NO344566B1 - Isolert antistoff eller fragment derav, nukleinsyre som koder for nevnte antistoff eller antistoffragment, vektor som omfatter nukleinsyren, celle som omfatter vektoren eller hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antistoffragment, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff eller antistoffragment samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoff. - Google Patents

Isolert antistoff eller fragment derav, nukleinsyre som koder for nevnte antistoff eller antistoffragment, vektor som omfatter nukleinsyren, celle som omfatter vektoren eller hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antistoffragment, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff eller antistoffragment samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoff. Download PDF

Info

Publication number
NO344566B1
NO344566B1 NO20171133A NO20171133A NO344566B1 NO 344566 B1 NO344566 B1 NO 344566B1 NO 20171133 A NO20171133 A NO 20171133A NO 20171133 A NO20171133 A NO 20171133A NO 344566 B1 NO344566 B1 NO 344566B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
antibodies
kir
amino acid
kir2dl1
Prior art date
Application number
NO20171133A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20171133A1 (no
Inventor
Ivan Svendsen
Alessandro Moretta
Mariella Della Chiesa
Pascale Andre
Laurent Gauthier
Peter Andreas Nicolai Reumert Wagtmann
Matthias Thórólfsson
Stefan Zahn
Pieter Spee
Kristian Kjaergaard
Michael Wilken
Anders Svensson
Francois Romagné
Søren Berg Padkær
Original Assignee
Univ Of Genoa
Innate Pharma Sas
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/IB2004/002464 external-priority patent/WO2005003172A2/en
Priority claimed from PCT/EP2005/053122 external-priority patent/WO2006003179A2/en
Publication of NO20171133A1 publication Critical patent/NO20171133A1/no
Application filed by Univ Of Genoa, Innate Pharma Sas, Novo Nordisk As filed Critical Univ Of Genoa
Publication of NO344566B1 publication Critical patent/NO344566B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B7/00—Special arrangements or measures in connection with doors or windows
    • E06B7/02—Special arrangements or measures in connection with doors or windows for providing ventilation, e.g. through double windows; Arrangement of ventilation roses
    • E06B7/08—Louvre doors, windows or grilles
    • E06B7/084—Louvre doors, windows or grilles with rotatable lamellae
    • E06B7/086—Louvre doors, windows or grilles with rotatable lamellae interconnected for concurrent movement
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0615—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the closing elements
    • E06B9/0638—Slats or panels
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0653—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored side by side in the closing plane
    • E06B9/0661—Lazy tongue, pantograph or scissor-like systems in the plane of the opening
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/24—Screens or other constructions affording protection against light, especially against sunshine; Similar screens for privacy or appearance; Slat blinds
    • E06B9/26—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds
    • E06B9/28—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable
    • E06B9/30—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable liftable
    • E06B9/302—Lamellar or like blinds, e.g. venetian blinds with horizontal lamellae, e.g. non-liftable liftable without ladder-tape, e.g. with lazy-tongs, with screw spindle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0653—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored side by side in the closing plane
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E06—DOORS, WINDOWS, SHUTTERS, OR ROLLER BLINDS IN GENERAL; LADDERS
    • E06B—FIXED OR MOVABLE CLOSURES FOR OPENINGS IN BUILDINGS, VEHICLES, FENCES OR LIKE ENCLOSURES IN GENERAL, e.g. DOORS, WINDOWS, BLINDS, GATES
    • E06B9/00—Screening or protective devices for wall or similar openings, with or without operating or securing mechanisms; Closures of similar construction
    • E06B9/02—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary
    • E06B9/06—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type
    • E06B9/0607—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position
    • E06B9/0646—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position
    • E06B9/0676—Shutters, movable grilles, or other safety closing devices, e.g. against burglary collapsible or foldable, e.g. of the bellows or lazy-tongs type comprising a plurality of similar rigid closing elements movable to a storage position characterised by the relative arrangement of the closing elements in the stored position stored in a stacked configuration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Civil Engineering (AREA)
  • Architecture (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Blinds (AREA)

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE
Den foreliggende oppfinnelsen angår humane antistoffer så vel som fragmenter og derivater av disse som kryssreagerer med og/eller blokkerer to eller flere hemmende KIR-reseptorer som er tilstede på overflaten av NK-celler og forsterker NK-cellecytotoksisitet i pattedyrpasienter eller i en biologisk prøve. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer, fragmenter, varianter og derivater; farmasøytiske sammensetninger som omfatter det samme; og anvendelsen av slike molekyler og sammensetninger, da spesielt i terapi, for å øke NK-celleaktivitet eller cytotoksisitet i pasienter.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Naturlige dreper (NK) -celler er en underpopulasjon av lymfocytter som inngår i immunitet og i det vertsspesifikke immunovervåkingssystemet.
NK-celler er mononukleære celler som utvikler seg i benmargen fra lymfoide progenitorer og morfologiske og biologiske egenskaper inkluderer typisk ekspresjonen av klusterdeterminantene (CDer) CD16, CD56 og/eller CD57; fraværet av alfa/beta eller gamma/delta TCR-komplekset på celleoverflaten; evnen til å binde og avlive målceller som ikke makter å uttrykke "selv" det store histokompatibilitetskomplekset (MHC)/humane leukocyttantigen (HLA) -proteiner; og evnen til å avlive tumorceller eller andre syke celler som uttrykker ligander for aktivering av NK-reseptorer. NK-celler er karakterisert ved sin evne til å binde og avlive flere typer humane cellelinjer uten et foregående behov for immunisering eller aktivering. NK-celler kan også frigjøre løselige proteiner og cytokiner som utøver en regulerende effekt på immunsystemet; og de kan gå gjennom flere runder med celledeling og produsere datterceller med lignende biologiske egenskaper som foreldrecellen. Ved aktivering av interferoner og/eller cytokiner, vil NK-celler mediere eller styre oppløsningen av tumorceller og celler som er infisert med intracellulære patogener, noe som skjer ved mekanismer som krever en direkte fysisk kontakt mellom NK-cellen og målcellen. Oppløsning av målceller innbefatter frigjøringen av cytotoksiske granulater fra NK-cellen på overflaten av det bundne målet og effektorproteiner så som perforin og granzym B som trenger gjennom plasmamembranen i målcellen og induserer apoptose eller programmert celledød. Normale friske celler er beskyttet mot oppløsning av NK-celler.
Basert på deres biologiske egenskaper, er det blitt foreslått forskjellige terapeutiske og vaksinestrategier som bygger på en modulering av NK-celler. NK-celleaktivitet blir imidlertid regulert ved komplekse mekanismer som innbefatter både stimulerende og hemmende signaler.
Kort beskrevet så er den oppløsende aktiviteten til NK-celler regulert ved forskjellige celleoverflatereseptorer som overfører enten positive eller negative intracellulære signaler ved interaksjon med ligander på målcellen. Balansen mellom positive og negative signaler som overføres via disse reseptorene bestemmer om en målcelle blir eller ikke blir oppløst (avlivet) av en NK-celle. NK-cellestimulerende signaler kan være mediert av naturlige cytotoksisitetsreseptorer (NCR) så som NKp30, NKp44 og NKp46; så vel som NKG2C-reseptorer, NKG2D-reseptorer, visse aktiverende avlivnings Ig-lignende reseptorer (KIRer) og andre aktiverende NK-reseptorer (Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23: 225-74). NK-cellehemmende signaler kan være mediert av reseptorer så som Ly49, CD94/NKG2A så vel som visse hemmende KIRer som gjenkjenner hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I-molekyler (Kärre et al., Nature 1986; 319: 675-8; Öhlén et al, Science 1989; 246: 666-8). Disse hemmende reseptorene binder seg til polymorfe determinanter på MHC klasse I-molekyler (inklusive HLA klasse I) som er tilstede på andre celler og hemmer den NK-cellemedierte oppløsningen.
KIRer, noen ganger betegnet som avlivningshemmende reseptorer (Killer Inhibitory Receptors), er blitt karakterisert både i mennesker og i ikke-humane primater og er polymorfe type 1 transmembranmolekyler som er tilstede på visse undersett av lymfocytter, inklusive NK-celler og noen T-celler. KIRer virker sammen med determinanter i alfa 1- og 2-domenene i MHC klasse I-molekylene og som beskrevet ovenfor, så er distinkte KIRer enten stimulerende eller hemmende for NK-celler.
Nomenklaturen for KIRer er basert på antallet ekstracellulære domener (KIR2D og KIR3D har henholdsvis to eller tre ekstracellulære Ig-domener) og hvorvidt den cytoplasmiske halen er lang (KIR2DL eller KIR3DL) eller kort (KIR2DS eller KIR3DS). Nærværet eller fraværet av et gitt KIR er varierende fra én NK-celle til en annen innenfor den NK-populasjonen som er tilstede i et enkelt individ. Blant mennesker er det også et relativt høyt nivå med hensyn til polymorfisme av KIR-gener og hvorvidt KIR-gener er tilstede hos noen, men ikke hos alle individer. Ekspresjonen av KIR-alleler på NK-celler er stokastisk regulert, noe som betyr at i et gitt individ så vil en gitt lymfocytt kunne uttrykke en, to eller flere KIRer, avhengig av individets genotype. NK-cellene i et enkeltindivid vil typisk uttrykke forskjellige kombinasjoner av KIRer, noe som tilveiebringer et repertoar av NK-celler med forskjellige spesifisiteter for MHC klasse I-molekyler.
Visse KIR-genprodukter frembringer en stimulering av lymfocyttaktivitet når de er bundet til en passende ligand. De aktiverende KIRer har alle en kort cytoplasmisk hale med en ladd transmembranrest som er assosiert med et adaptermolekyl med immunreseptortyrosinbaserte aktiveringsmotiver (ITAMer) som overfører stimulerende signaler til NK-cellen. I motsetning til dette har hemmende KIRer en lang cytoplasmisk hale som inneholder et immunreseptortyrosinbasert hemmende motiv (ITIM) som overfører hemmende signaler til NK-cellen ved aktivering av deres MHC klasse I-ligander. De kjente hemmende KIRene inkluderer reseptorer fra KIR2DL- og KIR3DL-underfamiliene. Hemmende KIRer har to Ig-domener (KIR2DL) som gjenkjenner HLA-C-allotyper: KIR2DL2 (tidligere betegnet p58.2) og det meget nært beslektede alleliske genproduktet KIR2DL3 gjenkjenner begge "gruppe 1" HLA-C-allotyper (inklusive HLA-Cw1, -3, -7 og -8), mens KIR2DL1 (p58.1) gjenkjenner "gruppe 2" HLA-C-allotyper (så som HLA-Cw2, -4, -5 og -6). Gjenkjennelsen av KIR2DL1 er diktert ved nærværet av en Lys-rest i posisjon 80 i HLA-C-alleler. KIR2DL2- og KIR2DL3-gjenkjenning er diktert ved nærværet av en Asn-rest i posisjon 80 i HLA-C. Det er viktig å understreke at de fleste HLA-C-alleler har enten en Asn- eller en Lys-rest i posisjon 80. Derfor vil KIR2DL1, -2 og -3 kollektivt gjenkjenne i alt vesentlig alle HLA-C-allotyper som finnes hos mennesker. Et KIR med tre Ig-domener, KIR3DL1 (p70), gjenkjenner en epitop som er felles for HLA-Bw4-alleler. Endelig vil KIR3DL2 (p140), som er en homodimer av molekyler med tre Ig-domener, gjenkjenne HLA-A3 og -A11.
Skjønt multiple hemmende KIRer og/eller andre MHC klasse I-spesifikke hemmende reseptorer (Moretta et al, Eur J Immunogenet. 1997; 24(6): 455-68;
Valiante et al, Immunol Rev 1997; 155: 155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998; 16: 359-93) kan uttrykkes sammen med NK-celler, så vil det i ethvert gitt individs NK-repertoar være celler som bare uttrykker en enkelt KIR og således bare er hemmet av spesifikke MHC klasse I-alleler (eller alleler som hører til den samme gruppen av MHC klasse I-allotyper). Humane MHC klasse I-molekyler blir ofte betegnet som humant histokompatibilitetsantigen (HLA) klasse I.
NK-cellepopulasjoner eller kloner som er KIR-ligandmistilpasset med hensyn til sine mål, det vil si uttrykker KIRer som ikke gjenkjenner noe HLA-molekyl i en vert, har vist seg å mediere eller aktivere sterke livreddende antitumorresponser etter allogen benmargstransplantasjon i leukemipasienter (Ruggeri et al., Science 2002, 295: 2097-2100). Det er antatt at den underliggende mekanismen er at HLA-mistilpasset hematopoetisk transplantasjon fører til ekspansjonen av donoravledede NK-celler som uttrykker KIR som ikke gjenkjennes av noen HLA-ligander i mottakeren og således ikke blir hemmet via KIR. Disse allogene NK-klonene utøver sterk antitumoraktivitet. Denne responsen er svært sterk i pasienter som er diagnostisert med akutt myeloid leukemi (AML) og som blir behandlet med KIR-MHC-mistilpassede haploidentiske transplantater. En måte for å reprodusere denne effekten ved farmakologisk behandling av en pasient vil være å administrere reagenser som blokkerer KIR/HLA-interaksjonen for å aktivere pasientens endogene NK-celler.
Visse monoklonale antistoffer som er spesifikke for KIR2DL1 har vist seg å blokkere interaksjonen mellom KIR2DL1 og "gruppe 2" HLA-C-allotyper så som HLA-Cw4 (Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604) og å fremme NK-mediert oppløsning av målceller som uttrykker disse HLA-C-allotypene. Monoklonale antistoffer mot KIR2DL2/3 som blokkerer interaksjonen mellom KIR2DL2/3 og HLA-Cw3 og lignende allotyper, er også blitt beskrevet (Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604). Slike antistoffer er ikke ideelle for bruk i kliniske situasjoner ettersom utviklingen av to terapeutiske monoklonale antistoffer (mAb-er) og administrering av begge slike antistoffer eller en seleksjon av ett av slike antistoffer (etter passende diagnose) vil nødvendiggjøre en behandling av alle mulige pasienter, avhengig av hvorvidt en gitt pasient uttrykker gruppe 1- eller gruppe 2 HLA-C-allotyper.
Watzl et al. (Tissue Antigens 2000; 56: 240-247) fremstilte kryssreagerende murine antistoffer som gjenkjenner multiple isotyper av KIR, men disse antistoffene forsterker ikke den lytiske aktiviteten til NK-celler. Videre utførte Spaggiari et al. (Blood 2002; 99: 1706-1714 og Blood 2002; 100: 4098-4107) eksperimenter hvor det ble anvendt tallrike murine monoklonale antistoffer mot forskjellige KIR. Ett av disse antistoffene, NKVSF1 (også kjent som Pan2D), ble angitt å gjenkjenne en felles epitop av KIR2DL1 (CD158a), KIR2DL2 (CD158b) og KIR2DS4 (p50.3). Shin et al. (Hybridoma 1999; 18: 521-7) rapporterte også produksjonen av to monoklonale antistoffer som ble betegnet A210 og A803g som var i stand til å binde seg til alle KIR2DL1, KIR2DL3 og KIR2DS4. For terapeutisk anvendelse av et antistoff som blokkerer de hemmende KIRer i en pasients NK-celler, vil imidlertid ha den ulempen at jo færre aktiverende KIR-molekyler et antistoff kryssreagerer med, jo bedre etter som blokaden av aktiverende reseptorer også vil kunne svekke stimuleringen av NK-celler. Et antistoff med antigenbindende egenskaper som NKVSF1, A210 eller A803g vil således ikke være optimale i en klinisk sammenheng. Bruken av murine monoklonale antistoffer ved behandlingen av en human pasient vil dessuten kunne resultere i en vertsimmunrespons mot antistoffene og således ødelegge effekten av behandlingen.
WARREN et al., Tissue Antigens, 2000, vol 55, suppl. 1, s 80-81 beskriver monoklonal antistoff som er spesifikk for et epitop av KIR2DL1, KIR2DL2/3 og KIR2DL4.
Praktiske og effektive fremgangsmåter for terapeutisk modulering av hemmende KIRer har således hittil ikke vært tilgjengelige innenfor den medisinske vitenskapen.
SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelsen angår isolerte antistoffer eller fragmenter derav som binder seg til hver av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3, men som ikke binder KIR2DS4, og som reduserer, nøytraliserer eller reverserer hemning av NK cellecytotoksisitet mediert av disse KIR2DLene.
I en utforming av oppfinnelsen binder ikke de isolerte antistoffene eller fragmentene KIR2DS3.
I en annen utforming av oppfinnelsen blokkerer de isolerte antistoffene eller fragmentene bindingen av minst én av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 til et HLA-C klasse I-molekyl.
I en annen utforming av oppfinnelsen blokkerer de isolerte antistoffene eller fragmentene bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til KIR2DL1 og bindingen av et HLA-Cw3-molekyl til KIR2DL2 og KIR2DL3.
Ifølge en utforming av oppfinnelsen binder de isolerte antistoffene eller fragmentene til i det vesentlige den samme epitopen som et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen SEKV.ID. NR.
17.
I en særlig utforming av oppfinnelsen omfatter de isolerte antistoffene eller fragmentene et lettkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 17.
I en annet særlig utforming av oppfinnelsen omfatter de isolerte antistoffene eller fragmentene:
(a) en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17;
(b) en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17;
(c) en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17;
(d) en lettkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15;
(e) en lettkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15; og
(f) en lettkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15.
I en annen særlig utforming av oppfinnelsen omfatter de isolerte antistoffene eller fragmentene et lettkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 39 og et tungkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 41.
Ifølge en annen utforming av oppfinnelsen binder de isolert antistoffene eller fragmentene til en KIR2DL1-epitop som omfatter aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88 av KIR2DL1 som vist i SEKV.ID.NR. 23.
Ifølge en annen utforming av oppfinnelsen blokkerer de isolerte antistoffene eller fragmentene bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til restene M44, F45 og D72 av KIR2DL1 sekvensen som vist i SEKV.ID. NR. 23.
I en særlig utforming av oppfinnelsen er de isolerte antistoffene eller fragmentene monoklonale antistoffer eller fragmenter derav.
I en annen særlig utforming av oppfinnelsen er de isolerte antis toffene eller fragmentene IgG1-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-antistoffer eller antistoffragmenter.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også nukleinsyrer som koder de isolerte antistoffene eller antistoffragmentene ifølge oppfinnelsen, eller vektorer omfattende nevnte nukleinsyrer i henhold til oppfinnelsen.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også celler som omfatter vektorene ifølge oppfinnelsen, eller hybridomene som uttrykker antistoffene eller antistoffragmentene ifølge oppfinnelsen.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for å produsere et anti-KIR-antistoff eller et fragment derav, omfattende å dyrke cellen eller hybridomet ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for ekspresjon av anti -KIR-antistoffet eller fragmentet derav.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også farmasøytiske sammensetninger, som omfatter antistoffene eller antistoffragmentene ifølge oppfinnelsen, eller antistoffene eller antistoffragmentene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, i en mengde som effektivt påvisbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også farmasøytiske sammensetninger som omfatter det isolerte antistoffet eller fragmentet ifølge oppfinnelsen, som binder til i det vesentlige den samme epitopen som et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område omfattende aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 39 og et tungkjedevariabelt område omfattende aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 41, i bindingen til i det minste en av KIR2DEL1, KIR2DEL2 og KIR2DEL3, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens.
Oppfinnelsen angår også farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen , for anvendelse i en fremgangsmåte til behandling av en sykdom valgt fra kreft, proliferative sykdommer andre enn kreft og infeksjonssykdommer.
Den foreliggende oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for fremstilling av et antistoff som kryssreagerer med multiple KIR2DL-genprodukter og som reduserer eller nøytraliserer den hemmende aktiviteten til slike KIRer,
der nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene:
(a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et KIR2DL-polypeptid, der nevnte pattedyr et transgent dyr konstruert for å uttrykke et humant antistoff repertoar;
(b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr, hvori nevnte antistoffer binder nevnte KIR2DL polypeptid;
(c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste KIR2DL1-, KIR2DL2-, og KIR2DL3-genprodukter, og
(d) å velge ut antistoffer fra (c) som forsterker NK-cellecytotoksisitet.
I den foreliggende beskrivelse er det gjort kjent nye og brukbare humane antistoffer som spesifikt binder seg til KIR2DL1 og minst én av KIR2DL2 og KIR2DL3 eller til alle disse tre KIRene og/eller antistoffer som forsterker en NK-cellelytisk aktivitet ved å blokkere interaksjonene mellom en eller flere slike KIRer og HLA-C. Det er også tilveiebrakt fragmenter og derivater av slike antistoffer. Det beskrives også nye og brukbare antistoffer, antistoffragmenter og derivater av antistoffer som omfatter VH- og VL-sekvenser som i alt vesentlig er identiske til de i de humane antistoffene 1-7F9 og 1-4F1 som er beskrevet her. Beskrivelsen tilveiebringer også nukleinsyrer som omfatter nukleotidsekvenser som koder slike antistoffer; vektorer som omfatter slike nukleinsyrer; vertsceller og organismer som omfatter slike nukleinsyrer og/eller vektorer; og sammensetninger så som farmasøytisk akseptable sammensetninger og sett som omfatter slike proteiner, nukleinsyrer, vektorer og/eller celler og typisk en eller flere ytterligere bestanddeler som kan være aktive bestanddeler eller inaktive bestanddeler som fremmer formulering, levering, stabilitet eller andre egenskaper til sammensetningen (for eksempel forskjellige bærere). Beskrivelsen tilveiebringer videre forskjellige nye og brukbare fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer, nukleinsyrer, vektorer, celler, organismer og/eller sammensetninger så som ved moduleringen av KIR-medierte biologiske aktiviteter, for eksempel ved behandlingen av sykdommer som er beslektet med disse.
Oppfinnelsen angår et isolert antistoff som binder seg til hver enkelt av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3, men som ikke binder seg til KIR2DS4. I en annen utførelse så blokkerer det humane eller humaniserte antistoffet bindingen av minst en av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 til et HLA-C klasse I-molekyl. I en ytterligere utførelse kan antistoffet blokkere bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til KIR2DL1, og bindingen av et HLA-Cw3-molekyl til minst en av KIR2DL2 eller KIR2DL3. For eksempel kan antistoffet blokkere bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til restene M44, F45 og D72 i den ekstracellulære delen av KIR2DL1 (SEKV.ID. NR. 23). I enda en ytterligere utførelse forsterker antistoffet den oppløsende aktiviteten til en NK-celle i forhold til en human målcelle som uttrykker et HLA-C klasse I-molekyl.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert antistoff som konkurrerer med et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 17 i bindingen til minst ett av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3. I en annen utførelse konkurrerer antistoffet med et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen fra SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen fra SEKV.ID. NR. 17 ved bindingen til hver av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3. I en annen utførelse omfatter antistoffet et lettkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 15. I en ytterligere utførelse som omfatter antistoffene (a) en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17; (b) en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17; og (c) en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som omfatter restene 99-112 i SEKV.ID. NR.
17. For eksempel antistoffet omfatter et tungkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 17.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert antistoff som binder seg til en KIR2DL1-epitop som i alt vesentlig omfatter aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer beskrivelsen et isolert humant eller humanisert antistoff som har en dissosiasjonskonstant (Kd) for KIR2DL1 på ikke mer enn omtrent 0,45 nM og/eller en Kdfor KIR2DL3 på ikke mer enn omtrent 0,025 nM.
Oppfinnelsen tilveiebringer også et isolert antistoff eller antistoffragment eller et derivat av slike som har enhver av de foran nevnte egenskaper, enten alene eller i enhver egnet kombinasjon. I en utførelse er antistoffet et monoklonalt antistoff. I en annen utførelse er antistoffet et IgG1-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-antistoff. For eksempel kan antistoffet være et IgG4-antistoff.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en nukleinsyre som koder det isolerte antistoffet eller antistoffragmentet med enhver av de foran nevnte egenskaper, en vektor som omfatter en slik nukleinsyre, en celle som omfatter en slik vektor, foruten en fremgangsmåte for å fremstille et anti-KIR-antistoff som omfatter at en slik celle dyrkes under betingelser som er egnet for ekspresjon av anti-KIR-antistoffet.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning som omfatter et isolert antistoff eller antistoffragment som har en eller flere av de foran nevnte egenskaper eller fremstilt ved enhver fremgangsmåte, i enhver mengde som effektivt og påvisbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Sammensetningen kan for eksempel omfatte polysorbat 80, sukrose eller både polysorbat 80 og sukrose.
Bskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å forsterke NK-celleaktivitet hos en pasient som har behov for dette, hvor fremgangsmåten omfatter å administrere pasienten en effektiv mengde av enhver av de foran nevnte sammensetninger. I en utførelse lider pasienten av kreft. Pasienten kan for eksempel lide av en kreftform valgt fra akutt myeloid leukemi, kronisk myeloid leukemi, multippelt myelom og Non-Hodgkins lymfom. Alternativt kan pasienten lide av en kreftform valgt fra kolorektal kreft, nyrekreft, eggstokkreft, lungekreft, brystkreft og ondartet melanom. I en annen utførelse lider pasienten av en infeksjonssykdom. I enda en ytterligere utførelse omfatter fremgangsmåten ytterligere å administrere et terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonelt middel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel og et andre antistoff som binder seg til en hemmende KIR, et antiinfiserende middel, et målsøkende middel og en tilhørende forbindelse.
Det er underforstått at beskrivelsen av antistoffer som "er tilveiebrakt" av oppfinnelsen eller antistoffer som oppfinnelsen "angår", osv., implisitt refererer seg til antistoffer som kan brukes i praktisk gjennomføring av de her beskrevne fremgangsmåter, hvis intet annet er angitt eller klart motsies av sammenhengen.
Disse og andre aspekter og egenskaper ved oppfinnelsen er ytterligere detaljert beskrevet i det etterfølgende.
KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE
Figur 1 viser den murine monoklonale antistoff DF200-bindingen til en vanlig determinant for forskjellige humane KIR2DL-reseptorer. (A) Klon CP11, KIR2DL1+, DF200, (B) klon CP502, KIR2DL3+, (c) Klon CP11, KIR2DL1+, anti -KIR2DL1, (D) klon CP502, KIR2DL3+, anti-KIR2DL2/3.
Figur 2 viser det murine monoklonale antistoffet DF200 som nøytraliserer den KIR2DL1-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet mot Cw4-uttrykkende målceller og viser rekonstitueringen av oppløsning med anti-KIR mAb på C1R-Cw4-mål ved et effektor/mål (E/T) -forhold på 4/1.
Figur 3 viser hvorledes det murine monoklonale antistoffet DF200, et Fab-fragment av DF200 og vanlige murine antistoffer som er spesifikke enten for KIR2DL1 (mAb EB6 og XA-141) eller KIR2DL2/3 (mAb GL183 og Y249) på nøytralisering av KIR2DL1-mediert hemming av cytotoksisitet mot Cw4-positive målceller og den KIR2DL2/3-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet mot Cw3-positive målceller. (A) og (C) KIR2DL1+, målceller 721.221-Cw4+. (B) KIR2DL2+, målceller 721.221-Cw3+. (D) KIR2DL3+, målceller 721.221-Cw3+.
Figur 4 viser rekonstituering av celleoppløsning ved NK-celler som uttrykker KIR2DL1 mot HLA-Cw4-positive målceller i nærvær av F(ab’)2-fragmenter av DF200- og EB6-antistoffene. (A) Målceller 721.221-Cw4; E/T-forhold = 1. (B) Målceller B-EBV-celler som uttrykker Cw4, E/T-forhold = 2.
Figur 5 viser induksjon av NK-mediert avlivning ved kryssreaktivt murint (DF200 og NKVSF1 (Pan2D)) og humane (1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1) mAb'er, og et murint vanlig KIR2DL1-spesifikt mAb (EB6). Nevnte mAb'er induserer (rekonstituerer) avlivning ved KIR2DL1-uttrykkende NK-celler (YTS-KIR2DL1) av 721.221-målceller som er transfektert med HLA-Cw4. E/T-forhold = 1. (A) 30 μg/ml mAb. (B) 10 μg/ml mAb.
Figur 6 viser induksjon av NK-mediert avlivning ved de samme antistoffene som vist på figur 5. Nevnte mAb'er induserer (rekonstituerer) avlivning ved KIR2DL1-uttrykkende NK-celler (YTS-KIR2DL1) av B-EBV-celler som uttrykker endogent HLA-Cw4. E/T-forhold = 2. (A) 30 μg/ml mAb. (B) 10 μg/ml mAb.
Figur 7 er et epitopkart som viser resultatene av konkurrerende bindingseksperimenter oppnådd ved overflateplasmonresonans (Biacore®) -analyser med anti-KIR-antistoffer til KIR2DL1 hvor overlappende sirkler betegner overlapping mellom de nevnte mAb med hensyn til binding til KIR2DL1.
Resultatene viser at 1-7F9 konkurrerer med EB6 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 (Pan2D) og DF200 på KIR2DL1. Antistoff 1-4F1 er på sin side konkurransedyktig med EB6, DF200, NKVSF1 (Pan2D) og 1-7F9. Antistoff NKVSF1 (Pan2D) konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1. DF200 konkurrerer med NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL1.
Figur 8 er et epitopkart som viser resultatene fra konkurrerende bindingseksperimenter oppnådd ved Biacore®-analyser med anti-KIR-antistoffer til KIR2DL3 hvor overlappende sirkler betegner overlapping med hensyn til binding til KIR2DL3. Resultatene viser at 1-4F1 er konkurransedyktig med NKVSF1 (Pan2D), DF200, gl183 og 1-7F9 på KIR2DL3. 1-7F9 er konkurransedyktig med DF200, gl183 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 (Pan2D) på KIR2DL3. NKVSF1 (Pan2D) konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GL183, men ikke med 1-7F9 på KIR2DL3.
DF200 konkurrerer med NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1 og 1-7F9, men ikke med GL183 på KIR2DL3.
Figur 9 er et epitopkart som viser resultatene av konkurrerende bindingseksperimenter oppnådd ved Biacore®-analyser med anti-KIR-antistoffer til KIR2DS1 hvor overlappende sirkler betegner overlapping med hensyn til binding til KIR2DS1. Resultatene viser at antistoffet 1-4F1 konkurrerer med NKVSF1 (Pan2D), DF200 og 1-7F9 på KIR2DS1. Antistoff 1-7F9 konkurrerer med 1-4F1, men ikke med DF200 og NKVSF1 (Pan2D) på KIR2DS1. NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1. DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9 på KIR2DS1.
Figur 10 viser Pan2D (NKVSF1) mAb-titrering som demonstrerer binding av nevnte mAb til cynomolgus NK-celler. Cynomolgus NK-celler (NK bulk dag 16) ble inkubert med forskjellige mengder av NKVSF1 (Pan2D) mAb fulgt av PE-konjugerte geit F(ab’)2-fragmenter av anti-mus IgG (H+L) -antistoffer.
Prosentandelen av positive celler ble bestemt med en isotypisk kontroll (renset mus IgG1). Prøvene ble utført i duplikat og midlere fluorescensintensitet = MFI.
Figur 11 viser bindingen av løselig KIR2DL1- og KIR2DL1(R131W)-mutant til celler. (A) Binding ved økende konsentrasjoner av løselig KIR2DL1-Fc og en KIR2DL1(R131W)-hFc-mutant til celler som uttrykker HLA-Cw3 eller -Cw4. De bundne KIR-Fc-proteinene ble påvist ved å bruke et sekundært fluorokromkonjugert antistoff og påvist ved flowcytometri. Midlere fluorescens er vist på y-aksen. (B) Binding av de angitte anti-KIR mAb (GL183, EB6, DF200 og Pan2D (NKVSF1)) til KIR2DL1-Fc og det 2DL1(R131W)-mutante proteinet ved å bruke humant Ig som kontroll. Figuren viser at DF200 og Pan2D (NKVSF1) binder seg mindre godt til mutanten enn villtype KIR2DL1-Fc, noe som indikerer at begge de nevnte mAb er påvirket av R131W-mutasjonen. R131 er derfor en av de restene som utgjør epitopen for DF200 og Pan2D på KIR2DL1.
Figur 12 viser en sammenlignende sammenstilling av aminosyresekvensene i lettkjedevariable områder og lettkjede CDRer for antistoffene DF200 og Pan2D (NKVSF1). (A) Sammenstilling av anti-KIR-variable lette (VL) -områder fra DF200 (SEKV.ID. NR. 1) og Pan-2D (SEKV.ID. NR. 2). Tallene over aminosyresekvensene indikerer posisjon med hensyn til start av translatering Met (+1) i det umodne (ikke-utskilte) immunglobulinet. (B) Sammenstilling av CDR-L1-sekvenser. Rest før: Normalt Cys. Rester etter: Trp. Typisk Trp-Tyr-Leu. Lengde: 10-17 aa. (C) Sammenstilling av CDR-L2-sekvenser. Rester før: Generelt Ile-Tyr. Lengde: 7 aa. Start: Tilnærmet 16 aa etter slutten på CDR-L1. Start: Tilnærmet 24 aa fra begynnelsen av det utskilte proteinet. (D) Sammenstilling av CDR-L3-sekvenser. Rester før: Cys. Rester etter: Phe-Gly-XXX-Gly. Lengde: 7-11 aa. Start: Tilnærmet 33 aa etter slutten på CDR-L2.
Figur 13 viser det tungkjedevariable området og de tungkjede CDR'ene for antistoff DF200. (A) DF-200 VH-områder, umodent protein. Det utskilte modne VH starter ved posisjon 20: Rest Q. VH-området slutter med rest S, hvoretter det konstante området (ikke vist) fortsetter. (B) CDR-H1. Rester før: Cys-XXX-XXX-XXX.
Rester etter: Trp. Generelt Trp-Val eller Trp-Ile. Lengde: 10-14 aa. Start: Tilnærmet 22-26 aa fra begynnelsen av det utskilte proteinet. (C) CDR-H2. Rester før: Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, men også andre varianter er mulige. Rester etter: Lys eller Arg/Leu eller Ile eller Val eller Phe eller Thr eller Ala/Thr eller Ser eller Ile eller Ala. Lengde: 16-20 aa. Start: Tilnærmet 15 aa etter slutten på CDR-H1. (D) CDR-H3. Rester før: Cys-XXX-XXX (typisk Cys-Ala-Arg). Rester etter: Trp-Gly-XXX-Gly. Lengde: 3-25 aa. Start: Tilnærmet 33 etter slutten av CDR-H2.
Figur 14 viser nukleotid- og aminosyresekvensene for VH- og VL-sekvensene i det humane antistoffet 1-7F9. (A) Translatering av HuKIR 1-7F9 moden variabel lettkjede. (B) Nukleotidsekvens som koder HuKIR 1-7F9 moden variabel lettkjede. (C) Translatering av HuKIR 1-7F9 moden variabel tungkjede. (D) Nukleotidsekvens som koder den HuKIR 1-7F9 modne tungkjeden.
Figur 15 viser aminosyresekvensene for VH- og VL-sekvensene i de monoklonale antistoffene 1-7F9, DF200 (VH-sekvens: SEKV.ID. NR. 19; VL-sekvens:
SEKV.ID. NR. 21) og Pan2D (NKVSF1; VH-sekvens: SEKV.ID. NR. 20; VL-sekvens: SEKV.ID. NR. 22). De angitte CDR er innrammet.
Figur 16 viser flowcytometridata som igjen viser bindingen av det murine antistoffet Pan2D (NKVSF1) og de humane mAb 1-7F9 og 1-4F1 til celler transfektert med KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3 eller KIR2DS4, som angitt (renset antistoff: 1 μg/ml). (A) - (R) NKVSF1 (pan2D), 1-7F9 og 1-4F1 binder seg alle til KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DS1 og KIR2DS2. Ingen av antistoffene binder seg til KIR2DS3. NKVSF1, men ikke 1-7F9 eller 1-4F1, binder seg til KIR2DS4.
Figur 17 viser resultatene av FACS-analyser. (A) Antistoff mediert nøytralisering av binding av løselig KIR-Fc til HLA-Cw4 på celler, påvist ved flowcytometri (FACS). FACS-måling av KIR2DL1-mFc-binding til LCL721.221-Cw4-celler etter preinkubering med forskjellige konsentrasjoner av det kryssreaktive mAb DF200 eller det KIR2DL2/3-spesifikke mAb GL183. DF200, men ikke GL183, reduserer bindingen av KIR2DL1 til HLA-Cw4. Målingene er avsatt som prosent av KIR2DL1-hFc-binding i fravær av hemmende antistoffer. (B) FACS-måling av KIR2DL1-mFc-binding til LCL721.221-Cw4-celler etter preinkubering med forskjellige konsentrasjoner av 1-1F4 og 1-7F9. Målingene er avsatt som prosent av KIR2DL1-mFc-binding i fravær av hemmende antistoffer.
Figur 18 viser resultatene av<51>Cr-frigjøringscytotoksisitetsprøver. (A) LCL 721.221-Cw3-celler blir effektivt avlivet av både YTS-celler (romber) og YTS-2DL1-celler (trekanter) ved forskjellige E:T-forhold. I motsetning til dette blir LCL 721.221-Cw4-celler effektivt avlivet av YTS-celler (kvadrater), men kan ikke avlives av YTS-2DL1-celler (kryss) på grunn av KIR-restriksjoner. (B) I fravær av antistoff kan YTS-2DL1-celler ikke avlive LCL-721.221-Cw4 (E:T-forhold 12:1).
1-7F9 induserer avlivning av LCL 721.221-Cw4-celler av YTS-2DL1-celler på en doseavhengig måte.
Figur 19 viser en overlagring av to krystallkomplekse strukturer; KIR2DL1/1-7F9 Fab' og KIR2DL1/MHC klasse I, PDB-kode 1IM9 (Fan et al., Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460) ved å bruke C α-atomene i det vanlige KIR-molekylet (merket "KIR") som templat. KIR2DL1/1-7F9 Fab' er angitt som et grått stripete bånd mens KIR2DL1/MHC klasse I er vist som et svart bånd. 1-7F9 Fab' er angitt som "1-7F9", mens MHC klasse I er merket som "MHC". En overlapping mellom MHC og Fab' kan ses i overlagringen, noe som viser at 1-7F9 Fab' har evne til å hindre MHC klasse I-binding til KIR2DL1-reseptoren. Se eksempel 11.
Figur 20 viser den bindende epitopen til 1-7F9 på KIR2DL1, slik dette er angitt i KIR2DL1-sekvensen. Aminosyrer med en avstand på 4.0 Å fra 1-7F9 er angitt med henholdsvis grå og svart bakgrunn. Aminosyrene med svart bakgrunn inngår i hydrogenbinding til 1-7F9.
DEFINISJONER
Av hensiktsmessighetsgrunner er flere begreper definert i det etterfølgende. Listen av de definerte begrepene er imidlertid ikke uttømmende. Andre begreper vil kunne være definert i beskrivelsen av oppfinnelsen.
I den foreliggende oppfinnelsen betegner "aktive" NK-celler biologisk aktive NK-celler inklusive NK-celler som har evnen til å oppløse målceller eller forsterke immunfunksjonen til andre celler. For eksempel kan en "aktiv" NK-celle være i stand til å avlive celler som uttrykker en ligand for en aktiverende NK-reseptor og/eller som ikke utrykker MHC/HLA-antigener som gjenkjennes av et KIR på NK-cellen. NK-cellene kan fremstilles eller oppnås ved hjelp av forskjellige teknikker som i seg selv er kjente innenfor molekylærbiologien så som isolering fra blodprøver, cytaferese, vevs- eller cellesamlinger, osv. Brukbare protokoller for prøver som innbefatter NK-celler kan finnes i Natural Killer Cells Protocols (utgitt av Campbell KS og Colonna M). Human Press, sidene 219-238 (2000).
Slik det brukes her, refererer begrepene "avlivende Ig-lignende reseptor", "avlivende hemmende reseptor" eller "KIR" til et protein eller polypeptid som er kodet av et gen som hører til KIR-genfamilien eller av et cDNA fremstilt fra et slikt gen. En detaljert oversikt over KIR-genfamilien inklusive nomenklaturen med hensyn til KIR-gener og KIR-genprodukter og Genbanktilvekstnumre for eksempler på KIR, kan finnes i "The KIR Gene Cluster" av M. Carrington og P. Norman, tilgjengelige fra NCBI-hjemmesiden som kalles "Bookshelf" (tilgjengelig via World-Wide Web (WWW) adresse ncbi.nlm.nih.gov/books). Sekvensene for humane KIR-gener og cDNA-molekyler så vel som deres proteinprodukter er tilgjengelige i offentlige databaser inklusive GenBank. Ikke-begrensende eksempler på GenBank-innføringer av humane KIR har de følgende innleveringsnumrene: KIR2DL1: Genbank innleveringsnummer U24076, NM_014218, AAR16197 eller L41267; KIR2DL2: Genbank innleveringsnummer U24075 eller L76669; KIR2DL3: Genbank innleveringsnummer U24074 eller L41268; KIR2DL4: Genbank innleveringsnummer X97229; KIR2DS1: Genbank innleveringsnummer X89892; KIR2DS2: Genbank innleveringsnummer L76667; KIR2DS3: Genbank innleveringsnummer NM_012312 eller L76670 (spleisevariant); KIR3DL1:
Genbank innleveringsnummer L41269; og KIR2DS4: Genbank innleveringsnummer AAR26325. Et KIR kan omfatte fra 1 til 3 ekstracellulære domener og kan ha en lang (det vil si mer enn 40 aminosyrer) eller kort (det vil si mindre enn 40 aminosyrer) cytoplasmisk hale. Som beskrevet tidligere, så er det disse egenskapene som bestemmer nomenklaturen for et KIR. Eksempler på KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3- og KIR2DS4-molekylene omfatter de følgende respektive aminosyresekvensene:
KIR2DL1 ekstracellulært domene:
HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLI GEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLY EKPSLSAQXGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVN GTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSP TEPSSKTGNPRHLH (SEKV.ID. NR. 23), hvor "X" i posisjon 16 er P eller R og hvor "X" i posisjon 114 er P eller L og representerer alleliske varianter.
KIR2DL2 ekstracellulært domene:
HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIG EHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYE KPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGT FQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEP SSKTGNPRHLH (SEKV.ID. NR. 24).
KIR2DL3 ekstracellulært domene:
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIG EHHDGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYE KPSLSAQPGPTVLAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGT FQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTE PSSETGNPRHLH (SEKV.ID. NR. 25).
KIR2DS4 ekstracellulært domene:
QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIG EHHDGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV
(SEKV.ID. NR. 38).
Begrepet "KIR2DL2/3" refererer seg til en til en eller til begge KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorene. Disse to reseptorene har svært høy homologi og de er alleliske former av det samme genet og anses å ha lik funksjon.
Hvis intet annet er angitt, så omfatter begrepet "MHC" MHC-molekyler i alle pattedyr, mens et "HLA"-molekyler refererer seg til et humant MHC-molekyl.
Hvis det i den foreliggende oppfinnelsen er angitt at et antistoff "binder seg" ti l en determinant (det vil si ordene "binder seg" i sammenheng med en antistoff: determinantinteraksjon), så betegner det at antistoffet binder determinanten med en spesifisitet og/eller affinitet. For eksempel er GL183 et vanlig kjent monoklonalt antistoff som binder seg til KIR2DL2/3. EB6 er et vanlig kjent monoklonalt antistoff som binder seg til KIR2DL1. EB6 og GL183 er begge kommersielt tilgjengelige (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA).
Et "kryssreaktivt" anti-KIR-antistoff er et antistoff som binder seg til mer enn ett KIR-molekyl med spesifisitet og/eller affinitet. For eksempel er DF200 og 1-7F9 monoklonale antistoffer som er kryssreaktive med KIR2DL1, -2 og -3. Hybridomet som produserer antistoffet DF200 er blitt innlevert til CNCM-kultursamlingen under identifikasjonsnummeret "DF200" og registreringsnummer CNCM I-3224, registrert 10. juni 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Frankrike. NKVSF1, også betegnet "Pan2D", er kryssreaktivt med KIR2DL1, -2 og -3 og KIR2DS4. Dette antistoffet er kommersielt tilgjengelig fra Serotec (Cergy Sainte-Christophe, Frankrike), katalogreferansenummer MCA2243.
"Spesifikk binding" eller "spesifisitet" refererer seg til et antistoffs eller et annet middels evne til påvisbart å binde en epitop som er tilstede på et antigen, så som et KIR, med en relativt liten påvisbar reaktivitet med andre proteiner eller strukturer (så som andre proteiner som måtte være tilstede på NK-celler på andre celletyper). Spesifisitet kan relativt bestemmes ved binding eller ved hjelp av konkurrerende bindingsprøver, for eksempel ved å bruke Biacore-instrumenter slik dette er beskrevet i det etterfølgende. Spesifisitet kan være vist ved for eksempel et omtrent 10:1, omtrent 20:1, omtrent 50:1, omtrent 100:1, 10.000:1 eller et større forhold mellom affinitet/aviditet ved binding til det spesifikke antigenet i forhold til ikke -spesifikk binding til andre irrelevante molekyler (i dette tilfellet er det spesifikke antigenet et KIR). Et KIR-bindende antistoff som er spesifikt for et KIR som er tilstede på NK-cellene i en spesiell organisme, for eksempel i et menneske, kan enkelte ganger oppvise binding til lignende KIR fra andre arter (for eksempel et KIR-bindende antistoff eller et annet KIR-bindende middel kan kryssreagere med KIR fra forskjellige arter).
"Selektivitet" refererer seg til den preferensielle eller foretrukne bindingen av et protein til et spesielt område, mål eller peptid i motsetning til ett eller flere andre biologiske molekyler, strukturer, celler, vev, osv. Et KIR-bindende antistoff kan også være selektivt for et KIR som er produsert i en spesiell organisme (for eksempel i et menneske i motsetning til i en primat) og/eller en spesiell type av KIR (for eksempel et KIR med en lang cytoplasmatisk hale), spesielt i de tilfeller hvor antistoffet kryssreagerer med mer enn en type KIR som er fremstilt i en spesiell organisme og/eller en spesiell del av et KIR (så som en spesiell epitop eller et spesielt antigent determinant område). Selektivitet kan for eksempel bestemmes ved konkurrerende ELISA- eller Biacore-prøver. Forskjellen i affinitet/aviditet som betegner selektivitet kan være enhver påvisbar preferanse (for eksempel et forhold på mer enn 1:1,1 eller mer enn 1:5, hvis den lar seg påvise, og vil således være egnet, inklusive 1:10, 1:100, 1:1000 eller mer). Hvis intet annet er angitt, så vil enhver referanse til enhver type kvantitative data med hensyn til "affinitet" referere seg til målinger av bivalent (i motsetning til monovalent) binding.
En "epitop" eller et "bindingssete" er et område som et antigenbindende peptid (så som et antistoff) spesifikt binder seg til. En proteinepitop kan omfatte aminosyrerester som direkte er involvert i bindingen (også kalt den immundominante komponenten av epitopen) og andre aminosyrerester som ikke direkte inngår i bindingen så som aminosyrerester som effektivt er blokkert av det spesifikke antigenbindende peptidet (med andre ord ligger aminosyreresten innenfor "fingeravtrykket" til det spesifikke antigenbindende peptidet). Begrepet epitop inkluderer her begge typer aminosyrebindingsseter i ethvert spesielt område av et KIR som spesifikt binder seg til et anti-KIR-antistoff, eller et annet KIR-spesifikt middel ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvis intet annet er angitt (i visse sammenhenger angår oppfinnelsen også antistoffer som binder seg direkte til spesielle aminosyrerester). KIR kan omfatte en rekke forskjellige epitoper og disse kan, uten begrensning, inkludere (1) lineære peptidantigene determinanter, (2) konformasjonelle antigene determinanter som består av en eller flere ikkesammenhengende aminosyrer plassert nær hverandre i en moden KIR-konformasjon, og (3) post-translasjon antigene determinanter som helt eller delvis består av molekylære strukturer som kovalent er knyttet til et KIR så som karbohydratgrupper.
Uttrykket at et første antistoff binder seg "i alt vesentlig" eller "i det minste delvis" til den samme epitopen som et andre antistoff, betyr at epitopbindingssetet for det første antistoffet omfatter minst 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller mer av aminosyrerestene på antigenet som utgjør det epitop bindende setet i det andre antistoffet. At et første antistoff binder seg i alt vesentlig eller delvis til samme epitop som et andre antistoff, betyr også at de nevnte første og andre antistoffer konkurrerer om binding til antigenet slik det er beskrevet ovenfor.
Begrepet "binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet 1-7F9, betyr således at et antistoff "konkurrerer" med 1-7F9. Generelt, når det er angitt at et antistoff som "binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet av interesse (for eksempel DF200, NKVSF1, 1-7F9), så betyr dette at antistoffet "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse med hensyn til binding til ett eller flere KIR-molekyler, fortrinnsvis et KIR-molekyl valgt fra gruppen bestående av KIR2DL1 og KIR2DL2/3. I andre eksempler så vil et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL1-molekyl som antistoffet av interesse, "konkurrere" med antistoffet av interesse for binding til KIR2DL1. Et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten på et KIR2DL2/3-molekyl som antistoffet av interesse, vil "konkurrere" med antistoffet av interesse for binding til KIR2DL2/3.
Begrepet "binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som" et antistoff av interesse, betyr at et antistoff "konkurrerer" med nevnte antistoff av interesse for minst ett eller ethvert av alle KIR-molekyler som nevnte antistoff av interesse binder seg spesifikt til. Begrepet "binder seg i al t vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som" det monoklonale antistoffet 1-7F9, betyr at et antistoff "konkurrerer" med 1-7F9 med minst ett, fortrinnsvis ethvert eller alle KIR-molekyler som 1-7F9 spesifikt binder seg til. For eksempel vil et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som de monoklonale antistoffene 1-7F9 eller NKVSF1 således "konkurrere" med nevnte 1-7F9 eller NKVSF1 henholdsvis for binding til KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 og KIR2DS2.
Et anti-KIR-antistoffs evne til å "blokkere" bindingen av et KIR-molekyl og et HLA-molekyl, betyr at antistoffet i en prøve som bruker løselige eller celleoverflateassosierte KIR- og HLA-molekyler påvisbart kan redusere bindingen av et KIR-molekyl til et HLA-molekyl på en doseavhengig måte, hvor KIR-molekylet påvisbart binder seg til HLA-molekylet i fravær av antistoffet. Et eksempel på en prøve for å bestemme hvorvidt et anti-KIR-antistoff er i stand til slik blokkering, er beskrevet i eksempel 8.
Et anti-KIR-antistoffs evne til å "redusere den hemmende aktiviteten til et KIR", "lette NK-celleaktivitet", "lette NK-cellecytotoksisitet", "lette NK-celler", "forsterke NK-celleaktivitet", "forsterke NK-cellecytotoksisitet" eller "forsterke NK-celler", betyr at en NK-celle som uttrykker et KIR, når denne kontaktes antistoffet, er i stand til å oppløse målceller som på sin overflate uttrykker et spesielt MHC- eller HLA klasse I som er en ligand for nevnte KIR. Begrepet "forsterkning av NK-cytotoksisitet" betyr for eksempel en vesentlig forsterkning, i det minste 5%, 10%, 20%, 30% eller sterkere forsterkning av NK-cytotoksisiteten, det vil si minst 50% forsterkning av NK-cytotoksisitet (for eksempel minst omkring 60%, minst omkring 70%, minst omkring 80%, minst omkring 85%, minst omkring 90% eller minst omkring 95%) sammenlignet med en kontroll. Dette inkluderer for eksempel 55-100%, omtrent 65-100%, omtrent 75-100%, omtrent 80-100% eller omtrent 90-100% forsterkning av NK-cellecytotoksisitet sammenlignet med en kontroll. Det inkluderer også mer enn omtrent 100%, mer enn omtrent 500%, mer enn omtrent 1000% og mer enn omtrent 2000% eller høyere forsterkning av cytotoksisiteten. Dette kan for eksempel måles i en prøve så som en standard cytotoksisitetsprøve hvor et høyere antall, det vil si en høyere prosent, av målcellene blir oppløst av NK-celler i nærvær av en NK-forsterker (så som et anti-KIR mAb) enn i fraværet av en slik forsterker (det vil si kontrollen).
Begrepet "nøytralisere KIR-mediert hemming av NK-celletoksisitet" eller "nøytralisere den hemmende aktiviteten for et KIR" slik det brukes her, betyr evnen til spesifikt å forsterke oppløsningen til mer enn omtrent 20%, fortrinnsvis med minst omtrent 40%, med minst omtrent 40% eller minst omtrent 50% eller minst omtrent 100% eller mer, av den spesifikke oppløsning som oppnås ved det samme effektor : målcelleforholdet med NK-celler eller NK-cellelinjer som ikke er blokkert av sine KIR, slik dette kan måles ved en klassisk kromfrigjøringstest for cytotoksisitet. "Nøytralisere KIR-mediert hemming" kan også bety at i nevnte kromfrigjøringsprøve eller en annen cytotoksisitetsprøve hvor det anvendes en NK-celleklon eller transfektant som uttrykker ett eller flere hemmende KIR og en målcelle som uttrykker minst ett HLA-klasse I-allel som gjenkjennes av ett av de nevnte KIR på NK-cellen, så vil den spesifikke oppløsning som oppnås med antistoffet være mer enn omtrent 100%, fortrinnsvis minst omtrent 101%, minst omtrent 150%, minst omtrent 200% eller mer (for eksempel omtrent 101-150%, omtrent 120-150%, omtrent 120-200%, omtrent 150-200% eller omtrent 200-1000%) eller mer av den spesifikke oppløsning som oppnås ved den samme konsentrasjonen av NKVSF1 (kommersielt tilgjengelig fra Serotec), ved å bruke de samme NK-cellene og målcellene, ved det samme effektor : målcelleforholdet.
Begrepet "humant antistoff" slik det brukes her, er tenkt å inkludere antistoffer med variable og konstante områder som er identiske eller i alt vesentlig identiske til, eller avledet fra humane kimlinjeimmunglobulinsekvenser. Slike humane antistoffer kan inkludere aminosyrerester som ikke er kodet av de humane kimlinjeimmunglobulinsekvensene (for eksempel mutasjoner innført ved vilkårlig eller setespesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo).
Begrepet "humant antistoff" slik det brukes her, er imidlertid ikke tenkt å inkludere antistoffer hvor CDR-sekvensene er avledet fra kimlinjen i andre pattedyrarter så som mus og som er blitt podet på humane rammeverkssekvenser.
I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen betyr "behandling", hvis intet annet er angitt, en forebygging, lindring, behandling, helbredelse eller reduksjon av en eller flere symptomer eller klinisk relevante manifestasjoner av en sykdom eller lidelse, hvis dette ikke er utelukket ut fra sammenhengen. For eksempel så vil "behandling" av en pasient hvor det ikke er blitt identifisert noen symptomer eller klinisk relevante manifestasjoner av en sykdom eller lidelse være en forebyggende terapi, mens "behandling" av en pasient hvor symptomer eller klinisk relevante manifestasjoner av en sykdom eller lidelse ikke er blitt identifisert, vil vanligvis ikke utgjøre eller omfatte forebyggende terapi. Ikke desto mindre er det underforstått at de forskjellige terapeutiske og profylaktiske fremgangsmåter og bruksanvendelser av den foreliggende oppfinnelse er distinkt fra en i mange henseende (for eksempel dose av en eller flere forbindelser som skal leveres en pasient, tidspunktet for anvendelsen, indikasjonen på anvendelsen, osv.) og hver kan være ansett å være et enestående trekk ved oppfinnelsen.
I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen, refererer begrepet "kreft" til enhver neoplastisk lidelse som inkluderer, men som ikke er begrenset til, cellulære lidelser så som sarkom, karsinom, melanom, leukemi og lymfom, som kan inkludere kreft i brystet, hodet og nakken, eggstokkene, urinblæren, lungene, svelget, strupen, spiserøret, magesekken, tolvfingertarmen, leveren, pankreas, kolon, hunnlige eller mannlige kjønnsorganer, prostata, nyrer og sentralnervesystemet.
Begrepet "biologisk prøve" slik det brukes her inkluderer, men er ikke begrenset til, en biologisk væske (for eksempel serum, lymfe og blod), celleprøver eller vevsprøver (for eksempel benmarg eller tumorvev) som er avledet fra et menneske eller et ikke-humant pattedyr.
Begrepet "i alt vesentlig identisk" i sammenheng med to aminosyresekvenser, betyr at sekvensene når de er optimalt sammenstilt, som for eksempel ved hjelp av programmene GAP eller BESTFIT som bruker standard gapvekter (gap weights), har minst omkring 50, minst omkring 60, minst omkring 70, minst omkring 80, minst omkring 90, minst omkring 95, minst omkring 98 eller minst omkring 99 prosent sekvensidentitet. I en utførelse så skiller de restposisjoner som ikke er identiske seg ved konservative aminosyresubstitusjoner (ytterligere beskrevet i det etterfølgende). Sekvensidentitet blir typisk målt ved å bruke sekvensanalysedataprogrammer. Slike dataprogrammer for proteinanalyse tilpasser tilsvarende sekvenser ved å bruke mål for likhet som er gitt forskjellige substitusjoner, delesjoner eller andre modifikasjoner inklusive konservative aminosyresubstitusjoner. Således vil det offentlige tilgjengelige GCG-programvaren som inneholder programmer så som "Gap" og "BestFit" brukes med standardparametere for å bestemme sekvenshomologi eller sekvensidentitet mellom nært beslektede polypeptider så som homologe polypeptider fra forskjellige arter eller mellom et villtypeprotein og et mutein av dette. Se for eksempel GCG vers jon 6.1. Polypeptidsekvenser kan også sammenlignes ved å bruke FASTA og ved å anvende standard eller anbefalte parametere. Et program i GCG versjon 6.1., så vil FASTA (for eksempel FASTA2 og FASTA3) gi sammenstilling og prosent sekvensidentitet i de områder hvor det er best overlapping mellom de forskjellige søkesekvensene (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132: 185-219). En annen foretrukket algoritme som sammenligner en sekvens med en database som inneholder et stort antall sekvenser fra forskjellige organismer er dataprogrammet BLAST, da spesielt blastp, som bruker standardparametere. Se for eksempel Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-402 (1997) som begge her er inkorporert som en referanse. "Tilsvarende" aminosyreposisjoner i to i alt vesentlig identiske aminosyresekvenser er de som er sammenstilt ved ethvert av de proteinanalyseprogrammer som er nevnt her, ved å bruke standardparametere.
Et "1-7F9-lignende" eller "1-4F1-lignende" antistoff slik det brukes her, betyr (1) et antistoff som i alt vesentlig binder seg til den samme epitopen som et antistoff som omfatter VH- og VL-sekvensene til henholdsvis 1-7F9 eller 1-4F1 så som for eksempel det monoklonale antistoffet 1-7F9 eller 1-4F1 henholdsvis og/eller (2) et antistoff som omfatter VH- og VL-sekvenser som er identiske eller i alt vesentlig identiske til VH- og VL-sekvensene i 1-7F9 eller 1-4F1 henholdsvis.
En "konservativ" aminosyresubstitusjon er en hvor en aminosyrerest blir substituert med en annen aminosyrerest med en sidekjede ("R-gruppe") med lignende kjemiske egenskaper (for eksempel ladning eller hydrofobisitet). Generelt så vil en konservativ aminosyresubstitusjon ikke i vesentlig grad endre proteinets funksjonelle egenskaper. I de tilfeller hvor aminosyresekvensene skiller seg fra hverandre ved konservative substitusjoner, så kan prosent sekvensidentitet justeres oppover for å korrigere den konservative typen av substitusjon. Fremgangsmåter for utførelse av slike justeringer er velkjente innen bioteknologien. Se for eksempel Pearson, Methods Mol. Biol. 1994; 243: 307-31. Eksempler på grupper av aminosyrer som har sidekjeder med lignende kjemiske egenskaper inkluderer 1) alifatiske sidekjeder: Glysin, alanin, valin, leucin og isoleucin; 2) alifatiske hydroksylsidekjeder: Serin og treonin; 3) amidholdige sidekjeder: Asparagin og glutamin; 4) aromatiske sidekjeder: Fenylalanin, tyrosin og tryptofan; 5) basiske sidekjeder: Lysin, arginin og histidin; 6) sure sidekjeder: asparginsyre og glutaminsyre; og 7) svovelholdige sidekjeder: Cystein og metionin. Eksempler på konservative aminosyresubstitusjonsgrupper inkluderer: Valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat og asparaginglutamin.
BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelsen angår et isolert antistoff eller et fragment derav som binder til hver og en av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR3DL3, men som ikke binder KIR2DS4, og som reduserer, nøytraliserer eller reverserer hemming av NK cellecytotoksisitet mediert av disse KIR2DLene.
Den foreliggende oppfinnelsen er basert på utviklingen av nye kryssreaktive og nøytraliserende antistoffer som binder seg til hemmende KIR og hvor antistoffene muliggjør effektiv aktivering av NK-celler hos de fleste individer i humane populasjoner.
Det er her for eksempel beskrevet antistoffer som binder seg til alle av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 og forsterker NK-cellelytisk aktivitet ved å blokkere interaksjoner mellom disse KIR og HLA-C. Slike antistoffer er her betegnet som "kryssreaktive og nøytraliserende anti-KIR mAb'er".
I et spesielt aspekt angår oppfinnelsen nye kryssreaktive, nøytraliserende eller både kryssreagerende og nøytraliserende, fullhumane anti-KIR-antistoffer så vel som sammensetninger som omfatter slike antistoffer, foruten fremgangsmåter for anvendelse av slike antistoffer eller sammensetninger. Disse antistoffene inkluderer humane antistoffer 1-7F9 og 1-4F1 som er beskrevet i PCT/DK2004/000470, innsendt 1. juli 2004, og som her er inkorporert som en referanse i sin helhet.
Antistoffer, sammensetninger og fremgangsmåter som er beskrevet her, vil blant annet unngå de for tiden herskende begrensninger som er assosiert med terapeutisk modulering av KIR og med terapeutisk NK-celleaktivering, og derved tilveiebringe ytterligere fordelaktige egenskaper og fordeler. For eksempel kan antistoffene kryssreagere med multiple hemmende KIR og nøytralisere eller redusere deres hemmende signaler, noe som resulterer i en forsterkning av NK-cellecytotoksisitet av NK-celler som uttrykker slike hemmende KIR-reseptorer. Evnen til å kryssreagere med multiple KIR-genprodukter vil gjøre at antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen effektivt kan brukes for å forsterke eller øke NK-celleaktivitet hos de fleste eller hos alle mennesker, uten bryet eller utgiftene med å forutbestemme pasientens KIR- eller HLA-type. I en utførelse så binder antistoffene seg ikke til KIR2DS4, noe som gjør at man unngår en reduksjon av det stimulerende potensialet som ville være assosiert med nøytralisering av den aktiverende KIR2DS4-reseptoren. Ytterligere eller alternativt så binder antistoffene ikke KIR3DS3.
Fra slike antistoffer kan det også utvikles forskjellige antistoffragmenter og derivater som kan brukes for de samme eller lignende formål som beskrevet her med hensyn til antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen og at de aspekter ved oppfinnelsen som er beskrevet med hensyn til antistoffene kan også anvendes på lignende måte for antistoffragmenter og derivater hvis intet annet er angitt eller klart motsies av sammenhengen. Med andre ord, en egenskap ved den foreliggende oppfinnelsen slik det er beskrevet her med hensyn til et antistoff, bør således hvis intet annet er angitt, også implisitt være underforstått at det også beskriver et lignende trekk med hensyn til et antistoffragment eller derivat med lignende funksjonalitet med hensyn til spesifisitet. Det skal imidlertid understrekes at "fullengde"-antistoffer og antistoff-"fragmenter" kan være karakterisert som distinkte aspekter av oppfinnelsen, ettersom deres biologiske og fysiokjemiske egenskaper kan skille seg signifikant.
Enkelte antistoffer ifølge oppfinnelsen kan være karakterisert som "humane", noe som gjør at de typisk er assosiert med en mindre risiko for en immunrespons mot antistoffene hos en human pasient til hvilke de blir administrert. I et eksempel på et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er det beskrevet et isolert antistoff som letter aktiveringen av humane NK-celler hos så å si alle mennesker. I et eksempel på en utførelse, er antistoffet det humane antistoffet 1-7F9 eller et humant 1-7F9-lignende antistoff.
Antistoffer, fragmenter eller derivater av disse kan kryssreagere med minst to hemmende KIR-reseptorer på overflaten av NK-celler og derved redusere eller nøytralisere de hemmende signalene til NK-cellene og forsterke aktiviteten til NK-cellene. For eksempel kan et antistoff, antistoffragment eller derivat binde en vanlig determinant i humane KIR2DL-reseptorer, slik at antistoffet, antistoffragmentet eller derivatet binder minst KIR2DL1-, KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorer. For det foreliggende formål, så refererer således begrepet "KIR2DL2/3" til enten en av dem eller begge KIR2DL2- og KIR2DL3-reseptorene.
Slik det er beskrevet her, så har anti-KIR mAb'ene 1-7F9 og 1-4F1 flere fordeler fremfor tidligere produserte anti-KIR-antistoffer. For eksempel er 1-7F9 og 1-4F1 helhumane, noe som reduserer eller minimaliserer risikoen for en immunrespons mot antistoffet når så snart dette er administrert en pasient. Videre er både 1-7F9 og 1-4F1 og egnede isotyper for terapeutiske anti-KIR-antistoffer (IgG4 og IgG2 henholdsvis) slik dette er beskrevet i det etterfølgende. 1-7F9 er også mer effektiv for å indusere avliving av NK-celler som uttrykker enten KIR2DL1, -2 og/eller -3 enn de murine mAb'ene EB6, GL183, DF200 og NKVSF1 (Pan2D). Slik det for eksempel er vist på figurene 5 og 6, så induserte 1-7F9 høyere nivåer med hensyn til spesifikk oppløsning av KIR2DL1-uttrykkende NK-celler blant målceller som uttrykte HLA-Cw4 enn det som var tilfellet med EB6, DF200 eller NKVSF1 (Pan2D). 1-7F9 hadde videre en høyere affinitet for KIR sammenlignet med tidligere kjente anti-KIR mAb'er. For eksempel binder 1-7F9 seg til KIR2DL1 og KIR2DL3 med dissosiasjonskonstanter (Kd'er) på 0,43 nM og 0,025 nM henholdsvis, noe som representerer høyere affinitet for begge antigenere enn for eksempel DF200 (se eksemplene 3 og 8). I motsetning til de murine antistoffene NKVSF1 (Pan2D), A210 og A208g, så binder ingen av 1-7F9 og 1-4F1 seg til KIR2DS4, noe som gjør dem bedre egnet for terapeutiske formål. Lik NKVSF1 (Pan2D) og DF200, så binder 1-7F9 og 1-4F1 seg også til KIR2DS1 og KIR2DS2, men de sistnevnte er antatt ikke å være særlig viktige med hensyn til antileukemieffekt. Spesielle antistoffer ifølge oppfinnelsen har derfor den eller de samme eller lignende antigenspesifisiteter som 1-7F9 og/eller 1-4F1. For eksempel vil antistoffer som omfatter de samme eller lignende VH- og VL-områder som 17F9 ha de samme eller lignende antigenbindende og/eller NK-stimulerende egenskaper som 1-7F9, mens antistoffer som omfatter de samme eller lignende VH-og VL-områder som 1-4F1 kan ha de samme eller lignende antigenbindende egenskaper som 1-4F1.
Som vist på figur 14, så er aminosyresekvensene for VL- og VH-områdene i 1-7F9 blitt bestemt:
1-7F9 VL-område (SEKV.ID. NR. 15):
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEI KRT
1-7F9 VH-område (SEKV.ID. NR. 17):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGF IPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSY YYDYDMDVWGQGTTVTVSS
Aminosyresekvensene for 1-4F1 VL- og VH-områdene er gitt i SEKV.ID. NR. 39 og 41 henholdsvis, og de nukleotidsekvensene som koder 1-4F1 VL- og VH-områdene er gitt i SEKV.ID. NR. 40 og 42 henholdsvis. I en spesiell utførelse er restene 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 og 74 i SEKV.ID. NR. 39 Q, L, S, R, A, G, L, D, E, F og A henholdsvis. I en annen spesiell utførelse er restene 3, 4, 9, 24, 32, 41, 47, 50, 55, 71 og 74 i SEKV.ID. NR. 39 R, M, F, W, Y, A, F, Y, Q, Y og T henholdsvis.
Som vist på figur 15, så er aminosyresekvensene for de nevnte 1-7F9 CDR blitt identifisert som følger: Lettkjede CDR1-aminosyresekvensen tilsvarer restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15; lettkjede CDR2-aminosyresekvensen tilsvarer restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15; lettkjede CDR3-aminosyresekvensen tilsvarer restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15; tungkjede CDR1-aminosyresekvensen tilsvarer restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17; tungkjede CDR2-aminosyresekvensen tilsvarer restene 50-65 SEKV.ID. NR. 17; og tungkjede CDR3-aminosyresekvensen tilsvarer restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17. Aminosyresekvensene for nevnte 1-4F1 CDR er blitt identifisert som følger: Lettkjede CDR1-aminosyresekvensen tilsvarer restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 39; lettkjede CDR2-aminosyresekvensen tilsvarer restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 39; lettkjede CDR3-aminosyresekvensen tilsvarer restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 39; tungkjede CDR1-aminosyresekvensen tilsvarer restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 41; tungkjede CDR2-aminosyresekvensen tilsvarer restene 50-66 i SEKV.ID. NR. 41; og tungkjede CDR3-aminosyresekvensen tilsvarer restene 99-113 i SEKV.ID. NR. 41.
Aminosyresekvensene for hele de 1-7F9 lette og tunge kjedene er gitt i SEKV.ID. NR. 36 og 37 henholdsvis.
Ytterligere antistoffer, for eksempel forskjellige humane antistoffunderklasser; antistoffragmenter, antistoffderivater og andre KIR-bindende peptider, kan følgelig lett fremstilles, for eksempel ved rekombinante teknikker basert på denne informasjonen. I et eksempel så tilveiebringer oppfinnelsen i ett aspekt et antistoff med en VL- og en VH-sekvens som i alt vesentlig består av SEKV.ID. NR. 15 og SEKV.ID. NR. 17 henholdsvis og/eller et antistoff med en VL- og en VH-sekvens som i alt vesentlig består av SEKV.ID. NR. 39 og SEKV.ID. NR. 41 henholdsvis. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter CDR-områder som i alt vesentlig består av 1-7F9 eller 1-4F1 VH CDR1-3 og VL CDR1-3 som beskrevet ovenfor. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter CDR-områder som følger: En lettkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15; en lettkjede CDR2-aminosyresekvensen som tilsvarer omtrent restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15; en lettkjede CDR3-aminosyresekvensen som tilsvarer omtrent restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15; en tungkjede CDR1-aminosyresekvensen som tilsvarer omtrent restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17; en tungkjede CDR2-aminosyresekvensen som tilsvarer omtrent restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17; og en tungkjede CDR3-aminosyresekvensen som tilsvarer omtrent restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter CDR-områder som følger: En lettkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 39; en lettkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 39; og en lettkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 39; en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 41; en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 41; og en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer omtrent restene 99-113 i SEKV.ID. NR. 41. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter en lettkjede CDR1-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15; en lettkjede CDR2-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15; en lettkjede CDR3-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15; en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17; en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17; og en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som omfatter CDR-områder som følger: En lettkjede CDR1-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 39; en lettkjede CDR2-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 39; og en lettkjede CDR3-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 39; en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 41; en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 41; og en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som i alt vesentlig består av restene 99-113 i SEKV.ID. NR. 41.
Oppfinnelsen omfatter også et anti-KIR-antistoff, antistoffragment eller antistoffderivat eller et KIR-bindende polypeptid som omfatter minst én variantaminosyresekvens som i alt vesentlig er identisk med 1-7F9 eller 1-4F1 VH-eller VL-sekvens eller til et CDR-område i disse. En variantaminosyresekvens kan omfatte eller i alt vesentlig bestå av en aminosyresekvens som er minst 50, 80, 90, 95, 98 eller 99 (for eksempel omtrent 50-99, omtrent 65-99, omtrent 75-99 eller omtrent 85-99) prosent identisk med 1-7F9 eller 1-4F1 CDR, VH- eller VL-område. En variantaminosyresekvens kan også eller alternativt omfatte 1, 2 eller 3 CDRer som omfatter eller består av aminosyresekvenser som er minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identiske med 1-7F9 eller 1-4F1 CDRer. I ett aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen et humant antistoff som omfatter en lettkjede CDR1-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15 eller SEKV.ID. NR. 39; en lettkjede CDR2-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15 eller SEKV.ID. NR. 39; en lettkjede CDR3-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15 eller SEKV.ID. NR. 39; en tungkjede CDR1-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17 eller SEKV.ID. NR. 41; en tungkjede CDR2-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17 eller til restene 50-66 i SEKV.ID. NR. 41; en tungkjede CDR3-aminosyresekvens med minst omtrent 80%, minst omtrent 90% eller minst omtrent 95% identitet med restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17 eller til restene 99-113 SEKV.ID. NR. 41. De grunnleggende egenskapene for 1-7F9- eller 1-4F1-avledede KIR-bindende aminosyresekvenser er beholdt i slike variante aminosyresekvenser og inkluderer fortrinnsvis og ønskelig spesifisiteten og/eller aviditeten til 1-7F9- eller 1-4F1-sekvenser for en eller flere KIRer, eller kan også eller alternativt inkludere evnen til 1-7F9 til å blokkere en KIR/HLA-C-interaksjon og forsterke den lytiske aktiviteten til NK-celler.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et anti-KIR-antistoff, antistoffragment eller antistoffderivat eller et KIR-bindende polypeptid som omfatter en KIR-bindende aminosyresekvens som skiller seg fra en 1-7F9 eller 1-4F1 KIR-bindende sekvens i en eller flere aminosyrerester (for eksempel minst 2, 3, 5, minst omtrent 10, minst omtrent 15, minst omtrent 20, minst omtrent 25, minst omtrent 30, minst omtrent 35, minst omtrent 40, minst omtrent 50 eller flere aminosyrerester) ved en eller flere restinnsettinger, -delesjoner og/eller -substitusjoner. I en slik utførelse vil en slik variant KIR-bindende sekvens gi større affinitet; større eller annen type spesifisitet; mindre immunogenisitet (med hensyn til vertsrespons til sekvensen); større in vivo stabilitet; og/eller andre fordelaktige effekter i den variante sekvensen i forhold til en i alt vesentlig identisk aminosyresekvens som omfatter den native eller naturlige 1-7F9- eller 1-4F1-sekvensen. Egnede sekvensvariasjoner er ytterligere beskrevet i det etterfølgende. En KIR-bindende del av et anti-KIR-antistoff, antistoffragment eller antistoffderivat eller et KIR-bindende polypeptid kan også omfatte ethvert egnet antall ikke-aminosyrekomponenter eller substitusjoner så som ikke-aminosyre organiske grupper som letter KIR-binding og/eller tilveiebringer andre fordelaktige fysiokjemiske eller immunologiske egenskaper.
Enkelte antistoffer ifølge oppfinnelsen kan også eller alternativt være karakterisert ved sin bindende affinitet til en eller flere KIR. For eksempel som vist i eksemplene 3 og 8, så har når det gjelder bivalent binding DF200 en Kdfor KIR2DL1 på omtrent 11 nM og en Kdfor KIR2DL3 på omtrent 2,0 nM og 1-7F9 har en Kdfor KIR2DL1 på omtrent 0,43 nM og en Kdfor KIR2DL3 på omtrent 0,025 nM. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer følgelig i ett aspekt humane eller ikkehumane (for eksempel murine, kimære eller humaniserte) antistoffer med en Kdi bivalent binding til KIR2DL1 på ikke mer enn omtrent 20 nM, ikke mer enn omtrent 11 nM, ikke mer enn omtrent 5 nM, ikke mer enn omtrent 1 nM, ikke mer enn omtrent 0,5 nM eller ikke mer enn omtrent 0,43 nM. I tillegg eller alternativt kan de humane eller ikke-humane (for eksempel murine, kimære eller humaniserte) antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen ha en Kdfor KIR2DL3 på ikke mer enn omtrent 20 nM, ikke mer enn omtrent 2 nM, ikke mer enn omtrent 1 nM, ikke mer enn omtrent 0,1 nM, ikke mer enn omtrent 0,05 nM eller ikke mer enn omtrent 0,025 nM. I et spesielt aspekt har antistoffene omtrent de samme Kd-verdier for bivalent binding til KIR2DL1 og KIR2DL3 som 1-7F9. Som vist i eksempel 13 når det monovalent binding, så har 1-7F9 og 1-4F1 Kd-verdier for KIR2DL3 på omtrent 3,5 og 7 nM henholdsvis. I ett aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen humane eller ikke-humane (for eksempel murine, kimære eller humaniserte) antistoffer med en Kdi monovalent binding til KIR2DL3 på ikke mer enn omtrent 20 nM, ikke mer enn omtrent 10 nM, ikke mer enn omtrent 7 nM eller ikke mer enn omtrent 3,5 nM.
Et anti-KIR-antistoff, antistoffragment eller antistoffderivat eller et KIR-bindende polypeptid binder seg selektivt og/eller spesifikt (typisk spesifikt) til minst ett KIR og mer spesielt et antigent determinantområde eller epitop i minst én KIR, under passende betingelser (for eksempel med hensyn til temperatur, pH, osv., som typisk vil tilsvare humane fysiologiske betingelser i en normal eller en NK-celleassosiert sykdomstilstand og i sammenheng med et egnet protein som omfatter sekvensen eller kombinasjonen). I ett aspekt angår oppfinnelsen for eksempel antistoffer som kan være karakterisert ved (blant andre ting) evnen til å konkurrere med 1-7F9-, 1-4F1- eller et 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoff og forskjellige fremgangsmåter som involverer samme. Andre antistoffer ifølge oppfinnelsen (og/eller som brukes ved praktisk gjennomføring av de fremgangsmåter som er beskrevet her) kan også alternativt karakteriseres ved sin evne til å konkurrere med ett eller flere av antistoffene DF200, NKVSF1, EB6 og GL183.
De kryssreaktive og nøytraliserende anti-KIR-antistoffene, antistoffragmentene eller derivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserer eller nøytraliserer den hemmende aktiviteten til KIR ved spesifikt å binde MHC og/eller HLA-molekyler til minst to hemmende KIR-reseptorer og lette NK-celleaktivitet, noe som betyr at slike antistoffer, fragmenter og derivater gjør det mulig for NK-celler å uttrykke en hemmende KIR-reseptor på sin overflate som er i stand til å oppløse celler som uttrykker en tilsvarende HLA-ligand for den spesielle hemmende KIR-reseptoren (for eksempel et spesielt HLA-antigen). I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som spesifikt hemmer bindingen av HLA-C-molekyler til KIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptoren. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som hemmer bindingen av KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3 til HLA-C. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som letter NK-celleaktivitet in vivo og/eller in vitro.
Minst én av KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 er tilstede i minst 90% eller mer av verdens befolkning og de mer foretrukne antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen er i stand til å forsterke aktiviteten til NK-celler som uttrykker enten en av dem eller begge de nevnte KIR. Sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan således brukes for effektivt å aktivere eller forsterke NK-celler hos de fleste mennesker, typisk i omtrent 90% eller mer av enhver befolkning. En enkelt antistoffsammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan følgelig brukes for å behandle de fleste mennesker og det er sjelden behov for å bestemme KIR-eller HLA-alleliske grupper eller å bruke blandinger eller cocktailer av to eller flere av anti-KIR-mAb'er.
I ett aspekt så binder antistoffet spesifikt både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer og reverserer hemming av NK-cellecytotoksisitet som er mediert eller kontrollert av disse KIR. Antistoffet kan også være humant og konkurrere med det monoklonale antistoffet 1-7F9 og/eller 1-4F1. Begrepet "konkurrere med" når det refererer seg til et spesielt par av antistoffer (for eksempel ett eller flere antistoffer valgt fra DF200, NKVSF1 (Pan2D), 1-7F9, EB6 og GL183), betyr at et første antistoff påvisbart konkurrerer med et andre antistoff (eller et annet molekyl) i en bindingsprøve hvor det anvendes enten rekombinante KIR-molekyler eller celleoverflateuttrykte KIR-molekyler. For eksempel i ett aspekt hvor prosentene med hensyn til hemming for et visst antistoffpar er over omtrent 20%, over omtrent 30%, over omtrent 40%, over omtrent 50%, uansett hvilket antistoff som brukes som første antistoff, så vil antistoffene konkurrere. Alternativt, hvis prosenten med hensyn til hemming for et visst antistoffpar i gjennomsnitt er minst omtrent 29%, minst omtrent 30%, minst omtrent 40% eller minst omtrent 50%, så vil antistoffene konkurrere. Prosent hemming for et andre antistoff for binding til KIR2D-protein av et første antistoff kan beregnes som 100*(1-(påvist binding av andre antistoff)/(påvist binding av første antistoff)). Det samme gjelder antistoffragmenter og antistoffderivater. Hvis intet annet er angitt, så vil et antistoff som "konkur rerer" med 1-7F9, 1-4F1 eller et 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoff kunne konkurrere med 1-7F9, 1-4F1 eller det 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoffet for binding til humant KIR2DL1, humant KIR2DL2/3 eller både humant KIR2DL1 og KIR2DL2/3. For eksempel vil antistoffet DF200 konkurrere med 1-7F9 og 1-4F1 for binding til KIR2DL3.
Eventuelt kan et antistoff som konkurrerer med 1-7F9 eller 1-4F1 være forskjellig fra 1-7F9 eller 1-4F1 henholdsvis (det vil si at oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som er forskjellige fra 1-7F9 og 1-4F1 og som blant annet er karakterisert ved sin evne til å konkurrere med 1-7F9 og/eller 1-4F1 for binding til en eller begge av de nevnte KIR).
I et annet aspekt så binder antistoffet både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer og reduserer eller nøytraliserer eller reverserer hemming av NK-cellecytotoksisitet som er mediert av disse KIR og konkurrerer med 1-7F9 for binding til den KIR2DL1-humane reseptoren, den KIR2DL2/3-humane reseptoren eller begge disse reseptorene. Eventuelt kan nevnte antistoff være kimært, humant eller et humanisert antistoff.
I et annet aspekt så binder antistoffet både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 humane reseptorer, reduserer, nøytraliserer eller reverserer hemmingen av NK-cellecytotoksisitet som er mediert av disse KIR og konkurrerer med EB6 for binding til den KIR2DL1-humane reseptoren eller konkurrerer med GL183 og/eller DF200 for binding til den KIR2DL2/3-humane reseptoren; eller konkurrerer med både EB6 for binding til den KIR2DL1-humane reseptoren og GL183 og/eller DF200 for binding til den KIR2DL2/3-humane reseptoren. I en utførelse er antistoffet ikke NKVSF1 (Pan2D), ikke A210, ikke A803g og/eller ikke DF200. Antistoffet kan for eksempel være et murint, kimært, humant eller humanisert antistoff.
I et annet aspekt så omfatter antistoffet VH-, VL- eller begge VH- og VL-områdene som i alt vesentlig er identisk med VH- og/eller VL-områdene i 1-7F9 eller 1-4F1. Antistoffet kan være av enhver underklasse og inkluderer IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4. I et spesielt aspekt er antistoffet et humant IgG4-antistoff. I et annet spesielt aspekt er antistoffet et humant IgG2-antistoff. Antistoffet kan været et kimært, humant eller humanisert antistoff.
I et annet aspekt er antistoffet humant og konkurrerer med 1-7F9 eller 1-4F1 og gjenkjenner binding til, eller har immunspesifisitet for i det minste delvis den samme eller den samme epitopen eller "epitopisk sete" på et KIR-molekyl som det monoklonale antistoffet 1-7F9 eller 1-4F1. Det er foretrukket at nevnte KIR-molekyl er en human KIR2DL1- eller KIR2DL2/3-reseptor.
I et annet aspekt binder antistoffet en felles determinant som er tilstede på begge KIR2DL1- og KIR2DL2/3-humane reseptorer og reduserer, nøytraliserer eller reverserer hemming av NK-cellecytotoksisitet som er mediert eller kontrollert av disse KIR. Antistoffet kan mer spesifikt binde i det minste delvis den samme, i alt vesentlig den samme eller den samme epitopen på KIR som det monoklonale antistoffet 1-7F9.
I et spesielt aspekt er antistoffet et monoklonalt antistoff som har en eller flere av de ovenfor beskrevne karakteristika.
I et annet aspekt kan funksjonelle fragmenter og derivater av de antistoffer som her er beskrevet fremstilles slik at de i alt vesentlig har lignende antigenbinding, spesifisitet og/eller aktivitet og inkluderer, uten begrensning, Fab-fragmenter, Fab'2-fragmenter, immunadhesiner, dialegemer, cameliserte antistoffer, Janusiner, minilegemer, CDRer og ScFv-fragmenter.
Hvis intet annet er angitt, så er antistoffer eller bivalente fragmenter eller derivater av disse monospesifikke, det vil si at begge "armene" til antistoffene, fragmentene eller derivatene binder det eller de samme antigenene.
I et ytterligere aspekt er det mulig å fremstille antistoffderivater som omfatter et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin, et radionuklide, en påvisbar gruppe (for eksempel et fluoratom) eller et fast underlag.
Oppfinnelsen omfatter også farmasøytiske sammensetninger som inneholder et antistoff som beskrevet ovenfor, et fragment av dette eller et derivat av det eller begge deler. Oppfinnelsen angår følgelig også bruken av et antistoff som beskrevet her i en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament. I foretrukne utførelser er medikamentet eller den farmasøytiske sammensetningen tenkt brukt for behandlingen av kreft eller andre proliferative lidelser, en infeksjon eller ved bruk ved transplantasjon.
I ett aspekt angår oppfinnelsen en sammensetning (for eksempel en sammensetning formulert for farmasøytisk administrering, et sett for fremstilling av en slik sammensetning, et prøvesett eller et medium, rensemedium, osv.) som omfatter et antistoff som binder minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter og som er i stand til å nøytralisere KIR-mediert hemmende cytotoksisitet av NK-celler som uttrykker minst én av de to nevnte forskjellige humane hemmende KIR-reseptorer og hvor antistoffet er inkorporert i et liposom. Liposomet kan også omfatte et ytterligere stoff så som for eksempel et nukleinsyremolekyl for levering av gener i genterapi; et nukleinsyremolekyl for levering av antisens RNA, RNAi eller siRNA for å undertrykke et gen i en NK-celle; eller et toksin eller et medikament som er måltilpasset for avlivning av NK-celler.
Det er her også beskrevet fremgangsmåter for å regulere human NK-celleaktivitet in vitro, ex vivo eller in vivo som omfatter å kontakte humane NK-celler med en effektiv mengde av et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen, et fragment av et slikt antistoff, et derivat eller begge deler, eller en farmasøytisk sammensetning som omfatter minst en av de nevnte. Foretrukne fremgangsmåter omfatter å administrere en effektiv mengde av en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen som vil forsterke eller øke den cytotoksiske aktiviteten for humane NK-celler, mest foretrukket ex vivo eller in vivo, i en pasient som har en kreftsykdom, en infeksjonssykdom eller en immunsykdom. For eksempel kan administreringen gjennomføres ved intravenøs infusjon av antistoffet i en egnet buffer til en pasient med kreft eller en infeksjonssykdom (så som en viral sykdom).
Oppfinnelsen tilveiebringer også en sammensetning som omfatter et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter hvor antistoffet er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i NK-celler som uttrykker minst én av de to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorene og hvor antistoffet er tilstede i en mengde som effektivt påvisbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler; og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Det er foretrukket at antistoffet binder seg til en felles determinant som er tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Sammensetninger som omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen kan eventuelt også omfatte et andre terapeutisk middel (et middel som induserer, fremmer og/eller forbedrer en terapeutisk effekt i en vert som er beslektet med en tilstand eller en lidelse for hvilken antistoffet er administrert, for eksempel en tilstand som er relatert til kreft, transplantasjon, en infeksjonssykdom, en viral infeksjonssykdom, osv.). I ett aspekt kan et andre terapeutisk middel administreres sammen med et antistoff ifølge oppfinnelsen slik at nevnte andre terapeutiske middel i en slik kombinert sammensetning kan velges fra for eksempel et immunmodulerende middel, et hormonelt middel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som er spesifikt for ikke-KIR-antigen, et eventuelt andre antistoff som binder seg til og hemmer og nøytraliserer et hemmende KIR, eller reduserer signaliseringen fra et hemmende KIR, et antiinfeksjonsmiddel, et målsøkende middel eller en tilhørende forbindel se. Fordelaktige immunmodulerende midler kan velges fra IL-1alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta eller IFN-gamma. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, daunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksoter, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin, kombretastatin(er) og andre vinkaalkyloider og derivater eller formedikamenter av disse. Eksempler på hormonelle midler inkluderer leuprorelin, goserelin, triptorelin, buserelin, tamoksifen, toremifen, flutamid, nilutamid, cyproteronbikalutamidanastrozol, eksemestan, letrozol, fadrozolmedroksy, klormadinon, megestrol andre LHRH-agonister, andre antiøstrogener, andre antiandrogener, andre aromatasehemmere og andre progestagener. Nevnte andre antistoff som binder seg til og hemmer en hemmende KIR-reseptor er fortrinnsvis et antistoff eller et derivat eller fragment av dette som binder seg til en epitop ved en hemmende KIR-reseptor som er forskjellig fra den epitopen som bindes av antistoffet som binder en felles determinant som er tilstede på minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter. I et annet aspekt kan et andre antistoff være rettet inn mot et mål som er assosiert med sykdomstilstanden som i det minste delvis lar seg behandle ved administrering av antistoffet ifølge oppfinnelsen (for eksempel et kreftassosiert antigen, en virusinfeksjonsassosiert antigen, osv.).
Videre er det beskrevet heri en fremgangsmåte for påvisbart å forsterke NK-celleaktivitet i en pasient som har behov for dette som omfatter et trinn hvor pasienten administreres en sammensetning ifølge oppfinnelsen. En pasient som har behov for NK-celleaktivitetsforsterkning kan være enhver pasient som er diagnostisert med en sykdom eller lidelse hvor en slik forsterkning kan fremme, forbedre og/eller indusere en terapeutisk effekt (eller fremmer, forbedrer og/eller induserer en slik effekt i det minste i en vesentlig andel av pasientene med sykdommen eller lidelsen og som i alt vesentlig har lignende karakteristika som pasienten og som kan bestemmes ved for eksempel kliniske forsøk). En pasient som har behov for en slik behandling kan for eksempel lide av kreft, en annen proliferativ lidelse, en infeksjonssykdom eller en immunlidelse. Fremgangsmåten omfatter fortrinnsvis et ytterligere trinn for å administrere pasienten et passende ytterligere terapeutisk middel valgt fra et immunmodulerende middel, et hormonelt middel, et kjemoterapeutisk middel, et antiangiogent middel, et apoptotisk middel, et andre antistoff som er spesifikt for et antigen som er forskjellig fra KIR, eventuelt et andre antistoff som binder seg til og hemmer og nøytraliserer en hemmende KIR-reseptor eller reduserer signaliseringen fra et hemmende KIR, et antiinfiserende middel, et målsøkende middel eller en tilhørende forbindelse hvor nevnte ytterligere terapeutiske middel blir administrert nevnte pasient som en enkeltdoseform sammen med nevnte antistoff eller som separate doseringsformer. Dosen av antistoffet (eller antistoffragmentet/derivatet) og dosen av nevnte ytterligere terapeutiske middel bør kollektivt være tilstrekkelig til at man påvisbart kan indusere, fremme og/eller forbedre en terapeutisk respons i pasienten og hvor nevnte respons omfatter forsterkningen av NK-celleaktivitet. Ved separat administrering bør antistoffet, fragmentet eller derivatet av dette og nevnte ytterligere terapeutiske middel fortrinnsvis og ønskelig administreres under betingelser (for eksempel med hensyn til tidspunktet, antallet doser, osv.) som resulterer i en påvisbar samlet terapeutisk fordel for pasienten.
Den foreliggende oppfinnelsen omfatter videre antistoffer som er i stand til spesifikt å binde NK-celler og/eller KIR-reseptorer i en ikke-human primat, fortrinnsvis en ape. Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåter for å bedømme toksisiteten, dosen og/eller aktiviteten eller effekten av antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen som er kandidatmedikamenter. I ett aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bestemme en dose av et antistoff som er toksisk for et dyr eller et målvev ved å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til en mottakende ikkehuman primat med NK-celler og så bedømme eventuelle toksiske eller skadelige effekter middelet på dyret, fortrinnsvis i et målvev. I et annet aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er toksisk for et dyr eller et målvev ved å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til en mottakende ikke-human primat med NK-celler og så bedømme eventuelle toksiske eller skadelige effekter av middelet på dyret eller fortrinnsvis i et målvev. I et annet aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere et antistoff som er effektivt for behandling av en infeksjon, sykdom eller tumor ved å administrere et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen til en ikke-human primatmodell på infeksjon, sykdom eller kreft og så identifisere antistoffet som lindrer infeksjonen, sykdommen eller nevnte kreft eller et symptom på disse. I en utførelse er nevnte antistoff ifølge oppfinnelsen et antistoff som (a) kryssreagerer med minst to hemmende humane KIR-reseptorer på overflaten av humane NK-celler og (b) kryssreagerer med NK-celler eller en KIR-reseptor i nevnte ikke-humane primat.
Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for å påvise nærværet av NK-celler som bærer en hemmende KIR på sin celleoverflate i en biologisk prøve eller en levende organisme og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinn:
a) kontakte nevnte biologiske prøve eller levende organisme med et antistoff ifølge oppfinnelsen hvor nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet til en påvisbar gruppe; og
b) påvise nærværet av nevnte antistoff i nevnte biologiske prøve eller levende organisme.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å rense fra en prøve NK-celler som bærer en hemmende KIR på sin celleoverflate og hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinn:
a) kontakte nevnte prøve med et antistoff ifølge oppfinnelsen under betingelser som gjør det mulig for nevnte NK-celler som bærer en hemmende KIR på sin celleoverflate å binde seg til nevnte antistoff, hvor nevnte antistoff er konjugert eller kovalent bundet til et fast underlag (for eksempel en perle, en matrise, osv.); og
b) eluere nevnte bundne NK-celler fra nevnte antistoff konjugert eller kovalent bundet til et fast underlag.
Man har også funnet at antistoffet NKVSF1 (Pan2D) også binder seg til NK-celler fra cynomolgusaper, se figur 10.
Det er derfor beskrevet et antistoff så vel som fragmenter og derivater av dette hvor nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med minst to hemmende humane KIR-reseptorer på overflaten av humane NK-celler og som ytterligere binder seg til NK-celler fra cynomolgusaper. I en utførelse av oppfinnelsen er antistoffet ikke antistoffet NKVSF1, ikke A210 og/eller ikke A802g. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å teste toksisiteten for et antistoff så vel som fragmenter og derivater av dette hvor nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med minst to hemmende humane KIR-reseptorer på overflaten av humane NK-celler hvor fremgangsmåten omfatter å teste antistoffet i en cynomolgusape.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av en av disse som omfatter det lettkjedevariable området eller ett eller flere lette variable områder CDRer fra antistoff 1-7F9 eller 1-4F1. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av en av disse som omfatter en sekvens som er svært lik alle eller i alt vesentlig alle de lettkjedevariable områdesekvensene fra 1-7F9 eller 1-4F1.
I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av en av disse som omfatter det tungkjedevariable området eller ett eller flere lette variable områder CDRer fra antistoff 1-7F9 eller 1-4F1. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff, antistoffragment eller derivat av en av disse som omfatter en sekvens som er svært lik alle eller i alt vesentlig alle de tungkjedevariable områdesekvensene fra 1-7F9 eller 1-4F1.
Antistoffer
Den foreliggende beskrivelsen tilveiebringer nye antistoffer og fragmenter eller derivater av disse som binder seg til felles determinanter som er konservert blant humane hemmende KIR-reseptorer og som fortrinnsvis inkluderer en determinant som er tilstede på minst to forskjellige KIR2DL-genprodukter, men ikke på KIR2DS4 og som frembringer en forsterkning av NK-celler som uttrykker minst én av disse KIR-reseptorene. Oppfinnelsen beskriver for første gang at slike kryssreagerende og nøytraliserende antistoffer kan fremstilles og effektivt brukes ved modulering av NK-celleaktivitet, noe som representerer et uventet resultat og åpner for store muligheter med hensyn til nye og effektive NK-baserte terapier, da spesielt for mennesker.
I den foreliggende sammenhengen betegner en "felles determinant" en determinant eller epitop som er felles for flere genprodukter fra de humane hemmende KIR-reseptorene. Den felles determinanten er fortrinnsvis felles for minst to reseptorer fra KIR2DL-gruppen. Mer foretrukket er det at determinanten er felles for minst KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Visse antistoffer ifølge oppfinnelsen kan i tillegg til å gjenkjenne multiple genprodukter av KIR2DL-typen også gjenkjenne determinanter som er tilstede på andre hemmende KIRer så som genproduktet fra KIR3DL-reseptorgruppen, for eksempel KIR3DL1 og/eller KIR3DL2. Determinanten eller epitopen kan representere et peptidfragment eller en konformell epitop som er felles for nevnte reseptorer. I en mer spesifikk utførelse så binder antistoffet seg ifølge oppfinnelsen spesifikt til i alt vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av det monoklonale antistoffet DF200. Denne determinanten er tilstede både på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. I en annen foretrukket utførelse binder antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen seg spesifikt til i alt vesentlig den samme epitopen som gjenkjennes av det humane mAb 1-7F9 eller den epitopen som gjenkjennes av det humane mAb 1-4F1, og hvor nevnte epitoper er tilstede på KIR2DL1, -2 og -3, men ikke på KIR2DS4.
Med begrepet "antistoffer" slik det brukes her, forstås polyklonale og monoklonale antistoffer så vel som fragmenter og derivater av nevnte polyklonale og monoklonale antistoffer, hvis intet annet klart er angitt eller klart er motsagt av sammenhengen. Avhengig av typen på det konstante domenet i de tunge kjedene, så vil fullengde antistoffer typisk være tilskrevet eller angitt i forhold til en av de fem hovedklassene: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Flere av disse er ytterligere oppdelt i underklasser eller isotyper så som IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 og lignende. De tungkjedekonstante domenene som tilsvarer de forskjellige klassene av immunglobuliner er henholdsvis betegnet "alfa", "delta", "epsilon", "gamma" og "my". Underenhetsstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene på de forskjellige klassene av immunglobuliner er velkjente. IgG og/eller IgM er de foretrukne klasser for antistoffer som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelsen, ettersom de er de mest vanlige antistoffene i den fysiologiske situasjonen og fordi at de er de letteste å fremstille under laboratoriebetingelser. Typisk vil et "antistoff" i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen referere seg til et monoklonalt antistoff, mer foretrukket et "humant" monoklonalt antistoff.
En utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å blokkere interaksjonen mellom et hemmende KIR og dens tilsvarende HLA-ligand in vivo for terapeutiske formål som innbefatter aktivering av endogene NK-celler. Under slike omstendigheter vil det være fordelaktig å unngå en fjerning av NK-celler, ettersom slike fraværende NK-celler da ikke vil kunne utøve sine terapeutisk fordelaktige effekter. Antistoff isotyper så som IgG4 og IgG2 som viser lite binding til Fcreseptorer og følgelig ikke vil aktivere komplementsystemet, vil derfor typisk være foretrukket. Isotypen av 1-7F9 er IgG4. IgG2-antistoffer er også generelt ansett for å være ikke-fjernende og vil ofte være mer stabile molekyler enn IgG4-antistoffer og vil derfor bidra til et lengre halvliv in vivo. 1-4F1 er av IgG2-isotypen.
Antistoffproduksjon
Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av en rekke teknikker som er velkjente inne molekylærbiologien. Typisk vil de bli fremstilt ved å immunisere et ikke-humant dyr, fortrinnsvis en mus, med et immunogen som omfatter et hemmende KIR-polypeptid, fortrinnsvis et KIR2DL-polypeptid, mer foretrukket et humant KIR2DL-polypeptid. Det hemmende KIR-polypeptidet kan omfatte fullengde-sekvensen fra et humant hemmende KIR-polypeptid, et fragment eller derivat av dette, typisk et immunogent fragment, det vil si en del av polypeptidet som omfatter en epitop som er eksponert på overflaten av den cellen som uttrykker en hemmende KIR-reseptor. Slike fragmenter vil typisk inneholdt minst omtrent 7 sammenhengende aminosyrer fra den modne polypeptidsekvensen eller mer foretrukket minst 10 sammenhengende aminosyrer fra denne. Fragmentene vil i alt vesentlig være avledet fra det ekstracellulære domenet i reseptoren. Enda mer foretrukket er et humant KIR2DL-polypeptid som inkluderer minst én, og fortrinnsvis begge, de ekstracellulære Ig-domenene fra det fullengde KIR2DL-polypeptidet og som er i stand til å etterligne minst én konformell epitop som er tilstede i en KIR2DL-reseptor. I andre utførelser omfatter nevnte polypeptid minst 8 sammenhengende aminosyrer fra et ekstracellulært Igdomene fra aminosyreposisjonene 1-224 i KIR2DL1-polypeptidet (aminosyrenummereringen er ifølge Wagtmann et al., Immunity 1995; 2: 439-449, som her er inkorporer som en referanse i sin helhet, eller ifølge PROW internetthjemmesiden som kan finnes på world wide web (www) -adressen ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm).
I en utførelse omfatter immunogenet et villtype humant KIR2DL-polypeptid i en lipidmembran, typisk på overflaten av en celle. I en spesifikk utførelse omfatter immunogenet intakte NK-celler, da spesielt intakte humane NK-celler. I en annen utførelse er cellene oppløst eller på annen måte behandlet slik at de ikke er intakte. Immunogenet kan for eksempel være suspendert eller løst i en buffer, eventuelt med en adjuvans så som fullstendig Freunds adjuvans, før administrering til et ikkehumant dyr så som en mus, kanin, geit, hest, hund, sau, marsvin, rotte, hamster, osv.
Selve immuniseringen av et ikke-humant dyr med et antigen kan utføres på en måte som er velkjent for å stimulere produksjonen av antistoffer i en mus (se for eksempel E. Harlow og D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Immunogenet blir så suspendert eller løst i en buffer, eventuelt med en adjuvans så som Freunds fullstendige adjuvans. Fremgangsmåter for å bestemme mengden av immunogen, typer av buffere og mengder av adjuvans er velkjente innenfor bioteknologien og er ikke på noen som helst måte begrensende for den foreliggende oppfinnelsen. Disse parameterne kan være forskjellige for forskjellige immunogener, men lar seg lett utlede.
På lignende måte er prinsipper som er relevante for valg av sted og frekvens med hensyn til immunisering som er tilstrekkelig for å stimulere produksjonen av antistoffer også velkjente innenfor bioteknologien. I et eksempel på en immuniseringsprotokoll blir de ikke-humane dyrene injisert intraperitonealt med antigenet på dag 1 og deretter omtrent en uke senere. Dette følges så opp ved supplerende injeksjoner av antigenet omkring dag 20, eventuelt med en adjuvans så som Freunds ufullstendige adjuvans. De supplerende injeksjonene kan utføres intravenøst og kan gjentas på flere påfølgende dager. Dette følges av en såkal t boosterinjeksjon på dag 40, enten intravenøst eller intraperitonealt, typisk uten adjuvans. Denne protokollen resulterer i produksjonen av antigenspesifikke antistoffproduserende B-celler etter omtrent 40 dager. Andre protokoller kan også brukes så lenge de resulterer i produksjonen av B-celler som uttrykker et antistoff som er rettet inn mot det antigenet som brukes ved immuniseringen.
For fremstilling av polyklonale antistoffer, blir serum oppnådd fra et immunisert ikke-humant dyr og de antistoffer som er tilstede der, isolert ved hjelp av velkjente teknikker. Nevnte serum kan affinitetsrenses ved å bruke enhver av de immunogener som er angitt ovenfor, festet til et fast underlag slik at det er mulig å få fremstilt antistoffer som reagerer med hemmende KIR-reseptorer.
I en alternativ utførelse blir lymfocytter fra ikke-immuniserte ikke-humane pattedyr isolert, dyrket in vitro og så eksponert for immunogenet i cellekulturen.
Lymfocyttene kan så innhøstes, hvoretter man kan utføre det fusjonstrinn som er beskrevet ovenfor.
For monoklonale antistoffer så vil det neste trinnet være isoleringen av splenocytter fra det immuniserte ikke-humane pattedyret, hvoretter den etterfølgende fusjonen av disse splenocyttene med en immortalisert cellelinje vil gi grunnlaget for en antistoffproduserende hybridom. Isoleringen av splenocytter fra et ikke-humant dyr er velkjent innenfor bioteknologien og innbefatter typisk å fjerne milten fra et bedøvet ikke-humant dyr, skjære milten opp i små stykker og presse ut splenocyttene fra miltkapslene og gjennom et nylon-nett i en cellesikt og inn i en passende buffer, hvorved man får fremstilt en enkeltcellesuspensjon. Cellene blir så vasket, sentrifugert og på nytt suspendert i en buffer som oppløser eventuelle røde blodceller. Løsningen blir igjen sentrifugert og de gjenværende lymfocyttene i pelleten blir så på nytt suspendert i frisk buffer.
Så snart de er isolert og tilstede i en enkeltcellesuspensjon, kan lymfocyttene fusjoneres til en immortal cellelinje. Dette vil typisk være en musemyelomcellelinje, skjønt man også kan bruke mange andre immortale cellelinjer for fremstilling av hybridomer, noe som er velkjent innenfor bioteknologien. Foretrukne murine myelomlinjer inkluderer, men er ikke begrenset til, de som er avledet fra MOPC-21- og MPC-11-musetumorer (tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A.) eller X63 Ag8653-og SP-2-cellelinjene (tilgjengelige fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A.). Cellefusjonen utføres ved å bruke polyetylenglykol eller lignende. De resulterende hybridomer kan så dyrkes i selektive media som inneholder ett eller flere stoffer som hemmer veksten eller overlevelsen av ufusjonerte, parenterale myelomceller. Hvis for eksempel de parenterale myelomcellene mangler enzymet hypoksantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), så vil dyrkningsmediet for hybridomene typisk inkludere hypoksantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) som er stoffer som hindrer veksten av celler med HGPRT-svikt.
Hybridomer blir typisk dyrket på et fødelag av makrofager. Makrofagene er fortrinnsvis fra søsken av det ikke-humane pattedyret som brukes for å isolere splenocytter og vil vanligvis være primet med Freunds ufullstendige adjuvans eller lignende flere dager før hybridomene blir utplatet. Fusjonsmetoder er for eksempel beskrevet i Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," sidene 59-103 (Academic Press, 1986), som her inngår som en referanse i sin helhet.
Cellene blir dyrket i seleksjonsmedia i et tilstrekkelig langt tidsrom til at det danner seg kolonier og det produseres antistoffer. Dette vil vanligvis være mellom omtrent 7 og omtrent 14 dager. Hybridomkoloniene blir så bedømt for produksjonen av antistoffer som kryssreagerer med multiple hemmende KIR-reseptorgenprodukter. Prøven er typisk en kolorimetrisk ELISA-typen, skjønt man kan også bruke flere andre typer av prøver, for eksempel immunutfelling og radioimmunitetsprøver eller FACS, Biacore, scintillasjonsnærhetsprøver (SPA) eller andre typer av prøver som er velkjente innenfor bioteknologien. De brønnene som inneholder antistoffene med den forønskede spesifisitet blir så undersøkt for å bestemme hvorvidt en eller flere av de distinkte hybridomcellekoloniene er tilstede. Hvis mer enn én koloni er tilstede, kan cellene klones på nytt og dyrkes for å sikre at bare en enkelt celle har gitt opphav til den kolonien som produserer det forønskede antistoffet. Positive brønner med en enkelt tilsynelatende koloni blir typisk klonet på nytt og så undersøkt på nytt for å sikre at bare ett monoklonalt antistoff er blitt påvist og produsert.
I en foretrukket utførelse er det ikke-humane dyret som brukes for å fremstille antistoffer ifølge de anvendbare fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen et pattedyr så som en gnager (for eksempel en mus, rotte, osv.), et storfe, et svin, en hest, en kanin, en geit, en sau, osv. Det ikke-humane pattedyret kan også være genetisk modifisert eller manipulert slik at det fremstilles "humane" antistoffer så som Xenomusen™ (Abgenix) eller HuMAb-musen™ (Medarex), slik det er beskrevet i det etterfølgende.
Antistoffer kan også fremstilles transgent ved utviklingen av et chordat (så som et pattedyr eller en fugl) eller en plante som er transgen for de immunglobulin tunge og lette kjedesekvensene av interesse og som kan brukes for fremstilling av antistoffet i en innvinnbar form (se for eksempel Ma et al., Nature Rev. Genetics 4: 794-805 (2003); Nolke et al., Expert Opin Biol Ther. 2003 okt; 3(7): 1153-62;
Schillberg et al., Cell Mol Life Sci. 2003 mars; 60(3): 433-45; Tekoah et al., Arch Biochem Biophys. 15. juni 2004; 426(2): 266-78; Fischer et al., Eur. J. of Biochem., 262(3): 810 (1999); og US patentsøknad 20030084482 som angår produksjonen av antistoffer og antistofflignende proteiner i planter). I forbindelse med transgen produksjon i pattedyr, så kan antistoffer og andre proteiner også fremstilles i og innvinnes fra melken fra geiter, kuer eller andre pattedyr. Se for eksempel US patentene 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 og 5,741,957. Antistoffer kan også fremstilles i eggene til fugler og innvinnes fra disse. Se for eksempel Tini et al., Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2002 mars; 131(3): 569-74 og US-patent 4,550,019.
Antistoffer kan også fremstilles ved seleksjon i kombinatoriske bibliotek av immunglobuliner, slik det for eksempel er beskrevet i Ward et al., Nature, 341 (1989) side 544.
Ifølge en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et hybridom som er avledet fra en B-celle fra en ikke-human vert, hvor nevnte B-celle produserer et antistoff som binder en determinant som er tilstede på minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter og hvor nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere den hemmende aktiviteten til nevnte reseptorer. Mer foretrukket er det at hybridomet ifølge dette aspektet av oppfinnelsen ikke er et hybridom som fremstiller det monoklonale antistoffet NKVSF1, ikke A210 og/eller ikke A802g. Hybridomet ifølge dette aspektet av oppfinnelsen kan skapes eller dannes slik det er beskrevet ovenfor ved fusjonen av splenocytter fra et immunisert ikke-humant pattedyr med en immortal cellelinje. Hybridomer fremstilt ved denne fusjonen kan så screenes for nærværet av et slikt kryssreagerende antistoff slik det er beskrevet i det etterfølgende. Det er foretrukket at hybridomet produserer et antistoff som gjenkjenner en determinant som er tilstede på minst to forskjellige KIR2DL-genprodukter og som vil gi en forsterkning av NK-celler som uttrykker minst en av disse KIR-reseptorene. Enda mer foretrukket er det at hybridomet fremstiller et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som 1-7F9 og som forsterker NK-celleaktivitet eller binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen som 1-4F1. Mer foretrukket at hybridomet er et hybridom 1-7F9 som produserer det monoklonale antistoffet 1-7F9, eller hybridom 1-4F1 som produserer det monoklonale antistoffet 1-4F1.
Hybridomer hvor det er bekreftet at de fremstiller et monoklonalt antistoff ifø lge oppfinnelsen kan dyrkes opp i større mengder i et passende medium så som DMEM eller RPMI-1640. Alternativt kan hybridomcellene dyrkes in vivo som ascitestumorer i et dyr.
Etter at veksten har vært tilstrekkelig til at man har fått fremstilt det forønskede monoklonale antistoffet, så kan vekstmediet inneholde det monoklonale antistoffet (eller ascitesvæsken) skilles fra cellene, hvoretter det monoklonale antistoffet renses. Rensing utføres typisk ved kromatografi ved å bruke protein A- eller protein G-sefarose eller et anti-mus Ig bundet til et fast underlag så som agarose eller sefaroseperler (alle er for eksempel beskrevet i Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publikasjon nr. 18-1037-46, utgave AC, og som her er inkorporert i sin helhet som referanse), eller ved enhver annen kjent teknikk så som ved elektroforese eller dialyse. Det bundne antistoffet blir så eluert fra protein A/protein G-kolonner ved å bruke buffere med lav pH (glysin- eller acetatbuffere med pH på 3,0 eller mindre) og med en umiddelbar nøytralisering av de antistoffholdige fraksjonene. Disse fraksjonene kan slås sammen, dialyseres og konsentreres etter behov.
Humane antistoffer
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen humane anti-KIR-antistoffer. "Humane" antistoffer skiller seg fra "humaniserte" antistoffer (som er beskrevet separat i det etterfølgende). Slike "humane" antistoffer kan inkludere aminosyrerester som ikke er kodet av humane kimlinje immunglobulinsekvenser (det kan for eksempel være innført mutasjoner ved vilkårlig eller setestyrt mutagenese in vitro eller ved en somatisk mutasjon in vivo), for eksempel i CDRer så som i CDR3. Begrepet "humant antistoff" slik det brukes her, er imidlertid ikke tenkt å inkludere humaniserte antistoffer eller humane/musekimære antistoffer hvor CDR-sekvensene avledet fra kimlinjen fra et annet pattedyr så som en mus og som er podet på de humane rammeverkssekvensene.
Transgene dyr kan og er blitt utviklet som inneholder humane Ig-gener og som ved immunisering produserer et fullt repertoar av humane antistoffer i fravær av musimmunglobulinproduksjon. Slike humane Ig-transgene mus kan brukes for å fremstille antistoffer. Slike humane antistoffer kan utvikles i humane Ig-transgene dyr (for eksempel mus, rotter, sauer, griser, geiter, storfe, hester, osv.) og omfatter humane immunglobulinloci og naturlige immunglobulingendelesjoner så som i en Xenomus<TM>(Abgenix - Fremont, CA, USA) (se for eksempel Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994); Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997); Green og Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998); europeisk patent nr. EP 0463 151 B1; internasjonale patentsøknader nr. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 99/45031, WO 99/53049 og WO 00/037504; og US-patentene 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 5,994,619, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 og 6,130,364) eller transgene dyr som omfatter et minilocus for humane Ig-kodende gener så som HuMab-musen™ (Medarex - Princeton, NJ, USA) (se for eksempel EP 0546073, EP0546073; U.S. patent nr. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, 5,643,763; og internasjonale patentsøknader nr. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 og WO 98/24884).
Splenocytter fra slike transgene mus kan brukes for å produsere hybridomer som skiller ut humane monoklonale antistoffer ved hjelp av velkjente teknikker slik det er beskrevet her. Lignende teknikker og prinsipper er for eksempel beskrevet i Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); og Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993).
Humane antistoffer eller antistoffer fra andre arter kan videre utvikles ved hjelp av såkalt display-typeteknologi som inkluderer, uten begrensning, fagdisplay, retroviraldisplay, ribosomaldisplay og andre beslektede teknikker ved å bruke fremgangsmåter som i seg selv er velkjente innenfor bioteknologien, hvoretter de resulterende molekylene kan underkastes ytterligere modningsmetoder så som en affinitetsmodning, og slike teknikker er også velkjente (se for eksempel (Hoogenboom et al ., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991) (fagdisplay); Vaughan, et al., Nature Biotech 14: 309 (1996) (fagdisplay); Hanes og Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942 (1997) (ribosomaldisplay); Parmley og Smith Gene 73: 305-318 (1988) (fagdisplay); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Scott TIBS 17: 241-245 (1992); Cwirla et al. PNAS USA 87: 6378-6382 (1990); Russel et al. Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993); Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130: 43-68 (1992); Chiswell og McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992); og US-patent 5,733,743). Hvis displayteknologiene brukes for å fremstille antistoffer som er ikkehumane, så kan slike antistoffer humaniseres slik det for eksempel er beskrevet i det etterfølgende.
Følgelig, som beskrevet her, så er anti-KIR mAb'er lovende midler for behandling av kreft og virusinfeksjoner og andre lidelser og sykdommer. Anti-KIR mAb'er kan utvikles ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter så som ved humanisering av murine mAb'er eller ved fusjon av splenocytter fra humane Ig-transgene mus (Xenomus eller HuMab-mus), ved fagdisplay eller ved immortalisering av humane Ab-produserende B-celler eller ved hjelp av andre metoder. I ethvert tilfelle kan antistoffet bli produsert ved hjelp av cellelinjer og renses i mengder som er egnet for formulering, pakking og injeksjon i pasienter som har behov for dette.
Rekombinant produksjon
Anti-KIR-antistoffer kan også fremstilles med rekombinant ekspresjon i enkeltcelleorganismer så som i gjør; eller i bakteriecellekulturer (så som i E. coli); eller i en eukaryot cellekultur (for eksempel i en kultur av pattedyrceller) ved å bruke standardteknikker.
Ifølge en alternativ utførelse kan således det DNA som koder de tunge og lette kjedene i et kryssreaktivt og nøytraliserende anti-KIR-antistoff og som binder en determinant som er tilstede på minst to forskjellige humane hemmende KIR, isoleres fra hybridomet ifølge oppfinnelsen og plasseres i en passende ekspresjonsvektor for transfeksjon i en passende vert. Verten kan så brukes for den rekombinante produksjonen av antistoffet eller varianter av dette så som en humanisert versjon av det monoklonale antistoffet, aktive fragmenter av antistoffet eller kimære antistoffer som omfatter den antigengjenkjennende delen av antistoffet. Det DNA som brukes i denne utførelsen bør fortrinnsvis kodet et antistoff som gjenkjenner en determinant som er tilstede på minst to forskjellige KIR2DL-genprodukter, men ikke på DIR2DS3 eller -4 og som forårsaker en forsterking av NK-celler som uttrykker minst én av disse KIR2DL-reseptorene. Det er enda mer foretrukket at nevnte DNA koder et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen eller determinanten som 1-7F9 og som forsterker NK-celleaktivitet. Mest foretrukket er det at DNA koder det monoklonale antistoffet 1-7F9.
DNA som koder de monoklonale antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen lar seg lett isoleres og sekvenseres ved å bruke vanlig kjente fremgangsmåter (for eksempel ved å bruke oligonukleotidprober som er i stand til spesifikt å binde seg til gener som koder de tunge og lette kjedene av murine eller humane antistoffer). Så snart det er isolert, kan nevnte DNA plasseres i ekspresjonsvektorer som så kan transfekteres inn i vertsceller så som E. coli-celler, simian COS-celler, kinesisk hamstereggstokk (CHO) -celler eller myelomceller som ellers ikke produserer immunglobulinprotein, hvorved man oppnår at de monoklonale antistoffene syntetiseres i de rekombinante vertscellene. Rekombinant ekspresjon i bakterier av DNA-kodende fragmenter av antistoffet er velkjent innenfor bioteknologien (se for eksempel Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, side 256 (1993); og Pluckthun, Immunol. Revs. 130, side 151 (1992).
Videre er det blitt beskrevet rekombinant produksjon av antistoffer fra kjente variable tunge (VH) og variable lette (VL) kjeder og humane konstante områder, for eksempel av Ruker et al. (Annals of the New York Academy of Sciences. 1991; 646: 212-219) som rapporterer ekspresjonen av et humant monoklonalt anti -HIV-1-antistoff i CHO-celler; Bianchi et al. (Biotechnology and Bioengineering. 2003; 84: 439-444) som beskriver høynivåekspresjon av fullengde antistoffer ved å bruke trans-komplementerende ekspresjonsvektorer; No Soo Kim et al. (Biotechnol. Prog.
2001; 17: 69-75) som beskriver nøkkeldeterminanter ved forekomsten av klonal variasjon ved humanisert antistoffekspresjon i CHO-celler ved dihydrofolatreduktasemediert genamplifisering; King et al. (Biochemical Journal. 1992; 281: 317-323) som rapporterer ekspresjon, rensing og karakterisering av et mus-humant kimært antistoff og et kimært Fab'-fragment; WO 2003064606 som beskriver isolerte humane monoklonale antistoffer som omfatter humane tung- og humane lettkjedevariable områder og som begge omfatter FR1-, CDR1-, FR2-, CDR2-, FR3-, CDR3- og FR4-sekvenser; og WO 2003040170 som beskriver kimære eller humane monoklonale antistoffer og antigenbindende deler som spesifikt binder seg til og aktiverer humant CD40.
Hele de cDNA-sekvenser som koder de konstante områdene i humant IgG kan finnes i de følgende GenBank-innføringer som hver er inkorporert i sin helhet som referanse, og som er innført 6. januar 2005:
Humant IgG1-konstant tungkjedeområde: GenBank aksesjon nr.: J00228 Humant IgG2-konstant tungkjedeområde: GenBank aksesjon nr.: J00230 Humant IgG3-konstant tungkjedeområde: GenBank aksesjon nr.: X04646 Humant IgG4-konstant tungkjedeområde: GenBank aksesjon nr.: K01316 Humant kappa lettkjede konstant område: GenBank aksesjon nr.: J00241.
Som et eksempel på en utførelse for å få fremstilt rekombinant mAb fra 1-7F9 eller 1-4F1 VH- og VL-sekvenser, så kan følgende protokoll anvendes. Trinnene 1-3 beskriver innvinning av VH- og VL-områdene fra et hybridom eller celler som produserer 1-7F9 eller 1-4F1. Det cDNA som koder de nevnte 1-7F9 eller 1-4F1 VH- og VL-sekvenser (eller mutanter eller derivater av disse) som skal brukes i trinn 4, kan imidlertid også fremstilles ved hjelp av den sekvensinformasjon som er gitt på figurene 14 eller 15, ved å bruke velkjente teknikker for syntese av cDNA-fragmenter. Alternativt kan VH- og VL-fragmentene fra 1-7F9 eller 1-4F1 eller mutanter eller derivater av disse, klones inn i enhver av en rekke forskjellige ekspresjonsvektorer som er beskrevet i litteraturen eller kommersielt tilgjengelige ekspresjonsvektorer og som inneholder et konstant område av den forønskede Igunderklassen for derved å få uttrykt et fullengde antistoff. Alternativt kan VH- og VL-fragmentene av 1-7F9 eller 1-4F1 eller mutanter eller derivater av disse, klones inn i vektorer som koder forkortede eller trunkerte konstante områder for derved å få uttrykt antistoffragmenter (for eksempel Fab-fragmenter). Et eksempel på en kommersielt tilgjengelig vektor er pASK84 som er tilgjengelig fra ATCC (American Type Culture Collection, katalognummer 87094).
(1) Isolering av totalt RNA fra hybridomceller:
4 x 10<6>hybridomceller (så som 1-7F9 eller 1-4F1) som skiller ut antistoffer mot humant KIR kan brukes for isolering av totalt RNA ved å bruke RNeasy minisettet fra Qiagen ved å følge fabrikantens anbefalinger og instruksjoner og som kort forklart er som følger: Cellene blir pelletert ved sentrifugering i 5 minutter ved 1000 rpm og deretter brutt i stykker ved å tilsette 350 μl RLT-buffer som inneholder 10 μl/ml β-merkaptoetanol. Lysatet blir overført til en QIA-opprivningskolonne fra Qiagen og sentrifugert i 2 minutter ved maksimal hastighet.
Gjennomstrømningsproduktet blir blandet med et tilsvarende volum av 70% etanol. Opptil en 700 μl prøve blir påsatt pr RNeasy spinnkolonne (Qiagen) og sentrifugert ved 14000 rpm, hvoretter gjennomstrømningsproduktet ble kastet. 700 μl RW1-buffer ble påsatt hver kolonne som så ble sentrifugert ved 14000 rpm i 15 sekunder for å vaske kolonnen. Kolonnen ble vasket to ganger med 500 μl RPE-buffer og sentrifugert ved 14000 rpm i 15 sekunder. For å tørke kolonnen blir den sentrifugert i ytterligere 2 minutter ved 14000 rpm. Kolonnen blir så overført til et nytt oppsamlingsrør og det forønskede RNA blir eluert med 50 μl nukleasefritt vann og sentrifugert i 1 minutt ved 14000 rpm. RNA-konsentrasjonen ble målt ved absorpsjon ved OD = 260 nm. RNA-produktet blir så lagret ved -80 ºC inntil det skal brukes.
(2) cDNA-syntese:
1 μg RNA blir brukt for en første tråds cDNA-syntese ved å bruke SMART RACE cDNA amplifiseringssettet fra Clontech. For fremstilling av 5'-RACE-Ready cDNA, blir det fremstilt en reaksjonsblanding som inneholder RNA isolert som beskrevet ovenfor, den reverse primeren 5'-CDS og SMART II A oligo, og denne blandingen blir så inkubert ved 72 ºC i 2 minutter og deretter avkjølt på is i 2 minutter, før det tilsettes 1 x første tråds buffer, DTT (20 mM), dNTP (10 mM) og PowerScript revers transkriptase. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 42 ºC i 1,5 timer og så tilsatt tricin-EDTA-buffer, hvoretter blandingen inkuberes ved 72 ºC i 7 minutter. På dette punktet kan prøvene lagres ved -20 ºC.
(3) PCR-amplifisering og kloning av humane variable lette (VL) og humane variable tunge (VH) -kjeder.
Det blir fremstilt en PCR (polymerasekjedereaksjon) -reaksjonsblanding som inneholder 1 x Advantage HF 2 PCR-buffer, dNTP (10mM) and 1 x Advantage HF 2-polymerase for separat amplifisering av de variable områdene av både VL og VH fra cDNA fremstilt som beskrevet ovenfor.
For amplifisering av VL, ble de følgende primere brukt:
UPM (universell primerblanding):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (SEKV.ID. NR. 26)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEKV.ID. NR. 27)
VK RACE2:
5'-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3' (SEKV.ID. NR. 28)
For amplifisering av VH, ble de følgende primere brukt:
UPM (universell primerblanding):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (SEKV.ID. NR. 29)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEKV.ID. NR. 30)
AB90RACE:
5'-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3' (SEKV.ID. NR. 31)
Det ble gjennomført tre runder med PCR. Runde 1: PCR ble kjørt i 5 sykluser ved 94 ºC i 5 sekunder og 72 ºC i 3 minutter. Runde 2: PCR ble kjørt i 5 sykluser ved 94 ºC i 5 sekunder, 70 ºC i 10 sekunder og så 72 ºC i 1 minutt. Runde 3: PCR ble kjørt i 28 sykluser ved 94 ºC i 5 sekunder, 68 ºC i 10 sekunder og 72 ºC i 1 minutt.
PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på en 1% agarosegel og det fremstilte DNA ble renset fra gelen ved å bruke QIAEX11 agarosegelekstraksjonssettet fra Qiagen.
De rensede PCR-produktene ble innført i PCR4-TOPO-vektoren ved å bruke TOPO TA kloningssettet fra Invitrogen og brukt for transformering av TOP10-kompetente celler.
Et egnet antall kolonier ble analysert ved koloni-PCR ved å bruke Taq-polymerase, 1 x Taq-polymerasebuffer, dNTP (10 mM) og de følgende primere og et PCR-program:
M13 foroverprimer: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3’ (SEKV.ID. NR. 32) M13 reversprimer: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEKV.ID. NR. 33)
PCR-program:
25 sykluser ble kjørt ved 94 ºC i 30 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder og 72 ºC i 1 minutt.
Plasmid DNA fra kloner som omfattet VL- og VH-innsettingene henholdsvis, ble ekstrahert og sekvensert ved å bruke primeren M13 forover og M13 revers som angitt ovenfor. I forbindelse med det humane anti-KIR-mAb 1-7F9, så er de sekvensene som koder de tung- og lettkjedevariable områdene vist på figur 15.
(4) Subkloning av antistoffgener i pattedyrekspresjonsvektorer
Basert på sekvensdata for de cDNA-molekyler som koder de tung- og lettkjedevariable områdene for nevnte mAb, ble det utformet primere for amplifisering av de variable lette (VL) og variable tunge (VH) kjedegenene henholdsvis. De variable områdene ble formatert ved hjelp av PCR til å inkludere en Kozaksekvens, en ledersekvens og unike restriksjonsenzymseter. For VL-kjeden ble dette oppnådd ved å utforme 5' PCR-primere som introduserte et HindIII-sete og slik at Kozaksekvensen ble homolog til 5'-enden av ledersekvensen i det variable lettkjedeområdet. 3'-primeren er homolog til 3'-enden i det variable området og det ble innført et BsiWI-sete ved 3'-grensen til det variable området. VH-området blir utviklet på lignende måte, bortsett fra at et NotI- og NheI-sete ble innført i 5'- og 3'-endene i stedet for HindIII og BsiWI henholdsvis.
De amplifiserte genproduktene ble hver klonet inn i en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholdt de lett- og tungkjedekonstante områdene ved hjelp av standardteknikker. VL DNA-fragmentene blir kuttet med HindIII og BsiWI og ligert inn i en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholdt beta-laktamasegenet som koder resistens for ampicillin og et E. coli replikasjonsorigo (pUC); og det resulterende plasmidet ble betegnet VLCL. VH DNA-fragmentene ble kuttet med NotI og NheI og innført i VLCL-vektoren som var et resultat fra innføringen av VL-fragmentet som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmidet inneholder funksjonelle ekspresjonskassetter som koder både de tunge og lette kjedene til antistoffet på det samme plasmidet. Det ligerte plasmidet ble brukt for å transformere E. coli. Plasmid DNA ble fremstilt fra disse ampicillinresistente bakteriepopulasjonene og ble så brukt for en transfeksjon i kinesiske hamstereggstokkceller eller andre pattedyrcellelinjer. Transfeksjonen og celledyrkingen ble utført ved hjelp av standardmetoder slik det for eksempel er beskrevet i "Molecular Cloning" av Sambrook et al. Resultatet er transfekterte cellelinjer som stabilt uttrykker og skiller ut antistoffmolekylet av interesse så som 1-7F9 eller 1-4F1 humane anti-KIR-mAb eller et mAb som omfatter VH- og VL-områdene for 1-7F9 eller 1-4F1 eller et annet humant anti-KIR-mAb.
Varianter av antistoffet kan lett utvikles. For eksempel kan det fremstilles e t antistoff med den nøyaktig samme spesifisiteten som 1-7F9 eller 1-4F1, men av en annen isotype enn IgG4 eller IgG2 henholdsvis ved å subklone nevnte cDNA som koder VL og VH fra 1-7F9 eller 1-4F1 i plasmider som inneholder et cDNA som koder de kappa-lettkjedekonstante områdene og et tungkjedekonstant område som er valgt fra IgG1- eller IgG2- eller IgG3- eller IgG4-kostante tungkjedeområder. Det kan således utvikles et antistoff som er av enhver isotype, hvoretter antistoffet kan isotypeveksles ved å bruke vanlig kjent teknikk. Slike teknikker inkluderer bruken av direkte rekombinante teknikker (se for eksempel US patent 4,816,397), celle -cellefusjonsteknikker (se for eksempel US patent 5,916,771) eller andre egnede teknikker som er velkjente innenfor bioteknologien. Effektorfunksjonen av antistoffer som er tilveiebrakt ved hjelp av den foreliggende oppfinnelsen kan således "forandres" med hensyn til isotypen fra det opprinnelige antistoffet ved isotypeveksling, for eksempel til et IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgD-, IgA-, IgE-eller IgM-antistoff for forskjellige anvendelser, inklusivt for terapeutiske formål.
I ytterligere aspekter tilveiebringer således oppfinnelsen et hybridom som omfatter: (a) en B-celle fra en pattedyrvert (typisk en ikke-human pattedyrvert) som er blitt immunisert med et antigen som omfatter en epitop som er tilstede på et hemmende KIR-polypeptid, fusjonert til (b) en immortalisert celle (for eksempel en myelomcelle) hvor nevnte hybridom produserer et monoklonalt antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorer og som er i stand til i det minste i alt vesentlig å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorer. I en utførelse er pattedyrverten et transgent dyr som er i stand til å produsere humane antistoffer. Eventuelt så vil nevnte hybridom ikke produsere det monoklonale antistoffet NKVSF1, ikke A210 og/eller ikke A802g. I forskjellige utførelser binder antistoffet KIR2DL1- og KIR2DL2/3-reseptorer eller en felles determinant som er tilstede både på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Hybridomet kan produsere et antistoff som er i stand til å hemme bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1-reseptor og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3-reseptorer. For eksempel kan man ved hjelp av hybridomet få fremstilt et antistoff som binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen som det monoklonale antistoffet 1-7F9 eller 1-4F1 på enten KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 eller både KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for produksjon av et antistoff som kryssreagerer med multiple KIR2DL-produkter og som produserer eller nøytraliserer den hemmende aktiviteten til slike KIR, og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinn:
(a) immunisering av et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et KIR2DL-polypeptid;
(b) fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr hvor nevnte antistoffer binder nevnte KIR2DL-polypeptid;
(c) velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med minst to forskjellige KIR2DL-genprodukter; og
(d) velge antistoffer fra (c) som forsterker NK-celler.
I en utførelse er nevnte ikke-humane pattedyr et transgent dyr som er manipulert slik at det uttrykker et humant antistoffrepertoar (for eksempel et ikke-humant pattedyr som omfatter humane immunglobulinloci og naturlige immunglobulingendelesjoner så som en Xenomus™ (Abgenix - Fremont, CA, USA) eller et ikke-humant pattedyr som omfatter et minilocus for humane Ig-kodende gener så som HuMab-musen™ (Medarex - Princeton, NJ, USA)). Eventuelt kan trinn a og b erstattes med alternative fremgangsmåter for å oppnå anti -KIR-mAb inklusive, uten begrensning, bruken av fagdisplay eller viral transduksjon av humane B-celler eller ved hjelp av andre fremgangsmåter som er velkjente innenfor bioteknologien. Eventuelt kan fremgangsmåten ytterligere omfatte en seleksjon av et antistoff som binder seg til KIR i en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Eventuelt kan oppfinnelsen ytterligere omfatte en fremgangsmåte for å bedømme et anti-KIR-antistoff hvor et antistoff fremstilt ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor blir administrert en primat, en fortrinnsvis en cynomolgusape, fortrinnsvis hvor apen blir observert for nærvær eller fravær av en indikasjon på antistoffets toksisitet.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane KIR-reseptorgenprodukter hvor antistoffet er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert eller -kontrollert hemming av cytotoksisitet (eller forsterke NK-cytotoksisitet) av en populasjon av NK-celler som uttrykker de minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenproduktene og hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinn:
a) immunisering av et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et hemmende KIR-polypeptid;
b) fremstille antistoffer fra det immuniserte dyret og hvor antistoffene binder KIR-polypeptidet;
c) velge antistoffer fra (b) som kryssreagerer med minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter; og
velge ut antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker de i det minste to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter hvor rekkefølgen av trinnene (c) og (d) eventuelt kan reverseres og hvor ethvert antall av trinnene eventuelt kan gjentas en eller flere ganger. Det hemmende KIR-polypeptidet som brukes for immunisering kan i en utførelse være en eller flere KIR2DL-polypeptider og de antistoffene som velges i trinn (c) vil kunne kryssreagere med minst KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Det er foretrukket at antistoffet gjenkjenner en felles determinant som er tilstede på minst to forskjellige KIR-reseptorgenprodukter og nevnte KIR er fortrinnsvis KIR2DL1 og KIR2DL2/3. I en utførelse omfatter trinn (c) en seleksjon av antistoffer som reagerer med minst ett KIR2DL- eller ett KIR3DL-reseptorgenprodukt. For eksempel kan det valgte antistoffet reagere med KIR2DL1 og KIR2DL2/3 så vel som KIR3DL1 og/eller KIR3DL2. Eventuelt kan fremgangsmåten ytterligere omfatte en seleksjon eller et valg av et antistoff som binder en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape, NK-celle eller KIR-polypeptid. Eventuelt kan oppfinnelsen ytterligere omfatte en fremgangsmåte for å bedømme et antistoff hvor et antistoff fremstilt ifølge den ovennevnte fremgangsmåten blir administrert en primat, fortrinnsvis en cynomolgusape og fortrinnsvis hvor apen blir observert for nærvær eller fravær på en indikasjon på antistoffets toksisitet.
I de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene så kan eventuelt det antistoffet som er valgt i trinn c) elle d) ikke være NKVSF1, ikke A210 og/eller ikke A802g.
Antistoffet fremstilt i trinn (b) i de ovennevnte fremgangsmåtene er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff. Det antistoffet som er valgt i trinn (c) i ovennevnte fremgangsmåter hemmer fortrinnsvis bindingen av en eller flere HLA-C-allotyper med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1-reseptor og bindingen av en eller flere HLA-C-allotyper med en Asn-rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3-reseptorer. De antistoffer som er valgt i trinn (d) i de ovennevnte fremgangsmåtene bør fortrinnsvis frembringe en forsterkelse av NK-cytotoksisitet eller en nøytralisering av en KIR-mediert eller -kontrollert hemming av NK-cytotoksisitet. Det er foretrukket at antistoffet binder seg i alt vesentlig til den samme epitopen som det monoklonale antistoffet 1-7F9 på KIR2DL og/eller KIR2DL2/3. Eventuelt kan fremgangsmåtene også eller alternativt omfatte ytterligere trinn for fremstilling av fragmenter av de valgte monoklonale antistoffene for fremstilling av derivater av de valgte monoklonale antistoffene (for eksempel ved konjugering med et radionuklide, cytotoksisk middel, reportermolekyl eller lignende) eller for fremstilling av derivater av antistoffragmenter fremstilt fra, eller som omfatter sekvenser som tilsvarer sekvensene i slike monoklonale antistoffer. I et annet aspekt kan en variant av et slikt antistoff produseres ved å fremstille et antistoff som omfatter en variantaminosyresekvens fra antistoffet fremstilt ved de ovennevnte beskrevne fremgangsmåtene, ved å bruke kjente genetiske manipuleringsmetoder (for eksempel en sekvens som er modifisert slik at den forandrer bindingsegenskapene til antistoffet, øker eller senker stabiliteten til antistoffet, bedrer rensing av antistoffet, bedrer påvisning av antistoffet og/eller forandrer antistoffets immunologiske egenskaper med hensyn til en vert som antistoffet eventuelt skal administreres).
Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som binder minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter hvor antistoffet er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert eller -kontrollert hemming av NK-cellecytotoksisitet (eller forsterke NK-cytotoksisitet) i en populasjon av NK-celler som uttrykker minst én av de forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenproduktene og hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinn:
(a) å velge fra et bibliotek eller repertoar et monoklonalt antistoff eller et antistoffragment som kryssreagerer med minst to forskjellige humane hemmende KIR2DL-reseptorgenprodukter, og
(b) å velge et antistoff fra (a) som er i stand til å nøytralisere den KIR-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker minst to forskjellige humane hemmende KIR2DL-reseptorgenprodukter.
Fortrinnsvis bør antistoffet binde en felles determinant som er tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Eventuelt er antistoffet som er valgt i trinn (b) ikke NKVSF1.
Antistoffet som er valgt i trinn (b) hemmer fortrinnsvis bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Lys-rest i posisjon 80 til en human KIR2DL1-reseptor og bindingen av et HLA-C-allelmolekyl med en Asn-rest i posisjon 80 til humane KIR2DL2/3-reseptorer. Antistoffet som er valgt i trinn (b) frembringer fortrinnsvis en forsterkning av NK-cytotoksisitet. Antistoffet binder seg fortrinnsvis i alt vesentlig til den samme epitopen som det monoklonale antistoffet 1-7F9 på KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3. Alternativt binder antistoffet seg i alt vesentlig til den samme epitopen som det monoklonale antistoffet 1-4F1. Eventuelt omfatter fremgangsmåten ytterligere trinn for fremstilling av fragmenter av de valgte monoklonale antistoffene for fremstilling av valgte monoklonale antistoffer eller for fremstilling av derivater av valgte monoklonale antistoffragmenter.
Oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter hvor antistoffet er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker minst en av de to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenproduktene og hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinn:
a) dyrking av en hybridom ifølge den foreliggende oppfinnelsen under betingelser som muliggjør produksjonen av det monoklonale antistoffet; og
b) separere det monoklonale antistoffet fra hybridomcellene. Eventuelt kan fremgangsmåten omfatte ytterligere trinn for fremstilling av fragmenter av det monoklonale antistoffet for fremstilling av derivater av det monoklonale antistoffer eller for fremstilling av derivater av slike monoklonale antistoffragmenter.
Antistoffet binder seg fortrinnsvis til en felles determinant som er tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som binder seg til minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter hvor antistoffet er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker minst en av de to forskjellige hemmende KIR-reseptorproduktene og hvor fremgangsmåten omfatter de følgende trinn:
a) å isolere fra et hybridom ifølge den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyre som koder det monoklonale antistoffet;
b) eventuelt modifisere nukleinsyren slik at man får oppnådd en modifisert nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder et modifisert eller derivatisert antistoff som omfatter en aminosyresekvens som tilsvarer en funksjonell sekvens i det monoklonale antistoffet eller i alt vesentlig er likt dette (for eksempel er minst omtrent 65%, minst omtrent 75%, minst omtrent 85%, minst omtrent 90%, minst omtrent 95% (så som omtrent 70-99%) identisk med en slik sekvens) valgt fra et humanisert antistoffet, et kimært antistoff, et enkeltkjedeantistoff, et immunreaktivt fragment av et antistoff eller et fusjonsprotein som omfatter et slik immunreaktivt fragment;
c) å innsette nukleinsyren eller den modifiserte nukleinsyren (eller en beslektet nukleinsyre som koder for den samme aminosyresekvensen) i en ekspresjonsvektor hvor det kodede antistoffet eller antistoffragmentet er i stand til å bli uttrykt når ekspresjonsvektoren er tilstede i en vertscelle som dyrkes under passende betingelser;
d) å transfektere en vertscelle med ekspresjonsvektoren, hvor vertscellen ikke ellers produserer immunglobulinprotein;
e) å dyrke den transfekterte vertscellen under betingelser som gjør at antistoffet eller antistoffragmentet blir uttrykt; og
f) å isolere antistoffet eller antistoffragmentet produsert av den transfekterte vertscellen. Antistoffet binder fortrinnsvis en felles determinant som er tilstede på KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Antistoffscreening og seleksjon
Spesielle antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen er i stand til å redusere eller nøytralisere den KIR-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet; spesielt hemming som er mediert eller kontrollert av KIR2DL-reseptorer og mer spesielt minst både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-mediert hemming. Disse antistoffene er således "nøytraliserende", "blokkerende" eller "hemmende" antistoffer i den forstand at de reduserer, nøytraliserer og/eller blokker i det minste delvis og påvisbart, den hemmende signaliserende reaksjonssekvensen som er mediert eller kontrollert av KIR-reseptorer når disse virker sammen med MHC klasse I-molekyler. Mer viktig er det at denne nøytraliseringsaktiviteten skjer eller blir oppvist med hensyn til flere typer hemmende KIR-reseptorer, fortrinnsvis flere KIR2DL-reseptorgenprodukter og mer foretrukket minst både KIR2DL1 og KIR2DL2/3 slik at disse antistoffene kan brukes i de fleste eller alle menneskepasienter med høy effekt. Nøytralisering av KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet kan bedømmes eller undersøkes ved hjelp av forskjellige prøver eller tester så som ved hjelp av de standard in vitro cellulære cytotoksisitetsprøver som er beskrevet her.
Så snart det er blitt identifisert et antistoff som kryssreagerer med multiple hemmende KIR-reseptorer, så kan det testes for sin evne til å redusere eller nøytralisere den hemmende effekten av disse KIR-reseptorene i intakte NK-celler. I en spesifikk variant kan den nøytraliserende aktiviteten illustreres ved nevnte antistoffs evne til å rekonstituere oppløsning av KIR2DL-uttrykkende NK-celler av mål som uttrykker HLA-C. I en annen spesifikk utførelse er antistoffet nøytraliserende aktivitet definert ved antistoffets evne til å blokkere eller redusere bindingen av HLA-C-molekyler til KIR2DL1 og KIR2DL3 (eller den nær beslektede KIR2DL2) -reseptorer og ytterligere fortrinnsvis ved antistoffets evne til å endre bindingen av KIR2DL2/3 til et HLA-C-molekyl valgt fra Cw1, Cw3, Cw7 og Cw8 (eller et annet HLC-C-molekyl med en Asn-rest i posisjon 80) og/eller bindingen av KIR2DL1 til et HLA-C-molekyl valgt fra Cw2, Cw4, Cw5 og Cw6 (eller et annet HLA-C-molekyl med en Lys-rest i posisjon 80).
I en annen variant kan antistoffets nøytraliserende aktivitet bedømmes i en cellebasert cytotoksisitetsprøve slik dette er beskrevet i de etterfølgende eksemplene.
I en annen variant kan den nøytraliserende aktiviteten til et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen bedømmes i en cytokinfrigjøringsprøve hvor NK-cellene inkuberes med testantistoffet og en målcellelinje som uttrykker et HLA-C-allel som gjenkjennes av et KIR-molekyl fra NK-populasjonen for å stimulere NK-cellecytokinproduksjon (for eksempel IFN- γ- og/eller GM-CSF-produksjon). I et eksempel på en protokoll blir IFN- γ-produksjon fra PBMC bedømt ved celleoverflate og intracytoplasmatisk farging og analyse ved flowcytometri etter 4 dager i kultur. Kort beskrevet blir brefeldin A (Sigma Aldrich) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på omtrent 5 μg/ml i løpet av minst 4 timer av dyrkingen.
Cellene kan så inkuberes med anti-CD3 og anti-CD56 mAb før permeabilisering (IntraPrep™; Beckman Coulter) og farming med PE-anti-IFN- γ eller PE-IgG1 (Pharmingen). GM-CSF- og IFN-produksjon fra polyklonale aktiverte NK-celler kan måles i supernatantene ved å bruke ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN- γ: OptE1A-sett, Pharmingen).
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan delvis (det vil si redusere) eller fullt ut nøytralisere den KIR-medierte hemmingen av NK-cellecytotoksisitet. For eksempel er foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen i stand til å indusere eller forsterke oppløsningen av HLA-matchede eller HLA-kompatible eller autologe målcellepopulasjoner, det vil si målpopulasjoner som ikke effektivt vil bli oppløst av NK-celler i fravær av nevnte antistoff. Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan følgelig også defineres ved at de letter NK-celleaktivitet in vivo og/eller in vitro.
I en spesifikk utførelse binder antistoffet seg i alt vesentlig til den samme epitopen som det monoklonale antistoffet DF200 (fremstilt av hybridom DF200), 1-7F9 eller 1-4F1. Slike antistoffer er her betegnet som henholdsvis "DF200-lignende antistoffer", "1-7F9-lignende antistoffer" og "1-4F1-lignende antistoffer". I en foretrukket utførelse er antistoffet et monoklonalt antistoff. "DF200-lignende antistoffer" ifølge oppfinnelsen er mer foretrukne antistoffer som er forskjellige fra det monoklonale antistoffet NKVSF1. Mest foretrukket er det monoklonale antistoffet 1-7F9 eller 1-4F1 og hvor antistoffene omfatter VH- og/eller VL-områdene av 1-7F9 eller 1-4F1.
Identifikasjonen av ett eller flere antistoffer som binder seg i alt vesentlig eller essensielt til den samme epitopen som de monoklonale antistoffene som er beskrevet her, kan lett bestemmes ved å bruke en av en rekke forskjellige immunologiske screeningsprøver hvor antistoffkonkurranse kan bedømmes. En rekke slike prøver blir rutinemessig praktisert og er velkjente innenfor bioteknologien (for eksempel U.S. patent nr. 5,660,827, utstedt 26. august 1997, som her spesifikt er inkorporert som en referanse). Det er underforstått at det å bestemme epitopen til hvilken antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen binder seg til, ikke på noen som helst måte er nødvendig for å identifisere et antistoff som binder seg til den samme eller i alt vesentlig den samme epitopen som det monoklonale antistoffet som er beskrevet her.
I de tilfeller hvor de testantistoffene som skal undersøkes er oppnådd fra forskjellige dyrekilder eller endog har en forskjellig Ig-isotype, så kan man for eksempel bruke en enkel konkurranseprøve hvor kontrollantistoffet (for eksempel DF200) blandes med testantistoffet og så påsettes en prøve som inneholder en eller begge KIR2DL1 og/eller KIR2DL2/3, som hver er kjent for å bli bundet av DF200. Protokoller basert på ELISA-prøver, radioimmunoprøver, Western blotting og bruk av en BIACORE-analyse (som for eksempel beskrevet i de etterfølgende eksemplene), er egnet for bruk i slike enkle konkurranseundersøkelser.
I visse utførelser vil man på forhånd blande kontrollantistoffet (for eksempel 1 -7F9 eller 1-4F1) med varierende mengder av testantistoffet (for eksempel i forhold på omtrent 1:1, 1:2, 1:10 eller omtrent 1:100) i et visst tidsrom før blandingen tilsettes KIR-antigenprøven. I andre utførelser kan kontrollprøven og varierende mengder av testantistoffet ganske enkelt tilsettes separat og blandes under eksponering overfor KIR-antigenprøven. Så lenge man kan skille de bundne fra de frie antistoffene (for eksempel ved å bruke separasjon eller forskjellige vasketeknikker for å eliminere ubundne antistoffer) og kontrollantistoffet fra testantistoffet (for eksempel ved å bruke artsspesifikke eller isotypespesifikke sekundære antistoffer eller ved spesifikt å merke kontrollantistoffet med en påvisbar markør), vil man være i stand til å bestemme hvorvidt testantistoffet reduserer bindingen av kontrollantistoffet til de forskjellige KIR2DL-antigenene, noe som indikerer at testantistoffet gjenkjenner i alt vesentlig den samme epitopen som 1-7F9. Bindingen av det (merkede) kontrollantistoffet i nærvær av et fullstendig irrelevant antistoff (som ikke binder KIR), kan tjene som kontrollhøyverdien. Kontrollavverdien kan oppnås ved å inkubere det merkede kontrollantistoffet med det samme men umerkede kontrollantistoffet, hvor det vil skje en konkurranse og redusere bindingen av det merkede antistoffet. I en testprøve vil en signifikant reduksjon av reaktiviteten for det merkede antistoffet i nærvær av et testantistoff være en indikasjon på at testantistoffet i alt vesentlig gjenkjenner den samme epitopen, det vil si en som konkurrerer med det merkede kontrollantistoffet. Ethvert testantistoff som for eksempel reduserer bindingen av 1-7F9 eller 1-4F1 til både KIR2DL1- og KIR2DL2/3-antigenene med minst omtrent 50%, så som minst 60% eller mer foretrukket minst omtrent 70% (for eksempel 65-100%), ved ethvert forhold mellom 1-7F9:testantistoff eller 1-4F1:antistoff mellom omtrent 1:1 eller 1:10 eller omtrent 1:100, anses å være et antistoff som i alt vesentlig binder seg til den samme epitopen eller determinanten som 1-7F9 eller 1-4F1 henholdsvis. Et slikt testantistoff vil fortrinnsvis redusere bindingen av 1-7F9 til minst en annen, fortrinnsvis hver av KIR2DL-antigenene, fortrinnsvis ved minst omtrent 50%, minst omtrent 60%, minst omtrent 80% eller minst omtrent 90% (for eksempel omtrent 95%) av bindingen av 1-7F9 eller 1-4F1 som blir observert i fravær av testantistoffet. Slike fremgangsmåter kan selvsagt tilpasses slik at de kan brukes for å identifisere og/eller bedømme antistoffer som konkurrerer med andre antistoffer og/eller KIR-antigener.
Konkurranse kan også eller alternativt bedømmes, for eksempel ved hjelp av en flowcytometritest. I en slik test eller prøve blir celler som bærer et gitt KIR inkubert først med et kontrollantistoff (for eksempel 1-7F9 eller 1-4F1) og så med testantistoffet merket med en fluorokrom eller biotin. Antistoffet angis å konkurrere med kontrollantistoffet hvis den bindingen som oppnås ved preinkuberingen med en mettende mengde av kontrollantistoffet er omtrent 80%, fortrinnsvis omtrent 50%, omtrent 40% eller mindre (for eksempel omtrent 30%) av bindingen (slik den måles ved hjelp av fluorescens) som er oppnådd med testantistoffet uten preinkubering med kontrollantistoffet. Alternativt kan det angis at et antistoff konkurrerer med kontrollantistoffet hvis bindingen som oppnås med et merket kontrollantistoff (ved hjelp av en fluorokrom eller biotin) på celler som er preinkubert med en mettende mengde av testantistoffet er omtrent 80%, fortrinnsvis omtrent 50%, omtrent 40% eller mindre (for eksempel omtrent 30%) av den bindingen som oppnås uten preinkubering med testantistoffet.
En enkel og fordelaktig konkurranseprøve som kan anvendes er en hvor et testantistoff preabsorberes og påsettes ved mettende konsentrasjon på en overflate hvor enten KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 eller begge er immobilisert. Overflaten i denne enkle konkurranseprøven er fortrinnsvis en BIACORE-brikke (eller et annet medium som er egnet for overflateplasmonresonansanalyse). Man kan så måle bindingen av et kontrollantistoff (for eksempel 1-7F9 eller 1-4F1) på den KIR-belagte overflaten. Denne bindingen av kontrollantistoffet alene til den KIR-holdige overflaten kan så sammenlignes med bindingen av kontrollantistoffet i nærvær av et testantistoff. En signifikant reduksjon av bindingen til den KIR2DL1 og KIR2DL2/3-holdige overflaten ved kontrollantistoffet i nærvær av testantistoffet, indikerer at testantistoffet i alt vesentlig gjenkjenner den samme epitopen som kontrollantistoffet, slik at testantistoffet "konkurrerer" med kontrollantisto ffet. Ethvert testantistoff som reduserer bindingen av kontrollantistoffet (så som 1-7F9 eller 1-4F1) til begge KIR2DL1- og KIR2DL2/3-antigenene med minst omtrent 20% eller mer, for eksempel med minst omtrent 40%, med minst omtrent 50%, med minst omtrent 70% eller mer, kan anses å være et antistoff som i alt vesentlig binder seg til den samme epitopen eller determinanten som kontrollantistoffet (for eksempel 1-7F9 eller 1-4F1). Et slikt testantistoff vil fortrinnsvis redusere bindingen av kontrollantistoffet (for eksempel 1-7F9 eller 1-4F1) til hver av KIR2DL-antigenene med minst omtrent 50% (for eksempel med minst omtrent 60%, med minst omtrent 70% eller mer). Det er underforstått at rekkefølgen med hensyn til bruken av kontroll- og testantistoffer kan reverseres, det vil si at kontrollantistoffet kan først bindes til overflaten hvoretter testantistoffet bringes i kontakt med den samme overflaten i en konkurranseprøve. Det er foretrukket at antistoffet med høyere affinitet for KIR2DL1- og DIR2DL2/3-antigener bindes til den KIR2DL1- og DIR2DL2/3-holdige overflaten først, etter som det vil være forventet at nedsettelsen av den bindingen man kan observere med det andre antistoffet (idet man antar at antistoffene er konkurrerende) vil være av en annen størrelsesorden. Ytterligere eksempler på slike prøver er gitt i de etterfølgende eksempler og for eksempel i Saunal og Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, hvis beskrivelse her er inkorporert som en referanse.
Skjønt de er beskrevet i sammenheng med 1-7F9 eller 1-4F1 som eksempler på anvendelse, så er det underforstått at de beskrevne screeningsprøver også kan brukes for å identifisere antistoffer som konkurrerer med en eller flere av NKVSF1, DF200, EB6, GL183 eller andre antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater ifølge oppfinnelsen.
Ved immunisering og produksjon av antistoffer i en vertebratcelle, så kan det gjennomføres spesielle seleksjonstrinn for å isolere antistoffene ifølge oppfinnelsen. I en spesifikk utførelse angår oppfinnelsen således fremgangsmåter for produksjon av slike antistoffer som omfatter de følgende trinn:
(a) immunisering av et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter het hemmende KIR-polypeptid;
(b) fremstille antistoffet fra nevnte immuniserte dyr hvor nevnte antistoffer binder nevnte KIR-polypeptid;
(c) velge antistoffer fra (b) som kryssreagerer med minst to hemmende KIR-genprodukter; og
(d) velge ut antistoffer fra (c) som er i stand til å nøytralisere KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker minst to av de nevnte forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenproduktene.
I visse utførelser kan et ytterligere trinn utføres mellom trinnene (c) og (d) som nevnt ovenfor for å selektere anti-KIR mAb'er som ikke reagerer med KIR2DS4.
Seleksjonen eller utvelgelsen av et antistoff som kryssreagerer med minst to forskjellige hemmende KIR-genprodukter kan oppnås ved å screene antistoffet mot to eller flere forskjellige hemmende KIR-antigener. I en mer foretrukket utførelse er antistoffene fremstilt som beskrevet i trinn (b), monoklonale antistoffer. Begrepet "fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte dyr" slik det brukes her, inkluderer således at man oppnår B-celler fra et immunisert dyr og bruker disse B-cellene for å fremstille et hybridom som uttrykker antistoffer så vel som å oppnå antistoffer direkte fra serum fra det immuniserte dyret. I en annet foretrukket utførelse vil de antistoffer som er selektert i trinn (c) være slike som kryssreagerer med minst KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
I en enda mer foretrukket utførelse, vil de antistoffer som er selektert i trinn (d) forårsake i det minste omtrent 10% eller mer av en spesifikk oppløsning mediert av NK-celler som fremviser minst ett KIR som er gjenkjent av antistoffet og fortrinnsvis minst omtrent 40% mer spesifikk oppløsning, minst omtrent 50% høyere spesifikk oppløsning eller mer foretrukket minst omtrent 70% forhøyet spesifikk oppløsning (for eksempel omtrent 60-100% økt eller forsterket spesifikk oppløsning), slik dette kan måles i en standard kromfrigjøringsprøve mot en målcelle som uttrykker et beslektet HLA klasse I-molekyl sammenlignet med den spesifikke oppløsningen som oppnås i fravær av et anti-KIR mAb. Når antistoffene som er selektert i trinn (d) brukes i en kromfrigjøringsprøve hvor det anvendes en NK-celleklon som uttrykker en eller flere hemmende KIR og målceller som uttrykker minst ett HLA-allel som gjenkjennes av den av de nevnte KIR på NK-klonen, så bør alternativt nivået av cytotoksisitet som oppnås med antistoffet minst være omtrent 20%, fortrinnsvis minst omtrent 30% eller av den spesifikke cytotoksisiteten som oppnås ved den samme konsentrasjonen av DF200 eller med et blokkerende anti-MHC-klasse I-antistoff ved det samme effektor : målcelleforholdet.
Rekkefølgen av trinnene (c) og (d) i den umiddelbart ovenfor beskrevne fremgangsmåten kan forandres. Eventuelt kan fremgangsmåten også eller alternativt omfatte trinn for å fremstille fragmenter av det monoklonale antistoffet eller derivater av det monoklonale antistoffet eller slike fragmenter som for eksempel er beskrevet i det etterfølgende.
I en annen variant tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som omfatter:
(a) selektere eller velge ut fra et bibliotek eller repertoar et monoklonalt antistoff, et fragment av et monoklonalt antistoff eller et derivat av en av de nevnte som kryssreagerer med minst to forskjellige humane hemmende KIR2DL-reseptorgenprodukter; og
(b) selektere et antistoff, fragment eller derivat av (a) som er i stand til å nøytralisere en KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet i en populasjon av NK-celler som uttrykker nevnte i det minste to forskjellige humane hemmende KIR2DL-reseptorgenprodukter.
Repertoaret kan være ethvert (rekombinant) repertoar av antistoffer eller fragmenter av disse og som eventuelt oppviser enhver egnet struktur (for eksempel fag, bakterie, syntetiske komplekser, osv.). Seleksjon eller utvelgelse av hemmende antistoffer kan utføres som beskrevet ovenfor eller som ytterligere illustrert i eksemplene.
Datamodellering av de ekstracellulære domenene i KIR2DL1, -2 og -3 (KIR2DL1-3) basert på deres publiserte krystallstrukturer (Maenaka et al. Structure with Folding and design 1999; 7: 391-398; Fan et al., Nature immunology 2001; 2: 452460; Boyington et al. Nature, 2000; 405: 537-543) viste at visse områder av KIR2DL1, -2 og -3 inngår i interaksjonen mellom disse KIR og de anti-KIR2DL-kryssreaktive murine monoklonale antistoffene DF200 og NKVSF1. I en utførelse tilveiebringer således den foreliggende oppfinnelsen antistoffer som utelukkende binder seg til KIR2DL1 innenfor et område definert av aminosyrerestene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181 og 192). I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 uten å interagere med aminosyrerester utenfor området definert av restene (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 181 og 192).
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1 og som ikke binder seg til en mutant av KIR2DL1 hvor R131 (det vil si Arg-resten i posisjon 131 i KIR2DL1-mutanten) er (det vil si er substituert med) en Ala-rest.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1 og som ikke binder seg til en mutant av KIR2DL1 hvor R157 er Ala.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1 og som ikke binder seg til en mutant av KIR2DL1 hvor R158 er Ala.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL-restene 131, 157 og 158.
En annen utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som binder seg til KIR2DS3(R131W), men ikke til villtype KIR2DS3.
I en spesiell utførelse binder antistoffene seg utelukkende til KIR2DL1 innenfor et område som er definert av aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88 (hvor bokstavene betegner aminosyrer i en enkelbokstavkode og nummeret er posisjonen for den resten i KIR2DL1 (SEKV.ID. NR. 23) ved å bruke det nummereringssystemet er som er beskrevet i Wagtmann et al., Immunity 1995; 2: 439-449)). Disse restene er blitt identifisert som 1-7F9 KIR2DL1-epitopen (se eksempel 11).
I en annen utførelse binder antistoffene seg til en antigen epitop i en KIR2DL1-sekvens som består av fragmentet L38 til Y88 i SEKV.ID. NR. 23. I en ytterligere utførelse binder antistoffene seg til en antigen epitop i en KIR2DL1-sekvens som omfatter fragmentene L38 til Y88 i SEKV.ID. NR. 23.
I en ytterligere utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1 og KIR2DL2/3 uten å interagere eller virke sammen med aminosyrerester utenfor området definert av restene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88.
I en annen utførelse binder antistoffene seg til KIR2DL1 innenfor et område som omfatter minst 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller mer av aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88. I en spesiell utførelse omfatter KIR2DL1-epitopen for antistoffene aminosyrerestene M44 og F45 (se eksemplene 9 og 11).
I en annen utførelse binder antistoffene seg til KIR2DL1 innenfor et område som omfatter minst 1, 2, 4, 6, 8, 10 eller 12 eller alle aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88. I en spesiell utførelse vil området omfatte aminosyrerestene M44 og F45 og minst 1, 2, 4, 6, 8, 10 eller alle av L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88 (se eksemplene 9 og 11). I en annen spesielt foretrukket utførelse omfatter området minst aminosyrerestene M44, F45 og D72 som ligger i det KIR2DL1-området hvor 1-7F9-epitopen og de HLA-C-bindende setene overlapper hverandre.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til KIR2DL1, KIR2DL2/3 og KIR2DS4.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg til både KIR2DL og KIR2DL2/3, men ikke til KIR2DS4.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder seg både til KIR2DL1 og KIR2DL2/3, men ikke til KIR2DS3 eller KIR2DS4.
En bestemmelse om hvorvidt et antistoff, antistoffragment eller antistoffderivat binder seg innenfor en av de epitopområder som er definert ovenfor, kan utføres ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er kjent innenfor bioteknologien. Se for eksempel eksemplene 9 og 11. I et annet eksempel på slike kartleggings/karakteriseringsmetoder kan et epitopområde for et anti -KIR-antistoff bestemmes ved epitop-"fotavtrykk" ved å bruke en kjemisk modifikasjon av de eksponerte aminer/karboksylgrupper i KIR2DL1- eller KIR2DL2/3-proteinet. Ett spesifikt eksempel på en slik fotavtrykksteknikk er bruken av HXMS (hydrogendeuteriumutbytting påvist ved massespektrometri), hvor det skjer en hydrogen/deuteriumutbytting av reseptor og proteinligandamidprotoner, binding og tilbakeutbytting og hvor amidgruppene i hovedkjeden som deltar i proteinbindingen er beskyttet mot tilbakeutbytting og derfor vil forbli deuterert. Relevante områder kan på dette punktet identifiseres ved peptidisk proteolyse, hurtig mikrobore høytrykks væskekromatografiseparasjon og/eller elektrosprayioniseringsmassespektrometri. Se for eksempel Ehring H, Analytical Biochemistry, bind 267 (2) sidene 252-259 (1999) og/eller Engen, J.R. og Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Et annet eksempel på en egnet epitopidentifikasjonsteknikk er kjernemagnetisk resonans epitopkartlegging (NMR) hvor man typisk sammenligner posisjonen for signalene i de todimensjonale NMR-spektra for det frie antigenet og antigenet kompleksdannet med det antigenbindende peptidet så som et antistoff. Antigenet vil typisk selektivt bli isotopisk merket med 15 N, slik at bare signaler som tilsvarer antigenet og ingen signaler fra det antigenbindende peptidet kan ses i NMR-spekteret. Antigensignaler som har sin opprinnelse fra aminosyrer som er involvert i interaksjonen med det antigenbindende peptidet, vil typisk skifte posisjon i spektraene for komplekset sammenlignet med spektraene for det frie antigenet slik at man på denne måten kan identifisere de aminosyrene som inngår i bindingen. Se for eksempel Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, bind 281 (1) sidene 61-67 (1998); og Saito og Patterson, Methods. 1996 juni; 9(3): 516-24.
Epitopkartlegging/karakterisering kan også utføres ved å bruke massespektrometrimetoder. Se for eksempel Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35(4): 493-503 og Kiselar og Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71(9): 1792-801.
Proteasekuttingsteknikker kan også brukes i sammenheng med epitopkartlegging og identifikasjon. Antigene determinant-relevante områder/sekvenser kan bestemmes ved proteasekutting, for eksempel ved å bruke trypsin i et forhold på omtrent 1:50 til KIR2DL1 eller KIR2DL2/3 o/n-kutting ved 37 ºC og pH 7-8 fulgt av massespektrometri (MS) -analyse for peptididentifikasjon. Peptidene som er beskyttet fra trypsinspalting på grunn av anti-KIR-antistoffet kan deretter identifiseres ved en sammenligning av de prøvene som er underkastet trypsinkutting og prøver som er inkubert med antistoffet og deretter underkastet kutting med for eksempel trypsin (som derved vil avsløre et "fotavtrykk" for antistoffet). Andre enzymer som kymotrypsin, pepsin, osv., kan også eller alternativt brukes i lignende epitopkarakteriseringsmetoder. Enzymatisk kutting kan videre gi en rask fremgangsmåte for å analysere hvorvidt en mulig antigen determinantsekvens ligger innenfor området til KIR2DL1 i sammenheng med et KIR-bindende polypeptid. Hvis polypeptidet ikke er overflateeksponert, så er det mest sannsynlig ikke relevant med hensyn til immunogenisitet/antigenisitet. Se for eksempel Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1): 15-9 for en diskusjon av lignende teknikker.
Seterettet mutagenese er en annen teknikk som brukes for belysning av en bindende epitop. I "alaninskanning" vil for eksempel hver rest innenfor et proteinsegment bli erstattet med en alaninrest, hvoretter konsekvensene for bindingsaffinitet måles. Hvis mutasjonen fører til en signifikant reduksjon med hensyn til bindingsaffinitet, så er det mest sannsynlig at mutasjonen inngår i binding. Monoklonale antistoffer som er spesifikke for strukturelle epitoper (det vil si antistoffer som ikke binder seg til det ufoldede proteinet) kan brukes for å verifisere at alaninerstatningen ikke påvirker proteinets generelle folding. Se for eksempel Clackson and Wells, Science 1995; 267: 383–386; og Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1–6.
Elektronmikroskopi kan også brukes for epitop-"fotavtrykking". For eksempel brukte Wang et al., Nature 1992; 355: 275-278 en koordinert anvendelse av kryoelektronmikroskopi, tredimensjonal billedrekonstruksjon og røntgenkrystallografi for å bestemme det fysiske fotavtrykket av et Fab-fragment på kapsidoverflaten av naturlig Vigna sinensis-virus.
Andre former for "markørfrie" prøver for epitopbelysning eller -undersøkelse inkluderer overflateplasmonresonans (SPR, BIACORE) og reflektometrisk interferensspektroskopi (RifS). Se for eksempel Fägerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646: 159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308–3311; Kröger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17: 937-944.
Antistoffragmenter og derivater
Fragmenter og derivater av antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen (som inngår i begrepene "antistoff" og "antistoffer" slik de brukes i den foreliggende søknad, hvis intet annet er angitt eller klart motsies av sammenhengen), fortrinnsvis et 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoff, kan produseres eller frembringes ved hjelp av teknikker som i seg selv er kjente innenfor bioteknologien. "Immunreaktive fragmenter" omfatter en del av det intakte antistoffet, generelt det antigenbindende setet eller variable området. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer "kappalegemer" (se for eksempel Ill et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)) og "janusiner" (ytterligere beskrevet et annet sted i søknaden). Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab)2, F(ab')2, dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); består i alt vesentlig av et VH-domene, Fd (består i alt vesentlig av VH- og CH1-domener) og Fv (består i alt vesentlig av VL- og VH-domener) fragmenter; dialegemer; kappalegemer; og janusiner. For eksempel kan antistoffragmenter inkludere et polypeptid med en primærstruktur som består av en uavbrutt sekvens av sammenhengende aminosyrerester (her betegnet som "enkeltkjedeantistoffragment" eller "enkeltkjedepolypeptid") og inkluderer, uten begrensning (1) enkeltkjede Fc (scFv) -molekyler, (2) enkeltkjedepolypeptider som bare inneholder ett lettkjedevariabelt domene eller et fragment av dette som inneholder de tre CDR'er i det lettkjedevariable domenet uten å være assosiert med en tungkjedegruppe og (3) enkeltkjedepolypeptider som inneholder bare ett tungkjedevariabelt område eller e t fragment av dette som inneholder de tre CDR'er i det tungkjedevariable området uten å være assosiert med en lettkjedegruppe; og multispesifikke antistoffer dannet av antistoffragmenter. Det kan for eksempel fremstilles Fab- eller F(ab')2fragmenter ved proteasekutting av isolerte antistoffer ved hjelp av vanlig kjent teknikk.
Det er underforstått at immunreaktive fragmenter kan modifiseres ved å bruke kjente fremgangsmåter, for eksempel for å redusere eller forsinke fjerningen av antistoffet in vivo og derved oppnå en mer ønskelig farmakokinetisk profil.
Fragmentet kan for eksempel modifiseres ved polyetylenglykol (PEG) eller polyoksyetylerte polyoler. Fremgangsmåter for kobling og setespesifikk konjugering av PEG til et Fab'-fragment er for eksempel beskrevet i Leong et al, Cytokine 16(3): 106-119 (2001) og Delgado et al, Br. J. Cancer 73(2): 175-182 (1996), hvis beskrivelser her er inkorporert som referanser.
I et spesielt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og antistoffderivater som omfatter den lett- og/eller tungkjedevariable områdesekvensen til 1-7F9 eller 1-4F1 som angitt på figur 14. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, antistoffragmenter og derivater av disse som omfatter ett eller flere av de lett- og/eller tungkjedevariable områdene CDRer til 1-7F9 eller 1-4F1 som angitt på figur 15 eller beskrevet ovenfor. Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan utvikles ved å anvende egnede substitusjoner, adderinger og/eller delesjoner i de beskrevne aminosyresekvensene ved å bruke standardteknikker som kan lettes ved sammenligningen av sekvensene. Ut fra en superimposisjon av krystallstrukturene til 1-7F9/KIR2DL1-komplekset og KIR2DL1/MHC klasse I-komplekset (Fan et al., Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460), PDB-kode 1IM9, kan det konkluderes at et scFv-derivat av 1-7F9 vil være i stand til å blokkere MHC klasse I-binding til KIR2DL1. Også enkelt L-kjeden av 1-7F9 eller enkelt VL-domenet av 1-7F9 alene når de er bundet til KIR2DL1, vil være i stand ti l å blokkere MHC klasse I-binding.
Funksjonelle varianter/analoger av slike sekvenser kan utvikles ved å anvende egnede substitusjoner, adderinger og/eller delesjoner av disse beskrevne aminosyresekvensene ved å bruke standardteknikker som kan lettes ved sammenligningen av sekvensene. I et annet aspekt kan posisjoner hvor en rest er tilstede i en sekvens i ett av disse antistoffene men ikke i et annet, være egnet for delesjoner, substitusjoner og/eller innsettinger.
Alternativt kan det DNA som koder et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen så som et 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoff modifiseres slik at det koder for et fragment ifølge oppfinnelsen. Det modifiserte DNA kan så innsettes i en ekspresjonsvektor og brukes for å transformere eller transfektere en passende celle som så vil uttrykke det forønskede fragmentet, slik det er beskrevet et annet sted i søknaden.
I en alternativ utførelse kan DNA fra et hybridom som produserer et murint antistoff ifølge oppfinnelsen så som et DF200-lignende antistoff, modifiseres før det innsettes i en ekspresjonsvektor, for eksempel ved å anvende den kodende sekvensen for humane tung- og lettkjedekonstante domener i stedet for de homologe ikke-humane sekvensene (slik det for eksempel er beskrevet av Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, side 6851 (1984)). I en annen utførelse kan de variable områdene som koder antistoffet ifølge oppfinnelsen forenes ved hjelp av rekombinant DNA-manipulering med den immunglobulinkodende sekvensen eller hele eller en del av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulinpolypeptid. På denne måten får man fremstilt "kimære" eller "hybride" antistoffer som har den bindende spesifisiteten til det opprinnelige antistoffet. Slike ikkeimmunglobulinpolypeptider vil så typisk erstatte de konstante domenene i et antistoff ifølge oppfinnelsen.
Ifølge en annen utførelse vil således antistoffet ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis et DF200-lignende antistoff, bli humanisert. "Humaniserte" former av antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen er spesifikke kimære immunglobuliner, immunglobulinkjeder eller fragmenter av disse (så som Fv, Fab, Fav', F(ab')2 eller andre antigenbindende undersekvenser av antistoffer) som inneholder en minimal sekvens avledet fra det murine immunglobulinet. I de fleste tilfeller vil de humaniserte antistoffene være humane immunglobuliner (mottakende antistoff) hvor rester fra et komplementært bestemmende område (CDR) fra mottakeren er erstattet med rester fra et CDR fra det opprinnelige antistoffet (donorantistoffet) samtidig som den forønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten til det opprinnelige antistoffet beholdes. I enkelte tilfeller kan Fv-rammeverksrester fra det humane immunglobulinet erstattes med tilsvarende ikke-humane rester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatter rester som ikke finnes hverken i mottakerantistoffet eller i det importerte CDR eller rammeverkssekvensene. Disse modifikasjonene kan utføres for ytterligere å raffinere og optimalisere antistoffets atferd eller reaksjonsevne. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte i vesentlig alle eller i det minste ett, typisk to, variable domener hvor alle eller i alt vesentlig alle CDR-områdene tilsvarer de fra det opprinnelige antistoffet og alle eller i alt vesentlig alle FR-områdene er de fra en human immunglobulin konsensussekvens. Det humaniserte antistoffet vil også optimalt kunne omfatte i det minste en del av et immunglobulinkonstant område (Fc), typisk fra et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al., Nature, 321, side 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, side 323 (1988); og Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, side 593 (1992).
Fremgangsmåter for å humanisere antistoffene ifølge oppfinnelsen er velkjente innenfor bioteknologien. Et humanisert antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen vil generelt inneholde en eller flere aminosyrerester som er innført fra det opprinnelige antistoffet. Disse murine eller andre ikke-humane aminosyrerestene blir ofte betegnet som "import"-rester og vil typisk være tatt fra et "import"-variabelt domene. Humaniseringen kan i alt vesentlig utføres ved å anvende fremgangsmåten til Winter og hans medarbeidere (Jones et al., Nature, 321, side 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, side 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, side 1534 (1988)). Slike "humaniserte" antistoffer er følgelig kimære antistoffer (Cabilly et al., U.S. patent nr. 4,816,567), hvori alt vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt område er blitt erstattet med den tilsvarende sekvensen fra det opprinnelige murine antistoffet. I praksis vil humaniserte antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen typisk være humane antistoffer hvor noen CDR-rester og muligens noen FR-rester er blitt erstattet med rester fra de analogene setene i det opprinnelige murine antistoffet.
Valget av humane variable domener, både lette og tunge, som kan brukes ved fremstilling av humaniserte antistoffer er meget viktig for å redusere antigenisitet. Ifølge den såkalte "best-tilpassede" metoden, så vil sekvensen for det variable domenet i et antistoff ifølge oppfinnelsen bli screenet mot hele biblioteket av kjente humane variable domenesekvenser. Den humane sekvensen som så ligger nærmest tilsvarende sekvens fra musen, blir så akseptert som det humane rammeverket (FR) for det humaniserte antistoffet (Sims et al., J. Immunol., 151, side 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, side 901 (1987)). En annen fremgangsmåte bruker et spesielt rammeverk fra konsensussekvensen fra alle humane antistoffer av en spesiell undergruppe av lette eller tunge kjeder. Det samme rammeverket kan brukes for flere humaniserte antistoffer (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, side 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51, side 1993)).
Det er videre viktig at antistoffene blir humanisert samtidig som de beholder den høye affiniteten for multiple hemmende KIR-reseptorer og andre gunstige biologiske egenskaper. For å oppnå dette ifølge en foretrukket fremgangsmåte, så blir det fremstilt humaniserte antistoffer ved en analyseprosess av de opprinnelige sekvensene og forskjellige konseptuelle humaniserte produkter ved å bruke tredimensjonale modeller på de parenterale eller opprinnelige og humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er generelt t ilgjengelige og velkjente innenfor bioteknologien. Det er tilgjengelig dataprogrammer som illustrerer og frembringer mulige tredimensjonale konformasjonelle strukturer av valgte kandidatimmunglobulinsekvenser. En undersøkelse av disse strukturene muliggjør en analyse av den sannsynlige rollen til enkelrester med hensyn til funksjonen til kandidatimmunglobulinsekvensen, det vil si analysen av de rester som påvirker kandidatimmunglobulinets evne til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-rester velges og kombineres fra konsensus- og importsekvensene slik at man oppnår forønskede antistoffegenskaper, for eksempel en forbedret affinitet i forhold til målantigenet eller -antigenene. Generelt vil CDR-restene være direkte og mest vesentlig involvert når det gjelder å påvirke antigenbinding.
Som beskrevet ovenfor, så vil en fremgangsmåte for å fremstille humane monoklonale antistoffer være å bruke en Xenomus® (Abgenix, Fremont, CA) som den musen som brukes for immunisering. En Xenomus er en murin vert ifølge den foreliggende oppfinnelsen som har sine immunglobulingener erstattet med funksjonelle humane immunglobulingener. Antistoffer som således fremstilles ved hjelp av denne musen eller i hybridomer fremstilt fra B-celler fra denne musen vil således allerede være humaniserte. Xenomusen er beskrevet i US patent nr.
6,162,963 som her er inkorporert i sin helhet som referanse. En analog fremgangsmåte er å bruke en HuMab-mus<TM>(Medarex).
Humane antistoffer kan også fremstilles ved hjelp av forskjellige andre teknikker som for eksempel å bruke andre transgene dyr for immunisering hvor dyret er blitt manipulert slik at det uttrykker et humant antistoffrepertoar (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255) eller ved å velge ut antistoffrepertoar ved å bruke fagdisplaymetoder. Slike fremgangsmåter og teknikker er velkjente innenfor bioteknologien og kan implementeres ved å gå ut fra de monoklonale antistoffene som er beskrevet i den foreliggende søknaden.
Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, fortrinnsvis et 1-7F9- eller 1-4F1-lignende antistoff, kan også derivatiseres til "kimære" antistoffer (immunglobuliner) hvor en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i det opprinnelige antistoffet mens resten av kjeden er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra andre arter eller som hører til en annen antistoffklasse eller underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge som de har den forønskede biologiske aktiviteten (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, side 6851 (1984)).
Andre derivater som ligger innenfor den foreliggende oppfinnelsen inkluderer funksjonaliserte antistoffer, det vil si antistoffer som er konjugert eller kovalent bundet til et toksin så som ricin, difteritoksin, abrin og Pseudomonas exotoxin eller et terapeutisk radionuklide så som for eksempel<90>Y eller<131>I; til en påvisbar gruppe så som en fluorescerende gruppe, en diagnostisk radioisotop eller et billeddannende middel; eller til et fast underlag så som agaroseperler eller lignende.
Fremgangsmåter for konjugering eller kovalent binding av disse andre midlene til antistoffer, er velkjente innenfor bioteknologien.
Konjugering til et toksin kan brukes for målsøkende avlivning av NK-celler som har en eller flere kryssreagerende KIR-reseptorer på sin celleoverflate. Så snart antistoffet ifølge oppfinnelsen binder seg til celleoverflaten på slike celler, blir det internalisert og toksinet blir så frigjort på innsiden av cellen og derved selektivt avlive denne cellen. En slik anvendelse er en alternativ utførelse av den foreliggende oppfinnelsen.
Konjugering til en påvisbar gruppe kan brukes når antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen skal brukes for diagnostiske formål. Slike formål inkluderer, men er ikke begrenset til, en undersøkelse av biologiske prøver for nærvær av NK-celler som bærer det kryssreagerende KIR på sine celleoverflater og for å påvise nærværet av NK-celler som bærer det kryssreagerende KIR i en levende organisme. Slike prøver og påvisningsmetoder er også alternative utførelser av den foreliggende oppfinnelsen.
Konjugering av et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen til et fast underlag, kan brukes som et verktøy for affinitetsrensing av NK-celler som bærer det kryssreagerende KIR på sin overflate fra en kilde så som en biologisk væske. Denne fremgangsmåten for rensing er en annen alternativ utførelse av den foreliggende oppfinnelsen og vil resultere i en renset populasjon av NK-celler.
FARMASØYTISKE SAMMENSETNINGER OG ANVENDELSER
Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger som omfatter et humant eller humanisert antistoff eller fragmenter eller derivater av disse, hvor nevnte antistoff, fragment eller derivat kryssreagerer med minst to hemmende KIR-reseptorer på overflaten av NK-celler, reduserer eller nøytraliserer deres hemmende signaler og forsterker aktiviteten til disse cellene i enhver egnet bærervæske i en mengde som effektivt og påvisbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient eller i en biologisk prøve som omfatter NK-celler. Farmasøytiske sammensetninger som omfatter et humant eller humanisert anti-KIR mAb, eventuelt sammen med et annet aktivt middel for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan formuleres med farmasøytisk akseptable bærere eller fortynningsmidler så vel som andre kjente adjuvanser og eksipienser i overensstemmelse med vanlig kjent teknikk, for eksempel slik det er beskrevet i Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Sammensetningene kan opptre i vanlig kjente former, for eksempel som kapsler, tabletter, aerosoler, løsninger eller suspensjoner eller som et frysetørket pulver.
Det er følgelig en hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en farmasøytisk formulering som omfatter et humant eller humanisert antistoff eller fragmenter eller derivater av disse, som er tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml til 500 mg/ml og hvor nevnte formulering har en pH fra 2,0 til 10,0. Formuleringen kan videre omfatte et buffersystem, konserveringsmidler, tonisitetsmidler, chelatdannere, stabilisatorer og overflateaktive midler. I en utførelse av oppfinnelsen er den farmasøytiske formuleringen en vandig formulering, det vil si en formulering som omfatter vann. En slik formulering vil typisk være en løsning eller en suspensjon. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er den farmasøytiske formuleringen en vandig løsning. Slik begrepet "vandig formulering" brukes her, forstås en formulering som omfatter minst 50% vekt/vekt av vann. På lignende måte betyr begrepet "vandig løsning" en løsning som omfatter minst 50% vekt/vekt vann og begrepet "vandig suspensjon" betyr en suspensjon som omfatter minst 50% vekt/vekt av vann.
I en annen utførelse er den farmasøytiske formuleringen en frysetørket formulering hvor den behandlende legen eller pasienten tilsetter løsemidler og/eller fortynningsmidler før bruk.
I en annen utførelse er den farmasøytiske formuleringen en tørket formulering (for eksempel frysetørket eller spraytørket) som er ferdig for bruk uten en foregående oppløsning.
I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en farmasøytisk formulering som omfatter en vandig løsning av et antistoff som beskrevet her og en buffer, og hvor nevnte antistoff er tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml eller mer, og hvor nevnte formulering har en pH fra omtrent 2,0 til omtrent 10,0.
I en annen utførelse er pH-verdien på formuleringen valgt fra listen som består av 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 og 10,0.
I en ytterligere utførelse er bufferen valgt fra gruppen bestående av natriumacetat, natriumkarbonat, citrat, glysylglysin, histidin, glysin, lysin, arginin, natriumhydrogenfosfat, dinatriumhydrogenfosfat, natriumfosfat og tris(hydroksymetyl)aminometan, bicin, tricin, eplesyre, suksinat, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, asparginsyre eller blandinger av disse. Hver av disse spesifikke buffere utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen også et farmasøytisk akseptabelt konserveringsmiddel. I en annen utførelse er konserveringsmiddelet valgt fra gruppen bestående av fenol, o-kresol, m-kresol, p-kresol, metyl p-hydroksybenzoat, propyl p-hydroksybenzoat, 2-fenoksyetanol, butyl p-hydroksybenzoat, 2-fenyletanol, benzylalkohol, klorbutanol og tiomerosal, bronopol, benzosyre, imidurea, klorheksidin, natriumdehydroacetat, klorkresol, etyl p-hydroksybenzoat, benzetoniumklorid, klorfenesin (3p-klorfenoksypropan-1,2-diol) eller blandinger av disse. I en utførelse er konserveringsmiddelet tilsatt i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 20 mg/ml. I en annen utførelse er konserveringsmiddelet tilstede i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 5 mg/ml. I en ytterligere utførelse er konserveringsmiddelet tilstede i en konsentrasjon fra 5 mg/ml til 10 mg/ml. I en enda ytterligere utførelse er konserveringsmiddelet tilstede i en konsentrasjon f ra 10 mg/ml til 20 mg/ml. Hvert av de spesifikke konserveringsmidler som er angitt ovenfor, utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen. Bruken av konserveringsmidler i farmasøytiske sammensetninger er velkjent innenfor farmasien, og rent hensiktsmessig se Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, 1995.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen også et isotont middel. I en utførelse er det isotone middelet valgt fra gruppen bestående av et salt (for eksempel natriumklorid), et sukker, en sukkeralkohol, et aminosukker, en aminosyre (for eksempel L-glysin, L-histidin, arginin, lysin, isoleucin, asparginsyre, tryptofan og treonin), en alditol (for eksempel glyserol (glyserin), 1,2-propandiol (propylenglykol), 1,3-propandiol, 1,3-buytandiol) og polyetylenglykol (for eksempel PEG400) eller blandinger av disse. Ethvert egnet sukker kan brukes og inkluderer, men er ikke begrenset til, mono-, di- eller polysakkarider; og vannløselige glukaner så som for eksempel fruktose, glukose, mannose, sorbose, xylose, maltose, laktose, sukrose, trehalose, dekstran, pullulan, dekstrin, syklodekstrin, løselig stivelse, hydroksyetylstivelse og karboksymetylcellulose-Na. I en utførelse er sukkeradditivet sukrose. En sukkeralkohol er definert som et C4-C8-hydrokarbon med minst én -OH-gruppe og inkluderer for eksempel mannitol, sorbitol, inositol, galaktitol, dulcitol, xylitol og arabitol. I en utførelse er sukkeralkoholadditivet mannitol. De sukkere og sukkeralkoholer som er nevnt ovenfor kan brukes individuelt eller i kombinasjon. Det er ingen fast grense med hensyn til den mengden som brukes, så lenge som sukkeret eller sukkeralkoholen er løselig i det flytende preparatet og ikke på skadelig måte påvirker de stabiliserende effekter som oppnås ved å bruke fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. I en utførelse er sukker- eller sukkeralkoholkonsentrasjonen mellom omtrent 1 mg/ml og omtrent 150 mg/ml. I en annen utførelse er det isotone middelet tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml til 50 mg/ml. I en annen utførelse er det isotone middelet tilstede i en konsentrasjon fra 1 mg/ml til 7 mg/ml. I en annen utførelse er det isotone middelet tilstede i en konsentrasjon fra 8 mg/ml til 24 mg/ml. I en annen utførelse er det isotone middelet tilstede i en konsentrasjon fra 25 mg/ml til 50 mg/ml. Hvert av de spesifikke isotone midlene som er angitt ovenfor utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen. Bruken av et isotont middel i farmasøytiske sammensetninger er velkjent innenfor farmasien og i så henseende henvises de t til Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, 1995.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen en chelatdanner. I en utførelse er chelatdanneren valgt fra salter av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), sitronsyre og asparginsyre og blandinger av disse. I en annen utførelse chelatdanneren tilstede i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 5 mg/ml. I en annen utførelse er chelatdanneren tilstede i en konsentrasjon fra 0,1 mg/ml til 2 mg/ml. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er chelatdanneren tilstede i en konsentrasjon fra 2 mg/ml til 5 mg/ml. Hvert av disse spesifikke chelatdannerene som er nevnt ovenfor utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen. Bruken av en chelatdanner i farmasøytiske sammensetninger er velkjente innenfor farmasien og i så henseende refereres det til Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, 1995.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen også en stabilisator. Bruken av en stabilisator i farmasøytiske sammensetninger er velkjent innenfor farmasien og i så henseende refereres det til Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, 1995.
Sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan for eksempel være stabiliserte flytende farmasøytiske sammensetninger hvis terapeutisk aktive komponenter inkluderer et polypeptid som eventuelt oppviser aggregatdannelse ved lagring i flytende farmasøytiske formuleringer. Med begrepet "aggregatdannelse" forstås en fysisk interaksjon mellom polypeptidmolekylene som resulterer i dannelsen av oligomerer som forblir løselige, eller synlige aggregater som utfelles fra løsningen. Uttrykket "under lagring" betyr at en flytende farmasøytisk sammensetning eller formulering, så snart den er fremstilt, ikke umiddelbart administreres en pasient. Etter fremstilling vil den snarere bli pakket for lagring, enten i væskeform, i frosset tilstand eller i tørket form for senere rekonstituering i en væskeform eller en annen form som er egnet for administrering til en pasient. Med begrepet "tørket form" forstås at den flytende farmasøytiske sammensetningen eller formuleringen er tørket enten ved frysetørking (se for eksempel Williams og Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), forstøvningstørking (se Masters (1991) i Spray-Drying Handbook (5. utgave; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), sidene 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; og Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), eller lufttørking (Carpenter og Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; og Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). Aggregatdannelse av et polypeptid under lagring av en flytende farmasøytisk sammensetning kan skadelig påvirke polypeptidets biologiske aktivitet, noe som resulterer i et tap av den farmasøytiske sammensetningens terapeutiske effekt.
Aggregatdannelse kan videre forårsake andre problemer så som tiltetting av rør, membraner eller pumper når den polypeptidholdige farmasøytiske sammensetningen administreres via et infusjonssystem.
Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en mengde av en aminosyrebase i tilstrekkelig grad til å redusere aggregatdannelse av polypeptidet under lagring av sammensetningen. Med begrepet "aminosyrebase" forstås en aminosyre eller en kombinasjon av aminosyrer hvor enhver gitt aminosyre enten er tilstede i sin frie baseform eller i en saltform. Når det brukes en kombinasjon av aminosyrer, så kan alle aminosyrene være tilstede i sine frie baseformer, alle kan være tilstede i sine saltformer eller noen kan være tilstede i sine frie baseformens mens de andre er tilstede i sine saltformer. I en utførelse er de aminosyrene som brukes for fremstilling av sammensetninger ifølge oppfinnelsen slike som har en ladd sidekjede så som arginin, lysin, asparginsyre og glutaminsyre. Enhver stereoisomer (det vil si L, D eller en blanding av slike) av en spesiell aminosyre (for eksempel metionin, histidin, imidazol, arginin, lysin, isoleukin, asparginsyre, tryptofan, treonin og blandinger av slike) eller kombinasjoner av slike stereoisomere former, kan være tilstede i de farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen så lenge den spesielle aminosyren enten er tilstede i sin frie baseform eller i sin saltform. I en utførelse brukes L-stereoisomeren. Sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan formuleres med analoger av disse aminosyrene. Med begrepet "aminosyreanalog" forstås et derivat av en naturlig forekommende aminosyre som frembringer den forønskede effekt med hensyn til å redusere aggregatdannelse av polypeptidet under lagring av de flytende farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen. Egnede argininanaloger inkluderer for eksempel aminoguanidin, ornitin og N-monoetyl L-arginin, egnede metioninanaloger inkluderer etionin og butionin og egnede cysteinanaloger inkluderer S-metyl-L-cystein. Som med de andre aminosyrene, så inkorporeres eller tilsettes også aminosyreanalogene til sammensetningene i enten sin frie baseform eller sin saltform. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen blir aminosyrene eller aminosyreanalogene brukt i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å hindre eller forsinke aggregering av proteinet.
I en ytterligere utførelse blir metionin (eller andre svovelholdige aminosyrer eller aminosyreanaloger) tilsatt for å hemme oksidasjon av metioninrester til metionsulfoksid når det polypeptidet som virker som det terapeutiske middelet er et polypeptid som omfatter minst én metioninrest som er utsatt for slik oksidasjon. Med å "hemme" forstås en minimal akkumulering av metioninoksiderte forbindelser over tid. En hemming av metioninoksidasjon resulterer i et større bibehold av polypeptidet i sin passende molekylære form. Enhver stereoisomer av metionin (L eller D) eller kombinasjoner av disse kan brukes. Den mengden som tilsettes bør være en mengde som er tilstrekkelig til å hemme oksidasjon av metioninrester slik at mengden av metioninsvoveloksid er akseptabel for regulerende myndigheter. Typisk betyr dette at sammensetningen inneholder maksimalt fra omtrent 10% til omtrent 30% metioninsulfoksid. Generelt kan dette oppnås ved å tilsette metionin slik at forholdet metionin til metionrester varierer fra omtrent 1:1 til omtrent 1000:1, så som fra 10:1 til omtrent 100:1.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen også en stabilisator valgt fra gruppen av høymolekylære polymerer eller lavmolekylære forbindelser. I en utførelse er stabilisatoren valgt fra polyetylenglykol (for eksempel PEG 3350), polyvinylalkohol (PVA), polyvinylpyrrolidon, karboksy-/hydroksycellulose eller derivater av disse (for eksempel HPC, HPC-SL, HPC-L og HPMC), syklodekstriner, svovelholdige stoffer så som monotioglyserol, tioglykolinsyre og 2-metyltioetanol og forskjellige salter (for eksempel natriumklorid). Hver enkelt av disse spesifikke stabilisatorene utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen.
De farmasøytiske sammensetningene kan også omfatte ytterligere stabiliserende midler som ytterligere bedrer stabiliteten til det terapeutisk aktive polypeptidet. Stabiliserende midler av spesiell interesse i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, metionin og EDTA som beskytter polypeptidet mot metioninoksidasjon og et ikke-ionisk overflateaktivt middel som beskytter polypeptidet mot aggregering som er assosiert med frysetørking eller mekanisk skjæring.
I en ytterligere utførelse omfatter formuleringen også et overflateaktivt middel. I en utførelse er det overflateaktive middelet valgt fra et rensemiddel, etoksylert ricinusolje, polyglykolyserte glyserider, acetylerte monoglyserider, sorbitan fettsyreestere, polyoksypropylen-polyoksyetylenblokkpolymerer (for eksempel poloksamerer så som Pluronic® F68, poloksamer 188 og 407, Triton X-100 ), polyoksyetylensorbitan fettsyreestere, polyoksyetylen- og polyetylenderivater så som alkylerte og alkoksylerte derivater (forskjellige typer tween, for eksempel Tween-20, Tween-40, Tween-80 og Brij-35), monoglyserider og etoksylerte derivater av disse, diglyserider eller polyoksyetylenderivater av disse, alkoholer, glyserol, lektiner og fosfolipider (for eksempel fosfatidylserin, fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol, difosfatidylglyserol og sfingomyelin), derivater av fosfolipider (for eksempel dipalmitoylfosfatidinsyre) og lysofosfolipider (for eksempel palmitoyllysofosfatidyl-L-serin og 1-acyl-sn-glysero-3-fosfateestere av etanolamin, kolin, serin eller treonin) og alkyl, alkoksyl (alkylester), alkoksy (alkyleter) -derivater av lysofosfatidyl og fosfatidylkoliner, for eksempel lauroyl- og myristoylderivater av lysofosfatidylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin og modifikasjoner av den polare toppgruppen, det vil si koliner, etanolaminer, fosfatidinsyre, seriner, treoniner, glyserol, inositol og de positivt ladde DODAC, DOTMA, DCP og BISHOP, lysofosfatidylserin og lysofosfatidyltreonin og glyserofosfolipider (for eksempel cefaliner), glyseroglykolipider (for eksempel galaktopyransoid), sfingoglykolipider (for eksempel ceramider, gangliosider), dodecylfosfokolin, hønseegglysolecitin, fusidinsyrederivater (for eksempel natriumtauro-dihydrofusidat, osv.), langkjedede fettsyrer og salter av disse C6-C12 (for eksempel oljesyre og kaprylsyre), acylkarnitiner og derivater, N<α>-acylerte derivater av lysin, arginin eller histidin eller sidekjedeacylerte derivater av lysin eller arginin, N<α>-acylerte derivater av dipeptider som omfatter enhver kombinasjon av lysin, arginin eller histidin og en nøytral eller sur aminosyre, N<α>-acylert derivat av et tripeptid som omfatter enhver kombinasjon av en nøytral aminosyre og to ladde aminosyrer, DSS (dokusatnatrium, CAS-registrering nr. [577-11-7]), dokusatekalsium, CAS-registrering nr. [128-49-4]), dokusatekalium, CAS-registrering nr. [7491-09-0]), SDS (natriumdodekylsulfat eller natriumlaurylsulfat), natriumkaprylat, kolinsyre eller derivater av denne, gallsyrer og salter av disse og glysin- og taurinkonjugater, ursodeoksykolinsyre, natriumkolat, natriumdeoksykolat, natriumtaurokolat, natriumglykokolat, N-heksadecyl-N,N-dimetyl-3-ammonio-1-propansulfonat, anioniske (alkylarylsulfonater) monovalente overflateaktive midler, zwitterioniske overflateaktive midler (for eksempel N-alkyl-N,N-dimetylammonio-1-propansulfonater, 3-kolamido-1-propyldimetylammonio-1-propansulfonat, kationiske overflateaktive midler (kvaternære ammoniumbaser) (for eksempel cetyltrimetylammoniumbromid, cetylpyridiniumklorid), ikke-ioniske overflateaktive midler (for eksempel dodecyl β-D-glukopyranosid), poloksaminer (for eksempel Tetronic's) som er tetrafunksjonelle blokksampolymerer avledet ved en sekvensmessig tilsetning av propylenoksid og etylenoksid til etylendiamin, eller så kan det overflateaktive middelet være valgt fra gruppen bestående av imidazolinderivater eller blandinger av slike. Hvert enkelt av disse spesifikke overflateaktive midlene utgjør en alternativ utførelse av oppfinnelsen.
Bruken av et overflateaktivt middel i farmasøytiske sammensetninger er velkjent innenfor farmasien, og i så henseende refereres det til Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. utgave, 1995.
I en ytterligere utførelse kan formuleringen også omfatte proteasehemmere så som EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) og benzamidin-HCl, skjønt også andre kommersielt tilgjengelige og egnede proteasehemmere også kan brukes. Bruken av en proteasehemmer er spesielt fordelaktig i farmasøytiske sammensetninger som omfatter zymogener av proteaser for å hindre autokatalyse.
Andre bestanddeler kan også være tilstede i den farmasøytiske formuleringen ifølge oppfinnelsen. Slike ytterligere bestanddeler kan inkludere fuktemidler, emulgeringsmidler, antioksidanter, volumgivende midler, tonisitetsmodifiserende midler, chelatdannere, metallioner, oljeholdige bærervæsker, proteiner (for eksempel humant serumalbumin, gelatin eller proteiner) og et zwitterion (for eksempel en aminosyre så som betain, taurin, arginin, glysin, lysin og histidin). Slike ytterligere bestanddeler bør fortrinnsvis ikke skadelig påvirke den totale stabiliteten til den farmasøytiske formuleringen ifølge den foreliggende oppfinnelsen.
Farmasøytiske sammensetninger som inneholder et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres en pasient som har behov for en slik behandling på flere steder, for eksempel på topiske steder, for eksempel i huden eller i slimhinnene, på steder som omgår absorpsjon, for eksempel administrering i en arterie, i en vene, i hjertet eller på steder som involverer absorpsjon, for eksempel administrering i huden, under huden, i en muskel eller i buken.
Administrering av farmasøytiske sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan utføres på flere forskjellige måter, for eksempel lingualt, sublingualt, bukalt, i munnen, oralt, i magesekken og i tarmkanalen, nasalt, i lunge, for eksempel gjennom bronkiene og alveolene eller en kombinasjon av disse, epidermalt, dermalt, transdermalt, vaginalt, rektalt, okulært, for eksempel gjennom konjunktiva, uretalt og parenteralt til pasienter som har behov for en slik behandling.
Sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan administreres i flere doseformer, for eksempel som løsninger, suspensjoner, emulsjoner, mikroemulsjoner, som multiple emulsjoner, skum, salver, pastaer, plastere, kremer, tabletter, belagte tabletter, rensevæsker, kapsler, for eksempel harde gelatinkapsler og myke gelatinkapsler, stikkpiller, rektale kapsler, dråper, geleer, som en dusj, pulvere, aerosoler, inhaleringspreparater, øyedråper, øyesalver, øyerensevæsker, vaginale pessarer, vaginale ringer, vaginale salver, injeksjonsløsning, in situ transformerende løsninger, for eksempel in situ geldannelse, in situ herding, in situ utfelling, in situ utkrystallisering, infusjonsløsninger og implantater.
Sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan videre opparbeides i eller knyttes til, for eksempel gjennom kovalente, hydrofobe og elektrostatiske interaksjoner, en medikamentbærer, et medikamentleveringssystem og avanserte medikamentleveringssystemer for ytterligere å bedre stabiliteten til antistoffet, øke dets biotilgjengelighet, øke løselighet, redusere skadelige effekter, oppnå kronoterapi som er velkjent innenfor den medisinske vitenskapen og bedre pasientens tilpasning til medisineringen eller enhver kombinasjon av disse.
Eksempler på bærere, medikamentleveringssystemer og avanserte medikamentleveringssystemer inkluderer, men er ikke begrenset til, polymerer, for eksempel cellulose og derivater, polysakkarider, for eksempel dekstran og derivater, stivelse og derivater, poly(vinylalkohol), akrylat- og metakrylatpolymerer, polymelkesyre og polyglykolinsyre og blokksampolymerer av disse, polyetylenglykoler, bærerproteiner, for eksempel albumin, geler, for eksempel termogelende systemer, for eksempel blokksampolymeriske systemer av velkjent type, miceller, liposomer, mikrokuler, nanopartikler, flytende krystaller og dispersjoner av disse, L2-fase og dispersjoner av disse som er velkjente for de med faglig innsikt i hvorledes faser opptrer i lipid-vannsystemer, polymeriske miceller, multiple emulsjoner, selv-emulgerende preparater, selv-mikroemulgerende preparater, syklodekstriner og derivater av disse og dendrimerer.
Sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan brukes for formulering av faste stoffer, halvfaste stoffer, pulvere og løsninger for lungeadministrering av antistoffet, for eksempel ved å bruke et inhaleringsapparat med doseutmåling, inhaleringsapparat for tørre pulvere og en forstøvningsanordning og hvor slike anordninger er velkjente innenfor farmasien og den medisinske vitenskapen.
Sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan spesifikt brukes i formuleringen av kontrollerte, vedvarende, utstrakte, forsinkede og langsomt frigjørende medikamentleveringssystemer. Mer spesifikt, men ikke begrenset til, så kan sammensetningene brukes ved formuleringen av parenteralt kontrollerte frigjørings- og vedvarende frigjøringssystemer (begge systemer fører til en mange gangers reduksjon med hensyn til antallet administreringer), noe som er velkjent innen den farmasøytiske industrien. Enda mer foretrukket er det at de kontrollerte, frigjørende og vedvarende frigjørende systemene administreres subkutant. Uten å begrense oppfinnelsen som sådan, så er eksempler på brukbare kontrollerte frigjørende systemer og sammensetninger hydrogeler, oljeholdige geler, flytende krystaller, polymere miceller, mikrokuler og nanopartikler.
Fremgangsmåter for å produsere kontrollerte frigjørende systemer som kan brukes for sammensetninger ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, utkrystallisering, kondensering, samutkrystallisering, utfelling, samutfelling, emulgering, dispergering, høytrykks homogenisering, innkapsling, forstøvningstørking, mikroinnkapsling, samacervering, faseseparasjon, løsemiddelfordampning for å fremstille mikrokuler, utdrivning og superkritiske væskeprosesser. I så henseende refereres det til Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., red. Marcel Dekker, New York, 2000) og Drug and the Pharmaceutical Sciences bind 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., red. Marcel Dekker, New York, 2000).
Parenteral administrering kan utføres ved subkutan, intramuskulær, intraperitoneal eller intravenøs injeksjon ved hjelp av en sprøyte, eventuelt ved hjelp av en blyantlignende sprøyte. Alternativt kan parenteral administrering utføres ved hjelp av en infusjonspumpe. En ytterligere mulighet er en sammensetning som kan være en løsning eller suspensjon for administrering av antistoffet i form av en nese- eller lungespray. Som en annen mulighet kan de farmasøytiske sammensetningene som inneholder antistoffet ifølge oppfinnelsen også tilpasses for transdermal administrering, for eksempel ved en nålefri injeksjon eller fra et plaster, eventuelt som et iontoforetisk plaster eller gjennom slimhinnen, for eksempel ved bukal administrering.
Antistoffet kan også administreres via lungene i en bærervæske som en løsning, suspensjon eller som et tørt pulver ved å bruke enhver av kjente typer anordninger som er egnet for lungemedikamentlevering. Eksempler på disse omfatter, men er ikke begrenset til, tre generelle typer av aerosolutvikling for lungemedikamentlevering og kan inkludere stråle- eller ultralydforstøvningsapparater, inhaleringsapparater med doseutmålingsanordning eller inhaleringsapparater for tørre pulvere (kfr. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).
Basert på standardiserte testingsmetodologi, så vil den aerodynamiske diameteren (da) til en partikkel være definert som den geometrisk ekvivalente diameteren for en referanse standard kuleformet partikkel med enhetstetthet (1 g/cm<3>). I det enkleste tilfellet for kuleformede partikler, så vil davære relatert til en referansediameter (d) som en funksjon av kvadratroten av tetthetsforholdet slik det er beskrevet ved følgende formel:
Modifikasjoner av dette forholdet opptrer for partikler som ikke er kuleformede (kfr. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Begrepene "MMAD" og "MMEAD" er velkjente innenfor farmasien (kfr. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Den massemediane aerodynamiske diameteren (MMAD) og den massemediane effektive aerodynamiske diameteren (MMEAD) som brukes om hverandre, er statistiske parametere og beskriver empirisk størrelsen på aerosolpartikler i forhold til deres potensiale til å bli avsatt i lungene og er uavhengige av den virkelige formen, størrelsen eller tettheten (kfr. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). MMAD blir normalt beregnet ut fra målinger som er gjort ved hjelp av såkalte impaktorer, et instrument som måler partiklenes inertielle opptreden i luft.
I en ytterligere utførelse kan formuleringen omdannes til en aerosol ved hjelp av enhver kjent teknologi for fremstilling av aerosoler, så som et forstøvningsapparat, for å oppnå en MMAD-verdi for aerosolpartiklene som er mindre enn 10 μm, fortrinnsvis 1-5 μm og mest foretrukket 1-3 μm. Den foretrukne partikkelstørrelsen er basert på den mest effektive størrelsen for levering av et medikament til den dypere delen av lungen hvor proteinet blir optimalt absorbert (kfr. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).
Dyplungeavsetning av lungeformuleringene som omfatter antistoffet kan eventuelt ytterligere optimaliseres ved å bruke modifikasjoner av inhaleringsteknikkene, for eksempel, men ikke begrenset til: Langsom inhaleringsstrøm (for eksempel 30 l/minutt), holde pusten og en tidstilpasning til det tidspunkt da virkningen opptrer.
Begrepet "stabilisert formulering" refererer seg til en formulering med bedret fysisk stabilitet, bedret kjemisk stabilitet eller bedret fysisk og kjemisk stabilitet.
Begrepet "fysisk stabilitet" for proteinformuleringen slik det brukes her, refererer seg til proteinets tendens til å danne biologisk inaktive og/eller uløselige aggregater av proteinet som et resultat av at proteinet eksponeres for varmemekanisk stress eller påkjenning og/eller interaksjon med grenseflater og overflater som er destabiliserende så som hydrofobe overflater og grenseflater. Fysisk stabilitet for vandige proteinformuleringer blir vanligvis bedømt ved hjelp av visuell undersøkelse og/eller ved turbiditetsmålinger etter at formuleringen fylt i egnede beholdere (for eksempel patroner eller ampuller) blir eksponert for mekanisk/fysisk stress (for eksempel røring) ved forskjellige temperaturer i forskjellige tidsrom. Visuell undersøkelse av formuleringene utføres i et skarpt fokusert lys mot en mørk bakgrunn. Formuleringens turbiditet er karakterisert ved en visuell score som rangerer graden av turbiditet, for eksempel på en skala fra 0 til 3 (en formulering som er helt uten turbiditet tilsvarer en visuell score på 0, mens en formulering som har tydelig visuell turbiditet i dagslys tilsvarer en visuell score på 3). En formulering er klassifisert som fysisk ustabil med hensyn til proteinaggregering når den har visuell turbiditet i dagslys. Alternativt kan formuleringens turbiditet bedømmes ved enkle turbiditetsmålinger av velkjent type. Fysisk stabilitet for vandige proteinformuleringer kan også bedømmes ved å bruke et spektroskopisk middel eller en probe på proteinets konformasjonelle status. Proben er fortrinnsvis et lite molekyl som preferensielt binder seg til en ikke-nativ eller naturlig konformasjoner av proteinet. Et eksempel på en liten molekylær spektroskopisk probe på proteinstruktur er tioflavin T. Tioflavin T er et fluorescerende fargestoff som er meget anvendt for å påvise amyloide fibriller. I nærvær av fibriller og muligens også andre konfigurasjoner, så gir tioflavin T opphav til et nytt eksitasjonsmaksimum på omtrent 450 nm og en bedret emisjon ved omtrent 482 nm når det er bundet til en fibrilproteinform. Ubundet tioflabin T er i alt vesentlig ikke -fluorescerende ved nevnte bølgelengder.
Andre mindre molekyler kan også brukes som prober på forandringer med hensyn til proteinstrukturen fra native til ikke-native tilstander. For eksempel vil "hydrofobe flekk"-prober binde seg preferensielt til eksponerte hydrofobe flekker på et protein. Hydrofobe flekker er generelt begravd eller forefinner seg i den indre tertiære strukturen til et protein i dets native eller naturlige tilstand, men blir eksponert etter hvert som proteinet begynner å folde seg ut eller bli denaturert. Eksempler på slike små molekylære spektroskopiske prober er aromatiske hydrofobe fargestoffer så som antracen, akridin, fenantrolin og lignende. Andre spektroskopiske prober er metall-aminosyrekomplekser så som koboltmetallkomplekser av hydrofobe aminosyrer så som fenylalanin, leucin, isoleucin, metionin og valin eller lignende.
Begrepet "kjemisk stabilitet" i forbindelse med proteinformuleringen slik det brukes her, refererer seg til kjemiske kovalente forandringer i proteinstrukturen som fører til dannelsen av kjemiske nedbrytningsprodukter med et mulig tap av biologisk styrke og/eller mulig bedret immunogene egenskaper sammenlignet med den naturlige opprinnelige proteinstrukturen. Forskjellige kjemiske nedbrytningsprodukter kan dannes avhengig av typen og naturen til det naturlige proteinet og det miljø som proteinet eksponeres for. Eliminering av kjemisk nedbrytning kan sannsynligvis ikke elimineres eller unngås fullstendig og økende mengder av kjemiske nedbrytningsprodukter kan ofte ses eller observeres under lagring og bruk av proteinformuleringen, noe som er velkjent for personer med faglig innsikt. De fleste proteiner er utsatt for deamidering, det vil si en prosess hvor sidekjedeamidgruppen i glutaminyl- eller asparaginylrestene blir hydrolysert og danner en fri karboksylsyre. Andre nedbrytningsveier innbefatter eller involverer dannelsen av høymolekylære transformeringsprodukter hvor to eller flere proteinmolekyler blir kovalent bundet sammen ved transaminering og/eller disulfidinteraksjoner, noe som fører til en dannelse av kovalent bundne dimer-, oligomer- og polymernedbrytningsprodukter (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Oksidasjon (for eksempel av metioninrester) kan nevntes som en annen variant av kjemisk nedbrytning. Den kjemiske stabiliteten til proteinformuleringen kan bedømmes ved å måle mengden av kjemiske nedbrytningsprodukter på forskjellige tidspunkter etter eksponering for varierende miljøbetingelser (dannelsen av nedbrytningsproduktene kan ofte akselereres ved for eksempel å øke temperaturen). Mengden av hvert av de individuelle nedbrytningsproduktene kan ofte bestemmes ved å skille produktene avhengig av molekylstørrelse og/eller ladning ved å bruke forskjellige kromatografiske teknikker (for eksempel SEC-HPLC og/eller RP-HPLC).
Som nevnt ovenfor vil således en "stabilisert formulering" referere seg til en formulering med bedret fysisk stabilitet, bedret kjemisk stabilitet eller bedret fysisk og kjemisk stabilitet. Generelt må en formulering være stabil under bruk og lagring (i overensstemmelse med de anbefalte bruks- og lagringsbetingelser) inntil utløpsdatoen blir nådd.
I en utførelse av oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske formuleringen et antistoff som er stabilt i mer enn 6 uker under bruk og mer enn 3 år under lagring.
I en annen utførelse av oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske formuleringen et antistoff som er stabilt i mer enn 4 uker under bruk og mer enn 3 år ved lagring.
I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske formuleringen et antistoff som er stabilt i mer enn 4 uker under bruk og mer enn to år under lagring.
I enda en ytterligere utførelse av oppfinnelsen omfatter den farmasøytiske formuleringen et antistoff som er stabilt i mer enn 2 uker under bruk og i mer enn to år under lagring.
Som beskrevet ovenfor så kan farmasøytisk akseptable bærere som kan brukes i disse sammensetningene inkludere, men ikke være begrenset til, ioneutbyttere; aluminiumoksid; aluminiumstearat; lecitin; serumprotein så som humant serumalbumin; bufferstoffer så som fosfater og glysin; sorbinsyre; kaliumsorbat; delvise glyseridblandinger av mettede vegetabilske fettsyrer; vann; salter eller elektrolytter så som protaminsulfat, dinatriumhydrogenfosfat, kaliumhydrogenfosfat, natriumklorid og sinksalter; kolloidalt silika; magnesiumtrisilikat; polyvinylpyrrolidon; cellulosebaserte stoffer; polyetylenglykol; natriumkarboksymetylcellulose; polyakrylater; forskjellige typer voks; polyetylen-polyoksyprolyenblokkpolymerer; polyetylenglykol; og ullfett.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan brukes i en fremgangsmåte for å forsterke aktiviteten av NK-celler i en pasient eller i en biologisk prøve. Denne fremgangsmåten omfatter et trinn hvor nevnte sammensetning kontaktes nevnte pasient eller biologiske prøve. En slik fremgangsmåte vil kunne brukes både for diagnostiske og terapeutiske formål.
For bruk i forbindelse med en biologisk prøve, så kan antistoffsammensetningen administreres ved at den ganske enkelt blandes med eller påsettes prøven direkte, avhengig av prøvens natur (enten den er en væske eller et fast stoff). Den biologiske prøven kan direkte kontaktes antistoffet i enhver egnet anordning (plate, pose, koble, osv.). For bruk i sammenheng med en pasient, må sammensetningen formuleres for administrering til pasienten.
Som beskrevet ovenfor, så kan sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres oralt, parenteralt, ved inhaleringsforstøvning, topisk, rektalt, nasalt, bukkalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Begrepet "parenteral" slik det brukes her, inkluderer subkutan, intravenøs, intramuskulær, intraartikulær, intrasynovial, intrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesjonal og intrakranial injeksjon eller ved hjelp av infusjonsteknikker. Det er foretrukket at sammensetningene blir administrert oralt, intraperitonealt eller intravenøst.
Sterile injiserbare former av sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være vandige eller være en oljeholdig suspensjon. Disse suspensjonene kan formuleres ved hjelp av velkjent farmasøytisk teknikk ved å bruke egnede dispergerings- eller fuktemidler og suspenderingsmidler. Det sterile injiserbare preparatet kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i et ikke-toksisk, parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller løsemiddel, for eksempel som en løsning i 1,3-butandiol. Blant akseptable bærervæsker og løsemidler som kan anvendes, er vann, Ringers løsning og en isoton natriumkloridløsning. I tillegg blir ofte sterile fikserte oljer brukt som et løsemiddel eller suspenderende medium. For dette formålet kan enhver mild fiksert olje brukes inklusive syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer så som oljesyre og dets glyserinderivater kan også brukes ved fremstillingen av injiserbare preparater, noe som også er tilfellet med naturlige farmasøytisk akseptable oljer så som olivenolje eller ricinusolje, spesielt i deres polyoksyetylerte versjoner. Disse oljeløsningene eller suspensjonene kan også inneholde langkjedede alkoholfortynningsmidler eller dispergeringsmidler så som karboksymetylcellulose eller lignende dispergeringsmidler av den type som brukes ved formuleringen av farmasøytisk akseptable doseringsformer inklusive emulsjoner og suspensjoner. Det er også mulig å bruke vanlig anvendte overflateaktive midler så som Tween, Span og andre emulgeringsmidler eller andre midler som bedrer biotilgjengeligheten og som er vanlig bruk ved fremstillingen av farmasøytisk akseptable faste, flytende eller andre doseringsformer.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt i enhver oralt akseptabel doseringsform som inkluderer, men som ikke er begrenset til kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. I forbindelse med tabletter for oral bruk, så vil vanlig brukte bærerstoffer inkludere kaltose og maisstivelse.
Smøremidler så som magnesiumstearat blir også ofte tilsatt. For oral administrering i en kapselform, så vil man ofte kunne bruke fortynningsmidler så som laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner er nødvendig for oral anvendelse, så vil den aktive bestanddelen bli kombinert eller blandet med emulgeringsmidler og suspenderingsmidler. Hvis det er ønskelig, kan også søtningsstoffer, smaksstoffer og fargestoffer tilsettes.
Alternativt kan sammensetningene ifølge oppfinnelsen administreres i form av stikkpiller for rektal administrering. Disse kan fremstilles ved å blande middelet med en egnet ikke-irriterende eksipiens som er fast ved romtemperatur med flytende ved rektal temperatur og vil derfor smelte i rektum slik at medikamentet frigjøres. Slike materialer inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylenglykoler.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk, spesielt når behandlingsmålet inkluderer områder eller organer som er lett tilgjengelige ved topisk anvendelse inklusive sykdommer i øyet, huden eller i den nedre del av fordøyelseskanalen. Egnede topiske formuleringer kan lett fremstilles for hvert av disse områdene eller organene.
Topisk anvendelse i den nedre fordøyelseskanalen kan utføres ved hjelp av en rektal stikkpilleformulering (se ovenfor) eller i en egnet klysterformulering. Topisktransdermale plastere kan også brukes.
For topiske formål kan sammensetningene formuleres i en egnet salve som inneholder den aktive komponenten som er suspendert eller løst i en eller flere bærere. Bærere for topisk administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, flytende petrolatum, hvit petrolatum, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylenforbindelser, emulgerende voks og vann. Alternativt kan sammensetningene formuleres i en egnet lotion eller krem som inneholder de aktive komponentene suspendert eller løst i en eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitanmonostearat, polysorbat 60, cetylestervokstyper, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.
For oftalmisk bruk kan sammensetningene formuleres som mikroniserte suspensjoner i isotone, pH-justerte sterile saltløsninger eller fortrinnsvis som løsninger i isotone, pH-justerte sterile saltløsninger, enten med eller uten et konserveringsmiddel så som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for oftalmisk bruk, kan sammensetningene formuleres som en salve så som ved hjelp av petrolatum.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved en nasal aerosol eller ved inhalering. Slike sammensetninger kan fremstilles ved hjelp av teknikker som er velkjente innenfor den farmasøytiske industrien og kan fremstilles som løsninger i saltløsning ved å bruke benzylalkohol eller andre egnede konserveringsmidler, absorpsjonsfremmende midler for å bedre biotilgjengelighet, fluorkarboner og/eller andre kjente og vanlige løselighetsgjørende eller dispergerende midler.
Flere monoklonale antistoffer har vist seg å være effektive i kliniske situasjoner så som rituksan (rituksimab), herceptin (trastuzumab) eller xolair (omalizumab) og lignende administreringsregimer (for eksempel formuleringer og/eller doser og/eller administreringsprotokoller) kan brukes med antistoffene ifølge oppfinnelsen.
Doseringsregimer og doser for administrering av antistoffet i farmasøytiske sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bestemmes i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter for slike produkter, for eksempel ved å anvende fabrikantenes instruksjoner. For eksempel kan et antistoff som er tilstede i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen leveres ved en konsentrasjon på 10 mg/ml i enten 100 mg (10 ml) eller 500 mg (50 ml) engangsampuller.
Produktet kan formuleres for IV-administrering i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumcitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og sterilt vann for injeksjon. pH justeres til 6,5. Et eksempel på et egnet doseringsområde for et antistoff i en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen kan være mellom omtrent 10 mg/m<2>og 500 mg/m<2>. Det er imidlertid underforstått at disse regimene kun er eksempler og at optimale regimer kan tilpasses ved å ta hensyn til affinitet og tålegrensen for det spesielle antistoffet som brukes i den farmasøytiske sammensetningen og må følgelig bestemmes ved kliniske forsøk. De mengder og doseringsregimer når det gjelder injeksjon av et antistoff i en farmasøytisk sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen og som vil mette NK-celler i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller en uke eller en måned, vil bli bestemt under hensyntagen til antistoffets affinitet og dets farmakokinetiske parametere i mennesker og ikke-humane pattedyr.
Ifølge en annen utførelse kan antistoffsammensetningene ifølge oppfinnelsen ytterligere omfatte ett eller flere andre terapeutiske midler, blant annet midler som normalt anvendes for det spesielle terapeutiske formål for hvilket antistoffet blir administrert. Det eller de ytterligere terapeutiske midlene vil normalt være tilstede i sammensetningen i mengder som er typiske når nevnte antistoff anvendes i en monoterapi for den spesielle sykdom eller tilstand som blir behandlet. Slike terapeutiske midler inkluderer, men er ikke begrenset til, terapeutiske midler for behandling av kreft, terapeutiske midler for å behandle infeksjonssykdommer, terapeutiske midler som brukes i andre immunterapier, cytokiner (så som IL-2 eller IL-15), andre antistoffer og fragmenter av andre antistoffer.
I en alternativ utførelse kan et antistoff som binder en felles determinant som er tilstede på minst to forskjellige humane hemmende KIR-reseptorgenprodukter og hvor nevnte antistoff er i stand til å nøytralisere KIR-mediert hemming av NK-cellecytotoksisitet på NK-celler som uttrykker minst ett av de to nevnte forskjellige humane hemmende KIR-reseptorene ifølge oppfinnelsen, kan inkorporeres i liposomer ("immunliposomer"), enten alene eller sammen med andre stoffer for målsøkende levering til en tumor eller et infeksjonssted i et menneske eller et annet ikke-humant pattedyr. Slike andre stoffer inkluderer nukleinsyrer for å levere gener for genterapi eller for å levere antisens RNA, RNAi eller siRNA for å undertrykke et gen i en NK-celle eller toksiner eller medikamenter for målrettet avliving av NK-celler.
Det er for eksempel tilgjengelig en rekke terapeutiske midler for behandling av kreft. Antistoffsammensetningene og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan kombineres med andre fremgangsmåter som generelt brukes for behandling av den spesielle sykdommen, den spesielle tumoren, kreftsykdommen eller andre sykdommer eller lidelser hos pasienten. Så lenge en spesiell terapeutisk fremgangsmåte ikke er kjent for å være skadelig med hensyn til pasientens tilstand som sådan og ikke signifikant motvirker aktiviteten til antistoffet i en farmasøytisk sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen, så er det mulig å bruke dem i kombinasjon med den foreliggende oppfinnelsen.
I forbindelse med behandling av faste tumorer, så kan de farmasøytiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen brukes i kombinasjon med klassiske metoder så som kirurgiske inngrep, radioterapi, kjemoterapi og lignende. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor kombinerte terapier hvor en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen brukes samtidig med, før eller etter et kirurgisk inngrep eller en strålingsbehandling; eller administreres pasienter sammen med, før eller etter vanlige kjemoterapeutiske, radioterapeutiske eller antiangiogene midler eller målrettede immuntoksiner eller koaguligander.
Når ett eller flere midler brukes i kombinasjon med en antistoffholdig sammensetning ifølge oppfinnelsen i et terapeutisk regime, så er det intet krav om at de samme resultater er summen av de effekter som observeres når hver behandling utføres separat. Skjønt additive effekter generelt er ønskelig, så vil en forbedret antikrefteffekt over det som oppnås med enkle terapier være fordelaktig. Det er videre intet spesielt krav om at den samlede behandlingen oppviser synergistiske effekter, skjønt dette er mulig og fordelaktig.
Ved praktisering av kombinert antikreftterapi, vil man ganske enkelt administrere pasienten en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med et annet antikreftmiddel på en måte som effektivt resulterer i deres samlede antikreftvirkninger inne i dyret eller pasienten. Midlene vil derfor bli tilveiebrakt i mengder som er effektive og i tidsperioder som effektivt resulterer i deres samlede nærvær inne i tumorvevet og hvor de utøver sine samlede virkninger i tumormiljøet. For å oppnå dette, kan en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen og eventuelle andre kreftmidler administreres pasienten samtidig, enten i en enkelt kombinert sammensetning eller som to distinkte sammensetninger som bruker den samme eller forskjellige administrasjonsveier.
Alternativt kan administreringen av en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen gå foran, eller komme etter, antikreftbehandlingen for eksempel ved intervaller som varierer fra minutter til uker og måneder. Man vil kunne sikre at antikreftmiddelet og et antistoff i antistoffsammensetningen ifølge oppfinnelsen utøver en fordelaktig kombinert effekt på kreften. For eksempel kan mAb'er ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres pasienter med ikke-Hodgkins lymfom (NHL). Slike pasienter blir typisk behandlet med en kombinasjon av rituksimab og en kombinasjon av kjemoterapimidler som er kjent som CHOP. Anti-KIR-antistoffer ifølge oppfinnelsen kan således brukes for å behandle NHL-pasienter som går gjennom behandling med rituksimab og CHOP ved å kombinere administreringen av alle disse midlene i et behandlingsregime hvor midlene gis på den samme dagen eller på forskjellige dager, med en lengre behandlingsperiode.
Andre antikreftmidler kan gis før, samtidig med eller etter administrering av en anti-KIR-antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen. Når immunkonjugater av et antistoff brukes i antistoffsammensetningen ifølge oppfinnelsen, så kan imidlertid forskjellige antikreftmidler gis samtid eller administreres deretter.
I visse situasjoner kan det endog være ønskelig å forlenge behandlingsperioden signifikant, hvor det går flere dager (2, 3, 4, 5, 6 eller 7), flere uker (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) eller endog flere måneder (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8) mellom de respektive administreringene av antikreftmiddelet eller antikreftbehandlingen og administreringen av en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen. Dette kan være fordelaktig under omstendigheter hvor antikreftmiddelet er tenkt i alt vesentlig å ødelegge tumoren så som ved et kirurgisk inngrep eller kjemoterapi, og hvor administreringen av en antistoffsammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen er tenkt å hindre mikrometastase eller fornyet tumorvekst.
Man kan også se for seg at en eller flere administreringer av enten en anti-KIR-antistoffbasert sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller av antikreftmiddelet. Disse midlene kan administreres om hverandre, for eksempel på alternerende dager eller uker; eller en behandling med en anti-KIR-sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen fulgt av en syklus med antikreftmiddelterapi. I ethvert tilfelle, for å oppnå tumorregresjon ved bruke en kombinert terapi, så er det utelukkende et krav at begge midlene leveres i en samlet mengde som effektivt utøver en antitumoreffekt, uansett tidspunktene for administrering.
Med hensyn til kirurgi, så kan ethvert kirurgisk inngrep praktiseres i kombinasjon med den foreliggende oppfinnelsen. I forbindelse med radioterapi, kan man tenke seg enhver mekanisme for å indusere DNA-skade lokalt inne i kreftceller så som gammabestråling, røntgenstråler, UV-stråler, mikrobølger og endog elektroniske emisjoner og lignende. Den direkte levering av radioisotoper til kreftceller kan også tenkes, og dette kan brukes i sammenheng med et målrettet antistoff eller andre målrettede anordninger.
I andre aspekter kan de immunmodulerende forbindelsene eller regimene administreres i kombinasjon med eller som en del av antistoffsammensetningene ifølge oppfinnelsen. Foretrukne eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer cytokiner. Forskjellige cytokiner kan brukes i slike kombinerte metoder. Eksempler på cytokiner som kan brukes i kombinasjon med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer IL-1alfa IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Cytokiner som brukes i kombinasjonsbehandling eller i sammensetninger ifølge den foreliggende oppfinnelsen, blir administrert ifølge standardregimer som er i overensstemmelse med kliniske indikasjoner så som pasientens tilstand og cytokinets relative toksitet. Andre immunmodulerende forbindelser som kan administreres i kombinasjon med eller som en del av antistoffsammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer antistoffer som spesifikt binder seg til andre hemmende reseptorer på lymfocytter og inkluderer, men er ikke begrenset til, antistoffer så som anti-CTLA4-antistoffer eller anti-CD94/NKG2A-antistoffer (se for eksempel U.S. offentlige patentsøknad 20030095965). Det er også kjent varianter og derivater av disse molekylene og alternativt kan slike brukes i de nevnte fremgangsmåtene og kan inkorporeres i sammensetninger ifølge oppfinnelsen når dette måtte passe.
I visse utførelser så kan de kryssreagerende, blokkerende og/eller hemmende anti -KIR-antistoff omfattende terapeutiske sammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres i kombinasjon med eller kan ytterligere omfatte et kjemoterapeutisk eller hormonelt terapimiddel. En rekke forskjellige hormonelle terapi- og kjemoterapeutiske midler kan brukes i kombinasjon med de behandlingsmetoder som er beskrevet her. Kjemoterapeutiske midler som for eksempel kan brukes inkluderer, men er ikke begrenset til, alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksiske antibiotika, vinkaalkaloider, for eksempel adriamycin, daktinomycin, mitomycin, karminomycin, daunomycin, doksorubicin, tamoksifen, taksol, taksoter, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-fluoruracil (5FU), cytosinarabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotecin, aktinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), aminopterin, kombretastatin(er) og derivater og formedikamenter av disse.
Hormonelle midler inkluderer, men er ikke begrenset til, for eksempel LHRH-agonister så som leuprorelin, goserelin, triptorelin og buserelin; antiøstrogener så som tamoksifen og toremifen; antiandrogener så som flutamid, nilutamid, cyproteron og bikalutamid; aromatasehemmere så som anastrozol, eksemestan, letrozol og fadrozol; og progestagener så som medroksy, klormadinon og megestrol.
Det er underforstått av de med faglig innsikt at de passende doser av de kjemiske terapeutiske midlene vil være nokså lik dem som allerede anvendes i kliniske terapier hvor de nevnte kjemoterapeutika administreres alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutika. Som et rent eksempel er det for eksempel mulig å bruke midler så som cisplatin og andre DNA-alkylerende forbindelser. Cisplatin har vært meget anvendt for behandling av kreft og hvor effektive doser som brukes for kliniske formål er 20 mg/m<2>i 5 dager hver tredje uke med totalt tre behandlinger. Cisplatin blir ikke absorbert oralt og må derfor leveres via injeksjon, for eksempel intravenøst, subkutant, intratumoralt eller intraperitonealt.
Ytterligere brukbare kjemoterapeutiske midler inkluderer forbindelser som interfererer eller påvirker DNA-replikasjon, mitose og kromosomal segregering og midler som bryter syntesen og utviklingen av polynukleotidforløpere. En rekke eksempler på kjemoterapeutiske midler for kombinert terapi er angitt i tabell C i U.S. patent nr. 6,524,583, hvis beskrivelse av midler og indikasjoner spesifikt er inkorporert her som en referanse. Hvert av de midler som der er angitt, er utelukkende eksempler og ikke begrensende som sådan. Det henvises i så henseende til "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. utgave, kapittel 33, spesielt sidene 624-652. Det vil være en variasjon med hensyn til dosene, alt avhengig av den tilstand som behandles. Den legen som administrerer behandlingen vil være i stand til å bestemme en passende dose for den enkelte pasient.
De foreliggende kryssreagerende, blokkerende og/eller hemmende anti-KIR-antistoffsammensetningene ifølge oppfinnelsen kan brukes i kombinasjon med ethvert av en eller flere antiangiogene terapier og kan ytterligere omfatte antiangiogene midler. Eksempler på slike midler inkluderer nøytraliserende antistoffer, antisens RNA, siRNA, RNAi, RNA-aptamerer og ribozymer som hver er rettet inn mot VEGF eller VEGF-reseptorer (U.S. patent nr. 6,524,583 hvis beskrivelse her er inkorporert som en referanse). Varianter av VEGF med antagonistiske egenskaper kan også brukes, slik det for eksempel er beskrevet i WO 98/16551 som her spesifikt er inkorporert som en referanse. Ytterligere eksempler på antiangiogene midler som kan brukes i sammenheng med kombinert terapi, er angitt i tabell D i U.S. patent nr. 6,524,583 og hvor beskrivelsen av slike midler og indikasjoner spesifikt er inkorporert her som en referanse.
Anti-KIR-antistoffsammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan med fordel også brukes i kombinasjon med fremgangsmåter for å indusere apoptose eller kan omfatte apoptotiske midler. Det er for eksempel identifisert en rekke onkogener som hemmer apoptose eller programmert celledød. Eksempler på onkogener i denne kategorien inkluderer, men er ikke begrenset til, bcr-abl, bcl-2 (forskjellig fra bcl-1, syklin D1; GenBank aksesjonsnummer M14745, X06487; U.S. patent nr. 5,650,491; og 5,539,094; som hver er inkorporert her som referanser) og onkogener som hører til samme familien og som inkluderer Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1 og A20.
Overekspresjon av bcl-2 ble først oppdaget i T-cellelymfomer. Onkogenet bcl-2 fungerer ved å binde og inaktivere Bax, et protein i den apoptotiske signalveien. Hemming av bcl-2-funksjonen hindrer inaktivering av Bax, noe som gjør at den apoptotiske signalveien utvikler seg videre. Hemming av denne klassen av onkogener, for eksempel ved å bruke antisens nukleotidsekvenser, RNAi, siRNA eller småmolekylære kjemiske forbindelser, kan tenkes brukt i den foreliggende oppfinnelsen for å bedre apoptose (U.S. patentene 5,650,491; 5,539,094; og 5,583,034; som hver her er inkorporert som en referanse).
Anti-KIR-antistoffsammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også omfatte eller kan brukes i kombinasjon med molekyler som omfatter en målrettet del, for eksempel et antistoff, ligand eller konjugat av disse, som er rettet inn mot en spesifikk markør på en målcelle ("målrettet middel"), for eksempel en måltumorcelle. Generelt så vil målrettede midler som brukes i disse ytterligere aspekter av oppfinnelsen fortrinnsvis gjenkjenne tilgjengelige tumorantigener som preferensielt eller spesifikt blir uttrykt i tumorsetet. De målrettede eller målsøkende midlene vil generelt binde seg til en overflateuttrykt, overflatetilgjengelig eller overflatelokalisert komponent i en tumorcelle. De målrettede midlene vil fortrinnsvis også ha egenskaper som høy affinitet og vil ikke utøve signifikante in vivo sideeffekter eller bivirkninger mot livsoppholdende normalt vev så som ett eller flere vev valgt fra hjerte, nyre, hjerne, lever, benmarg, kolon, bryst, prostata, skjoldbruskkjertelen, galleblæren, lungene, binyrene, muskler, nervefibere, pankreas, hud eller andre livsopprettholdende organer eller vev i menneskekroppen. Begrepet "utøver ikke signifikante sideeffekter" slik det brukes her, refererer seg til det faktum at et målsøkende middel, når det administreres in vivo, bare vil gi neglisjerbare eller klinisk behandlbare sideeffekter, for eksempel av den type som normalt opptrer under kjemoterapi.
Med behandlingen av tumorer kan en antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen ytterligere omfatte, eller kan brukes i kombinasjon med, tilhørende forbindelser. Tilhørende forbindelser kan for eksempel inkludere antiemetika så som serotoninantagonister og terapier så som fenoltiaziner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyofenoner, kortikosteroider, benzodiazepiner og cannabinoider; bifosfonater så som zoledroninsyre og pamidroninsyre; og hematopoietiske vekstfaktorer så som erytropoietin og G-CSF, for eksempel filgrastim, lenograstim og darbepoietin.
I en annen utførelse vil to eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen gjenkjenne forskjellige epitoper eller determinanter inklusive NKVSF1, DF200, 1-4F1 og/eller 1-7F9 og kan kombineres i en enkelt sammensetning for derved å redusere eller nøytralisere de hemmende effektene til så mange KIR-genprodukter som mulig. Sammensetninger som omfatter kombinasjoner av kryssreaktive hemmende KIR-antistoffer ifølge oppfinnelsen eller fragmenter eller derivater av disse, vil muliggjøre enda videre anvendelser, ettersom det sannsynligvis foreligger en liten prosent av den humane populasjonen som vil mangle enhver av de hemmende KIR-genproduktene som gjenkjennes av et enkelt kryssreagerende antistoff. På lignende måte vil en antistoffsammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen ytter ligere omfatte ett eller flere antistoffer som gjenkjenner enkelte hemmende KIR-undertyper. Slike kombinasjoner vil igjen gi videre anvendelser i en terapeutisk sammenheng. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan følgelig kombineres med annen anti-KIR-antistoffbinding til en eller flere av for eksempel KIR2DL1, KIR2DLK2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2 og KIR3DL3.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å forsterke NK-celleaktivitet hos en pasient som har behov for dette ved å administrere en sammensetning ifølge den foreliggende oppfinnelsen til nevnte pasient. Fremgangsmåten er mer spesifikt rettet inn mot eller ment å bedre eller forsterke NK-celleaktivitet i pasienter med en sykdom hvor forsterket NK-celleaktivitet er fordelaktig eller som skyldes eller er karakterisert ved utilstrekkelig NK-celleaktivitet så om kreft, en annen proliferativ lidelse, en infeksjonssykdom eller en immunlidelse. Mer spesifikt kan fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen brukes for å behandle en rekke forskjellige kreftformer og andre proliferative sykdommer som inkluderer, men som ikke er begrenset til, carcinom, blant annet så som i blæren, brystet, kolon, nyrene, leveren, lungene, eggstokkene, prostata, pankreas, magesekken, halsen, skjoldbruskkjertelen og huden inklusive skvamøst cellecarcinom; hematopoietiske tumorer i lymfekjertlene inklusive leukemi, akutt lymfocyttisk leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi, B-cellelymfom, T-cellelymfom, Hodgkins lymfom, ikke-Hodgkins lymfom, hårcellelymfom og Burketts lymfom; hematopoietiske tumorer av myelid type inklusive akutte og kroniske myelogene leukemier og promyelocyttisk leukemi; tumorer av mesenkymal opprinnelse inklusive fibrosarkom og rabdomyosarkom; andre tumorer inklusive melanom, seminom, teratocarcinom, nevroblastom og gliom; tumorer i det sentrale og perifere nervesystemet inklusive astrocytom, nevroblastom, gliom og schwannomer; tumorer av mesenkymal opprinnelse inklusive fibrosarkom, rabdomyosarkom og osteosarkom; og andre tumorer som inkluderer melanom, xeroderma pigmentosum, keratoakantom, seminom, tyroid follikulær kreft og teratocarcinom.
Andre foretrukne lidelser som kan behandles ifølge oppfinnelsen inkluderer hematopoietiske tumorer av lymfoid opprinnelse, for eksempel T-celle- og B-celletumorer og som inkluderer, men som ikke er begrenset til, T-cellelidelser så som T-prolymfocyttisk leukemi (T-PLL) inklusive de av småcelle og cerebriform celletype; stor granulær lymfocyttleukemi (LGL), fortrinnsvis av T-celletypen; Sezarysyndrom (SS); voksent T-celleleukemilymfom (ATLL); a/d T-NHL hepatosplenisk lymfom; perifert/posttymisk T-cellelymfom (pleomorfe og immunoblastiske undertyper); angioimmunoblastisk T-cellelymfom; angiosentrisk (nasalt) T-cellelymfom; anaplastisk (Ki1+) storcellelymfom; tarm T-cellelymfom; T-lymfoblastisk; og lymfom/leukemi (T-Lbly/T-ALL).
Andre proliferative lidelser kan også behandles ifølge den foreliggende oppfinnelsen og inkluderer for eksempel hyperplasier, fibrose (spesielt lungefibrose, men også andre typer av fibrose så som nyrefibrose), angiogenese, psoriasis, aterosklerose og glatt muskelproliferering i blodkar så som stenose og restenose etter angioplasti. Det kryssreagerende hemmende KIR-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan brukes for å behandle eller å hindre infeksjonssykdommer og inkluderer fortrinnsvis enhver infeksjon som er forårsaket av virus, bakterier, protozoer, muggsopper eller andre typer sopp. Slike virusinfiserende organismer inkluderer, men er ikke begrenset til, hepatitt type A, hepatitt type B, hepatitt type C, influensa, varicella, adenovirus, herpes simpleks type I (HSV-1), herpes simpleks type 2 (HSV-2), kvegpest, rinovirus, ekkovirus, rotavirus, respiratorisk synkytialvirus, papillomvirus, cytomegalovirus, ekinovirus, arbovirus, huntavirus, coxsakkievirus, kusmavirus, meslingvirus, rubellavirus, poliovirus, Ebolavirus og humant immunsviktvirus type I eller type 2 (HIV-1 og HIV-2).
Bakterieinfeksjoner som kan behandles ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, infeksjoner som skyldes de følgende bakterier: Staphylococcus; Streptococcus inklusive S. pyogenes; Enterococcl; Bacillus, inklusive Bacillus anthracis og Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella inklusive G. vaginalis; Nocardia; Streptomyces;
Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas inklusive Raeruginosa; Legionella; Neisseria inklusive N.gonorrhoeae og N.meningitides; Flavobacterium inklusive F. meningosepticum og F. odoraturn; Brucella;
Bordetella inklusive B. pertussis og B. bronchiseptica; Escherichia inklusive E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia inklusive S. marcescens og S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus inklusive P. mirabilis og P. vulgaris; Streptobacillus;
Rickettsiaceae inklusive R. fickettsfi, Chlamydia inklusive C. psittaci og C. trachornatis; Mycobacterium inklusive M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare og M. lepraernurium; og Nocardia.
Protozoinfeksjoner som kan behandles ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, infeksjoner som skyldes leishmania, kokzidioa og trypanosom. En fullstendig liste over infiserende sykdommer kan finnes på hjemmesiden til the National Center for Infectious Disease (NCID) ved Center for Disease Control (CDC) (www.cdc.gov/ncidod/diseases/) som her er inkorporert som en referanse. Alle de nevnte sykdommene er kandidater for behandling ved å bruke de kryssreagerende hemmende KIR-antistoffene ifølge oppfinnelsen.
Slike fremgangsmåter for å behandle forskjellige infeksjonssykdommer kan anvende antistoffsammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelsen, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlinger og/eller terapeutiske midler som er kjent for å behandle slike sykdommer inklusive antivirale midler, antisoppmidler, antibakterielle midler, antibiotika, antiparasittiske midler og antiprotozoale midler. Når disse fremgangsmåtene innbefatter ytterligere behandlinger med ytterligere terapeutiske midler, så kan disse administreres sammen med antistoffene ifølge oppfinnelsen, enten som en enkeltdoseform eller som separate multiple doseringsformer. Ved administrasjon av en separat doseringsform, så kan det ytterligere middelet administreres før, samtidig med eller etter administreringen av antistoffet ifølge oppfinnelsen.
Ytterligere aspekter og fordeler ved oppfinnelsen er beskrevet i det følgende eksperimentelle avsnittet, som utelukkende må anses som illustrerende og ikke begrensende for oppfinnelsens omfang og intensjon.
EKSEMPLER
Eksempel 1: Rensing av PBL'er og utvikling av polyklonale eller klonale NK-cellelinjer
PBL'er ble hentet fra friske frivillige forsøkspersoner ved hjelp av Ficoll -Hypaquegradienter og fjerning av plastisk tilfestede celler. For å oppnå anrikede NK-celler ble PBL'ene inkubert med anti-CD3, anti-CD4 og anti-HLA-DR mAb'er i 30 minutter ved 4 ºC fulgt av en inkubering med geit antimus magnetiske perler (Dynal) (30 minutter ved 4 ºC) og en immunomagnetisk seleksjon ved fremgangsmåter som er velkjente (Pende et al., J Exp Med 1999; 190: 1505-1516). CD3-- CD4-- DR--celler ble dyrket på bestrålte føderceller og 100 U/ml interleukin 2 (proleucin, Chiron Corporation) og 1,5 ng/ml fytohemagglutinin A (Gibco BRL) for å oppnå polyklonale NK-cellepopulasjoner. NK-cellene ble så klonet ved begrensende fortynning og klonene av NK-celler ble så karakterisert ved flowcytometri for ekspresjon av celleoverflatereseptorer.
De mAb som ble brukt var JT3A (IgG2a, anti-CD3), EB6 og GL183 (IgG1, anti-KIR2DL1 og KIR2DL3 henholdsvis), XA-141 (IgM, anti-KIR2DL1 med den samme spesifisitet som EB6), anti-CD4 (HP2,6) og anti-DR (D1,12, IgG2a). I stedet for JT3A, HP2,6 og DR1,12, så er det også mulig å bruke andre kommersielt tilgjengelige mAb'er med samme spesifisiteter. EB6 og GL183 er kommersielt tilgjengelige (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141 er ikke kommersielt tilgjengelig, men mAb EB6 kan på lignende måte brukes for kontrollrekonstituering av oppløsning, slik det er vist i eksemplene og de foreliggende figurer og beskrevet av Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604.
Cellene ble farget med de passende antistoffene (30 mns ved 4 ºC) fulgt av PE- eller FITC-konjugerte polyklonale antimusantistoffer (Southern Biotechnology Associates Inc). Prøvene ble analysert ved en cytofluorometrisk analyse (flowcytometri) i et FACScan-apparat (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
De følgende NK-celleklonene ble brukt i denne undersøkelsen. CP11, CN5 og CN505 er KIR2DL1-positive kloner og blir farget av EB6 (IgG1, anti-KIR2DL1) eller XA-141 (IgM, anti-KIR2DL1 med den samme spesifisitet som sammenlignet med EB6-antistoffer). CN12 og CP502 er KIR2DL3-uttrykkende NK-kloner og blir farget av GL183-antistoff (IgG1, anti-KIR2DL2/3).
NK-klonenes cytolytiske aktivitet ble undersøkt ved hjelp av en standard 4 timers 51Cr frigjøringsprøve hvor effektor NK-celler ble testet for sin evne til å avlive målceller som uttrykte HLA-Cw3 eller -Cw4, HLA-positive cellelinjer som er kjent for sin følsomhet for NK-celleoppløsning. Alle målene ble brukt i en konsentrasjon på 5000 celler pr brønn i en mikrotitrerings 96 brønners plate og effektor: målforholdene er angitt på figurene (vanligvis 4 effektorceller pr målcelle). Den cytolytiske prøven ble utført med eller uten hybridomsupernatant av de angitte monoklonale antistoffene ved en 1⁄2 (1:1) fortynning. Fremgangsmåten var i alt vesentlig den samme som beskrevet i Moretta et al., J Exp Med 1993; 178: 597-604.
Eksempel 2: Utvikling av nye mAb'er
mAb'er ble utviklet ved å immunisere 5 uker gamle Balb/C-mus med aktiverte polyklonale eller monoklonale humane NK-cellelinjer som beskrevet i Moretta et al., J Exp Med 1990; 172: 1589-1598. Etter forskjellige cellefusjoner ble de nye mAb'er først selektert for sin evne til å kryssreagere med EB6- og GL183-positive NK-cellelinjer og kloner. Positive monoklonale antistoffer ble ytterligere screenet for sin evne til å rekonstituere oppløsning av EB6-positve eller GL183-positive NK-kloner av Cw4- eller Cw3-positive mål henholdsvis.
Cellefarging ble utført på følgende måte. Cellene ble farget med en rekke forskjellige antistoffer (1 μg/ml eller 50 μl supernatant, 30 mns ved 4 ºC) fulgt av PE-konjugert geit F(ab')2-fragment antimus IgG (H+L) eller PE-konjugert geit F(ab')2-fragment antihumant IgG (Fc gamma) antistoffer (Beckman Coulter).
Cytofluorometrisk analyse ble utført i et Epics XL.MCL-apparat (Beckman Coulter).
Ett av de monoklonale antistoffene, DF200 mAb, viste seg å reagere med forskjellige enheter innenfor KIR-familien inklusive KIR2DL1 og KIR2DL2/3. Både KIR2DL1-positive og KIR2DL2/3-positive NK-celler ble skarpt farget med DF200 mAb (figur 1).
NK-kloner som uttrykte en eller en annen (eller endog begge) disse HLA klasse I-spesifikke hemmende reseptorene ble brukt som effektorceller mot målceller som uttrykker ett eller flere HLA-C-alleler. Cytotoksisitetsprøvene ble utført som følger. Den cytolytiske aktiviteten til YTS-KIR2DL1 eller YTS-Eco (KIR-negative) cellelinjer ble bedømt ved en standard 4 timers Cr-51 frigjøringsprøve. Målcellene var HLA-Cw4-positive eller -negative B-EBV-cellelinjer eller HLA-Cw4-transfekterte 721.221-celler. Alle målene ble brukt i en konsentrasjon på 3000 celler pr brønn i mikrotiterplater. Effektor/målforholdet er angitt på figurene. Den cytolytiske prøven ble utført med eller uten de angitte fullengde eller F(ab’)2-fragmentene av monoklonale mus- eller humane antistoffer. Som forventet hadde de KIR2DL1-positive (KIR2DL1<+>) NK-klonene liten, hvis noen som helst, cytolytisk aktivitet mot målceller som uttrykte HLA-Cw4 og KIR2DL3+ NK-kloner hadde liten eller ingen aktivitet på Cw3-positive mål. I nærvær av DF200 mAb (som ble brukt for å maskere deres KIR2DL-reseptorer), var imidlertid NK-klonene ikke i stand til å gjenkjenne sine HLA-C-ligander og hadde sterk cytolytisk aktivitet mot mål som uttrykte Cw3 eller Cw4 (eksempler på resultater er vist på figurene 2-6).
C1R-cellelinjen (CW4+ EBV-cellelinje, ATCC nr. CRL-1993) som uttrykker HLA-Cw4 (men ingen gruppe 1 HLA-C-allotyper) ble for eksempel ikke avlivet av KIR2DL1-positive NK-kloner (CN5/CN505), men hemmingen kunne effektivt reverseres ved å bruke enten DF200 eller et vanlig anti-KIR2DL1 mAb. På den annen side så viste det seg at NK-kloner som uttrykte KIR2DL2/3<+>KIR2DL1-fenotypen (CN12) effektivt avlivet C1R-celler og denne avlivingen var upåvirket av DF200 mAb (figur 2). Lignende resultater ble oppnådd med KIR2DL2- eller KIR2DL3-positive NK-kloner på Cw3-positive mål.
På lignende måte ble Cw4+ 221 EBV-cellelinjen ikke avlivet av KIR2DL1+-transfekterte NK-celler, men denne hemmingen kunne effektivt reverseres ved å bruke nevnte DF200 mAb, et Fab-fragment av DF200, eller de vanlige anti-KIR2DL1 mAb'ene EB6 eller XA141. Også en Cw3-positiv 721.221-transfektant ble ikke avlivet av KIR2DL2<+>NK-celler, men denne hemmingen kunne reverseres ved å bruke enten DF200 eller et DF200 Fab-fragment. Endelig ble Cw3+ 721.221-transfektanten ikke avlivet av KIR2DL3<+>NK-celler, men denne hemmingen kunne reverseres ved enten å bruke et DF200 Fab-fragment eller det vanlige anti-KIR2DL3 mAb GL183 eller Y249. Resultatene er vist på figur 3.
F(ab')2-fragmentene ble også testet for sin evne til å rekonstituere oppløsning av Cw4-positive mål. F(ab')2-fragmenter av DF200 og EB6 Ab'er var begge i stand til å reversere hemmingen av oppløsning som skyldes KIR2DL1-transfekterte NK-celler av den Cw4-transfekterte 221-cellelinjen eller den Cw4+ TUBO EBV-cellelinjen. Resultatene er vist på figur 4.
Eksempel 3: Biacoreanalyse av DF200 mAb/KIR2DL1- og DF200 mAb/KIR2DL3-interaksjoner
Produksjon og rensing av rekombinante proteiner. De KIR2DL1 og KIR2DL3 rekombinante proteinene ble produsert i E. coli. cDNA som koder hele det ekstracellulære domenet til KIR2DL1 (SEKV.ID. NR. 23) og KIR2DL3 (SEKV.ID. NR. 25) ble amplifisert ved hjelp av PCR fra pCDM8-klon 47.11-vektoren (Biassoni et al, Eur J Immunol. 1993; 23: 1083-7) og RSV.5(gpt)183-klon 6-vektoren (Wagtmann et al, Immunity 1995; 2: 439-49 pg 1995; 3: 801-809) ved å bruke de følgende primere:
Sens: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3. (SEKV.ID. NR. 13)
Antisens: 5'- CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3' (SEKV.ID. NR. 14)
De ble klonet inn i pML1-ekspresjonsvektoren i ramme med en sekvens som koder et biotinyleringssignal (Saulquin et al, J Exp Med. 2003; 197: 933-8).
Proteinekspresjonen ble utført i BL21(DE3)-bakteriestammen (Invitrogen).
Transfekterte bakterier ble dyrket til OD600 = 0,6 ved 37 ºC i et medium som var supplert med ampicillin (100 μg/ml) og ekspresjon ble indusert med 1 mM IPTG.
Proteinene ble innvunnet fra inneslutningslegemene under denaturerende betingelser (8 M urea). Refolding av de rekombinante proteinene ble utført i 20 mM Tris, pH 7,8, NaCl 150 mM buffer inneholdende L-arginin (400 mM, Sigma) og βmerkaptoetanol (1 mM) ved romtemperatur ved å senke ureakonsentrasjonen i en sekstrinns dialyse (4, 3, 2, 1, 0,5 og 0 M urea henholdsvis). Redusert og oksidert glutation (5 mM og 0,5 mM henholdsvis, Sigma) ble tilsatt under de nevnte 0,5 og 0 M ureanalysetrinnene. Endelig ble proteinene langvarig dialysert mot 10 mM Tris, pH 7,5, NaCl 150 mM buffer. Løselige og refoldede proteiner ble konsentrert og renset på en Superdex 200 størrelsesutelukkelseskolonne (Pharmacia; ÄKTA-system).
Overflateplasmonresonansmålinger ble utført i et Biacoreapparat (Biacore). I alle Biacoreeksperimentene ble HBS-buffer supplert med 0,05% av det overflateaktive middelet P20, brukt som løpende buffer.
Proteinimmobilisering. Rekombinante KIR2DL1- og KIR2DL3-proteiner fremstilt som beskrevet ovenfor ble immobilisert kovalent til karboksylgrupper i dekstranlaget på en sensorbrikke CM5 (Biacore). Sensorbrikkeoverflaten ble aktivert med EDC/NHS (N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid og N-hydroksysuccinimid, Biacore). Proteiner i koblingsbuffer (10 mM acetat, pH 4,5) ble så injisert. Deaktivering av de gjenværende aktiverte gruppene ble utført ved å bruke 100 mM etanolamin pH 8 (Biacore).
Affinitetsmålinger. For å få utført kinetiske målinger, ble forskjellige konsentrasjoner av det løselige antistoffet (1 x 10<-7>til 4 x 10<-10>M) påsatt den immobiliserte prøven. Målingene ble utført ved en kontinuerlig strømningshastighet på 20 μl/minutt. For hver syklus ble overflaten på sensorbrikken regenerert ved en 5 μl injeksjon av 10 mM NaOH pH 11. BIAlogue Kinetics Evaluation-programmet (BIAevaluation 3.1, Biacore) ble brukt for dataanalyse. Den løselige analytten (40 μl ved forskjellige konsentrasjoner) ble injisert med en strømhastighet på 20 μl/minutt i HBS-buffer, på dekstranlag som inneholdt 500 eller 540 refleksjonsenheter (RU) og 1000 eller 700 RU av henholdsvis KIR2DL1 og KIR2DL3. De data som er angitt er representative for 6 uavhengige eksperimenter. Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor.
Tabell 1
Biacoreanalyse av DF200 mAb-binding til immobilisert KIR2DL1 og KIR2DL3.
KD: Dissosiasjonskonstant.
Eksempel 4: Utvikling av nye humant anti-KIR mAb'er
Humane monoklonale anti-KIR mAb'er ble utviklet ved å immunisere transgene mus som var manipulert slik at de uttrykker et humant antistoffrepertoar med rekombinante løselige KIR-proteiner. Etter forskjellige cellefusjoner for å etablere hybridomer, ble mAb'er først selektert for sin evne til å kryssreagere med immobilisert KIR2DL1- og KIR2DL3-protein (fremstilt som beskrevet i eksempel 3 ovenfor). Det viste seg at flere humane monoklonale antistoffer inklusive 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1, viste seg å være kryssreaktive med KIR2DL1 og KIR2DL2/3.
Positive monoklonale antistoffer ble ytterligere screenet eller undersøkt for sin evne til å rekonstituere oppløsning av KIR2DL1-positive NK-transfektanter mot Cw4-positive målceller. De Nk-cellene som uttrykte HLA klasse I-spesifikke hemmende reseptorer ble brukt som effektorceller mot målceller som uttrykte ett eller flere HLA-C-alleler (figurene 5 og 6). Cytotoksisitetsprøver ble utført som beskrevet ovenfor. Effektor/målforholdet er angitt i figurteksten og antistoffene ble enten brukt i en konsentrasjon på 10 μg/ml eller 30 μg/ml.
Som forventet hadde KIR2DL1+ NK-cellene liten eller ingen cytolytisk aktivitet mot målceller som uttrykte HLA-Cw4. I nærvær av 1-7F9 mAb ble imidlertid NK-cellene ute av stand til å gjenkjenne sin HLA-C (det vil si at de ikke lenger var hemmet av HLA-C-molekyler) og hadde nå sterk cytolytisk aktivitet mot de Cw4-positive målene. De to cellelinjene som ble testet (HLA-Cw4 transfektert med 721.221 og CW4+ EBV-cellelinjene) ble for eksempel ikke avlivet av KIR2DL1+ NK-celler, men hemmingen kunne effektivt reverseres ved å bruke enten mAb 1-7F9 eller de vanlige anti-KIR2DL1 mAb EB6. De murine mAb'ene DF200 og Pan2D (NKVSF1) ble sammenlignet med det humane mAb 1-7F9 og i alle eksperimentene var 1-7F9 kraftigere enn noen av de andre mAb som ble testet med hensyn til å indusere cytotoksisitet i NK-cellene. Antistoffene 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 var på den annen side ikke i stand til å rekonstituere celleoppløsning av NK-celler mot Cw4-positive mål.
Eksempel 5: Biacore konkurrerende bindingsanalyse av murine og humane anti-KIR-antistoffer
Epitopkartleggingsanalyse ble utført ifølge en tidligere beskrevet fremgangsmåte (Gauthier et al., Journal of Immunology 1999; 162: 41-50; Saunal and van Regenmortel, Journal of Immunology 1995; 183: 33-41) på immobilisert KIR2DL1 (900 RU), KIR 2DL3 (2000 RU) og KIR2DS1 (1000 RU) med mus anti-KIR2D-antistoffene DF200, NKVSF1 (Pan2D), gl183 og EB6 og de humane anti-KIR2D-antistoffene 1-4F1, 1-6F1, 1-6F5 og 1-7F9.
Alle eksperimenter ble utført ved en strømhastighet på 5 μl/minutt i en HBS-buffer med 2 minutters injeksjon av de forskjellige antistoffene i en konsentrasjon på 15 μg/ml. For hvert par av antistoffer ble det utført en konkurrerende bindingsanalyse i to trinn. I det første trinnet ble det første monoklonale antistoffet (mAb) injisert på KIR2D-målproteinet fulgt av det andre mAb (uten å fjerne det første mAb) og den andre mAb RU-verdien (RU2) ble kontrollert. I det andre trinnet ble det andre mAb først injisert, direkte på det nakne KIR2D-proteinet, hvoretter mAb RU-verdien (RU1) ble kontrollert og målt. Prosent hemming av den andre mAb-binding til KIR2D-proteinet på grunn av det første mAb, ble beregnet ved formelen: 100*(1-RU2/RU1).
Resultatene er vist i tabellene 2, 3 og 4, hvor de antistoffene som er betegnet "første antistoff" står i den vertikale kolonnen mens det "andre antistoffet" er gitt på den horisontale linjen på toppen av tabellen. For hver undersøkte antistoffkombinasjon er verdiene for direkte bindingsnivå (RU) av antistoffet til KIR2D-brikken gitt i tabellen, hvor direkte binding av det andre stoffet til KIR2D-brikken er angitt i den øvre delen av feltet og verdien for binding av det andre antistoffet til KIR2D-brikken når det første antistoffet er tilstede, i den nedre delen av feltet. Angitt til høyre i hvert felt er prosent hemming av andre antistoffbinding. Tabell 2 viser binding på en KIR2DL1-brikke, tabell viser binding av antistoffer til en KIR2DL3-brikke og tabell 4 viser binding av antistoffer til en KIR2DS1-brikke.
Konkurrerende binding av murine antistoffer DF200, NKVSF1 og EB6 og humant antistoffer 1-4F1, 1-7F9 og 1-6F1 til immobilisert KIR2DL1, KIR2DL2/3 og KIR2DS1 ble bedømt. Epitopkartlegging (figur 7) fra eksperimentene med anti -KIR-antistoffenes binding til KIR2DL1, viste at (a) antistoffet 1-7F9 kan konkurrere med EB5 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1 og DF200; (b) antistoffet 1-4F1 kan på sin side konkurrere med EB6, DF200, NKVSF1 og 1-7 F9; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og EB6, men ikke med 1-7F9. Epitopkartlegging (figur 8) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffers binding til KIR2DL3 viste at (a) 1-4F1 konkurrerer med NKVSF1, DF200, gl183 og 1-7F9; (b) 1-7F9 konkurrerer med DF200, gl183 og 1-4F1, men ikke med NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200, 1-4F1 og GL183, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1, 1-4F1 og 1-7F9, men ikke med GL183.
Epitopkartlegging (figur 9) fra eksperimenter med anti-KIR-antistoffenes binding til KIR2DS1 vist at (a) 1-4F1 konkurrerer med NKVSF1, DF200 og 1-7F9; (b) 1-7F9 konkurrerer med 1-4F1 men konkurrerer ikke med DF200 og NKVSF1; (c) NKVSF1 konkurrerer med DF200 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9; og (d) DF200 konkurrerer med NKVSF1 og 1-4F1, men ikke med 1-7F9.
Tabell 2
KIR2DL1-epitopkartlegging ved å bruke konkurrerende binding mellom første og andre antistoffer (ND = ikke bestemt).
Tabell 3
KIR2DL3-epitopkartlegging ved å bruke konkurrerende binding mellom første og andre antistoffer (ND = ikke bestemt).
Tabell 4
KIR2DS1-epitopkartlegging ved å bruke konkurrerende binding mellom første og andre antistoffer (ND = ikke bestemt).
Eksempel 6: Anti-KIR mAb-titrering med cynomolgus NK-celler
Anti-KIR-antistoffet NKVSF1 ble testet for sin evne til å binde seg til NK-celler fra cynomolgusaper.
Rensing av ape PBMC og utvikling av polyklonal NK-cellebulk. Cynomolgus Macaque PBMC ble fremstilt fra natriumcitrat CPT-rør (Becton Dickinson). NK-cellerensingen ble utført ved negativ fjerning (Macaque NK-celleanrikningssett, Stem Cell Technology). NK-cellene ble dyrket på bestrålte humane fødeceller med 300 U/ml interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1 ng/ml fytohemagglutinin A (Invitrogen, Gibco) for å oppnå polyklonale NK-cellepopulasjoner.
Pan2D mAb-titrering med cynomolgus NK-celler. Cynomolgus NK-celler (NK-bulk på dag 16) ble inkubert med forskjellige mengder av Pan2D mAb fulgt av PE-konjugerte geit F(ab')2-fragmenter antimus IgG (H+L) -antistoffer. Prosenten av positive celler ble bestemt ved en isotypisk kontroll (renset mus IgG1). Prøvene ble utført i to paralleller. Midlere fluorescensintensitet = MFI.
Binding av antistoffet til ape NK-celler er vist på figur 10.
Eksempel 7: Screening av humane anti-KIR mAb'er
Humane monoklonale anti-KIR Ab'er ble utviklet ved å immunisere transgene mus som var manipulert slik at de uttrykker et humant antistoffrepertoar med rekombinant KIR-protein slik det er beskrevet i eksempel 4. For å utvikle kryssreaktive anti-KIR-antistoffer ble dyrene sekvensmessig immunisert med forskjellige KIR, enten i løselig form som beskrevet i eksempel 3, eller ble uttrykt på overflaten av cellene.
Etter forskjellige cellefusjoner ble nevnte mAb'er deretter først selektert for sin evne til å kryssreagere med immobilisert KIR2DL1- og KIR2DL3-protein ved ELISA ved å bruke standardmetoder. Flere humane monoklonale antistoffer så som 1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 og 1-6F1 viste seg å reagere med alle av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 ved ELISA. De mAb som reagerte med både KIR2DL1 og KIR2DL2/3, ble betegnet som "KIR2DL-kryssreaktive mAb".
De KIR2DL-kryssreaktive mAb'ene ble så testet for sin evne til å reagere med KIR på overflaten av cellene ved hjelp av flowcytometri. Kort beskrevet ble bindingen av de humane anti-KIR mAb'er testet ved at disse ble inkubert med forskjellige cellelinjer som stabilt overuttrykker KIR (for eksempel YTS-2DL1, BWZ-KIR2DL2 og BWZ-KIR2DS4) eller som ikke uttrykker KIR (for eksempel YTS og BWZ). Kort beskrevet ble cellene inkubert med forskjellige konsentrasjoner (typisk 0-50 μg/ml) av humant anti-KIR mAb1-7F9 i DMEM-medium som inneholdt 2% FCS. Etter inkubering ble cellen vasket og inkubert med APC-konjugerte sekundære antistoffer som var spesifikke for humant IgG. Alle inkuberinger og vaskinger ble utført ved 0-4 ºC. Deretter ble cellene vasket, på nytt suspendert i PBS og analysert ved flowcytometri på en FACScalibur eller en FACScanto (begge fra Beckton Dickinson). Et typisk eksempel er vist på figur 16. Man fant for eksempel at 1-7F9 og 1-4F1 ikke bandt seg til celler som var transfektert med KIR2DS4, noe som var tilfellet med NKVSF1 (Pan2D) (figur 16).
Evnen til de humane anti-KIR mAb'er til å blokkere interaksjonen mellom KIR og dens HLA-C-ligand ble deretter testet ved 1) biokjemiske direkte bindingseksperimenter og 2) funksjonell rekonstituering av oppløsningsprøver.
I den biokjemiske bindingsprøven ble evnen til de humane anti-KIR mAb'er, inklusive 1-7F9, til å blokkere interaksjonen mellom HLA-C og KIR-molekylene bedømt ved konkurrerende binding til løselige rekombinante KIR-Fcfusjonsproteiner til celler som uttrykte HLA-C. KIR-Fc-proteinene ble fremstilt som beskrevet (Wagtmann et al., Immunity 1995; 3(6): 801-9), bortsett fra at det humane Fc ble erstattet met murint IgG1 Fc. Løselig KIR-Fc binder seg til celler som uttrykker de spesifikke HLA-C-allotypene som gjenkjennes av KIR2DL1 og denne bindingen kan visualiseres ved flowcytometri ved å bruke et sekundært fluorokromkonjugert Ab som er spesifikt for den murine Fc-delen av KIR-Fcproteinet. KIR2DL1-Fc binder seg for eksempel til celler som er transfektert med HLA-Cw*0402 (LCL 721.221-Cw4-transfektanter) (Litwin et al., J Exp Med. 1993; 178: 1321-36), men ikke til de utransfekterte LCL 721.221-cellene (se figur 11A).
For å hvorvidt anti-KIR mAb'er kunne hindre denne interaksjonen mellom KIR2DL1-Fc og HLA-Cw4, ble KIR2DL1-FC-proteinene preinkubert med økende konsentrasjoner av anti-KIR mAb'er og så tilsatt LCL 721.221-Cw4-cellene, inkubert ved 4 ºC, vasket, inkubert med APC-konjugert anti-murint IgG1 Fc, vasket og analysert ved flowcytometri på en FACScalibur eller en FACScanto (Beckton Dickinson) ved hjelp av standardmetoder. Enkelte murine anti-KIR mAb'er så som DF200 og noen humane anti-KIR mAb'er, det vil si 1-7F9 og 1-4F1, hindret bindingen av KIR2DL1-Fc til celler som uttrykte HLA-Cw4, noe som viser at disse mAb'er blokkerer interaksjonen mellom KIR2DL1 og HLA-Cw4. Eksempelvis viser figur 17A at DF200 hindrer bindingen av KIR2DL1-Fc til celler som uttrykker HLA-Cw4. Figur 17B viser at 1-7F9 mAb'er hindrer at KIR2DL1 binder seg til HLA-Cw4. Parallelt ble nevnte anti-KIR mAb'er testet for sin evne til å hindre bindingen av KIR2DL2 til HLA-Cw3. Antistoffer som hindret bindingen av KIR2DL-Fc til HLA-C-uttrykkende celler på en doseavhengig måte slik det eksempelvis er vist på figur 17, ble betegnet som "blokkerende mAb'er" og ble ytterligere testet i funksjonelle cytotoksisitetsprøver som beskrevet i det etterfølgende.
Den terapeutiske anvendelsen av de humane anti-KIR mAb'er er forbundet med deres evne til å indusere KIR-uttrykkende NK-celler til å avlive tumorceller ved å hindre hemmende signalisering via KIR. Det er derfor viktig å kunne bedømme hvorvidt humane KIR2DL-kryssreaktive og blokkerende mAb'er er i stand til å indusere oppløsning av målceller som uttrykker HLA-C ved hjelp av NK-celler som uttrykker KIR2DL. For dette formålet ble de følgende eksperimenter utført:
I<51>Cr-frigjøringscytotoksisitetsprøver så kan YTS-celler som uttrykker KIR2DL1 (YTS-2DL1) avlive LCL 721.221-Cw3, men ikke LCL 721.221-Cw4-celler (figur 18A). I motsetning til dette, så vil YTS-effektorceller som mangler KIR (YTS), meget effektivt avlive begge cellelinjene. YTS-2DL1-effektorceller kan således ikke avlive LCL 721.221-Cw4-celler på grunn av den HLA-Cw4-induserte hemmende signaliseringen via KIR2DL1. Når YTS-2DL1-celler ble preinkubert med 1-7F9 i<51>Cr-frigjøringscytotoksisitetprøver, så ble LCL 721.221-Cw4-cellene avlivet på en 1-7F9-konsentrasjonsavhengig måte (figur 18B). 3-1F13, et humant kryssreaktivt anti-KIR mAb som binder KIR2DL1 med høy affinitet men som ikke kan hindre interaksjonen mellom KIR2DL1 og HLA-Cw4, kan ikke indusere avliving av LCL 721.221-Cw4-celler av YTS-2DL1-celler. 1-7F9 induserer således NK-mediert eller -kontrollert avliving av målceller ved å hindre KIR-HLA-C-interaksjoner mellom NK- og målcellene.
Eksempel 8: Affinitetsmålinger for 1-7F9
Affiniteten til 1-7F9 for binding til KIR2DL1 og KIR2DL3 ble målt ved hjelp av en Biacore analyse ved å bruke løselige rekombinante KIR-proteiner fremstilt som beskrevet i eksempel 3. Biacore eksperimentene ble utført som beskrevet i eksempel 3, bortsett fra at det antistoffet som ble brukt var det humane mAb 1-7F9.
Resultatene av disse affinitetsbestemmelsene med hensyn til binding av 1-7F9 til KIR2DL1 og -3 er vist i tabell 5.
Tabell 5
Biacore analyse av 1-7F9 mAb-binding til immobilisert KIR2DL1 og KIR2DL3.
KD: Dissosiasjonskonstant.
Eksempel 9: Epitopkartlegging av 1-7F9 på KIR2DL1
Epitopkartlegging av et gitt monoklonalt antistoff på et gitt antigen kan oppnås ved hjelp av in silico metoder når det eksisterer egnede røntgenstrukturer/homologimodeller av både antistoffet og antigenet ved å utføres såkalt protein-proteindokking.
En homologimodell på et antistoff kan oppnås ved å sammenstille sekvensen for henholdsvis den lette og den tunge kjeden med et utvalg av antistoffer hvor man kjenner deres tredimensjonale struktur. Lengden av de 6 komplementaritetsbestemmende områdene (CDRer) kan beregnes og deretter kan den beste templaten velges ut fra antistoffer med de samme CDR-lengder. Ved hjelp av standardteknikker kan således en homologimodell utvikles fra den valgte templaten.
I protein-proteindokkingsmetoden, som nylig er beskrevet (Schneidman-Duhovny et al., Curr Med Chem 2004; 11: 91-107), blir de to overflatene representert ved sine karakteristiske overflateegenskaper. Disse egenskaper eller trekk inkluderer hydrogenbindingsevner, ladninger og hydrofobisitet. I en nettbasert metode blir rommet oppdelt i terninger (kuber) og hver terning blir gitt en verdi alt etter sin stilling til overflaten (indre, overflate, ytre) og betegnet etter sitt relevante trekk av egenskaper. En krafttilpasning av overflatene ved hjelp av en scoringsfunksjon kan også brukes for å lete etter de hele 3-translaterende og 3-roterende frihetsgradene. Translateringene utføres ved en Fast Fourier-transformering og rotasjonen behandles som individuelle beregninger innenfor en standard diskretisering av rotasjonsrommet. Ut fra de beste scoringskompleksene kan resultatene filtreres og scores ved hjelp av en rekke fremgangsmåter, for eksempel formkomplementaritet, Van der Waals interaksjoner, hydrofobisitet, elektrostatiske egenskaper, desolvatering, hydrogenbinding, atomkontaktenergi, rest-restparingsstatistikk og paring av de hydrofile gruppene. De beste scoringskompleksene kan så bedømmes detaljert og interagerende rester og derved epitopen kan så identifiseres.
Metoder og analyser
Rester og domenenomenklatur for de anvendte KIR er i følge Fan et al. (Nature 1997; 389: 96-100) slik at domene 1 omfatter restene 6-101, mens domene 2 omfatter aminosyrerestene 105-200.
Det ble konstruert en homologimodell på 1-7F9 ved å bruke 1OM3 som en templat.
1OM3-strukturen, utviklet av Calarese et al (Science 2003; 300: 2065, et seq.), ble innhentet fra proteindatabasen ved World Wide Web (WWW) adresse rcsb.org/pdb/; 1OM3 VL-sekvens: SEKV.ID. NR. 34; 1OM3 VH-sekvens: SEKV.ID. NR. 35). Kabatnummerering og CDR-betegnelser ble brukt. Den totale sammenstillingen var god og CDR-lengdene var identiske slik at homologimodellen vil være tilstrekkelig nøyaktig til at den kan brukes i et protein-proteindokkingseksperiment.
Ut fra protein-proteindokkingen av 1-7F9-antistoffhomologimodellen på KIR2DL1-strukturen, ble det oppnådd 1NKR.pdb 2000-løsninger. Disse ble filtrert for sin nærhet til D183 (atomer < 6 Å fra CD) og R131 (atomer < 12 Å fra CZ) og 133 resulterende løsninger ble så detaljert analysert.
Det høyeste scoringskomplekset som var dannet ble analysert og en mulig interaksjon mellom R131 (KIR) og D100C (tung kjede) ble identifisert og dempet. Det ble valgt ut en ny rotamer for F181 og energien ble minimalisert. Denne modellen predikerer at antistoffet virker sammen med de følgende restene på KIR2DL1 (SEKV.ID. NR. 23): S20 (Hyd, CB) (HydAkseptor, OG), E21 (Hyd, CB, CG), M44 (Hyd, SD, CE), F45 (Hyd, CD1, CD1, CZ, CE2), R68 (HydDonor, NH2), T70 (Hyd, CB, CG2), Q71 (Hyd, CG), L104 (Hyd, CB, CG, CD1, CD2), Y105 (Hyd, CG, CD2, CE2), R131 (Ion, NH2) (HydDonor, NH2), S133 (Hyd, CA, CB) (HydDonor/Akseptor, OG), Y134 (Hyd, CD1, CE1), F181 (Hyd, CB, CG, CD1, CD2, CE1, CE2, CZ) og D183 (Hyd, CB).
Eksempel 10: Biacore konkurrerende bindingsanalyser av murine og humane anti-KIR-antistoffer
Konkurrerende binding av 1-7F9, Pan2D (NKVSF1) og DF200 ble bedømt ved hjelp av den samme fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 5.
Resultatene er vist i tabellene 6 og 7, hvor de antistoffene som er betegnet "første antistoff" er gitt i den vertikale kolonnen og det "andre antistoffet" er gitt på den horisontale linjen. For hver antistoffkombinasjon som ble testet, er det angitt prosentvis hemming av det andre antistoffet. Når den prosentvise hemmingen for et visst antistoffpar var over 40%, uansett hvilket antistoff som ble brukt som det første antistoffet, så ble antistoffene ansett å være konkurrerende. Tabell 6 viser bindingen på en KIR2DL1-brikke mens tabell 7 viser bindingen av antistoffene til en KIR2DL3-brikke.
Kort beskrevet så viser resultatene for KIR2DL1-binding at DF200 og Pan2D er konkurrerende, mens 1-7F9 ikke er konkurrerende hverken med DF200 eller Pan2D. For KIR2DL3-binding var DF200 og Pan2D konkurrerende, mens 1-7F9 ikke var konkurrerende med Pan2D, men konkurrerte med DF200.
Tabell 6
KIR2DL1-konkurrerende binding mellom første og andre antistoffer
Tabell 7
KIR2DL3-konkurrerende binding mellom første og andre antistoffer
Eksempel 11: Krystallstruktur for KIR2DL1 i kompleks med HuKIR1-7F9-Fab'
Krystallstrukturen for KIR2DL1 i kompleks med Fab'-fragmentet av 1-7F9 ble løst og raffinert til en 2,35 Å oppløsning ved hjelp av røntgenkrystallografi. Resultatene bekreftet at antistoffet, når det er bundet til KIR2DL, vil være i stand til å blokkere bindingen til et MHC klasse I-molekyl (figur 19).
Materialer og metoder
Ekstracellulært KIR2DL1 (aminosyre 1-23 i SEKV.ID. NR. 23 hvor rest 16 er arginin (R), mens rest 114 er leucin (L) og som inkluderer en ytterligere N-terminal metionin (M) -rest) og HuKIR1-7F9 Fab' (med den lettkjedesekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 36 og med tungkjedesekvensen med restene 1-221 i SEKV.ID. NR.
37), ble blandet med et svakt overskudd av KIR2DL1 og komplekset ble renset på en gelfiltreringskolonne. Komplekset ble så konsentrert til omtrent 13,5 mg/ml. Krystaller ble så utviklet med den såkalte hengende dråpeteknikken i 10% PEG6000 og 500 mM citratbuffer med en pH på 4,2. Krystallene ble så flashfrosset i flytende N2og krystallografiske data med en oppløsning på 2,35 Å ble målt ved 100 K ved å bruke strålelinjen BL711I, MAX-lab, Lund, Sverige. Dataene ble integrert ved hjelp av XDS-programmet (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993; 26: 795-800). For strukturbestemmelse ble det brukt molekylær erstatning ved å bruke MOLREP-programmet fra CCP4-rekken (Bailey, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr.
1994; 50: 760-763) og de PDB-avsatte strukturene 1RZJ (Fab del 1) og 1NKR (KIR). Faseforbedringene ble utført ved hjelp av ARP/WARP-programmet (Lamzin og Wilson, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1993; 49: 129-147) og manuelle modifikasjoner av den røntgenavledede strukturen ble utført ved hjelp av QUANTA-programmet (tilgjengelig fra Accelrys Inc., San Diego, CA, USA).
Finjusteringen ble utført ved hjelp av REFMAC5-dataprogrammet i CCP4-rekken. Vannmolekylene ble tilsatt ved hjelp av ARP/WARP-programmet. Modellen omfattet restene 6-114 og 124-200 i KIR2DL1, 1-212 i den 1-7F9 lette kjeden 1-136 sammen med 143-224 i den 1-7F9 tunge kjeden. I tillegg ble det plassert 330 vannmolekyler. R- og R-frihetsgraden for modellen var henholdsvis 0,191 og 0,253.
Resultater
Kontaktene ble identifisert ved hjelp av CONTACT-dataprogrammet i CCP4-rekken ved å bruke en avskjæringsavstand på 4,0 Å mellom Fab'- og KIR2DL1-molekylene. Man fant at den resulterende KIR2DL1-epitopen for humant 1-7F9 omfattet de følgende restene i KIR2DL1 (SEKV.ID. NR. 23): L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88 (tabellene 8 og 9).
Rester i 1-7F9 som inngitt i interaksjoner med KIR2DL1, inkluderte S28, V29, S30, Y32, S92, N93 og W94 fra den 1-7F9-variable lette (VL) kjeden (SEKV.ID. NR. 15, tabell 8) og T28, F29, S30, F31, I54, F55, E74, S77, G102, S103, Y105, Y106, D107 og Y108 i den variable tunge (VH) kjeden (SEKV.ID. NR. 17). KIR2DL1-epitopen og de rester som er involvert i hydrogenbinding, er også angitt i aminosyresekvensen til KIR2DL1 på figur 20. De isotrope forskyvningsfaktorene (også kalt "temperaturfaktorer" eller "B-verdier") som ble oppnådd fra koordinatfinjusteringen, viste relativt lavere verdier for det N-terminale domenet i KIR2DL1 og de variable domenene i 1-7F9-antistoff Fab'-fragmentet og alle disse domenene er direkte involvert i den intermolekylære bindingen. Dette viste at de bindende kreftene mellom de to molekylene i komplekset av krystallen er sterke og stabile og understøtter at krystallstrukturen viser et stabilt KIR2DL1/1-7F9 Fab'-kompleks.
1-7F9 Fab'-molekylet er bundet til KIR2DL1-molekylet på en side av C'CFGA βplaten i domene D1, men i tillegg berørte også en E β-trådrestsidekjede i det samme domenet. Forbindelser med sløyferester i D1-domenet er også viktig for binding (for konvensjoner med hensyn til topologinavnsetting, se Fan et al., Nature 1997; 389: 96-100). Mer spesifikt er det forbindelser til de følgende topologiske delene av KIR2DL1; β-tråd C (aminosyrene L38 og R41), sløyfen mellom β-trådene C og C', L2 (M44, F45 og N46), β-tråd C' (D47, T48, L49, R50 og I52), β-tråd E (F64), sløyfen mellom E- og F β-trådene, L3 (D72), β-tråd F (Y80) og sløyfen mellom F-og G β-trådene (P87 og Y88).
Mens HLA-Cw4-molekylet binder seg både til D1- og D2-domenene i KIR2DL1-molekylet (Fan et al. Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460), så binder 1-7F9-antistoffet seg bare til KIR2DL1 D1-domenet. Det er imidlertid en romlig overlapping mellom et bundet 1-7F9- og et bundet HLA-Cw4-molekyl og dette er tilstrekkelig stort til at 1-7F9-antistoffet med godt resultat erstatter HLA-Cw4. Ved å bruke den publiserte strukturen for KIR2DL1 i kompleks med HLA-Cw4 (PDB-aksesjonskode 1IM9), så kan kontaktrester mellom KIR2DL1 og HLA-Cw4 beregnes ved hjelp av CONTACT-programmet. I en beregning ved å bruke en avstandsavskjæring på 4,0 Å, kan man se at de tre KIR2DL1-restene som inngår i kontakter med HLA-Cw4-rester er felles med kontaktrestene i 1-7F9/KIR2DL1-komplekset (tabell 8 og 9). Disse tre KIR2DL1-restene er M44, F45 og D72.
Uten å være begrenset av noen spesifikk teori, så indikerer de krystallografiske resultatene også at 1-7F9 ikke binder den aktiverende NK-reseptoren KIR2DS4 på grunn av aminosyrene N47 og V72 i den ekstracellulære delen av KIR2DS4-sekvensen (SEKV.ID. NR. 38).
Tabell 8
KIR2DL1 - 1-7F9 Fab' VL-kjedeinteraksjoner. En avkjæringsavstand på 4,0 Å ble brukt. Kontaktene ble identifisert ved hjelp av CONTACT-dataprogrammet fra CCP4-rekken. I den siste kolonnen indikerer "***" en sterk mulighet for en hydrogenbinding ved denne kontakten (avstand < 3,3 Å) slik det ble beregnet med CONTACT, "*" indikerer en svak mulighet (avstand > 3,3 Å). Åpne felter indikerer at programmet anså at det ikke var noen mulighet for en hydrogenbinding.
Tabell 9
KIR2DL1 - 1-7F9 Fab' VH-kjedeinteraksjoner. Det ble brukt en avskjæringsavstand på 4,0 Å. Kontaktene ble identifisert ved hjelp av CONTACT-dataprogrammet fra CCP4-rekken. I den siste kolonnen indikerer "***" en sterk mulighet for en hydrogenbinding ved denne kontakten (avstand < 3,3 Å) slik det ble beregnet med CONTACT, "*" indikerer en svak mulighet (avstand > 3,3 Å). Åpne felter indikerer at programmet anså at det ikke var noen mulighet for en hydrogenbinding.
Eksempel 12: Fysisk stabilitet for 1-7F9
De biofysiske egenskapene og stabiliteten for det humane antistoffet 1-7F9 ble undersøkt. Foldingen og proteinets sekundære struktur ble undersøkt ved hjelp av såkalt sirkulær dikroisme (CD) og oligomerisering og aggregering ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). For å etterligne lagringsbetingelsene i to år ved 5 ºC ble proteinet innkubert ved 37 ºC med risting i 14 dager.
Materialer og metoder
Prøvefremstilling. 2 mg/ml 1-7F9 ble fremstilt i (a) 50 mM Na-fosfat, 0,001% polysorbat 80 (Sigma, P8074), pH 7,0; (b) 50 mM Na-fosfat, 0,001 % polysorbat 80, pH 7,0, 0,5 mM sukrose; (c) 50 mM citrat, 0,001 % polysorbat 80, pH 3,0; og d) 50 mM Tris, 0,001 % polysorbat 80, pH 8,5.
Sirkulær dikroisme (CD). CD-målingene ble utført ved 25 ºC en proteinkonsentrasjon på 2,0 mg/ml i et Chirascan sirkulært dikroismespektrometer (Applied Photophysics) utstyrt med et peltierelement for temperaturkontroll. 1 -7F9-prøvene ble plassert i sylindriske kvartsceller med en strålingslengde på 0,1 mm. Hver buffer ble skannet og de oppnådde data ble fratrukket hvert enkelt
prøvespektrum.
Dynamisk lysspredning (DLS). DLS ble utført ved 25 ºC og en proteinkonsentrasjon på 2,0 mg/ml ved å bruke et Dynapro 99 temperaturkontrollert DLS-instrument (Protein Solutions Inc.). Dataanalysene ble utført ved å bruke det Dynamicsprogrammet som ble levert med instrumentet.
Resultater
Mens molekylstørrelsen ikke forandret seg i prøvene ved en pH på 7,0 etter 14 dager inkubering slik dette kunne bedømmes ved DLS, så ble det i begge prøvene formulert ved pH 3,0 og pH 8,5 en sterk aggregering i løpet av en periode på 14 dager.
CD-målingene viste egenskaper for en total betastruktur og viste at de prøvene som var formulert ved pH 7,0 beholdt sin sekundære struktur under hele den akselererte undersøkelsen, skjønt det var et svakt fall i signalet for den prøven som bare inneholdt polysorbat 80 som eksipiens. Dette kan skyldes en svak utfelling av prøven ettersom den generelle formen på spekteret forble uforandret. Prøven som inneholdt sukrose viste ingen slik senkning over tid. CD-målingene for prøvene som var formulert ved pH 3,0 og 8,5 viste en sterk forandring med hensyn til spektralegenskaper over tid, noe som sannsynligvis er et resultat av utfolding eller andre konformasjonelle forandringer som vil kunne føre til et ikke-funksjonelt 1-7F9-protein. Forandringene ble observert umiddelbart og var mest signifikante ved pH 3,0.
Generelt beholdt 1-7F9 sine fysiske egenskaper og forble stabilt under de stressede betingelsene (37 ºC med risting) ved pH 7,0 med polysorbat 80 og sukrose som eksipienser.
Eksempel 13: Affinitetsbestemmelse (monovalent binding) for 1-7F9 og 1-4F1
Affinitetene til 1-7F9 og 1-4F1 i en monovalent binding til KIR2DL1- og KIR2DL3-antigen (i motsetning til de bivalente bindingsaffinitetsbestemmelsene som angitt i eksemplene 3 og 8), ble bestemt ved overflateplasmonresonansteknologi ved å bruke et Biacore 3000-apparat.
Kort beskrevet ble et antihumant IgG (Dako RAHIgG nr. 0423) brukt sammen med en HBS-EP-buffer ved en strømhastighet på 20 μl/minutt. Rensede antistoffer ble fortynnet til 10 μg/ml. For hvert antistoff ble det injisert KIR2DL1 eller KIR2DL3 og buffer. Antigenene ble testet ved konsentrasjoner på 2000, 500, 200, 50 og 20 nM. Strømhastigheten ble hele tiden holdt på 20 μl/minutt. Regenerering av overflaten ble oppnådd ved en enkelt 30 sekunders injeksjon med glysin-HCl pH 1,8.
Resultatene er vist i tabell 10. For bindingen av 1-4F1 til KIR2DL1, var det et signifikant skift i basislinjen. Uten å være begrenset av noen som helst spesifikk teori, så kan dette representere en buffereffekt som skyldes matrisen eller at bindingsreaksjonen i virkeligheten involverer 2 trinn, for eksempel på grunn av en konformasjonell forandring av antigenet.
Tabell 10
Monovalent bindingsaffinitet for 1-7F9 og 1-4F1 til KIR2DL1 og KIR2DL3. *) indikerer tilpasning med RI (responsmatrise) global tilpasning.

Claims (20)

PATENTKRAV
1. Isolert antistoff eller fragment derav,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det binder seg til hver av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3, men som ikke binder KIR2DS4, og som reduserer, nøytraliserer eller reverserer hemning av NK cellecytotoksisitet mediert av disse KIR2DLene.
2. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det ytterligere ikke binder KIR2DS3.
3. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at antistoffet eller fragmentet blokkerer bindingen av minst én av KIR2DL1, KIR2DL2 og KIR2DL3 til et HLA-C klasse I-molekyl.
4. Isolert antistoff eller fragment ifølge ethvert av de foregående krav, k a r a k t e r i s e r t v e d at antistoffet eller fragmentet blokkerer bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til KIR2DL1 og bindingen av et HLA-Cw3-molekyl til KIR2DL2 og KIR2DL3.
5. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det binder til i det vesentlige den samme epitopen som et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter aminosyresekvensen SEKV.ID. NR. 17.
6. Isolert antistoff eller fragment ifølge ethvert av de foregående krav, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 15 og et tungkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 17.
7. Isolert antistoff eller fragment ifølge ethvert av de foregående krav, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter
(a) en tungkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer restene 31-35 i SEKV.ID. NR. 17;
(b) en tungkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer restene 50-65 i SEKV.ID. NR. 17;
(c) en tungkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer restene 99-112 i SEKV.ID. NR. 17;
(d) en lettkjede CDR1-aminosyresekvens som tilsvarer restene 24-34 i SEKV.ID. NR. 15;
(e) en lettkjede CDR2-aminosyresekvens som tilsvarer restene 50-56 i SEKV.ID. NR. 15; og
(f) en lettkjede CDR3-aminosyresekvens som tilsvarer restene 89-97 i SEKV.ID. NR. 15.
8. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter et lettkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 39 og et tungkjedevariabelt område som omfatter en aminosyresekvens som er minst 80% identisk med SEKV.ID. NR. 41.
9. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det binder til en KIR2DL1-epitop som omfatter aminosyrerestene L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 og Y88 av KIR2DL1 som vist i SEKV.ID.NR. 23.
10. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 eller 2,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det blokkerer bindingen av et HLA-Cw4-molekyl til restene M44, F45 og D72 av KIR2DL1 sekvensen som vist i SEKV.ID. NR. 23.
11. Isolert antistoff eller fragment ifølge ethvert av de foregående krav,
k a r a k t e r i s e r t v e d at det er et monoklonalt antistoff eller et fragment derav.
12. Isolert antistoff eller antistoffragment ifølge ethvert av de foregående krav, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er et IgG1-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-antistoff eller antistoffragment.
13. Nukleinsyre,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den koder det isolerte antistoffet eller antistoffragmentet ifølge ethvert av de foregående krav, eller en vektor omfattende nevnte nukleinsyre.
14. Celle,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter vektoren ifølge krav 13, eller et hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet ifølge ethvert av krav 1-12.
15. Fremgangsmåte for å produsere et anti-KIR-antistoff eller et fragment derav, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter å dyrke cellen eller hybridomet ifølge krav 14 under betingelser som er egnet for ekspresjon av anti-KIR-antistoffet eller fragmentet derav.
16. Farmasøytisk sammensetning,
k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter antistoffet eller antistoffragmentet ifølge ethvert av kravene 1-12, eller antistoffet eller antistoffragmentet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 15, i en mengde som effektivt påvisbart forsterker NK-cellecytotoksisitet i en pasient, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens.
17. Farmasøytisk sammensetning som omfatter det isolerte antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1 eller 2, som binder til i det vesentlige den samme epitopen som et antistoff som omfatter et lettkjedevariabelt område omfattende aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 39 og et tungkjedevariabelt område omfattende aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 41, i bindingen til i det minste en av KIR2DEL1, KIR2DEL2 og KIR2DEL3, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens.
18. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 16 eller 17, for anvendelse i en fremgangsmåte til behandling av en sykdom valgt fra kreft, proliferative sykdommer andre enn kreft og infeksjonssykdommer.
19. Sammensetning for anvendelse ifølge krav 18 der sykdommen er kreft.
20. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som kryssreagerer med multiple KIR2DL-genprodukter og som reduserer eller nøytraliserer den hemmende aktiviteten til slike KIRer,
k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene:
(a) å immunisere et ikke-humant pattedyr med et immunogen som omfatter et KIR2DL-polypeptid, der nevnte pattedyr et transgent dyr konstruert for å uttrykke et humant antistoff repertoar;
(b) å fremstille antistoffer fra nevnte immuniserte pattedyr, hvori nevnte antistoffer binder nevnte KIR2DL polypeptid;
(c) å velge ut antistoffer fra (b) som kryssreagerer med i det minste KIR2DL1-, KIR2DL2-, og KIR2DL3-genprodukter, og
(d) å velge ut antistoffer fra (c) som forsterker NK-cellecytotoksisitet.
NO20171133A 2004-07-01 2017-07-07 Isolert antistoff eller fragment derav, nukleinsyre som koder for nevnte antistoff eller antistoffragment, vektor som omfatter nukleinsyren, celle som omfatter vektoren eller hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antistoffragment, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff eller antistoffragment samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoff. NO344566B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2004/002464 WO2005003172A2 (en) 2003-07-02 2004-07-01 Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
PCT/DK2004/000470 WO2005003168A2 (en) 2003-07-02 2004-07-01 Methods for the production and cytotoxicity evaluation of kir2dl nk-receptor antibodies
DKPA200500025 2005-01-06
PCT/EP2005/053122 WO2006003179A2 (en) 2004-07-01 2005-07-01 Antibodies binding to receptors kir2dl1, -2, 3 but not kir2ds4 and their therapeutic use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20171133A1 NO20171133A1 (no) 2007-01-31
NO344566B1 true NO344566B1 (no) 2020-02-03

Family

ID=38462469

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20070585A NO341198B1 (no) 2004-07-01 2007-01-31 Humane anti-KIR antistoff.
NO20171133A NO344566B1 (no) 2004-07-01 2017-07-07 Isolert antistoff eller fragment derav, nukleinsyre som koder for nevnte antistoff eller antistoffragment, vektor som omfatter nukleinsyren, celle som omfatter vektoren eller hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antistoffragment, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff eller antistoffragment samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoff.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20070585A NO341198B1 (no) 2004-07-01 2007-01-31 Humane anti-KIR antistoff.

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP1841941A1 (no)
JP (1) JP5770142B2 (no)
KR (1) KR101299167B1 (no)
CN (1) CN103509111A (no)
AT (1) ATE499386T1 (no)
BR (1) BRPI0512911B1 (no)
CY (1) CY1122391T1 (no)
DE (1) DE602005026538D1 (no)
DK (1) DK1791868T3 (no)
ES (2) ES2738578T3 (no)
HU (1) HUE045639T2 (no)
IL (1) IL179635A0 (no)
LT (1) LT2287195T (no)
MX (1) MX2007000210A (no)
NO (2) NO341198B1 (no)
PT (2) PT1791868E (no)
RU (1) RU2410396C2 (no)
TW (2) TWI422389B (no)
ZA (1) ZA200700736B (no)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3579879A4 (en) * 2017-02-09 2020-12-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTI-BODY ANTI-KIR3DL1

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE334395T1 (de) * 1998-10-29 2006-08-15 Dakocytomation Denmark As Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl
MXPA05013923A (es) * 2003-07-02 2006-08-11 Univ Genova Anticuerpos nk receptores de pan-kir2dl y su utilizacion en diagnostico y terapia.
AU2005259221B2 (en) * 2004-07-01 2011-02-10 Innate Pharma Antibodies binding to receptors KIR2DL1, -2, 3 but not KIR2DS4 and their therapeutic use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WARREN H.S. ET AL., "Functional analysis of CD158b monoclonal antibodies recognizing the killer Ig-like receptors KIR2DS2, KIR2DL2 and KIR2DL3", Tissue Antigens, vol. 55, no. Supplement 1, 2000, pages 80-81., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20070585L (no) 2007-01-31
ES2738578T3 (es) 2020-01-23
BRPI0512911B1 (pt) 2023-05-16
KR101299167B1 (ko) 2013-08-30
RU2006144820A (ru) 2008-09-10
NO20171133A1 (no) 2007-01-31
PT2287195T (pt) 2019-07-29
ATE499386T1 (de) 2011-03-15
LT2287195T (lt) 2019-07-25
MX2007000210A (es) 2007-08-02
PT1791868E (pt) 2011-05-02
TWI422389B (zh) 2014-01-11
JP2013009676A (ja) 2013-01-17
HUE045639T2 (hu) 2020-01-28
DK1791868T3 (da) 2011-05-16
RU2410396C2 (ru) 2011-01-27
TW201235048A (en) 2012-09-01
TWI472338B (zh) 2015-02-11
NO341198B1 (no) 2017-09-11
ES2360467T3 (es) 2011-06-06
EP1841941A1 (en) 2007-10-10
DE602005026538D1 (de) 2011-04-07
IL179635A0 (en) 2007-05-15
CN103509111A (zh) 2014-01-15
JP5770142B2 (ja) 2015-08-26
TW200612986A (en) 2006-05-01
KR20070034568A (ko) 2007-03-28
ZA200700736B (en) 2008-04-30
CY1122391T1 (el) 2021-01-27
BRPI0512911A (pt) 2008-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2287195B1 (en) Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
US9708403B2 (en) KIR-binding agents and methods of use thereof
NO344566B1 (no) Isolert antistoff eller fragment derav, nukleinsyre som koder for nevnte antistoff eller antistoffragment, vektor som omfatter nukleinsyren, celle som omfatter vektoren eller hybridom som uttrykker antistoffet eller antistoffragmentet, fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antistoffragment, farmasøytisk sammensetning omfattende nevnte antistoff eller antistoffragment samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoff.