KR101299167B1 - 인간 항-ｋｉｒ 항체 - Google Patents

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Abstract

피험체 내 면역 반응을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 설명된다. 더 구체적으로, NK 셀의 활성을 조절하고 포유동물 피험체 내 NK 셀 세포독성의 강화를 가능케하는 인간 항체, 및 인간 단일클론 항체 1-7F9 또는 14F1과 유사한 항체 결합 특성을 갖는 항체가 설명된다. 또한, 상기 및 그들의 사용, 특히 피험체 내 NK 셀 활성 또는 세포독성을 증가시키기 위해, 치료에서 사용하기 위한 것을 포함하는 약학적 조성물 뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편 및 유도체가 설명된다.
NK 셀, 세포독성, 면역반응, 항체 단편

Description

인간 항-ＫＩＲ 항체{HUMAN ANTI-KIR ANTIBODIES}
본 발명은 NK 셀의 표면 상에 존재하는 2 개 이상의 억제성 KIR 리셉터와 상호작용하고/상호작용하거나 이것을 차단하고, 포유동물 피험체 또는 생물학적 샘플에서 NK 셀 세포독성을 강화하는 인간 항체, 및 그것의 단편 및 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항체, 단편, 변이체, 및 유도체의 제조 방법; 상기 항체 등을 포함하는 약학적 조성물; 및 특히, 피험체에서 NK 셀 활성 또는 세포독성을 증가시키기 위한 요법에서 이러한 분자 및 조성물의 사용에 관한 것이다.
자연 살해(NK) 세포는 면역 및 숙주 면역 감시 시스템에 연루되는 림프구의 하위-집단이다.
NK 셀은 림프구 전구체로부터 유래되어 골수에서 발달되는 단핵 세포이며, 형태상 특징 및 생물학적 특성은 일반적으로 덩어리 결정인자(CD) CD16, CD56, 및/또는 CD57의 발현; 세포 표면 상의 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 부재; "자기" 주요 조직적합성 복합체(MHC)/인간 백혈구 항원(HLA) 단백질을 발현하지 못하는 표적 세포에 결합하거나 상기 표적 세포를 살해하는 능력; 및 NK 리셉터를 활성화하는 리간드를 발현시키는 종양 세포 또는 기타 질병 세포를 살해하는 능력을 포함한다. NK 셀은 사전 면역화 또는 활성화의 필요없이 몇 가지 유형의 종양 셀라 인에 결합하고 이들을 살해하는 능력을 특징으로 한다. 또한, NK 셀은 면역계에 조절적 영향을 미치는 가용성 단백질 및 사이토카인을 방출할 수 있으며; 여러 주기의 세포분열을 겪고 모 세포와 유사한 생물학적 특성을 갖는 딸 세포를 생성할 수 있다. 인터페론 및/또는 사이토카인에 의한 활성화 시, NK 셀은 종양 세포의 용해 및 NK 셀과 표적 세포간의 직접적이고 물리적인 접촉을 필요로 하는 메카니즘에 의해 세포내 병원체로 감염된 세포의 용해를 매개한다. 표적 세포가 용해되어 NK 셀로부터 속박된 표적의 표면 상으로 세포독성 과립이 방출되고, 표적 혈장 멤브레인에 침투하여 아폽토시스 또는 프로그래밍된 세포사를 유도하는 페포린 및 그란자임 B와 같은 작동자 단백질의 방출이 수반된다. 정상적인 건강한 세포는 NK 셀에 의한 용해로부터 보호된다.
그것의 생물학적 특성에 기인하여, 각종 치료 및 백신 전략이 당업계에서 제안되어 왔으며 이것은 NK 셀의 조절에 의존적이다. 그러나, NK 셀 활성은 자극 및 억제성 신호 모두를 포함하는 복합 메카니즘에 의해 조절된다.
간단히 말해서, NK 셀의 용해 활성은 표적 세포 상에서 리간드와 상호작용하여 포지티브 또는 네거티브 세포에서 신호를 도입하는 각종 세포 표면 리셉터에 의해 조절된다. 이들 리셉터를 통하여 전달된 포지티브 및 네거티브 신호들 간의 균형은 표적 세포가 NK 셀에 의해 용해되는지(사멸하는지) 여부를 결정한다. NK 셀 자극성 신호는 NKp30, NKp44, 및 NKp46과 같은 자연 세포독성 리셉터(NCR); 및 NKG2C 리셉터, NKG2D 리셉터, 특정 활성화 킬러 lg-유사 리셉터(KIR), 및 기타 활성화 NK 리셉터에 의해 매개될 수 있다 (Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74). NK 셀 억제성 신호는 Ly49, CD94/NKG2A와 같은 리셉터, 및 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I-분자를 인지하는 특정한 억제성 KIR에 의해 매개될 수 있다(Karre et al., Nature 1986;319:675-8; Ohlen et al, Science 1989;246:666-8). 이들 억제성 리셉터는 다른 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 I 분자(HLA 클래스 I 포함)의 다형 결정인자에 결합하고 NK 셀-매개 용해를 억제한다.
또한, 종종 킬러 억제성 리셉터라고도 칭하는 KIR은 인간 및 인간이 아닌 영장류로 특성화되었으며, NK 셀 및 일부 T 세포를 포함하는 림프구의 특정 서브셋에 존재하는 다형 1 타입 트랜스-멤브레인 분자이다. KIR은 MHC 클래스 I 분자의 알파 1 및 2 도메인에서 결정인자와 상호작용하고, 상기 설명한 바와 같이, 별개의 KIR은 NK 셀에 대해 자극성 또는 억제성이다.
KIR에 대한 명명법은 세포외 도메인의 수(각각 2개 그리고 3개의 세포외 lg-도메인을 갖는 KIR2D 및 KIR3D) 및 세포질 꼬리가 긴지(KIR2DL 또는 KIR3DL) 또는 짧은지(KIR2DS 또는 KIR3DS) 여부에 따른다. 주어진 KIR의 존재 또는 부재는 단일 개체에 존재하는 NK 집단 내에 하나의 NK 셀로부터 그 외의 수의 NK셀에 이르기까지 다양할 수 있다. 또한, 인간에서, KIR 유전자에 대한 비교적 높은 수준의 다형 현상이 존재하며, 특정 KIR 유전자는 모든 개체에서는 아니지만, 일부에 존재한다. NK 셀 상의 KIR 대립 유전자의 발현은 확률적으로 조절되며, 이것은 주어진 개체에서, 주어진 림프구가 개체의 유전형에 따라서, 1, 2개 이상의 상이한 KIR을 발현할 수도 있음을 의미한다. 단일 개체의 NK 셀은 일반적으로 KIR의 상이한 조합을 발현하여, MHC 클래스 I 분자에 대한 상이한 특이성을 갖는 NK 셀의 레퍼토리를 제공한 다.
특정한 KIR 유전자 산물은 적절한 리간드에 결합하는 경우 림프구 활성의 자극을 유도한다. 모든 활성화 KIR은 하전된 막투과성 잔기가 있는 짧은 세포질 꼬리를 가지며, 상기 하전된 막 투과성 잔기는 NK 셀에 자극성 신호를 도입하는 면역리셉터 티로신-기재 활성 모티프(ITAM)을 갖는 어뎁터 분자와 결합한다. 이와는 반대로, 억제성 KIR은 면역리셉터 티로신-기재 억제성 모티프(ITIM)를 함유하는 긴 세포질 꼬리를 가지며, 이것은 그들의 MHC 클래스 I 리간드의 진입시 억제성 신호를 NK 셀로 도입한다. 공지의 억제성 KIR은 KIR2DL 및 KIR3DL 서브패밀리를 포함한다. 2개의 lg 도메인(KIR2LD)을 갖는 억제성 KIR은 HLA-C 알로타입: KIR2DL2(앞서 명시한 p58.2)를 인지하고 근접하게 관련된, 대립 유전자 산물 KIR2DL3는 모두 "그룹 1" HLA-C 알로타입(HLA-Cwa, -3, -7, 및 -8을 포함)을 인지하고, 반면 KIR2DL1(p58.1)은 "그룹 2" HLA-C 알로타입(HLA-Cw2, -4, -5, 및 -6과 같은 것)을 인지한다. KIR2DL1에 의한 인지는 HLA-C 대립 유전자 내 위치 80에서 Lys 잔기의 존재에 의해 지시된다. KIR2DL2 및 KIR2DL3 인지는 HLA-C 내 위치 80에서의 Asn 잔기의 존재에 의해 지시된다. 의미있게도, 대부분의 HLA-C 대립 유전자는 위치 80에 Asn 또는 Lys 잔기를 갖는다. 따라서, KIR2DL1, -2, 및 -3는 집합적으로 인간에서 발견된 모든 HLA-C 알로타입을 본질적으로 인지한다. 3개의 lg 도메인을 갖는 하나의 KIR인 KIR3DL1(p70)은 HLA-Bw4 대립 유전자와 공유하는 에피토프를 인지한다. 최종적으로, 3개의 lg 도메인을 갖는 분자의 동종다이머인, KIR3DL2(p140)은 HLA-A3 및 -A11을 인지한다.
다수의 억제성 KIR 및/또는 기타 MHC 클래스 I-특이적 억제성 리셉터들(Moretta et al, Eur J Immunogenet. 1997;24(6):455-68; Valiante et al, Immunol Rev 1997;155:155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998;16:359-93)이 NK 셀에 의해 공동 발현될 수도 있지만, 어떤 주어진 개체의 NK 레퍼토리에서, 단지 하나의 KIR을 발현하여 특이적 MHC 클래스 I 대립 유전자(또는 MHC 클래스 I 알로타입의 동일한 그룹에 속하는 대립 유전자)에 의해서만 억제되는 세포가 존재한다. 인간 MHC 클래스 I 분자는 종종 인간 조직적합성 항원(HLA) 클래스 I이라 칭한다.
그것의 표적에 관하여 잘못 매칭된 KIR-리간드, 즉 숙주의 어떤 HLA 분자를 인지하지 않는 KIR을 발현하는 NK 셀 집단 또는 클론은 백혈병 환자에서 동종이계 골수 이식 후 강력한, 수명 연장 항암 반응을 매개하는 것으로 나타났다(Ruggeri et a., Science 2002, 295:2097-2100). 기초를 이루는 메카니즘은 HLA 잘못 매칭된 조혈 이식이 수령체 내 어떤 HLA 리간드도 인지하지 않는 KIR을 발현시키는 공여체-유도성 NK 셀의 확장을 유도하고, 이로 인하여 KIR을 통해 억제되지 않는 것으로 여겨진다. 이들 동종이계 NK 클론은 강력한 항암 활성을 발휘한다. 이 반응은 급성 백혈병(AML)으로 진단된 환자에서 매우 강력하고, KIR-MHC 잘못 매칭된 1/2 동일한 이식으로 치료된다. 환자의 약리학적 치료에 의한 이 효과를 재생산하는 한 가지 방법은 환자의 내인성 NK 셀을 활성화하기 위해 KIR/HLA 상호작용을 차단하는 시약을 투여하는 것이다.
KIR2DL1에 특이적인 특정한 단일클론 항체는 LIR2DL1과 HLA-Cw4와 같은 "그룹 2" HLA-C 알로타입과의 상호작용을 차단하고(Moretta et al., J Exp Med 1993;178:597-604), HLA-C 알로타입을 발현하는 표적 세포의 NK-매개 용해를 촉진하는 것으로 나타났다. 또한, KIR2DL2/3과 HLA-Cw3 또는 그것의 유사한 알로타입과의 상호작용을 차단하는 KIR2DL2/3에 대한 단일 클론 항체가 설명되었다(Moretta et al., J -Exp Med 1993;178:597-604). 이러한 항체들은 임상적 상황에서의 사용상 이상적이지 않은데, 2개의 치료적 단일클론 항체(mAb)의 개발 및 이러한 항체들 모두 또는 이러한 항체들 중 하나의 선택(적절한 진단 후) 투여가 어떤 주어진 환자가 그룹 1 또는 그룹 2 HLA-2 알로타입을 발현하는지 여부에 따라, 모든 잠재적 환자를 치료하기 위해 필요할 것이기 때문이다.
Watzl 등(Tissue Antigens 2000;56:240-247)은 KIR의 다수의 이소타입을 인지하는 상호 반응 뮤린 항체를 생산하였으나, 그들 항체는 NK 셀의 용해 활성을 가능케 하지 않았다. 또한, Spaggiari 등(Blood 2002;99:1706-1714 and Blood 2002;100:4098-4107)은 각종 KIR에 대한 수많은 뮤린 단일클론 항체를 이용하는 실험을 수행하였다. 그들 항체 중 하나인 NKVSF1 (또한, Pan2D라고도 알려짐)은 KIR2DL1 (CD158a), KIR2DL2 (CD158b) 및 KIR2DS4 (p50.3)의 공통의 에피토프를 인지하는 것으로 보고되었다. 또한, Shin 등(Hybridoma 1999;18:521-7)은 KIR2DL1, KIR2DL3, 및 KIR2DS4 모두에 결합할 수 있는, A210 및 A803g라 표시된 2개의 단일클론 항체의 생성을 보고하였다. 그러나, 환자의 NK 셀의 억제성 KIR을 차단함에 있어서 항체의 치료적 사용의 경우, KIR 분자의 더 낮은 활성화는 항체와의 상호 작용을 더 좋게 하는데, 이것은 활성화 리셉터의 활성화를 차단하면 NK 셀의 자극을 손상시킬 수 있기 때문이다. 따라서, NKVSF1 , A210, 또는 A803g의 항원 결합 특성을 갖는 항체가 임상적 세팅에서 최적이 아닐 것이다. 추가적으로, 인간 환자의 치료에서 뮤린 단일클론 항체의 사용은 항체에 대한 숙주 면역 반응을 일으켜서, 치료의 효험을 손상시킬 수도 있다.
따라서, 억제성 KIR의 치료적 조절을 위한 실제적이고 효과적인 접근법이 당업계에서 지금까지 이용가능하지 않았다.
발명의 개요
본 발명은 KIR2DL1 및 KIR2DL2와 KIR2DL3 중 최소한 하나에, 또는 이들 3개의 KIR 모두에 특이적으로 결합하는 신규하고 유용한 인간 항체, 및/또는 이러한 KIR 들 중 하나 이상과 HLA-C 간의 상호작용을 차단함으로써 NK-셀 용해 활성을 강화하는 신규하고 유용한 인간 항체를 제공한다. 또한, 이러한 항체들의 단편 및 유도체가 제공된다. 또한, 본 발명은 본원에서 설명한 바와 같이, 그들 인간 항체 1-7F9 및 1-4F1과 실질적으로 동일한 VH 및 VL 서열을 포함하는, 신규하고 유용한 항체, 항체 단편, 및 항체의 유도체에 관련한다. 또한, 본 발명은 이러한 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 이러한 핵산을 포함하는 벡터; 이러한 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 유기체; 및 약학적으로 허용가능한 조성물과 같은, 조성물 및 이러한 단백질, 핵산, 벡터, 및/또는 세포를 포함하는 키트 및 일반적으로 조성물의 제조, 송달, 안정, 또는 기타 특성을 증진하는 활성 성분 또는 비활성 성분일 수 있는 하나 이상의 첨가 성분(예를 들어, 각종 담체)을 제공한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 관련 질병의 치료에 있어서, KIR-매개 생물학적 활성의 조절과 같이, 이러한 항체, 핵산, 벡터, 세포, 유기체, 및/또는 조성물의 각종 신규하고 유용한 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 각각 하나에 결합하지만, KIR2DS4에 결합하지는 않는 인간 또는 인간화 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항체는 또한 KIR2DS3에 결합하지 않는다. 다른 구체예에서, 인간 또는 인간화 항체는 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 최소한 하나의 HLA-C 클래스 I에 대한 결합을 차단한다. 추가적 구체예에서, 항체는 HLA-Cw4 분자의 KIR2DL1에 대한 결합, 및 HLA-Cw3 분자의 KIR2DL2 또는 KIR2DL3 중 최소한 하나에 대한 결합을 차단할 수도 있다. 예를 들어, 항체는 HLA-Cw4 분자의 KIR2DL1(SEQ ID NO:23)의 세포 외 부분의 잔기 M44, F45 및 D72에 대한 결합을 차단할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현하는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화한다.
다른 양태에서, 본 발명은 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 최소한 하나에 대한 결합에서, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체를 제공한다. 한 양태에서, 항체는 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 각각에 대한 결합에서, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO:17의 31-35 잔기에 대응하는 중쇄 CDR1 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:17의 50-65 잔기에 대응하는 중쇄 CDR2 아미노산 서열; 및 (c) SEQ ID NO:17의 99-112 잔기에 대응하는 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체는 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수도 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 아미노산 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88 잔기를 포함하는 KIR2DL1 에피토프에 결합하는 단리된 인간 또는 인간화 항체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약 0.45 nM 이하의 KIR2DL1에 대한 해리 상수(Kd) 및/또는 약 0.025 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 KIR2DL3에 대한 Kd를 갖는 단리된 인간 또는 인간화 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 단독으로 또는 어떠한 적절한 조합으로, 어떤 외부 특성을 갖는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편, 또는 그것의 유도체를 제공한다. 한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 IgGI , IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 예를 들어, 항체는 IgG4 항체일 수도 있다.
또한, 본 발명은 어떤 외부 특성을 갖는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 세포, 및 항-KIR 항체의 발현에 적합한 조건하에서 이러한 세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 항-KIR 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 환자 내 NK 셀 세포 독성을 검출가능하게 하기에 유효한 양으로, 하나 이상으 상기 특성을 갖거나 임의의 방법에 의해 생성된 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 폴리소르베이트 80이나 수크로스, 또는 폴리소르베이트 80 및 수크로스 모두를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 NK 셀 활성을 효력있게 하는 것이 필요한 피험체에 NK 셀 활성을 효력있게 하는 방법을 제공하며, 이 방법은 어떤 상기 조성물의 유효량을 피험체에 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 피험체는 암을 앓는 환자이다. 예를 들어, 환자는 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 다발성 골수종, 및 비 호지킨 림프종으로부터 선택된 암을 앓는 환자일 수도 있다. 대안으로, 환자는 결장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암, 및 악성 흑색종으로부터 선택된 암을 앓는 환자일 수도 있다. 다른 구체예에서, 피험체는 감염성 질환을 앓는 환자이다. 또 다른 구체예에서, 방법은 면역조절제, 호르몬제, 화학요법제, 항-엔지오제네시스 제제, 아폽토시스 제제, 억제성 KIR에 결합하는 2차 항원, 항염제, 표적화제, 및 부가 화합물로부터 선택된 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다.
본 발명에 의해 "제공되는" 항체 또는 본 발명이 "관련" 등, 또한, 포함되는 항체에 대한 설명은 문맥에서 달리 진술되거나 명백히 모순되지 않는다면, 본원에서 설명되는 본 발명의 방법의 실행상 유용할 수도 있는 것으로 해석된다.
본 발명의 이들 및 다른 양태 및 특징들이 본원에서 더욱 상세히 설명된다.
도 1은 각종 사람 KIR2DL 리셉터의 공통 결정인자에 결합하는 뮤린 단일클론 항체 DF200을 묘사한다. (A) 클론 CP11 , KIR2DL1+, DF200. (B) 클론 CP502, KIR2DL3+. (C) 클론 CP11 , KIR2DL1 +, 항-KIR2DL1. (D) 클론 CP502, KIR2DL3+, 항-KIR2DL2/3.
도 2는 Cw4-발현 표적 세포에 대한 NK 셀 세포독성의 KIR2DL1-매개 억제를 중화하는 뮤린 단일클론 항체 DF200을 묘사하며, 이것은 4/1의 작동자/표적(ET) 비율에서 C1R-Cw4 표적 상의 항-KIR mAb을 포함하는 용해의 재구성을 보여준다.
도 3은 Cw4-포지티브 표적 세포에 대한 세포독성의 KIR2DL1-매개 억제, 및 Cw3-포지티브 표적 세포에 대한 NK 셀 세포독성의 KIR2DL2/3-매개 억제를 중화하는, 뮤린 단일클론 항체 DF200, DF200의 Fab 단편, 및 KIR2DL1(mAb Eb6 및 XA-141) 또는 KIR2DL2/3(mAb GL183 및 Y249)에 특이적인 전통적인 뮤린 항체를 묘사한다. (A) 및 (C) KIR2DL1+, 표적 세포 721.221-Cw4+. (B) KIR2DL2+, 표적 세포 721.221 -Cw3+. (D) KIR2DL3+, 표적 세포 721.221-Cw3+.
도 4는 DF200 및 EB6 항체의 F(ab')2 단편의 존재시 HLA-Cw4 포지티브 표적 세포에 대하여 KIR2DL1을 발현시키는 NK 셀에 의한 세포 용해의 재구성을 묘사한다. (A) 표적 세포 721.221-Cw4; E/T 비율 = 1. (B) Cw4를 발현시키는 표적 세포 B-EBV 세포, E/T 비율 = 2.
도 5는 상호반응성 뮤린 (DF200 및 NKVSF1 (Pan2D)) 및 인간 (1-7F9, 1-4F1, 1-6F5 및 1-6F1)mAb, 및 뮤린 전통적 KIR2DL1-특이적 mAb(EB6)에 의한 NK-매개 살해의 유도를 묘사한다. mAb는 HLA-Ce4로 트랜스펙션된 721.221 표적 세포의 KIR2DL1-발현 NK 셀(YTS-KIR2DL1)에 의한 살해를 유도(재구성)한다. E/T 비율 = 1. (A) 30 ㎍/ml mAb. (B) 10 ㎍/ml mAb.
도 6은 도 5와 동일한 항체에 의한 NK-매개 살해의 유도를 묘사한다. mAb는 내인성 HLA-Cw4를 발현시키는 B-EBV 세포의 KIR2DL1-발현 NK 셀(YTS-KIR2DL1)에 의한 살해를 유도(재구성)한다. E/T 비율 = 2. (A) 30 ㎍/ml mAb. (B) 10 ㎍/ml mAb.
도 7은 KIR2DL1에 대한 항-KIR 항체와 함께 표면 플라스몬 공명(BIAcore®) 분석에 의해 얻은 경쟁적 결합 실험의 결과를 보여주는 에피토프 지도를 묘사하며, 여기서 겹쳐진 원형은 KIR2DL1에 대한 결합에 있어서 mAb들 간의 겹침을 나타낸다. 결과는 1-7F9가 KIR2DL1 상에서 EB6 및 1-4F1과 경쟁적이지만, NKVSF1 (Pan2D) 및 DF200과는 경쟁적이지 않음을 보여준다. 항체 1-4F1은 차례로 EB6, DF200, NKVSF1 (Pan2D), 및 1-7F9와 경쟁적이다. 항체 NKVSF1 (Pan2D)은 KIR2DL1 상에서 DF200, 1-4F1, 및 EB6와는 경쟁적이지만, 1-7F9과는 경쟁적이지 않다. DF200은 KIR2DL1 상에서 NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1, 및 EB6와는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않다.
도 8은 KIR2DL3에 대한 항-KIR 항체와 함께 BIAcore® 분석에 의해 얻은 경쟁적 결합 실험의 결과를 보여주는 에피토프 지도를 묘사하며, 여기서 겹쳐진 원형은 KIR2DL3에 대한 결합에 있어서 겹침을 나타낸다. 결과는 1-4F1이 KIR2DL3 상에서 NKVSF1 (Pan2D), DF200, gl183, 및 1-7F9와 경쟁적임을 보여준다. 1-7F9는 KIR2DL3 상에서 DF200, gl183, 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, NKVSF1 (Pan2D)과는 경쟁적이지 않다. NKVSF1 (Pan2D)은 KIR2DL3 상에서 DF200, 1-4F1, 및 GL183과는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않다. DF200은 KIR2DL3 상에서 NKVSF1 (Pan2D), 1-4F1, 및 1-7F9과는 경쟁적이지만, GL183과는 경쟁적이지 않다.
도 9는 KIR2DS1에 대한 항-KIR 항체와 함께 BIAcore? 분석에 의해 얻은 경쟁적 결합 실험의 결과를 보여주는 에피토프 지도를 묘사하며, 여기서 겹쳐진 원형은 KIR2DS1에 대한 결합에 있어서 겹침을 나타낸다. 결과는 1-4F1이 KIR2DS1 상에서 NKVSF1 (Pan2D), DF200, 및 1-7F9와 경쟁적임을 보여준다. 항체 1-7F9는 KIR2DS1 상에서 1-4F1과는 경쟁적이지만, DF200 및 NKVSF1 (Pan2D)과는 경쟁적이지 않다. NKVSF1 (Pan2D)은 KIR2DS1 상에서 DF200, 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않다. DF200은 KIR2DS1 상에서 NKVSF1, 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않다.
도 10은 mAb의 사이노몰거스 NK 셀에 대한 결합을 증명하는 Pan2D(NKVSF1) mAb 적정을 묘사한다. 사이노몰거스 NK 셀(NK 덩어리 16일)을 상이한 양의 NKVSF1(Pan2D) mAb로 인큐베이션 한 다음 PE-콘쥬게이트된 염소 F(ab')2 단편 항체 lgG(H+L) 항체와 함꼐 인큐베이션하였다. 포지티브 세포의 백분율은 아이소타입 대조군(정제된 마우스 lgG1)와 함꼐 결정하였다. 샘플을 두배로 만들었다. 평균 형광 강도 = MFI.
도 11은 가용성 KIR2DL1 및 KIR2DL1 (R131W) 돌연변이체의 세포에 대한 결합을 보여준다. (A) HLA-Cw3 또는 -Cw4를 발현하는 세포에 대한, 가용성 KIR2DL1-Fc, 및 KIR2DL1 (R131W)-hFc 돌연변이체의 결합의 증가 농도. 결합된 KIR-Fc 단백질은 2차 형고아색소-콘쥬게이트된 항체를 사용하여 검출하였으며, 유세포 측정기에 의해 나타냈다. 평균 형광성은 y 축에 나타낸다. (B) 대조군으로서 인간 lg를 사용하 는, 지시된 항-KIR mAb (GL183, EB6, DF200, 및 Pan2D (NKVSF1))의 KIR2DL1-Fc 및 KIR2DL1(R131W) 돌연변이체 단백질에 대한 결합. 도면은 DF200 및 Pan2D(NKVSF1)이 야생형 KIR2DL1-Fc 보다 돌연변이체에 더 적게 결합하며, 이것은 두개의 mAb 모두가 R131W 돌연변이에 의해 영향받음을 나타낸다. 따라서, R131은 KIR2DL1 상의 DF200 및 PAn2D에 대한 에피토프로 이루어진 잔기 중 하나이다.
도 12는 항체 DF200 및 Pan2D(NKVSF1)의 경쇄 가변 영역, 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열의 비교상의 정렬을 제공한다. (A) DF200 (SEQ ID NO:1) 및 Pan-2D (SEQ ID NO:2)의 항-KIR 가변 경쇄(VL) 영역의 정렬. 상기 아미노산 서열의 숫자는 미성숙(비-분비성) 면역글로불린 내 전사 Met(+1)의 개시에 관한 각각의 위치를 나타낸다. (B) CDR-L1 서열의 정렬. 이전(before) 잔기: 보통 Cys. 이후(after) 잔기: Trp. 일반적으로 Trp-Tyr-Leu. 길이:10-17 aa. (C) CDR-L2 서열의 정렬. 이전 잔기: 일반적으로 Ile-Tyr. 길이:7 aa. 출발: CDR-L1의 말단 이후 약 16 aa. 출발: 분비 단백질의 시작으로부터 약 24 aa. (D) CDR-L3 서열의 정렬. 이전 잔기: Cys. 이후 잔기: Phe-Gly-XXX-Gly. 길이:7-11 aa. 출발: CDR-L2의 말단 이후 약 33 aa.
도 13은 항체 DF200의 중쇄 가변 영역, 및 중쇄 CDR을 제공한다. (A) DF-200 VH 영역, 미성숙 단백질, 분비된, 성숙한 VH는 위치 20: 잔기 Q에서 출발한다. VH 영역은 잔기 S로 끝나므로 불변 영역(도시하지 않음)이 계속된다. (B) CDR-H1. 이전 잔기: Cys-XXX-XXX-XXX. 이후 잔기: Trp. 일반적으로 Trp-Val 또는 Trp-Ile. 길이: 10-14 aa. 출발: 분비 단백질의 시작으로부터 약 22-26 aa. (C) CDR-H2. 이전 잔기: Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, 다른 가능한 변화는 제외함. 이후 잔기: Lys 또는 Arg / Leu /또는 Ile 또는 Val 또는 Phe 또는 Thr 또는 Ala / Thr 또는 Ser 또는 Iie 또는 Ala. 길이: 16-20 aa. 출발: CDR-H1의 말단 이후 약 15 aa. (D) CDR-H3. 이전 잔기: Cys-XXX-XXX (일반적으로 Cys-Ala-Arg). 이후 잔기: Trp-Gly-XXX-Gly. 길이: 3-25 aa. 출발: CDR-H2의 말단 이후 약 33.
도 14는 인간 항체 1-7F9의 VH 및 VL 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 묘사한다. (A) HuKIR 1-7F9 성숙 가변 경쇄의 전사 (B) HuKIR 1-7F9 성숙 가변 경쇄의 전사을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (C) HuKIR 1-7F9 성숙 가변 중쇄의 전사 (D) HuKIR 1-7F9 성숙 가변 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
도 15는 단일클론 항체 1-7F9, DF200 (VH 서열: SEQ ID NO:19; VL 서열: SEQ ID NO:21 ), 및 Pan2D (NKVSF1; VH 서열: SEQ ID NO:20; VL 서열: SEQ ID NO:22)의 VH 및 VL 서열의 아미노산 서열을 보여준다. CDR은 상자 모양이다.
도 16은 유세포 측정 데이타를 묘사하며, 이것은 지시한 바와 같이(정제된 항체: 1㎍/ml), 뮤린 항체, Pan2D (NKVSF1) 및 인간 mAb 1-7F9 및 1-4F1의 KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3 또는 KIR2DS4로 트랜스펙션된 세포에 대한 결합을 보여준다. (A) - (R) NKVSF1 (pan2D), 1-7F9, 및 1-4F1 모두가 KIR2DL1, KIR2DL3, K1R2DS1, 및 KIR2DS2에 결합한다. 어느 항체도 KIR2DS3에 결합하지 않는다. NKVSF1는, 1-7F9 또는 1-4F1에는 결합하지 않으나, KIR2DS4에 결합한다.
도 17은 FACS 분석 결과를 묘사한다. (A) 세포 상에서 가용성 KIR-Fc의 HLA-Cw4에 대한 결합의 항체-매개 중화는 유세포 측정(FACS)에 의해 검출되었음. 상호 반응성 mAb DF200, 또는 KIR2DL2/3-특이성 mAb GL183의 다양한 농도로 사전 인큐베이션 한 후, KIR2DL1-mFc의 LCL721.221-Cw4 세포에 대한 결합의 FACS-측정. DF200(GL183은 아님)은 KIR2DL1의 HLA-Cw4에 대한 결합을 감소시킨다. 측정은 억제성 항체의 부재시 KIR2DL1-hFc-결합의 백분율로 구성된다. (B) 다양한 농도의 1-1F4 및 1-7F9로 사전 인큐베이션 한 후, KIR2DL1-mFc의 LCL721.221-Cw4 세포에 대한 결합의 FACS-측정. 측정은 억제성 항체의 부재시 KIR2DL1-mFc-결합의 백분율로 구성된다.
도 18은 51Cr-방출 세포독성 분석의 결과를 묘사한다. (A) LCL 721.221-Cw3 세포는 다양한 E:T 비율에서 YTS 세포(다이아몬드) 및 YTS-2DL1 세포(삼각형)에 의해 효율적으로 살해된다. 이와 반대로, LCL 721.221-Cw4 세포는 YTS 세포(사각형)에 의해 효율적으로 살해될 수 있으나, KIR-제한으로 인하여 YTS-2DL1 세포(x표)에 의해 살해될 수 없다. (B) 항체의 부재시, YTS-2DL1 세포는 LCL-721.221-Cw4 (E:T 비율 12:1)를 살해할 수 없다. 1-7F9는 투여량 의존적 방식에서 YTS-2DL1세포에 의한 LCL 721.221-Cw4 세포의 살해를 유도한다.
도 19는 주형으로서 공통의 KIR 분자('KIR'이라 표지함)의 Cα-원자를 사용하는, 2개의 결정 복합체 구조의 중첩을 묘사한다; KIR2DL1/1-7F9 Fab' 및KIR2DL1/MHC 클래스 I, PDB-코드 1IM9 (Fan et al., Nat. Immunol. 2001;2;452-460). KIR2DL1/1-7F9 Fab'는 회색 선 리본 모양으로 나타내고, KIR2DL1/MHC 클래스 I은 어두운 튜브 모양으로 나타낸다. 1-7F9 Fab'은 '1-7F9'이라 표지하고, MHC 클 래스 I은 'MHC'라 표지한다. MHC와 Fab' 간의 겹침은 중첩으로 나타내고, 이것은 MHC 클래스 I이 KIR2DL1 리셉터에 결합하는 것을 막는 1-7F9 Fab'의 능력을 증명한다. 실시예 11을 참조할 것.
도 20은 KIR2DL1 서열에서 나타낸 바와 같이, KIR2DL1 상에서 1-7F9의 결합 에피토프를 보여준다. 1-7F9로부터 4.0Å 거리 내에 있는 아미노산은 회색 및 검은색 배경으로 강조하고 있다. 검은색 배경으로 강조된 아미노산은 1-7F9에 대한 수소 결합에 관여한다.
정의
편의를 위해, 몇가지 용어가 여기에서 정의된다. 그러나, 본원에서 제공된 정의된 용어들의 목록은 한정적이지는 않다. 다른 용어들은 본 발명의 설명을 통해 정의될 수도 있다.
본 발명의 문맥에서 "활성" NK 셀은 NK 셀이 표적 세포를 용해하거나 다른 세포의 면역 기능을 증대시키는 능력을 갖는 것을 비롯하여 생물학적으로 활성인 NK 셀을 가리킨다. 예를 들어, "활성" NK 셀은 NK 리셉터를 활성화하는 리간드를 발현하는 세포를 죽이고/죽이거나 NK 셀 상에서 KIR에 의해 인지되는 MHC/HLA 항원을 발현하지 못하도록 할 수 있다. NK 셀은 혈액 샘플로부터의 단리, 세포성분 채집술, 조직 또는 세포 수집 등과 같이, 당업계에 공지된 각종 기술에 의해 얻을 수 있다. NK 셀에 관련한 분석용으로 유용한 프로토콜을 Natural Killer Protocol(Campbell KS 및 Colonna M이 편집)에서 발견할 수 있다. Human Press. pp.219-238(2000).
본원에서 사용되는 바와 같이, "킬러 유사 리셉터", "킬러 억제성 리셉터", 또는 "KIR"은 KIR 유전자 패밀리의 멤버인 유전자에 의해 또는 이러한 유전자로부터 제조된 cDNA에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. KIR 유전자 및 KIR 유전자 산물의 명명법, 및 대표적인 KIR에 대한 Genbank 수탁 번호를 비롯하여, KIR 유전자 패밀리의 상세한 리뷰는 "Bookshelf"라 불리는 NBCl 웨사이트(월드와이드웹(WWW) 주소 nbcl.nlm.nih.gov/books을 통해 접근가능)에서 이용가능한, M. Carrington and P. Norman에 의한 "The KIR Gene Cluster"이다. 인간 KIR 유전자 및 cDNA, 및 그들의 단백질 산물의 서열은 GenBank를 비롯한 공공 데이타베이스에서 이용가능하다. 인간 KIR의 비제한적인 전형적 GenBank 진입은 하기 수탁 번호에 따른다: KIR2DL1 : Genbank 수탁 번호 U24076, NM_014218, , AAR16197, 또는 L41267; KIR2DL2: Genbank 수탁 번호 U24075 또는 L76669; KIR2DL3: Genbank 수탁 번호 U24074 또는 L41268; KIR2DL4: Genbank 수탁 번호 X97229; KIR2DS1 : Genbank 수탁 번호 X89892; KIR2DS2: Genbank 수탁 번호 L76667; KIR2DS3: Genbank 수탁 번호 NM_012312 또는 L76670 (스플라이싱 변이체); KIR3DL1 : Genbank 수탁 번호 L41269; 및 KIR2DS4: Genbank 수탁 번호 AAR26325. KIR은 1 내지 3 세포외 도메인을 포함할 수도 있으며, 길거나(즉, 40 아미노산 이상) 또는 짧은(즉, 40 아미노산 미만) 세포질 꼬리를 가질 수도 있다. 본원에서 앞서 설명한 바와 같이, 이들 특징은 KIR의 명명을 결정한다. 전형적인 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, 및 KIR2DS4 분자는 하기 각각의 아미노산 서열을 포함한다:
KIR2DL1 세포외 도메인:
HEGVHRKPSLLAHPGXLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHH DGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQXGPTVL AGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFG SFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH (SEQ ID NO:23),
위치 16에서 "X"는 P 또는 R이고, 위치 114에서 "X"는 P 또는 L이며, 이것은 대립형질 변이체를 나타낸다.
KIR2DL2 세포외 도메인:
HEGVHRKPSLLAHPGRLVKSEETVILQCWSDVRFEHFLLHREGKFKDTLHLIGEHH DGVSKANFS[GPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLD[VITGLYEKPSLSAQPGPTV LAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHECRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCF GSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVIGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLH(SEQ ID NO:24)
KIR2DL3 세포외 도메인:
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVRFQHFLLHREGKFKDTLHLIGEHH DGVSKANFSIGPMMQDLAGTYRCYGSVTHSPYQLSAPSDPLDIVITGLYEKPSLSAQPGPTV LAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRFSAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCF GSFRDSPYEWSNSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSETGNPRHLH(SEQ ID NO:25).
KIR2DS4 세포외 도메인:
QEGVHRKPSFLALPGHLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGKFNNTLHLIGEHH DGVSKANFSIGPMMPVLAGTYRCYGSVPHSPYQLSAPSDPLDMV(SEQ ID NO:38).
용어 "KIR2DL2/3"는 KIR2DL2 및 KIR2DL3 리셉터 중 하나 또는 두가지 모두를 말한다. 이들 2개의 리셉터들은 매우 높은 상동성을 가지며, 그들은 동일한 유전자의 대립 유전자 형태이며, 유사하게 기능하는 것으로 당업계에서 고려된다.
달리 명기하지 않는다면, 용어 "MHC"는 모든 포유동물 내 MHC 분자를 포함하는 반면, "HLA" 분자는 인간 MHC 분자를 나타낸다.
본 발명의 문맥 내에서, 항체가 결정인자에 "결합한다"는 진술(즉, 항체:결정인자 상호작용의 문맥에서 단어 "결합한다")은 항체가 특이성 및/또는 친화도를 갖는 결정인자에 결합함을 의미한다. 예를 들어, GL 183은 KIR2DL2/3에 결합하는 전통적인 단일클론 항체이다. EB6은 KIR2DL1에 결합하는 전통적인 단일클론 항체이다. EB6 및 GL183은 모두 시중구매 가능하다(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA).
"상호-반응" 항-KIR 항체는 하나 이상의 KIR 분자가 특이성 및/또는 친화도를 가지고 결합하는 항체이다. 예를 들어, DF200 및 1-7F9는 KIR2DL1, -2, 및 -3과 상호 반응하는 단일클론 항체이다. 하이브리도마 프로듀싱 항체 DF200은 확인 번호 "DF200", 2004년 6월 10일자로 등록된 등록 번호 CNCM I-3224, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, lnstitut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France 하에 CNCM 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 또한, 본워넹서 "Pan2D"로 칭하는 NKVSF1은 KIR2DL1, -2, 및 -3 및 KIR2DS4와 상호 반응성이다. 이 항체는 Serotec (Cergy Sainte-Christophe, France), 카타로그 번호 MCA2243로부터 시중 구매 가능하다.
"특이적 결합" 또는 "특이성"은 KIR과 같은 항언 상에 존재하는 에피토프에 검출가능하게 결합하지만, 다른 단백질 또는 구조(NK 셀, 또는 기타 세포 유형 상에 존재하는 다른 단백질과 같은 것)와는 상대적으로 거의 검출가능한 반응성을 갖지 않는 항체 또는 다른 항원의 능력을 말한다. 특이성은 본원 곳곳에서 설명된 바와 같이, 예를 들어, Biacore 기구를 사용하여 결합 또는 경쟁정 결합 분석에 의해 상대적으로 결정할 수 있다. 특이성은 예를 들어, 특이적 항원에 대한 결합(이 경우 특이적 항원은 KIR임):다른 무관계한 분자에 대한 결합에 있어서, 예를 들어, 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 또는 그 이상의 친화도/항원항체결합력의 비율로서 나타내어질 수 있다. 인간과 같은 특정 유기체의 NK 셀 상에 존재하는 KIR에 대하여 특이적인, KIR-결합 항체는 종종 다른 종(즉, KIR-결합 항원, 또는 다른 KIR-결합제는 다양한 종의 KIR과 상호작용할 수도 있음)의 유사한 KIR에 대한 결합을 나타낼 수 있다.
"선택성"은 하나 이상의 다른 생물학적 분자, 구조, 세포, 조직 등에 반대되는 특정 영역, 표적, 또는 펩티드에 대한 단백질의 우선적 결합을 말한다. 또한, KIR-결합 항체는 특정 유기체(예를 들어, 영장류와는 반대로 사람에서)에서 생산된 KIR, 및/또는 특정 유형의 KIR(예를 들어, 긴 세포질 꼬리가 있는 KIR)에 대하여 선택적일 수 있으며, 특히 여기서 항체는 특정 유기체, 및/또는 KIR의 특정 부분(특정 에피토프 또는 항원 결정인자 영역과 같은 곳)에서 생산된 KIR의 유형 중 하나 이상과 상호 반응한다. 예를 들어, 선택성은 경쟁적 ELISA 또는 Biacore 분석법에 의해 결정될 수 있다. 선택성을 표시하는 친화도/항원항체 결합력의 차이는 임의의 검출가능한 선호도일 수 있다(예를 들어, 1:1.1 이상의 비율, 또는 1:5 이상 이상의 비율은, 검출가능한 경우, 1:10, 1:100, 1:1000 이상을 비롯하여, 안정적일 것임). 달리 명기하지 않는다면, 본원에서 나타낸 "친화도"에 관한 임의의 정략적 데이타는 2가 (1가와는 반대임)결합의 측정을 말한다.
"에피토프" 또는 "결합 자리"는 항원 결합 펩티드(항체와 같은 것)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 참여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우세 성분이라고도 불림) 및 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같이, 결합에 직접 참여하지 않는 다른 아미노산 잔기(즉, 상기 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 "족문(footprint)" 내에 존재함)를 포함할 수도 있다. 달리 언급하지 않는다면(예를 들어, 어떤 문맥에서 본 발명은 특정 아미노산 잔기에 직접 결합하는 항체에 관한 것임), 본원에서 용어 에피토프는 항-KIR 항체에 특이적으로 결합하는 KIR의 어떤 특정 영역 내 아미노산 결합 자리의 두개의 유형을 포함한다. KIR은 수많은 상이한 에피토프를 포함할 수도 있으며, 이것은 다음을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: (1) 선형 펩티드 항원 결정인자, (2) 성숙 KIR 입체형태에 각각 서로 인접하여 위치하는 하나 이상의 비인접 아미노산으로 이루어진 입체형태상의 항원 결정인자; 및 (3) 탄화수소 기와 같이, KIR에 공유 결합된 분자 구조로 전부 또는 일부 구성되는 전사후 항원 결정인자.
1차 항체가 2차 항체와 동일한 에피토프에 "실질적으로" 또는 "최소한 부분적으로" 결합한다는 문구는 1차 항체에 대한 에피토프 결합 위치는 2차 항체의 에피토프 결합 위치를 구성하는 항원 상 아미노산 잔기의 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 포함함을 의미한다. 또한, 1차 항체가 2차 항체와 동일한 에피토프에 실질적으로 또는 부분적으로 결합한다는 것은 1차 및 2차 항체가 상기 설명한 바와 같은 항원에 대한 결합에 있어서 경쟁함을 의미한다. 따라서, 용어 단일클론 항체 1-7F9 "와 동일한 에피토프 또는 결정인자에 실질적으로 결합한다"는 것은 항체가 1-7F9와 "경쟁함"을 의미한다. 일반적으로, 관심있는 단일클론 항체(예를 들어, DF200, NKVSF1, 1-7F9)"와 동일한 에피토프 또는 결정인자에 실질적으로 결합하는" 항체는 항체가 하나 이상의 KIR 분자, 바람직하게는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3으로 이루어진 군으로부터 선택된 KIR 분자에 결합하기 위해 관심있는 상기 항체와 "경쟁하는" 것을 의미한다. 다른 실시예에서, 관심있는 항체와 KIR2DL1 분자 상의 동일한 에피토프나 결정인자에 실질적으로 결합하는 항체가 KIR2DL1에 결합하기 위해 관심있는 항체와 "경쟁한다". 관심있는 항체와 KIR2DL2/3 상의 동일한 에피토프 또는 결정인자에 실질적으로 결합하는 항체는 KIR2DL2/3에 결합하기 위해 관심있는 항체와 "경쟁한다".
관심있는 항체와 "동일한 에피토프 또는 결정인자에 필수적으로 결합한다"는 것은 항체가 상기 관심있는 항체가 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 KIR 분자, 또는 일부 KIR 분자 및 모든 KIR 분자에 대하여 관심있는 상기 항체와 "경쟁하는" 것을 의미한다. 문구 단일클론 항체 1-7F9"와 동일한 에피토프 또는 결정인자에 필수적으로 결합한다"는 것은 항체가 1-7F9가 특잊거으로 결합하는 최소한 하나, 바람직하게는 일부 및 모든 KIR 분자에 대한 1-7F9와 "경쟁한다"는 것을 의미한다. 예를 들어, 단일 클론 항체 1-7F9 또는 NKVSF1과 동일한 에피토프 또는 결정인자에 필수적으로 결합하는 항체는 KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DS1 및 KIR2DS2에 각각 결합하기 위한 상기 1-7F9 또는 NKVSF1과 "경쟁"할 수 있다.
KIR 분자 및 HLA 분자에 대한 결합을 "차단"하는 항-KIR 항체의 능력은 가용성 또는 세포-표면 결합된 KIR 및 HLA 분자를 사용하는 분석에서, 항체가 투여량 의존성 방식으로 HLA 분자에 대한 KIR 분자의 결합을 검출가능하도록 감소시킬 수 있는 것을 의미하며, 여기서 KIR 분자는 항체의 부재시 HLA 분자에 검출가능하게 결합한다. 항-KIR 항체가 이러한 차단을 할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 전형적인 분석법이 실시예 8에서 제공된다.
"KIR의 억제 활성을 감소시키는", "NK 셀 활성을 촉진시키는", "NK 셀 세포독성을 촉진하는", "NK 셀을 촉진하는", "NK 셀 활성을 강화하는", "NK 셀 세포독성을 강화하는", 또는 "NK 셀을 강화하는" 항-KIR 항체의 능력은 항체와 접촉하는 경우, KIR을 발현시키는 NK 셀이 상기 KIR에 대한 리간드인 특정 MHC 또는 HLA 클래스 I을 그것들의 표면에 발현시키는 표적 세포를 용해할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 용어 "NK 셀독성의 강화"는 NK 셀독성에 있어서 어떤 실질적인 강화, 또는 최소한 5%, 10%, 20%, 30% 이상의 강화, 예를 들어, NK 셀독성의 최소한 약 50% 강화(대조군과 비교하여 예를 들어, 최소한 약 60%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%)를 의미한다. 이것은 대조군과 비교하여, NK 셀 세포독성의 예를 들어, 약 55-100%, 약 65-100%, 약 75-100%, 약 80-100%, 또는 약 90-100% 강화를 포함한다. 또한, 그것은 세포독성의 약 100% 이상, 약 500% 이상, 약 1000% 이상, 약 2000% 이상의 증가를 포함한다. 이것 은 예를 들어, 표준 세포독성 분석과 같은 분석법에서 측정될 수 있으며, 이때 표적 세포의 높은 백분율에 이르는 많은 수가 강화제의 부재시(즉, 대조군) 보다 NK 강화제(항-KIR mAb와 같은 것)의 존재시 NK 셀에 의해 용해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화한다" 또는 "KIR의 억제 활성을 중화한다"는 특이적 용해를 전통적인 크롬-방출 테스트에 의해 측정되는 바와 같이, 그들의 KIR에 의해 차단되지 않는 NK 셀 또는 NK 셀라인이 있는 동일한 작동자:표적 세포 비율에서 얻어진 약 20% 이상, 바람직하게는 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 최소한 약 50%, 최소한 약 100% 이상의 특이적 용해로 증가시키는 능력을 의미한다. 또한, "KIR 매개 억제를 중화한다"는 것은 크롬 방출 분석법, 또는 NK 셀 클론 또는 1개 개 또는 몇개의 억제성 KIR을 발현시키는 형질전환체 및 NK 셀 상의 KIR 중 하나에 의해 인지되는 최소한 하나의 HLA 클래스 I 대립 유전자를 발현시키는 표적 세포를 사용하는, 기타 세포독성 분석법에서, 항체와 함께 얻은 특이적 용해는 약 100%, 바람직하게는 약 101%, 최소한 약 150%, 최소한 약 200% 이상(예를 들어, 약 101-150%, 약 120-150%, 약 120-200%, 약 150-200%, 또는 약 200-1000%)이거나, 또는 동일한 작동자:표적 세포 비율에서, 동일한 NK 셀 및 표적 세포를 사용하는, 동일한 농도의 NKVSF1(Serotec 사로부터 구매가능)와 함께 얻은 특이적 용해 이상이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열과 동일하거나, 필수적으로 동일하거나, 또는 이로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 인간 항체는 인간 생식세포 계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 위치 특이적 돌연변이생성에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같인 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유도된 CDR 서열이 인간 틀구조 서열 상으로 이식되는 항체를 포함하지는 않도록 의도된다.
본 발명의 문맥에서, 달리 언급하지 않는다면, "치료" 또는 "치료하는 것"은 문맥에서 부정하지 않는 한, 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 임상적 관련 징후를 예방, 완화, 관리, 치료 또는 감소시키는 것을 말한다. 예를 들어, 질병 또는 질환의 증상 또는 임상적 관련 징후가 확인되지 않은 환자의 "치료"는 예방적 요법인 반면, 질병 또는 질환의 증상 또는 임상적 관련 징후가 확인된 환자의 "치료"는 일반적으로 예방적 요법을 구성하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 각종 요법 및 예방법 그리고 본 발명의 사용 양태는 피험체에 송달될 많은 고려사항들(예를 들어, 피험체에 송달될 화합물(들)의 투여량, 적용의 시기, 적용을 위한 자극 등) 중 하나와 구별되며 각각 본 발명의 독특한 양태로 고려될 수도 있다.
본 발명의 문맥에서 "암"은 육종, 암종, 흑색종, 백혈병, 및 림프종과 같은 세포 질환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 어떤 종양 질환을 말하며, 이것은 유방암, 두경부암, 난소암, 방광암, 폐암, 인두암, 후두암, 식도암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 결장암, 여성 생식관암, 남성 생식솬암, 전립선암, 신장암 및 중추신경계 암을 포함할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "생물학적 샘플"은 체액(예를 들어, 혈 청, 림프액, 및 혈액), 인간 또는 인간이 아닌 포유동물로부터 얻은 세포 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 골수 또는 종양 조직)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
2개의 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 서열이, 디폴트 갭 중량을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT와 같이, 선택적으로 정렬되는 경우, 최소한 약 50, 최소한 약 60, 최소한 약 70, 최소한 약 80, 최소한 약 90, 최소한 약 95, 최소한 약 98, 또는 최소한 약 99% 서열 동일성을 공유한다. 한 구체예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환과 상이하다(본원의 다른 부분에서 더 설명됨). 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 각종 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 비롯한 기타의 변형을 원인으로 한 유사성의 측정으로 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 GCG 소프트웨어는 디폴트 매개변수를 사용하여 상이한 종의 유기체로부터 상동성 폴리펩티드와 같이, 밀접히 관련된 폴리펩티드들 간, 또는 야생형 단백질 및 그것의 뮤테인 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정할 수 있는 "Gap" 및 "BestFit"과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조할 것. 또한, 폴리펩티드 서열은 디폴트 또는 권장된 매개변수를 적용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 의문 및 조사 서열 간 최고의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성%를 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods MoI. Biol. 2000;132:185-219). 서열을 각종 유 기체로부터의 수많은 서열을 함유하는 데이타 베이스와 비교하는 경우 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 디폴트 매개변수를 사용하는 blastp이다. 예를 들어, 각각 본원에서 참고로 인용되는 다음 문헌들을 참조할 것: Altschul et al., J. MoI. Biol. 1990;215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997). 2개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서 "대응" 아미노산 위치는 디폴트 매개변수를 이용하는 본원에서 언급한 어떤 단백질 분석 소프트웨어에 의해 정렬된 것들이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "1-7F9-유사" 또는 "1-4F1-유사" 항체는 (1)1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및/또는 (2) 각각 1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및 VL 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체를 의미한다.
"보존적" 아미노산 치환은 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 있는 측쇄("R-기")를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능상의 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 아미노산 서열이 보존적 치환과 서로 다른 경우, 서열 동일성%는 상향 조절되어 치환의 보존적 특성에 대하여 수정할 수도 있다. 이 조절을 이루는 수단은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, Pearson, Methods MoI. Biol. 1994;243:307-31을 참조할 것. 유사한 화학적 특성이 있는 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 방향족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 전형적인 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민을 포함한다.
발명의 설명
본 발명은 억제성 KIR에 결합하는 신규한 상호반응성 및 중화 항체의 생성을 기초로 하며, 상기 항체는 인간 개체군의 대부분 또는 모든 개체에서 NK 셀의 유효한 활성을 허용한다.
예를 들어, 본원에서 모든 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3에 결합하는 항체 및 이들 KIR과 HLA-C 같의 상호작용을 차단함으로써 NK-셀 용해 활성을 강화하는 항체가 설명된다. 이러한 항체는 본원에서 "상호반응성 및 중화 항-KIR mAb"라 부른다.
특정 양태에서, 본 발명은 신규한 상호반응성이거나 중화성인, 또는 상호반응성이며 중화성인, 완전한 인간 항-KIR 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 조성물 및 이러한 항체 또는 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 항체는 본원에서 전체가 참고로 인용되는, 2004년 7월 1일자로 출원된 PCT/DK2004/00470에서 설명된 인간 항체 1-7F9 및 1-4F1을 포함한다.
본원에서 설명된 항체, 조성물, 및 방법은 그중에서도, KIR의 치료적 조절, 및 치료적 NK 셀 활성과 관련된 현재의 한계를 극복할 수도 있으며, 추가적인 이로 운 특징 및 이점을 제공한다. 예를 들어, 항체는 여러개의 억제성 KIR과 상호작용할 수 있으며 그들의 억제성 신호를 감소 또는 중화시킬 수 있어서, 이러한 억제성 KIR 리셉터를 발현시키는 NK 셀에 의한 NK 셀 세포독성의 강화를 야기한다. 여러개의 KIR 유전자 산물과 상호작용하는 능력은 본 발명의 항체가 피험체의 KIR 또는 HLA 유형을 사전 결정하는 부담 또는 비용을 들이지 않으면서, 대부분 또는 모든 인간 피험체에서 NK 셀 활성을 증가시키는데 효과적으로 사용되도록 할 수 있다. 한 구체예에서, 항체가 KIR2DS4에 결합하지 않음으로 해서, 활성 KIR2DS4 리셉터의 중화와 연관될 잠재적 자극이 감소하지 않는다. 추가적으로 또는 대안으로, 항체는 KIR2DS3에 결합하지 않는다.
또한, 이러한 항체로부터, 각종 항체 단편 및 유도체들이 생성될 수 있으며 문맥상 달리 언급하거나 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명의 항체와 관련하여 본원에서 설명한 바와 동일 또는 유사한 목적, 및 항체 단편 및 유도체와 동일하게 적용되는 항체와 관련하여 설명된 본 발명의 양태를 위해 사용될 수 있다. 즉, 항체와 관련하여 본원에서 설명된 본 발명의 특징은 달리 나타내지 않는다면, 또한, 특이성에 관하여 유사한 기능성을 갖는 항체 단편 또는 유도체에 관련한 유사한 특징을 기술하는 것으로 함축적으로 해석될 것이다. 그러나, "총길이" 항체 및 항체 "단편"은 그들의 생물학적 및 물리화학적 특성이 현저히 다르지 않는 한, 본 발명의 명백한 양태로서 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 어떤 항체는 "인간"으로서 특징을 가질 수 있으며, 이것은 일반적으로 그들이 투여되는 인간 피험체에 의한 항체에 대한 면역 반응의 낮은 위험과 관련된다. 한 전형적인 양태에서, 사실상 모든 인간에서 인간 NK 셀의 활성화를 촉진하는 단리 항체가 설명된다. 전형적인 구체예에서, 항체는 인간 항체 1-7F9 또는 인간 1-7F9-유사 항체이다.
항체, 그들의 단편, 또는 유도체는 NK 셀의 표면에서 최소한 2개의 억제성 KIR 리셉터와 상호작용하고, NK 셀의 억제성 신호를 감소 또는 중화시키며, NK 셀의 활성을 강화시킬 수 있다. 예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 유도체는 인간 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 리셉터의 공통의 결정인자에 결합할 수도 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 유도체는 최소한 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 리셉터에 결합한다. 본 발명의 목적에 대하여, 용어 "KIR2DL2/3"은 KIR2DL2 및 KIR2DL3 리셉터 중 하나 또는 두가지 모두를 말한다.
본원에서 설명되는 바와 같이, 항-KIR mAb 1-7F9 및 1-4F1은 앞서 생산된 항-KIR 항체 이상의 몇가지 이점을 갖는다. 예를 들어, 1-7F9 및 1-4F1은 완전히 인간이며, 따라서 일단 피험체에 투여된 항체에 대한 어떤 면역 반응을 감소 또는 최소화한다. 이에 더하여, 1-7F9 및 1-4F1 모두는 하기 설명한 바와 같이, 치료적 항-KIR 항체(각각 IgG4 및 IgG2)에 대한 적당한 이소타입이다. 또한, 1-7F9는 뮤린 mAb EB6, GL182\3, DF200, 및 NKVSF1(Pan2D) 보다는 KIR2DL1, -2, 및/또는 -3을 발현하는 NK 셀에 의한 사멸을 유도하는데 더욱 더 효과적이다. 예를 들어, 도 5 및 6에서 나타낸 바와 같이, 1-7F9는 EB6, DF200 또는 NKVSF1(Pan2D) 보다 HLA-Cw4를 발현시킨 표적 세포의 KIR2DL1-발현 NK 셀에 의한 특이적 용해의 더 높은 수준을 야기하였다. 1-7F9는 추가적으로 이미 공지된 항-KIR mAb와 비교하여 KIR에 대한 높은 친화도를 갖는다. 예를 들어, 1-7F9는 각각 0.43 nM 및 0.025 nM 각각의 해리 상수(Kd's)를 갖는 KIR2DL1 및 KIR2DL3에 결합하여, 예를 들어, DF200 보다 두개의 항원에 대하여 더 높은 친화도를 나타낸다(실시예 3 및 8 참조). 뮤린 항체 NKVSF1(Pan2D), A210, 및 A208g과는 반대로, 1-7F9 및 1-4F1 중 어느 것도 KIR2DS4에 결합하지 않아서, 그들이 치료 목적에 보다 적합하도록 한다. NKVSF1(Pan2D) 및 DF200과 유사하게, 1-7F9 및 1-4F1 또한 KIR2DS1 및 KIR2DS2에 결합하지만, KIR2DS1 및 KIR2DS1은 항-백혈병 효능에 있어서 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 항체는 1-7F9 및/또는 1-4F1와 동일하거나 유사한 항원-특이성을 갖는다. 예를 들어, 1-7F9와 동일하거나 유사한 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체는 1-7F9와 동일하거나 유사한 항원-결합 및/또는 NK-자극 특성을 가질 수 있으며; 1-4F1과 동일하거나 유사한 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체는 1-4F1과 동일하거나 유사한 항원-결합 특성을 가질 수 있다.
도 14에서 나타낸 바와 같이, 1-7F9의 VL 및 VH 영역의 아미노산 서열을 결정하였다:
1-7F9 VL 영역(SEQ ID NO:15):
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT
1-7F9 VH 영역 (SEQ ID NO:17):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIF GAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARiPSGSYYYDYDMDVWGQ GTTVTVSS
1-4F1 VL 및 VH 영역은 각각 SEQ ID NOS: 39 및 41에서 제공되며, 1-4F1 VL 및 VH 영역은 각각 SEQ ID NOS:40 및 42에서 제공된다. 특정 구체예에서, SEQ ID NO:39의 3, 4, 9, 24, 32, 41 , 47, 50, 55, 71, 및 74 잔기는 각각 Q, L, S, R, A, G, L, D, E, F, 및 A이다. 다른 특정한 구체예에서, SEQ ID NO:39의 3, 4, 9, 24, 32, 41 , 47, 50, 55, 71, 및 74 잔기는 각각 R, M, F, W, Y, A, F, Y, Q, Y, 및 T이다.
도 15에서 나타낸 바와 같이, 1-7F9 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같이 확인되었다: 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 24-34 잔기에 해당함; 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 50-56 잔기에 해당함; 경쇄 GDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 89-97 잔기에 해당함; 중쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 31-35 잔기에 해당함; 중쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 50-65 잔기에 해당함; 및 중쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 99-112 잔기에 해당함. 1-4F1 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같이 확인되었다: 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 24-34 잔기에 해당함; 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 50-56 잔기에 해당함; 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 89-97 잔기에 해당함; 중쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41의 31-35 잔기에 해당함; 중쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41의 50-66 잔기에 해당함; 및 중쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41의 99-113 잔기에 해당함.
전체 1-7F9 경쇄 및 중쇄에 대한 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOS :36 및 37에서 제공된다.
따라서, 예를 들어, 각종 인간 항체 서브클래스; 항체 단편, 항체 유도체, 및 기타 KIR-결합 펩티드의 추가적 항체들은 이러한 정보를 기초로 하여, 예컨대 재조합 기술에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 각각 필수적으로 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:17로 이루어진 VL 및 VH 서열을 갖는 항체, 및/또는 각각 필수적으로 SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:41로 이루어진 VL 및 VH 서열을 갖는 항체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 필수적으로 상기 설명된 1-7F9 또는 1-4F1 VH CDR1-3 및 VL CDR1-3으로 이루어진 CDR 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다음과 같은 CDR 영역을 포함하는 항체를 제공한다: 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 약 24-34 잔기에 해당함; 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 약 50-56 잔기에 해당함; 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15의 약 89-97 잔기에 해당함; 중쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 약 31-35 잔기에 해당함; 중쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 약 50-65 잔기에 해당함; 그리고 중쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17의 약 99-112 잔기에 해당함. 다른 양태에서, 본 발명은 다음과 같은 CDR 영역을 포함하는 항체를 제공한다: 경쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 약 24-34 잔기에 해당함; 경쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 약 50-56 잔기에 해당함; 경쇄 CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO:39의 약 89-97 잔기에 해당함; 중쇄 CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41의 약 31-35 잔기에 해당함; 중쇄 CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41의 약 50-66 잔기에 해당함; 그리고 중쇄 CDR3 아미노산 서 열은 SEQ ID NO:41의 약 99-113 잔기에 해당함. 다른 양태에서, 본 발명은 필수적으로 SEQ ID NO:15의 24-34 잔기로 이루어진 경쇄 CDR1 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:15의 50-56 잔기로 이루어진 경쇄 CDR2 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:15의 89-97 잔기로 이루어진 경쇄 CDR3 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:17의 31-35 잔기로 이루어진 중쇄 CDR1 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:17의 50-65 잔기로 이루어진 중쇄 CDR2 아미노산 서열; 및 필수적으로 SEQ ID NO:17의 99-112 잔기로 이루어진 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다음과 같은 CDR 영역을 포함하는 항체를 제공한다: 필수적으로 SEQ ID NO:39의 24-34 잔기로 이루어진 경쇄 CDR1 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:39의 50-56 잔기로 이루어진 경쇄 CDR2 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:39의 89-97 잔기로 이루어진 경쇄 CDR3 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:41의 31-35 잔기로 이루어진 중쇄 CDR1 아미노산 서열; 필수적으로 SEQ ID NO:41의 50-66 잔기로 이루어진 중쇄 CDR2 아미노산 서열; 및 필수적으로 SEQ ID NO:41의 99-113 잔기로 이루어진 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
또한, 본 발명은 항-KIR 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체, 또는 1-7F9 또는 1-4F1 VH 또는 VL 서열이나, 그 것의 CDR-영역과 실질적으로 동일한 최소한 하나의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 KIR-결합 폴리펩티드를 포함한다. 변이체 아미노산 서열은 1-7F9 또는 1-4F1 CDR, VH, 또는 VL 영역과 최소한 약 50, 80, 90, 95, 98, 또는 99(예를 들어, 약 50-99, 약 65-99, 약 75-99, 또는 약 85-99)% 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 변이체 아미노산 서열은 이에 더하여 또는 대안으로 1-7F9 또는 1-4F1 CDR과 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 1, 2, 또는 3 CDR을 포함할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39의 24-34 잔기와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열; SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39의 50-56 잔기와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열; SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39의 89-97 잔기와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열; SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:41의 잔기 31-35와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열; SEQ ID NO:17의 50-65 잔기 또는 SEQ ID NO:41의 50 내지 66 잔기와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열; 및 SEQ ID NO:17의 99-112 잔기 또는 SEQ ID NO:41의 99 내지 113 잔기와 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95% 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체를 제공한다. 이러한 변이체 아미노산 서열에 보유되어 있는 1-7F9- 또는 1-4F1-유도성 KIR-결합 아미노산 서열의 기본적 특성은 바람직하게는 하나 이상의 KIR에 대한 1-7F9 또는 1-4F1 서열의 특이성 및/또는 항원항체 결합력을 포함하며, 이에 더하여서 또는 대안으로 KIR/HLA-C 상호작용을 차단하고 NK 셀의 용해 활성을 강화하는 1-7F9의 능력을 포함할 수도 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항-KIR 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체, 또는 하나 이상의 잔기 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해서 하나 이상의 잔기(예를 들어, 최소한 2, 3, 5, 최소한 약 10, 최소한 약 15, 최소한 약 20, 최소한 약 25, 최소한 약 30, 최소한 약 35, 최소한 약 40, 최소한 약 50 이상의 아미노산 잔기) 내 1-7F9 또는 1-4F1 KIR-결합 서열이 상이한 KIR-결합 아미노산 서열을 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 변이체 KIR-결합 서열은 더 높은 친화도; 더 높거나 상이한 특이성; 더 낮은 면역원성(서열에 대한 숙주 반응의 면에서); 더 높은 생체 내 안정성; 및/또는 본래의 1-7F9 또는 1-4Fa 서열을 포함하는 필수적으로 동일한 아미노산 서열 이상의 변이체 서열에 대한 다른 이로운 특성을 수여한다. 적당한 서열 변화는 본원의 다른 곳에서 더 설명된다. 항-KIR 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체, 또는 KIR-결합 폴리펩티드의 KIR-결합 부분은 또한 KIR 결합을 촉진하고/촉진하거나 다른 이로운 물리화학적 또는 면역학적 특성을 제공하는, 비아미노산 유기 부분과 같은 어떤 적당한 수의 비-아미노산 성분 또는 치환기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 항체는 이에 더하여서 또는 대안으로 하나 이상의 KIR에 대한 그들의 결합 친화도를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 실시예 3 및 8에서 나타낸 바와 같이, 2가 결합의 면에서, DF200은 약 11 nM의 KIR2DL1에 대한 Kd, 및 약 2.0 nM의 KIR2DL3에 대한 Kd를 가지며, 1-7F9는 약 0.43 nM의 KIR2DL1에 대한 Kd, 및 약 0.025 nM의 KIR2DL3에 대한 Kd를 갖는다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 약 20 nM 이하, 약 11nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 또는 약 0.43 nM 이하의 KIR2DL1에 대한 2가 결합에서 Kd를 갖는 인간 또는 비-인간(예를 들 어, 뮤린, 키메라, 또는 인간화) 항체를 제공한다. 추가적으로 또는 대안으로, 본 발명의 인간 또는 비-인간(예를 들어, 뮤린, 키메라, 또는 인간화) 항체는 약 20 nM 이하, 약 2 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 또는 약 0.05 nM 이하, 또는 약 0.025 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 Kd를 가질 수도 있다. 특정 양태에서, 항체는 1-7F9와 마찬가지로 KIR2DL1 및 KIR2DL3에 대한 2가 결합에 대한 거의 동일한 Kd 값을 갖는다. 실시예 13에서 나타낸 바와 같이, 1가 결합의 면에서, 1-7F9 및 1-4F1은 각각 약 3.5 및 7 nM의 KIR2DL3에 대한 Kd 값을 갖는다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 7 nM 이하, 또는 약 3.5 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 1가 결합에서 Kd를 갖는 인간 또는 비-인간(예를 들어, 뮤린, 키메라, 또는 인간화) 항체를 제공한다.
항-KIR 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체, 또는 KIR-결합 폴리펩티드는 선택적으로 및/또는 특이적으로(일반적으로 특이적으로) 최소한 하나의 KIR, 및 더 두드러지게는 적절한 조건하에(예를 들어, 일반적으로 정상 또는 NK 셀 관련 질병 상태에 있어서, 및 상기 서열 또는 조합을 포함하는 적절한 단백질의 문맥에서 인간 생리학적 상태를 반영하는 온도, pH 등에 관하여), 최소한 하나의 KIR의 항원 결정인자 영역 또는 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 (그 중에서도 특히) 1-7F9, 1-4F1 또는 1-7F9- 또는 1-4F1-유사 항체와 경쟁하는 능력을 특징으로 할 수 있는 항체, 및 상기의 것들을 포함하는 각종 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 항체들(및/또는 본원에서 설명된 본 발명의 방법의 실행에서 유용한 것)은 이에 더하여서 또는 대안으로 하나 이상의 항체 DF200, 항체 NKVSF1, 항체 EB6, 및 항체 GL183과 경쟁하는 능력을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상호반응성 및 중화 항-KIR 항체, 항체 단편, 또는 유도체는 최소한 2개의 억제성 KIR 수용체에 대한 MHC 및/또는 HLA 분자의 결합을 특이적으로 억제하고, NK 셀 활성을 촉진함으로써 KIR의 억제 활성을 감소 또는 중화시키는데, 이것은 이러한 항체, 단편 또는 유도체가 NK 셀이 그들의 표면 상에서 억제성 KIR 리셉터를 발현하도록 허용하여 그 특정 억제성 KIR 리셉터(예를 들어, 특정한 HLA 리간드)에 대한 대응 HLA 리간드를 발현하는 세포를 용해할 수 있음을 의미한다. 한 양태에서, 본 발명은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 리셉터에 대한 HLA-C 분자의 결합을 특이적으로 억제하는 항체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 HLA-C에 대한 KIR2DL1 및/또는 KIR2DL2/3의 결합을 억제하는 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 생체 내, 및/또는 시험관 내 NK 셀 활성을 촉진하는 항체를 제공한다.
최소한 하나의 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 중 최소한 하나는 최소한 약 90% 이상의 인간 개체군에 존배하며, 본 발명의 더욱 바람직한 항체는 이들 KIR 중 하나 또는 두개 모두를 발현시키는 NK 셀의 활성을 강화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 대부분의 인간 개체에서, 일반적으로는 약 90% 이상의 인간 개체에서 NK 셀을 효과적으로 활성화하거나 강화하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단일 항체 조성물은 대부분의 인간 피험체를 치료하는데 사용될 수도 있으며, KIR- 또는 HLA-대립 기를 결정하거나 2개 이상의 항-KIR mAb의 혼합물 또는 칵테일 을 사용하는데 거의 필요하지 않다.
한 양태에서, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 인간 리셉터 모두에 특이적으로 결합하며 이들 KIR에 의해 매개되는 NK 셀 세포독성의 억제를 역전시킨다. 도한 항체는 인간일 수도 있으며 단일클론 항체 1-7F9 및/또는 1-4F1과 경쟁할 수도 있다. 특정 쌍의 항체(예를 들어, DF200, NKVSF1 (Pan2D), 1-7F9, EB6, 및 GL183으로부터 선택된 하나 이상의 항체)에 관하여 언급하는 경우 용어 "경쟁하다"는 1차 항체가 재조합 KIR 분자 또는 세포 표면 발현된 KIR 분자를 사용하는 결합 분석법에서 2차 항체(또는 다른 분자)와 검출가능하게 경쟁하는 것을 의미한다. 예를 들어, 한 양태에서, 어떤 항체 쌍에 대한 억제%가 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상인 경우, 항체가 1차 항체로서 사용되는지에 관계없이, 항체는 경쟁한다. 대안으로, 어떤 항체 쌍에 대한 억제%가 최소한 약 29%, 최소한 약 30%, 최소한 약 40%, 또는 최소한 약 50%의 평균에 달하는 경우, 항체는 경쟁한다. 1차 항체에 의한 KIR2D 단백질에 결합하는 2차 항체의 억제%를 다음과 같이 계산할 수 있다: 100*(1-(검출된 결합 2차 항체)/(검출된 1차 항체의 결합)). 위 식을 항체 단편 및 항체 유도체에 적용한다. 달리 명기하지 않는다면, 1-7F9, 1-4F1 또는 1-7F9- 또는 1-4F1-유사 항체와 "경쟁"하는 항체는 인간 KIR2DL1, 또는 인간 KIR2DL2/3, 또는 인간 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 모두에 결합하기 위해 1-7F9, 1-4F1 또는 1-7F9- 또는 1-4F1-유사 항체와 경쟁할 수도 있다. 예를 들어, 항체 DF200은 KIR2DL3에 결합하기 위해 1-7F9 및 1-4F1과 경쟁한다.
선택적으로, 1-7F9 또는 1-4F1과 경쟁하는 항체는 각각 1-7F9 또는 1-4F1 그 들 자신이 아니다(즉, 본 발명은 그중에서도 특히, 이들 KIR 중 하나 또는 이들 모두에 결합함에 있어서 1-7F9 및/또는 1-4F1과 경쟁하는 능력을 특징으로 하는 1-7F9 및 1-4F1을 제외한 항체를 제공함).
다른 양태에서, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 인간 리셉터 모두에 결합하고, 이들 KIR에 의해 매개되는 NK 셀 세포독성의 억제를 감소 또는 중화시키거나 역전시키며, KIR2dL1 인간 리셉터, 또는 KIR2DL2/3 인간 리셉터, 또는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 모두에 결합하기 위해 1-7F9와 경쟁한다. 선택적으로, 상기 항체는 키메라, 인간, 또는 인간화 항체이다.
다른 양태에서, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 인간 리셉터 모두에 결합하고, 이들 KIR에 의해 매개되는 NK 셀 세포독성의 억제를 감소, 중화 또는 역전시키며, KIR2DL1 인간 리셉터에 대한 결합을 위해 EB6와 경쟁하거나, 또는 KIR2DL2/3 인간 리셉터에 대한 결합을 위해 GL183 및/또는 DF200과 경쟁한다; 또는 항체는 KIR2DL1 인간 리셉터에 대한 결합을 위해 EB6 및 KIR2DL2/3 인간 리셉터에 대한 결합으 ㄹ위하 GL183 및/또는 DF200과 경쟁한다. 한 구체예에서, 항체는 NKVSF1 (Pan2D), A210, A803g, 및/또는 DF200이 아니다. 항체는 예를 들어, 뮤린, 키메라, 인간, 또는 인간화 항체일 수 있다.
다른 양태에서, 항체는 1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및/또는 VL 영역과 최소한 실질적으로 동일한 VH, VL, 또는 VH 및 VL 영역을 포함한다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 비롯하여 어떤 서브클래스일 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 인간 IgG4 항체이다. 다른 특정 양태에서, 항체는 인간 IgG2 항체이다. 항체는 키메 라, 인간, 또는 인간화 항체일 수 있다.
다른 양태에서, 항체는 인간이며, 1-7F9 또는 1-4F1과 경쟁하고, 인지하고, 결합하거나, 또는 단일 클론 항체 1-7F9 또는 1-4F1과 같이 KIR 분자상의 최소한 일부 동일하거나, 또는 동일한 에피토프 또는 "에피토프 위치"에 대하여 면역특이성을 갖는다.
다른 양태에서, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 인간 리셉터 모두에 존재하는 공통의 결정인자에 결합하고 이들 KIR에 의해 매개되는 NK 셀 세포독성의 억제를 감소, 중화 또는 역전시킨다. 항체는 단일 클론 항체 1-7F9와 같이 KIR 상의 최소한 일부 동일한, 실질적으로 동일한, 또는 동일한 에피토프에서 더욱 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 양태에서, 항체는 상기 설명한 특성의 하나 이상을 보이는 단일클론 항체이다.
다른 양태에서, 본원에서 설명된 항체의 기능상 단편 및 유도체가 제조될 수 있으며, 이것은 실질적으로 유사한 항원 결합, 특이성 및/또는 활성을 가지며, Fab 단편, Fab'2 단편, 면역부착소, 디어바디, 카멜화 항체, 자누신(Janusin), 미니바디, CDR, 및 ScFv 단편을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
달리 명기하지 않는다면, 항체 또는 그것의 2가 단편 또는 유도체는 단일 특이성이 있으며, 즉, 항체, 단편, 또는 유도체의 "팔"이 동일한 항원(들)에 결합한다.
또 다른 양태에서, 독소, 방사성 핵종, 검출가능 부분(예를 들어, 플루오르 ), 또는 고형 지지체에 콘쥬게이션 되거나 공유 결합된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체가 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 항체, 그것의 단편, 또는 그것들의 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 약제의 제조 방법에서 본원에서 개시된 바와 같은 항체의 사용에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 약제 또는 약학적 조성물은 암 또는 기타 증식성 질환, 감염의 치료를 위해, 또는 이식에서의 사용을 위한 것이다.
한 양태에서, 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하고 상기 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 중 최소한 하나에서 NK 셀 발현에 의해 KIR-매개 억제 세포독성을 중화할 수 있는 항체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 투여를 위해 제조된 조성물, 이러한 조성물을 제조하기 위한 키트, 분석 키트 또는 배지, 정제 배지 등)에 관한 것이며, 여기서 항체는 리포좀으로 통합된다. 또한, 리포솜은 예를 들어, 유전자 요법을 위한 유전자의 송달용 핵산 분자; NK 셀에서 유전자를 억제하기 위한 안티센스 RNA, RNAi, 또는 siRNA의 송달용 핵산 분자; 또는 NK 셀의 표적화 사멸용 독소 또는 약물과 같은 추가 물질을 포함할 수도 있다.
또한, 시험관 내, 생체외, 또는 생체 내 인간 NK 셀 활성을 조절하는 방법이 본원에서 설명되며, 상기 방법은 인간 NK 셀과 유효량의 본 발명의 항체, 이러한 항체의 단편, 그것들의 유도체, 또는 상기의 것들 중 최소한 하나를 포함하는 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 방법은 본 발명의 약학적 조성 물의 유효량의 투여를 포함하며 암, 감염성 질병, 또는 면역 질병을 갖는 피험체에서, 가장 바람직하게는 생체 외 또는 생체 내, 인간 NK 셀의 세포 독성 활성을 증가로 향하게 한다. 예를 들어, 투여는 암 또는 감염성 질병(예를 들어, 바이러스 질병)에 걸린 환자에 적당한 버퍼 내 항체를 정맥 주사함으로써 효과적일 수 있다.
또한, 본 발명은 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하는 항체를 포함하는 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 제공하며, 이때 항체는 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 중 최소한 하나를 발현하는 NK 셀 중 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있으며, 항체는 환자 또는 NK 셀을 포함하는 생물학적 샘플 내에 NK 셀 세포독성을 검출가능하게 강화하기에 유효한 양으로 존재한다. 바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통의 결정인자에 결합한다. 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 선택적으로 2차 치료제(항체가 투여되는 상태 또는 질환과 관련한 숙주 내 치료적 효과를 유도, 증진, 및/또는 향상시키는 약제 - 예를 들어, 암, 이식, 감염성 질병, 바이러스 감염 등과 관련된 상태)를 추가로 포함할 수도 있다. 한 양태에서, 이러한 조합으로 본 발명의 항체와 공동 투여될 수 있는 2차 치료제는 예를 들어, 면역조절제, 호르몬제, 화학요법제, 항-엔지오제네시스 제제, 아폽토시스 제제, 비-KIR 항원에 특이적인 2차 항체, 선택적으로 억제성 KIR에 결합하고 억제 및 중화하거나, 억제성 KIR로부터의 신호를 감소시키는 2차 항체. 항-감염성 제제, 표적화제, 또는 부가 화합물로부터 선택될 수도 있다. 이로운 면역조절제는 IL-1알파, IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL- 13, IL-15, IL-21 , TGF-베타, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-알파, TNF-베타, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-알파, IFN-베타, 또는 IFN-감마로부터 선택될 수도 있다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 대사길항제, 세포독성항생제, 아드리아마이신, 닥티노마이신, 미토마이신, 카미노마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 탁소티어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에토포사이드(VP-16), 5-플루오로우라실(5FU), 시토신 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 티오테파, 메토트렉사트, 캠프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP), 아미노프테린, 콤브레타스타틴(들), 기타 빈카 알칼로이드 및 그것의 유도체 또는 프로드러그를 포함한다. 호르몬제의 예는 류프로렐린, 고세셀렌, 트리프토렐린, 부세렐린, 타목시펜, 토레미펜, 플루타미드, 닐루타미드, 시프로테론 비칼루타미드 아나스트로졸, 엑세메스테인, 레트로졸, 파드로졸 메드록시, 클로르마디논, 메게스트롤, 기타 LHRH 아고니스트, 기타 항-에스트로겐, 기타 항-안드로겐, 기타 아로마타아제, 억제제, 및 기타 프로게스타젠을 포함한다. 바람직하게, 억제성 KIR 리셉터에 결합하고 억제하는 2차 항체는 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 존재하는 공통의 결정인자에 결합하는 항체에 결합된 에피토프와 상이한 억제성 KIR 리셉터의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그것의 유도체 또는 단편이다. 다른 양태에서, 2차 항체는 본 발명의 항체의 투여에 의해 최소한 부분적으로 치료될 수 있는 질병(예를 들어,암-관련 항원, 바이러스 감염-관련 항원 등)과 관련된 표적으로 유도될 수도 있다.
본 발명은 NK 셀 활성을 강화하는 것이 필요한 환자 내에 NK 셀 활성을 검출 가능하게 강화하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다. NK 셀 활성 강화가 필요한 환자는 질병 또는 질환을 앓는 것으로 진단된 어떤 환자일 수 있으며, 이러한 강호는 치료적 효과를 촉진, 증대, 및/또는 유도할 수도 있다(또는, 질병 또는 질환에 걸린 환자 및 상기 환자와 실질적으로 유사한 특징이 있는 환자를 최소한 실질적인 정도로 이러한 효과를 촉진, 증대, 및/또는 유도함 - 예를 들어, 임상 실험에 의해 결정될 수도 있음). 이러한 치료가 필요한 환자는 예를 들어, 암, 다른 증식성 질환, 감염성 질병 또는 면역 질환을 앓고 있을 수도 있다. 바람직하게, 방법은 면역조절제, 호르몬제, 화학요법제, 항-엔지오제네시스 제제, 아폽토시스 제제, KIR에 별개인 항원에 특이적인 2차 항체, 선택적으로 억제성 KIR 리셉터에 결합하고 억제 및 중화하거나, 억제성 KIR로부터의 신호를 감소시키는 2차 항체. 항-감염성 제제, 표적화제, 또는 부가 화합물로부터 선택될 수도 있으며, 상기 추가적 치료제는 상기 항체와 함께 단일 투여량 형태로서, 또는 분리 투여량 형태로서 상기 환자에 투여된다. 총괄하여 항체(또는 항체 단편/유도체)의 투여량 및 추가적 치료제의 투여량은 NK 셀 활성의 강화를 포함하는 환자 내 치료 반응을 검출가능하게 유도, 촉진, 및/또는 증대시키기에 충분하다. 분리하여 투여되는 경우, 항체, 단편, 또는 유도체 및 추가적 치료제는 바람직하게는 조건(예를 들어, 시기, 투약의 횟수 등) 하에 투여되어 환자에 검출가능한 조합된 치료적 이익을 가져온다.
추가적으로, 비-인간 영장류, 바람직하게는 원숭이(monkey)에서 NK 셀 및/또는 KIR 리셉터에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 본 발명에 포함된다. 또한, 후 보자 약제인 본 발명의 항체의 독성, 투여량 및/또는 활성이나 효능을 평가하는 방법이 포함된다. 한 양태에서, 본 발명은 NK 셀을 갖는 비-인간 영장류 수령체 동물에 본 발명의 항체를 투여함으로써 동물 또는 표적 조직에 대해 독성인 항체의 투여량을 결정하고, 동물에 있어서, 또는 바람직하게는 표적 조직에 있어서 제제의 임의의 독성 또는 해로운 효능 또는 부작용을 평가하는 방법을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 NK 셀을 갖는 비-인간 영장류 수령체 동물에 본 발명의 항체를 투여함으로써 동물 또는 표적 조직에 독성인 항체를 확인하고, 동물에 있어서, 또는 바람직하게는 표적 조직에 있어서 제제의 임의의 독성 또는 해로운 효능 또는 부작용을 평가하는 방법이다. 다른 양태에서, 본 발명은 감염, 질병 또는 암의 비-인간 영장류 모델에 본 발명의 항체를 투여함으로써 감염, 질병 또는 종양의 치료에 효험이 있는 항체를 확인하고, 감염, 질병 또는 암, 또는 그것들의 증상을 경감시키는 항체를 확인하는 방법이다. 한 구체예에서, 본 발명의 상기 항체는 (a) 인간 NK 셀의 표면에서 최소한 2개의 억제성 인간 KIR 리셉터와 상호작용하고, (b) 비-인간 영장류의 NK 셀 또는 KIR 리셉터와 상호작용하는 항체이다.
추가적으로, 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체 내에서 그들 세포 표면 상에 억제성 KIR을 함유하는 NK 셀의 존재를 검출하는 방법에 본 발명에 포함되며, 상기 방법은
a) 상기 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체를 검출가능 부분과 콘쥬게이션되어 있거나 공유결합되어 있는 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 생물학적 샘플 또는 살아있는 유기체에서 상기 항체의 존재를 검출 하는 단계
를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포 표면 상에 억제성 KIR을 함유하는 샘플 NK 셀로부터 정제하는 ㅂ아법이 제공되며, 상기 방법은
a) 상기 샘플을 세포 표면 상에 억제성 KIR을 함유하는 상기 NK 셀이 상기 항체에 결합하도록 허용하는 조건하에서 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및
b) 고형 지지체에 콘쥬게이트 되거나 공유결합된 상기 항체로부터 상기 결합된 NK 셀을 용리하는 단계
를 포함한다.
또한, 항체 NKVSF1(Pan2D)는 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이로부터의 NK 셀에 결합함을 발견하였으며, 도 10을 참조하시오.
따라서, 본 발명은 항체, 및 그것의 단편 및 유도체를 제공하며, 상기 항체, 단편 또는 유도체는 인간 NK 셀의 표면에서 최소한 2개의 억제성 인간 KIR 리셉터와 상호작용하며, 또한 사이노몰거스 원숭이로부터의 NK 셀에 결합한다. 그것의 한 구체예에서, 항체는 NKVSF1, A210, 및/또는 A802g이 아니다. 또한, 본 발명은 항체, 및 그것의 단편 및 유도체의 독성을 테스트하는 방법을 제공하며, 상기 항체, 단편 또는 유도체는 인간 NK 셀의 표면에서 최소한 2개의 억제성 인간 KIR 리셉터와 상호작용하고, 상기 방법은 시아노몰거스 원숭이에서 항체를 테스트하는 것을 포함한다.
추가적 양태에서, 본 발명은 항체 1-7F9 또는 1-4F1의 경쇄 가변 또는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 그것의 유도체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 1-7F9 또는 1-4F1의 모든 또는 필수적으로 모든 경쇄 가변 영역 서열과 매우 유사한 서열을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 그것의 유도체를 제공한다.
추가적 양태에서, 본 발명은 항체 1-7F9 또는 1-4F1의 중쇄 가변 영역 또는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 CDR을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 그것의 유도체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 1-7f9 또는 1-4F1의 모든 또는 필수적으로 모든 중쇄 가변 영역 서열과 매우 유사한 서열을 포함하는 항체, 항체 단편, 또는 그것의 유도체를 제공한다.
항체
본 발명은 바람직하게는 최소한 2개의 상이한 KIR2DL 유전자 산물(단, KIR2DL4는 아님)에 존재하는 결정인자를 비롯하여, 인간 억제성 KIR 리셉터 간에 보존된 공통의 결정인자에 결합하는 신규한 항체 및 그것의 단편 또는 유도체를 제공하며, 이것은 이들 KIR 리셉터 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 강화를 야기한다. 본 발명은, 우선, 상호 반응 및 중화 항체가 생성되고, NK 셀 활성의 조절에 효과적으로 사용될 수 있음을 개시하며, 이것은 특히 인간 피험체에서의 예상치 못한 결과를 나타내고 신규하고 효과적인 NK-기재 요법으로의 길을 연다.
본 발명의 문맥 내에서, "공통의 결정인자"는 인간 억제성 KIR 리셉터의 몇몇 유전자 산물을 공유하는 결정인자 또는 에피토프를 나타낸다. 바람직하게, 공통의 결정인자는 KIR2DL 리셉터 기 중 최소한 2개의 구성원에 의해 공유된다. 더 바 람직하게, 결정인자는 최소한 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 의해 공유된다. 본 발명의 특정한 항체는 KIR2DL 유형의 다수의 유전자 산물을 인지하는 것 이외에도, 또한 KIR3DL 리셉터 기, 예를 들어, KIR3DL1 및/또는 KIR3DL2의 유전자 산물과 같은 다른 억제성 KIR에 존재하는 결정인자들을 인지할 수도 있다. 결정인자 또는 에피토프는 상기 구성원에 의해 공유된 펩티드 단편 또는 형태상 에피토프를 나타낼 수도 있다. 더 특이적인 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체 DF200에 의해 인지되는 실질적으로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 결정인자는 KIR2DL1 및 KIR2dL2/3 모두에 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 mAb 1-7F9에 의해 인지되는 실질적으로 동일한 에피토프, 또는 인간 mAb 1-4F1에 의해 인지되는 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 KIR2DL1, -2 및 -3에 존재하지만, KIR2DS4에는 존재하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 문맥상 달리 진술하거나 명백히 모순되지 않는 한, 폴리클론 및 단일클론 항체, 및 상기 폴리클론 및 단일클론 항체의 단편 및 유도체를 나타낸다. 중쇄의 불변 도메인의 유형에 따라, 총길이 항체는 일반적으로 5가지 주요 분류 중 하나로 할당된다: IgA, gD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 중 일부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같은 서브클래스 또는 이소타입으로 더 나뉘어진다. 면역글로불린의 상이한 분류에 해당하는 중쇄 불면 도메인은 "알파", "델타", "엡실론", "감마" 및 "뮤"라고 각각 칭한다. 상이한 분류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열이 주지되어 있다. IgG 및/또는 IgM은 그들이 생리학적 상황에서 대부분 공통으 항체이며 그들은 실험실 세팅에서 대부분 용이하게 만들어지기 때문에, 본 발명에서 사용되는 항체의 바람직한 분류이다. 일반적으로, 본 발명의 문맥에서 "항체"는 단일클론 항체, 더 바람직하게는 "인간" 단일클론 항체를 말한다.
본 발명의 한 구체예는 내인성 NK 셀의 활성화를 포함하는 치료적 목적을 위해, 생체 내에서 억제성 KIR 및 그것의 대응 HLA 리간드의 상호작용을 차단하는 방법을 젝오한다. 이러한 세팅에서, 그것은 NK 셀의 고갈을 피하기 위해 이로울 수도 있으며, 만일 고갈되는 경우, NK 셀은 그들의 치료적으로 이로운 효과를 발휘할 수 없기 때문이다. 따라서, Fc-리셉터에 대한 결합을 거의 보이지 않으며, 보체 시스템을 활성화하지 않는 IgG4 및 IgG2와 같은 항체 이소타입이 전형적으로 바람직하다. 1-7F9의 이소타입은 IgG4이다. 또한, IgG2 항체는 일반적으로 비-고갈성인 것으로 여겨지며, 또한 IgG4 항체 보다 더 안정한 분자일 수도 있으며, 그로 인하여 생체 내 더 긴 반감기를 가져온다. 1-4F1은 IgG2 이소타입이다.
항체 생산
본 발명의 항체는 당업계 주지의 각종 기술에 의해 생산될 수도 있다. 일반적으로, 그들은 억제성 KIR 폴리펩티드, 바람직하게는 KIR2DL 폴리펩티드, 더 바람직하게는 인간 KIR2DL 폴리펩티드를 포함하는 면역원과 함께 인간이 아닌 동물, 바람직하게는 마우스의 면역화에 의해 생산된다. 억제성 KIR 폴리펩티드는 인간 억제성 KIR 폴리펩티드, 또는 그것의 단편 또는 유도체의 총길이 서열을 포함할 수도 있으며, 일반적으로, 면역원성 단편, 즉 폴리펩티드의 일부는 억제성 KIR 리셉터를 발현시키는 세포의 표면상에 노출된 에피토프를 포함한다. 이러한 단편은 일반적으 로 성숙 폴리펩티드 서열의 최소한 약 7개의 보존적 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 그것의 최소한 약 10개의 보존적 아미노산을 함유한다. 단편은 일반적으로 리셉터의 세포외 도메인으로부터 필수적으로 유도된다. 총길이 KIEDL 폴리펩티드의 최소한 하나, 더 바람직하게는 두개 모두의 세포외 lg 도메인을 포함하며 KIR2DL 리셉터에 존재하는 최소한 하나의 형태상 에피토프를 모방할 수 있는 인간 KIR2DL 폴리펩티드가 더욱 더 바람직하다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 KIR2DL1 폴리펩티드의 아미노산 위치 1-224(본원에서 전체가 참고로 인용되는 Wagtmann et al., Immunity 1995;2:439-449, 또는 월드 와이드 웹(www) 주소 ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1326018082.htm에서 찾은 PROW 인터넷 웹사이트에 따른 아미노산 넘버링)의 세포외 lg 도메인의 최소한 약 8개의 보존적 아미노산을 포함한다.
한 구체예에서, 면역원은 일반적으로 세포 표면에서, 지질 막 내에 야생형 인간 KIR2DL 폴리펩티드를 포함한다. 특이적 구체예에서, 면역원은 무손상 NK 셀, 특히 무손상 인간 NK 셀을 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 용해되거나 그렇지 않은 경우 손상되도록 처리된다. 면역원은 예를 들어, 선택적으로 완전 프룬드(Freund) 애쥬반트와 같은 애쥬반트와 함께, 버퍼에 현탁되거나 용해된 후, 마우스, 래빗, 염소, 말, 개, 양, 기니아 피그, 래트, 햄스터 등과 같은 인간이 아닌 포유동물에 투여될 수 있다.
비-인간 포유동물을 항원으로 면역화하는 단계는 마우스에서 항체 생산을 자극하기 위한 당업계 주지된 임의의 방식으로 수행될 수도 있다(예를 들어, E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988) 참조). 이어서, 면역원을 완전 프룬드(Freund) 애쥬반트와 같은 애쥬반트와 함께, 버퍼에 현탁되거나 용해시킨다. 면역원의 양, 버퍼의 유형 및 애쥬반트의 양을 결정하는 방법은 당업계 숙련자에게 주지되어 있으며 본 발명에 있어서 어떤 식으로든 제한되지 않는다. 이들 매개변수는 상이한 면역원 마다 상이하지만, 용이하게 설명된다.
이와 유사하게, 항체의 생산을 자극하기에 충분한 면역화의 우치 및 빈도의 선택에 관한 원리 또한 당업계에 주지되어 있다. 전형적인 면역화 프로토콜에서, 비-인간 동물에 1일 및 약 1주일 후에 다시 항원을 복막내 주사한다. 이어서, 20일 정도에 선택적으로 프룬드 애쥬반트와 같은 애쥬반트와 함께 항원의 회상(recall) 접종한다. 회상 접종은 정맥내로 수행되며 며칠 연속하여 반복될 수도 있다. 이어서, 40일에 일반적으로 애쥬반트를 포함하지 않고서, 정맥내 또는 복막내로 추가 접종(booster injection)한다. 이 프로토콜로 40일 후 항원-특이적 항체-생산 B 셀을 생산하게 된다. 또한, 그들이 면역화에 사용한 항원에 대한 항체를 발현하는 B 셀의 생산을 야기하는 한 다른 프로토콜이 이용될 수도 있다.
폴리클론 항체 제조를 위해, 혈청은 면역화된 인간이 아닌 동물로로부터 얻고 그 안에 존재하는 항체를 주지의 기술에 의해 단리시킨다. 상기 혈청을 억제성 KIR 리셉터와 반응하는 항체를 얻기 위해 고형 지지체에 연결된 상기 제시한 면역원 중 임의의 것을 사용하여 친화도 정제할 수도 있다.
대안적 구체예에서, 비면역화 비-인간 포유동물로부터의 림프구를 단리시키 고, 시험관 내에서 성장시킨 다음, 세포 배양액에서 면역원에 노출시킨다. 그 다음 림프구를 수확하고 하기 설명된 융합 단계를 수행한다.
단일클론 항체를 위해, 다음 단계는 면역화된 비-인간 포유동물로부터 비장 림프구의 단리 및 항체-생산 하이브리도마를 형성하기 위해 불멸화 세포와 상기 비장 림프구와의 후속적 융합이다. 비-인간 포유동물로부터 비장 림프구의 단리는 당업계에 주지되어 있으며 일반적으로 마취된 비-인간 포유동물로부터 비장을 제거하는 단계, 그것을 작은 조작으로 자르는 단계 및 비장 림프구를 비장 캡슐로부터 세포 여과기(strainer)의 나이론 메시를 통해 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 버퍼로 압착시키는 단계를 포함한다. 세포를 세척하고, 원심분리하고 임의의 적혈구를 용해하는 버퍼에서 현탁시킨다. 용액을 다시 원심분리하고 펠릿 내 잔여 림프구를 최종적으로 신선한 버퍼에서 현탁시킨다.
일단 단리되어 단일 세포 현탁액에 존재하는 경우, 림프구는 불멸 셀라인으로 융합될 수 있다. 하이브리도마를 생성하기에 유용한 많은 다른 불멸 셀라인들이 당업계 주지되어 있지만, 이것은 일반적으로 마우스 골수종 셀라인이다. 바람직한 뮤린 골수종 라인은 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(미국 캘리포니아 샌디에고 소재 SaIk Institute Cell Distribution Center로부터 구매가능), 또는 X63 Ag8653 및 SP-2 셀라인 (미국 매릴랜드 록빌 소재 American Type Culture Collection로부터 구매가능)으로부터 유도된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 세포 융합은 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 수행한다. 그 다음 결과의 하이브리도마를 비융합, 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 기질을 함유하 는 선택적 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하는 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 일반적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)를 포함할 것이며, 이 기질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는다.
하이브리도마는 일반적으로 대식세포의 영양세포층에서 성장한다. 대식세포는 바람직하게는 비장 림프구를 단리시키는데 사용된 비-인간 포유동물의 한배새끼(littermates)이며 일반적으로 불완전 프룬드 애쥬반트 등과 함께 며칠간 준비킨 후 하이브리도마를 평판 배양한다. 융합법은 본원에서 참고로 인용되는 Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)에서 설명된다.
세포는 콜로니 형성 및 항체 생산을 위해 선택 배지에서 충분한 시간동안 성장하도록 허용한다. 이 시간은 통상적으로 약 7 일 내지 약 14일이다. 후속하여 하이브리도마 콜로니를 다수의 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물과 상호반응하는 항체의 생산에 대하여 분석하였다. 면역 침강 및 방사 면역 검정법, 또는 FACS, Biacore, 섬광-근접 접촉법(SPA), 또는 당업계 주지된 다른 유형의 분석법을 비롯하여, 몇 가지 다른 유형의 분석법이 사용될 수도 있지만, 분석은 일반적으로 비색 ELISA-형 분석법이다. 원하는 특이성의 항체를 함유하는 웰을 하나 이상의 뚜렷한 하이브리도마 세포 콜로니가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 조사한다. 하나 이상의 콜로니가 존재하는 경우, 단지 하나의 단일 세포를 원하는 항체를 생산하는 콜로니를 발생시키도록 확보하기 위해 세포를 다시 클로닝시키고 성장시킬 수도 있 다. 일반적으로 단지 하나의 단일클론 항체가 검출되거 생산되도록 확실시하기 위해 하나의 뚜렷한 콜로니가 있는 양성 웰을 다시 클로닝하고 다시 분석한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 적용가능한 방법에 따른 항체를 생산하는데 사용되는 비-인간 동물은 설치류(예를 들어, 매우스, 래트 등), 소, 돼지, 말, 토끼, 염소, 양 등과 같은 포유동물이다. 또한, 비인간 포유동물은 하기 설명한 바와 같이 Xenomouse(TM)(Abgenix) 또는 HuMAb-Mouse(TM)(Medarex)와 같은 "인간" 항체를 생산하도록 유전자 변형 또는 유전자 조작될 수도 있다.
또한, 항체는 관심있는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대하여 유전자 도입된 척색 동물(포유동물 또는 조류와 같은 것) 또는 식물의 발생 및 그것으로부터 회복가능한 형태로 항체의 생산을 통해 유전자 도입에 의해 생산할 수도 있다 (예를 들어, Ma et al., Nature Rev. Genetics 4:794-805 (2003); Nolke et al., Expert Opin Biol Ther. 2003 Oct;3(7):1153-62; Schillberg et al., Cell MoI Life Sci. 2003 Mar;60(3):433-45; Tekoah et al., Arch Biochem Biophys. 2004 Jun 15;426(2):266-78; Fischer et al., Eur. J. of Biochem., 262(3):810 (1999); 및 식물 내 항체 및 항체 유사 단백질의 생산에 관한 US 특허 출원 20030084482 참조). 포유동물 내 유전자 도입에 의한 생산과 관련하여, 항체 및 다른 단백질들이 염소, 소, 또는 기타 포유동물의 우유로부터 생산되고, 회수될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, 및 5,741 ,957 참조. 또한, 항체는 조류의 알로부터 생산되고, 그로부터 회수될 수도 있다. 예를 들어, Tini et al., Comp Biochem Physiol A MoI lntegr Physiol. 2002 Mar;131 (3):569-74 및 US 특허 4,550,019를 참조할 것.
또한, 예컨대 Ward et al., Nature, 341 (1989) p. 544에서 개시된 바와 같이, 면역글로불린의 조합 라이브러리로부터의 선택에 의해 생산될 수도 있다.
다른 구체예에 따라서, 본 발명은 비-인간 숙주의 B 세포로부터 유도된 하이브리도마를 제공하며, 상기 B-세포는 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 존재하는 결정인자에 결합하는 항체를 생산하며 상기 항체는 상기 리셉터의 억제 활성을 중화시킬 수 있다. 더 바람직하게, 본 발명의 이러한 양태의 하이브리도마는 단일클론 항체 NKVSF1 (A210, 및/또는 A802g는 아님)를 생산하는 하이브리도마가 아니다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 하이브리도마는 면역화 비-인간 포유동물로부터의 비장 림프구의 불멸 셀라인과의 융합에 의해 상기 설명한 바와 같이 생성될 수 있다. 이 융합에 의해 생산된 하이브리도마는 본원의 그 밖의 곳에서 설명한 바와 같은 상호 반응 항체의 존재에 대하여 스크리닝할 수 있다. 바람직하게, 하이브리도마는 최소한 2개의 상이한 KIR2DL 유전자 산물에 존재하는 결정인자를 인지하고, 그들 KIR 리셉터 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 강화를 야기하는 항체를 생산한다. 보다 더 바람직하게, 하이브리도마는 1-7F9와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정인자에 결합하며 NK 셀 활성을 강화하거나, 또는 1-4F1과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 생산한다. 더 바람직하게, 하이브리도마는 단일클론 항체 1-7F9를 생산하는 하이브리도마 1-7F9, 또는 단일클론 항체 1-4F1을 생산하는 하이브리도마 1-4F1이다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하도록 확인된 하이브리도마는 DMEM 또는 RPMI-1640과 같은 적절한 배지에서 더 많은 양으로 성장할 수 있다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 동물 내 복수와 같은 생체 내에서 성장할 수 있다.
원하는 단일클론 항체를 생산하기 위해 충분한 성장 후, 단일클론 항체를 함유하는 성장 배지(또는 복수액)를 세포로부터 분리시킬 수 있으며, 단일클론 항체를 정제한다. 정제는 일반적으로 단백질 A 또는 단백질 G-Sepharose를 사용하거나, 또는 아가로스 또는 Sepharose 비드와 같은 고형 지지체에 연결된 항-마우스 lg를 사용하는 크로마토그래피에 의해(예를 들어, 본원에서 참고로 인용되는 항체 Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC에서 모두 설명됨), 또는 전기영동 또는 투석과 같은 기타 공지의 기술을 사용하여 이룬다. 결합된 항체는 일반적으로 항체를 함유하는 분획의 직접 중화를 하는 낮은 pH 버퍼(pH 3.0 이하의 글리신 또는 아세테이트 버퍼)를 사용하여 단백질 A/단백질 G 컬럼으로부터 용리한다. 이들 분획은 원하는 만큼 풀되고, 투석되고, 농축될 수 있다.
인간 항체
한 양태에서, 본 발명은 인간 항-KIR 항체를 제공한다. "인간" 항체는 "인간화" 항체(이것은 하기에서 따로 설명함)와 구별할 수 있다. 이러한 "인간" 항체는 예를 들어, CDR3와 같은 CDR에서, 인간 생식세포 면역글로불린 서열(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이 생성 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간화 항체 또는 인간 /마우스 키메라 항체를 함하지 않는 것으로 의도되며, 여기서 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포 라인으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 틀구조 서열로 이식되었다.
유전자 조작 동물은 발전하였으며, 이것은 인간 lg-유전자를 품고, 면역화시에, 마우스 면역글로불린 생산이 없을 때 인간 항체의 총 레파토리를 생산한다. 이러한 인간 lg-유전자 변형 마우스는 인간 항체를 생산하도록 이용될 수 있다. 이러한 인간 항체는 XenoMouseTM(Ab- genix - Fremont, CA, USA)와 같이 인간 면역글로불린 유전자 좌 및 본래의 면역글로불린 유전자 결실을 포함하는 인간 lg-유전자 변형 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 양, 돼지, 염소, 소, 말 등)(예를 들어, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994); Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997); Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998); European Patent No., EP 0 463 151 B1 ; 국제 특허 출원 제 WO 94/02602, WO 96/34096; WO 98/24893, WO 99/45031 , WO 99/53049, 및 WO 00/037504호; 및 US Patents 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 5,994,619, 6,075,181 ,6,091,001 , 6,114,598 및 6,130,364호 참조) 또는 HuMab-mouseTM (Medarex - Princeton, NJ, USA)와 같이 인간 lg-암호화 유전자의 미니 유전자 좌를 포함하는 유전자 변형 동물(예를 들어, EP 0546073, EP0546073; U.S. 특허 제 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591 ,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215, 5,643,763; 및 국제 특허 출원 제 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 참조)에서 발생될 수 있다. 이러한 유전자 변형 마우스로부터의 비장 림프구를 사용하여 본원에서 설명한 바와 같이, 주지의 기술에 따라 인간 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산할 수 잇따. 유사한 기술 및 원리가 예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); and Bruggemann et al., Year in Immune, 7:33 (1993))에서 설명된다.
이에 더하여, 기타 종들로부터의 인간 항체 또는 항체들이 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 및 당업계 주지의 방법을 사용하는 기타 관련 기술을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 디스플레이-형 기술을 통해 발생될 수 있으며, 결과의 분자는 주지의 기술인 친화도 성숙과 같은 추가적 성숙 방법에 놓이게 할 수 있다(예를 들어, (Hoogenboom et al ., J. MoI. Biol. 227: 381 (1991 ) (파지 디스플레이); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996) (파지 디스플레이); Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (리보솜 디스플레이), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (파지 디스플레이), Marks et al., J. MoI. Biol., 222:581 (1991 ), Scott TIBS 17:241 -245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21 :1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), 및 US Patent 5,733,743 참조). 디스플레이 기술이 인간이 아닌 항체를 생산하는데 사용되는 경우, 이러한 항체들은 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 인간화될 수 있다.
따라서, 본원에서 설명한 바와 같이, 항-KIR mAb는 암 및 바이러스 감염 및 다른 질병 및 질환의 치료를 위한 장래의 약제이다. 항-KIR mAb는 뮤린 mAb의 인간화와 같은 각종 접근법에 의해 또는 인간 lg-유전자 변형 마우스(XenoMouse, 또는 HuMab 마우스)로부터의 비장 림프구의 융합에 의해, 파지 디스플레이에 의해, 인간 Ab-생성 B 세포의 불멸화에 의해, 또는 기타의 방법에 의해 발생될 수도 있다. 어느 경우에, 항체는 셀라인에 의해 생산되고 정제, 포장 및 이것이 필요한 환자에 주사하기에 적절한 양으로 정제될 수 있다.
재조합 생산
또한, 항-KIR 항체는 표준 기술을 사용하여 효모와 같은 단일 세포 생물체; 박테리아 세포 배양액(E. Coli와 같은 것); 또는 진핵 세포 배양액(예를 들어, 포유동물 세포의 배양액)에서의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 대안적 구체예에 따라, 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR에 존재하는 결정인자에 결합하는, 상호반응성 및 중화 항-KIR 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA를 본 발명의 하이브리도마로부터 단리하고 적절한 숙주로 트랜스펙션을 위한 적절한 발현 벡터에 위치시킨다. 그 다음 숙주를 항체, 또는 단일클론 항체의 인간화 버전, 상기 항체의 활성 단편, 또는 항체의 항원 진지 부분을 포함하는 키메라 항체와 같은 그것의 변이체에 대하여 사용한다. 바람직하게, 이 구체예 에서 사용된 DNA는 최소한 2갸의 상이한 KIR2DL 유전자 산물(KIR2DS3 또는 -4가 아님)에 존재하는 결정인자를 인지하고 그들 KIR2DL 리셉터 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 강화를 야기하는 항체를 코딩한다. 더욱 더 바람직하게, DNA는 1-7F9와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정인자에 결합하고 NK 셀 활성을 강화하는 항체를 코딩한다. 가장 바람직하게, DNA는 단일클론 항체 1-7F9를 코딩한다.
본 발명의 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 전통적인 과정(예를 들어, 뮤린 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열화한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 위치될 수 있고, 후속하여 이것을 그 외에 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. Coli 셀, 원숭이 COS 셀, 중국 햄스터 난소(CHO) 셀, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션하여, 재조합 숙주 세포 내 단일클론 항체의 합성을 얻는다. 항체의 DNA 코딩 단편의 박테라이 내 재조합 발현은 당업계 주지되어 있다(예를 들어, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); 및Pluckthun, Immunol. Revs. 130, pp. 151 (1992) 참조).
추가적으로, 기지의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL), 및 인간 불변 영역으로부터 항체의 재조합 생산은 예를 들어, 하기로서 설명되었다: Ruker 등 (Annals of the New York Academy of Sciences. 1991 ;646:212-219)에 의해 설명되었으며, 그들은 CHO 셀 내 인간 단일클론 항-HIV-1 항체의 발현을 보고하였고; Bianchi 등(Biotechnology and Bioengineering. 2003;84:439-444)은 트랜스-보체 발현 벡터 를 사용하는 총 길이 항체의 고수준 발현을 설명하며, No Soo Kim 등(Biotechnol. Prog. 2001;17:69-75)은 디하이드로폴레이트 환원효소 매개 유전자 증폭 중에 CHO 세포의 인간화 항체 발현에서 클론 변화의 발생의 중요한 결정인자를 설명한다; King 등(Biochemical Journal. 1992;281 :317-323)은 마우스-인간 키메라 항체 및 키메라 Fab' 단편의 발현, 정제 및 특성화를 보고한다; WO 2003064606호는 FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열 모두를 포함하는, 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체를 설명한다; WO 2003040170호는 인간 CD40에 특이적으로 결합하고 활성화하는 키메라 또는 인간 단일클론 항체 및 항원-결합 부분을 설명한다.
인간 IgG의 불변 영역을 코딩하는 전체 cDNA 서열은 하기 GenBank 기재 사항에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 전체가 참고로 인용되며, 2005년 1월 6일자로 수탁되었다.
인간 IgGI 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 #: J00228
인간 IgG2 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 #: J00230
인간 IgG3 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 #: X04646
인간 IgG4 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 #: K01316
인간 κ 경쇄 불변 영역: GenBank 수탁 #: J00241.
전형적인 구체예에서, 1-7F9 또는 1-4F1 VH 및 VL 서열의 재조합 mAb 산물을 생산하기 위해, 하기 프로토콜이 적용될 수 있다. 단계 1-3은 1-7F9 또는 1-4F1을 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포로부터의 VH 및 VL 영역의 회복을 설명한다. 그러나, 단계 4에서 사용되는 1-7F9 또는 1-4F1 VH 및 VL 서열(또는 그것의 돌연변이체 또는 유도체)을 코딩하는 cDNA는 또한 cDNA 단편을 합성하기 위해 확립된 기술을 사용하여, 도 14 또는 15에서 제공된 서열 정보로부터 제조할 수 있다. 대안으로, 1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및 VL 단편, 또는 그것의 돌연변이는 총길이 항체를 발현시키기 위해, 원하는 lg 서브클래스의 불변 영역을 함유하는, 과학 문헌에서 설명된 수많은 발현 벡터들 중 하나 또는 시중 구매가능한 발현 벡터로 클로닝시킬 수도 있다. 추가적으로, 1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및 VL 단편, 또는 그것의 돌연변이체 또는 유도체는 항체 단편(예를 들어, Fab 단편)을 발현시키기 위해 절단된 불변 영역을 코딩하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 시중 구매가능한 벡터 중 한 예는 ATCC(American Type Culture Collection, catalog number 87094)로부터 구매가능한 pASK84이다.
(1) 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA의 단리
인간 KIR에 대한 항체를 분비하는 4x106 하이브리도마 세포(1-7F9 또는 1-4F1과 같은 것)를 제조업자의 지시, 및 본원에서 간략히 개략된 바에 따라서, Qiagen으로부터의 RNeasy Mini Kit를 사용하는 전체 RNA의 단리를 위해 사용한다: 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 10μl/ml β-메르캅토에탄올을 함유하는 350μl RTL 버퍼의 첨가에 의해 붕괴시킨다. 용해물을 Qiagen으로부터의 QIAshredder 컬럼 상으로 이동시키고 최대 속도로 2분 동안 원심분리한다. 플로우-쓰루(flow-through)를 70% 에탄올과 동량으로 섞는다. 최대 700 μl 샘플을 각 RNeasy 회전 컬럼(Qiagen)에 적용하고 14000 rpm에서 원심분리하고, 플로우-쓰루를 버린다. 700μl RW1 버퍼를 각 컬럼에 적용하고 이것을 15초 동안 14000 rpm에서 원심분리하여 컬럼을 세척한다. 컬럼을 500μl RPE 버퍼로 2번 세척하고 15초 동안 14000rpm으로 원심분리한다. 컬럼을 건조시키기 위해, 그것을 14000 rpm에서 추가로 2분 동안 원심분리한다. 컬럼을 새로운 수집관으로 옮기고 RNA를 50μl의 뉴클레아제가 없는 물로 용리하고 14000rpm에서 1분 동안 원심분리한다. RNA 농도를 OD=260nm의 흡광도로 측정한다. RNA를 필요시까지 -80℃에 저장한다.
(2) cDNA 합성:
1μg RNA를 Clontech 사 MART RACE cDNA 증폭 키트를 사용하여 첫번째 가닥 cDNA 합성을 위해 사용한다. 5'-RACE-Ready cDNA의 제조를 위해, 반응 혼합물을 상기 설명한 바와 같이 단리된 RNA, 역-프라이머 5'-CDS 프라이머 백, 및 SMART II A 올리고를 함유하여 제조하며, 이 혼합물을 2분 동안 72℃에서 인큐베이션하고, 후속하여 약 2분 동안 얼음 위에서 냉각시킨 다음, 1xFirst-Strand 버퍼, DTT (2OmM), dNTP (1OmM) 및 PowerScript 역전사효소를 첨가한다. 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 42℃에서 인큐베이션하고 Tricine-EDTA 버퍼를 첨가하고 7분 동안 72℃에서 인큐베이션한다. 이 지점의 샘플을 -20℃에서 저장할 수 있다.
(3) 인간 가변 경쇄(VL) 및 인간 가변 중쇄(VH)의 PCR 증폭 및 클로닝:
1xAdvantage HF 2 PCR 버퍼, dNTP (1OmM) 및 1xAdvantage HF 2 폴리머라제 혼합을 함유하는 PCR(중합효소 연쇄 반응) 반응 혼합물을 상기와 같이 제조한 cDNA로부터 VL 및 VH 모두의 가변 영역을 각각 분리하기 위해 성립시킨다.
VL의 증폭을 위해, 하기 프라이머가 사용된다:
UPM (보편적인 프라이머 혼합):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-S' (SEQ ID NO:26)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-S' (SEQ ID NO:27)
VK RACE2:
5'-GCAGGCACACMCAGAGGCAGTTCCAGATTTC-S' (SEQ ID NO:28)
VH의 증폭을 위해, 하기 프라이머가 사용된다:
UPM (보편적인 프라이머 혼합):
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-S' (SEQ ID NO:29)
5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-S' (SEQ ID NO:30)
AB90RACE:
5'-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-S' (SEQ ID NO:31)
3회의 PCR을 수행한다. 1회: PCR은 5초 동안 94℃에서 및 3분 동안 72℃에서 5사이클 동안 실행한다. 2회: PCR은 5초 동안 94℃에서, 10초 동안 70℃에서, 그리고 1분 동안 72℃에서 실행한다. 3회: PCR은 5초 동안 94℃에서, 10초 동안 68℃에서, 그리고 1분 동안 72℃에서 28 사이클 동안 실행한다.
PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석하고 DNA를 Qiagen 사로부터의 QIAEX11 아가로스 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 정제한다.
정제된 PCR 산물은 Invitrogen 사로부터의 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 PCR4-TOPO 벡터에 도입하고 TOP10 컴피턴트 셀의 형질 전환을 위해 사용한다.
적절한 양의 콜로니를 Taq 중합효소, 1xTaq 중합효소 버퍼, dNTP(10 mM) 및 하기 프라이머 및 PCR 프로그램을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 분석한다:
M13정방향 프라이머: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (SEQ ID NO:32)
M13역방향 프라이머: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQ ID NO:33)
PCR 프로그램:
25 사이클을 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 및 1분 동안 72℃에서 실행한다.
각각 VL 및 VH 삽입을 포함하는 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 추출하고 상기 열거한 프라이머 M13정방향 및 M13역방향을 사용하여 시퀀싱한다. 인간 항-KIR mAb 1-7F9의 경우에, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 도 15에 나타낸다.
(4) 포유동물 발현 벡터로 항체 유전자로의 서브클로닝
mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA에 대한 서열 데이타를 기재로 하여, 프라이머를 각각 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)의 증폭을 위해 설계한다. 가변 영역을 Kozak 서열, 리더 서열 및 독특한 제한 효소 자리를 포함하도록 PCR에 의해 구성한다. VL을 위해, 이것을 HindIII 위치, Kozak 서열을 도입하고 가변 영역의 5' 말단의 리더 서열에 동종인 5' PCR 프라이머를 설계함으로써 이룬다. 3' 프라이머는 가변 영역의 3' 말단에 동정이고 가변 영역의 3' 경계에 BsiWI 위치를 도입한다. VH 영역은 유사한 방식으로 생성되지만, 단 Notl 및 Nhel 위치가 각각 HindIII 및 BsiWI의 5' 및 3' 말단에 도입되는 것을 제외한다.
증폭된 유전자 산물을 표준 기술을 하영하여, 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 진핵생물 발현 벡터로 클로닝시킨다. VL DNA 단편을 HindIII 및 BsiWI로 가수분해시키고 엠피실린 및 E.Coli 복제 개시점(pUC)에 내성인 베타-락타마제 유전자 암호화를 함유하는 진핵생물 발현 벡터로 리게이션하고; 결과의 플라스미드를 VLCL이라 칭한다. VH DNA 단편을 Notl 및 Nhel로 가수분해시키고 상기 설명한 바와 같은 VL 단편의 도입의 결과인 VLCL 벡터로 도입시킨다. 결과의 플라스미드는 동일한 플라스미드 상의 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 기능상의 발현 카세트를 함유한다. 리게이션된 플라스미드는 E. Coli를 형질전환하는데 사용한다. 플라스미드 DNA는 이들 앰피실린 내성 박테리아 개체군으로부터 제조되며 중국 햄스터 난소 세포, 또는 다른 포유동물 셀라인으로 트랜스펙션되는데 사용된다. 트랜스펙션 및 세포 배양은 Sambrook 등의 "Molecular Cloning"에서 예로서 설명되는 바와 같은 표준 방법에 의해 수행된다. 1-7F9 또는 1-4F1, 또는 다른 인간 항-KIR mAb의 VH 및 VL 영역을 포함하는 1-7F9 또는 1-4F1 인간 항-KIR mAb 또는 mAb와 같은 관심있는 항체 분자를 안정적으로 발현 및 분비시키는 트랜스펙션된 셀라인을 결과로 한다.
항체의 변이체는 용이하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 각각 1-7F9 또는 1-4F1과 정확히 동일한 특이성을 가지지만, lgG4 또는 lgG2와 상이한 이소타입을 갖는 항체를 1-7F9 또는 1-4F1의 VL 및 VH를 코딩하는 cDNA를 lgG1 또는 lgG2 또는 lgG3 또는 lgG4 불변 중쇄 영역으로부터 선택된 κ 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드로 하위 클로닝함으로써 획득할 수 있 다. 따라서, 생성된 바와 같은 항체는 어떤 이소타입을 가질 수 있으며 그 다음, 항체는 당업계 전통적 기술을 사용하여 이소타입을 바꿀수 있다. 이러한 기술은 직접 재조합 기술(예를 들어, 미국 특허 4,816,397호 참조), 세포-세포 융합 기술(예를 들어, 미국 특허 5,916,771호 참조), 및 당업계 공지된 다른 적당한 기술들의 사용을 포함한다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 항체의 작동자 기능은 치료적인 사용을 비롯하여, 각종 사용을 위해 이소타입 전환에 의해 모 항체의 이소타입에 관하여 예를 들어, 예를 들어, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgD, lgA, lgE, 또는 lgM 항체로 변화시킬 수도 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 억제성 KIR 폴리펩티드에 존재하는 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된 포유동물 숙주(일반적으로 비-인간 포유동물 숙주)로부터의 B 세포와, 이것이 융합된 (b) 불멸 세포(예를 들어, 골수종 세포)를 포함하는 하이브리도마를 제공하며, 상기 하이브리도마는 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터에 결합하는 단일클론 항체를 생산하며 상기 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터를 발현시키는 NK 셀의 생산에 있어서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 최소한 실질적으로 중화할 수 있다. 한 구체예에서, 포유동물 숙주는 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물이다. 선택적으로, 상기 하이브리도마는 단일클론 항체 NKVSF1(A210, 및/또는 A802g이 아님)을 생산하지 않는다. 각종 구체예에서, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 리셉터 또는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 모두에 존재하는 공통의 결정인자에 결합한다. 하이브리도마는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-C 대립 유전자 분자의 인간 KIR2DL1 리셉터에 대한 결 합, 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 HLA-C 대립 유전자 분자의 인간 KIR2DL2/3 리셉터의 결합을 억제하는 항체를 생성할 수도 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 또는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 상에서 단일클론 항체 1-7F9 또는 1-4F1과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 생산할 수도 있다.
또한, 본 발명은 KIR2DL 유전자 산물과 상호작용하고 이러한 KIR의 억제 활성을 감소 또는 중화시키는 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) KIR2DL 폴리펩티드를 포함하는 면역원과 함께 비-인간 포유동물을 면역화하는 단계;
(b) 상기 면역화된 포유동물로부터 항체를 제조하는 단계(상기 항체는 상기 KIR2DL 폴리펩티드에 결합함);
(c) 최소한 2개의 상이한 KIR2DL 유전자 산물과 상호반응하는 (b)의 항체를 선택하는 단계;
(d) NK 셀을 강화하는 (c)의 항체를 선택하는 단계. 한 구체예에서, 상기 비-인간 포유동물은 인간 항체 레퍼토리(예를 들어, XenomouseTM (Abgenix - Fremont, CA, USA)와 같은 인간 면역글로불린 유전자 좌 및 고유의 면역글로불린 유전자 결실을 포함하는 비-인간 포유동물 또는 HuMabmouseTM (Medarex - Princeton, NJ, USA)와 같이, 인간 lg-암호화 유전자의 미니 유전자 좌를 포함하는 비-인간 포유동물)를 발현시키도록 조작된 유전자 변형 동물이다. 선택적으로, 단계 a 및 b는 인 간 B 세포의 파지-디스플레이 또는 바이러스 도입, 또는 기타 당업계 공지의 방법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 항-KIR mAb를 얻는 대안적 방법에 의해 대체될 수도 있다. 선택적으로, 방법은 영장류, 바람직하게는 사이노몰거스 원숭이, NK 샐 또는 KIR 폴리펩티드 내 KIR에 결합하는 항체를 선택하는 것을 더 포함한다. 선택적으로, 본 발명은 항-KIR 항체를 평가하는 방법을 더 포함하며, 상기 방법에 따라 생성된 항체는 영장류, 바람직하게는 사이노몰거스 원숭이에 투여되며, 바람직하게 원숭이는 항체의 독성의 징후에 대한 존재 또는 부재에 대하여 관찰된다.
또한, 본 발명은 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 항체는 최소한 2개의 ㅅ아이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물을 발현하는 NK 셀의 개체군에 의해 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화(또는 NK 셀독성을 강화)할 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 비-인간 포유동물을 억제성 KIR 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화하는 단계;
b) 면역화 동물로부터 항체를 제조하는 단계(여기서 항체가 KIR 폴리펩티드에 결합함);
c) 최소한 2개의 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물과 상호작용하는 단계 (b)의 항체를 선택하는 단계, 및
d) 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물을 발현하는 NK 셀의 개체군 상에서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있는 단계 (c)의 항체를 선택하는 단계, 이때 단계 (c) 및 (d)는 선택적으로 거꾸로되며 상기 단계 중 임의의 수가 1회 이상 반복된다. 면역화를 위해 사용된 억제성 KIR 폴리펩티드는, 한 구체예에서, 하나 이상의 KIR2DL 폴리펩티드(들) 및 최소한 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과의 상호반응하는 단계 (c)에서 선택된 항체일 수 있다. 바람직하게, 항체는 최소한 2개의 상이한 KIR 리셉터 유전자 산물에 존재하는 공통의 결정인자를 인지하며; 가장 바람직하게 KIR은 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3이다. 한 구체예에서, 단계 (c)는 최소한 1개의 KIR2DL 및 하나의 KIR3DL 리셉터 유전자 산물과 반응하는 상체를 선택하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 선택된 항체는 KIR3DL1 및/또는 KIR3DL2 뿐만 아니라 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과도 반응한다. 선택적으로, 상기 방법은 영장류, 바람직하게는 시아노몰거스 원숭이, NK 셀 또는 KIR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 본 발명은 항체를 평가하는 방법을 더 포함하며, 이때 상기 방법에 따라 생산된 항체는 영장류, 바람직하게 시아노몰거스 원숭이에 투여됨, 바람직하게 원숭이는 항체의 독성의 징후의 존재 또는 부재에 대하여 관찰된다.
선택적으로, 상기 설명된 방법에서, 단계 c) 또는 d)에서 선별된 항체는 NKVSF1, A210, 및/또는 A802g이 아니다. 바람직하게, 상기 방법 중 단계 b)에서 제조된 항체는 단일클론 항체이다. 바람직하게 상기 방법 중 단계 (c)에서 선별된 항체는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 하나 이상의 HLA-C 알로타입의 인간 KIR2DL1 리셉터에 대한 결합, 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 하나 이상의 HLA-C 알로타입의 인간 KIR2DL2/3 리셉터에 대한 결합을 억제한다. 바람직하게 상기 방법 중 단계 (d)에서 선별된 항체는 NK 셀독성의 강화, 또는 NK 셀독성의 KIR-매개 억제의 중화를 야기한다. 바람직하게, 항체는 KIE2DL1 및/또는 KIR2DL2/3 상의 단일클론 항체 1-7F9와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 선택적으로, 방법은 선별된 단일클론 항체의 단편을 만드는 추가적 단계, 상기 선별된 단일클론 항체의 유도체를 만드는 추가적 단계(예를 들어, 방사성 핵종, 세포독성 제제, 리포터 분자 등과의 콘쥬게이션에 의함), 또는 이러한 단일클론 항체의 서열로부터 생산되거나, 또는 이것에 대응하는 서열을 포함하는 항체 단편의 유도체를 만드는 추가적 단계를 포함한다. 다른 양태에서, 이러한 항체의 변이체는 공지의 유전자 조작법을 사용하여 상기 설명된 방법에 의해 얻은 항체로부터의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제조함으로써 생산될 수 있다(예를 들어, 항체의 결합 특성을 변화시키고, 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키고, 항체의 순도를 향상시키고, 항체의 검출을 향상시키며, 및/또는 투여될 숙주에 관련하여 항체의 면역학적 특성을 변화시키기 위해 변형되는 서열).
본 발명은 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 더 제공하며, 이때 항체는 최소한 하나의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물을 발현시키는 NK 셀의 개체군 상에서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화(또는 NK셀의 개체군에 의해 NK 셀독성을 강화)할 수 있으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR2DL 리셉터 유전자 산물과 상호작용하는 단일클론 항체 또는 항체 단편을 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선별하는 단계, 및
(b) 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR2DL 리셉터 유전자 산물을 발현시키는 NK 셀의 개체군 내 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있는 단계 (a)의 항체를 선별하는 단계. 바람직하게 상기 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통의 결정인자에 결합한다. 선택적으로 단계 (b)에서 선별된 항체는 NKVSF1이 아니다. 바람직하게, 단계 (b)에서 선별된 항체는 위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 HLA-c 대립 유전자 분자의 인간 KIR2DL1 리셉터에 대한 결합, 및 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 HLA-c 대립 유전자 분자의 인간 KIR2DL2/3 리셉터에 대한 결합을 억제한다. 바람직하게, 단계 (b)에서 선별된 항체는 NK 셀독성의 강화를 야기한다. 바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및/또는 KIR2DL2/3 상의 단일클론 항체 1-7F9와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 대안으로, 항체는 단일클론 항체 1-4F1과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 선택적으로, 방법은 선별된 단일클론 항체의 단편을 만드는 추가적 단계, 상기 선별된 단일클론 항체의 유도체를 만드는 추가적 단계, 또는 선별된 단일클론 항체 단편의 유도체를 만드는 추가적 단계를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 이때 항체는 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 개체군 내 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있으며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 단일클론 항체의 생산을 위해 허용되는 조건하에 본 발명의 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
b) 상기 하이브리도마 셀로부터 단일클론 항체를 분리하는 단계. 선택적으로 상기 방법은 단일클론 항체의 단편을 만드는 추가적 단계, 상기 단일클론 항체의 유도체를 만드는 추가적 단계, 또는 이러한 단일클론 항체 단편의 유도체를 만드는 추가적 단계를 포함한다. 바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통의 결정인자에 결합한다.
또한, 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 본 발명에 의해 제공되며, 이때 항체는 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 개체군 내에서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화시킬 수 있으며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 본 발명의 하이브리도마를 단일클론 항체를 코딩하는 핵산과 단리시키는 단계;
b) 단일클론 항체의 기능상 서열과 동일하거나 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 항체의 면역반응성 단편, 또는 이러한 면역반응성 단편을 포하맣는 융합 단백질로부터 선별된 그들과 실질적으로 동일한(예를 들어, 이러한 서열과 최소한 약 65%, 최소한 약 75%, 최소한 약 85%, 최소한 약90%, 최소한 약 95%(예를 들어, 약 70-99%와 같음) 동일함) 아미노산 서열을 포함하는 면형되거나 유도체화된 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 변형된 핵산을 얻기 위해 핵산을 선택적으로 변형시키는 단계;
c) 핵산 또는 변형된 핵산(또는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 관련 핵산)을 발현 벡터로 삽입시키는 단계(이때, 코딩된 항체 또는 항체 단편은 발현 벡터가 적절한 조건하에 성장한 숙주 세포에 존재하는 경우 발현될 수 있음);
d) 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 숙주 세포를 발현 벡터로 트랜스펙션시키는 단계;
e) 항체 또는 항체 단편의 발현을 야기하는 조건하에서 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계;
f) 트랜스펙션된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 또는 항체 단편을 단리시키는 단계.
바람직하게, 항체는 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 존재하는 공통의 결정인자에 결합한다.
항체 스크리닝 및 선별
본 발명의 특정 항체는 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제; 특히 KIR2DL 리셉터 및 보다 구체적으로는 최소한 KIR2DL1- 및 KIR2DL2/3- 모두에 매개된 억제를 감소 또는 중화시킬 수 있다. 따라서 이들 항체는 이들이 MHC 클래스 I 분자와 상호작용하는 경우 KIR 리셉터에 의해 매개되는 억제성 신호 경로를 최소한 부분적으로 및 검출가능하게, 감소, 중화 및/또는 차단한다는 의미에서, 항체를 "중화", "차단", 또는 "억제"한다. 보다 의미있게, 이 중화 활성은 몇가 지 유형의 억제성 KIR 리셉터, 바람직하게는 몇가지 KIR2DL 리셉터 유전자 산물, 및 더 바람직하게는 최 소한 두가지 모두인 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 관하여 나타내며 이들 항체는 높은 효험으로 대부분 또는 모든 인간 피험체에서 사용될 수도 있다. NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제의 중화는 본원에서 설명되는 표준 시험관 내 세포질 세포독성 분석법과 같은 각종 분석법 또는 테스트에 의해 평가될 수 있다.
다수의 억제성 KIR 리셉터와 상호작용하는 항체가 확인되면, 그것은 무손상 NK 셀에서 그들 KIR 리셉터의 억제 효과를 감소 또는 중화시키는 그들의 능력에 대하여 테스트될 수 있다. 특정 변이체에서, 중화 활성은 HLA-C를 발현하는 표적의 KIR2DL-발현 NK 셀에 의한 재구성 용해에 대한 상기 항체의 역량에 의해 설명될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 항체의 중화 활성은 KIR2DL1 및 KIR2DL3(또는 밀접히 관련된 KIR2DL2)에 대한 HLA-C 분자의 결합을 차단 또는 감소시키는 항체의 능력으로 정의되며, 더 바람직하게, 그것은 Cw1, Cw3, Cw7, 및 Cw8(또는 위치 80에서 Asn 잔기를 갖는 다른 HLA-C 분자 중의 것)로부터 선택된 HLA-C 분자에 대한 KIR2DL2/3의 결합, 및/또는 Cw2, Cw4, Cw5 및 Cw6(위치 80에서 Lys 잔기를 갖는 다른 HLA-C 분자 중의 것)로부터 선택된 HLA-C 분자에 대한 KIR2DL1의 결합을 변경시키는 항체의 역량과 같다.
다른 변이체에서, 본 발명의 항체의 중화 활성은 본원에서 제공된 실시예에 개시된 바와 같이, 세포-기재 세포독성 분석에서 평가될 수 있다.
다른 변이체에서, 본 발명의 항체의 중화 활성은 사이토카인-방출 분석에서 평가될 수 있으며, 이때 NK 셀은 테스트 항체 및 NK 개체군의 KIR 분자에 의해 인지되는 하나의 HLA-C 대립 유전자를 발현시키는 표적 셀라인과 함께 인큐베션되어, NK 셀 사이토카인 생산(예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 생산)을 자극한다. 전형적인 프로토콜에서, PBMC로부터 IFN-γ 생산은 배양액에서 약 4일 후에 세포 표면 및 세포질 내 염색 및 유세포 분석기에 의해 평가된다. 간단히 말해서, Brefeldin A(Sigma Aldrich)는 최소한 약 4시간의 배양 동안 약 5μg/ml의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 그 다음, 세포를 항-CD3 및 항-CD56 mAb와 함께 인큐베이션 시킨 후 삼투화(IntraPrepTM; Beckman Coulter) 및 PE-항-IFN-γ 또는 PE-lgG1(Pharmingen)으로 염색할 수 있다. 폴리클론 활성화 NK 셀로부터 GM-CSF 및 IFN-생산은 ELISA(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-γ: OptEIA set, Pharmingen)를 사용하여 상청액에서 측정될 수 있다.
본 발명의 항체는 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 부분적으로 중화(즉, 감소) 또는 완전히 중화시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 항체는 HLA-매칭된, 또는 HLA-적합성이거나, 또는 자기 유래의 표적 세포 집단(즉, 상기 항체의 부재시 NK 셀에 의해 효과적으로 용해되지 않을 세포 개체군)의 용해를 야기하거나 증대시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 생체 내, 및/또는 시험관 내 NK 셀 활성을 촉진하는 것으로 정의될 수도 있다.
특정 구체예에서, 항체는 단일클론 항체 DF200(하이브리도마 DF200에 의해 생산됨), 1-7F9, 또는 1-4F1과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 각각 본원에서 "DF200 유사 항체", "1-7F9-유사 항체", 및 "1-4F1-유사 항체"라 칭할 수 있다. 더 바람직한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 본 발명의 더 바람직한 "DF200 유사 항체"는 단일클론 항체 NKVSD1 이외의 항체이다. 단일클론 항체 1-7F9 또는 1-4F1, 및 1-7F9 또는 1-4F1의 VH 및/또는 VL 영역을 포함하는 항체가 가장 바람직하다.
본원에서 설명된 단일클론 항체와 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체의 확인은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 각종 면역학적 스크리닝 분석 중 어떤 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 수많은 이러한 분석법들이 루틴하게 실행되며 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 참고로서 본원에서 구체적으로 인용되는 미국 특허 5,660,827호 참조). 본원에서 설명된 항체가 결합하는 에피토프를 실질적으로 결정하는 것은 본원에서 설명된 단일클론 항체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해 필요한 어떤 방식이 아님이 이해될 것이다.
예를 들어, 조사될 테스트 항체는 상이한 출처 동물로부터 얻거나, 상이한 lg 이소타입이기도 하며, 간단한 경쟁 분석이 사용될 수도 있으며, 이때 대조군 항체(예를 들어, DF200)은 테스트 항체와 혼합된 후 각각 DF200에 의해 결합되는 것으로 알려진, KIR2DL1 및/또는 KIR2DL2/3을 함유하는 샘플에 적용시킨다. ELISA, 방사선면역분석법, 웨스턴 블롯을 기초로 한 프로토콜, 및 BIACORE 분석법(예를 들어, 본원에서 실시예 단락에서 설명된 바와 같음)의 사용은 이러한 간단한 경쟁 연구에서 사용상 적합하다.
특정 구체예에서, 하나는 시간의 기간 동안 대조군 항체(예를 들어, 1-7F9 또는 1-4F1)를 다양한 양의 테스트 항체(예를 들어, 1:1, 1:2, 1:10 또는 약 1:100 의 비율)와 미리 혼합한 후에 KIR 항원 샘플에 적용시킬 것이다. 다른 구체예에서, 대조군 및 다양한 양의 테스트 항체를 분리하여 단순히 첨가할 수 있으며 KIR 항원 샘플에 대한 노출 중에 혼합할 수 있다. 하나가 유리 항체(예를 들어, 결합된 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기술을 사용함으로써) 및 테스트 항체로부터의 대조군 항체(예를 들어, 종 특이적 또는 이소타입 특이적 2차 항체를 사용하거나 또는 대조군 항체를 검출가능 표지로 특이적으로 표지함으로써)와 구별할 수 있는 한, 그것은 테스트 항체가 상이한 KIR2DL 항원에 대한 대조군 항체의 결합을 감소시키는지 여부를 결정할 수 있을 것이며, 이것은 테스트 항체가 1-7F9와 실질적으로 동일한 에피토프를 인지한다는 것을 나타낸다. 완전히 무관계한 항체(KIR에 결합하지 않는 것)의 존재하에(표지된) 대조군 항체의 결합은 대조군 높은 값으로 작용할 수 있다. 대조군 낮은 값은 표지된 대조군 항체를 동일하지만 표지되지 않은 대조군 항체와 인큐베이션함으로써 얻을 수 있으며, 여기서 경쟁이 발생할 것이며 표지된 항체의 결합을 감소시킬 것이다. 테스트 분석에서, 테스트 항체의 존재하에 표지된 항체의 현저한 감소는 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하는 테스트 항체를 나타내며, 즉 표지된 대조군 항체와 경쟁하는 것이다. 예를 들어, 1:1 또는 1:10 및 약 1:10 사이의 1-7F9:테스트 항체 또는 1-4F1:테스트 항체의 어떤 비에서, 1-7F9 또는 1-4F1의 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 항원의 결합을 최소한 약 50% 까지, 예를 들어, 최소한 약 60%, 또는 더 바람직하게는 최소한 약 70%(예를 들어, 약 65-100%)로 감소시키는 임의의 테스트 항체는 각각 1-7F9 또는 1-4F1과 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정인자에 결합하는 항체인 것으로 여겨진다. 바람직하게, 이러한 테스트 항체는 1-7F9의 최소한 서로에 대한, 바람직하게는 각각의 KIR2DL 항원에 대한 결합을 바람직하게는 테스트 항체의 부재시 관찰된 1-7F9 또는 1-4F1의 결합을 최소한 약 50%, 최소한 약 60%, 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 90%로 감소시킬 것이다. 물론, 이러한 방법들은 다른 항체 및/또는 KIR 항원과 경쟁하는 항체를 확인하고/확인하거나 평가하는데 적용될 수 있다.
경쟁은 이에 더하여서 또는 대안으로 예를 들어, 유세포 측정기 테스트에 의해 평가될 수 있다. 이러한 테스트에서, 주어진 KIR을 함유하는 세포를 처음에는 대조군 항체(예를 들어, 1-7F9 또는 1-4F1)와 함께, 그 다음에는 형광색소(fluorochrome) 또는 비오틴으로 표지된 테스트 항체와 함께 인큐베이션 시킬 수 있다. 항체는 대조군 항체의 포화량과 함께 사전-인큐베이션 하여 얻은 결합이 대조군 항체와 사전 인큐베이션 하지 않은 테스트 항체에 의해 얻은 결합(형광성에 의해 측정됨)의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예를 들어, 약 30%)인 경우, 대조군 항체와 경쟁한다라고 말한다. 대안으로, 항체는 테스트 항체의 포화량과 함께 사전 인큐베이션된 세포 상에서 표지된 대조군 항체(예를 들어, 형광색소 또는 비오틴)와 함께 얻은 결합은 테스트 항체와 함께 사전 인큐베이션 하지 않고서 얻은 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예를 들어, 약 30%)인 경우, 대조군 항체와 경쟁한다라고 말한다.
또한, 테스트 항체가 고정되어 있는 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3, 또는 이 두가지 모두의 표면에 미리 흡수되고 포화 농도로 사용되는 단순 경쟁 분석이 유리하게 사용될 수도 있다. 단순 경쟁 분석에서 표면은 바람직하게는 BIACORE 칩(또는 표면 플라스몬 경쟁 분석에 적합한 다른 배지)이다. KIR-코팅된 표면에 대한 대조군 항체(예를 들어, 1-7F9 1-4F1)의 결합이 측정된다. 대조군 항체 단독의 KIR-함유 표면에 대한 결합은 테스트 항체의 존재시 대조군 항체의 결합과 비교된다. 테스트 항체의 존재시 대조군 항체에 의한 KIR2DL1 및 KIR2DL23-함유 표면에 대한 결합의 현저한 감소는 테스트 항체가 대조군 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하여 테스트 항체가 대조군 항체와 "경쟁"함을 나타낸다. 대조군 항체의 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 모두에 대한 결합을 최소한 약 20% 이상, 최소한 약 40%, 최소한 약 50%, 최소한 약 70% 이상으로 감소시키는 임의의 테스트 항체가 대조군 항체(예를 들어, 1-7F9 또는 1-4F1)와 실질적으로 동일한 에피토프 또는 결정인자에 결합하는 항체인 것으로 생각되어질 수 있다. 바람직하게, 이러한 테스트 항체는 대조군 항체(예를 들어, 1-7F9 또는 1-4Fa)의 각각 KIR2DL 항원에 대한 결합을 최소한 약 50%(예를 들어, 최소한 약 60%, 최소한 약 70% 이상)까지 감소시킬 것이다. 대조군 및 테스트 항체의 순서는 바뀔 수 있으며, 즉 대조군 항체가 먼저 표면에 결합된 다음 테스트 항체가 그 이후 경쟁 분석에서 표면과 접촉시킬 수 있는 것으로 이해된다. 바람직하게, KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 항원에 대한 더 높은 친화성을 갖는 항체는 1차로 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3-함유 표면에 결합하는데, 즉 2차 항원(항체가 경쟁하는 것으로 추측됨)에 대하여 보인 결합의 감소가 더 클 것으로 예상된다. 이러한 분석의 추가적 예가 본원의 실시예, 및 예를 들어, 본원에서 참고로 인용되는 Saunal and Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods 183:33-41에서 제공된다.
예시의 목적으로 1-7F9 또는 1-4F1의 문맥에서 설명되는 동안, 상기 설명된 스크리닝 분석법은 또한 하나 이상의 NKVSD1, DF200, EB6, GL183, 및 본 발명에 따른 다른 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체와 경쟁하는 항체와 항체를 확인하는데 사용될 수 있다.
척추동물 또는 세포 내 항체의 면역화 및 생산에 있어서, 특정한 선별 단계는 요구되는 항체를 단리시키기 위해 수행될 수도 있다. 이 점에 있어서, 특정 구체예에서, 본 발명은 또한 이러한 항체를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 억제성 KIR 폴리펩티드를 포함하는 면역원으로 비-인간 포유동물을 면역화하는 단계;
(b) 상기 면역화 동물로부터 항체를 제조하는 단계(상기 항체는 상기 KIR 폴리펩티드에 결합함),
(c) 최소한 2개의 상이한 억제성 KIR 유전자 산물과 상호작용하는 (b)의 항체를 선별하는 단계, 및
(d) 상기 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀의 개체군 상에서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있는 (c)의 항체를 선별하는 단계.
특정 구체예에서, 추가적 단계는 상기 단계 (c) 및 (d) 사이에서 수행되어, KIR2DS4와 작용하지 않는 항-KIR mAb를 선택한다.
최소한 2개의 상이한 억제성 KIR 유전자 산물과 상호작용하는 항체의 선벽은 2개 이상의 상이한 억제성 KIR 항원에 대한 항체를 스크리닝함으로써 이루어질 수 도 있다. 더 바람직한 구체예에서, 단계 (b)에서 제조된 항체는 단일클론 항체이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상기 면역화 동물로부터 항체를 제조하는 단계"는 면역화 동물의 혈청으로부터 직접 항체를 획득하는 것 뿐만 아니라, 면역화 동물로부터 B-셀을 획득하여 상기 B 셀을 사용하여 항체를 발현시키는 하이브리도마를 생산하는 것을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 단계 (c)에서 선별된 항체는 최소한 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3과 상호작용하는 것들이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 단계 (d)에서 선택된 항체는 항-KIR mAb의 부재시 특이적 용해와 비교하여, 동족 HLA 클래스 I 분자를 발현하는 표적 세포에 대한 표준 크롬 방출 분석에서 측정되는 바와 같이, 항체에 의해 인지된 최소한 하나의 KIR을 나타내는 NK 셀에 의해 매개되는 최소한 약 10% 이상의 특이적 용해, 및 바람직하게는 최소한 약 40% 이상의 특이적 용해, 최소한 약 50% 이상의 특이적 용해, 또는 더 바람직하게 최소한 약 70% 증가된 특이적 용해(예를 들어, 약 60-100% 증가된 특이적 용해)를 야기한다. 대안으로, 하나 또는 몇 개의 억제성 KIR을 발현시키는 NK 셀 클론 및 최소한 하나의 HLA 대립 유전자를 발현시키는 표적 세포를 사용하는 크롬-방출 분석에서 사용되는 경우 단계 (d)에서 선택된 항체는 NK 클론 상에서 KIR 중 하나에 의해 인지되며, 상기 항체와 함께 얻은 세포독성의 수준은 동일한 작동자:표적세포 비에서, 동일한 농도의 DF200 또는 차단 항-MHC 클래스 I 항체와 함께 얻은 특이적 세포 독성의 최소한 약 20%, 바람직하게는 약 30% 이상일 것이다.
바로 위에 설명한 방법의 단계 (c) 및 (d)의 순서는 바뀔 수 있다. 선택적으 로, 방법은 이에 더하여서 또는 대안으로 단일클론 항체 또는 단일클론 항체의 유도체 또는 예로써, 본원 다른 곳에서 설명된 바와 같은 단편들을 만드는 추가적 단계를 더 포함할 수도 있다.
다른 변이체에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항체를 얻는 방법을 제공한다:
(a) 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR2DL 리셉터 유전자 산물과 상호작용하는, 라이브러리 또는 레퍼토리로부터, 단일클론 항체, 단일클론 항체의 단편, 또는 그것들 중 하나의 유도체를 선별하는 단계, 및
(b) 상기 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR2DL 리셉터 유전자 산물을 발현시키는 NK 셀의 개체군 상에서 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있는 단계 (a)의 항체, 단편, 또는 유도체를 선별하는 단계.
레퍼토리는 선택적으로 임의의 적절한 구조(예를 들어, 파지, 박테리아, 합성 복합체 등)로 나타내어지는, 항체 또는 그것의 단편의 임의의 (재조합) 레퍼토리일 수도 있다. 억제성 항체의 선별은 상기 개시한 바와 같이 수행될 수도 있으며 실시예에서 더 설명된다.
알려진 결정 구조(Maenaka et al. Structure with Folding and design 1999;7:391-398; Fan et al., Nature immunology 2001 ;2:452-460; Boyington et al. Nature, 2000;405:537-543)를 기초로 한, KIR2DL1, -2 및 -3(KIRE2DL1-3)의 세포외 도메인의 컴퓨터 모델링은 이들 KIR 및 항-KIR2DL 상호 반응성 뮤린 단일클론 항체 DF200 및 NKVSF1 간의 상호작용에 있어서 특정 영역 또는 KRI2DL1, -2 및 -3의 연루를 드러내었다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 아미노산 잔(105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 127, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 181, 및 192)로 정의도는 영역 내 KIR2DL1에 배타적으로 결합하는 항체를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 잔기 (105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 127, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 181, 및 192)에 의해 정의되는 영역 외부에서 아미노산 잔기와의 상호작용 하지 않고서 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1에 결합하고 R131(즉, KIR2DL1 돌연변이의 위치 131에서 Arg 잔기)이 Ala 잔기인(즉, Ala 잔기로 치환된) KIR2DL1의 돌연변이에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1에 결합하고 R157이 Ala인 KIR2DL1의 돌연변이에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1에 결합하고 R158이 Ala인 KIR2DL1의 돌연변이에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1 잔기 131, 157, 및 158에 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DS3(R131W)에 결합하지만, 야생형 KIR2DS3에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
특정 구체예에서, 항체는 배타적으로 아미노산 잔기 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88로 정의되는 영역 내 KIR2DL1에 결합하며, 숫자는 KIR2DL1(SEQ ID NO:23) 내 상기 잔기의 위치이고, Wagtmann 등의 Immunity 1995;2:439-449에서 설명된 넘버링 시스템을 사용한다. 이들 잔기는 1-7F9 KIR2DL1 에피토프(실시예 11 참조)로 확인되었다.
다른 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:23의 단편 L38 내지 Y88로 이루어진 KIR2DL1 서열 내 항원 에피토프에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO:23의 단편 L38 내지 Y88을 포함하는 KIR2DL1 서열 내 항원 에피토프에 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 잔기 잔기 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88에 의해 정의되는 영역 외부의 아미노산 잔기와 상호작용하지 않고서 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 항체는 아미노산 잔기 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88의 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 포함하는 영역 내 KIR2DL1에 결합한다. 특정 구체예에서, 항체에 대한 KIR2DL1 에피토프는 아미노산 잔기 M44 및 F45를 포함한다 (실시예 9 및 11 참조).
다른 구체예에서, 최소한 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12 또는 모든 아미노산 잔기 L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88을 포함하는 영역 내 KIR2DL1에 결합한다. 특정 구체예에서, 영역은 아미노산 잔기 M44 및 F45, 및 선택적으로 최소한 1, 2, 4, 6, 8, 10, 또는 모든 L38, R41, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88 (실시예 9 및 11 참조)을 포함하는 영역 내 KIR2dL1에 결합한다. 다른 특정 구체예에서, 영역은 최소한 아미노산 잔기 M44, F45, 및 D72를 포함하며, 이것은 1-7F9 에피토프 및 HLA-C 결합 자리가 중첩되는 KIR2DL1 영역 내이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1, KIR2DL2/3, 및 KIR2DS4에 결합하는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1 및 KIRDL2/3에 결합하지만, KIR2DS4에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 KIR2DL1 및 KIRDL2/3에 결합하지만, KIR2DS3 또는 KIR2DS4에 결합하지 않는 항체를 제공한다.
항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체가 상기 정의된 에피토프 영역 중 하나에 결합하는지 여부의 결정은 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 실시예 9 및 11을 참조할 것. 이러한 지도작성/특성화 방법의 다른 실시예에서, 항-KIR 항체에 대한 에피토프 영역은 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 단백질에서 노출된 아민/카르복실의 화학적 변형을 사용하는 에피토프 "풋-프린팅"에 의해 결정될 수도 있다. 이러한 풋-프린팅 기술의 한가지 특이적 예는 HXMS(질량 분광기에 의해 검출된 수소-중수소 교환)의 사용이며, 이때 리셉터 및 리간드 단백질 아미드 프로톤의 수소/중소소 교환, 결합, 및 역 교환이 발행하며, 단백질 결합에 참여하는 골격 아미드 기는 역 교환으로부터 보호되어서 중수소화되 채로 남아있게 될 것이다. 관련 영역은 이 지점에서 소화성 단백질 분해, 고속 마이크로보어 고성능 액체 크 로마토그래피 분리, 및/또는 전기분무 이온화 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp.252-259 (1999) 및/또는 Engen, J.R. and Smith, D.L (2001 ) Anal. Chem. 73, 256A-265A를 참조할 것. 적당한 에피토프 확인 기술의 다른 예는 핵자기 공명 에피토프 지도작성법(NMR)이며, 일반적으로 유리 항원과 이러한 항체와 같이 항원 결합 펩티드와 복합체를 이룬 항원의 2차원 NMR 분광법에서 신호의 위치가 비교된다. 일반적으로 항원 결합 펩티드와의 상호작용에 관여하는 아미노산으로부터 기원한 항원 신호는 유리 항원의 분광과 비교하여 복합체의 분광에서의 위치를 이동시킬 것이며, 결합에 참여하는 아미노산은 상기 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들어, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004;(44):149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); 및 Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun;9(3):516-24 참조할 것.
또한, 에피토프 지도작성/특성화는 질량 분광법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr;35(4):493-503 and Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1 ;71 (9):1792-801을 참조할 것.
또한, 프로테아제 가수분해 기술은 에피토프 지도작성 및 확인의 문맥에서 사용될 수 있다. 항원 결정인자-관련 영역/서열은 프로테아제 가수분해에 의해 결정될 수 있는데, 예를 들어, 밤새 37℃ 및 pH 7-8에서 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3에 대한 약 1:50의 비율에서 트립신을 사용한 후, 펩티드 확인을 위해 질량 분광(MS) 분석을 사용한다. 항-KIR 항체에 의한 트립신 분해로부터 보호된 펩티드는 후속하 여 트립신 가수분해에 놓이는 샘플 및 항체와 함께 배양되고 예를 들어, 트립신에 의해 가수분해에 놓이는 샘플(그로써 항체에 대한 풋 프린트를 드러냄)을 비교함으로써 확인될 수 있다. 키모트립신, 펩신 등과 같은 다른 효소들은 이에 더하여 또는 대안으로 유사한 에피토프 특성화 방법에서 사용될 수 있다. 게다가, 효소 가수분해는 잠재적 항원 결정인자 서열이 KIR-결합 폴리펩티드의 문맥에서 KIR2DL1의 영역 내에 존재하는지 여부에 대한 신속한 분석 방법을 제공할 수 있다. 폴리펩티드가 표면 노출되지 않는 경우, 그것은 면역원성/항원성에 관하여 관련이 없을 것이다. 예를 들어, 유사한 기술의 논의를 위해 Manca, Ann 1st Super Sanita. 1991 ;27(1):15-9를 참조할 것.
부위-특이적 돌연변이는 결합 에피토프의 설명에 유용한 다른 기술이다. 예를 들어, "알라닌-스캐닝"에서, 단백질 부분 내 각각의 잔기는 알라닌 잔기로 치환되며, 결합 친화성에 대한 결과가 측정된다. 돌연변이가 결합 친화성의 현저한 감소를 야기하는 경우, 그것은 결합에 연루될 것이다. 구조적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체(즉, 폴딩되지 않은 단백질에 결합하지 않는 항체)는 알라닌-치환이 단백질의 전체 폴딩에 영향을 미치지 않음을 입증하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Clackson and Wells, Science 1995;267:383-386; and Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1-6을 참조할 것.
또한, 전자 검경이 에피토프 "풋-프린팅"에 대하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Wang 등의 Nature 1992;355:275-278은 저온 전자 검경, 3차원 영상 재구성, 및 X-레이 결정학의 통합된 적용을 사용하여 본래의 동부 모자이크 바이러스의 캡시드 상 Fab-단편의 물리적 풋프린트를 결정한다.
에피토프 평가를 위한 "무-표지" 분석의 다른 형태는 표면 플라스몬 공명(SPR, BIACORE) 및 반사 간섭 분광법(RifS)을 포함한다. 예를 들어, Fagerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chroma- togr. 1993;646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998;37:3308-3311 ; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002 ;17:937-944를 참조할 것.
항체 단편 및 유도체
본 발명의 항체의 단편 및 유도체(문맥상 달리 진술하거나 명백히 모순되지 않는다면, 이것은 본 출원에서 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"을 포함함), 바람직하게 1-7F9 또는 1-4F1-유사 항체는 당업계에 공지되어 있는 기술에 의해 생산될 수 있다. "면역반응 단편"은 무손상 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 위치 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 "카파 바디"(예를 들어, e.g., III et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)) 및 "자누신"(본원 다른 부분에서 추가로 설명됨)을 포함한다. Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)2, F(ab')2, dAb (Ward et 등 (1989) Nature 341 :544-546); VH 도메인으로 필수적으로 구성됨), Fd(VH 및 CH1 도메인으로 필수적으로 구성됨), 및 Fv (VL 및 VH 도메인으로 필수적으로 구성됨) 단편; 디어바디; 카파 바디; 및 자누신. 예를 들어, 항체 단편은 인접 아미노산 잔기의 하나의 연속 서열로 이루어진 1차 구조를 갖는 폴리펩티드를 포함하며(본원에서 "단일 사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩티드"라고도 칭함), 상기 폴리펩티드는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: (1) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자 (2) 중쇄 부분과 결합하지 않으면서, 경괘 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 단지 하나의 경쇄 가변 도메인, 또는 그것의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드 및 (3) 경쇄 부분과 결합하지 않으면서, 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 함유하는 단지 하나의 중쇄 가변 영역, 또는 그것의 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드. 예를 들어, Fab 또는 F(ab')2 단편은 전통적 기술에 따라서, 단리된 항체의 프로테아제 가수분해에 의해 생산될 수도 있다.
면역반응 단편은 예를 들어, 생체 내 제거를 늦추고 보다 바람직한 약물 동력학적 프로파일을 얻기 위해, 공지의 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 단편은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리옥시에틸화 폴리올과 함께 변형될 수도 있다. Fab' 단편에 대한 커플링 및 부위-특이적 결합 PEG의 방법은 예를 들어, 본원에서 참고로서 인용되는 Leong et al, Cytokine 16(3) :106-119 (2001) and Delgado et al, Br. J. Cancer 73(2):175-182 (1996)에서 설명된다.
특정 양태에서, 본 발명은 도 114에 나타낸 바와 같은 1-7F9 또는 1-4F1의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 항체 단편, 및 항체 유도체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 도 15에 나타내거나 또는 상기 설명한 바와 같은 1-7F9 또는 1-4F1의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역 CDR을 포함하는 항체, 항체 단편, 및 그것의 유도체를 제공한다. 이러한 서열들의 기능상 변이체/유사체는 서열의 비교로써 보조될 수도 있는 표준 기술을 사용하여 이들 개시된 아미노산 서열 을 적절히 치환, 첨가, 및/또는 결실하여 만들수 있다. 1-7F9/KIR2DL1 복합체 및 KIR2DL1/MHC 클래스 I 복합체 (Fan et al., Nat. Immunol. 2001; 2: 452-460), PDB-코드 1 IM9의 결정 구조의 중복으로부터, 그것은 1-7F9의 scFv 유도체가 MHC 클래스 I이 KIR2DL1에 대한 결합을 차단할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 1-7F9의 단일 L-사슬 또는 1-7F9의 단일 VL 도메인 단독은, KIR2DL1에 결합하는 경우, MHC 클래스 I 결합을 차단할 것이다.
이러한 서열들의 기능상 변이체/유사체는 서열의 비교로써 보조될 수도 있는 표준 기술을 사용하여 이들 개시된 아미노산 서열을 적절히 치환, 첨가, 및/또는 결실하여 만들수 있다. 다른 양태에서, 잔기가 이들 항체 중 하나(그 밖의 것들은 제외함)의 서열에 존재하는 위치가 결실, 치환, 및/또는 삽입에 적합할 수도 있다.
대안으로, 1-7F9- 또는 1-4F1-유사 항체와 같은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA는 본 발명의 단편에 대하여 코딩하기 위해 변형될 수도 있다. 그 다음 변형된 DNA를 발현 벡터로 삽입시켜서 적절한 세포를 형질 전환 또는 트렌스펙션하는데 사용하면, 세포는 본원의 다른 곳에서 설명한 바와 같이, 바람직한 단편을 발현시킨다.
대안의 구체예에서, DF200-유사 항체와 같은 본 발명의 뮤린 항체를 생산하는 하이브리도마의 DNA를 변형시킨 후 발현 벡터로 삽입할 수 있는데, 예를 들어, 상동 비-인간 서열의 위치에서 코딩 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 치환하는 것에 의한다(예를 들어, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 , pp. 6851 (1984)에서 설명됨). 다른 구체예에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 가변 영역은 재조합 DNA 조작에 의해, 면역글로불린 코딩 서열을 모든 또는 일부의 비-면역글로불린 폴리펩티등 대한 코딩 서열에 결합시킬 수도 있다. 상기 방식에서, "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조되어 원래 항체의 결합 특이성을 갖는다. 일반적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대하여 치환된다.
따라서, 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 항체, 바람직하게 DF-200-유사 항체가 인간화된다. 본 발명에 따른 항체의 "인간화" 형태는 특이적 키메라 면역글로불린, 그것의 면역글로불린 사슬 또는 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원-결합 결과와 같은 것들)이며, 이것은 뮤린 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수령체 항체)이며, 여기서 수령체의 상보성-결정 영역(CDR)로부터의 잔기는 원하는 특이성, 친화성, 및 원래 항체의 역량을 유지하면서, 원래 항체(공여체 항체)으 CDR로부터으 잔기로 치환된다. 어떤 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 틀구조 잔기는 대응 비-인간 잔기로 치환될 수도 있다. 이에 더하여, 인간화 항체는 수령체 항체에서 또는 이입된 CDR 또는 틀구소 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이 변형들은 항체 성능을 더 정련하고 최적화하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 원래 항체의 영역에 대응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 일치 서열의 영역이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 일반적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 최소한 일부를 포함할 것이다. 보다 상세히는, Jones et al., Nature, 321 , pp. 522 (1986); Reichmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992)를 참조할 것.
본 발명의 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 인간화 항체는 원래 항체로부터 그것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 뮤린 또는 다른 비-인간 아미노산 잔기를 종종 "이입" 잔기라 말하며, 이것은 일반적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 필수적으로 Winter와 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321 , pp. 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, pp. 1534 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체(Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,5137호)이며, 여기서 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인은 원래의 뮤린 항체로부터의 대응 서열로 치환되었다. 실행상, 본 발명에 따른 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 원래 뮤린 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환되는 인간 항체이다.
인간화 항체를 만드는데 사용될 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인에 대한 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 이른바 "최적" 방법에 따라, 본 발명의 항체의 가변 도메인의 서열을 기지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리레 대하여 스크리닝한다. 후속하여, 마우스의 서열과 가장 근접한 인간 서열을 인 간화 항체에 대한 인간 틀구조(FR)로서 수용한다(Sims et al., J. Immunol., 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196, pp. 901 (1987)). 다른 방법은 특정 하위그룹의 경쇄 도는 중쇄의 모든 인간 항체에 대한 일치 서열로부터의 특정 틀구조를 사용한다. 동일한 틀구조가 몇몇 상이한 인간화 항체에 대하여 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 51 , pp. 1993)).
또한, 항체는 다수의 억제성 KIR 리셉터 및 다른 좋은 생물학적 특성에 대한 높은 친화성을 보유하면서 인간화되는 것이 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 각종 개념의 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보자 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 도해하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보자 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할에 대한 분석, 즉, 그것의 항원에 결합하는 후보자 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 선택되고 일치 및 이입 서열과 조합될 수 있어서, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 직접 그리고 가장 실질적으로 연루된다.
상기 설명한 바와 같이, 인간 단일클론 항체를 만드는 방법은 면역화를 위해 사용되는 마우스로서 XenoMouse®(Abgenix, Fremont, CA)를 사용하는 것이다. XenoMouse는 그것의 면역 글로불린 유전자가 기능상 인간 면역글로불린 유전자에 의해 치돤된 본 발명에 따른 뮤린 숙주이다. 따라서, 상기 마우스에 의해 생성되거나 상기 마우스의 B 세포로부터 만들어진 하이브리도마에서 생산된 항체는 이미 인간화되어 있다. XenoMouse는 본원에서 전체가 참고로 인용되는 미국 특허 제 6,162,963호에 설명되어 있다. HuMAb-MouseTM(Medarex)를 사용하여 유사한 방법이 이루어질 수 있다.
또한, 인간 항체는 면역화를 위해 인간 항체 레퍼토리를 발현시키도록 유전 조작된 다른 유전자변형 동물을 사용하거나(Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), 또는 파지 디스플레이 방법을 사용하는 항체 레퍼토리의 선별에 의한 것과 같은 각종 다른 기술들에 따라 생산될 수도 있다. 이러한 기술들은 당업자에게 공지되어 있으며 본 출원에서 개시된 단일클론 항체로부터의 출발을 실행할 수 있다.
본 발명의 항체, 바람직하게는 1-7F9- 또는 1-4F1-유사 항체는 또한 "키메라" 항체(면역글로불린)로 유도체화할 수도 있으며, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 원래 항체의 대응 서열과 동일하거나 유사한 반면, 나머지 사슬(들)은 그들이 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체, 및 이러한 항체들의 단편의 대응 서열과 동일하거나 유사하다(Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 , pp. 6851 (1984)).
본 발명의 범주 내 다른 유도체들은 기능화된 항체, 즉, 리신, 디프테리아 독소, 아브린 및 Pseudomonas exotoxin과 같은 독소, 또는 예를 들어, 90Y 또는 131I와 같은 치료적 방사선 핵종; 형광성 부분, 진단상의 방사선 동위원소 또는 이미지화 제제와 같은 검출가능 부분; 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 콘쥬게이션되거나 공유 결합되는 항체를 포함한다. 항체에 대한 이들 다른 제제들의 콘쥬게이션 또는 공유 결합 방법은 당업계에 주지되어 있다.
독소에 대한 콘쥬게이션은 세포 표면 상 상호반응성 KIR 리셉터 중 하나를 나타내는 NK 셀의 표적화 살해에 유용하다. 일단 본 발명의 항체가 이러한 세포의 표면에 결합하면, 그것은 흡수되고 독소는 세포 외부에 방출되어, 그 세포를 선택적으로 살해한다. 이러한 사용은 본 발명의 대안적 구체예이다.
검출가능 부분에 대한 콘쥬게이션은 본 발명의 항체가 진단상 목절을 위해 사용되는 경우 유용하다. 이러한 목적은 그들의 세포 표면 상에 상호반응성 KIR을 함유하는 NK 셀의 존재에 대하여 생물학적 샘플을 분석하고 살라있는 유기체에 상호반응성 KIR을 함유하는 NK 셀의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 분석 및 검출 방법은 본 발명의 대안적 구체예이다.
고형 지지체에 대한 본 발명의 항체의 콘쥬게이션은 체액과 같은 공급원으로부터 그들의 세포 표면 상에 상호 반응성 KIR을 함유하는 NK 셀의 진화도 정제를 위한 도구로서 사용된다. 이 정제 방법은 NK 셀의 결과의 정제된 개체군으로서, 본 발명의 다른 대안적 구체예이다.
약학적 조성물 및 적용
또한, 본 발명은 인간 또는 인간화 항체, 또는 그것의 단편 및 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 항체, 단편 또는 유도체는 환자에서 또는 NK 셀을 포함하는 생물학적 샘플 내에서 NK 셀 세포독성을 검출가능하게 강화하기에 유효한 양의 어떤 적당한 비히클 내에서, NK 셀의 표면에 최소한 2개의 억제성 KIR 리셉터와 상호작용하고, 그들의 억제성 신호를 감소 또는 중화하며 그들 세포의 활성을 강화한다. 본 발명에 따른 사용을 위해, 선택적으로 다른 활성제와 함께, 인간 또는 인간화 항-KIR mAb를 포함하는 약학적 조성물은 Remington: The Science and Prac-tice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995에서 개시된 바와 같이 전통적 기술에 따라서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 임의의 다른 공지된 애쥬반트 및 부형제와 함께 제조될 수도 있다. 조성물은 전통적 형태, 예를 들어, 캡슐, 정제, 에어로졸, 용액 또는 현탁액 또는 냉동 건조 분말로 나타날 수도 있다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 존재하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그것의 단편 또는 유도체를 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것이며, 상기 제형은 pH 2.0 내지 10.0이다. 제형은 버퍼 시스템, 보존제(들), 강직성 물질(들)(tonicity agents), 킬레이트화제(들), 안정화제 및 계면활성제를 더 포함할 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 약학적 제형은 액상 제형, 즉 물을 포함하는 제형이다. 이러한 제형은 일반적으로 용액 또는 현탁액이다. 본 발명의 추가적 구체예에서, 약학적 제형은 수성 용액이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수성 제형"은 최소한 약 50%w/w 물을 포함하는 제형이다. 이 와 마찬가지로, 용어 "수용액"은 최소한 약 50%w/w 물을 포함하는 용액이며, 용어 "수성 현탁액"은 최소한 50%w/w 물을 포함하는 현탁액이다.
다른 구체예에서, 약학적 제형은 냉동 건조 제형이며, 그것에 의사나 환자가 사용전에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
다른 구체예에서, 약학적 제형은 어떠한 사전 용해도 하지 않고 사용을 위해 준비가 되어 있는 건조 제형(예를 들어, 냉동 건조 또는 분무 건조)이다.
추가적 양태에서, 본 발명은 본원에서 설명된 항체의 수성 용액, 및 버퍼를 포함하는 약학적 제형에 관한 것이며, 상기 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하며, 상기 제형은 약 pH 2.0 내지 약 10.0이다.
다른 구체예에서, 본제형의 pH는 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 버퍼는 아세트산 나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산 이수소 나트륨, 인산 수소 이나트륨, 인산 나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 비신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 그것의 혼합물로 이 루어진 군으로부터 선택된다. 이들 특이적 버퍼들 중 각각 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한 약학적으로 허용가능한 보존제를 포함한다. 다른 구체예에서, 보존제는 페놀, O-크레졸, m-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 클로로부타놀, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 소디움 디히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈에토니움 클로라이드, 클로르페네센(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디옥) 또는 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 보존제는 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 보존제는 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 보존제는 5 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 존재한다. 더 다른 구체예에서, 보존제는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 열거된 특이적 보존제 중 각각 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 주지되어 있지만, 편의를 위해, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고로 한다.
추가적 구체예에서, 또한 제형은 등장성 제제를 포함한다. 한 구체예에서, 등장성 제제는 염(예를 들어, 염화 나트륨), 당, 당 알콜, 아미노 당, 아미노산(예를 들어, L-글리신, L-히드티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌 글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 및 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 또는 그것의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 적당한 당이 사용될 수 있으며, 단당류, 이당류, 또는 다당류; 및 예를 들어, 과당, 글루코스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 농말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로스-Na와 같은 수용성 글루칸을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 한 구체예에서, 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알콜은 최소한 하나의 --OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알콜 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급한 당 또는 당 알콜은 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수도 있다. 당 또는 당 알콜이 약상 제조물에서 가용성이며 본 발명의 방법을 사용하여 이루어진 안정화 효과에 불리한 효과를 내지 않는 한, 사용되는 양에 대한 정해진 한계는 없다. 한 구체예에서, 당 또는 당 알콜 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이다. 다른 구체예에서, 등장성 제제는 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 등장성 제제는 1 mg/ml 내지 7 mg/ml의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 등장성 제제는 8 mg/ml 내지 24 mg/ml의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 등장성 제제는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 상기 열거된 구체적 등장성 제제 중 각각 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 등장성 제제의 사용은 당업자에게 주지되어 있지만, 편의를 위해, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995 를 참고로 한다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한 킬레이트화제를 포함한다. 한 구체예에서, 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산, 및 그것의 혼합물들의 염으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 킬레이트화 제는 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 다른 구체예에서, 킬레이트화제는 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가적 구체예에서, 킬레이트화제는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 상기 열거된 구체적 킬레이트화제 중 각각 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다. 약학적 조성물에서 킬레이트화제의 사용은 당업자에게 주지되어 있지만, 편의를 위해, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고로 한다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한 안정제를 포함한다. 약학적 조성물에서 안정제의 사용은 당업자에게 주지되어 있지만, 편의를 위해, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고로 한다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 안정화된 액체 약학적 조성물일 수도 있으며, 상기 조성물의 치료적 활성 성분은 액체 약학적 제형 내 저장 중에 응집체 형성을 나타낼 수도 있는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "응집체 형성"은 폴리펩티드 분자간 물리적 상호작용을 의도하여 올리고머의 형성을 일으키며, 이것은 용액으로부터 침전하는 가용성, 또는 대형 가시성 응집체를 남길수도 있다. 용어 "저장 중"은 일단 제조되었지만, 피험체에 즉시 투여되지 않는 액체 약학적 조성물 또는 제형을 의도한다. 그 보다는, 제조 후에, 그것은 저장을 위해, 액상형, 냉동 상태, 또는 피험체에 투여하기 적합한 액상형 또는 기타 제형으로 이후에 재구성되기 위한 건조 제형으로 포장된다. 용어 "건조 제형"은 약체 약학적 조성물 또는 제형이 냉동 건조(즉, 동결 건조; 예를 들어, 하기 참조: Williams and PoIIi (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59), 스프레이 건조(하기 참조: Masters (1991) in Spray-Drying Hand- book (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11 :12-20), 또는 공기 건조(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)에 의해 건조되는 것을 의도한다. 액체 약학적 조성물의 저장 중에 폴리펩티드에 의한 응집체 형성은 폴리펩티드의 생물학적 활성에 불리하게 작용하여, 약학적 조성물의 치료적 효능의 손실을 가져올 수 있다. 이에 더하여, 응집체 형성은 폴리펩티드-함유 약학적 조성물이 주입 시스템을 사용하여 투여되는 경우, 관, 막, 또는 펌프의 차단과 같은 기타의 문제를 야기할 수도 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 저장 중에 폴리펩티드에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 포함할 수도 있다. "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의도하며, 여기서 어떤 제공된 아미노산은 유리 염기 형태 또는 그것의 염 형태로 존재한다. 아미노산의 조합이 사용되는 경우, 모든 아미노산들이 유리 염기 형태로 존재할 수도 있거나, 모두가 그들의 염 형태로 존재할 수도 있으며, 또는 일부가 유리 염기 형태로 존재하면서 동시에 나머지들은 염 형태로 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 아미노산들은 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 및 글루탐산과 같은 하전된 측쇄를 함유하는 것들이다. 특정 아미노산(예를 들어, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 그들의 혼합물)의 입체 이성질체(즉, L, D, 또는 그들의 혼합물) 또는 이들 입체 이성질체의 조합은 특정 아미노산이 유리 염기 형태 또는 염 형태로 존재하는 한 본 발명의 약학적 조성물로 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, L-입체 이성질체가 사용된다. 또한, 본 발명의 조성물들은 이들 아미노산의 유사체와 함께 제조될 수도 있다. 용어 "아미노산 유사체"는 본 발명의 액상 약학적 조성물의 저장 중에 폴리펩티드에 의한 응집체 형성을 감소시키는 원하는 효과를 가져오는 천연 발생 아미노산의 유도체를 의도한다. 적당한 아르기닌 유사체는 예를 들어, 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하며, 적당한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고 적절한 시스테인 유사체는 S-메틸-K 시스테인을 포함한다. 다른 아미노산과 함께, 아미노산 유사체는 유리 염기 형태 또는 염 형태로서 조성물에 통합된다. 본 발명의 추가적 구체예에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 예방하거나 지연시키기에 충분한 농도로 사용된다.
추가적 구체예에서, 메티오닌(또는 다른 황 아미노산 또는 아미노산 유사체)을 첨가하여 메티오닌 설폭시드에 대한 메티오닌 잔기의 산화를 억제할 수도 있는데, 이것은 치료제로 작용하는 폴리펩티드가 이러한 산화에 취약한 최소한 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드인 경우이다. 용어 "억제하다"는 시간에 걸쳐서 메티오닌 산화 종의 최소한의 축적을 의도한다. 메티오닌 산화를 억제하여 적절 한 분자 형태로 폴리펩티드를 더 많이 보유한다. 메티오닌의 어떤 입체 이성질체(L 또는 D) 또는 그것의 조합이 사용될 수 있다. 첨가될 양은 메티오닌 설폭시드의 양이 조절제에 대하여 허용가능한 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양일 것이다. 일반적으로, 이것은 상기 조성물인 약 10% 이하 내지 약 30% 이하의 메티오닌 설폭시드를 함유함을 의미한다. 일반적으로, 이것은 메티오닌 잔기에 대하여 첨가된 메티오닌의 비율이 10:1 내지 약 100:1과 같이, 약 1:1 내지 약 1000:1의 범위에 이르도록 메티오닌을 첨가하여 이루어질 수 있다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한 고분자량 폴리머 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 포함한다. 한 구체예에서, 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로스 또는 그것의 유도체(예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황-함유 물질, 및 다른 염(예를 들어, 염화나트륨)으로부터 선택된다. 이들 구체적 안정제중 각각 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성한다.
또한, 약학적 조성물은 본원에서 치료적 활성 폴리펩티드의 안정성을 더 증가시키는 추가적 안정제를 포함할 수도 있다. 본 발명에 관하여 특히 관심있는 안정제는 메티오닌 및 메티오닌 산화에 대하여 폴리펩티드를 보호하는 EDTA, 및, 냉동-해동 또는 기계적 전단과 연관된 응집에 대하여 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한, 계면활성제를 포함한다. 한 구체예에서, 계면활성제는 세제, 에톡시화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 차단 폴리머(예를 들어, Pluronic® F68, 폴록사머 188 및 407, Triton X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체로서, 알킬화 및 알콕시화 유도체와 같은 것들(트윈, 예를 들어, Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세리드 또는 그것의 에톡시화 유도체, 디글리세리드 도는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알콜, 글리세롤, 렉틴 및 인지질(예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 인지질의 유도체(예를 들어, 디팔미토일 포스파티드산) 및 리소인지질(예를 들어, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린 및 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕시(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예를 들어, 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 머릿기가 콜린, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시놀, 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌인 상기 극성 머릿기의 변형, 및 글리세로인지질(예를 들어, 세팔린), 글리세로당인지질(예를 들어, 갈락토피라노시드), 스핑고당지질(예를 들어, 세라마이드, 강글리오시드), 도데실포스포콜린, 달걀 리소레시틴, 후시딘산 유도체-(예를 들어, 소디움 타우로-디히드로푸시데이트 등), 길 사슬 지방산 및 그것의 염 C6-C12(예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 도는 산성 아미노산 어떤 조합을 포함하는 펩티드의 Nα-아실화 유도체, 중성 아미노산 및 2개의 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 Nα-아실화 유도체, DSS(도큐세이트 나트륨, CAS 등록 번호 [577-11-7]), 도큐세이트 칼슘, CAS 등록 번호 [128-49-4]), 도큐세이트 칼륨, CAS 등록 번호 [7491-09-0]), SDS(황산 도데실 나트륨 또는 황산 라우릴 나트륨), 카프릴산 나트륨, 콜산 또는 그것의 유도체, 담즙산 및 그것의 염 및 글리신 또는 타우린 콘쥬게이트, 우르소데옥시콜산, 소디움 콜레이트, 소디움 데옥시콜레이트, 소디움 타우로콜레이트, 소디움 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-아미노-1-프로판설포네이트, 음이온(알킬-아릴-설포네이트) 1가 계면활성제, 쌍성이온 계면활성제(예를 들어, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 양이온 계면활성제(제 4 암모늄 염기)(예를 들어, 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제(예를 들어, 도데실 β-D-글루코피라노시드), 프로필렌 옥시드 및 에틸렌 옥시드의 에틸렌디아민에 대한 순차적 첨가로부터 유도된 4관능성 블록 공중합체인 폴록사민(예를 들어, Tetronic's), 또는 이미다졸린 유도체, 또는 그것의 혼합물의 군으로부터 선택된 계면활성제로부터 선택된다.
약학적 조성물에서 계면활성제의 사용은 당업자에게 주지되어 있지만; 편의 를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고로 한다.
추가적 구체예에서, 제형은 또한 다른 시중 구매가능하고 적절한 프로테아제 억제제도 사용될 수도 있지만, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 벤즈아미딘 HCl과 같은 프로테아제 억제제를 포함한다. 프로테아제 억제제의 사용은 자체 촉매 작용을 억제하기 위해 프로테아제의 치모겐을 포함하는 약학적 조성물에서 특히 유용하다.
또한, 다른 성분들이 본 발명의 약학적 제형에 존재할 수도 있다. 이러한 첨가 성분들은 습윤제, 유화제, 항산화제, 팽화제, 강성 조절제, 킬레이트화제, 유성 비히클, 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쌍성이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수도 있다. 이러한 첨가 성분들은 바람직하게는 본 발명의 약학적 제형의 전체적 안정성에 불리한 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 다른 항체를 함유하는 약학적 조성물은 예를 들어, 피부 및 점막 부위와 같은 국소 부위로서, 흡수를 우회하는, 예컨대 동맥내, 정맥내, 심장내 투여, 및 흡수를 수반하는, 예컨대, 피부내, 피하내, 근육내 또는 복부내 투여와 같은 몇몇 부위에서 이러한 치료가 필요한 환자에 투여될 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 이러한 치료가 필요한 환자에 예를 들어, 혀, 혀 밑, 볼, 구강내, 구강, 위 및 장 내, 코, 폐(예를 들어, 세기관지 및 꽈리 또는 그것의 조합), 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 눈(예를 들어, 결막), 요 관, 및 비경구와 같은 몇가지 루트의 투여를 통할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 복합 에멀젼, 포말, 고약(slaves), 페이스트, 회반죽(plaster), 연고(ointment), 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐(예를 들어, 경질 젤라틴 켑슐 및 연질 젤라틴 캡슐), 좌약, 직장 캡슐, 점적약, 젤, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안약, 안과용 연고, 안과용 린스, 질좌제, 질 고리, 질 연고, 주사액, 예를 들어, 그 자리에서, 겔화, 그 자리에서, 세팅, 그 자리에서, 침전, 그 자리에서 결정화되는 것과 같이, 자리에서 변형되는 용액, 주입액, 및 이식물로 투여시킬 수도 있다.
본 발명의 조성물은 항체의 안정성을 더 향상시키고, 생물학적 이용가능성을 증가시키고, 용해도를 증가시키고, 역효과를 감소시키고, 당업자에게 주지되어 있는 생체 리듬 치료를 이루고, 환자의 수용 상태를 조합시키거나 그것들의 어떤 조합을 위해 예를 들어, 공유결합, 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용, 약물 담체, 약물 송달 시스템 및 개선된 약물 송달 시스템을 통해 더 화합되거나 부착될 수도 있다. 담체, 약물 송달 시스템 및 개서된 약물 송달 시스템은 폴리머, 예를 들어, 셀룰로스 및 유도체, 다당류, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 녹말 및 유도체, 폴리(비닐 알콜), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 폴리머, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 그것의 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어, 알부민, 젤, 예를 들어, 터모겔링(thermogelling) 시스템, 예를 들어, 당업자에게 주지되어 있는 블록 공중합체 시스템, 미셀, 리포솜, 마이크로스피어, 나노입자, 액정, 및 그것의 분산, 지질-물 시스템에서 상 행동에 관하여 당업자에게 주지 되어 있는 L2 상 및 그것의 분산, 중합체 미셀, 복합 에멀젼, 자가 에멀젼화, 자가-마이크로에멀젼화, 시클로덱스트린 및 그것의 유도체, 및 덴드리머를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 예를 들어, 모두가 당업자에게 주지되어 있는 장치인 정량 측정 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 사용하여, 항체의 폐 투여를 위한 고형, 반고형, 분말형 및 용액의 조성물에 유용하다.
본 발명의 조성물은 특히 제어, 지속, 연장, 지연, 및 저속 방출 약물 송달 시스템의 제형에서 유용하다. 보다 구체적으로, 이에 한정되지는 않지만, 조성물은 당업자에게 주지되어 있는 비경구 제어 방출 및 서방형 시스템(두가지 시스템은 투여의 횟수를 몇배 감소시킴)의 제형에 유용하다. 훨씬 더 바람직하게, 제어 방출 및 서방형 시스템은 피하 투여된다. 본 발명의 범주를 제한하지 않고서, 제어된 방출 시스템 및 조성물에 유용한 예는 히드로겔, 유성 겔, 액정, 중합체 미셀, 마이크로스피어, 나노입자이다.
본 발명의 조성물에 유용한 제어된 방출 시스템을 생산하는 방법은 결정화, 축합, 공동-결정화, 침전, 공동-침전, 에멀젼화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 스프레이 건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이션, 상 분리, 마이크로스피어를 생산하기 위한 용매 증발, 분출 및 초임계 유체 과정을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 Handbook of Pharrrjaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) and Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)를 참고로 한다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜 유사 주사기를 이용하여 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥내 주사에 의해 수행할 수도 있다. 대안으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행할 수 있다. 추가적 선택사항은 코 또는 폐 스프레이의 형태로 항체의 투여를 위한 용액 또는 현탁액일 수도 있는 조성물이다. 다른 선택사항으로서, 본 발명의 항체를 함유하는 약학적 조성물은 또한, 예를 들어, 바늘이 없는 주사에 의하거나 패치, 선택적으로 전리요법 패치로부터의 경피성 투여, 또는 예를 들어, 볼 투여와 같은 경점막 투여에 적응시킬 수 있다.
항체는 폐 약물 송달에 적합한 장치의 공지된 유형 중 임의의 것을 사용하여, 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서 비히클 내 폐 루트를 통해 투여할 수 있다. 이들의 예는 폐 약물 송달을 위한 에어로졸-생성의 3가지 일만적 유형을 포함하지만, 이에 한정되지는 않으며, 제트 또는 초음파 분무기, 정량 측정 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수도 있다(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453 참조).
표준화 테스트 방법을 기초로 하여, 입자의 공기역학 직경(da)은 참조 표준 구형 입자의 단위 밀도(1 g/cm3)에 대한 기하학적 평균 직경으로서 정의된다. 더 간단한 경우에, 구형 입자에 대하여, da는 하기 식으로 설명되는 바와 같이 밀도비의 제곱근의 함수로서 참조 직경(d)에 관련한다:
Figure 112007000396302-pct00001
이러한 관계에 대한 변형은 비-구형 입자에 대하여 발생한다[0249](Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조). 용어 "MMAD" 및 "MMEAD"가 잘 기술되어 있으며 당업계에 주지되어 있다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998) 379-385 참조). 공기역학적 중량 평균 직경(MMAD) 및 유효 공기역학적 중량 평균 직경(MMEAD)이 호환성있게 사용되며, 통계적 파라미터이며, 실제 형상, 크기, 또는 밀도와 별개로, 폐에 침착되는 그들의 잠재력에 관한 에어로졸 입자의 크기를 실험적으로 설명한다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (199S)" 379-385 참조). MMAD는 보통 공기중에서 입자 관성 행동을 측정하는 도구인 임팩터(impactor)로 얻어낸 측정치로부터 계산된다.
추가적 구체예에서, 제형은 10 μm 이하, 더 바람직하게는 1 내지 5μm, 가장 바람직하게는 1 내지 3 μm의 에어로졸 입자의 MMAD를 달성하기 위해, 분무화와 같은 임의의 공지된 에어로졸화 기술에 의해 에어로졸화할 수 있다. 바람직한 입자 크기는 단백질이 최적으로 흡수되는 곳인 심폐로 약물을 송달하기에 가장 효과적인 크기를 기초로 한다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조).
항체를 포함하는 폐 제형의 심폐 침착은 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 저속 흡입(예를 들어, 30 L/분), 호흡 중지 및 발동의 시기와 같은 흡입 기술의 변형을 사용하여 보다 최적화시킬 수도 있다.
용어 "안정화 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리화학적 안정성을 갖는 제형을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 단백질 제형의 용어 "물리적 안정성"은 수소성 표면 및 경계면과 같이, 불안정화하는 경계면 및 표면과의 열적-기계적 응력 및/또는 상호작용에 단백질을 노출시킨 결과로서, 단백질의 생물학적으로 비활성인/비활성이거나 가용성인 응집체를 형성하는 단백질의 경향에 대하여 나타낸다. 수성 단백질 제형의 물리적 안정성은 다양한 시간 기간 동안 다른 온도에서 기계적/물리적 응력(예를 들어, 교반)에 적합한 용기(예를 들어, 카트리지 또는 바이알)에 채워진 제형을 노출시킨 후 시각적 조사 및/또는 혼탁도 측정에 의해 평가된다. 제형의 시각적 조사는 어두운 배경이 있는 날카롭게 집중된 광선에서 수행한다. 제형의 혼탁도는 예를 들어, 0 내지 3의 크기로 혼탁도의 등급을 랭킹하는 시각 점수를 특징으로 한다(어떤 혼탁도도 보이지 않는 제형은 시각 점수 0에 해당하고, 일광에서 시각 혼탁도를 보이는 제형은 시각 점수 3에 해당함). 제형은 그것이 일광에서 시각적 혼탁도를 보이는 경우, 단백질 응집과 관련하여 물리적 불안정성으로 분류된다. 대안으로, 제형의 혼탁도는 당업자에게 주지된 간단한 혼탁도 측정으로 평가될 수 있다. 또한, 수성 단백질 제형의 물리적 안정성은 분광제 또는 단백질 배좌 상태의 프로프를 사용하여 평가될 수 있다. 프로브는 바람직하게는 단백질의 본래의 것이 아닌 이형태체에 우위적으로 결합하는 소분자이다. 단백질 구조의 소분자 분광 프로브의 한 예는 Thioflavin T이다. Thioflavin T는 아밀로이드 소섬유의 검출을 위해 널리 사용된 형광성 염료이다. 소섬유, 및 가능한 경우 다른 단백질 구성 또한 존재하는 때에, Thioflavin T가 소섬유 단백질 형태에 결합되는 경우, 약 450 nm에서 새로운 최대 자극 및 약 482 nm로 증가된 방출을 발생시킨다. 결합되지 않은 Thioflavin T는 상기 파장에서 필수적으로 비형광성이다.
다른 소분자는 본래의 상태로부터 본래의 것이 아닌 상태로의 단백질 구조상 변화에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, "소수성 패치"는 단백질의 노출된 소수성 패치에 우위적으로 결합하는 것을 프로브한다. 소수성 패치는 일반적으로 그것의 본래의 상태인 단백질의 3차 구조 안에 묻혀지지만, 단백질로서 노출되어 폴딩하지 않거나 변성된다. 이들 소분자, 분광 프로브의 예는 안트라센, 아크리딘, 펜안트롤린 등과 같은 방향족, 소수성 염료이다. 다른 분광 프로브들은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 및 발린 등과 같은 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체와 같은 금속 아미노산 복합체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 단백질 제형의 "화학적 안정성"은 본래의 단백질과 비교하여 잠재적인 보다 적은 생물학적 효능 및/또는 잠재적인 증가된 면역원성 특성을 갖는 화학적 분해 산물의 형성을 야기하는 단백질 구조의 화학적 공 유 결합의 변화를 의미한다. 각종 화학적 분해 산물들은 본래의 단백질의 유형 및 특성 그리고, 단백질이 노출되는 환경에 따라 형성될 수 있다. 화학적 분해의 제거는 아마도 완전히 피할수는 없을 것이며 화학적 분해 산물의 증가량은 종종 저장 및 당업자에게 주지된 단백질 제조의 사용 중에 나타난다. 대부분의 단백질들은 탈아미노화하기 쉬우며, 탈아미노화 과정은 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기 내 측쇄 아미노기가 가수분해되어 유리 카르복시산을 형성한다. 다른 분해 경로는 고분자 변형 산물의 형성을 포함하며, 이때 2개 이상의 단백질 분자가 공유 결합된 다이머, 올리고머 및 폴리퍼 분해 산물의 형성을 야기하는 트랜스아미드화 반응 및/또는 이황화 상호작용을 통해 서로 공유결합된다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. TJ. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). (예를 들어 메티오닌 잔기의) 산화는 화학적 분해의 다른 변이체로 언급될 수 있다. 단백질 제형의 화학적 안정성은 다른 환경적 조건에 노출시킨 후 다양한 시간-지점에서 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다(분해 산물의 형성은 종종 예컨대 온도 증가에 의해 가속화될 수 있음). 각 개별적 분해 산물의 양은 종종 각종 크로마토그래피 기술(예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 사용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라 분하 산물의 분리에 의해 결정된다.
따라서, 상기 개략된 바와 같이, "안정화 제형"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리 화학적 안정성을 의미한다. 일반적으로, 제형은 유효 기간이 될때까지 사용 및 저장(권장된 사용 및 저장 조건에 따름) 중에 안정해야만 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 6주 이상의 사용 및 3년 이상의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 4주 이상의 사용 및 3년 이상의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 4주 이상의 사용 및 2년 이상의 저장 동안 안정하다.
본 발명의 추가적 구체예에서, 항체를 포함하는 약학적 제형은 2주 이상의 사용 및 2년 이상의 저장 동안 안정하다.
따라서, 상기 설명한 바와 같이, 이들 조성물에서 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체들은 이온 교환체; 알루미나; 알루미늄 스테아레이트; 레시틴; 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질; 포스페이트 및 글리신과 같은 완충 물질; 소르브산; 칼륨 소르베이트; 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물; 물; 프로타민 설페이트, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 및 아연 염과 같은 염 또는 전해질; 콜로이드 실리카; 삼규산 마그네슘; 폴리비닐 피롤리돈; 셀룰로스-기재 물질; 폴리에틸렌 글리콜; 소디움 카르복시메틸셀룰로스; 폴리아크릴레이트; 왁스; 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머; 폴리에틸렌 글리콜; 및 양모지를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 환자 또는 생물학적 샘플 내 NK 셀의 활성을 강화하는 방법에서 사용될 수도 있다. 이 방법은 상기 조성물을 상기 환자 또는 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 진단 및 치료상의 목적 모두에 유용할 것이다.
생물학적 샘플과 함께 사용하기 위해, 항체 조성물은 샘플의 특성(액체 또는 고체)에 따라, 샘플과 단순히 혼합시키거나 직접 가하여 투여할 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 적당한 장치(플레이트, 포우치, 플라스크 등)에서 항체와 직접 접촉할 수도 있다. 환자와 함께 사용하기 위해, 조성물은 환자에 대한 투여용으로 제조되어야 한다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 볼을 통해, 질을 통해 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수도 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "비경구"는 피하, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 윤활막 내, 복장 내, 경막 내, 간 내, 병소 내 및 두개골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 바람직하게, 조성물은 경구적으로, 복막 내로 또는 정맥 내로 투여된다.
본 발명의 조성물의 멸균 주사가능 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수도 있다. 이 현탁액들은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁를 사용하는 당업계 공지 기술에 따라 제조될 수도 있다. 멸균 주사가능 제조물은 또한 예를 들어, 1,3-부탄디올과 같이, 비독성인 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 이에 더하여, 멸균, 고정 오일은 용매 또는 현탁 배지로 편리하게 이용된다. 이러한 목적에서, 어떤 부드러운 고정 오일은 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 사용될 수도 있다. 올레산과 같은 지 방산 및 그것의 글리세리드 유도체는 특히 그들의 폴리옥시에틸화 버전으로, 올리브 오일 또는 피마자유와 같은 천연의 약학적으로 허용가능한 오일이기 때문에, 주사가능 제조물에서 유용하다. 또한, 이들 오일 용액 또는 현탁액들은 카르복시메틸 셀룰로스와 같은 길사슬 알콜 희석제 또는 분산제 또는 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용가능한 투여량 형태의 제형에서 보통 사용되는 유사한 분산 제제를 함유할 수도 있다. Tween, Span 및 약학적으로 허용가능한 고체, 약체, 또는 기타 투여량 형태의 제조에서 통상적으로 사용되는 유화제 또는 생물학적 이용률 향상 약물과 같은, 기타의 통상적으로 사용되는 계면활성제가 제형의 사용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 임의의 경구 허용가능 투여량 형태로 경구 투여될 수도 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 콘스타치를 포함한다. 또한 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제들이 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 콘스타치를 포함한다. 수성 현탁액이 경구 사용을 위해 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 화합시킨다. 원하는 경우, 특정 감미료, 조미로 또는 색소가 첨가될 수도 있다.
대안으로, 본 발명의 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수도 있다. 이들은 상기 제제를 실온에서는 고형이지만 직장 온도에서 액체이며 따라서 직장에서 용해되어 약물을 방출하는 적당한 무자극성 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 재료들은 카카오 기름, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한 다.
본 발명의 조성물들은 또한 국소적으로 투여될 수도 있으며, 특히 치료의 표적이 눈, 피부, 또는 하부 장관을 포함하는 국소적 적용에 의해 용이하게 접근가능한 부위 또는 기관을 포함하는 경우이다. 적당한 국소 제형은 각각의 이들 부위 또는 기관을 위해 용이하게 제조된다.
하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌약 제형(상기 참조) 또는 적당한 관장 제형으로 이룰 수 있다. 또한, 국소-경피성 패치가 사용될 수도 있다.
국소 적용을 위해, 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 연고로 제조될 수도 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 광유, 액체 바세린, 백색 바세린, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 어멀젼화 왁스 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 대안으로, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 로션 또는 크림으로 제조될 수 있다. 적당한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
안과적 사용을 위해, 조성물은 등장성, pH 조절된 멸균 식염수 내 미세화된 현탁액, 또는 바람직하게는 등장성, pH 조절된 멸균 식염수 내 용액으로서, 벤질알코니움 클로라이드와 같은 보존제를 포함하거나 이를 포함하지 않고서 제조될 수도 있다. 대안으로, 안과적 사용을 위해, 조성물은 바세린과 같은 연고로 제조될 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 코 분무제 또는 흡입제에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 조성물들은 약학적 제형의 당업계 주지된 기술에 따라 제조되며 벤질 알콜 또는 다른 적절한 보존제, 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 탄화플루오르, 및/또는 다른 존통적 용해제 또는 분산제를 사용하여, 염수 내 용액으로서 제조될 수도 있다.
몇가지 단일클론 항체들은 임상적 상황에서 효능있는 것으로 나타났으며, 예컨대 Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) 또는 Xolair (Omalizumab)와 같은 것들이며 유사한 투여 요법(즉, 제형 및/또는 투여량 및/또는 투여 프로토콜)이 본 발명의 항체와 함께 이용될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물 내 항체의 투여를 위한 스케쥴 및 투여량은 이들 제품에 대한 공지의 방법에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들어, 제조업자의 설명서를 사용한다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 존재하는 항체는 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL) 1회용 바이알에서 10 mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. 상기 제품은 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 2수산화물 시트르산 나트륨, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 주사용 멸균수로 IV 투여를 위해 제조된다. pH는 6.5로 조절된다. 본 발명의 약학적 조성물 내 항체에 대한 전형적인 적절한 투여량 범위는 약 10 mg/m2 내지 500 mg/m2일 수도 있다. 그러나, 이들 스케쥴은 본보기이며 상기 최적 스케쥴 및 투약 계획은 임상적 실험에서 결정되어야 하는 약학적 조성물 내 특정 항체의 친화도 및 허용도를 고려하여 적응시킬 수 있는 것으로 해석된다. 24시간, 48시간, 72시간 또는 1주 혹은 1개월 동안 NK 셀을 포화시키는 본 발명의 약학적 조성물 내 항체의 주사량 및 스케쥴은 인간 및 비인간 포유동물 내 항체 및 항체의 약물 동력학적 파라미터의 친화도를 고려하여 결정할 것이다.
다른 구체예에 따라, 본 발명의 항체는 항체가 투여되는 특정한 치료적 목적을 위해 통상적으로 이용되는 제제를 비롯하여, 다른 치료제를 더 포함할 수도 있다. 추가적 치료제는 통상적으로 치료될 특정 질병 또는 상태에 대한 단독 요법에서 그 제제에 대하여 일반적으로 사용되는 양으로 조성물내에 존재할 것이다. 이러한 치료제들은 암의 치료에서 사용되는 치료제, 감염성 질병을 치료하는데 사용되는 치료제, 다른 면역요법에서 사용되는 치료제, 사이토카인(IL-2 또는 IL-5와 같은 것), 기타 항체 및 다른 항체들의 단편을 포함하지만, 여기에 한정되지는 않는다.
대안의 구체예에서, 최소한 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 유전자 산물에 존재하는 공통의 결정인자에 결합하는 항체(상기 항체는 본 발명의 상기 2개의 상이한 인간 억제성 KIR 리셉터 중 최소한 하나를 발현시키는 NK 셀 상의 NK 셀 세포독성의 KIR-매개 억제를 중화할 수 있음)는 인간 또는 비인간 포유동물 내에서, 단독으로 또는, 종양, 또는 감염의 부위에 표적 송달 하기 위해 다른 물질과 함께 리포솜으로 통합될 수도 있다("면역리포솜"). 이러한 다른 물질들은 유전자 요법용 유전자의 송달을 위한 또는 안티센스 RNA의 송달을 위한 핵산, NK 셀에서 유전자를 억제하기 위한 RNAi 또는 siRNA, 또는 NK 셀의 표적화 살해를 위한 독소 또는 약물을 포함한다.
예를 들어, 암의 치료를 위해 수많은 치료제들이 이용가능하다. 본 발명의 항체 조성물 및 방법은 특정 질병, 특히 종양, 암 질병, 또는 환자가 보이는 기타 질병 또는 질환의 치료에서 일반적으로 사용되는 임의의 다른 방법들과 화합될 수도 있다. 특정 치료 접근법이 그 자체로 환자 상태에 대하여 해로운 것으로 알려져 있지 않고, 본 발명의 약학적 조성물 내 항체의 활성에 현저히 반하지 않는 한, 본 발명과의 조합이 고려된다.
고형암 치료와 관련하여, 본 발명의 약학적 조성물은 외과 수술, 방사선 요법, 화학요법 등과 같은 전통적 접근법과 조합하여 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물이 외과 수술 또는 방사선 처치와 동시에, 전에, 또는 이후에 사용되거나, 전통적인 화학요법, 방사선 요법 또는 항-엔지오제네시스 제제, 또는 표적화된 면역독소 또는 코아규리간드(coaguligands)와 함께, 전에, 또는 이후에 투여되는 조합 요법을 제공한다.
하나 이상의 제제가 치료적 투약 계획에서 본 발명의 항체-함유 조성물과 조합되어 사용되는 경우, 각각의 치료법이 분리하여 수행되는 경우 관찰된 효과가 조합된 결과에 있어서 부가되도록 요구되지는 않는다. 최소한의 부가 효과가 바람직하지만, 상기 단일 요법 중 하나에 대한 임의의 증가된 항암 효과가 이로울 것이다. 또한, 이것이 가능하고 이롭더라도, 상승 효과를 보이는 조합 치료가 특히 필요하지 않다.
조합된 항암 요법을 실행하기 위해, 동물 내 그들의 조합된 항암 활성을 이 루기에 효과적인 방식으로 본 발명의 항체 조성물을 다른 항암제와 함께 환자에 단순히 투여할 것이다. 따라서, 상기 제제들은 종양 맥관구조 내 그들의 조합된 존재 및 종양 환경 내 그들의 조합된 작용을 야기하기에 효과적인 양 및 효과적인 시간의 기간 동안 제공될 것이다. 이 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 항체 조성물 및 항암제는 동시에, 하나의 조합된 조성물로서, 또는 동일하거나 상이한 투여 루트를 사용하는 2개의 개별 조성물로서 환자에 투여될 수도 있다.
대안으로, 본 발명의 항체 조성물의 투여는 예를 들어, 몇 분 내지 몇 주 및 몇 달의 범위에 이르는 간격으로, 항암제 처리 보다 선행하거나, 또는 그것에 뒤따를 수도 있다. 항암제 및 본 발명의 항체 조성물 내 항체는 암에 대하여 유리하게 조합된 효과를 발휘한다는 것이 확실할 것이다. 예컨대, 본 발명의 mAb는 호지킨 림프종(NHL)에 걸린 환자에 투여될 수도 있다. 이러한 환자들은 일반적으로 리툭시맙의 조합 및 CHOP로 알려진 화학요법제의 조합으로 처리된다. 따라서, 본 발명의 항-KIR 항체들은 제제들이 동일자에, 또는 장기간 치료로서, 상이한 날에 제공되는 치료 스케쥴에서 모든 제제들의 투여를 조합시킴으로써, 리툭시맙 및 CHOP으로의 치료를 겪는 NHL 환자들을 치료하는데 사용될 수도 있다.
다른 항암제들은 본 발명의 항-KIR 항체 조성물의 투여 전에, 동시에, 또는 이후에 제공될 수도 있다. 그러나, 항체의 면역콘쥬게이트가 본 발명의 항체 조성물에서 사용되는 경우, 각종 항암제가 동시에 또는 순차적으로 투여될 수도 있다.
어떤 상황에 있어서, 치료의 시간 기간을 현저히 연장시키는 것이 바람직할 수도 있으며, 이때 각각의 항암제의 투여 또는 항암 처치 및 본 발명의 항체 조성 물의 투여 사이에 며칠(2,3,4,5,6 또는 7일), 몇주(1,2,3,4,5,6,7 또는 8주) 또는 심지어 몇 개월(1,2,3,4,5,6,7 또는 8 개월)이 경과한다. 이것은 외과 수술 또는 화학요법과 같이, 항암 치료가 종양을 실질적으로 파괴하도록 의도되고 본 발명의 항체 조성물의 투여가 미세전이 또는 종양 재성장을 막도록 의도되는 상황에서 이로울 수 있다.
또한, 본 발명의 항-KIR 항체-기재 조성물 또는 항암제 중 하나 이상의 투여가 이용될 것으로 계획된다. 이들 제제는 상호교환가능하게, 격일 또는 격주로 투여되거나; 또는 본 발명의 항-KIR 항체 조성물을 포함하는 치료의 사이클 다음, 항암제 요법의 사이클로 투여될 수도 있다. 어떤 사건에서, 조합 요법을 사용하여 종양 퇴행을 달성하기 위해, 요구되는 모든 것은 투여의 시간에 관계없이 항암 효과를 발휘하기에 효과적인 조합된 양으로 모든 제제를 송달하는 것이다.
외과 수술에 있어서, 어떤 시술은 본 발명과 함께 실행될 수도 있다. 방사선 요법과 관련하여, 암 세포 내에 국소적으로 DNA 손상을 일으키는 어떤 메카니즘이 고려되며, 예컨대, 감마-방사선 요법, X-레이, UV-방사선 요법, 마이크로파 및 전자 방출 등과 같은 것이고, 이것은 표적화 항체 또는 다른 표적화 수단과 함께 사용될 수도 있다.
다른 양태에서, 면역조절 화합물 또는 투약 계획은 본 발명의 항체 조성물과 함께 또는 그것의 일부로서 투여될 수도 있다. 면역조절 화합물의 바람직한 예는 사이토카인을 포함한다. 다양한 사이토카인들이 이러한 조합 접근법에서 사용될 수도 있다. 본 발명에 의해 고려되는 조합에서 유용한 사이토카인의 예는 IL-1 알파 IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21 , TGF-베타, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-알파, TNF-베타, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마를 포함한다. 조합 치료 또는 본 발명의 조성물에서 사용되는 사이토카인은 환자의 상태 및 사이토카인의 상대적 독성과 같은 임상적 지표와 일치하는, 표준 투약 계획에 따라 투여된다. 본 발명의 항체 조성물과 함께, 또는 그것의 일부로서 투여될 수도 있는 다른 면역조절 화합물들은 림프구 상의 다른 억제 리셉터에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 상기 항체는 항 CTLA4 항체, 또는 항-CD94/NKG2A 항체(예를 들어, 미국 공개 특허 번호 20030095965호 참조)와 같은 항체들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 당업계 공지되어 있는 이들 분자의 변이체 및 유도체는 이에 더하여서 또는 대안으로 이러한 방법들에서 사용될 수 있으며, 적절하게 본 발명의 조성물로 통합될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물을 포함하는 상호반응성, 차단성, 및/또는 억제성 항-KIR 항체는 화학요법 또는 호르몬 요법제와 함께 투여되거나 이것을 더 포함할 수도 있다. 다양한 호르몬 요법제 및 화학요법제가 본원에서 개시된 조합 치료법에서 사용될 수도 있다. 본보기로 고려되는 화학요법제는 알킬화제, 항대사제, 세포독성 항생제, 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 아드리아마이신, 탁티노마이신, 미토마이신, 카미노마이신, 다우노마이신, 독소루비신, 타목시펜, 탁솔, 탁소테어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 에토포시드(VP-16), 5-플루오로우라실(5FU), 시토신 아라비노시드, 시클로포스파미드, 티오테파, 메토트렉사트, 캄포 테신, 악티모마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP), 아미노프테린, 콤브레타스타틴(들) 및 그것의 유도체 및 프로드러그를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
호르몬제는 예를 들어, 류프로렐린, 고세렐린, 트립토렐린, 및 부세렐린과 같은 LHRH 아고니스트; 타목시펜 및 토레미펜과 같은 항에스트로겐; 플루타미드, 닐루타미드, 시프로테론 및 비칼루타미드와 같은 항엔드로겐제; 아나스트로졸, 엑세메스테인, 레트로졸 및 파드로졸과 같은 아로마타제 억제제; 및 메드록시, 클로르마디논 및 마제스트롤과 같은 프로게스타젠을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
당업자에게 이해되는 바와 같이, 화학요법제의 적절한 양은 대략적으로 임상 요법에서 이미 사용된 것들일 것이며, 이때 화학요법은 단독으로 또는 다른 화학요법제와 함께 투여된다. 단지 예로써, 시스플라틴, 및 다른 DNA 알킬화 제제가 이용될 수도 있다. 시스플라틴은 총 3개의 코스 동안 3주 마다 5일 동안 20 mg/m2의 임상적 적용에 사용된 효험있는 투여량으로 암을 치료하는데 널리 사용되었다. 시스플라틴은 경구로 흡수되지 않으므로 정맥 주사, 피하 주사, 종양내 주사 또는 복막내 주사를 통해 송달되어야 한다.
추가적으로 이용가능한 화학요법제는 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물, 및 폴리뉴클레오티드 전구체의 합성 및 충실도를 파괴하는 제제를 포함한다. 조합 요법을 위한 많은 전형적인 화학요법제는 미국 특허 제 6,524,583호의 표 C에 열거되며, 이 제제 및 지시의 개시는 구체적으로 본원에서 참고로서 인용된다. 각각의 열거된 제제는 예시적이며 제한적이지는 않다. 당업자는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15판, 33 장, 특히 624-652 페이지를 지시한다. 투여량은 치료될 상태에 따라 변화될 것이다. 의사 투여 치료는 각 환자에 대한 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 상호 반응, 차단, 및/또는 억제성 항-KIR 항체 조성물은 임의의 하나 이상의 항-엔지오제네시스 요법과 조합하여 사용되거나 항-엔지오제네시스 제제를 포함할 수도 있다. 이러한 제제의 예는 중화 항체, 안티센스 RNA, siRNA, RNAi, RNA 압타머 및 리포솜으로서 각각 VEGF 또는 VEGF 리셉터에 대하여 특이적인 것들을 포함한다(본원에서 참고로서 인용되는 미국 특허 제 6,524,583호). 길항제 특성을 갖는 VEGF의 변이체는 구체적으로 본원에서 참고로서 인용되는 WO 98/16551호에서 설명된 바와 같이 사용될 수도 있다. 조합 요법과 연결되어 유용한 추가적인 전형적 항-엔지오제네시스 제제는 이 제제 및 지시의 개시가 구체적으로 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제 6,524,583호의 표 D에 열거된다.
본 발명의 항-KIR 항체 조성물은 아폽토시스를 유도하기 위한 방법들을 조합하여 이롭게 사용할 수도 있으며 또는 아폽토시스 제제를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 수많은 종양원들이 아폽토시스, 또는 프로그램된 세포사를 억제함을 확인하였다. 본 카테고리 내 전형적인 종양원들은 bcr-abl, bcl-2 (bcl-1, cyclin D1과는 구별됨; Genbank 수탁 번호 M14745, X06487; 미국 특허 제 5,650,491; 및 5,539,094; 각각 본원에서 참고로서 인용됨) 및 Bcl-x1 , Mcl-1 , Bak, A1 , 및 A20을 포함하는 과 멤버들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. bcl-2의 과잉발 현은 T 세포 림프종에서 처음 발결되었다. 종양원 bcl-2는 아폽토시스 경로의 단백질인 Bax에 결합하고 비활성화함으로써 작용한다. bcl-2 작용의 억제는 Bax의 비활성을 막아서 아폽토시스 경로가 진행되도로 허용한다. 예를 들어, 안티센스 뉴클레오티드 서열, RNAi, siRNA 또는 소분자 화합물을 사용하는 이 부류의 종양원의 억제는 아폽토시스의 향상을 제공하도록 본 발명의 사용상 고려된다(미국 특허 제5,650,491 ; 5,539,094; 및 5,583,034호; 각각 본원에서 참고로서 인용됨).
또한, 본 발명의 항-KIR 항체 조성물은 표적 세포("표적화 제제), 예를 들어, 표적 종양 세포 상 특이적 마커에 대한, 표적화 부분, 예를 들어, 항체, 리간드, 또는 그들의 콘쥬게이트를 포함하는 소분자를 포함하거나 이들과 함께 사용될 수도 있다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 이들 추가적 양태에서 사용하기 위한 표적화 제제는 바람직하게는 우위적으로, 또는 특이적으로, 종양 부위에서 발현되는 접근가능한 종양 항원을 인지할 것이다. 표적화 제제는 일반적으로 종양 세포의 표면-발현, 표면-접근가능 또는 표면-집중된 성분에 결합할 것이다. 또한, 표적화 제제는 바람직하게는 높은 친화도의 특성을 보일 것이며; 심장, 신장, 뇌, 간, 골수, 결장, 유방, 전립선, 갑상선, 방광, 폐, 부신, 근육, 신경 섬유, 췌장, 피부, 또는 기타 인체 내 기타 생명 유지 기관 또는 조직으로부터 선택된 하나 이상의 조직과 같은 생명 유지 정상 조직에 대하여 현저한 생체 내 부작용을 발휘하지 않을 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "현저한 부작용을 발휘하지 않음"은 생체 내에 투여되는 경우, 표적화 제제가 화학 요법 중에 보통 부딪히게 되는 것들과 같은 단지 무시할만하거나 또는 임상적으로 다루기 쉬운 부작용을 생산할 것이다.
종양의 치료에서, 본 발명의 항체 조성물을 추가적으로 포함하거나 애쥬반트 호합물과 함께 사용할 수도 있다. 애쥬반트 화합물은 예컨대, 세로토닌 길항제와 같은 구토 억제제 및 페노티아진, 치환 벤즈아미드, 항히스타민, 부티로페논, 코르티코스테로이드, 벤조디아제핀 및 카나비노이드와 같은 치료제; 및 졸레드론산 및 파미드론산과 같은 비포스포네이트; 및 에트로포이에틴 및 G-CSF, 예를 들어, 필그라스팀, 레노그라스팀 및 다베포이에틴과 같은 조혈 성장 인자를 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, NKVSF1, DF200, 1-4F1 및/또는 1-7F9를 비롯하여, 상이한 에피토프 또는 결정인자를 인지하는 본 발명의 2 이상의 항체는 가능한한 많은 KIR 유저자 산물의 억제 효과를 감소 또는 중화하기 위한 단일 조성물로 조합될 수도 있다. 본 발명의 상호반응 억제성 KIR 항체, 그것의 단편 또는 유도체의 조합을 포함하는 조성물은 훨씬 광범위한 이용을 허용할 것이며, 이는 단일 상호반응 항체에 의해 인지된 억제성 KIR 유전자 산물을 각각 결여할 수도 있는 적은 비율의 인간 개체군이 존재할 것이기 때문이다. 이와 유사하게, 본 발명의 항체는 단일 억제성 KIR 하위 유형을 인지하는 하나 이상의 항체를 더 포함할 수도 있다. 이러한 조합은 또한 치료 환경에서 보다 넓은 이용을 제공할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는 예를 들어, KIR2DL1, KIR2DLK2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, 및 KIR3DL3 중 하나 이상에 결합하는 다른 항-KIR 항체와 화합될 수 있다.
또한, 본 발명은 NK 셀 활성을 강화하는 것이 필요한 환자에 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 NK 셀 활성을 강화하는 방법을 제공한다. 방법 은 더 구체적으로, 증가된 NK 셀 활성이 이로운 작용(를 포함함)을 하거나 NK 셀에 의해 용해되기 쉬운 세포에 의해 야기되는 질병, 또는 암, 다른 증식성 질환, 감염성 질병 또는 면역 질환과 같은 불충분한 NK 셀 활성에 의해 야기되거나 이를 특징으로 하는 질병에 걸린 환자 내 NK 셀 활성을 증가시키는데 특이적이다. 더 구체적으로, 본 발명의 방법은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암 및 편평 세포 암종을 포함하는 피부암; 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-셀 림프종, T-셀 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모양 세포성 림프종 및 Burketts 림프종을 포함하는 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수 백혈병 및 전골수 백혈병을 포함하는 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 기타 암종; 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경집종을 포함하는, 중추 신경계 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질 가시세포증, 고환종, 갑상선 소포 암 및 기형암종을 포함하는 기타 암종을 포함하지만, 이에 한정되지는 암종을 포함하는 각종 암 및 기타 증식성 질병의 치료를 위해 사용된다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 다른 바람직한 질환들은 예를 들어, 소세포 및 대뇌모양 세포 유형을 포함하는, T-전림프구성 백혈병(T-PLL); 바람직하게는 T-세포 유형의 대 과립 림프구 백혈병(LGL); 세자리(Sezary) 증후군(SS); 성인 T-세포 백혈병 림프종(ATLL); a/d T-NHL 간지라(hepatosplenic) 림프종; 말초/뒤-흉선 T 세포 림프종(다형 및 면역모세포 하위 유형); 엔지오 면역모세포; 장 T-세포 림 프종; T-림프모구; 및 림프종/백혈병(T-Lbly/T-ALL)과 같은 T-세포 질환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 T-세포 및 B-세포 종양과 같은, 림프 계통의 조혈 종양을 포함한다.
또한, 다른 증식성 질환들이 본 발명에 따라서 치료될 수 있으며, 예를 들어, 증식증, 섬유증(특히 폐, 또한, 신장 섬유증과 같은 다른 유형의 섬유증), 엔지오제네시스, 건선, 죽상경화증 및 혈관확장술 후 협착 또는 재협착과 같은, 혈관 내 민무니근 증식을 포함한다. 본 발명의 상호 반응 억제성 KIR 항체는 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 곰팡이 또는 진균류에 의해 야기되는 어떤 감염을 포함하는, 감염성 질병을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 바이러스 감염성 유기체는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 1 형 단순 헤르페스(HSV-1), 2 형 단순 헤르페스(HSV-2), 우역(rinderpest), 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 거대세포 바이러스, 에키노 바이러스, 아르보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스, 에볼라 바이러스, 및 1형 또는 2형 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 바이러스 감염은 하기에 의해 유발되는 감염을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: 포도상구균(Staphylococcus); S. pyogenes를 포함하는 연쇄 상구균(Streptococcus); 엔터콕클(Enterococcl); Bacillus anthracis 및 Lactobacillus를 포함하는 바실러스(Bacillus); 리스테리 아(Listeria); 코리네박테리아 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae); G. vaginalis를 포함하는 가드네렐라(Gardnerella); 노카르디아(Nocardia); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 터모악티노미세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris); 트레포네마균(Treponema); Raeruginosa를 포함하는 캠플라오박터(Camplyobacter), 슈도모나스(Pseudomonas); 레지오넬라(Legionella); N.gonorrhoeae 및 N.meningitides를 포함하는 네세리아(Neisseria); F. meningosepticum 및 F. odoraturn를 포함하는 플라보박테리아(Flavobacterium); 브루셀라균(Brucella); B. pertussis 및 B. bronchiseptica를 포함하는 보르데텔라(Bordetella); E. coli, Klebsiella를 포함하는 에스케리치아(Escherichia); S. marcescens 및 S. liquefaciens를 포함하는 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia); 에드워드시엘리아(Edwardsielia); P. mirabilis 및 P. vulgaris를 포함하는 프로테우스(Proteus); 스트렙토바실러스(Streptobacillus); R. fickettsfi를 포함하는 리켓치아(Rickettsiaceae), C. psittad 및 C. trachomatis를 포함하는 클라미디아(Chlamydia); M. tuberculosis, M. intracellular, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellular, 및 M. lepraernurium을 포함하는 마이코박테리아(Mycobacterium); 및 노카르디아(Nocardia).
본 발명에 의해 치료될 수 있는 원생동물 감염은 리슈마니아(leishmania), 코크지디오아(kokzidioa), 및 트리파노소마(trypanosoma)에 의한 감염을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 감염성 질병의 완전한 리스트는 미국 질병 관리 센 터(CDC) 산하 국립 전염병 센터(NCID)의 웹사이트(월드 와이드 웹(www) at cdc.gov/ncidod/diseases/)에서 찾을 수 있으며, 이 리스트는 본원에서 참고로서 인용된다. 상기 모든 질병들은 본 발명의 상호반응 억제성 KIR 항체를 사용하는 치료의 후보자이다.
각종 감염성 질병을 치료하는 이러한 방법들은 단독으로 또는 항바이러스 제제, 항-진균 제제, 항박테리아 제제, 항생제, 항-기생충 제제 및 항-원생동물 제제를 포함하는, 이러한 질병을 치료하기 위해 알려진 다른 치료법 및/또는 치료제들과 함께, 본 발명의 항체 조성물을 사용할 수도 있다. 이 방법들이 추가적 치료제가 있는 추가 치료를 포함하는 경우, 이들 제제는 단독 투여량 형태로 또는 다수의 투여량 제형을 분리하여 본 발명의 항체와 함꼐 투여될 수도 있다. 분리 투여량 제형으로 투여되는 경우, 추가적 제제는 본 발명의 항체를 투여하기 전, 투여와 동시, 또는 투여 이후에 투여될 수도 있다.
본 발명의 추가적 양태 및 이점은 하기 실험 절에서 개시될 것이며, 이것은 예시적으로 간주되며 본 출원의 범주를 제한하지 않을 것이다.
실시예 1: PBL의 정제 및 폴리클론 또는 클론 NK 셀라인의 생성
PBL은 Ficoll-Hypaque 성분 및 플라스틱 부착성 세포의 고갈에 의한 건강한 도너로부터 유래되었다. 풍부 NK 셀을 얻기 위해, PBL을 4℃에서 30분 동안 항-CD3, 항-CD4 및 항-HLA-DE mAb와 함께 인큐베이션한 후, 염소 항-마우스 마그네틱 비드(Dynal)(4℃에서 30분)와 함께 인큐베이션 하고 당업계 공지의 방법에 의한 면 역자기 선택한다(Pende et al., J Exp Med 1999;190:1505-1516). CD3-, CD4-, DR- 세포를 방사선 조사된 영양공급 세포 및 100 U/ml 인터루킨 2(카이론 코포레이션의 Proleukin) 및 1.5 ng/ml Phytohemagglutinin A(Gibco BRL) 상에서 배양시켜서 폴리클론 NK 셀 개체군을 얻었다. NK 셀을 제한 희석에 의해 클로닝시키고 NK 셀의 클론은 세포 표면 리셉터의 발현에 대하여 유세포 분석기에 의해 특징화하였다.
사용된 mAb는 JT3A (lgG2a, 항-CD3), EB6 및 GL183 (IgGI , 각각 항-KIR2DL1 및 KIR2DL3), XA-141 (IgM, ER6와 동일한 특이성을 갖는 항-KIR2DL1), 항-CD4 (HP2.6), 및 항-DR (D1.12, lgG2a)이었다. JT3A, HP2.6, 및 DR1.12를 대신하여, 동일한 특이성을 갖는 다른 시중 구매 가능한 mAb를 사용할 수 있다. EB6 및 GL183은 시중구매 가능하다(Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). XA-141은 시중 구매 가능하지 않지만, mAb EB6는 본원의 실시예 및 도에서 나타내듯이, 용해의 억제 재구성을 위해 균일하게 잘 사용될 수 있으며, 이는 Moretta et al., J Exp Med 1993 ;178:597-604]에서 설명되는 바와 같다.
세포를 적절한 항체(4℃에서 30mns)로 염색한 다음 PE- 또는 FITC-콘쥬게이트된 폴리클론 항-마우스 항체(Southern Biotechnology Associates Inc)로 염색하였다. 샘플을 FACScan 기구(Becton Dickinson, Mountain View, CA) 상에서 유세포측정 분석(유세포 측정기)에 의해 분석하였다.
하기 NK 셀 클론을 본 연구에서 사용하였다. CP11, CN5 및 CN505는 KIR2DL1 포지티브 클론이며 EB6 (IgGI, 항-KIR2DL1) 또는 XA-141 (IgM, EB6 항체와 비교하여 동일한 특이성을 갖는 항 KIR2DL1)로 염색한다. CN12 및 CP502는 KIR2DL3-발현 NK 클론이며 GL183 항체(IgGI, 항-KIR2DL2/3)로 염색된다.
NK 클론의 세포용해 활성을 표준 4-시간 51Cr-방출 분석에 의해 분석하였으며, 여기서 작동자 NK 셀은 NK 셀 용해에 대하여 민감성인것으로 알려져 있는 HLA-Cw3 또는 -Cw4, HLA 포지티브 셀라인을 발현시키는 표적 세포를 살해하는 그들의 능력에 대하여 테스트되었다. 모든 표적은 미세적정 96-웰 플레이트 내에서 각 웰 당 5000 셀에서 사용하였으며 작동자:표적 비율은 도면에 나타낸다(일반적으로 각 표적 세포 당 4개의 작동자). 세포 용해 분석은 1/2 (1:1) 희석에서 지시한 단일클론 항체의 하이브리도마 상청액과 함께 또는 이것을 포함하지 않고서 수행하였다. 과정은 Moretta et al., J Exp Med 1993;178:597-604에 설명한 바와 필수적으로 동일하였다.
실시예 2: 신규한 mAb의 생성
mAb를 (Moretta et al., J Exp Med 1990;172:1589-1598)에서 설명한 바와 같이 활성화된 폴리클론 또는 단일클론 인간 NK 셀라인과 함께 5 주령 Balb/C 마우스를 면역화함으로써 생성하였다. 상이한 세포 융합 이후에, mAb는 우선 EB6- 및 GL 183-포지티브 NK 셀라인 및 클론과 상호반응하는 그들의 능력에 대하여 선택되였다. 포지티브 단일클론 항체는 각각 Cw4 또는 Cw3 포지티브 표적의 EB6- 포지티브 또는 GL 183-포지티브 NK 클론에 의한 용해를 재구성하는 그들의 능력에 대하여 더 스크리닝되었다.
세포 염색을 하기와 같이 수행하였다. 세포를 한 패널의 항체(1 μg/ml 또는 50 μl 상청액, 4℃에서 30 mns)로 염색한 다음 PE-콘쥬게이트된 염소 F(ab')2 단 편 항-마우스 lgG(H+L) 또는 PE-콘쥬게이트된 염소 F(ab')2 단편 항-인간 lgG(Fc 감마) 항체(Beckman Coulter)로 염색하였다. 유세포 측정 분석은 Epics XL.MCL 기구(Beckman Coulter) 상에서 수행하였다.
단일클론 항체 중 하나인 DF200 mAb는 KIR2DL1, 및 KIR2DL2/3을 포함하는 KIR 과의 다양한 구성원들과 반응하는 것으로 밝혀졌다. KIR2LD1-포지티브 및 KIR2DL2/3-포지티브 NK 셀 모두를 DF200mAb(도 1)로 밝게 염색하였다.
이들 HLA 클래스 I-특이적 억제성 리셉터 중 하나 또는 다른 것(또는 두가지 모두도 포함)을 발현하는 NK 클론은 하나 이상의 HLA-C 대립 유전자를 발현하는 표적 세포에 대한 작동자 세포로서 사용되었다. 세포독성 분석은 하기와 같이 수행하였다. YTS-KIR2DL1 또는 YTS-Eco(KIR-네거티브)셀 라인의 세포용해 활성을 표준 4시간 Cr-51 방출 분석에 의해 분석하였다. 표적 세포는 HLA-Cw4-포지티브 또는 -네거티브 B-EBV 셀라인, 또는 HLA-Cw4-트랜스펙션된 721.221 셀이었다. 모든 표적은 미세적정 플레이트에서 각 웰당 300 셀로 사용하였다. 작동자/표적 비율은 도면에 나타낸다. 세포용해 분석은 지시된 단일클론 마우스 또는 인간 항체의 총길이 또는 F(ab')2 단편과 함께 또는 이것을 포함하지 않고서 수행하였다.
예상되는 바와 같이, KIR2DL1-포지티브(KIR2DL1+) NK 클론은 Cw3 포지티브 표적 상에서 거의 또는 전혀 활성을 나타내지 않는 HLA-Cw4 및 KIR2DL3+ NK 클론을 발현시키는 표적 세포에 대한 세포 용해 활성을 거의 나타내지 않았다. 그러나, DF200mAb(그들의 KIR2DL 리셉터를 가리는데 사용됨)의 존재시, NK 클론은 그들의 HLA-C 리간드를 인지할 수 없게 되었으며 Cw3- 또는 Cw4-발현 표적에 대한 강한 세 포용해 활성을 보였다(결과의 실시예를 도 2-6에 나타냄).
예를 들어, HLA-Cw4(그룹 1 HLA-C 알로타입은 아님)를 발현하는 C1R 셀라인(CW4+ EBV 셀라인, ATCC No. CRL-1993)은 KIR2DL1-포지티브 NK 클론(CN5/CN505)에 의해 살해되지 않았으나, 억제는 DF200 또는 전통적인 항 KIR2DL1 mAb를 사용하여 효율적으로 역전될 수 있다. 반면, KIR2DL2/3+ KIR2DL1- 표현형(CN12)를 발현하는 NK 클론은 C1R 세포를 효율적으로 살해하였으며 이 살해는 DF200mAb에 영향받지 않았다(도 2). 유사한 결과를 Cw3-포지티브 표적 상에서 KIR2DL2- 또는 KIR2DL3-포지티브 NK 클론과 함꼐 얻었다.
이와 유사하게, Cw4+ 221 EBV 셀라인은 KIR2DL1+트랜스펙션된 NK 셀에 의해 살해되지 않았지만, 억제는 DF200 mAb, DF200의 Fab 단편, 또는 전통적인 항-KIR2DL1 mAb EB6 또는 XA141을 사용하여 효율적으로 역전시킬 수 있다. 또한, Cw3-포지티브 721.221-트랜스펙턴트는 KIR2DL2+ NK 셀에 의해 살해되지 않았지만, 이 억제는 DF200 또는 DF200 Fab 단편을 사용하여 역전될 수 있었다. 최종적으로, Cw3+ 721.221-트랜스펙턴트는 KIR2DL3+ NK 셀에 의해 살해되지 않았지만, 이 억제는 DF200 Fab 단편 또는 전통적인 항-KIR2DL3 mAb GL183 또는 Y249를 사용하여 역전될 수 있었다. 결과는 도 3에 나타낸다.
또한, F(ab')2 단편을 Cw4 포지티브 표적의 용해를 재구성하는 그들의 능력에 대하여 테스트하였다. DF200 및 EB6 Abs의 F(ab')2 단편 모두는 Cw4 트랜스펙션된 221 셀라인 및 Cw4+ TUBO EBV 셀라인의 KIR2DL1-트랜스펙션된 NK 셀에 의한 용 해를 역 억제할 수 있었다. 결과는 도 4에 나타낸다.
실시예 3: DF200 mAb/KIR2DL1 및 DF200 mAb/KIR2DL3 상호작용의 Biacore 분석
재조합 단백질의 생산 및 정제. KIR2DL1 및 KIR2DL3 재조합 단백질을 E.Coli에서 생산하였다. KIR2DL1(SEQ ID NO:23) 및 KIR2DL3(SEQ ID NO:25)의 전체 세포외 도메인을 코딩하는 cDNA를 하기 프라이머를 사용하여, 각각 pCDM8 클론 47.11 벡터 (Biassoni et al, Eur J Immunol. 1993;23:1083-7) 및 RSV.5(gpt)183 클론 6 벡터 (Wagtmann et al, Immunity 1995;2:439-49 및 1995;3:801-809)로부터 PCR에 의해 증폭시켰다:
센스: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3' (SEQ ID NO:13)
안티센스: 5'-CGGGATCCCAGGTGTCTGGGGTTACC-3' (SEQ ID NO:14)
그들을 비오틴화 신호를 코딩하는 서열과 함께 프레임 내 pML1 발현 벡터로 클로닝시켰다(Saulquin et al, J Exp Med. 2003;197:933-8).
단백질 발현은 BL21 (DE3) 박테리아 균주(Invitrogen)에서 수행하였다. 트랜스펙션된 박테리아를 암피실린(100 ㎍/ml)으로 보충된 배지에서 37℃로 OD600-0.6에서 성장시키고 발현은 1 mM IPTG와 함께 유도하였다.
단백질은 변성 조건 (8M 요소)하에 봉입체로부터 회수하였다. 재조합 단백질의 재폴딩은 6 단계 투석(각각 4, 3, 2, 1, 0.5 및 0 M 요소)에서 요소 농도를 감소시킴으로써, 실온에서, 20 mM Tris, pH7.8, L-아르기닌(400 mM, Sigma) 및 β-머캅토에탄올(1 mM)을 함유하는 NaCl 150 mM 버퍼에서 수행하였다. 환원 및 산화된 글루타티온(각각 5 mM 및 0.5 mM, Sigma)을 0.5 및 0 M 요소 투석 단계 동안 첨가하였다. 최종적으로, 단백질을 10 mM Tris, ph 7.5, NaCk 150 mM 버퍼에 대하여 광범위하게 투석하였다. 가용성, 재폴딩 단백질을 농축시킨 다음 Superdex 200 크기-배제 컬럼(Pharmacia; AKTA 시스템) 상에서 정제하였다.
Biacore 기구(Biacore) 상에서 표면 플라스몬 공명 측정을 수행하였다. 모든 Biacore 실험에서 0.05% 계면활성제 P20으로 보충된 HBS 버퍼를 러닝 버퍼로서 제공하였다.
단백질 고정. 상기 설명한 바와 같이 생산된 재조합 KIR2DL1 및 KIR2DL3 단백질을 센서 칩 CM5(Biacore) 상의 덱스트란 층에서 카르복시기로 공유결합하여 고정시켰다. 센서 칩 표면은 EDC/NHS (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드히드로클로라이드 및 N-히드록시숙신이미드, Biacore)로 활성화시켰다. 커플링 버퍼(10 mM 아세테이트, pH 4.5) 중 단백질을 주사하였다. 잔여 활성화 기의 비활성화는 100 mM 에탄올아민 pH 8(Biacore)를 사용하여 수행하였다.
친화도 측정. 동역학적 측정을 위해, 가용성 항체의 다양한 농도(1 x 10-7 내지 4 x 10-10 M)를 고정된 샘플 상으로 적용시켰다. 측정은 20 μl/분 연속 유속에서 수행하였다. 각 사이클에 대하여, 센서 칩의 표면은 10 mM NaOH pH 11를 5μl 주사하여 재생시켰다. BIAlogue 동역학적 평가 프로그램(BIAevaluation 3.1 , Biacore)을 데이타 분석을 위해 사용하였다. 가용성 분석 물질(다양한 농도로 40 μl)을 각각 KIR2DL1 및 KIR2DL3의 500 또는 540 반사도 단위(RU), 및 1000 또는 700 RU를 함유하는 덱스트란 층에서, HBS 버퍼 중 20 μl/분의 유속으로 주사하였 다. 데이타는 6개의 독립적 실험의 표시이다. 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
Figure 112007000396302-pct00002
실시예 4: 신규한 인간 항-KIR mAb의 생성
인단 단일클론 항-KIR mAb를 제조한, 가용성 KIR 단백질과 함께 인간 항체 레퍼토리를 발현시키기 위해 조작된, 유전자 변형 마우스를 면역화함으로써 생성하하였다. 하이브리도마를 만들기 위해 상이한 세포 융합을 한 후, mAb를 우선 고정된 KIR2DL1 및 KIR2DL3 단백질(상기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 생산됨)과 상호반응하는 그들의 능력에 대하여 선택하였다. 1-7F9, 1-4F1 , 1-6F5 및 1 -6F1을 포함하는 몇 가지 인간 단일클론 항체가 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3와 상호반응하는 것으로 밝혀졌다.
포지티브 단일클론 항체는 추가적으로 Cw4-포지티브 표적 세포에 대하여 KIR2DL1-포지티브 NK 트랜스펙턴트에 의한 용해를 재구성하는 그들의 능력에 대하여 스크리닝하였다. HLA 클래스 I-특이적 억제성 리셉터를 발현하는 NK 셀을 하나 이상의 HLA-C 대립 유전자를 발현시키는 표적 세포에 대한 작동자 세포로서 사용하였다(도 5 및 6). 세포 독성 분석은 상기 설명한 바와 같이 수행하였다. 작동자/표적 비율은도 범례에 나타내고 있으며, 항체는 10 ㎍/ml 또는 30 ㎍/ml로 사용하였다.
예상한 바와 같이, KIR2DL1+ NK 셀은 HLA-Cw4를 발현하는 표적세포에 대한 임의의 세포용해 활성을 거의 나타내지 않았다. 그러나, 1-7F9 mAb의 존재시, NK 셀은 그들의 HLA-C를 인지할 수 없게 되었으며(즉, HLA-C 분자에 의해 더이상 억제되지 않았음), Cw4-포지티브 표적에 대한 강력한 세포용해 활성을 나타내었다. 예를 들어, 테스트된 2개의 셀라인(HLA-Cw4 트랜스펙션된 721.221 및 CW4+ EBV 셀라인)은 KIR2DL1+ NK 셀에 의해 살해되지 않았으며, 억제는 mAb 1-7F9 또는 전통적인 항-KIR2DL1 mAb EB6를 사용하여 효율적으로 역전시킬 수 있었다. 뮤린 mAb DF200 및 Pan2D(NKVSF1)을 인간 mAb 1-7F9와 비교하였으며 모든 실험에서 1-7F9는 NK 셀에 의한 세포독성 감소의 측면에서 테스트된 다른 mAb들 중 어느 것 보다도 효력있었다. 반면, 항체 1-4F1 , 1-6F5 및 1-6F1은 Cw4-포지티브 표적에 대한 NK셀에 의한 세포 용해를 재구성할 수 없었다.
실시예 5: 뮤린 및 인간 항-KIR 항체의 Biacore 경쟁적 결합 분석
에피토프 지도화 분석은 마우스 항-KIR 2D 항체 DF200, NKVSF1 (Pan2D), gl183 및 EB6, 및 인간 항-KIR2D 항체 1-4F1 , 1-6F1 , 1-6F5 및 1-7F9와 함께 고정된 KIR2DL1 (900 RU), KIR2DL3 (2000 RU) 및 KIR2DS1 (1000 RU) 상에서 앞서 설명된 방법(Gauthier et al., Journal of Immunology 1999;162:41-50; Saunal and van Regenmortel, Journal of Immunology 1995;183:33-41)에 따라 수행하였다.
모든 실험은 HBS 버퍼 중에서 유속 5 μl/분으로 15 ㎍/ml로 상이한 항체의 2분 주사와 함께 이루어졌다. 각 쌍의 항체에 대하여, 경쟁적 결합 분석은 2단계로 수행되었다. 1 단계에서, 1차 단일클론 항체(mAb)를 KIR2DL 표적 단백질 상으로 주사한 다음 2차 mAb(1차 mAb를 제거하지 않고서) 및 2차 mAb RU 값(RU2)를 모니터링하였다. 2 단계에서, 2차 mAb를 첫번째로 누드 KIR2D 단백질 상으로 직접 주사하고, mAb RU 값(RU1)을 모티너링하였다. 1차 mAb에 의한 KIR2D에 대한 2차 mAb 결합의 억제율을 계산하였다: 100*(1-RU2/RU1).
결과를 표 2, 3 및 4에 나타내고 있으며, 여기서 "1차 항체"라고 칭한 항체는 수직 기둥에 열거 하고 "2차 항체"를 수평 기둥에 열거한다. 테스트된 각각의 항체 조합에 대하여, 칩에 대한 항체의 직접 결합 수준(RU)의 수치를 표에 열거하고 있으며, 여기서 KIR2DL 칩에 대한 2차 항체의 직접 결합은 필드의 상부에 열거하고 1차 항체가 존재하는 경우 KIR2D 칩에 대한 2차 항체의 결합에 대한 값은 필드의 하부에 열거한다. 2차 항체 결합의 억제율은 각 필드의 오른쪽에 열거한다. 표 2는 KIR2DL1 침에 대한 결합을 나타내며, 표 3은 KIR2DL3 침에 대한 항체의 결합을 나타내며, 표 4는 KIR2DS1 칩에 대한 항체의 결합을 나타낸다.
뮤린 항체 DF200, NKVSF1 및 EB6, 및 인간 항체 1-4F1 , 1-7F9 및 1-6F1의 고정된 KIR2DL1, KIR2DL2/3 및 KIR2DS1에 대한 경쟁적 결합을 평가하였다. KIR2DL1에 대한 항-KIR 항체의 결합을 포함하는 실험에서 에피토프 지도화(표 7)은 항체 1-7F9가 EB6 및 1-4F1과 경쟁적이지만, NKVSF1 및 DF200과는 경쟁적이지 않으며; (b) 항체 1-4F은 번갈아 EB6, DF200, NKVSF1 및 1-7 F9과 경쟁적이고; (c) NKVSF1은 DF200, 1-4F1 및 EB6과는 경쟁적이지만, 1-7F9과는 경쟁적이지 않으며; (d) DF200는 NKVSF1, 1-4F1 및 EB6과는 경쟁적이지만, 1-7F9과는 경쟁적이지 않음을 보여준다. KIR2DL3에 대한 항-KIR 항체의 결합을 포함하는 실험에서 에피토프 지도화(표 8)은 (a) 1-4F1이 NKVSF1, DF200, gl183 및 1-7F9와 경쟁적이며; (b) 1-7F9가 DF200, gl183 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, NKVSF1과는 경쟁적이지 않고; (c) NKVSF1이 DF200, 1-4F1 및 GL183과는 경쟁적이지만, 1-7F9과는 경쟁적이지 않으며; (d) DF200는 NKVSF1, 1-4F1 및 1-7F9와는 경쟁적이지만, GL183과는 경쟁적임을 보여준다. KIR2DS2에 대한 항-KIR 항체의 결합을 포함하는 실험에서 에피토프 지도화(표 9)는 (a) 1-4F1이 NKVSF1, DF200 및 1-7F9와 경쟁적이고; (b) 1-7F9는 1-4F1과는 경쟁적이지만, DF200 및 NKVSF1과는 경쟁적이지 않으며; (c) NKVSF1은 DF200 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않고; (d) DF200는 NKVSF1 및 1-4F1과는 경쟁적이지만, 1-7F9와는 경쟁적이지 않음을 보여준다.
Figure 112007000396302-pct00003
Figure 112007000396302-pct00004
Figure 112007000396302-pct00005
실시예 6: 사이노몰거스 NK 셀을 포함하는 항-KIR mAb 적정
항-KIR 항체 NKVSF1을 사이노몰거스 원숭이로부터의 NK 셀에 결합하는 그들의 능력에 대하여 테스트하였다.
원숭이 PBMC의 정제 및 폴리클론 NK 셀 덩어리의 생성. 사이노몰거스 Macaque PBMC를 소디움 시트레이트 CPT 관(Becton Dickinson)으로부터 제조하였다. NK 셀 정제는 네거티브 고갈(Macaque NK 셀 풍부 키트, Stem Cell Technology 사)에 의해 수행하였다. NK 셀을 300 U/ml 인터루킨 2(Proleukin, 카이론 코포레이션 사) 및 1 ng/ml Phytohemagglutinin A (Invitrogen, Gibco)와 함께 방사선 조사된 인간 영양공급 세포 상에서 배양시켜서 폴리클론 NK 셀 개체군을 얻었다.
사이노몰거스 NK 셀을 포함하는 Pan2D mAb 적정. 사이노몰거스 NK 셀(NK 덩어리 16일)을 상이한 양의 Pan2D mAb와 함께 인큐베이션 한 다음 PE-콘쥬게이트된 염소 F(ab')2 단편 항-마우스 lgG(H+L) 항체와 함께 인큐베이션하였다. 포지티브 세포의 백분율은 이소타입 대조군(정제된 마우스 lgG1)와 함꼐 결정하였다. 샘플을 두배로 만드렁ㅆ다. 평균 형광 강도 = MFI.
원숭이 NK 셀에 대한 항체의 결합을 도 10에 나타낸다.
실시예 7: 인간 항-KIR mAb의 스크리닝
인간 단일클론 항-KIR Abs는 실시예 4에서 설명한 바와 같이, 재조합 KIR 단백질과 함께 인간 항체 레퍼토리를 발현시키도록 조작된 유전자 변형 마우스를 면역화함으로써 생성하였다. 상호 반응성 항-KIR 항체를 생성하기 위해, 동물을 순차적으로 실시예 3에서 설명한 바와 같은 가용성 형태이거나, 또는 세포 표면에 발현된 상이한 KIR로 면역화시켰다.
다음으로, 상이한 세포 융합을 한 후, mAb를 우선 표준 방법을 사용하는 ELISA에 의해 고정된 KIR2DL1 및 KIR2DL3 단백질과 상호반응하는 그들의 능력에 대하여 선택하였다. 1-7F9, 1-4F1 , 1-6F5 및 1-6F1을 포함하는 몇 가지 인간 단일클론 항체는 ELISA에 의해 모든 KIR2DL1, KIR2DL2 및 KIR2DL3와 반응하는 것으로 밝혀졌다. KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 모두와 반응하는 mAb를 "KIR2DL-상호반응성 mAb"라고 칭하였다.
이어서 KIR2DL 상호반응성 mAb를 유세포 측정기에 의해 세포 표면에서 KIR과 반응하는 그들의 능력에 대하여 테스트하였다. 요약하면, 인간 항-KIR mAb의 결합은 KIR(예를 들어, YTS-2DL1, BWZ-KIR2DL2 및 BWZ-KIR2DS4)을 안정하게 과잉발현하거나 KIR(예를 들어, YTS 및 BWZ)을 발현하지 않는 각종 셀라인과 함께 그들을 인큐베이션함으로써 테스트하였다. 요약하면, 세포를 2% FCS를 함유하는 DMEM-배지에서 각종 농도(일반적으로 0-50 ㎍/ml)의 인간 항-KIR mAb1-7F9와 함꼐 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 인간 lgG에 특이적인 APC-콘쥬게이트된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 모든 인큐베이션 및 세척 단계는 0-4℃에서 수행하였다. 후속하여, 세포를 세척하고, PBS에 재현탁시키고, FACScalibur 또는 FACScanto(둘다 Beckton Dickinson사로부터 입수) 상에서 유세포 측정하여 분석하였다. 일반적인 예를 도 16에 나타낸다. 예를 들어, 1-7F9 및 1-4F1은 KIR2DS4로 트랜스펙션된 세포에 결합하지 않는 반면, NKVSF1(Pan2D)에 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 16).
다음으로, 인간 항-KIR mAb가 KIR 및 그것의 HLA-C 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 능력을 1) 생화학적 직접 결합 실험 및 2) 용해 분석의 기능적 재구성에 의해 테스트하였다.
생화학적 결합 분석에서, 1-7F9를 포함하는 인간 항-KIR mAb가 HLA-C 및 KIR 분자 간의 상호작용을 차단하는 능력을 가용성, 재조합 KIR-Fc 융합 단백질의 HLA-C를 발현하는 세포에 대한 결합을 경쟁시킴으로써 분석하였다. KIR-Fc 단백질을 (Wagtmann et al., Immunity 1995;3(6):801-9)에서 설명한 바와 같이 생산하였으며, 단 인간 Fc가 뮤린 lgG1 Fc로 치환된 경우를 제외하였다. 가용성 KIR-Fc는 KIR2DL1에 의해 인지되는 특이적 HLA-C 알로타입을 발현하는 세포에 결합하며, 이 결합은 KIR-Fc 단백질의 뮤린 Fc 부분에 특이적인 2차 형광색소-콘쥬게이트된 Ab를 사용하여 유세포 측정에 의해 시각화할 수 있다. 예를 들어, KIR2DL1-F1는 HLA-Cw*0402(LCL 721.221-Cw4 트랜스펙턴트)와 함께 트랜스펙션된 세포에 결합하지만 (Litwin et al., J Exp Med. 1993;178:1321-36) 트랜스펙션되지 않은 LCL 721.221 세포에는 결합하지 않는다(도 11A 참조). 항-KIR mAb가 KIR2DL1-Fc 및 HLA-Cw4 간의 상호작용을 막을 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, KIR2DL1-FC 단백질을 항-KIR mAb의 증가 농도와 함꼐 사전 인큐베이션시킨 다음, LCL 721.221-Cw4 세포에 첨가하고, 4℃에서 인큐베이션하고, 세척하고, APC-콘쥬게이트된 항-뮤린 IgGI Fc와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 표준 방법에 의해, FACScalibur, 또는 FACScanto (Beckton Dickinson) 상에서 유세포 측정에 의해 분석하였다. DF200과 같은 일부 뮤린 항-KIR mAb, 및 일부 인간 항-KIR mAb, 즉 1-7F9 및 1-4F1은 HLA-Cw4를 발현하는 세포에 대한 KIR2DL1-Fc의 결합을 차단하였으며, 이것은 이들 mAb가 KIR2DL1 및 HLA-Cw4 간의 상호작용을 차단함을 나타낸다. 한 예로서, 도 17A는 DF200이 KIR2DL1-Fc의 HLA-Cw4를 발현하는 세포에 대한 결합을 차단함을 보여준다. 도 17B는 1-7F9 mAb가 KIR2DL1의 HLA-Cw4에 대한 결합을 차단함을 보여준다. 동시에, 항-KIR mAb는 KIR2DL2의 HLA-Cw3에 대한 결합을 차단하는 그들의 능력에 대하여 테스트되었다. 도 17에서 예증되는 바와 같이, 투여량 의존성 방식에서 KIR2DL-Fc의 HLA-C-발현 세포에 대한 결합을 차단하는 항체를 "차단성 mAb"라 칭하였으며 하기와 같이, 기능상 세포독성 분석에서 추가로 테스트하였다.
인간 항-KIR mAb의 치료적 이용은 KIR을 통한 억제성 신호를 차단함으로써, 종양 세포를 살해하는 KIR-발현 NK 셀을 유도하는 그들의 능력과 연결된다. 따라서, 인간 KIR2DL 상호반응성 및 차단성 mAb가 KIR2DK을 발현하는 NK 셀에 의한 HLA-C를 발현하는 표적세포의 용해를 유도할 수 있는지 여부를 평가하는 것이 중요하다. 이러한 목적에서, 하기 실험을 수행하였다:
51Cr-방출 세포 독성 분석에서, KIR2DL1-발현 YTS 세포(YTS-2DL1)은 LCL 721.221-Cw3를 살해할 수 있으나, LCL 721.221-Cw4 세포를 살해하지는 못한다(도 18A). 이와는 반대로, KIR(YTS)을 결핍하는 YTS 작동자-세포는 두개의 셀라인을 효율적으로 살해한다. 따라서, YTS-2DL1 작동자 세포는 KIR2DL1을 통한 HLA-Cw4-유도된 억제성 신호로 인하여 LCL 721.221-Cw4 세포를 살해할 수 없다. YTS-2DL1 세포를 51Cr-방출 세포 독성 분석과 함께 사전 인큐베이션하고, LCL 721.221 -Cw4 세포를 1-7F9 농도-의존성 방식으로 살해하였다(도 18B). 높은 친화성으로 KIR2DL1과 결합하지만, KIR2DL1 및 HLA-Cw4 간의 상호작용을 차단할 수 없는 인간 상호반응성 항-KIR mAb인 3-1F13은 YTS-2DL1 세포에 의한 LCL 721.221-Cw3 세포의 살해를 유도할 수 없다. 따라서, 1-7F9는 NK- 및 표적 세포 간의 KIR-HLA-C 상호작용을 차단함으로써 표적 세포의 NK-매개 살해를 유도한다.
실시예 8: 1-7F9의 친화도 측정
KIR2DL1 및 KIR2DL3에 대한 결합에 대한 1-7F9의 친화도는 실시예 3에서 설명한 바와 같이 생산된 가용성 재조합 KIR 단백질을 사용하여, Biacore 분석에 의해 측정하였다. Biacore 실험은 실시예 3에서 설명한 바와 같이 수행하였으나, 단 사용된 항체가 인간 mAb 1-7F9인 것을 제외한다.
1-7F9에 의한 KIR2DL1 및 -3에 대한 결합의 친화도 결정의 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure 112007000396302-pct00006
실시예 9: KIR2DL1 상으로 1-7F9의 에피토프 지도화
제공된 항원 상으로의 제공된 단일클론 항체의 에피토프 지도화는 적절한 X-레이 구조/상동 모델이 단백질-단백질 도킹을 수행함으로써 항체 및 항원 모두에 존재하는 경우, 인실리코 방법에 의해 얻을 수 있다.
항체의 상동-모델은 3D 구조가 존재하는 항체의 선별을 갖는, 각각 경쇄 및 중쇄의 서열을 정렬함으로써 얻을 수 있다. 6개의 상보성 결정 영역(CDR)의 길이를 계산할 수 있으며 최적의 주형을 동일한 CDR 길이를 갖는 항체로부터 선택하였다. 표준 기술을 사용하여, 선택된 주형으로부터 상동 모델을 만들 수 있다.
단백질-단백질 도킹 접근법에 있어서, 최근 리뷰되었으며(Schneidman-Duhovny et al., Curr Med Chem 2004;11 :91-107), 2개의 표면은 표면 상의 특징을 나타낸다. 특징은 수소 결합 능력, 하전 및 소수성을 포함한다. 그리드 기재법에서, 공간을 정육면체로 나누고 각 정육면체를 표면(내부, 표면, 외부)에 상대적인 위치에 따라 값이 주어지며 관련하는 특징 세트가 할당된다. 득점 함수에 의한 표면의 억지(Brute force) 매칭은 총 3개의 직선운동 자유도 및 3개의 회전 운동 자유도를 찾아서 이용할 수 있다. 직선 운동은 Fast Fourier Transform에 의해 다루어지고 회전 운동은 회전 공간의 표준 이산화에서 개별적 계산치로 처리된다. 상부 득점 복합으로부터, 결과를 여과할 수 있으며, 일련의 방법, 예를 들어, 형상 상보성, 반데르 발스 상호작용, 소수성, 정전기, 탈용매화, 수소 결합, 원자 접촉 에너지, 잔기-잔기 짝짓기 통계 및 친수성 기 짝짓기를 사용하여 점수를 계산할 수 있다. 상부 득점 복합은 세부적으로 계산될 수 있으며 상호작용 잔기 및 그것에 의한 에피토프가 확인도리 수 있다.
방법 및 분석
KIR에 대한 잔기 및 도메인 명명법은 Fan 등의 (Nature 1997;389:96-100)에 따르며, 여기서 도메인 1은 잔기 6-101을 포함하고 도메인 2는 아미노산 잔기 105-200을 포함한다.
1-7F9의 상동-모델은 주형으로서 1OM3를 사용하여 구성되었다. Calarese 등의 (Science 2003;300:2065, 이하 참조)에 의해 생성된 1OM3 구조를 PDB(Protein Data Bank, 월드 와이드 웹(WWW) 주소 rcsb.org/pdb/; 10M3 VL 서열: SEQ ID NO:34; 1OM3 VH 서열: SEQ ID NO:35)로부터 회수하였다. Kabat 넘버링 및 CDR 지정을 사용하였다. 모든 정렬은 유효하였으며 CDR 길이는 동일하였으며, 따라서 상동 모델은 단백질-단백질 도킹 실험에서 사용될 만큼 충분히 정확할 것이다.
1-7F9 항체 상동 모델의 KIR2DL1 구조 상으로의 단백질-단백질 도킹으로부터, 1NKR.pdb 2000 용액을 얻었다. 그것들을 D183(CD로부터 <6Ａ인 원자) 및 R131(CZ로부터 <12Ａ인 원자)에 대한 그것의 근접성에 대하여 여과하였으며 133 결과의 용액을 세부적으로 분석하였다.
형성된 높은 득점 복합을 분석하였으며 R131(KIR) 및 D100C(중쇄) 사이의 가능한 상호작용을 확인하고 구속시켰다. F181에 대한 신규한 회전 이성질체를 선별하였으며 에너지를 최소화하였다. 이 모델은 항체가 KIR2DL1 (SEQ ID NO:23) 상에서 하기 잔기와 상호작용하였음을 예측하였다: S20 (Hyd, CB)(HydAcceptor, OG), E21 (Hyd, CB, CG), M44 (Hyd, SD, CE), F45 (Hyd, CD1 , CD1 , CZ, CE2), R68 (HydDonor, NH2), T70 (Hyd, CB, CG2), Q71 (Hyd, CG), L104 (Hyd, CB, CG, CD1 , CD2), Y105 (Hyd, CG, CD2, CE2), R131 (Ion, NH2) (HydDonor, NH2), S133 (Hyd, CA, CB) (HydDonor/Acceptor, OG), Y134 (Hyd, CD1 , CE1), F181 (Hyd, CB, CG, CD1 , CD2, CE1 , CE2, CZ), 및 D183 (Hyd, CB).
실시예 10: 뮤린 및 인간 항-KIR 항체의 Biacore 경쟁적 결합 분석
1-7F9, Pan2D (NKVSF1), 및 DF200의 경쟁적 결합을 실시예 5에서 설명한 동일한 방법에 따라 평가하였다.
결과를 표 6 및 7에 나타냈으며, 여기서 "1차 항체"라고 칭한 항체를 수직 기둥에 열거하고 "2차 항체"를 수형 기둥에 열거한다. 테스트된 각각의 항체 조합에 대하여, 2차 항체 결합의 억제율을 열거한다. 특정한 항체 쌍에 대한 억제율은 40% 이상이었으며, 이 항체가 1차 항체로서 사용되었음에도 불구하고, 상기 항체는 경쟁적인 것으로 간주되었다. 표 6은 KIR2DL1 칩 상의 결합을 보여주며, 표 7은 KIR2DL3 칩으로의 항체의 결합을 보여준다.
요약하면, KIR2DL1 결합에 대하여, 결과는 DF200 및 Pan2D가 경쟁적인 반면, 1-7F9는 DF200 또는 Pan2D 중 하나와 경쟁적이지 않음을 보여준다. KIR2DL3 결합에 대하여, DF200 및 Pan2D는 경쟁적인 반면, 1-7F9는 Pan2D와 경쟁적이지 않지만, DF200과는 경쟁적이었다.
Figure 112007000396302-pct00007
Figure 112007000396302-pct00008
실시예 11: HuKIR1-7F9-Fab'와의 복합체 내 KIR2DL1의 결정 구조
1-7F9의 Fab' 단편과의 복합체 내 KIR2DL1의 결정 구조를 해석하고 X-레이 결정학으로 2.35 Å 분해능으로 정련하였다. 결과는 KIR2DL1에 결합하는 경우, 항체가 MHC 클래스 K 분자에 대한 결합을 차단할 수 있음을 확증하였다(도 19).
재료 및 방법
세포외 KIR2DL1(SEQ Id NO:23의 아미노산 1-223으로서, 아르기닌(R)이 있는 잔기 16 및 류신(L)이 있는 잔기 114를 포함) 및 HuKIR1-7F9(SEQ ID NO:36의 경쇄 서열 및 SEQ ID NO:37의 잔기 1-221의 중쇄 서열을 포함)를 약간 과량의 KIR2DL1과 혼합하고, 복합체를 겔 여과 컬럼 상에서 정제하였다. 후속하여 복합체를 약 13.5 mg/ml로 농축시켰다. 결정을 pH 4.2인 10% PEG600 및 500 nN 시트레이트 버퍼에서 현적 기술(hanging drop technique)과 함께 성장시켰다. 결정을 액체 질소에서 고속 냉동시키고 2.35 Å 분해능에서 결정학적 데이타는 스웨덴 Lund 대학 Max-lab의 빔라인 BL711I를 사용하여 100K에서 수집하였다. 데이타를 XDS 프로그램 (Kabsch, J. Appl. Crystallogr. 1993;26:795-800)에 의해 통합하였다. 구조 결정을 위해, CCP4 슈트의 MOLREP 프로그램(Bailey, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1994;50:760-763)을 사용하는 분자 대체 및 PDB-증착 구조 1RZJ(Fab 부분1) 및 1NKR(KIR)을 사용하였다. ARP/WARP 프로그램(Lamzin and Wilson, Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 1993;49:129-147)으로 상 개선을 이루었으며 X-레이 유도된 구조 모델에 대한 메뉴얼 변형은 QUANTA 프로그램(미국 캘리포니아 샌디에고 주재 Accelrys 사로부터 입수 가능)으로 이루었다. 정련은 CCP4 슈트의 REFMAC5 컴퓨터 프로그램에서 수행하였다. 물 분자를 ARP/WARP 프로그램에 의해 첨가하였다. 모델은 KIR2DL1의 잔기 6-114 및 124-220, 1-7F9 경쇄의 1-212 및 1-7F9 중쇄의 1-136과 143-224를 포함하였다. 또한, 330 물 분자가 배치되었다. R- 및 R이 없는 모델은 각각 0.191 및 0.253이었다.
결과
접촉은 Fab' 및 KIR2DL1 분자 간 4.0Å의 컷오프 거리를 사용하여 CCP4 슈트의 CONTACT 컴퓨터 프로그램에 의해 확인하였다. 인간 1-7F9에 대한 결과의 KIR2DL1 에피토프는 KIR2DL1(SEQ ID NO:23)의 하기 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다: L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88 (표 8 및 9). KIR2DL1과의 상호작용에 참여한 1-7F9의 잔기는 1-7F9 가변 경쇄(VL)(SEQ ID NO:15: 표 18)의 S28, V29, S30, Y32, S92, N93, 및 W94, 및 가변 중쇄(VH)(SEQ ID NO:17)의 T28, F29, S30, F31 , I54, F55, E74, S77, G102, S103, Y105, Y106, D107, 및 Y108를 포함하였다. KIR2DL1 에피토프, 및 수소 결합에 참여하는 잔기는 또한 도 20에서 KIR2DL1의 아미노산 서열로서 나타낸다. 동등한 정련으로부터 얻은 등방성 대체 인자("온도 인자" 또는 "B-값"이라고도 칭함)는 KIR2DL1의 N-말단 도메인 및 1-7F9 항체 Fab' 단편의 가변 도메인에 대하여 비교적 낮은 값을 보였으며, 모든 도메인은 분자간 결합에 직접 참여하였다. 이것은 결정의 복합체 내 2개의 분자가 결합력이 강하고 안정하였음을 보여주었으며, 또한 결정 구조가 안정한 KIR2DL1/1-7F9 Fab' 복합체를 묘사하였음을 지지하였다.
1-7F9 Fab' 분자는 도메인 D1의 C'CFGA' β-시트의 한 면의 KIR2DL1 분자에 결합하였으며, 또한 동일한 도메인의 하나의 E β-가닥 잔기 측쇄에 접촉하였다. 또한, D1 도메인의 루프 잔기에 대한 연결은 결합에 있어서 중요하다(위상학 네이밍 규정에 대하여, Fan et al., Nature 1997;389:96-100를 참조할 것). 더 구체적으로, KIR2DL1의 하기 위상학적 부분들이 연결된다; β-가닥 C (아미노산 L38 및 R41), β-가닥 C 및 C' 사이의 루프, L2 (M44, F45 및 N46), β-가닥 C (D47, T48, L49, R50 및 I52), β-가닥 E (F64), E 및 F β-가닥 사이이 루프, L3 (D72), β-가닥 F (Y80) 및 F 및 G β-가닥사이의 루프(P87 및 Y88).
HLA-Cw4 분자가 KIR2DL1 분자의 D1 및 D2 도메인에 결합하는 반면(Fan et al. Nat. Immunol. 2001 ; 2: 452-460), 1-7F9 항체는 KIR2DL1 D1 도메인에만 결합한다. 그러나, 1-7F9 항체가 성공적으로 HLA-Cw4를 치환하기에 충분히 큰 결합된 1-7F9 및 결합된 HLA-Cw4 분자 간의 공간상의 중첩이 존재한다. HLA-Cw4가 있는 복합체 내 KIR2DL1의 공개된 구조(PDB 접근 코드 1IM9)를 사용하여, KIR2DL1 및 HLA-Cw4 간의 접촉 잔기는 CONTACT 프로그램에 의해 계산될 수 있다. 4.0Å의 거리 컷오프를 사용하는 계산에서, HLA-Cw4 잔기와의 접촉에 참여하는 3개의 KIR2DL1 잔기가 1-7F9/KIR2DL 복합체에서의 접촉 잔기와 공통임을 알 수 있다. 이들 3개의 KIR2DL1 잔기는 M44, F45 및 D72이다.
어떤 구체적 이론에 제한도지 않고서, 결정학상의 결과는 또한 1-7F9는 KIR2DS4 서열(SEQ ID NO:38)의 세포외 부분 중 아미노산 N47 및 V72로 인하여 활성화 NK 리셉터 KIR2DS4에 결합하지 않음을 나타낸다.
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실시예 12: 1-7F9의 물리적 안정성
인간 항체 1-7F9의 생물 물리학적 특성 및 안정성을 연구하였다. 단백질의 폴딩 및 2차 구조는 원평광 이색성(CD) 및 동적 광 산란(DS)에 의한 올리고머화 및 응집을 이용해 연구하였다. 5℃에서 2년간의 유사한 저장 조건을 위해, 단백질을 14일 동안 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이션에 놓이게 하였다.
재료 및 방법
샘플 제조. 2 mg/ml 1-7F9를 (a) 50 mM Na-포스페이트, 0.001 % 폴리소르베이트 80 (Sigma, P8074), pH 7.0; (b) 50 mM Na-포스페이트, 0.001 % 폴리소르베이트 80, pH 7.0, 0.5 mM 수크로스; (c) 50 mM 시트레이트, 0.001 % 폴리소르베이트 80, pH 3.0; 및 d) 50 mM Tris, 0.001 % 폴리소르베이트 80, pH 8.5에서 제조하였다.
원평광 이색성(CD). DLS를 Dynapro 99 온도 제어된 DLS 장치(Protein Solution 사)를 사용하여 2.0 mg/ml의 단백질 농도로 25℃에서 수행하였다. 데이타 분석은 상기 장치를 구비하고 있는 Dynamics 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결과
분자 크기는 DLS에 의해 평가되는 바와 같이 pH 7.0에서 14일 인큐베이션 후각 샘플에서 변화하지 않았던 반면, pH 3.0 및 pH 8.5에서 제조된 두개의 샘플은 14일 기간 동안 대량으로 응집하였다.
CD 측정은 모든 베타 구조의 특징으로 보여주었으며 pH 7.0에서 제조된 샘플은, 부형제로서 폴리소르베이트 80 만을 함유하는 샘플에 대한 신호에 있어서 약간의 하락을 가지기는 하였으나, 가속화 연구 내내 그들의 2차 구조를 유지하였음을 나타내었다. 이것은 모든 스펙트럼의 형태가 변하지 않았기 때문에, 샘플의 약한 침전으로 인한 것일 수도 있다. 수크로스를 함유하는 샘플은 시간에 따른 이러한 감소를 보이지 않았다. pH 3.0 및 8.5에서 제조된 샘플의 CD 측정은 시간에 따른 스펙트럼 특징의 강력한 변화를 나타냈으며, 추측컨대 폴딩하지 않거나 다른 형태상의 변화의 결과로서, 이것은 비-기능성 1-7F9 단백질을 야기할 수 있었다. 변화는 즉시 관찰되었으며 pH 3.0에서 가장 현저하였다.
결국, 1-7F9는 그것의 물리적 특성을 유지하였으며 부형제로서 폴리소르베이트 80 및 수크로스와 함께 pH 7.0에서 응력을 가한 조건 하에서(37℃에서 교반과 동시에) 안정하게 유지되었다.
실시예 13: 1-7F9 및 1-4F1의 친화도 결정(1가 결합)
KIR2DL1 및 KIR2DL3 항원에 대한 1가 결합에서 1-7F9 및 1-4F1의 친화도(실시예 3 및 8에서의 2가 결합 친화도 결정과는 반대됨)는 Biacore 3000을 사용하는표면 플라스몬 공명 기술에 의해 결정하였다.
요약하면, 항-인간 lgG(Dako RAHIgG, # 0423)을 20μl/분의 유속에서 HBS-EP 버퍼와 함께 사용하였다. 정제된 항체를 10 ㎍/mL로 희석하였다. 각 항체에 대하여, LIR2DL1 또는 KIR2DL3 및 버퍼를 주사하였다. 항원을 2000, 500, 200, 50 og 2OnM의 농도에서 테스트하였다. 유속은 20 μL/분에서 유지하였다. pH 1.8의 글리신-HCl의 단일 30 주사에 의해 표면의 생성을 이루었다.
결과는 표 10에 나타낸다. KIR2DL1의 1-4F1에 대한 결합의 경우, 기준선에서 현저한 이동이 있었다. 어떤 특정한 이론에 제한을 두지 않고서, 이것은 매트릭스에 의한 버퍼 효과, 또는 예를 들어, 항원의 형태상 변화로 인하여, 2 단계에 실제로 관여하는 결합 반응을 나타낸다.
Figure 112007000396302-pct00013
본 발명의 전형적인 양태
1. SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39와 최소한 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:41과 최소한 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
2. SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39과 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:41과 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
3. SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:41과 최소한 90% 동일한 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
4. SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:41에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
5. SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39에 최소한 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:41에 최소한 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
6. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 경쇄 가변 영역은 최소한 하나의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 각각의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39에서의 대응 위치의 아미노산과 비교하여 보존적인 것을 특징으로 하는 항체.
7. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 중쇄 가변 영역은 최소한 하나의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 각각의 아미노산 치환은 SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:39에서의 대응 위치의 아미노산과 비교하여 보존적인 것을 특징으로 하는 항체.
8. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(a) SEQ ID NO:15의 잔기 24-34에 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(b) SEQ ID NO:15의 잔기 50-56에 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(c) SEQ ID NO:15의 잔기 89-97와 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(d) SEQ ID NO:17의 잔기 31-35와 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(e) SEQ ID NO:17의 잔기 50-65와 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(f) SEQ ID NO:17의 잔기 99-112와 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
9. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(a) SEQ ID NO:15의 잔기 24-34와 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(b) SEQ ID NO:15의 잔기 50-56과 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(c) SEQ ID NO:15의 잔기 89-97과 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(d) SEQ ID NO:17의 잔기 31-35와 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(e) SEQ ID NO:17의 잔기 50-65와 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(f) SEQ ID NO:17의 잔기 99-112와 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
10. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(a) SEQ ID NO:15의 잔기 24-34로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(b) SEQ ID NO:15의 잔기 50-65로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(c)SEQ ID NO:15의 잔기 89-97로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(d) SEQ ID NO:17의 잔기 31-35로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(e) SEQ ID NO:17의 잔기 50-65로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(f) SEQ ID NO:17의 잔기 99-112로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
11. 제 8 양태 내지 제 10 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 2개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
12. 제 8 양태 내지 제 10 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
13. 제 8 양태 내지 제 10 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 4개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
14. 제 8 양태 내지 제 10 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 5개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
15. 제 8 양태 내지 제 10 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
17. 제 1 양태 내지 제 7 양태 중 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(g) SEQ ID NO:39의 잔기 24-34와 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(h) SEQ ID NO:39의 잔기 50-56와 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(i) SEQ ID NO:39의 잔기 89-97과 최소한 90% 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(j) SEQ ID NO:41의 잔기 31-35와 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(k) SEQ ID NO:41의 잔기 50-65와 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(l) SEQ ID NO:41의 잔기 99-113과 최소한 90% 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
18. 제 1 양태 내지 제 7 양태 및 제 17 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(g) SEQ ID NO:39의 잔기 24-34와 동일한 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(h) SEQ ID NO:39의 잔기 50-56과 동일한 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(i) SEQ ID NO:39의 잔기 89-97과 동일한 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(j) SEQ ID NO:41의 잔기 31-35와 동일한 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(k) SEQ ID NO:41의 잔기 50-65와 동일한 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(l) SEQ ID NO:41의 잔기 99-113과 동일한 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
19. 제 1 양태 내지 제 7 양태 및 제 17 양태 내지 제 18 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 다음 중 최소한 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
(g) SEQ ID NO:39의 잔기 24-34로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR1 아미노산 서열;
(h) SEQ ID NO:39의 잔기 50-65로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR2 아미노산 서열;
(i) SEQ ID NO:39의 잔기 89-97로 필수적으로 구성되는 경쇄 CDR3 아미노산 서열;
(j) SEQ ID NO:41의 잔기 31-35로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR1 아미노산 서열;
(k) SEQ ID NO:41의 잔기 50-65로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR2 아미노산 서열;
(l) SEQ ID NO:41의 잔기 99-113으로 필수적으로 구성되는 중쇄 CDR3 아미노산 서열.
20. 제 17 양태 내지 제 19 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 2개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
21. 제 17 양태 내지 제 19 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
22. 제 17 양태 내지 제 19 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 4개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
23. 제 17 양태 내지 제 19 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) 중 최소한 5개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
24. 제 17 양태 내지 제 19 양태 중 어느 한 양태에 있어서, (a) 내지 (f) a모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
25. 제 1 항 내지 제 7 항 및 제 17 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
26. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 KIR2DS4 및 KIR2DS3 중 최소한 하나에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
27. 제 1 양태 내지 제 15 양태 및 제 26 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자에 대한 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체.
28. 제 1 양태 내지 제 15 양태 및 제 26 양태 내지 제 27 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화하는 것을 특징으로 하는 항체.
29. 제 1 양태 내지 제 15 양태 및 제 26 양태 내지 제 28 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화시키는 경우에 DF200 보다 효율적인 것을 특징으로 하는 항체.
30. 제 1 양태 내지 제 15 양태 및 제 26 양태 내지 제 28 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화시키는 경우에 NKVSF1(Pan2D)보다 효율적인 것을 특징으로 하는 항체.
31. 제 1 양태 내지 제 15 양태 및 제 26 양태 내지 제 28 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화시키는 경우에 EB6 보다 효율적인 것을 특징으로 하는 항체.
32. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
33. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, IgGI , lgG2, lgG3, 또는 lgG4 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
34. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 인간 lgG4 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
35. 제 1 양태 내지 제 34 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 인간 IgG2 항체인 것을 특징으로 하는 양태.
36. SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:17의 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간 lgG4 항체.
37. SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간 lgG2 항체.
38. KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3에 대한 결합에 있어서 1-7F9와 경쟁하는 항체로서, 항체는 1-4F1 , DF200, gl183, A210, A803(g), 또는 EB6가 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
39. KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3에 대한 결합이 있어서 1-4F1과 경쟁하는 항체로서, 항체는 1-7F9, DF200, gl183, A210, A803(g), 또는 EB6가 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
40. 제 38 양태에 있어서, 항체는 1-4F1이 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
41. 제 39 양태에 있어서, 항체는 1-7F9가 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
42. 제 38 양태 내지 제 39 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 DF200가 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
43. 제 38 양태 내지 제 39 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 gl183이 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
44. 제 38 양태 내지 제 39 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 EB6가 아닌 것을 특징으로 하는 항체.
45. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 20 nM 이하의 KIR2DL1에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
46. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 10.9nM 이하의 KIR2DL1에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
47. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 0.45 nM 이하의 KIR2DL1에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
48. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 20 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
49. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 2.0 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
50. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 약 0.025 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 Kd를 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
51. 선행하는 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 인간인 것을 특징으로 하는 항체.
52. KIR2DL1에 대한 결합에 있어서 1-7F9와 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
53. KIR2DL1에 대한 결합에 있어서 1-4F1과 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
54. KIR2DL2에 대한 결합에 있어서 1-7F9와 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
55. KIR2DL2에 대한 결합에 있어서 1-4F1과 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
56. KIR2DL3에 대한 결합에 있어서 1-7F9와 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
57. KIR2DL3에 대한 결합에 있어서 1-4F1과 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
58. KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 대한 결합에 있어서 1-7F9와 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
59. KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 대한 결합에 있어서 1-4F1과 경쟁하는 인간 또는 인간화 항체.
60. 제 52 양태 내지 제 59 양태 중 어느 한 양태에 있어서, KIR2DS4 및 KIR2DS3 중 최소한 하나에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
61. 제 52 양태 내지 제 60 양태 중 어느 한 양태에 있어서, HLA-C 클래스 I 분자에 대한 KIR2DL1 또는 KIR2DL2/3 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
62. 제 52 양태 내지 제 47 양태 중 어느 한 양태에 있어서, HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화시키는 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
63. 제 52 양태 내지 제 62 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:15와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:17과 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 SEQ ID NO:39와 최소한 90% 동일한 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:41과 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
64. 제 52 양태 내지 제 63 양태 중 어느 한 양태에 있어서, IgGI, lgG2, lgG3, 또는 lgG4 항체인 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
65. 제 64 양태에 있어서, lgG4 항체인 것을 특징으로 하는 인간 또는 인간화 항체.
66. 제 64 양태에 있어서, lgG2 항체인 것을 특징으로 하는 인간 항체.
67. KIR2DL1, -2, 또는 -3 중 각각 하나에 결합하고, KIR2DL1, -2, 또는 -3가 HLA-C 클래스 I 분자 결합하는 것을 차단하는 인간 또는 인간화 항체.
68. KIR2DL1의 잔기 M44 및 F45와 상호작용하는 항체.
69. 제 68 양태에 있어서, 하나 이상의 KIR2DL1 잔기 L38, R41 , N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88과 추가적으로 상호작용하는 것을 특징으로 하는 항체.
70. 아미노산 잔기 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88로 한정되는 영역 내에서 독점적으로 KIR2DL1에 결합하는 항체.
71. 잔기 L38, R41 , M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, 152, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88로 한정되는 영역 외부에서 아미노산 잔기와 상호작용하지 않으면서 KIR2DL1 및 KIR2DL2/3에 결합하는 항체.
72. 제 67 양태 내지 제 71 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 인간 항체 1-7F9인 것을 특징으로 하는 항체.
73. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
74. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 2개의 경쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
75. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
76. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 VL 영역을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
77. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 하나의 중쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
78. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 2개의 중쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
79. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 최소한 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
80. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 VH 영역을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
81. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 모든 CDR을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
82. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체 단편 또는 항체 유도체.
83. 선행하는 양태 중 한 양태의 항체를 생산하는 하이브리도마.
84. 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산.
85. 제 84 양태의 핵산을 포함하는 벡터.
86. 제 85 양태의 벡터를 포함하는 세포.
87. 제 86 양태에 있어서, 세포는 유인원 COS 세포, CHO 세포, 및 인간 골수종 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
88. 항-KIR 항체, 항체 단편의 발현에 적합한 조건하에 제 86 양태의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-KIR 항체 또는 항체 단편을 생산하는 방법.
89. 항-KIR 항체 또는 항체 단편을 제공하는 단계 및 그것에 최소한 하나의 유도체 부분을 콘쥬게이션시키는 단계를 포함하는 항-KIR 항체 또는 항-KIR 항체 단편의 유도체를 생산하는 방법.
90. 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 유효량을 암에 걸림 피험체에 투여시키는 단계를 포함하는 피험체 내 암을 치료하는 방법.
91. 제 90 양태에 있어서, 화학요법제, 방사선요법제, 항-엔지오제네세스 제제, 면역조절제, 및 호르몬제로부터 선택된 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
92. 피험체에서 바이러스로 인한 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 유효량을 바이러스로 인한 질병 또는 질환을 앓는 피험체에 투여시키는 단계를 포함하는 방법.
93. 암을 치료용 약제의 제조에 있어서 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 사용.
94. 바이러스로 인한 질병 또는 질환의 치료용 약제의 제조에 있어서 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체의 사용.
95. 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
96. 제 95 양태에 있어서, 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물.
97. 제 95 양태에 있어서, 수크로스를 포함하는 조성물.
98. 제 95 양태에 있어서, 폴리소르베이트 80 및 수크로스를 포함하는 조성물.
99. 제 95 양태 내지 제 98 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 화학요법, 방사선요법제, 항-엔지오제네세스 제제, 면역조절제, 및 호르몬제로부터 선택된 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
100. 제 95 양태 내지 제 99 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체가 종양-표적 제제에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
101. 제 95 양태 내지 제 99 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체는 리포솜 내에 캡슐화되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
102. 제 95 양태 내지 제 99 양태 중 어느 한 양태에 있어서, 항체가 KIR에 결합하는 것을 포함하며, 이때 KIR은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, 또는 KIR2DS2이 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
103. 림프구 및 NK 셀로부터 선택된 세포의 용해 활성을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포가 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체와 좁촉하는 단계를 포함하는 방법.
104. 림프구, T 셀, 및 NK 셀로부터 선택된 세포에 의해 발현된 KIR과 표적 세포에 의해 발현된 HLA-C 클래스 I 분자 간의 상호작용을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
105. NK 셀에 의해 발현된 KIR의 억제 활성을 중화하는 방법으로서, NK 셀을 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태의 항체 또는 항체 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
106. KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 각각의 하나에 결합하는 인간 항체로서, 항체는 KIR2DL1에 대한 HLA-Cw4 분자의 결합, 및 KIR2DL2 또는 KIR2DL3 중 최소한 하나에 대한 HLA-Cw3 분자의 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
107. KIR2DL1은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하고, KIR2DL2는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하며, 및/또는 KIR2DL3은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태에 따른 항체 또는 항체 단편 또는 유도체.
108. 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태에 따른 항체, 항체 단편, 또는 유도체와 실질적으로 동일한 KIR2DL1 에피토프에 결합하는 화합물.
109. 제 1 양태 내지 제 82 양태 중 어느 한 양태에 따른 항체, 항체 단편, 또는 유도체와 필수적으로 동일한 KIR2DL1 에피토프에 결합하는 화합물.
110. SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 유도체.
111. SEQ ID NO:37의 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 항체 유도체.
112. 제 109 양태의 경쇄 및 제 110 양태의 중쇄를 포함하는 항체 또는 항체 유도체.
113. SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:37의 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
* * *
본원에서 인용되는 공개 문헌, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌들은 각각의 참고문헌이 참고로서 인용되는 것으로 개별적으로 및 구체적으로 나타내어지고 본원에서 그 전체를 제시하는 바와 같은 정도로 참고로서 인용된다.
모든 제목 및 작은 제목들은 본원에서 단지 편의상 사용되며 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않을 것이다.
모든 가능한 변이체에서 상기 설명된 요소들의 임의의 조합은 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 발명을 설명하는 문맥에서 사용되는 단수를 나타내는 용어들 및 이와 유사한 지시 대상들은 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하도록 해석되어야 한다.
본원에서의 값의 범위의 기술은 본원에서 달리 나타내지 않는한, 범위 내에 해당하는 각각의 개별 값에 대하여 개별적으로 칭한 약칭으로서 쓰일 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용되는 바와 같은 정도로 명세서로 인용된다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 제공된 모든 정확한 값들은 대응하는 근사값의 대표이다(예를 들어, 특정 인자 또는 측정치와 관련하여 제공된 모든 정확한 전형적인 값들은 대응하는 근사 측정치들을 제공하는 것으로 간주될 수 있으며, 이것은 적절한 경우 "약"으로 변형됨).
본원에서 설명된 모든 방법들은 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는한 어떤 적절한 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 제공된 일부 및 모든 예, 또는 전형적인 언어(예를 들어, "이와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하고자 하며 달리 나타내지 않는 한 본 발명의 범주에 제한을 두지 않는다. 명세서 내 어떤 언어도 명백히 언급하지 않는 한 어떤 요소도 본 발명의 실행에 있어서 본질적인 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 특허 문서의 인용 및 수록은 단지 편의상 이루어지며 이러한 특허 문헌들의 유효성, 특허성 및/또는 강제성의 견지를 반영하지는 않는다,
요소 또는 요소들에 관련하여 "이루어지는", "갖는", "포함하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어들을 사용하는 본 발명의 일부 양태 또는 구체예에 관한 본원의 설명은 달리 언급하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는한(예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에서 설명된 조성물은 달리 언급하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는한, 상기 요소로 이루어지는 조성물을 설명하는 것으로 이해되어야 함), 그 특정 요소 또는 요소들로 "구성되는", "본질적으로 구성되는", 또는 "실질적으로 이루어지는" 본 발명의 유사한 양태 또는 구체예에 관한 지지를 제공하고자 한다.
본 발명은 적용 법에 의해 허용되는 최대 범위로 본원에서 나타낸 양태 또는 청구항에서 기술된 당면 문제의 모든 변형 및 이에 상응하는 것들을 포함한다.
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135 140 Ala His Glu Arg Arg Phe Ser Ala Gly Pro Lys Val Asn Gly Thr Phe 145 150 155 160 Gln Ala Asp Phe Pro Leu Gly Pro Ala Thr His Gly Gly Thr Tyr Arg 165 170 175 Cys Phe Gly Ser Phe Arg Asp Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asn Ser Ser 180 185 190 Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Thr Gly Asn Pro Ser Asn Ser Trp Pro 195 200 205 Ser Pro Thr Glu Pro Ser Ser Glu Thr Gly Asn Pro Arg His Leu His 210 215 220 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 26 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 27 ctaatacgac tcactatagg g 21 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 gcaggcacac aacagaggca gttccagatt tc 32 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 29 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 30 ctaatacgac tcactatagg g 21 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 31 gtgccagggg gaagaccgat ggg 23 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 32 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 33 caggaaacag ctatgac 17 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Thr Trp Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Ala Ser Thr Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Phe Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln His Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 35 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ile Leu Ser Cys Gly Val Ser Asn Phe Arg Ile Ser Ala His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Arg Val Pro Gly Gly Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Leu Glu Asp Phe Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met His Lys Met Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Ser Asp Arg Leu Ser Asp Asn Asp Pro Phe Asp Ala 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Val Val 115 <210> 36 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 37 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 38 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Glu Gly Val His Arg Lys Pro Ser Phe Leu Ala Leu Pro Gly His 1 5 10 15 Leu Val Lys Ser Glu Glu Thr Val Ile Leu Gln Cys Trp Ser Asp Val 20 25 30 Met Phe Glu His Phe Leu Leu His Arg Glu Gly Lys Phe Asn Asn Thr 35 40 45 Leu His Leu Ile Gly Glu His His Asp Gly Val Ser Lys Ala Asn Phe 50 55 60 Ser Ile Gly Pro Met Met Pro Val Leu Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr 65 70 75 80 Gly Ser Val Pro His Ser Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Pro Ser Asp Pro 85 90 95 Leu Asp Met Val 100 <210> 39 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(109) <223> Xaa 3 is Q or R. Xaa 4 is L or M. Xaa 9 is S or F. Xaa 24 is R or W. Xaa 32 is A or Y. Xaa 41 is G or A. Xaa 47 is L or F. Xaa 50 is D or Y. Xaa 55 is E or Q. Xaa 71 is F or Y. Xaa 74 is A or T. <400> 39 Ala Ile Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Xaa Xaa Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Xaa 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Lys Ala Pro Lys Leu Xaa Ile 35 40 45 Tyr Xaa Ala Ser Ser Leu Xaa Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Leu Xaa Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 40 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(153) <223> n8 is a or g. n10 is t or a. n26 is c or t. n70 is c or t. n75 is a or c. n94 is g or t. n95 is c or a. n114 is g or a. n122 is g or c. n123 is g or a. n129 is t or c. n139 is c or t. n141 is g or c. n148 is g or t. n153 is c or a. <220> <221> misc_feature <222> (154)..(327) <223> n162 is g or a. n163 is g or c. n207 is a or g. n212 is t or a. n220 is g or a. <400> 40 gccatccngn tgacccagtc tccatnctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcn gggcnagtca gggcattagc agtnntttag cctggtatca gcanaaacca 120 gnnaaagcnc ctaagctcnt natctatnat gcntccagtt tnnaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacngat tncactctcn ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tattatagta ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaact 327 <210> 41 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ser Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Thr Arg Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Asp Ile Phe Lys Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gttaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg cacctccaac agctattcta ttaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tatttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt tccgcggacg aatccacgcg cacagtctac 240 atggagctga acagtctgag atctgaggat acggccgtgt attactgtgc gagaggatat 300 tacgatattt tcaaggacta ctattacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372

Claims (35)

  1. KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 각 하나에 결합하지만, KIR2DS4에는 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이것들의 단편으로서,
    상기 항체는
    (a) SEQ ID NO:17의 31-35 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; SEQ ID NO:17의 50-65 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; SEQ ID NO:17의 99-112 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; SEQ ID NO:15의 24-34 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; SEQ ID NO:15의 50-56 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; SEQ ID NO:15의 89-97 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 또는
    (b) SEQ ID NO:41의 31-35 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; SEQ ID NO:41의 50-66 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; SEQ ID NO:41의 99-113 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; SEQ ID NO:39의 24-34 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; SEQ ID NO:39의 50-56 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO:39의 89-97 잔기에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
    을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 추가적으로 KIR2DS3에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 KIR2DL1, KIR2DL2, 및 KIR2DL3 중 최소한 하나의 HLA-C 클래스 I 분자에 대한 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 HLA-Cw4 분자의 KIR2DL1에 대한 결합, 및 HLA-Cw3 분자의 KIR2DL2 또는 KIR2DL3 중 최소한 하나에 대한 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 HLA-C 클래스 I 분자를 발현시키는 인간 표적 세포에 대한 NK 셀의 용해 활성을 강화시키는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 (i) SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 (ii) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 0 초과 0.45 nM 이하의 KIR2DL1에 대한 해리 상수(Kd)를 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 0 초과 0.025 nM 이하의 KIR2DL3에 대한 해리 상수(Kd)를 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 아미노산 잔기 L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87, 및 Y88 잔기를 포함하는 KIR2DL1 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 HLA-Cw4 분자가 KIR2DL1(SEQ ID NO:23)의 세포 외 부분의 M44, F45 및 D72 잔기에 결합하는 것을 차단하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 IgG4 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항의 항체 또는 이것들의 단편을 코딩하는 핵산.
  19. 제 18 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제 19 항의 벡터를 포함하는 세포.
  21. 항-KIR 항체를 발현시키기 위하여 제 20 항의 세포를 시험관내(in vitro) 배양하는 단계를 포함하는,항-KIR 항체 또는 이것들의 단편을 시험관내에서(in vitro) 생산하는 방법.
  22. (a) 환자에서 NK세포의 세포독성을 검출가능하게 강화하기에 유효한 양으로,
    제 1 항 또는 제 2 항의 항체 또는 이것들의 단편; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제
    를 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 폴리소르베이트 80, 또는 수크로스를 포함하거나, 또는 폴리소르베이트 80 및 수크로스 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제 22 항에 있어서, 암은 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 다발성 골수종, 및 비 호지킨 림프종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  27. 제 22 항에 있어서, 암은 결장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암, 및 악성 흑색종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. (a) 환자에서 NK세포의 세포독성을 검출가능하게 강화하기에 유효한 양으로, 제 21 항의 방법에 의해 생산된 항체 또는 이것들의 단편; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제
    를 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 폴리소르베이트 80, 또는 수크로스를 포함하거나, 또는 폴리소르베이트 80 및 수크로스 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  32. 제 30 항에 있어서, 암은 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 다발성 골수종, 및 비 호지킨 림프종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  33. 제 30 항에 있어서, 암은 결장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암, 및 악성 흑색종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 또는 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  34. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단리된 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이것들의 단편인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
  35. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것들의 단편.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3579879A4 (en) * 2017-02-09 2020-12-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTI-BODY ANTI-KIR3DL1

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1125130B1 (de) * 1998-10-29 2006-07-26 DakoCytomation Denmark A/S Nachweis von säure-resistenten mikroorganismen im stuhl
KR101325023B1 (ko) * 2003-07-02 2013-11-04 노보 노르디스크 에이/에스 Ｎｋ 세포 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법
DK2287195T3 (da) * 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, Vol. 100, No. 12, pp. 4098-4107 (2002.12.01.) *
TISSUE ANTIGENS, Vol. 55, No. Supplement 1, pp. 80-81 (2000.) *

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