais específica, lise específica pelo menos cerca de 50 % mais alta ou mais preferivelmente lise específica pelo menos cerca de 70 % aumentada (por exemplo, lise específica de cerca de 60 a 100 % aumentada), como medida em um ensaio de liberação de cromo padrão contra uma célula alvo que expressa molécula de HLA classe I cognata, comparada com a lise específica na ausência de um mAb anti-KIR. Alternativamente, os anticorpos selecionados na etapa (d) quando usados em um ensaio de liberação de cromo utilizando um clone de célula NK que expressa um ou diversos KIRs inibidores e uma célula alvo que expressa pelo menos um alelo HLA que é reconhecido por um dos KIRs no clone NK, o nível de citotoxicidade obtido com o anticorpo deve ser de pelo menos cerca de 20 %, preferivelmente pelo menos cerca de 30 % ou mais da citotoxicidade específica obtida com a mesma concentração de DF200 ou com um anticorpo anti-MHC classe I bloqueador, na mesma razão célula efetora:alvo.
[00208] A ordem das etapas (c) e (d) do método descrito imediatamente acima pode ser mudada. Opcionalmente, o método também ou alternativamente pode compreender ainda etapas adicionais de fabricar fragmentos do anticorpo monoclonal ou derivados do anticorpo monoclonal ou fragmentos, por exemplo, tais como descritos aqui em outro lugar.
[00209] Em uma outra variante, a invenção fornece um método para a obtenção de um anticorpo que compreende: (a) selecionar, a partir de uma biblioteca ou repertório, um anticorpo monoclonal, um fragmento de um anticorpo monoclonal ou um derivado de cada um destes que reagem cruzado com pelo menos dois produtos de gene do receptor de KIR2DL inibidor humano diferentes, e (b) selecionar um anticorpo, fragmento ou derivado de (a) que seja capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK on uma população de células NK que expresse o dito pelo menos dois produtos de gene do receptor de KIR2DL inibidor humano diferentes.
[00210] O repertório pode ser qualquer repertório (recombinante) de anticorpos ou fragmentos destes, opcionalmente demonstrados por qualquer estrutura adequada (por exemplo, fago, bactérias, complexo sintético, etc.). A seleção de anticorpos inibidores pode ser realizada como divulgada acima e ainda ilustrada nos exemplos.
[00211] A modelagem computador dos domínios extra-celulares de KIR2DL1, -2 e -3 (KIR2DL13), com base nas suas estruturas cristalinas publicadas (Maenaka et al. Structure with Folding and design 1999; 7: 391-398; Fan et al., Nature immunology 2001; 2: 452-460; Boyington et al. Nature, 2000; 405: 537-543), revelou o envolvimento de certas regiões ou KIR2DL1, -2 e -3 na interação entre estes KIR e os anticorpos monoclonais DF200 de murino reativos cruzados anti-KIR2DL e NKVSF1. Assim, em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos que exclusivamente ligam o KIR2DL1 dentro de uma região definida pelos resíduos de aminoácido (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181 e 192). Em uma outra forma de realização a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1 e KIR2DL2/3 sem interagir com resíduos de aminoácido fora da região definida pelos resíduos (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181 e 192).
[00212] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1 e que não se liga a um mutante de KIR2DL1 em que R131 (isto é, o resíduo Arg na posição 131 do mutante de KIR2DL1) é (isto é, é substituído com) um resíduo Ala.
[00213] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1 e que não se ligam a um mutante de KIR2DL1 em que R157 é Ala.
[00214] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1 e que não se liga a um mutante de KIR2DL1 em que R158 é Ala.
[00215] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam aos resíduos 131, 157 e 158 de KIR2DL1.
[00216] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DS3(R131W), mas não ao KIR2DS3 do tipo selvagem.
[00217] Em uma forma de realização particular, os anticorpos exclusivamente se ligam ao KIR2DL1 dentro de uma região definida pelos resíduos de aminoácido L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88 (em que as letras designam aminoácidos no código de letra única e o número está na posição daquele resíduo em KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23), usando o sistema de numeração descrito em Wagtmann et al., Immunity 1995; 2: 439-449). Estes resíduos foram identificados como o epítopo KIR2DL1 de 1-7F9 (ver o Exemplo 11).
[00218] Em uma outra forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo antigênico em uma seqüência de KIR2DL1 consistindo do fragmento L38 a Y88 da SEQ ID NO: 23. Já em uma outra forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo antigênico em uma seqüência de KIR2DL1 que compreende o fragmento L38 a Y88 da SEQ ID NO: 23.
[00219] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1 e KIR2DL2/3 sem interagir com os resíduos de aminoácido fora da região definida pelos resíduos L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88.
[00220] Em uma outra forma de realização, os anticorpos ligam o KIR2DL1 dentro de uma região que compreende pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais dos resíduos de aminoácido L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88. Em uma forma de realização particular, o epítopo de KIR2DL1 para os anticorpos compreende os resíduos de aminoácido M44 e F45 (ver os Exemplos 9 e 11).
[00221] Em uma outra forma de realização, os anticorpos se ligam ao KIR2DL1 dentro de uma região que compreende pelo menos 1, 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 ou todos os resíduos de aminoácido L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88. Em uma forma de realização particular, a região compreende resíduos de aminoácido M44 e F45 e opcionalmente pelo menos 1, 2, 4, 6, 8, 10 ou todos de L38, R41, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88 (ver os Exemplos 9 e 11). Em uma outra forma de realização particular, a região compreende pelo menos os resíduos de aminoácido M44, F45 e D72, que estão na região KIR2DL1 onde o epítopo 1-7F9 e a sobreposição dos sítios de ligação HLA-C.
[00222] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam ao KIR2DL1, KIR2DL2/3 e KIR2DS4.
[00223] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam tanto a KIR2DL1 quanto a KIR2DL2/3, mas não a KIR2DS4.
[00224] Em uma outra forma de realização, a invenção fornece anticorpos que se ligam tanto a KIR2DL1 quanto a KIR2DL2/3, mas não a KIR2DS3 ou a KIR2DS4.
[00225] A determinação de se um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo se liga dentro de uma das regiões de epítopo definidas acima pode ser realizada em modos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Ver, por exemplo, os Exemplos 9 e 11. Em um outro exemplo de tais métodos de mapeação/caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti-KIR pode ser determinada pela “pegada” do epítopo usando a modificação química das aminas/ carboxilas expostas na proteína KIR2DL1 ou KIR2DL2/3. Um exemplo específico de uma tal técnica de pegada é o uso de HXMS (troca de hidrogênio- deutério detectada pela espectrometria de massa) em que uma troca de hidrogênio/deutério de prótons da amida da proteína receptora e de ligando, ligação e retro troca ocorrem, em que os grupos amida da cadeia principal que participa na ligação da proteína são protegidos da retro troca e portanto permanecerão deuter- ados. As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, separação pela cromatografia líquida de alto desempenho de microfuro rápido, e/ou espectrometria de massa pela ionização de eletropulverização. Ver, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) e/ou Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Um outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é o mapeamento de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), onde tipicamente a posição dos sinais em espectros de RMN bidimensional do antígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, são comparados. O antígeno tipicamente é de modo seletivo isotopicamente rotulado com 15N de modo que apenas sinais que correspondem ao antígeno e nenhum sinal do peptídeo de ligação de antígeno são observados no espectro de RMN. Os sinais de antígeno que se originam dos aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígeno tipicamente mudará a posição nos espectros do complexo comparado com os espectros do antígeno livre e dos aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados desta maneira. Ver, por exemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods. Jun 1996; 9(3): 516-24.
[00226] O mapeamento/caracterização de epítopo também podem ser realizados usando métodos de espectrometria de massa. Ver, por exemplo, Downward, J Mass Spectrom. Abril de 2000; 35(4): 493-503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1 de Maio de 1999; 71(9): 1792-801.
[00227] As técnicas de digestão da protease também podem ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/seqüências relevantes determinantes antigênicas podem ser determinadas pela digestão com protease, por exemplo usando-se tripsina em uma relação de cerca de 1:50 para KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 o/n digestão a 37°C e pH 7 a 8, seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação de peptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelo anticorpo anti-KIR pode ser subseqüentemente identificado pela comparação de amostras submetidas à digestão com tripsina e as amostras incubadas com anticorpo e depois submetidas à digestão por exemplo pela tripsina (revelando deste modo uma pegada para o anticorpo). Outras enzimas como a quimiotripsina, pepsina, etc., também ou alternativamente podem ser usadas em um método de caracterização de epítopo similar. Além disso, a digestão enzimática pode fornecer um método rápido para analisar se uma seqüência determinante antigênica potencial está dentro de uma região do KIR2DL1 no contexto de um polipeptídeo de ligação de KIR. Se o polipeptídeo não é exposto na superfície, é mais provavelmente não relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade. Ver, por exemplo, Manca, Ann 1st Super Sanita. 1991; 27(1): 15-9 para um debate de técnicas similares.
[00228] A mutagênese direcionada ao sítio é uma outra técnica útil para a elucidação de um epítopo de ligação. Por exemplo, no “escaneamento de alanina”, cada resíduo dentro de um segmento de proteína é recolocado com um resíduo de alanina e as conseqüências para a afinidade de ligação medidas. Se a mutação leva a uma redução significante na afinidade de ligação, está mais provavelmente envolvido na ligação. Anticorpos monoclonais específicos para epítopos estruturais (isto é, anticorpos que não se ligam à proteína desdobrada) podem ser usados para verificar que a substituição de alanina não influencia a dobra global da proteína. Ver, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383-386; e Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1-6.
[00229] A microscopia eletrônica também pode ser usada para a “pegada” de epítopo. Por exemplo, Wang et al., Nature 1992; 355: 275-278 usaram a aplicação coordenada de microscopia de crioelétron, reconstrução da imagem tridimensional e cristalografia de raio X para determinar a área de cobertura física de um fragmento Fab na superfície capsídica do vírus mosaico de ervilha de vaca nativa.
[00230] Outras formas de ensaio “isento de rótulo” para a avaliação de epítopo incluem ressonância de plasma de superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência reflectométrica (RifS). Ver, por exemplo, Fgerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646: 159168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17: 937-944.
[00231] Fragmentos e Derivados de Anticorpos
[00232] Os fragmentos e derivados de anticorpos desta invenção (que são abrangidos pelos termos “anticorpo” e “anticorpos” como usados neste pedido, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto), preferivelmente um anticorpo equivalente a 1-7F9 ou 1-4F1, pode ser produzido pelas técnicas que são conhecidas no ramo. “Fragmentos imunorreativos” compreendem uma porção do anticorpo intacto, no geral o sítio de ligação de antígeno ou região variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem “corpos capa” (ver, por exemplo, Ill et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)) e “janusins” (descritos ainda aqui em outro lugar). Fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab)2, F(ab’)2, dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); consistindo essencialmente de um domínio VH), Fd (consistindo essencialmente dos domínios VH e CH1) e Fv (consistindo essencialmente dos domínios VL e VH); diacorpos; corpos capa; e janusins. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo incluem um polipeptídeo tendo uma estrutura primária consistindo de uma seqüência ininterrupta de resíduos de aminoácido contíguos (aludidos aqui como um “fragmento de anticorpo de cadeia única” ou “polipeptídeo de cadeia única”), incluindo sem limitação (1) moléculas Fv de cadeia única (scFv) (2) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável de cadeia leve ou um fragmento deste que contenha as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem uma porção de cadeia pesada associada e (3) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada ou um fragmento deste contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, os fragmentos Fab ou F(ab’)2 podem ser produzidos pela digestão da protease dos anticorpos isolados, de acordo com técnicas convencionais.
[00233] Será avaliado que fragmentos imunorreativos podem ser modificados usando métodos conhecidos, por exemplo para diminuir a depuração in vivo e obter um perfil farmacocinético mais desejável. Por exemplo, o fragmento pode ser modificado com polietileno glicol (PEG) ou polióis polioxietilados. Os métodos para ligar e conjugar especificamente ao sítio PEG a um fragmento Fab’ são descritos, por exemplo, em Leong et al, Cytokine 16(3): 106-119 (2001) e Delgado et al, Br. J. Cancer 73(2): 175-182 (1996), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência.
[00234] Em um aspecto particular, a invenção fornece anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo que compreendem a seqüência da região variável de cadeia leve e/ou pesada de 17F9 ou 1-4F1 como apresentada na Figura 14. Em um outro aspecto, a invenção fornece anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados destes que compreendem uma ou mais CDRs da região variável de cadeia pesada de 1-7F9 ou 1-4F1 como apresentado na Fig. 15 ou descrito acima. As variantes/análogos funcionais de tais seqüências podem ser gerados fazendo-se substituições, adições, e/ou deleções adequadas nestas seqüências de aminoácido divulgadas usando técnicas padrão, que podem ser auxiliadas pela comparação das seqüências. A partir da superposição de estruturas cristalinas do complexo 1- 7F9/KIR2DL1 e o complexo KIR2DL1/MHC classe I (Fan et al., Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460), PDB-código 1 IM9, pode ser concluído que um derivado scFv de 1-7F9 será capaz de bloquear a ligação de MHC classe I ao KIR2DL1. Também a cadeia L única de 1-7F9 ou o domínio VL único de 1-7F9 sozinho, quando ligado ao KIR2DL1, pode bloquear a ligação de MHC classe I.
[00235] As variantes/análogos funcionais de tais seqüências podem ser gerados fazendo-se substituições, adições, e/ou deleções adequadas nestas seqüências de aminoácido divulgadas usando técnicas padrão, que podem ser auxiliadas pela comparação das seqüências. Em um outro aspecto, posições onde um resíduo está presente em uma seqüência de um destes anticorpos, mas não uma outra, podem ser adequadas para deleções, substituições, e/ou inserções.
[00236] Alternativamente, o DNA de um anticorpo codificador desta invenção, tal como um anticorpo equivalente a 1-7F9-ou 1-4F1, pode ser modificado de modo a codificar um fragmento desta invenção. O DNA modificado é depois inserido em um vetor de expressão e usado para transformar ou transfectar uma célula apropriada, que depois expressa o fragmento desejado, como descrito aqui em outro lugar.
[00237] Em uma forma de realização alternativa, o DNA de um hibridoma que produz um anticorpo de murino desta invenção, tal como um anticorpo equivalente a DF200, pode ser modificado antes da inserção em um vetor de expressão, por exemplo, pela substituição da seqüência codificadora para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das seqüências não humanas homólogas (como descrito por exemplo, por Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, pp. 6851 (1984)). Em uma outra forma de realização, as regiões variáveis que codificam o anticorpo desta invenção podem ser unidas, pela engenharia de DNA recombinante, à seqüência codificadora da imunoglobulina toda ou parte da seqüência codificadora para um polipeptídeo que não imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos “quiméricos” ou “híbridos” são preparados de modo que tenham a especificidade de ligação do anticorpo original. Tipicamente, tais polipeptídeos que não imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção.
[00238] Assim, de acordo com uma outra forma de realização, o anticorpo desta invenção, preferivelmente um anticorpo equivalente a DF-200 é humanizado. As formas “humanizadas” de anticorpos de acordo com esta invenção são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subseqüências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm derivado de seqüência mínima da imunoglobulina de murino. Geralmente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinadora de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos pelos resíduos de uma CDR do anticorpo original (anticorpo doador) enquanto mantendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas do anticorpo original. Em alguns casos, resíduos da matriz Fv da imunoglobulina humana podem ser substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreendem resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou na CDR importada ou seqüências de matriz. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas do anticorpo original e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes ver Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992).
[00239] Os métodos para humanizar os anticorpos desta invenção são bem conhecidos na técnica. No geral, um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos nele do anticorpo original. Estes resíduos de aminoácido de murino ou outro não humano são freqüentemente aludidos como resíduos “importados”, que são tipicamente tomados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988)). Consequentemente, tais anticorpos “humanizado” são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente a partir do anticorpo de murino original. Na prática, anticorpos humanizados de acordo com esta invenção são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos pelos resíduos de sítios análogos no anticorpo de murino original.
[00240] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizado é muito importante reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método “best-fit”, a seqüência do domínio variável de um anticorpo desta invenção é triada contra a biblioteca inteira de seqüências do domínio variável humano conhecidas. A seqüência humano que está mais próxima daquela do camundongo é depois aceita como a matriz humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901 (1987)). Um outro método usa uma matriz particular da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma matriz pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51, pp. 1993)).
[00241] É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para receptores múltiplo de KIR inibidores e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se alcançar esta meta, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parenterais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das seqüências precursoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são habitualmente disponíveis e são familiares àqueles habilitados na técnica. Programas de computador são disponíveis que ilustram e demonstram as estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas demonstrações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar o seu antígeno. Deste modo, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir de seqüências de consenso e importadas de modo que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo, seja obtida. No geral, os resíduos CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influenciação da ligação de antígeno.
[00242] Como descrito acima, um método de fabricar anticorpos monoclonais humanos é usar um XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como o camundongo usado para a imunização. Um XenoMouse é um hospedeiro murino de acordo com esta invenção que teve os seus genes da imunoglobulina substituídos pelos genes da imunoglobulina humana funcionais. Assim, os anticorpos produzidos por este camundongo ou em hibridomas fabricados a partir das células B deste camundongo, já são humanizados. O XenoMouse é descrito na Patente dos Estados Unidos No 6.162.963, que é aqui incorporada na sua totalidade por referência. Um método análogo pode ser obtido usando um HuMAb-MouseTM (Medarex).
[00243] Anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como usando-se, para imunização outros animais transgênicos que foram engendrados para expressar um repertório de anticorpo humano (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255) ou pela seleção de repertórios de anticorpo usando métodos de demonstração de fago. Tais técnicas são conhecidas pela pessoa habilitada e podem ser implementadas partindo de anticorpos monoclonais como divulgados no presente pedido.
[00244] Os anticorpos da presente invenção, preferivelmente um anticorpo equivalente a 1-7F9 ou 1-4F1, também podem ser derivatizados para anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes no anticorpo original, enquanto que o resto da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a um outro classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que estes exibam a atividade biológica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, pp. 6851 (1984)).
[00245] Outros derivados dentro do escopo desta invenção incluem anticorpos funcionalizados, isto é, anticorpos que são conjugados ou covalentemente ligados a uma toxina, tal como ricina, toxina da difteria, abrina e exotoxina de Pseudomonas ou um radionuclídeo terapêutico tal como, por exemplo, 90Y ou 131I; a uma porção detectável, tal como uma porção fluorescente, um radioisótopo de diagnóstico ou um agente de formação de imagem; ou a um suporte sólido, tal como pérolas de agarose ou semelhante. Os métodos para a conjugação ou ligação covalente destes outros agentes aos anticorpos são bem conhecidos na técnica.
[00246] A conjugação a uma toxina é útil para a morte alvejada de células NK que demonstram um dos receptores de KIR que reagem cruzado na sua superfície celular. Uma vez que o anticorpo da invenção liga-se à superfície celular de tais células, este é internalizado e a toxina é liberada dentro da célula, matando seletivamente aquela célula. Tal uso é uma forma de realização alternativa da presente invenção.
[00247] A conjugação a uma porção detectável é útil quando o anticorpo desta invenção é usado com propósitos de diagnóstico. Tais propósitos incluem, mas não são limitados a, ensaiar amostras biológicas quanto a presença das células NK que portam o KIR que reage cruzado na sua superfície celular e detectar a presença de células NK que portam o KIR que reage cruzado em um organismo vivo. Tais métodos de ensaio e detecção também são formas de realização alternativa da presente invenção.
[00248] A conjugação de um anticorpo desta invenção a um suporte sólido é útil como uma ferramenta para a purificação de afinidade de células NK que portam o KIR que reage cruzado na sua superfície celular a partir de uma fonte, tal como um fluido biológico. Este método de purificação é uma outra forma de realização alternativa da presente invenção, como o é a população purificada resultante de células NK.
[00249] COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E APLICAÇÕES
[00250] A invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo humano ou humanizado ou fragmentos e derivados destes, em que o dito anticorpo, fragmento ou derivado reagem cruzados com pelo menos dois receptores de KIR inibidores na superfície de células NK, reduzem ou neutralizam seus sinais inibidores e potenciam a atividade destas células, em qualquer veículo adequado em uma quantidade eficaz para potenciar detectavelmente a citotoxicidade da célula NK em um paciente ou em uma amostra biológica que compreenda células NK. As composições farmacêuticas que compreendem um mAb anti-KIR humano ou humanizado, opcionalmente junto com um outro agente ativo, para o uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas com carregadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis assim como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas divulgadas em Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. As composições podem aparecer em formas convencionais, por exemplo, cápsulas, tabletes, aerossóis, soluções ou suspensões ou como pó secado por congelamento.
[00251] Conseqüentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação farmacêutica que compreenda um anticorpo humano ou humanizado ou fragmentos ou derivados destes, que está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 500 mg/ml e em que a dita formulação tem um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema de tampão, preservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) queladores, estabilizadores e tensoativos. Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação que compreende água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. Como aqui usado, o termo “formulação aquosa” é uma formulação que compreende pelo menos 50 % p/p de água. Do mesmo modo, o termo “solução aquosa” é uma solução que compreende pelo menos 50 % p/p de água e o termo “suspensão aquosa” uma suspensão que compreenda pelo menos 50 % p/p de água.
[00252] Em uma outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação secada por congelamento, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.
[00253] Em uma outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação secada (por exemplo, secada por congelamento ou secada por pulverização) pronta para o uso sem qualquer dissolução anterior.
[00254] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica que compreende uma solução aquosa de um anticorpo como aqui descrito e um tampão, em que o dito o anticorpo está presente em uma concentração de 1 mg/ml ou acima e em que a dita formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.
[00255] Em uma outra forma de realização, o pH da formulação é selecionado da lista consistindo de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 e 10,0.
[00256] Em uma outra forma de realização, o tampão é selecionado do grupo que consiste de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, hidrogeno fosfato de sódio, hidrogeno fosfato de dissódio, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00257] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um preservante farmaceuticamente aceitável. Em uma outra forma de realização, o preservante é selecionado do grupo que consiste de fenol, o-cresol, m-cresol, p- cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p- hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, cloroexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p- clorfenoxipropano-1,2-diol) ou misturas destes. Em uma forma de realização, o preservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o preservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Já em uma outra forma de realização, o preservante está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Ainda em uma outra forma de realização, o preservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um dos preservantes específicos listados constitui uma forma de realização alternativa da invenção. Embora o uso de um preservante nas composições farmacêuticas seja bem conhecido pela pessoa habilitada; por conveniência, referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00258] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um agente isotônico. Em uma forma de realização, o agente isotônico é selecionado do grupo que consiste de um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar, um álcool de açúcar, um amino açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propileno glicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanodiol) e polietileno glicol (por exemplo, PEG400) ou misturas destes. Qualquer açúcar adequado pode ser usado, incluindo, mas não limitado a mono-, di- ou polissacarídeos; e glicanos solúveis em água, tais como, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietílico e carboximetil celulose-Na. Em uma forma de realização, o aditivo de açúcar é sacarose. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 tendo pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em uma forma de realização o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não existe limite fixado para a quantidade usada, contanto que o açúcar ou álcool de açúcar é solúvel na preparação líquida e não afeta adversamente os efeitos de estabilização obtidos usando os métodos da invenção. Em uma forma de realização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar está entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o agente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/m1 a 24 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um dos agentes isotônicos específicos listados acima constitui uma forma de realização alternativa da invenção. Embora o uso de um agente isotônico nas composições farmacêuticas seja bem conhecido pela pessoa habilitada; por conveniência, referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00259] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um agente de quelação. Em uma forma de realização, o agente de quelação é selecionado de sais de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e misturas destes. Em uma outra forma de realização, o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada um destes agentes de quelação específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente de quelação em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada. Por conveniência referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00260] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um estabilizador. Embora o uso de um estabilizador em composições farmacêuticas seja bem conhecido pela pessoa habilitada; por conveniência, referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00261] As composições da invenção, por exemplo, podem ser composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe a formação de agregado durante a armazenagem em formulações farmacêuticas líquidas. Por “formação de agregado” é intencionado uma interação física entre as moléculas de polipeptídeo que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis ou agregados visíveis grandes que precipitam da solução. Por “durante a armazenagem” é intencionado uma composição ou formulação farmacêutica líquidas que uma vez preparadas, não são imediatamente administradas a um paciente. Ao invés, a seguir da preparação, as mesmas são embaladas para a armazenagem, em uma forma líquida, em um estado congelado ou em uma forma seca para a reconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma adequada para a administração a um paciente. Por “forma seca” é intencionado que a composição ou formulação farmacêuticas líquidas seja seca pela secagem por congelamento (isto é, liofilização; ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secagem por pulverização (ver Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (5a ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20) ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). A formação de agregado por um polipeptídeo durante a armazenagem de uma composição farmacêutica líquida pode afetar adversamente a atividade biológica daquele polipeptídeo, que resulta na perda da eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregado pode causar outros problemas tais como bloqueio de tubulação, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica contendo polipeptídeo é administrada usando um sistema de infusão.
[00262] As composições farmacêuticas da invenção também podem compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante a armazenagem da composição. Por “base de aminoácido” é intencionado um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácido dado está presente na sua forma de base livre ou na sua forma salina. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes na sua forma de base livre, todos podem estar presentes na sua forma salina ou alguns podem estar presentes na sua forma de base livre enquanto que outros estão presentes na sua forma salina. Em uma forma de realização, aminoácidos para o uso na preparação das composições da invenção são aqueles que carregam uma cadeia lateral carregada, tal como arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, L, D ou uma mistura destes) de um aminoácido particular (por exemplo metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros, pode estar presente nas composições farmacêuticas da invenção contanto que o aminoácido particular esteja presente na sua forma de base livre ou sua forma salina. Em uma forma de realização o L-estereoisômero é usado. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos destes aminoácidos. Por “análogo de aminoácido” é intencionado um derivado do aminoácido que ocorre naturalmente que realiza o efeito desejado de diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante a armazenagem das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Os análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, os análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina e os análogos de cisteína adequados incluem S-metil-L cisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácido são incorporados nas composições na sua forma de base livre ou na sua forma salina. Em uma outra forma de realização da invenção os aminoácidos ou análogos de aminoácido são usados em uma concentração, que é suficiente para impedir ou retardar a a- gregação da proteína.
[00263] Em uma outra forma de realização, a metionina (ou outros aminoácidos ou análogos de aminoácido sulfúricos) pode ser adicionada para inibir a oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo que atua como o agente terapêutico é um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a tal oxidação. Por “inibir” é intencionado o acúmulo mínimo de espécies oxidadas de metionina com o tempo. Inibir a oxidação da metionina resulta em maior retenção do polipeptídeo na sua forma molecular apropriada. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D) ou combinações destes pode ser usado. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina tal que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável pelas agências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição não contenha mais do que cerca de 10 % a cerca de 30 % de sulfóxido de metionina. No geral, isto pode ser obtido pela adição de metionina tal que a razão de metionina adicionada aos resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como de 10:1 a cerca de 100:1.
[00264] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um estabilizador selecionado do grupo de polímeros de peso molecular alto ou compostos de peso molecular baixo. Em uma forma de realização, o estabilizador é selecionado de polietileno glicol (por exemplo PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carbóxi-/hidroxicelulose ou derivados destes (por exemplo, HPC, HPCSL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol e sais diferentes (por exemplo cloreto de sódio). Cada um destes estabilizadores específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00265] As composições farmacêuticas também podem compreender agentes estabilizadores adicionais, que realçam ainda mais a estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo nesta. Os agentes de estabilização de interesse particular para a presente invenção incluem, mas não são limitados a, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação da metionina e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra a agregação associada com o congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.
[00266] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende um tensoativo. Em uma forma de realização, o tensoativo é selecionado de um detergente, óleo de mamona etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo sorbitano, polímeros de bloco de polioxipropileno- polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros tais como Pluronic® F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X-100), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, derivados de polioxietileno e polietileno tais como derivados alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou derivados etoxilados destes, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, álcoois, glicerol, lectinas e fosfolipídeos (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos (por exemplo, ácido dipalmitoil fosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina e ésteres de 1-acil-sn- glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina ou treonina) e derivados de alquila, alcoxila (éster alquílico), alcóxi (éter alquílico) de lisofosfatidil e fosfatidil colinas, por exemplo derivados lauroíla e miristoíla de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e modificações do grupo de cabeça polar, isto é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol e o DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP positivamente carregados, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina e glic- erofosfolipídeos (por exemplo, cefalinas), gliceroglicolipídeos (por exemplo, galactopiranosídeo), esfingoglico-lipídeos (por exemplo, ceramidas, gangliosídeos), dodecilfosfocolina, lisolecitina do ovo de galinha, derivados do ácido fusídico (por exemplo tauro-diidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais destes C6-C12 (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Nα-acilados de lisina, arginina ou histidina ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados Nα-acilados de dipeptídeos que compreendem qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Nα-acilado de um tripeptídeo que compreende qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato sódico, registro CAS no [577-11-7]), docusato cálcico, registro CAS no [128-49-4]), docusato potássico, registro CAS no [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico ou derivados destes, ácidos biliares e sais destes e conjugados de glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato, tensoativos monovalentes de (alquil-aril-sulfonatos) aniônicos, tensoativos zuiteriônicos (por exemplo N-alquil-N,N-dimetilamônio-1-propanossulfonatos, 3- colamido-1-propildimetilamônio-1-propano-sulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo brometo de cetil-trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo dodecil (3-D-glicopiranosídeo), poloxaminas (por exemplo, da Tetronic), que são copolímeros de bloco tetrafuncionais derivados da adição seqüencial de óxido de propileno e óxido de etileno à etilenodiamina ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina ou misturas destes. Cada um destes tensoativos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[00267] Embora o uso de um tensoativo nas composições farmacêuticas seja bem conhecido pela pessoa habilitada; por conveniência, referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00268] Em uma outra forma de realização, a formulação também compreende inibidores da protease tais como EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) e benzamidinaHCl, embora outros inibidores de protease comercialmente disponíveis e adequados também possam ser usados. O uso de um inibidor de protease é particularmente útil em composições farmacêuticas que compreendam zimogênios de proteases de modo a inibir a autocatálise.
[00269] Outros ingredientes também podem estar presentes na formulação farmacêutica da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificadores, antioxidantes, agentes de volume, modificadores de tonicidade, agentes de quelação, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humana, gelatina ou proteínas) e um zuiteríon (por exemplo, um aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais preferivelmente não afetam adversamente a estabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.
[00270] As composições farmacêuticas contendo um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade de tal tratamento em diversos locais, por exemplo, em locais tópicos, por exemplo, pele e locais mucósicos, em locais que desviam a absorção, por exemplo, a administração em uma artéria, em uma veia, no coração e em locais que envolvem a absorção, por exemplo, a administração na pele, sob a pele, em um músculo ou no abdômen.
[00271] A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser através de diversas vias de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou uma combinação destes, epidérmico, dérmico, transdérmico, vaginal, retal, ocular, por exemplo através da conjuntiva, uretal e parenteral aos pacientes em necessidade de um tal tratamento.
[00272] As composições da invenção corrente podem ser administradas em diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsões múltiplas, espumas, pomadas, pastas, emplastros, ungüentos, tabletes, tabletes revestidos, enxágües, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gelatina mole, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, pulverizações, pó, aerossóis, inalantes, colírios, ungüentos oftálmicos, enxágües oftálmicos, pessários vaginais, anéis vaginais, ungüentos vaginais, solução de injeção, soluções de transformação in situ, por exemplo formação de gel in situ, endurecimento in situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão e implantes.
[00273] As composições da invenção pode ser ainda misturada em ou ligada a, por exemplo através de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, um carregador medicamentoso, sistema de liberação de medicamento e sistema de liberação de medicamento avançado de modo a realçar ainda mais a estabilidade do anticorpo, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a solubilidade, diminuir efeitos adversos, obter cronoterapia bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e aumentar a condescendência do paciente ou qualquer combinação destes. Os exemplos de carregadores, sistemas de liberação de medicamento e sistemas de liberação de medicamento avançados incluem, mas não são limitados a, polímeros, por exemplo celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo dextrano e derivados, amido e derivados, poli(álcool vinílico), polímeros de acrilato e metacrilato, ácidos poliláticos e poliglicólicos e copolímeros de bloco destes, polietileno glicóis, proteínas carregadoras, por exemplo albumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplo sistemas copoliméricos de bloco bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, micelas, lipossomas, microesferas, nanoparticulados, cristais líquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destes, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, auto- emulsificante, auto-microemulsificante, ciclodextrinas e derivados destes e dendrímeros.
[00274] As composições da corrente invenção são úteis na formulação de sólidos, semissólidos, pó e soluções para a administração pulmonar do anticorpo, usando, por exemplo um inalador de dose medida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00275] As composições da corrente invenção são especificamente úteis na formulação de sistemas de liberação de medicamento controlada, assistida, prolongada, retardada e de liberação lenta. Mais especificamente, mas não limitado a, as composições são úteis na formulação de sistemas de liberação controlada e liberação assistida parenteral (ambos sistemas levando a uma redução múltipla no número de administrações), bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são sistemas de liberação controlada e de liberação assistida administrados subcutaneamente. Sem limitar o escopo da invenção, os exemplos de sistemas e composições de liberação controlada úteis são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas,
[00276] Os métodos para produzir sistemas de liberação controlada úteis para as composições da corrente invenção incluem, mas não são limitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em alta pressão, encapsulação, secagem por pulverização, microencapsulação, coacervação, separação de fase, evaporação de solvente para produzir microesferas, extrusão e processos de fluido supercrítico. Referência geral é feita ao Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, Nova Iorque, 2000) e Drug and the Pharmaceutic Sciences vol. 99: Protein Formulation and Liberation (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, Nova Iorque, 2000).
[00277] A administração parenteral pode ser realizada pela injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa do tipo caneta. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma outra opção é uma composição que pode ser uma solução ou suspensão para a administração do anticorpo na forma de uma pulverização nasal ou pulmonar. Como uma outra opção, as composições farmacêuticas contendo o anticorpo da invenção também podem ser adaptadas para a administração transdérmica, por exemplo pela injeção isenta de agulha ou a partir de um emplastro, opcionalmente um emplastro iontoforético ou transmucósico, por exemplo a administração bucal.
[00278] O anticorpo pode ser administrado por intermédio da via pulmonar em um veículo, como uma solução, suspensão ou pó seco usando qualquer um de tipos conhecidos de dispositivos adequados para a liberação de medicamentosa pulmonar. Os exemplos destes compreendem, mas não são limitados aos três tipos gerais de geração de aerossol para a liberação de medicamentosa pulmonar e podem incluir nebulizadores de jato ou ultra-sônicos, inaladores de dose medida ou inaladores de pó seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug liberation: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).
[00279] Com base na metodologia de teste padronizada, o diâmetro aerodinâmico (da) de uma partícula é definida como o diâmetro equivalente geométrico de uma partícula esférica padrão de referência de densidade unitária (1 g/cm3). No caso mais simples, para partículas esféricas, da está relacionado com um diâmetro de referência (d) como uma função da raiz quadrada da razão de densidade como descrito por:
[00280] Modificações para esta relação ocorrem para partículas não esféricas (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug liberation using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Os termos “MMAD” e “MMEAD” são bem descritos e conhecidos na técnica (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R e representa uma medida do valor médio de uma distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica. Avanços recentes na liberação de medicamento pulmonar usando partículas grandes, porosas inaladas. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). O diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) e o diâmetro aerodinâmico eficaz médio de massa (MMEAD) são usados intercambiavelmente, são parâmetros estatísticos e empiricamente descrevem o tamanho de partículas de aerossol em relação ao seu potencial para depositar nos pulmões, independente da forma, tamanho ou densidades reais (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug liberation using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). MMAD é normalmente calculado a partir de medições feitas com impactadores, um instrumento que mede o comportamento inercial da partícula em ar.
[00281] Em uma outra forma de realização, a formulação pode ser aerossolizada por qualquer tecnologia de aerossolização conhecida, tal como nebulização, para se obter um MMAD de partículas de aerossol menores do que 10 μ m, mais preferivelmente entre 1 a 5 μ m e o mais preferivelmente entre 1 a 3 μ m. O tamanho de partícula preferido está fundamentado no tamanho mais eficaz para a liberação de medicamento para o pulmão profundo, onde a proteína é otimamente absorvida (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug liberation using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).
[00282] A deposição pulmonar profunda das formulações pulmonares que compreendem o anticorpo podem ser opcionalmente ainda otimizada usando-se modificações das técnicas de inalação, por exemplo, mas não limitada a: fluxo de inalação lento (por exemplo, 30 Umin), retenção da respiração e regulagem do tempo de atuação.
[00283] O termo “formulação estabilizada” refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentadas.
[00284] O termo “estabilidade física” da formulação de proteína como aqui usado refere-se à tendência da proteína para formar agregados biologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado da exposição da proteína aos estresses termo-mecânicos e/ou interação com interfaces e superfícies que são desestabilizadoras, tais como superfícies e interfaces. A estabilidade física das formulações de proteína aquosas é avaliado por meio da inspeção visual e/ou medições de turbidez depois da exposição da formulação enchida em recipientes adequados (por exemplo cartuchos ou frascos) ao estresse mecânico/ físico (por exemplo agitação) nas temperaturas diferentes por vários períodos de tempo. A inspeção visual das formulações é realizada em uma luz focalizada nítida com um fundo preto. A turbidez da formulação é caracterizada por uma contagem visual que classifica o grau de turbidez por exemplo em uma escala de 0 a 3 (uma formulação que não mostra nenhuma turbidez corresponde a uma contagem visual de 0 e uma formulação que mostra turbidez visual na luz do dia corresponde à contagem visual 3). Uma formulação é classificada fisicamente instável com respeito à agregação da proteína, quando ela mostra turbidez visual na luz do dia. Alternativamente, a turbidez da formulação pode ser avaliada pelas medições de turbidez simples bem conhecidas pela pessoa habilitada. A estabilidade física das formulações de proteína aquosas também podem ser avaliadas usando-se um agente ou sonda espectroscópica da situação conformacional da proteína. A sonda é preferivelmente uma molécula pequena que preferencialmente se liga a um confôrmero não nativo da proteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular pequena da estrutura de proteína é a Tioflavina T. A Tioflavina T é um corante fluorescente que foi amplamente usado para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas e talvez também de outras configurações de proteína, a Tioflavina T dá origem a um novo máximo de excitação em cerca de 450 nm e emissão realçada a cerca de 482 nm quando ligado a uma forma de proteína de fibrila. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.
[00285] Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas das mudanças na estrutura da proteína de estados nativos para não nativos. Por exemplo as sonda do “fragmento hidrofóbico” que se ligam preferencialmente aos fragmentos hidrofóbicos expostos de uma proteína. Os fragmentos hidrofóbicos são no geral ocultos dentro da estrutura terciária de uma proteína no seu estado nativo, mas tornam-se expostos conforme uma proteína começa a desdobrar ou desnaturar. Os exemplos destas sondas moleculares pequenas, espectroscópicas são corantes aromáticos, hidrofóbicos, tais como antraceno, acridina, fenantrolina ou semelhante. Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal-aminoácido, tais como complexos do metal cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tais como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina ou semelhante.
[00286] O termo “estabilidade química” da formulação de proteína como aqui usado refere-se a mudanças covalentes químicas na estrutura da proteína levando à formação de produtos da degradação química com potência biológica menos potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas potenciais comparada com a estrutura da proteína nativa. Vários produtos da degradação química podem ser formados dependendo do tipo e natureza da proteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. A eliminação da degradação química mais provavelmente pode não ser completamente evitada e quantidades crescentes de produtos da degradação química são freqüentemente observadas durante a armazenagem e uso da formulação de proteína como bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. A maioria das proteínas são propensas à desamidação, um processo em que o grupo amida da cadeia lateral nos resíduos de glutaminila ou asparaginila é hidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outros caminhos de degradações envolvem a formação de produtos de transformação de peso molecular alto onde duas ou mais moléculas de proteína são covalentemente ligadas entre si através da transami- dação e/ou interações de dissulfeto levando à formação de produtos de degradação de dímero, oligômero e polímero covalentemente ligados (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, Nova Iorque 1992). A oxidação (por exemplo de resíduos de metionina) pode ser mencionada como uma outra variante de degradação química. A estabilidade química da formulação de proteína pode ser avaliada medindo-se a quantidade dos produtos de degradação química em vários pontos no tempo depois da exposição a condições ambientais diferentes (a formação de produtos de degradação pode ser freqüentemente acelerada por exemplo aumentando-se a temperatura). A quantidade de cada produto de degradação individual é freqüentemente determinada pela separação dos produtos de degradação dependendo do tamanho e/ou carga da molécula usando várias técnicas cromatográficas (por exemplo SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
[00287] Por este motivo, como esboçado acima, uma “formulação estabilizada” refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e estabilidade química aumentadas. No geral, uma formulação deve ser estável durante o uso e armazenagem (conforme as condições de uso e armazenagem recomendadas) até que a data de expiração seja atingida.
[00288] Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais do que 6 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenagem.
[00289] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais do que 4 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenagem.
[00290] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais do que 4 semanas de uso e por mais do que dois anos de armazenagem.
[00291] Ainda em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais do que 2 semanas de uso e por mais do que dois anos de armazenagem.
[00292] Assim, como descrito acima, os carregadores farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem, mas não são limitados a, trocadores de íon; alumina; estearato de alumínio; lecitina; proteínas séricas tais como a albumina sérica humana; substâncias tampão tais como fosfatos e glicina; ácido sórbico; sorbato de potássio; misturas de glicerídeo parcial de ácidos graxos vegetais saturados; água; sais ou eletrólitos tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de dissódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio e sais de zinco; sílica coloidal; trissilicato de magnésio; polivinil pirrolidona; substâncias com base em celulose; polietileno glicol; carboximetilcelulose sódica; poliacrilatos; ceras; polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno; polietileno glicol; e lanolina.
[00293] As composições desta invenção podem ser utilizadas em um método de potenciar a atividade de células NK em um paciente ou uma amostra biológica. Este método compreende a etapa de contatar a dita composição com o dito paciente ou amostra biológica. Tal método será útil para propósitos tanto de diagnóstico quanto terapêuticos.
[00294] Para o uso em conjunção com uma amostra biológica, a composição de anticorpo pode ser administrada simplesmente misturando-se com ou aplicando-se diretamente à amostra, dependendo da natureza da amostra (fluida ou sólida). A amostra biológica pode ser contatada diretamente com o anticorpo em qualquer dispositivo adequado (placa, bolsa, frasco, etc.). Para o uso em conjunção com um paciente, a composição deve ser formulada para a administração ao paciente.
[00295] Como descrito acima, as composições da presente invenção podem ser administradas oral, parenteral, pela pulverização de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginalmente ou por intermédio de um reservatório implantado. O termo “parenteral” como aqui usado inclui a injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intraepática, in- tralesional e intracraniana ou técnicas de infusão. Preferivelmente, as composições são administradas oral, intraperitoneal ou intravenosamente.
[00296] As formas injetáveis estéreis das composições desta invenção podem ser aquosas ou uma suspensão oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas no ramo usando agentes de dispersão ou umectação e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos estéreis, fixos são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou di-glicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, tais como ácido oléico e seus derivados glicerídicos são úteis na preparação de injetáveis, como o são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliva ou óleo de mamona, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agentes de dispersão similares que são habitualmente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos habitualmente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes ou realçadores de biodisponibilidade que são habitualmente usados na fabricação de sólida, líquida ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para os propósitos de formulação.
[00297] As composições desta invenção podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitáveis incluindo, mas não limitado a, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. No caso de tabletes para o uso oral, carregadores habitualmente usados incluem lactose e amido de milho. Os agentes de lubrificação, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para a administração oral em uma forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para o uso oral, o ingrediente é combinado com emulsificadores e agentes de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, flavorizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[00298] Alternativamente, as composições desta invenção podem ser administradas na forma de supositórios para a administração retal. Estes podem ser preparados misturando-se o agente com um excipiente não irritante adequado que seja sólido na temperatura ambiente mas líquida na temperatura retal e portanto fundirá no reto para liberar o medicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.
[00299] As composições desta invenção também podem ser administradas topicamente, de modo especial quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis pela aplicação tópica, incluindo doenças dos olhos, da pele ou do trato intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos.
[00300] A aplicação tópica para o trato intestinal inferior pode ser afetada em uma formulação de supositório retal (ver acima) ou em uma formulação de enema adequada. Emplastros topicamente transdérmicos também podem ser usados.
[00301] Para as aplicações tópicas, as composições podem ser formuladas em um ungüento adequado contendo o componente ativo colocado em suspensão ou dissolvido em um ou mais carregadores. Carregadores para a administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificadora e água. Alternativamente, as composições podem ser formuladas em uma loção ou creme adequados contendo os componentes ativos colocados em suspensão ou dissolvidos em um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis. Os carregadores adequados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
[00302] Para o uso oftálmico, as composições podem ser formuladas como suspensões micronizadas e solução salina isotônica, ajustada no pH estéril ou, preferivelmente, como soluções em solução salina isotônica, ajustada no pH estéril, com ou sem um preservante tal como cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, para usos oftálmicos, as composições podem ser formuladas em um ungüento tal como petrolato.
[00303] As composições desta invenção também podem ser administradas pelo aerossol nasal ou inalação. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas no ramo da formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzílico ou outros preservantes adequados, promotores de absorção para realçar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos, e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão convencionais.
[00304] Diversos anticorpos monoclonais mostraram ser eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab), Herceptina (Trastuzumab) ou Xolair (Omalizumab) e regimes de administração similares (isto é, formulações e/ou doses e/ou protocolos de administração) podem ser usados com os anticorpos desta invenção. Os programas e dosagens para a administração do anticorpo nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser determinados de acordo com métodos conhecidos para estes produtos, por exemplo usando as instruções dos fabricantes. Por exemplo, um anticorpo presente em uma composição farmacêutica desta invenção pode ser fornecida em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml). O produto é formulado para a administração IV em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de citrato de sódio diidratado, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e Água Estéril para Injeção. O pH é ajustado a 6,5. Uma faixa de dosagem adequada exemplar para um anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção pode estar entre cerca de 10 mg/m2 e 500 mg/m2. Entretanto, será avaliado que estes programas são exemplares e que um programa e regime ótimos podem ser adaptados levando-se em conta a afinidade e tolerabilidade do anticorpo particular na composição farmacêutica que deve ser determinada em testes clínicos. Quantidades e programa de injeção de um anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção que satura células NK por 24 horas, 48 horas 72 horas ou uma semana ou um mês será determinado considerando a afinidade do anticorpo e seus parâmetros farmacocinéticos em mamíferos humanos e não humanos.
[00305] De acordo com uma outra forma de realização, as composições de anticorpo desta invenção podem ainda compreender um outro agente terapêutico, incluindo agentes normalmente utilizados com propósitos terapêuticos particulares para os quais o anticorpo está sendo administrado. O agente terapêutico adicional normalmente estará presente na composição em quantidades tipicamente usadas para aquele agente em uma monoterapia para a doença ou condição particulares que são tratadas. Tais agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, agentes terapêuticos usados no tratamento de cânceres, agentes terapêuticos usados para tratar doença infecciosa, agentes terapêuticos usados em outras imunoterapias, citocinas (tais como IL-2 ou IL-15) outros anticorpos e fragmentos de outros anticorpos.
[00306] Em uma forma de realização alternativa, um anticorpo que se liga a um determinante comum presente em pelo menos dois produtos de gene de receptor de KIR inibidor humano diferentes, em que o dito anticorpo é capaz de neutralizar a inibição mediada por KIR da citotoxicidade da célula NK nas células NK que expressam pelo menos um dos ditos dois receptores humanos de KIR inibidores diferentes desta invenção, pode ser incorporado em lipossomas (“imunolipossomas”), sozinhos ou juntos com uma outra substância para a liberação alvejada a um tumor ou ao sítio de uma infecção, em um ser humano ou outro mamífero não humano. Tais outras substâncias incluem ácidos nucléicos para a liberação de genes para a terapia de gene ou para a liberação de RNA de anti- sentido, RNAi ou siRNA para suprimir um gene em uma célula NK ou toxinas ou medicamentos para a matança alvejada de células NK.
[00307] Por exemplo, vários agente terapêuticos estão disponíveis para o tratamento de cânceres. As composições de anticorpo e métodos da presente invenção podem ser combinados com quaisquer outros métodos no geral utilizados no tratamento da doença particular, particularmente um tumor, doença cancerosa ou outra doença ou distúrbio que o paciente exiba. Contanto que um método terapêutico particular não seja conhecido ser nocivo para a condição do paciente por si só e não neutralize significantemente a atividade do anticorpo em uma composição farmacêutica desta invenção, a sua combinação com a presente invenção é considerada.
[00308] Em conexão com tratamento de tumor sólido, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas em combinação com métodos clássicos, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e outros. A invenção portanto fornece terapias combinadas em que uma composição farmacêutica desta invenção é usada simultaneamente com, antes ou depois de cirurgia ou tratamento com radiação; ou é administrada aos pacientes com, antes ou depois agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos ou anti-angiogênicos convencionais ou imunotoxinas alvejadas ou coaguligandos.
[00309] Quando um ou mais agentes são usados em combinação com uma composição contendo anticorpo desta invenção em um regime terapêutico, não há nenhuma exigência quanto aos resultados combinados serem aditivos dos efeitos observados quando cada tratamento é conduzido separadamente. Embora pelo menos efeitos aditivos sejam no geral desejáveis, qualquer efeito anticâncer aumentado acima de um das terapias únicas pode ser de benefício. Também, não existe nenhuma exigência particular quanto ao tratamento combinado exibir efeitos sinergísticos, embora isto seja possível e vantajosos.
[00310] Para praticar a terapia anticâncer combinada, poder-se-ia simplesmente administrar a um paciente uma composição de anticorpo desta invenção em combinação com um outro agente anticâncer em uma maneira eficaz para resultar nas suas ações anticâncer combinadas dentro do animal. Os agentes portanto seriam fornecidos em quantidades eficazes e por períodos de tempo eficazes para resultar na sua presença combinada dentro da vasculatura do tumor e suas ações combinadas no ambiente do tumor. Para se alcançar esta meta, uma composição de anticorpo desta invenção e agentes anti-câncer podem ser administrados ao paciente simultaneamente, em uma única composição combinada ou como duas composições distintas usando as mesmas ou vias de administração diferentes.
[00311] Alternativamente, a administração de uma composição de anticorpo desta invenção pode preceder ou seguir, o tratamento com agente anticâncer, por exemplo, em intervalos que variam de minutos a semanas e meses. Poder-se-ia garantir que o agente anticâncer e um anticorpo na composição de anticorpo desta invenção exerceriam um efeito vantajosamente combinado sobre o câncer. Como um exemplo, mAbs da presente invenção podem ser administrados aos pacientes com Linfoma de não Hodgkin (NHL). Tais pacientes são tipicamente tratados com uma combinação de Rituximab e uma combinação de agentes quimioterapêuticos conhecidos como CHOP. Consequentemente, os anticorpos anti-KIR desta invenção podem ser usados para tratar pacientes com NHL que estão passando pelo tratamento com Rituximab e CHOP, combinando-se a administração de todos os agentes em um programa de tratamento onde os agentes são dados no mesmo dia ou em dias diferentes, com um período de tratamento mais longo.
[00312] Outros agentes anticânceres podem ser dados antes, ao mesmo tempo como ou a seguir da administração de uma composição de anticorpo anti-KIR desta invenção. Entretanto, quando imunoconjugados de um anticorpo são usados na composição de anticorpo desta invenção, vários agentes anticânceres podem ser simultânea ou subseqüentemente administrados.
[00313] Em algumas situações, pode ser ainda desejável prolongar o período de tempo para o tratamento significantemente, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) ou ainda vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) decorrem entre a respectiva administração do agente anticâncer ou tratamento anticâncer e a administração de uma composição de anticorpo desta invenção. Isto seria vantajoso em circunstâncias onde o tratamento anticâncer foi intencionado a destruir substancialmente o tumor, tal como cirurgia ou quimioterapia e a administração de uma composição de anticorpo desta invenção foi intencionada para prevenir micrometástases ou o recrescimento do tumor.
[00314] Também é previsto que mais do que uma administração de cada um de uma composição com base em anticorpo anti-KIR desta invenção ou do agente anticâncer será utilizada. Estes agentes podem ser administrados intercambiavelmente, em dias ou semanas alternados; ou um ciclo de tratamento com uma composição de anticorpo anti-KIR desta invenção, seguido por um ciclo de terapia com agente anticâncer. Em qualquer evento, para se obter a regressão do tumor usando uma terapia combinada, tudo que é requerido é liberar ambos os agentes em uma quantidade combinada eficaz para exercer um efeito antitumor, independente das vezes para administração.
[00315] Em termos de cirurgia, qualquer intervenção cirúrgica pode ser praticada em combinação com a presente invenção. Em conexão com radioterapia, qualquer mecanismo para induzir o dano ao DNA localmente dentro das células cancerosas é considerado, tal como a irradiação gama, raios X, irradiação UV, microondas e ainda emissões eletrônicas e outros. A liberação direcionada de radioisótopos às células cancerosas também é considerada e esta pode ser usada em conexão com um anticorpo alvejador ou outros meios alvejadores.
[00316] Em outros aspectos, compostos ou regimes imunomodulatórios podem ser administrados em combinação com ou como parte das composições de anticorpo da presente invenção. Os exemplos preferidos de compostos imunomodulatórios incluem citocinas. Várias citocinas podem ser utilizadas em tais métodos combinados. Os exemplos de citocinas úteis nas combinações consideradas por esta invenção incluem IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama. As citocinas usadas no tratamento de combinação ou composições desta invenção são administradas de acordo com regimes padrão, compatíveis com as indicações clínicas tais como a condição do paciente e a toxicidade relativa da citocina. Outros compostos imunomoduladores que podem ser administrados em combinação com ou como parte das composições de anticorpo da presente invenção incluem anticorpos que se ligam especificamente a outros receptores inibidores on linfócitos, incluindo sem limitação anticorpos tais como anticorpos anti-CTLA4 ou anticorpos anti-CD94/NKG2A (ver, por exemplo, o pedido de patente publicado US 20030095965). As variantes e derivados destas moléculas que são conhecidas na técnica também ou alternativamente podem ser usados em tais métodos e incorporados em composições da invenção, como apropriado.
[00317] Em certas formas de realização, as composições terapêuticas que compreendem o anticorpo anti-KIR que reagem cruzado, bloqueadoras, e/ou inibidoras da presente invenção podem ser administradas em combinação com ou podem ainda compreender um agente de terapia quimioterapêutica ou hormonal. Uma variedade de agentes de terapia hormonal e quimioterapêuticos pode ser usada nos métodos de tratamento combinados aqui divulgados. Os agentes quimioterapêuticos considerados como exemplares incluem, mas não são limitados a, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, alcalóides vinca, por exemplo adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina, daunomicina, doxorubicina, tamoxifen, taxol, taxotere, vincristina, vinblastina, vinorelbina, etoposida (VP-16), 5-fluorouracila (5FU), citosina arabinosida, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s) e derivados e pró medicamentos destes.
[00318] Agentes hormonais incluem, mas não são limitados a, por exemplo agonistas de LHRH tais como leuprorelina, goserelina, triptorelina e buserelina; anti- estrogênios tais como tamoxifeno e toremifeno; anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, ciproterona e bicalutamida; inibidores de aromatase tais como anastrozol, exemestano, letrozol e fadrozol; e progestagênios tais como medróxi, clormadinona e megestrol.
[00319] Como será entendido por aqueles de habilidade comum na técnica, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos aproximar-se-ão daquelas já utilizadas em terapias clínicas em que os produtos quimioterapêuticos são administrados sozinhos ou em combinação com outros quimioterapêuticos. Por via de exemplo apenas, agentes tais como cisplatina e outros alquiladores de DNA podem ser usados. A cisplatina foi amplamente usada para tratar câncer, com doses eficazes usadas em aplicações clínicas de 20 mg/m2 por 5 dias a cada três semanas por um total de três procedimentos. A cisplatina não é oralmente absorvida e portanto deve ser liberada por intermédio da injeção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperitonealmente.
[00320] Outros agente quimioterapêuticos úteis incluem compostos que interferem com a replicação de DNA, mitose e segregação cromossômica e agentes que rompem a síntese e a fidelidade de precursores de polinucleotídeo. Vários agentes quimioterapêuticos exemplares para a terapia combinada estão listados na Tabela C da Patente US 6.524.583, a divulgação de agentes e indicações esta que é aqui especificamente incorporada por referência. Cada um dos agentes listados são exemplares e não limitantes. O técnico habilitado é direcionado a “Remington’s Pharmaceutic Sciences” 15a Edição, capítulo 33, em particular as páginas 624-652. A variação na dosagem provavelmente ocorrerá dependendo da condição que é tratada. O médico que administra o tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual.
[00321] As presentes composições de anticorpo anti-KIR que reagem cruzado, bloqueadoras, e/ou inibidoras desta invenção podem ser usadas em combinação com qualquer uma ou mais das terapias anti-angiogênicas ou podem ainda compreender agentes anti-angiogênicos. Os exemplos de tais agentes incluem anticorpos neutralizadores, RNA de antisentido, siRNA, RNAi, aptâmeros de RNA e ribozimas cada um direcionados contra VEGF ou receptores de VEGF (Patente US 6.524.583, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência). Variantes de VEGF com propriedades antagonísticas também podem ser utilizadas, como descrito na WO 98/16551, especificamente aqui incorporada por referência. Outros agentes anti-angiogênicos exemplares que são úteis em conexão com terapia combinada são listados na Tabela D da Patente US 6.524.583, a divulgação de agentes e indicações esta que é aqui especificamente incorporada por referência.
[00322] As composições de anticorpo anti-KIR desta invenção também podem ser vantajosamente usadas em combinação com métodos para induzir a apoptose ou podem compreender agentes apoptóticos. Por exemplo, vários oncogenes foram identificados que inibem a apoptose ou a morte celular programada. Os oncogenes exemplares nesta categoria incluem, mas não são limitados a, bcr-abl, bcl-2 (distinto de bcl-1, ciclina D1; números de acesso no GenBank M14745, X06487; Patente US 5.650.491 e 5.539.094; cada uma aqui incorporada por referência) e membros da família incluindo Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1 e A20. A super expressão de bcl-2 foi primeiro descoberta em linfomas de célula T. O oncogene bcl-2 funciona pela ligação e inativação de Bax, uma proteína no caminho apoptótico. A inibição da função de bcl-2 impede a inativação de Bax e possibilita que o caminho apoptótico se processe. A inibição desta classe de oncogenes, por exemplo, usando seqüências de nucleotídeo de anti-sentido, RNAi, siRNA ou compostos químicos de molécula pequena, é considerada para o uso na presente invenção para dar o realce da apoptose (Patente US 5.650.491, 5.539.094 e 5.583.034; cada uma aqui incorporada por referência).
[00323] As composições de anticorpo anti-KIR desta invenção também pode compreender ou ser usado em combinação com moléculas que compreendem uma porção alvejadora, por exemplo, anticorpo, ligando ou conjugada deste, direcionado a um marcador específico em uma célula alvo (“agente alvejador”), por exemplo uma célula de tumor alvo. Falando no geral, agentes alvejadores para o uso nestes aspectos adicionais da invenção preferivelmente reconhecerão antígenos de tumor acessíveis que são preferencial ou especificamente, expressados no sítio do tumor. Os agentes alvejadores no geral ligar-se-ão a um componente expressado na superfície, acessível na superfície ou localizado na superfície de uma célula de tumor. Os agentes alvejadores também preferivelmente exibirão propriedades de alta afinidade; e não exercerão efeitos colaterais in vivo significantes contra os tecidos normais que sustentam a vida, tais como um ou mais tecidos selecionados de coração, rim, cérebro, fígado, medula óssea, cólon, mama, próstata, tireóide, vesícula biliar, pulmão, glândulas supra-renais, músculo, fibras nervosas, pâncreas, pele ou outro órgão ou tecido que sustente a vida no corpo humano. O termo “não exerce efeitos colaterais significantes,” como aqui usado, refere-se ao fato de que um agente alvejador, quando administrado in vivo, produzirá apenas efeitos colaterais negligenciáveis ou clinicamente controláveis, tais como aqueles normalmente encontrados durante a quimioterapia.
[00324] No tratamento de tumores, uma composição de anticorpo desta invenção pode adicionalmente compreender ou pode ser usada em combinação com compostos adjuntos. Os composto adjuntos podem incluir por via de exemplo anti- eméticos tais como antagonistas de serotonina e terapias tais como fenotiazinas, benzamidas substituídas, antiistaminas, butirofenonas, corticosteróides, benzodiazepinas e canabinóides; bisfosfonatos tais como ácido zoledrônico e ácido pamidrônico; e fatores de crescimento hematopoiético tais como eritropoietina e G- CSF, por exemplo filgrastim, lenograstim e darbepoietina.
[00325] Em uma outra forma de realização, dois ou mais anticorpos desta invenção que reconhecem epítopos ou determinantes diferentes, incluindo NKVSF1, DF200, 1-4F1 e/ou 1-7F9, podem ser combinados em uma única composição de modo a reduzir ou neutralizar os efeitos inibidores de tantos produtos de gene de KIR quanto possível. As composições que compreendem combinações de anticorpos de KIR inibidor que reagem cruzado desta invenção ou fragmentos ou derivados destes, possibilitarão utilidade ainda mais ampla porque provavelmente existe uma porcentagem pequena da população humana que pode carecer de cada um dos produtos de gene de KIR inibidor reconhecidos por um único anticorpo que reage cruzado. Similarmente, uma composição de anticorpo desta invenção pode ainda compreender um ou mais anticorpos que reconhecem subtipos únicos de KIR inibidor. Tais combinações mais uma vez forneceriam utilidade mais ampla em um cenário terapêutico. Consequentemente, um anticorpo desta invenção pode ser combinado com um outro anticorpo anti-KIR que se liga a um ou mais, por exemplo, de KIR2DL1, KIR2DLK2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2 e KIR3DL3.
[00326] A invenção também fornece um método de potenciar a atividade da célula NK em um paciente em necessidade disso, que compreende a etapa de administrar uma composição de acordo com esta invenção ao dito paciente. O método é mais especificamente direcionado a aumentar a atividade da célula NK em pacientes tendo uma doença em que a atividade aumentada da célula NK é benéfica, envolve, afeta ou é causada pelas células suscetíveis à lise pelas células NK ou que é causada ou caracterizada pela atividade insuficiente da célula NK, tal como um câncer, um outro distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa ou um distúrbio imune. Mais especificamente, os métodos da presente invenção são utilizados para o tratamento de uma variedade de cânceres e outras doenças proliferativas incluindo, mas não limitado a, carcinoma, incluindo aquele da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago, cerviz, tireóide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica linfoblástica, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkins, linfoma de não Hodgkins, linfoma de célula pilosa e linfoma de Burketts; tumores hematopoi- éticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schvanomas; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarcinoma.
[00327] Outros distúrbios preferidos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem tumores hematopoiéticos da linhagem linfóide, por exemplo tumores de célula T e célula B, incluindo mas não limitado a distúrbios de célula T tais como leucemia prolinfocítica T (T-PLL), incluindo da célula pequena e tipo de célula cerebriforme; leucemia linfocítica granular grande (LGL) preferivelmente do tipo de célula T; síndrome de Sezary (SS); linfoma da leucemia de célula T no adulto (ATLL); linfoma hepatosplênico a/d T-NHL; linfoma de célula T periférico/pós tímico (subtipos pleomórficos e imunoblásticos); linfoma de célula T angio imunoblástico; linfoma de célula T angiocêntrico (nasal); linfoma de célula grande anaplástico (Ki 1+); linfoma de célula T intestinal; linfoblástico T; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL).
[00328] Outros distúrbios proliferativos também podem ser tratados de acordo com a invenção, incluindo por exemplo hiperplasias, fibrose (especialmente pulmonar, mas também outros tipos de fibrose, tais como fibrose renal), angiogênese, psoríase, aterosclerose e proliferação de músculo liso nos vasos sangüíneos, tal como estenose ou restenose a seguir da angioplastia. O anticorpo de KIR que reage cruzado inibidor desta invenção pode ser usado para tratar ou prevenir doenças infecciosas, incluindo preferivelmente quaisquer infecções causadas por vírus, bactérias, protozoários, mofos ou fungos. Tais organismos infecciosos virais incluem, mas não são limitados a, hepatite tipo A, hepatite tipo B, hepatite tipo C, influenza, varicela, adenovírus, herpes simples tipo I (HSV-1), herpes simples tipo 2 (HSV-2), rinderpest, rinovírus, echovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, vírus do papiloma, vírus do papiloma, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da cachumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da poliomielite, vírus Ebola e vírus da imunodeficiência humana tipo 1 ou tipo 2 (HIV-1, HIV-2).
[00329] As infecções bacterianas que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem, mas não são limitadas a, infecções causadas pelos seguintes: Staphilococcus; Streptococcus, incluindo S. pyogenes; Enterococci; Bacillus, incluindo Bacillus anthracis e Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella incluindo G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas incluindo Raeruginosa; Legionella; Neisseria incluindo N. gonorrhoeae e N. meningitides; Flavobacterium incluindo F. meningosepticum e F. odoratum; Brucella; Bordetella incluindo B. pertussis e B. bronchiseptica; Escherichia incluindo E. coli, Kiebsiella; Enterobacter, Serratia incluindo S. marcescens e S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Streptobacillus; Rickettsiaceae incluindo R. fickettsfi, Chlamydia incluindo C. psittaci e C. trachornatis; Mycobacterium incluindo M. tuberculosis, M. intracelulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracelulare e M. lepraernurium; e Nocardia.
[00330] As infecções de protozoário que podem ser tratadas de acordo com esta invenção incluem, mas não são limitadas às infecções causadas por leishmania, kokzidioa e trypanosoma. Uma lista completa de doenças infecciosas podem ser encontradas no sítio da web da National Center for Infectious Disease (NCID) no Center for Disease Control (CDC) (World Wide Web (www) em cdc.gov/ncidod/diseases/), lista esta que é aqui incorporada por referência. Todas as ditas doenças são candidatas para tratamento usando os anticorpos de KIR que reage cruzado inibidor da invenção.
[00331] Tais métodos de tratar várias doenças infecciosas podem utilizar a composição de anticorpo desta invenção, sozinha ou em combinação com outros tratamentos e/ou agentes terapêuticos conhecidos para tratar tais doenças, incluindo agentes antivirais, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, antibióticos, agentes antiparasíticos e agentes antiprotozoáricos. Quando estes métodos envolvem tratamentos adicionais com agentes terapêuticos adicionais, estes agentes podem ser administrados juntos com os anticorpos desta invenção como uma forma de dosagem única ou como formas de dosagem separadas, múltiplas. Quando administradas como uma forma de dosagem separada, o agente adicional pode ser administrado antes da, simultaneamente com, ou a seguir da administração do anticorpo desta invenção.
[00332] Outros aspectos e vantagens desta invenção serão divulgados na seguinte seção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitante do escopo deste pedido.
[00333] EXEMPLOS
[00334] Exemplo 1: Purificação de PBLs e geração de linhagens de célula NK policlonais ou clonais
[00335] PBLs foram derivadas de doadores saudáveis pelos gradientes de Ficoll- Hypaque e esgotamento de células aderentes a plástico. Para obter células NK enriquecidas, PBLs foram incubadas com mAbs anti-CD3, anti-CD4 e anti-HLA-DR por 30 minutos a 4°C, seguido pela incubação com pérolas magnéticas anti- camundongo de cabra (Dynal) (30 minutos a 4°C) e seleção imunomagnética pelos métodos conhecidos na técnica (Pende et al., J Exp Med 1999; 190: 1505-1516). As células CD3-, CD4-, DR- foram cultivadas em células alimentadoras irradiadas e 100 U/ml de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1,5 ng/ml de Fitoemaglutinina A (Gibco BRL) para obter populações de célula NK policlonais. As células NK foram clonadas pela diluição limitante e clones de células NK foram caracterizados pela citometria de fluxo para a expressão de receptores de superfície celular.
[00336] Os mAbs usados foram JT3A (IgG2a, anti-CD3), EB6 e GL183 (IgG1, anti- KIR2DL1 e KIR2DL3, respectivamente), XA-141 (IgM, anti-KIR2DL1 com a mesma especificidade como EB6), anti-CD4 (HP2.6) e anti-DR (D1.12, IgG2a). Ao invés de JT3A, HP2.6 e DR1.12 outros mAbs comercialmente disponíveis das mesmas especificidades podem ser usados. EB6 e GL183 são comercialmente disponíveis (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141 não é comercialmente disponível, mas mAb EB6 pode ser usado igualmente bem para controlar a reconstituição de lise, como mostrado nos exemplos e Figuras neste, como descrito por Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604.
[00337] As células foram tingidas com os anticorpos apropriados (30 minutos a 4°C) seguido pelos anticorpos anti-camundongo policlonais conjugados a PE ou FITC (Southern Biotechnology Associates Inc). A amostras foram analisadas pela análise citofluorométrica (citometria de fluxo) em um aparelho FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
[00338] Os seguintes clones de célula NK foram usados neste estudo. CP11, CN5 e CN505 são clones positivos em KIR2DL1 e são tingidos por EB6 (IgG1, anti- KIR2DL1) ou XA-141 (IgM, anti KIR2DL1 com a mesma especificidade quando comparado com anticorpos EB6). CN12 e CP502 são clones de NK que expressam KIR2DL3 e são tingidos pelo anticorpo GL183 (IgG1, anti-KIR2DL2/3).
[00339] A citoatividade lítica de clones NK foi avaliada por um ensaio de liberação de 51Cr de 4 horas padrão em que as células NK efetoras foram testadas quanto a sua capacidade para matar células alvo que expressam HLA-Cw3 ou -Cw4, as linhagens de célula positivas em HLA conhecidas quanto a sua sensibilidade à lise de célula NK. Todos os alvos foram usados a 5000 células por reservatório em placas de 96 reservatórios de microtitulação e a relação efetor:alvo é indicada nas Figuras (usualmente 4 efetores por célula alvo). O ensaio citolítico foi realizado com ou sem sobrenadante de hibridoma dos anticorpos monoclonais indicados em uma diluição 1/2 (1:1). O procedimento foi essencialmente o mesmo como descrito em Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604.
[00340] Exemplo 2: Geração de novos mAbs
[00341] Os mAbs foram gerados pela imunização de camundongos Balb/C de 5 semanas de idade com linhagens de célula NK policlonal ou monoclonal humanas ativadas como descrito em (Moretta et al., J Exp Med 1990; 172: 1589-1598). Depois das fusões celulares diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados quanto a sua capacidade para reagir cruzado com linhagens e clones de célula NK positivas em EB6 e GL183. Os anticorpos monoclonais positivos foram ainda triados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise pelos clones de NK positivos em EB6 ou positivos em GL183 de alvos positivos Cw4 ou Cw3, respectivamente.
[00342] O manchamento celular foi realizado como segue. As células foram tingidas com um painel de anticorpos (1 μg/ml ou 50 μ l de sobrenadante, 30 minutos a 4°C) seguido pelos anticorpos IgG anti-camundongo de fragmentos F(ab’)2 de cabra conjugados a PE (H+L) ou IgG anti-humano de fragmento F(ab’)2 de cabra conjugado a PE (Fc gama) (Beckman Coulter). A análise citofluorométrica foi realizada em um aparelho Epics XL.MCL (Beckman Coulter).
[00343] Um dos anticorpos monoclonais, o mAb DF200, foi descoberto reagir com vários membros da família KIR incluindo KIR2DL1 e KIR2DL2/3. As células NK tanto positivas em KIR2DL1 quanto positivas em KIR2DL2/3 foram tingidas de modo brilhante com mAb DF200 (Figura 1).
[00344] Os clones NK que expressam um ou outro (ou mesmo ambos) destes receptores inibidores específicos de HLA de classe I foram usados como células efetoras contra células alvo que expressam um ou mais alelos HLA-C. os ensaios de citotoxicidade foram realizados como segue. A citoatividade lítica de linhagens de célula YTSKIR2DL1 ou YTS-Eco (negativos em KIR) foi avaliada por um ensaio de liberação de Cr-51 de 4 horas padrão. As células alvo foram linhagens de célula B- EBV positivas ou negativas em HLA-Cw4 ou células 721.221 transfectadas com HLA-Cw4. Todos os alvos foram usados a 3000 células por reservatório em placa de microtitulação. A razão efetor/alvo é indicada nas figuras. O ensaio citolítico foi realizado com ou sem os fragmentos de tamanho natural ou F(ab’)2 indicados de anticorpos de camundongo ou ser humano monoclonais. Como esperado, os clones NK positivos em KIR2DL1 (KIR2DL1+) demonstraram pouca se alguma atividade citolítica contra células alvo que expressam HLA-Cw4 e os clones NK KIR2DL3+ demonstraram pouca ou nenhuma atividade nos alvos positivos em Cw3. Entretanto, na presença de DF200mAb (usado para mascarar seus receptores KIR2DL), os clones NK tornam-se incapazes de reconhecer os seus ligandos HLA-C e demonstraram atividade citolítica forte contra alvos que expressam Cw3 ou Cw4 (exemplos de resultados são mostrados nas Figuras 2-6).
[00345] Por exemplo, a linhagem de célula C1R (linhagem de célula CW4+ EBV, ATCC No CRL-1993), que expressa HLA-Cw4 (mas nenhum alotipo de HLA-C do grupo 1) não foi morta pelos clones NK positivos em KIR2DL1 (CN5/CN505), mas a inibição pôde ser eficientemente revertida pelo uso de DF200 ou um mAb anti KIR2DL1 convencional. Por outro lado, clones NK que expressam o fenótipo de KIR2DL1- KIR2DL2/3+ (CN12) eficientemente matou as células C1R e esta matança não foi afetada pelo DF200mAb (Figura 2). resultados similares são obtidos com clones NK positivos KIR2DL2 ou KIR2DL3 nos alvos positivos em Cw3.
[00346] Similarmente, a linhagem de célula Cw4+ 221 EBV não foi morta pelas células NK transfectadas com KIR2DL1+, mas a inibição pôde ser eficientemente revertida pelo uso do mAb DF200, um fragmento Fab de DF200 ou um dos mAbs anti-KIR2DL1 convencionais EB6 ou XA141. Também, um transfectante de 721.221 positivo em Cw3 não foi morto pelas células NK KIR2DL2+, mas esta inibição pôde ser revertida pelo uso de DF200 ou um fragmento Fab de DF200. Finalmente, o transfectante de 721.221 Cw3+ não foi morto pelas células NK KIR2DL3+, mas esta inibição pôde ser revertida pelo uso de um fragmento Fab de DF200 ou o mAb anti- KIR2DL3 convencional GL183 ou Y249. Os resultados são mostrados na Figura 3.
[00347] Os fragmentos F(ab’)2 também foram testados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise de alvos positivos em Cw4. Os fragmentos F(ab’)2 dos Abs DF200 e EB6 foram ambos capazes de reverter a inibição da lise pelas células NK transfectadas com KIR2DL1 da linhagem de célula 221 transfectada com Cw4 e a linhagem de célula Cw4+ TUBO EBV. Os resultados são mostrados na Figura 4.
[00348] Exemplo 3: Análise Biacore de interações mAb DF200/KIR2DL1 e mAb DF200/ KIR2DL3
[00349] Produção e purificação de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes KIR2DL1 e KIR2DL3 foram produzidas na E. coli. O cDNA que codifica o domínio extracelular inteiro de KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23) e KIR2DL3 (SEQ ID NO: 25) foram amplificados pela PCR a partir do vetor 47.11 clone pCDM8 (Biassoni et al, Eur J Immunol. 1993; 23: 1083-7) e vetor 6 clone RSV.5(gpt)183 (Wagtmann et al, Immunity 1995; 2: 439-49 e 1995; 3: 801-809) respectivamente, usando os seguintes iniciadores:
[00350] Sentido: 5’-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAG TCCACAG-3’ (SEQ ID NO: 13)
[00351] Anti-sentido: 5’-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3’ (SEQ ID NO: 14)
[00352] Estes foram clonados no vetor de expressão pML1 na matriz com uma seqüência que codifica um sinal de biotinilação (Saulquin et al, J Exp Med. 2003; 197: 933-8).
[00353] A expressão da proteína foi realizada na cepa bacteriana BL21(DE3) (Invitrogen). As bactérias transfectadas foram cultivadas na OD600 = 0,6 a 37°C em meio suplementado com ampicilina (100 μ g/ml) e a expressão foi induzida com 1 mM de IPTG.
[00354] As proteínas foram recuperadas a partir de corpos de inclusão sob condições desnaturantes (uréia a 8 M). A redobra das proteínas recombinantes foi realizada em tampão de 20 mM de Tris, pH 7,8, NaCl 150 mM contendo L-arginina (400 mM, Sigma) e p-mercapto-etanol (1 mM), na temperatura ambiente, diminuindo- se a concentração de uréia em uma diálise de seis etapas (4, 3, 2, 1, 0,5 e 0 M de uréia, respectivamente). A glutationa reduzida e oxidada (5 mM e 0,5 mM, respectivamente, Sigma) foram adicionadas durante as etapas de diálise de 0,5 e 0 M de uréia. Finalmente, as proteínas foram dialisadas extensivamente contra tampão de 10 mM de Tris, pH 7,5, NaCl 150 mM. as proteínas solúveis, redobrada foram concentradas e depois purificadas em uma coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 (Pharmacia; sistema AKTA).
[00355] As medições de ressonância de plasma de superfície foram realizadas em um aparelho Biacore (Biacore). Em todos os experimentos Biacore tampão HBS suplementado com 0,05 % de tensoativo P20 serviu como tampão de condução.
[00356] Imobilização de proteína. As proteínas KIR2DL1 e KIR2DL3 recombinantes produzidas como descrito acima foram imobilizadas covalentemente a grupos carboxila na camada de dextrano em um Sensor Chip CM5 (Biacore). A superfície do chip sensor foi ativada com EDC/NHS cloridreto de (N-etil-N’-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida e N-hidroxissuccinimida, Biacore). As proteínas, em tampão de ligação (10 mM de acetato, pH 4,5) foram injetadas. A desativação dos grupos ativados remanescentes foi realizada usando 100 mM de etanolamina pH 8 (Biacore).
[00357] Medições de afinidade. Para as medições cinéticas, várias concentrações do anticorpo solúvel (1 x 10-7 a 4 x 10-10 M) foram aplicadas sobre a amostra imobilizada. As medições foram realizadas a uma taxa de fluxo contínuo de 20 μ l/min. Para cada ciclo, a superfície do chip sensor foi regenerada pela injeção de 5 μ l de NaOH a 10 mM pH 11. O programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) foi usado para análise de dados. O análito solúvel (40 μ l em várias concentrações) foi injetada em uma taxa de fluxo de 20 μ l/min em tampão HBS, em camadas de dextrano contendo 500 ou 540 unidades de reflectância (RU) e 1000 ou 700 RU de KIR2DL1 e KIR2DL3, respectivamente. Os dados são representativos de 6 experimentos independentes. Os resultados são mostrados na Tabela 1, abaixo.
[00358] Tabela 1
[00359] Análise BIAcore da ligação de mAb DF200 a KIR2DL1 e KIR2DL3 imobilizados. KD: Constante de dissociação.
Figure img0001
[00360] Exemplo 4: Geração de novos mAbs anti-KIR humanos
[00361] Os mAbs anti-KIR monoclonais humanos foram gerados pela imunização de camundongos transgênicos, engendrados para expressar um repertório de anticorpo humano, com proteínas KIR recombinantes, solúveis. Depois das fusões celulares diferentes para estabelecer hibridomas, os mAbs foram primeiro selecionados quanto a sua capacidade para reagir cruzado com as proteínas KIR2DL1 e KIR2DL3 imobilizadas (produzidas como descrito no Exemplo 3, acima). Diversos anticorpos monoclonais humanos, incluindo 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1, foram descobertos reagir cruzado com KIR2DL1 e KIR2DL2/3.
[00362] Os anticorpos monoclonais positivos foram ainda triados quanto a sua capacidade para reconstituir a lise pelos transfectantes de NK positivos em KIR2DL1 contra células alvo positivas em Cw4. As células NK que expressam os receptores inibidores específicos de HLA classe I foram usados como células efetoras contra as células alvo que expressam um ou mais alelos HLA-C (Figuras 5 e 6). Os ensaios de citotoxicidade foram realizados como descrito acima. A razão efetora/alvo é indicada nas legendas da figura e os anticorpos foram usados a 10 μ g/ml ou 30 μ g/ml.
[00363] Como esperado, as células NK KIR2DL1+ demonstraram pouca se alguma atividade citolítica contra células alvo que expressam HLA-Cw4. Entretanto, na presença de mAb 1-7F9, células NK tornam-se incapazes de reconhecer seu HLA-C (isto é, não foram mais inibidas pelas moléculas de HLA-C) e agora demonstraram atividade citolítica forte contra os alvos positivos em Cw4. Por exemplo, as duas linhagens de célula testadas (as linhagens de célula 721.221 transfectada com HLA-Cw4 e EBV CW4+) não foram mortas pelas células NK KIR2DL1+, mas a inibição pôde ser eficientemente revertida pelo uso de mAb 1-7F9 ou o mAb EB6 anti-KIR2DL1 convencional. Os mAbs de murino DF200 e Pan2D (NKVSF1) foram comparados com o mAb humano 1-7F9 e em todos os experimentos 1-7F9 foi mais potente do que qualquer um dos outros mAbs testados em termos de induzir a citotoxicidade pelas células NK. Os anticorpos 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1 por outro lado não foram capazes de reconstituir a lise celular pelas células NK contra alvos positivos em Cw4.
[00364] Exemplo 5: A análise de ligação competitiva Biacore de murino e anticorpos anti-KIR humanos
[00365] A análise de mapeamento de epítopo foi realizada de acordo com um método anteriormente descrito (Gauthier et al., Journal of Immunology 1999; 162: 41-50; Saunal e van Regenmortel, Journal of Immunology 1995; 183: 33-41) em KIR2DL1 (900 RU), KIR 2DL3 (2000 RU) e KIR2DS1 (1000 RU) imobilizados com anticorpos anti-KIR2D de camundongo DF200, NKVSF1 (Pan2D), gl183 e EB6 e anticorpos anti-KIR2D humanos 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 e 1-7F9.
[00366] Todos os experimentos foram feitos em uma taxa de fluxo de 5 μ l/min em tampão HBS com injeção de 2 min dos anticorpos diferentes a 15 μg/ml. Para cada par de anticorpos, a análise de ligação competitiva foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa o primeiro anticorpo monoclonal (mAb) foi injetado na proteína KIR2D alvo seguido pelo segundo mAb (sem remover o primeiro mAb) e o valor RU do segundo mAb (RU2) foi monitorado. Na segunda etapa o segundo mAb foi injetado primeiro, diretamente na proteína KIR2D nua e os valores RU de mAb (RU1) foram monitorados. A inibição percentual da ligação do segundo mAb à proteína KIR2D pelo primeiro mab foi calculada por: 100*(1-RU2/RU1).
[00367] Os resultados são mostrados nas Tabelas 2, 3 e 4, onde os anticorpos designados “primeiro anticorpo” são listados na coluna vertical e os ‘segundo anticorpo’ são listados na coluna horizontal. Para cada combinação de anticorpo testada, os valores para direcionar o nível de ligação (RU) dos anticorpos ao chip são listados na tabela, onde a ligação direta do segundo anticorpo ao chip KIR2D é listado na porção superior do campo e o valor para a ligação do segundo anticorpo ao chip KIR2D quando o primeiro anticorpo está presente é listado na porção inferior do campo. Listada na direita de cada campo está a inibição percentual da segunda ligação de anticorpo. A Tabela 2 mostra a ligação em um chip KIR2DL1, a Tabela 3 mostra a ligação de anticorpos a um chip KIR2DL3 e a Tabela 4 mostra a ligação de anticorpos a um chip KIR2DS1.
[00368] A ligação competitiva de anticorpos de murino DF200, NKVSF1 e EB6 e anticorpos humanos 1-4F1, 1-7F9 e 1-6F1 a KIR2DL1, KIR2DL2/3 e KIR2DS1 imobilizados foi avaliada. O mapeamento de epítopo (Figura 7) de experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DL1 mostrou que (a) o anticorpo 1-7F9 é competitivo com EB6 e 1-4F1, mas não com NKVSF1 e DF200; (b) o anticorpo 1- 4F1 por sua vez é competitivo com EB6, DF200, NKVSF1 e 1-7 F9; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e EB6, mas não 1-7F9. O mapeamento de epítopo (Figura 8) de experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DL3 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200, gl183 e 1-7F9; (b) 1-7F9 é competitivo com DF200, gl183 e 1-4F1, mas não com NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200, 1- 4F1 e GL183, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1, 1-4F1 e 1-7F9, mas não com GL183. O mapeamento de epítopo (Figura 9) de experimentos com ligação de anticorpos anti-KIR a KIR2DS1 mostrou que (a) 1-4F1 é competitivo com NKVSF1, DF200 e 1-7F9; (b) 1-7F9 é competitivo com 1-4F1 mas não competitivo com DF200 e NKVSF1; (c) NKVSF1 compete com DF200 e 1-4F1, mas não 1-7F9; e (d) DF200 compete com NKVSF1 e 1-4F1, mas não com 1-7F9.
[00369] Tabela 2
[00370] Mapeamento de epítopo de KIR2DL1 usando a ligação competitiva entre o primeiro e segundo anticorpos
[00371] (ND = não determinado).
Figure img0002
Figure img0003
[00372] Tabela 3
[00373] Mapeamento de epítopo de KIR2DL3 usando a ligação competitiva entre o primeiro e segundo anticorpos
[00374] (ND = não determinado)
Figure img0004
Figure img0005
[00375] Tabela 4
[00376] Mapeamento de epítopo de KIR2DS1 usando a ligação competitiva entre o primeiro e segundo anticorpos
[00377] (ND = não determinado)
Figure img0006
[00378] Exemplo 6: Titulação de mAb Anti-KIR com células NK de cinomolgo
[00379] O anticorpo anti-KIR NKVSF1 foi testado quanto a sua capacidade para ligar às células NK de macacos cinomolgos.
[00380] A purificação de PBMC de macaco e a geração de volume de célula NK policlonal. As PBMC de Cynomolgus Macaque foram preparadas a partir de tubo CPT de citrato de sódio (Becton Dickinson). A purificação das células NK foi realizada pelo esgotamento negativo (kit de enriquecimento de célula NK de símio do gênero Macaca, Stem Cell Technology). As células NK foram cultivadas em células alimentadoras humanas irradiadas com 300 U/ml de Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) e 1 ng/ml de Fitoemaglutinina A (Invitrogen, Gibco) para se obter populações de célula NK policlonal.
[00381] Titulação de mAb Pan2D com células NK de cinomolgo. As células NK de cinomolgo (volume NK dia 16) foram incubadas com quantidades diferentes de mAb Pan2D seguido pelos anticorpos de IgG anti-camundongo (H+L) de fragmentos F(ab’)2 de cabra conjugado a PE. A porcentagem de células positivas foi de-terminada com um controle isotípico (IgG1 de camundongo purificado). A amostras foram feitas em duplicata. Intensidade de fluorescência média = MFI.
[00382] Ligação do anticorpo às células NK de macaco é mostrada na Figura 10.
[00383] Exemplo 7: Triagem de mAbs anti-KIR humanos
[00384] Abs anti-KIR monoclonais humanos foram gerados pela imunização de camundongos transgênicos engendrados para expressar um repertório de anticorpo humano com proteína KIR recombinante, como descrito no Exemplo 4. Para gerar anticorpos anti-KIR que reagem cruzado, os animais foram seqüencialmente imunizados com KIRs diferentes, na forma solúvel como descrita no Exemplo 3 ou expressados na superfície de células.
[00385] Em seguida, depois das fusões celulares diferentes, os mAbs foram primeiro selecionados quanto a sua capacidade para reagir cruzado com as proteínas KIR2DL1 e KIR2DL3 imobilizadas, pelo ELISA, usando métodos padrão. Diversos anticorpos monoclonais humanos, incluindo 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 e 1-6F1, foram descobertos reagir com todos de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, pelo ELISA. Os mAbs que reagiram tanto com KIR2DL1 quanto com KIR2DL2/3 foram designados “mAbs reativos cruzado com KIR2DL.”
[00386] Os mAbs reativos cruzado com KIR2DL foram depois testados quanto a sua capacidade para reagir com KIR na superfície de células pela citometria de fluxo. Em resumo, a ligação dos mAbs anti-KIR humanos foi testada incubando-os com várias linhagens de célula que super expressam estavelmente KIRs (por exemplo, YTS2DL1, BWZ-KIR2DL2 e BWZ-KIR2DS4) ou que não expressam KIRs (por exemplo, YTS e BWZ). Em resumo, as células foram incubadas com várias concentrações (tipicamente 0 a 50 μ g/ml) de mAb 1-7F9 anti-KIR humano em meio DMEM contendo 2 % de FCS. Depois da incubação, as células foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados a APC específicos para IgG humana. Todas as incubações e etapas de lavagem foram realizadas de 0 a 4°C. Subseqüentemente, as células foram lavadas, recolocadas em suspensão em PBS e analisadas pela citometria de fluxo em um FACScalibur ou um FACScanto (ambos da Beckton Dickinson). Um exemplo típico é mostrado na Figura 16. Por exemplo, 1- 7F9 e 1-4F1 foram descoberto não ligar as células transfectadas com KIR2DS4, ao passo que NKVSF1 (Pan2D) não (Figura 16).
[00387] Em seguida, a capacidade dos mAbs anti-KIR humanos para bloquear a interação entre KIR e seu ligando HLA-C foi testado por 1) experimentos bioquímicos de ligação direta e 2) reconstituição funcional de ensaios de lise.
[00388] No ensaio de ligação bioquímica, a capacidade de mAbs anti-KIR humanos, incluindo 1-7F9, para bloquear a interação entre moléculas HLA-C e KIR foi avaliada pela competição da ligação de proteínas de fusão KIR-Fc solúvel, recombinante às células que expressam HLA-C. As proteínas KIR-Fc foram produzidas como descrito (Wagtmann et al., Immunity 1995; 3(6): 801-9), exceto que o Fc humano foi substituído com Fc de IgG1 de murino. KIR-Fc solúvel liga-se às células que expressam os alotipos de HLA-C específicos que são reconhecidos por KIR2DL1 e esta ligação pode ser visualizada pela citometria de fluxo usando um Ab conjugado a fluorocromo secundário específicos para a parte Fc de murino da proteína KIR-Fc. Por exemplo, KIR2DL1-Fc liga-se às células transfectadas com HLA-Cw*0402 (transfectantes LCL 721.221-Cw4) (Litwin et al., J Exp Med. 1993; 178: 1321-36) mas não às células LCL 721.221 não transfectadas (ver a Figura 11A). Para testar se mAbs anti-KIR preveniriam esta interação entre KIR2DL1-Fc e HLA-Cw4, as proteínas KIR2DL1-FC foram pré incubadas com concentrações crescentes de mAbs anti-KIR e depois adicionadas às células LCL 721.221-Cw4, incubadas a 4°C, lavadas, incubadas com um Fc de IgG1 anti-murino conjugado a APC, lavadas e analisadas pela citometria de fluxo em um FACScalibur ou um FACScanto (Beckton Dickinson), pelos métodos padrão. Alguns mAbs anti-KIR de murino, tais como DF200 e alguns mAbs anti-KIR humanos, a saber 1-7F9 e 1-4F1, impediram a ligação de KIR2DL1-Fc às células que expressam HLA-Cw4, mostrando que estas mAbs bloqueiam a interação entre KIR2DL1 e HLA-Cw4. Como um exemplo, a Figura 17A mostra que DF200 impede a ligação de KIR2DL1-Fc às células que expressam HLA-Cw4. A Figura 17B mostra que os mAbs 1-7F9 impediram KIR2DL1 de ligar-se ao HLA-Cw4. Em paralelo, os mAbs anti-KIR foram testados quanto a sua capacidade para prevenir a ligação de KIR2DL2 a HLA-Cw3. Os anticorpos que preveniram a ligação de KIR2DL-Fc às células que expressam HLA-C em uma maneira dependente da dose, como exemplificado na Figura 17, foram designados “mAbs bloqueadores” e foram ainda testados em ensaios de citotoxicidade funcionais, como segue.
[00389] A utilidade terapêutica dos mAbs anti-KIR humanos está ligada à sua capacidade para induzir células NK que expressam KIR para matar as células de tumor, pela prevenção da sinalização de inibidores por intermédio de KIR. Portanto, foi importante avaliar se KIR2DL humano reage cruzado e mAbs bloqueadores foram capazes de induzir a lise de células alvo que expressam HLA-C pelas células NK que expressa KIR2DL. Para este propósito, os seguintes experimentos foram realizados:
[00390] Nos ensaios de citotoxicidade na liberação de 51Cr, as células YTS que expressam KIR2DL1 (YTS-2DL1) podem matar as células LCL 721.221-Cw3, mas não as LCL 721.221-Cw4 (Figura 18A). Ao contrário, as células efetoras YTS que carecem de KIRs (YTS) matam ambas as linhagens celulares eficientemente. Assim, as células efetoras YTS-2DL1 não podem matar as células LCL 721.221-Cw4 devido aos inibidores induzidos por HLA-Cw4 que sinalizam por intermédio de KIR2DL1. Quando as células YTS-2DL1 foram pré incubadas com 1-7F9 em ensaios de citotoxicidade na liberação de 51Cr, as células LCL 721.221-Cw4 foram mortas em uma maneira dependente da concentração de 1-7F9 (Figura 18B). 3-1F13, um mAb anti-KIR reativo cruzado humano que se liga a KIR2DL1 com alta afinidade, mas que não pode prevenir a interação entre KIR2DL1 e HLA-Cw4, não pode induzir a matança de Células LCL 721.221-Cw4 pelas células YTS-2DL1. Assim, 1-7F9 induz a matança mediada por NK de células alvo pela prevenção de interações KIR-HLA-C entre as células NK e alvo.
[00391] Exemplo 8: Medições da afinidade de 1-7F9
[00392] A afinidade de 1-7F9 quanto a ligação a KIR2DL1 e KIR2DL3 foi medida pela análise de Biacore, usando proteínas KIR recombinantes solúveis produzidas como descrito no Exemplo 3. Os experimentos Biacore foram realizados como descrito no Exemplo 3, exceto que o anticorpo usado foi o mAb 1-7F9 humano.
[00393] Os resultados destas determinações da afinidade de ligação pelo 1-7F9 ao KIR2DL1 e -3 são mostrados na Tabela 5.
[00394] Tabela 5
[00395] Análise BIAcore de ligação de mAb 1-7F9 a KIR2DL1 e KIR2DL3 imobilizados.
[00396] KD: Constante de dissociação.
Figure img0007
[00397] Exemplo 9: O mapeamento de epítopo de 1-7F9 em KIR2DL1
[00398] O mapeamento de epítopo de um dado anticorpo monoclonal em um dado antígeno pode ser obtido pelos métodos in silico quando estruturas de raio X/modelos de homologia adequados existem tanto do anticorpo quanto do antígeno pela realização do acoplamento de proteína-proteína.
[00399] Um modelo de homologia de um anticorpo pode ser obtido alinhando-se a seqüência da cadeia leve e pesada, respectivamente, com uma seleção de anticorpos para os quais uma estrutura 3D existe. O comprimento das 6 Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs) pode ser calculado e o melhor padrão selecionado de anticorpos com os mesmos comprimentos de CDR. Usando técnicas padrão um modelo de homologia pode ser construído a partir do padrão selecionado.
[00400] No método de acoplamento de proteína-proteína, recentemente revisado (Schneidman-Duhovny et al., Curr Med Chem 2004; 11: 91-107), as duas superfícies são representadas pelas características nas superfícies. As características incluem capacidades de ligação de hidrogênio, cargas e hidrofobicidade. Em um método com base em grade, o espaço é dividido em cubos e a cada cubo é dado um valor de acordo com a sua posição relativa à superfície (interior, superfície, exterior) e designado o conjunto de característica relevante. O emparelhamento com força bruta das superfícies por uma função de contagem pode agora ser utilizado pesquisando-se os 3 graus de translação e 3 de rotação inteiros de autonomia. As translações são manuseadas pelo Fast Fourier Transform e a rotação é tratada como cálculos individuais dentro de uma discretização padrão do espaço rotacional. A partir dos complexos de contagem de topo os resultados podem ser filtrados e contados, por uma faixa de métodos, por exemplo, complementaridade de forma, interações de Van der Waals, hidrofobicidade, eletrostáticas, dessolvatação, ligação de hidrogênio, energia de contato atômico, estatísticas de emparelhamento resíduo- resíduo e emparelhamento de grupo hidrofílico. Os complexos de contagem de topo podem ser avaliados em detalhes e resíduos influenciadores e deste modo o epítopo pode ser identificado.
[00401] Métodos e Análise
[00402] A nomenclatura de resíduo e domínio para os KIRs foram de acordo com Fan et al. (Nature 1997; 389: 96-100), de modo que o Domínio 1 compreendeu os resíduos de 6 a 101 e o Domínio 2 compreendeu os resíduos de aminoácidos de 105 a 200).
[00403] Um modelo de homologia de 1-7F9 foi construído usando 1OM3 como um padrão. A estrutura 1OM3, gerada por Calarese et al (Science 2003; 300: 2065, et seq.), foi recuperada do PDB (Protein Data Bank, no endereço da World Wide Web (WWW) rcsb.org/pdb/; 1OM3 seqüência VL: SEQ ID NO: 34; 1OM3 seqüência VH: SEQ ID NO: 35). A Numeração de Kabat e as designações de CDR foram usadas. O alinhamento global foi bom e os comprimentos de CDR foram idênticos, de modo que o modelo de homologia pôde ser preciso o bastante para ser usado em um experimento de acoplamento de proteína-proteína.
[00404] A partir do acoplamento de proteína-proteína do modelo de homologia de anticorpo 1-7F9 na estrutura KIR2DL1, soluções 1NKR.pdb 2000 foram obtidas. Estas foram filtradas quanto a sua proximidade a D183 (átomos < 6 A de CD) e R131 (átomos < 12 A de CZ) e 133 soluções resultantes foram analisadas em detalhes.
[00405] O complexo de contagem mais alto formado foi analisado e uma interação possível entre R131 (KIR) e D1000 (Cadeia pesada) foi identificada e restringida. Um novo rotâmero para F181 foi selecionado e a energia foi minimizada. Este modelo predisse que o anticorpo interagiu com os seguintes resíduos em KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23): S20 (Hyd, CB) (HydAceitador, OG), E21 (Hyd, CB, CG), M44 (Hyd, SD, CE), F45 (Hyd, CD1, CD1, CZ, CE2), R68 (HydDoador, NH2), T70 (Hyd, CB, CG2), Q71 (Hyd, CG), L104 (Hyd, CB, CG, CD1, CD2), Y105 (Hyd, CG, CD2, CE2), R131 (Ion, NH2) (HydDoador, NH2), S133 (Hyd, CA, CB) (Hyd Doador/Aceitador, OG), Y134 (Hyd, CD1, CE1), F181 (Hyd, CB, CG, CD1, CD2, CE1, CE2, CZ) e D183 (Hyd, CB).
[00406] Exemplo 10: Análise Biacore de ligação competitiva de anticorpos antiKIR de murino e ser humano
[00407] A ligação competitiva de 1-7F9, Pan2D (NKVSF1) e DF200 foi avaliada de acordo com o mesmo método descrito no Exemplo 5.
[00408] Os resultados são mostrados nas Tabelas 6 e 7, onde os anticorpos designados “primeiro anticorpo” são listados na coluna vertical e o ‘segundo anticorpo’ são listados na coluna horizontal. Para cada combinação de anticorpo testada, a inibição percentual da ligação do segundo anticorpo é listada. Onde as porcentagens de inibição para um certo par de anticorpo foram acima de 40 %, independente de qual anticorpo foi usado como primeiro anticorpo, os anticorpos foram considerados competitivos. A tabela 6 mostra a ligação em um chip de KIR2DL1 e a Tabela 7 mostra a ligação de anticorpos a um chip de KIR2DL3.
[00409] Em resumo, quanto a ligação de KIR2DL1, os resultados mostram que DF200 e Pan2D são competitivos, ao passo que 1-7F9 não é competitivo com um de DF200 ou Pan2D. Quanto a ligação de KIR2DL3, DF200 e Pan2D foram competitivos, ao passo que 1-7F9 não foi competitivo com Pan2D, mas foi competitivo com DF200.
[00410] Tabela 6
[00411] Ligação competitiva de KIR2DL1 entre o primeiro e segundo anticorpos.
Figure img0008
[00412] Tabela 7
[00413] Ligação competitiva de KIR2DL1 entre o primeiro e segundo anticorpos.
Figure img0009
[00414] Exemplo 11: Estrutura cristalina de KIR2DL1 em complexo com HuKIR1- 7F9-Fab’
[00415] A estrutura cristalina de KIR2DL1 em complexo com o fragmento Fab’ de 1-7F9 foi resolvido e refinado na resolução de 2,35 A com cristalografia de raio X. Os resultados confirmaram que o anticorpo, quando ligado ao KIR2DL1, será capaz de bloquear a ligação a uma molécula MHC Classe I (Figura 19).
[00416] Materiais e Métodos
[00417] KIR2DL1 extracelular (aminoácido 1 a 223 da SEQ ID NO: 23, com o resíduo 16 sendo arginina (R) e o resíduo 114 sendo leucina (L) e incluindo um resíduo de metionina (M) de terminal N adicional) e HuKIR1-7F9 Fab’ (com a seqüência de cadeia leve da SEQ ID NO: 36 e seqüência de cadeia pesada de resíduos 1-221 da SEQ ID NO: 37) foram misturados, com um leve excesso de KIR2DL1 e o complexo foi purificado em uma coluna de filtração em gel. O complexo foi depois concentrado a cerca de 13,5 mg/ml. Os cristais foram cultivados com a técnica de gota suspensa em 10 % de PEG6000 e 500 mM de tampão de citrato com um pH de 4,2. Os cristais foram subitamente congelados em N2 líquido e os dados cristalográficos para a resolução de 2,35 A foram coletados a 100 K usando a linha de feixe BL711I, MAX-lab, Lund, Suécia. Os dados foram integrados pelo programa XDS (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993; 26: 795-800). Para a determinação da estrutura a recolocação molecular, usando o programa MOLREP do conjunto CCP4 (Bailey, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1994; 50: 760-763) e as estruturas depositadas no PDB 1RZJ (a parte 1 de Fab) e 1NKR (KIR), foram usadas. As melhorias de fase foram feitas com o programa ARP/WARP (Lamzin e Wilson, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1993; 49: 129-147) e as modificações manual para o modelo de estrutura derivado de raio X foram feitas com o programa QUANTA (disponível da Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). O refinamento foi realizado no programa de computador REFMAC5 do conjunto CCP4. As moléculas de água foram adicionadas pelo programa ARP/WARP. O modelo compreendeu os resíduos 6-114 e 124-200 de KIR2DL1, 1-212 da cadeia leve de 1- 7F9 e 1-136 junto com 143-224 da cadeia pesada 1-7F9. Além disso, 330 moléculas de água foram colocadas. R- e R-livre para o modelo foram 0,191 e 0,253, respectivamente.
[00418] Resultados
[00419] Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4 usando uma distância de corte de 4,0 A entre as moléculas Fab’ e KIR2DL1. O epítopo KIR2DL1 resultante para 1-7F9 humano foi descoberto compreender os seguintes resíduos de KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23): L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88 (Tabelas 8 e 9). Os resíduos de 1-7F9 envolvidos nas interações com KIR2DL1 incluíram S28, V29, S30, Y32, S92, N93 e W94 da cadeia leve variável (VL) de 1-7F9 (SEQ ID NO: 15, Tabela 8) e T28, F29, S30, F31, 154, F55, E74, S77, G102, S103, Y105, Y106, D107 e Y108 da cadeia pesada variável (VH) (SEQ ID NO: 17). O epítopo KIR2DL1 e os resíduos envolvidos na ligação de hidrogênio, também são indicados na seqüência de aminoácido de KIR2DL1 na Figura 20. Os fatores de deslocamento isotrópico (também chamados de “fatores de temperatura” ou “valores B”) obtidos do refinamento de coordenada mostraram valores relativamente mais baixos para o domínio de terminal N de KIR2DL1 e os domínios variáveis do fragmento Fab’ do anticorpo 1-7F9, todos os domínios diretamente envolvidos na ligação intermolecular. Isto mostrou que as forças de ligação entre as duas moléculas no complexo do cristal foram fortes e estáveis, também sustentando que a estrutura cristalina representou um complexo KIR2DL1/1-7F9 Fab’ estável.
[00420] A molécula Fab’ de 1-7F9 ligou-se à molécula KIR2DL1 em um lado da folha β de C’CFGA’ de domínio D1 mas, além disso, tocou também uma cadeia lateral do resíduo de filamento β de E do mesmo domínio. As conexões para os resíduos da alça do domínio D1 também são importantes para a ligação (para convenções de nome de topologia, ver Fan et al., Nature 1997; 389: 96-100). Mais especificamente, as conexões são fabricadas para as seguintes partes topológicas de KIR2DL1; C filamento R (aminoácidos L38 e R41), a alça entre os filamentos β C e C’, L2 (M44, F45 e N46), filamento β C’ (D47, T48, L49, R50 e 152), filamento β E (F64), a alça entre os filamentos R de E e F, L3 (D72), filamento β F (Y80) e a alça entre os filamento β F e G (P87 e Y88).
[00421] Embora a molécula HLA-Cw4 se ligue tanto ao domínio D1 quanto D2 da molécula KIR2DL1 (Fan et al. Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460) o anticorpo 1-7F9 liga-se apenas ao domínio D1 de KIR2DL1. Existe, entretanto, uma sobreposição espacial entre um 1-7F9 ligado e uma molécula HLA-Cw4 ligada, grande o bastante para o anticorpo 1-7F9 deslocar com êxito HLA-Cw4. Usando a estrutura publicada de KIR2DL1 no complexo com HLA-Cw4 (acesso PDB código 11M9) o contato de resíduos entre KIR2DL1 e HLA-Cw4 pode ser calculado com o programa CONTACT. Em um cálculo usando um corte de distância de 4,0 A pode ser observado que três resíduos KIR2DL1 envolvidos em contatos com resíduos HLA-Cw4 são comuns para contatar resíduos no complexo 1-7F9/KIR2DL1 (Tabelas 8 e 9). Aqueles três resíduos de KIR2DL1 são M44, F45 e D72.
[00422] Sem estar limitado a qualquer teoria específica, os resultados cristalográficos também indicaram que 1-7F9 não liga o receptor de NK ativador KIR2DS4 por causa dos aminoácidos N47 e V72 na porção extracelular da seqüência KIR2DS4 (SEQ ID NO: 38).
[00423] Tabela 8
[00424] Interações de cadeia VL Fab’ KIR2DL1 - 1-7F9. Um corte de 4,0 A foi usado. Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4. Na última coluna “***” indica uma possibilidade forte para uma ligação de hidrogênio neste contato (distância < 3,3 A) como calculado pelo CONTACT, “*” indica uma possibilidade fraca (distância > 3,3 A). Branco indica que o programa considerou não haver nenhuma possibilidade de uma ligação de hidrogênio.
Figure img0010
Figure img0011
Figure img0012
[00425] Tabela 9
[00426] Interações de cadeia VH Fab’ KIR2DL1 -1-7F9. Um corte de 4,0 A foi usado. Os contatos foram identificados pelo programa de computador CONTACT do conjunto CCP4. Na última coluna “***” indica uma possibilidade forte quanto a uma ligação de hidrogênio neste contato (distância < 3,3 A) como calculado pelo CONTACT, “*” indica uma fraca possibilidade (distância > 3,3 A). Branco indica que o programa considerou não haver nenhuma possibilidade de uma ligação de hidrogênio.
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
Figure img0016
[00427] Exemplo 12: Estabilidade Física de 1-7F9
[00428] As propriedades biofísicas e a estabilidade de anticorpo humano 1-7F9 foram estudadas. A dobra e a estrutura secundária da proteína foram estudadas pelo dicroísmo circular (CD) e a oligomerização e agregação pela dispersão de luz dinâmica (DLS). De modo a imitar as condições de armazenagem por dois anos a 5°C a proteína foi submetida à incubação a 37°C com agitação por 14 dias.
[00429] Materiais e Métodos
[00430] Preparação de Amostra. 2 mg/ml de 1-7F9 foram preparados em (a) 50 mM de Na-Fosfato, 0,001 % de Polissorbato 80 (Sigma, P8074), pH 7,0; (b) 50 mM de Na-Fosfato, 0,001 % de Polissorbato 80, pH 7,0, 0,5 mM de Sacarose; (c) 50 mM de Citrato, 0,001 % de Polissorbato 80, pH 3,0; e d) 50 mM de Tris, 0,001 % de Polissorbato 80, pH 8,5.
[00431] Dicroísmo circular (CD). As medições de CD foram realizadas a 25°C com uma concentração de proteína de 2,0 mg/ml em um espectrômetro de dicroísmo circular Chirascan (Applied Photo-physics) equipado com um elemento peltier para o controle de temperatura. As amostras 1-7F9 estavam em células de quartzo cilíndricas com comprimento de trilha de 0,1 mm. as varreduras de tampão foram registradas e subtraídas para cada espectro de amostra.
[00432] Dispersão de luz dinâmica (DLS). A DLS foi realizada a 25°C com uma concentração de proteína de 2,0 mg/ml usando um instrumento de DLS de temperatura controlada Dynapro 99 (Protein Solutions Inc.). A análise dos dados foi realizada usando o software Dynamics fornecido com o instrumento.
[00433] Resultados
[00434] Visto que o tamanho molecular não muda para as amostras no pH 7,0 depois de 14 dias de incubação como avaliado pela DLS, Ambas as amostras formuladas no pH 3,0 e pH 8,5 agregaram em grande quantidade durante um período de 14 dias.
[00435] As medições de CD mostraram características de uma estrutura toda beta e revelaram que as amostras formuladas no pH 7,0 mantiveram a sua estrutura secundária por todo o estudo acelerado, embora houvesse uma leve queda no sinal para a amostra contendo apenas Polissorbato 80 como excipiente. Isto pode ser devido a uma precipitação fraca da amostra visto que a forma global dos espectros é inalterado. A amostra contendo sacarose não mostrou nenhuma de tal diminuição com o tempo. As medições de CD das amostras formuladas no pH 3,0 e 8,5 mostraram uma mudança forte nas características espectrais com o tempo, provavelmente como um resultado de desdobramento ou outras mudanças conformacionais, que levariam à proteína 1-7F9 não funcional. As mudanças foram observadas imediatamente e foram mais significantes no pH 3,0.
[00436] Além de tudo, 1-7F9 manteve as suas propriedades físicas e permaneceu estável sob condições de estresse (37°C com agitação) no pH 7,0 com Polissorbato 80 e Sacarose como excipientes.
[00437] Exemplo 13: Determinação de afinidade (ligação monovalente) de 1-7F9 e 1-4F1
[00438] As afinidades de 1-7F9 e 1-4F1 em ligação monovalente aos antígenos KIR2DL1 e KIR2DL3, (como oposto às determinações de ligação de afinidade bivalente nos Exemplos 3 e 8), foram determinadas pela tecnologia de ressonância de plasma de superfície, usando um Biacore 3000.
[00439] Em resumo, um IgG anti-humano (Dako RAHIgG, # 0423) foi usado junto com um tampão HBS-EP em uma taxa de fluxo de 20 μ l/min. Os anticorpos purificados foram diluídos a 10 μg/ml. Para cada anticorpo, KIR2DL1 ou KIR2DL3 e tampão foram injetados. Os antígenos foram testados nas concentrações de 2000, 500, 200, 50 og 20 nM. A taxa de fluxo foi mantida a 20 μ l/min. A regeneração da superfície foi realizada por uma injeção de 30s única de Glicina-HCl pH 1,8.
[00440] Os resultados são demonstrados na Tabela 10. Para a ligação de 1-4F1 a KIR2DL1, houve uma mudança significante na linha de referência. Sem estar limitado a qualquer teoria específica, isto representaria um efeito tampão causado pela matriz ou a reação de ligação realmente envolvendo 2 etapas, por exemplo, por causa de uma mudança conformacional do antígeno.
[00441] Tabela 10
[00442] Afinidade de ligação monovalente de 1-7F9 e 1-4F1 a KIR2DL1 e KIR2DL3. *) indica ajuste com RI (resposta de matriz) ajustado de modo global.
Figure img0017
[00443] ASPECTOS EXAMPLARES DA INVENÇÃO 1. Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 50 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39, e/ou uma região de cadeia pesada variável que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 50 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 2. Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 80 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39, e/ou uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 80 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 3. Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39, e/ou uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 4. Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39, e/ou uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 5. Um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 98 % idêntica à SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39, e/ou uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 98 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 6. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, em que a região variável de cadeia leve compreende pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa, cada substituição de aminoácido sendo conservativa quando comparada com o aminoácido na posição correspondente na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 39. 7. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, em que a região variável de cadeia pesada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa, cada substituição de aminoácido sendo conservativa quando comparada com o aminoácido na posição correspondente na SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 41. 8. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que compreende pelo menos um de uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; (a) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 50-56 da SEQ ID NO: 15; (b) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15; (c) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; (d) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 50-65 da SEQ ID NO: 17; e (e) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 99-112 da SEQ ID NO: 17. 9. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que compreende pelo menos um de (a) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; (b) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15; (c) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15. (d) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; (e) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e (f) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. 10. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que compreende pelo menos um de (a) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 15; (b) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 15; (c) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 15. (d) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 17; (e) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 65 da SEQ ID NO: 17; e (f) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 99 a 112 da SEQ ID NO: 17. 11. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 8 a 10, que compreende pelo menos 2 de (a) a (f). 12. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 8 a 10, que compreende pelo menos 3 de (a) a (f). 13. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 8 a 10, que compreende pelo menos 4 de (a) a (f). 14. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 8 a 10, que compreende pelo menos 5 de (a) a (f). 15. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 8 a 10, que compreende todos de (a) a (f). 16. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17. 17. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 7, que compreende pelo menos um de (g) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; (h) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; (i) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; (j) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; (k) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e (l) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41. 18. O anticorpo de qualquer um dos aspectos 1 a 7 e 17, que compreende pelo menos um de (g) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; (h) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; (i) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve que corresponde aos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; (j) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; (k) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e (l) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada que corresponde aos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41. 19. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 7 e 17 e 18, que compreende pelo menos um de (g) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 39; (h) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 56 da SEQ ID NO: 39; (i) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve consistindo essencialmente dos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 39; (j) uma seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 31 a 35 da SEQ ID NO: 41; (k) uma seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 41; e (l) uma seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada consistindo essencialmente dos resíduos 99 a 113 da SEQ ID NO: 41. 20. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 17 a 19, que compreende pelo menos 2 de (a) a (f). 21. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 17 a 19, que compreende pelo menos 3 de (a) a (f). 22. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 17 a 19, que compreende pelo menos 4 de (a) a (f). 23. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 17 a 19, que compreende pelo menos 5 de (a) a (f). 24. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 17 a 19, que compreende todos de (a) a (f). 25. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 e de 17 a 24, que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 41. 26. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, anticorpo este que não liga pelo menos um de KIR2DS4 e KIR2DS3. 27. O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 15 e 26, anticorpo este que bloqueia a ligação de KIR2DL1 e KIR2DL2/3 a uma molécula de HLA-C de classe I. 28.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 15 e 26 e 27, que potencia a atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula de HLA-C de classe I. 29.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 15 e de 26 a 28 anticorpo este que é mais eficiente do que DF200 em potenciar a atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula HLA-C Classe I. 30.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 15 e de 26 a 28, anticorpo este que é mais eficiente do que NKVSF1 (Pan2D) na potenciação da atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula HLA-C Classe I. 31.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 15 e de 26 a 28, anticorpo este que é mais eficiente do que o EB6 na potenciação da atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula HLA- C Classe I. 32.O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que é um anticorpo humano ou humanizado. 33.O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. 34.O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que é um anticorpo IgG4 humano. 35.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 34, que é um anticorpo IgG2 humano. 36. Um anticorpo IgG4 humano que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17. 37. anticorpo IgG2 humano que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 41. 38. Um anticorpo que compete com 1-7F9 na ligação a KIR2DL1 ou KIR2DL2/3, em que o anticorpo não é o 1-4F1, DF200, gl183, A210, A803(g) ou EB6. 39. Um anticorpo que compete com 1-4F1 na ligação a KIR2DL1 ou KIR2DL2/3, em que o anticorpo não é o 1-7F9, DF200, gl183, A210, A803(g) ou EB6. 40.O anticorpo do aspecto 38, em que o anticorpo não é o 1-4F1. 41.O anticorpo do aspecto 39, em que o anticorpo não é o 1-7F9. 42.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 38 e 39, em que o anticorpo não é DF200. 43.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 38 e 39, em que o anticorpo não é o gl183. 44.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 38 e 39, em que o anticorpo não é EB6. 45.O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL1 de não mais do que cerca de 20 nM. 46. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL1 de não mais do que 10,9 nM. 47. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL1 de não mais do que 0,45 nM. 48. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL3 de não mais do que cerca de 20 nM. 49. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL3 de não mais do que 2,0 nM. 50. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que tem um Kd para KIR2DL3 de não mais do que 0,025 nM. 51. O anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes, que é humano. 52. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-7F9 na ligação a KIR2DL1. 53. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-4F1 na ligação a KIR2DL1. 54. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-7F9 na ligação a KIR2DL2. 55. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-4F1 na ligação a KIR2DL2. 56. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-7F9 na ligação a KIR2DL3. 57. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-4F1 na ligação a KIR2DL3. 58. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-7F9 na ligação a KIR2DL1 e KIR2DL2/3. 59. Um anticorpo humano ou humanizado que compete com 1-4F1 na ligação a KIR2DL1 e KIR2DL2/3. 60. O anticorpo humano ou humanizado de qualquer um dos aspectos de 52 a 59, não se liga a pelo menos um de KIR2DS4 e KIR2DS3. 61. O anticorpo humano ou humanizado de qualquer um dos aspectos de 62.O anticorpo humano ou humanizado de qualquer um dos aspectos de 52 a 47, que potencia a atividade lítica de uma célula NK contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula de HLA-C de classe I. 63.O anticorpo humano ou humanizado de qualquer um dos aspectos de 52 a 62, anticorpo este que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 17 ou uma região variável de cadeia leve pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 41. 64.O anticorpo humano ou humanizado de qualquer um dos aspectos de 52 a 63, que é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. 65.O anticorpo humano ou humanizado do aspecto 64, que é um anticorpo IgG4. 66.O anticorpo humano do aspecto 64, que é um anticorpo IgG2. 67. Um anticorpo humano ou humanizado que se liga a cada um de KIR2DL1, -2 e -3 e que bloqueia a ligação de KIR2DL1, -2 ou -3 a uma molécula de HLA-C de classe I. 68. Um anticorpo que interage com os resíduos M44 e F45 de KIR2DL1. 69. O anticorpo do aspecto 68, que ainda interage com um ou mais dos resíduos de KIR2DL1 L38, R41, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 e Y88. 70. Um anticorpo que se liga a KIR2DL1 exclusivamente dentro de uma região definida pelos resíduos de aminoácido L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87 e Y88. 71. Um anticorpo que se liga a KIR2DL1 e KIR2DL2/3 sem interagir com resíduos de aminoácido fora da região definida pelos resíduos L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 e Y88. 72.O anticorpo de qualquer um dos aspectos de 67 a 71, que é o anticorpo humano 1-7F9. 73. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 74. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos duas CDRs de cadeia leve do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 75. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos três CDRs de cadeia leve do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 76. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende uma região VL do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 77. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 78. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos duas CDRs de cadeia pesada do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 79. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende pelo menos três CDRs de cadeia pesada do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 80. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende uma região VH do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 81. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende todas as CDRs do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 82. Um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende as regiões VH e VL do anticorpo de qualquer um dos aspectos precedentes. 83. Um hibridoma que produz o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes. 84. Um ácido nucléico que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 85. Um vetor que compreende o ácido nucléico do aspecto 84. 86. Uma célula que compreende o vetor do aspecto 85. 87. A célula do aspecto 86, em que a célula é selecionada de uma célula COS símia, uma célula CHO e uma célula de mieloma humanas. 88. Um método de produzir um anticorpo anti-KIR ou fragmento de anticorpo que compreende cultivar a célula do aspecto 86 sob condições adequadas para a expressão do anticorpo anti-KIR, fragmento de anticorpo, respectivamente. 89. Um método de produzir um derivado de um anticorpo anti-KIR ou fragmento de anticorpo anti-KIR que compreende fornecer um anticorpo anti-KIR ou fragmento de anticorpo e além disso conjugar pelo menos uma porção derivada. 90. Um método de tratar um câncer em um paciente, método este que compreende administrar a um paciente que sofre de câncer uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 91. O método do aspecto 90, compreendendo ainda administrar ao paciente um agente selecionado de um agente quimioterapêutico, radioterapêutico, anti-angiogênico, imunomodulatório e hormonal. 92. Um método de tratar uma doença ou distúrbio causado por um vírus em um paciente, método este que compreende administrar a um paciente que sofre de doença ou distúrbio causado por um vírus uma quantidade eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 93. Um uso do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82 na preparação de um medicamento para tratar câncer. 94. Um uso do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82 na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio causados por um vírus. 95. Uma composição que compreende o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82 e um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. 96. A composição do aspecto 95, que compreende Polissorbato 80. 97. A composição do aspecto 95, que compreende Sacarose. 98. A composição do aspecto 95, que compreende Polissorbato 80 e Sacarose. 99. A composição de qualquer um dos aspectos de 95 a 98, que ainda compreende um agente selecionado de um agente quimioterapêutico, radioterapêutico, anti-angiogênico, imunomodulatório e hormonal. 100. A composição de qualquer um dos aspectos de 95 a 99, em que o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo é covalentemente conjugado a um agente alvejador de tumor. 101. A composição de qualquer um dos aspectos de 95 a 99, o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo são encapsulados em um lipossoma. 102. A composição de qualquer um dos aspectos de 95 a 99, que ainda compreende uma ligação de anticorpo a um KIR, em que o KIR não é KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1 ou KIR2DS2. 103. Um método de aumentar a atividade lítica de uma célula selecionada de um linfócito e uma célula NK que compreende contatar a célula com o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 104. Um método de reduzir a interação entre um KIR expressado por uma célula selecionada de um linfócito, célula T e uma célula NK e uma molécula de HLA-C de classe I expressada por uma célula alvo, o método compreendendo contatar a célula com o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 105. Um método de neutralizar a atividade inibidora de um KIR expressado por uma célula NK, o método compreendendo contatar a célula NK com o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 106. Um anticorpo humano que se liga a cada um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, anticorpo este que bloqueia a ligação de uma molécula de HLA-Cw4 a KIR2DL1 e a ligação de uma molécula de HLA-Cw3 a pelo menos um de KIR2DL2 ou KIR2DL3. 107. O anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado de acordo com qualquer um dos aspectos de 1 a 82, em que o KIR2DL1 compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 23, o KIR2DL2 compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 24, e/ou o KIR2DL3 compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 25. 108. Um composto que se liga substancialmente ao mesmo epítopo de KIR2DL1 como o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 109. Um composto que se liga essencialmente ao mesmo epítopo de KIR2DL1 como o anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer um dos aspectos de 1 a 82. 110. Um anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende um cadeia leve que compreende a seqüência da SEQ ID NO: 36. 111. Um anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a seqüência da SEQ ID NO: 37. 112. Um anticorpo ou derivado de anticorpo que compreende a cadeia leve do aspecto 109 e a cadeia pesada do aspecto 110. 113. Um anticorpo consistindo de uma cadeia leve que compreende a seqüência da SEQ ID NO: 36 e uma cadeia pesada consistindo da seqüência da SEQ ID NO: 37. Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, aqui citadas são por meio deste incorporadas por referência no mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamente indicada como sendo aqui incorporada por referência e fosse aqui apresentado em sua totalidade. Todos os cabeçalhos e subcabeçalhos são aqui usados apenas por conveniência e não deve ser interpretado como limitando a invenção de nenhum modo. Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as suas variações possíveis são abrangidas pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. Os termos “um” e “uma” e “o” e “a” e referentes similares como usados no contexto de descrever a invenção devem ser interpretados como abrangendo tanto o singular quanto o plural, a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. A recitação de faixas de valores aqui são meramente intencionados a servir como um método de taquigrafia de referir-se individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo aqui indicado e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fossem individualmente aqui relatados. A menos que de outro modo estabelecido, todos os valores exatos aqui fornecidos são representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com respeito a um fator ou medição particular pode ser considerada também fornecer uma medida aproximada correspondente, modificada pelo “cerca de,” onde apropriado). Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como”) aqui fornecidos, são intencionados meramente a esclarecer melhor a invenção e não propõe uma limitação no escopo da invenção a menos que de outro modo indicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento seja essencial para a prática da invenção a menos que outro tanto seja explicitamente estabelecido. A citação e incorporação de documentos de patente aqui é feita por conveniência apenas e não reflete qualquer aspecto da validade, patentabilidade e/ou obrigatoriedade de tais documentos de patente. A descrição aqui de qualquer aspecto ou forma de realização da invenção usando termos tais como “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” ou “contendo” com referência a um elemento ou elementos é intencionada a fornecer suporte para um aspecto ou forma de realização similares da invenção que “consistem de”, “consistem essencialmente de” ou “substancialmente compreendem” que elemento ou elementos particulares, a menos que de outro modo estabelecidos ou claramente contraditos pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo daquele elemento, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto). Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da questão objeto relatada nos aspectos ou reivindicações aqui apresentadas até o grau máximo permitido pela lei aplicável.

Claims (21)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno se liga a cada um de Receptor como Ig Matador (KIR) 2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3, mas que não se liga a KIR2DS4 e reduz, neutraliza ou reverte a inibição da citotoxicidade da célula NK mediada por estes KIRs, em que: (I) o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno compreende: (a) uma sequência de aminoácidos da Região Determinadora de Complementaridade (CDR) 1 da cadeia pesada correspondente aos resíduos 3135 da SEQ ID NO: 17; (b) uma sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia pesada correspondendo aos resíduos 50-65 de SEQ ID NO: 17; (c) uma sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia pesada correspondendo aos resíduos 99-112 de SEQ ID NO: 17; (d) uma sequência de aminoácidos da CDR1 de cadeia leve correspondendo aos resíduos 24-34 de SEQ ID NO: 15; (e) uma sequência de aminoácidos da CDR2 de cadeia leve correspondendo aos resíduos 50-56 da SEQ ID NO: 15; e (f) uma sequência de aminoácidos da CDR3 de cadeia leve correspondendo aos resíduos 89-97 de SEQ ID NO: 15; ou (III) o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e (b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, ainda caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno não se liga a KIR2DS3.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, ainda caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno bloqueia a ligação de pelo menos um de KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR2DL3 a uma molécula de antígeno de leucócito humano (HLA)-C de classe I.
4. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ainda caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno bloqueia a ligação de uma molécula HLA-Cw4 a KIR2DL1 e a ligação de uma molécula HLA- Cw3 a pelo menos um de KIR2DL2 ou KIR2DL3.
5. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ainda caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno potencia a atividade lítica de uma célula matadora natural (NK) contra uma célula alvo humana que expressa uma molécula HLA-C de classe I.
6. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, concretizalçao (I), caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15.
7. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) para KIR2DL1 de não mais que cerca de 0,45 nM e/ou tem uma Kd para KIR2DL3 de não mais que 0,025 nM.
8. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
9. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
10. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno é um anticorpo IgG4.
11. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico compreende um primeiro ácido nucleico de SEQ ID NO: 16 e um segundo ácido nucleico de SEQ ID NO:18, em que os ditos primeiro e segundo ácidos nucleicos em combinação codificam um anticorpo anti-KIR como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Vetor, caracterizado pelo fato de que o dito vetor compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 11.
13. Célula microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que a dita célula microbiana transgênica compreende o vetor como definido na reivindicação 12.
14. Método de produzir de forma recombinante de um anticorpo anti-KIR ou fragmento de anticorpo, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende cultivar a célula microbiana transgênica como definida na reivindicação 13 sob condições adequadas para a expressão do anticorpo anti-KIR ou fragmento de anticorpo codificado pelo mesmo.
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou o anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido pelo método como definido na reivindicação 14, em uma quantidade eficaz para potenciar detectavelmente a citotoxicidade da célula NK em um paciente e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica compreende Polissorbato 80, sacarose ou uma combinação dos mesmos.
17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica é para uso em um método de potenciar a atividade da célula NK em um paciente em necessidade do mesmo.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito paciente sofre de câncer.
19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado de leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, mieloma múltiplo, linfoma de não Hodgkin ou o dito câncer é selecionado de câncer colorretal, câncer renal, câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer de mama e melanoma maligno.
20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito paciente sofre de uma doença infecciosa.
21. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica compreende ainda um agente terapêutico selecionado de um agente imunomodulador, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um agente antiangiogênico, um agente apoptótico, um segundo anticorpo que se liga a um KIR inibitório, um agente anti-infectivo, um agente alvejador e um composto adjunto.
BRPI0512911-7A 2004-07-01 2005-07-01 Anticorpo humano isolado, ácido nucleico, vetor, célula, método de produzir um anticorpo anti-kir humano, composição farmacêutica, e, método de potenciar a atividade da célula nk em um paciente em necessidade do mesmo BRPI0512911B1 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IBPCT/IB2004/002464 2004-07-01
DKPCT/DK2004/000470 2004-07-01
PCT/IB2004/002464 WO2005003172A2 (en) 2003-07-02 2004-07-01 Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
PCT/DK2004/000470 WO2005003168A2 (en) 2003-07-02 2004-07-01 Methods for the production and cytotoxicity evaluation of kir2dl nk-receptor antibodies
DKPA200500025 2005-01-06
DKPA200500025 2005-01-06
PCT/EP2005/053122 WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2005-07-01 Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0512911A BRPI0512911A (pt) 2008-04-15
BRPI0512911B1 true BRPI0512911B1 (pt) 2023-05-16

Family

ID=38462469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0512911-7A BRPI0512911B1 (pt) 2004-07-01 2005-07-01 Anticorpo humano isolado, ácido nucleico, vetor, célula, método de produzir um anticorpo anti-kir humano, composição farmacêutica, e, método de potenciar a atividade da célula nk em um paciente em necessidade do mesmo

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1841941A1 (pt)
JP (1) JP5770142B2 (pt)
KR (1) KR101299167B1 (pt)
CN (1) CN103509111A (pt)
AT (1) ATE499386T1 (pt)
BR (1) BRPI0512911B1 (pt)
CY (1) CY1122391T1 (pt)
DE (1) DE602005026538D1 (pt)
DK (1) DK1791868T3 (pt)
ES (2) ES2360467T3 (pt)
HU (1) HUE045639T2 (pt)
IL (1) IL179635A0 (pt)
LT (1) LT2287195T (pt)
MX (1) MX2007000210A (pt)
NO (2) NO341198B1 (pt)
PT (2) PT2287195T (pt)
RU (1) RU2410396C2 (pt)
TW (2) TWI472338B (pt)
ZA (1) ZA200700736B (pt)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3579879A4 (en) * 2017-02-09 2020-12-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTI-BODY ANTI-KIR3DL1

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1125130B1 (de) * 1998-10-29 2006-07-26 DakoCytomation Denmark A/S Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl
KR101325023B1 (ko) * 2003-07-02 2013-11-04 노보 노르디스크 에이/에스 Ｎｋ 세포 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법
DK2287195T3 (da) * 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi

Also Published As

Publication number Publication date
IL179635A0 (en) 2007-05-15
BRPI0512911A (pt) 2008-04-15
KR101299167B1 (ko) 2013-08-30
RU2006144820A (ru) 2008-09-10
PT1791868E (pt) 2011-05-02
MX2007000210A (es) 2007-08-02
NO341198B1 (no) 2017-09-11
CN103509111A (zh) 2014-01-15
JP5770142B2 (ja) 2015-08-26
JP2013009676A (ja) 2013-01-17
DK1791868T3 (da) 2011-05-16
ES2738578T3 (es) 2020-01-23
RU2410396C2 (ru) 2011-01-27
ATE499386T1 (de) 2011-03-15
KR20070034568A (ko) 2007-03-28
TWI472338B (zh) 2015-02-11
EP1841941A1 (en) 2007-10-10
TWI422389B (zh) 2014-01-11
DE602005026538D1 (de) 2011-04-07
HUE045639T2 (hu) 2020-01-28
TW200612986A (en) 2006-05-01
NO20171133A1 (no) 2007-01-31
ZA200700736B (en) 2008-04-30
NO344566B1 (no) 2020-02-03
CY1122391T1 (el) 2021-01-27
ES2360467T3 (es) 2011-06-06
NO20070585L (no) 2007-01-31
LT2287195T (lt) 2019-07-25
TW201235048A (en) 2012-09-01
PT2287195T (pt) 2019-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5112863B2 (ja) ヒト抗−ｋｉｒ抗体
US9708403B2 (en) KIR-binding agents and methods of use thereof
ES2738578T3 (es) Anticuerpos contra el receptor NK PAN-KIR2DL y su uso en el diagnóstico y la terapia

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B12B Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 01/07/2005, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A RPI 2732 DE 16/05/2023, QUANTO AO ITEM (73) NOME DO TITULAR E ENDERECO DO TITULAR