TWI413646B - 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途 - Google Patents

用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI413646B
TWI413646B TW099129879A TW99129879A TWI413646B TW I413646 B TWI413646 B TW I413646B TW 099129879 A TW099129879 A TW 099129879A TW 99129879 A TW99129879 A TW 99129879A TW I413646 B TWI413646 B TW I413646B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
matrix metalloproteinase
inhibiting
collagen
skin
expression
Prior art date
Application number
TW099129879A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201211060A (en
Inventor
jin bin Wu
Wen Chuan Lin
Hui Ya Ho
Sze Ying Chen
Original Assignee
Univ China Medical
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ China Medical filed Critical Univ China Medical
Priority to TW099129879A priority Critical patent/TWI413646B/zh
Priority to US12/955,336 priority patent/US8853271B2/en
Priority to EP11167430A priority patent/EP2425832A1/en
Priority to JP2011119563A priority patent/JP2012056937A/ja
Publication of TW201211060A publication Critical patent/TW201211060A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI413646B publication Critical patent/TWI413646B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/63—Steroids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

用於抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途
本發明係關於一種委陵菜酸(tormentic acid)於抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成，尤其是於改善、調理及/或修補皮膚之應用。
一般人隨著年紀的增長，老化的表徵會漸漸出現，例如皮膚鬆弛、皺紋生成及膚色暗沉等。皮膚的構造由上而下，依次為表皮層(epidermis)、真皮層(dermis)及皮下組織(hypodermis)，其老化原因可分為內因性及外因性。內因性之老化係指身體自然的老化過程，包含細胞自然死亡、荷爾蒙減少及免疫力降低。其中，荷爾蒙的分泌減少會減緩整體皮膚的新陳代謝，且因真皮層之纖維母細胞(fibroblast)的機能衰退，而逐漸停止製造膠原蛋白(collagen)及彈力纖維，使得真皮層之結締組織進入退化階段，造成皮膚鬆弛，甚至產生皺紋。此外，真皮層結締組織之退化亦會影響皮膚的儲水功能，導致皮膚乾燥及缺水等問題。
外因性之老化則係因外在因素(例如日曬、污染、自由基傷害及抽菸)所造成的老化。其中，損害皮膚最嚴重且加速皮膚老化的首要因素即為日光中之紫外線。紫外線依據波長可分為長波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)及短波紫外線(UVC)。一般日常生活中所接觸之紫外線，主要係長波紫外線及中波紫外線。長波紫外線及中波紫外線會使皮膚產生紅斑及曬傷、傷害皮膚細胞之去氧核醣核酸、以及造成皮膚免疫系統異常及皮膚癌等。紫外線所造成的老化現象稱為光老化，其會經由有絲分裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK pathway)之磷酸化作用而增加真皮層之基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)含量。基質金屬蛋白酶會分解膠原蛋白，減少皮膚中的膠原蛋白含量。若皮膚缺少膠原蛋白的支撐，其外觀會變得鬆弛，並造成角質層過度增生，進而使皮膚變得黯沉，並產生皺紋。
目前已發現的動物膠原蛋白大致可分成二十一種型式，依不同組織而有不同的膠原蛋白，其中以第一型(Type I)膠原蛋白的含量最多，也是用途最廣的膠原蛋白。於皮膚組織中，第一型膠原蛋白約占80%，而第三型(Type III)膠原蛋白約占20%。真皮層中的纖維母細胞主要係製造第一型膠原蛋白及第三型膠原蛋白供皮膚使用。
如上所述，由於基質金屬蛋白酶會分解膠原蛋白，減少皮膚中的膠原蛋白含量，因此，若能抑制細胞中之MAPK途徑或基質金屬蛋白酶之活性及/或生成，即可達到改善/增進膚質之功效。
本案發明人研究後發現，委陵菜酸(tormentic acid)具有優異之抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成的功效，可用於改善、調理及/或修補皮膚。
本發明之一目的在於提供一種用於抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、式(I)化合物之醫藥可接受鹽、式(I)化合物之醫藥可接受酯、及前述之組合：
本發明之又一目的在於提供一種使用式(I)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯於製造藥劑之用途，其中該藥劑係用於抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
於本文中(尤其後附申請專利範圍中)，除非另外說明，所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
本發明係關於一種用於抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、式(I)化合物之醫藥可接受鹽、式(I)化合物之醫藥可接受酯、及前述之組合：
本發明醫藥組合物具有抑制基質金屬蛋白酶活性及抑制基質金屬蛋白酶生成之功效，可防止或減緩膠原蛋白被破壞。基質金屬蛋白酶主要可分為膠原蛋白酶(collagenase)、基質酶(stromelysin)、膠質酶(gelatinase)、基酶(matrilysin)、及膜型基質金屬蛋白酶(transmembrane type-MMP)等類型。常見之基質金屬蛋白酶包括基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶-10(MMP-10)、基質金屬蛋白酶-11(MMP-11)、基質金屬蛋白酶-12(MMP-12)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)、及基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)等。本發明之醫藥組合物，尤其可有效抑制基質金屬蛋白酶-1之生成(或表現)。基質金屬蛋白酶-1屬於膠原蛋白酶，亦稱作膠原蛋白酶-1(collagenase-1)，且另具別名為組織型膠原蛋白酶(tissue collagenase)或纖維母細胞型膠原蛋白酶(fibroblast-type collagenase)。
除具有抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成之功效之外，本發明之醫藥組合物亦具有抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化之功效，尤其可抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)、細胞外訊息調控蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)及p38蛋白質之磷酸化。如上所述，有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化會增加真皮層之基質金屬蛋白酶的量，進而增加膠原蛋白被分解的機會，使皮膚中的膠原蛋白含量減少。
由於本發明之醫藥組合物同時兼具(1)直接抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成，及(2)藉由抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化，進而亦可間接抑制基質金屬蛋白酶之生成的功效，故可大幅減少皮膚中膠原蛋白被分解或變性的機會，藉此增加膠原蛋白之含量，尤其是增加第一型膠原蛋白之含量，進而有效改善、調理及/或修補皮膚，例如可達到抗老化、抗光老化、減少皮膚皺紋、改善膚質及皮膚鬆弛現象、及促進傷口癒合等功效。
式(I)化合物(即，委陵菜酸)可採如下方法製得。使用約95體積%乙醇萃取經培養之枇杷葉細胞，以濾紙過濾，收集濾液並減壓濃縮，以獲得一濃縮物。接著以約50體積%甲醇溶解該濃縮物，以濾紙過濾，收集未溶解部分。其後，使用約85體積%甲醇溶解未溶解部分，以濾紙過濾，收集濾液，再對濾液進行減壓濃縮，獲得枇杷葉細胞之萃取物，於此萃取物中，含有特別令人滿意含量的式(I)化合物。最後，使用高效能液相層析儀純化出式(I)化合物。
本發明醫藥組合物可呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，可呈供直接外用之乳液、乳霜或凝膠形式，例如保養品、化妝品等。或者，可將其製備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。此外，亦可呈一般常見之藥劑形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、酊劑、靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑及乾粉懸液注射劑等等。
本發明醫藥組合物之用量，可依照所施用對象之年紀及施用目的(例如減少皮膚皺紋或促進傷口癒合)而加以調整，亦可視需要調整使用頻率。至於本發明醫藥組合物中之其它成分及其含量，端視組合物之最終形式而定。舉例言之，當製備皮膚用之保養品時，可添加任何合宜且適量的乳化劑、香料及其它可改善膚質之活性成分等。原則上，只要所添加的其它成分之種類及含量，不會對式(I)化合物之功效有不利的影響即可。
本發明另關於一種使用式(I)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯於製造藥劑之用途，其中該藥劑係用於抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成，故可用於改善、調理及/或修補皮膚，尤其可用於抗皮膚之光老化。此外，該藥劑尤其可用於抑制基質金屬蛋白酶-1之活性及/或生成、及/或促進第一型膠原蛋白之生成。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。
[實施例]
[實施例1]製備委陵菜酸(式(I)化合物)
(1)建立枇杷無菌苗
自台中縣頭汴坑之果園中，採集成熟之枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)種子，並以水沖洗30分鐘。以70%乙醇浸泡種子達約1分鐘，再改浸泡於含有0.01%聚山梨醇酯20(Tween 20)之1%次氯酸鈉溶液，並置於超音波震盪器中，進行表面消毒約15分鐘後，再移至無菌操作台。以滅菌水清洗種子三至四次，於含有30公克/公升蔗糖之MS培養基(Murashige-Skoog medium)中培養種子。二至三週後，種子開始發芽，收集發芽後二個月之種子苗的葉片，以作為試驗材料。
(2)誘導癒傷組織(callus tissue)
割劃種子苗之葉片約0.3公分，並將其移入固態培養基(MS基本配方中包含2.5 ppm之6-苄基腺嘌呤(BA，6-benzyladenine)、1 ppm之α-萘乙酸(NAA，α-naphthaleneacetic acid)、3%(30公克/公升)蔗糖及0.3%(3公克/公升)水晶洋菜(gelrite))中培養。一個月後，自經割劃之傷口處長出淺黃色癒傷組織。
(3)培養枇杷葉細胞
取約60公克之上述淺黃色癒傷組織(可分化成新生之枇杷葉細胞)，並利用590微米之篩網過篩，使癒傷組織細胞分散成一定大小後，將其移入含4,000毫升培養液(MS基本配方中包含2.5 ppm之BA、1 ppm之NAA及3%(30公克/公升)蔗糖)之生物反應器(BioFlo110 Bioreactor，New Brunswick Scientific，美國)中培養(培養條件：通氣量為0.3 v.v.m.(每分鐘每單位液體體積之氣體體積流量，gas volume flow per unit of liquid volume per minute)，攪拌速度為40轉/分鐘，溫度為24至26℃)。每十天繼代新的培養液，並於每次繼代時，留下500毫升舊的懸浮細胞液(即培養液)，再加入4,500毫升新的培養液。將另外4,500毫升舊的懸浮細胞液(含細胞鮮重約320公克)移入含25.5公升培養液(MS基本配方中包含2.5 ppm之BA、1 ppm之NAA及3%(30公克/公升)蔗糖)之生物反應器(體積為30公升之不鏽鋼瓶)中，並添加1 ppm之枇杷葉細胞萃餘物至培養液中，以繼續培養經分化之枇杷葉細胞。於18天後，終止培養。
(4)製備枇杷葉細胞萃餘物
於一獨立之培養批次中，獲得經培養之枇杷葉細胞，將其乾燥(乾燥前約5,400公克，乾燥後約320公克)，並以95體積%之乙醇進行回流萃取三次後，以濾紙過濾，收集濾液並進行減壓濃縮。以50體積%甲醇溶解濃縮物，溶解二次後，以濾紙過濾，取未溶解部分。之後，再用85體積%甲醇溶解該未溶解部分，溶解三次，以濾紙過濾，收集未溶解部分，即獲得枇杷葉細胞萃餘物。
(5)製備枇杷葉細胞萃取物
於一獨立之培養批次中，獲得經培養之枇杷葉細胞，於60℃下將其乾燥(乾燥前約5,400公克，乾燥後約320公克)，並以10公升之95體積%乙醇進行回流萃取三次後，以濾紙過濾，收集濾液並進行減壓濃縮。以5公升之50體積%甲醇溶解濃縮物，溶解二次後，以濾紙過濾，取未溶解部分。之後，再用10公升之85體積%甲醇溶解該未溶解部分，溶解三次，以濾紙過濾，收集濾液，並進行減壓濃縮，即可獲得約53公克白色粉狀之枇杷葉細胞萃取物。經上述步驟製得之枇杷葉細胞萃取物實質上不包含50體積%甲醇可溶解成分與85體積%甲醇不可溶解成分。
(6)純化委陵菜酸
將約1公克之白色粉狀枇杷葉細胞之萃取物置於矽膠(LiChroprep RP-18，E. Merck，40至63微米)上，以甲醇對水之比例為8：2至10:0之濃度分配，再利用製備型高效能液相層析儀(HPLC，幫浦：Shimadzu LC-8A(日本，京都)；移動相：85體積%甲醇；流速：3毫升/分鐘；管柱：YMC，J’ Sphere series ODS-H80管柱(內徑為10毫米，長為250毫米，顆粒尺寸為5微米)純化，可以得到委陵菜酸。
利用質譜(Jeol GCmate，日本，東京)與NMR(1 H，13 C，DEPT，COSY，HMQC，HMBC，Jeol 500 MHz，日本，東京)分析經純化之化合物，其中，主要成分經確認為委陵菜酸(式(1)化合物)。
委陵菜酸(25.3毫克)：1 H-NMR(吡啶-d5 ):δ0.92(3H,s,H-24),δ1.00(3H,s,H-25),δ1.12(3H,s,H-26),δ1.12(3H,s,H-30),δ1.28(3H,s,H-23),δ1.43(3H,s,H-29),δ1.65(3H,s,H-27),1.74(1H,t,J =12.7 Hz,H-1),1.90(1H,dd,J =12.0、3.8 Hz,H-1),δ2.34(1H,td,J =13.2、4.1Hz,H-15),δ3.05(3H,s,H-18),δ3.14(1H,td,J =13.1、4.1 Hz,H-16),δ3.77(3H,s,H-3),δ4.31(1H,dt,J =10、2.6 Hz,H-2),δ5.59(1H,s,H-12).13 C-NMR(吡啶-d5 )：δ17.1(C-30),17.2(C-25),19.1(C-6),22.8(C-24),17.7(C-26),24.5(C-11),25.1(C-27),26.9(C-16),27.4(C-21),27.6(C-29),29.7(2C,C-15,C-23),34.0(C-7),39.0(C-22),39.1(C-10),39.3(C-4),41.1(C-8),42.6(C-1),42.8(C-20),43.3(C-14),48.1(C-9),48.7(C-17),49.2(C-5),55.1(C-18),66.6(C-2),73.2(C-19),79.8(C-3),128.5(C-12),140.4(C-13),181.2(C-28)。
(7)測定委陵菜酸含量
以HPLC測定委陵菜酸含量。HPLC所用條件如下：幫浦係Shimadzu LC-10ATvp；折射率偵測器係Shimadzu RID-10A；管柱係HyPURITY C-18管柱(內徑為4.6毫米，長為250毫米，顆粒尺寸為5微米)；溶劑系統為甲醇/0.15體積%含水醋酸，甲醇：0.15體積%含水醋酸=85：15體積比，流速為0.5毫升/分鐘，溫度為35℃。如第1圖所示，以枇杷葉細胞之萃取物之乾重計，委陵菜酸之含量為約48重量%。
[實施例2]抑制基質金屬蛋白酶活性試驗
基質金屬蛋白酶(膠原蛋白酶)除可分解膠原蛋白外，亦可分解明膠。本實施例利用明膠的分解及市售膠原蛋白酶之受質(購自Calbiochem，la Jolla，加拿大)被分解後可產生螢光的特性，來檢測委陵菜酸對基質金屬蛋白酶的抑制作用。
實驗A、明膠分解試驗
在一微量小管中加入50微升緩衝液(pH 7.8，包含50毫莫耳濃度三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、10毫莫耳濃度氯化鈣、及0.15莫耳濃度氯化鈉)、30微升無菌水、10微升細菌基質金屬蛋白酶(0.1毫克/毫升，購自Sigma)，再加入10微升之含有不同濃度(25、50、100或200微克/毫升)委陵菜酸的溶液(溶於二甲基亞碸)或作為正對照組之四環黴素(doxycycline)，將混合物混合均勻，並靜置於室溫下反應60分鐘。
吸取30微升之混合液，並滴於一覆蓋於一明膠培養基上之圓形濾紙片上，再置於37℃之培養箱中。反應18小時後，移除濾紙片，再以考馬司藍(Coomassie Blue)R-250染色液(購自Amresco公司，美國)染色培養基，再以退染液退染。明膠受到基質金屬蛋白酶分解後，不會被Coomassie Blue所染色，培養基呈現之透明度可顯現基質金屬蛋白酶的活性。拍照紀錄培養基後，以影像分析軟體(AlphaDigiDoc 1201，購自Alpha Innotech Co.公司，美國)計算委陵菜酸對基質金屬蛋白酶分解明膠之活性的抑制率。試驗結果係如表1及第2圖所示。
如表1及第2圖所示，委陵菜酸明顯抑制基質金屬蛋白酶對明膠之分解活性。
實驗B、螢光受質試驗
將定量的膠原蛋白酶受質III(Mcc-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Lys(DNP)-OH，購自Calbiochem，la Jolla，加拿大)溶液、基質金屬蛋白酶(膠原蛋白酶，購自Sigma)溶液與委陵菜酸或作為正對照組之四環黴素混合，並加入一96孔培養盤中。利用一ELISA讀取器在螢光激發光285奈米及放射光405奈米的條件下，測定吸光值。結果係如表2及第3圖所示，其中ΔF係減掉時間為零時一開始的基本值的螢光值。
表2及第3圖顯示委陵菜酸能減少螢光的產生，說明委陵菜酸能抑制基質金屬蛋白酶分解膠原蛋白酶受質III的活性。
實驗A及實驗B之結果說明，本發明醫藥組合物可抑制基質金屬蛋白酶之活性。
[實施例3]細胞試驗
實驗C、細胞存活試驗
以WS1人類真皮纖維母細胞(購自材團法人食品工業發展研究所)進行以下試驗。紫外線於0至120毫焦耳/平方公分之照射量範圍內，不會使WS1人類真皮纖維母細胞死亡，因此，以90毫焦耳/平方公分之照射量進行實驗。首先，分別添加不同濃度的委陵菜酸(0、0.1、1.0、2.0或10微克/毫升)至含有WS1人類真皮纖維母細胞之培養皿(成分為α-最小基礎培養基、10%之經熱去活性之胎牛血清、100活性單位/毫升之盤尼西林、及100微克/毫升之鏈黴素)中，並培養24小時後，以MTS(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，購自Promega，Madison，威斯康辛州，美國)測量細胞存活率，其結果列於表3。於此，MTS的作用原理為：由於活細胞具脫氫酶之活性，故可將MTS還原成紅紫色水溶性的產物，而其在490奈米之波長下有最高吸光值，因此，由吸光值比率即可判斷細胞之存活率。
如表3所示，在90毫焦耳/平方公分之紫外線照射下，委陵菜酸在10微克/毫升之濃度下會引起細胞死亡，但當劑量在2微克/毫升之濃度以下時，則不會引起細胞死亡。此試驗說明委陵菜酸於低劑量下不具細胞毒性。
實驗D、前膠原蛋白-1及基質金屬蛋白酶-1之蛋白質分析
取出實驗C中之WS1人類真皮纖維母細胞內的蛋白質，並利用西方點墨法(western blotting)分析細胞內蛋白質的表現情形，結果顯示於第4圖。如第4圖所示，WS1人類真皮纖維母細胞在紫外線照射後24小時，其前膠原蛋白-1(procollagen-1)之表現量減少，基質金屬蛋白酶-1之表現量則增加。但在收集細胞前，以委陵菜酸處理1小時，則可抑制基質金屬蛋白酶-1之表現及增強前膠原蛋白-1之表現。
此試驗說明，本發明之醫藥組合物可抑制基質金屬蛋白酶-1之生成，且可促進膠原蛋白之生成。
實驗E、有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化分析
由於紫外線所造成的皮膚光老化，會經由有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化作用而增加真皮層之基質金屬蛋白酶含量，故於此實驗中，亦使用西方點墨法分析委陵菜酸對細胞內有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化的影響，結果顯示於第5圖。
如第5圖所示，WS1人類真皮纖維母細胞在紫外線照射後24小時，三種有絲分裂原活化蛋白激酶(即c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)、細胞外訊息調控蛋白激酶(ERK)及p38)之磷酸化蛋白質的表現量增加。但在收集細胞前，以委陵菜酸處理1小時，則可抑制磷酸化JNK、ERK及p38之表現。
此試驗說明，本發明之醫藥組合物可經由抑制有絲分裂原活化蛋白激酶途徑來抑制基質金屬蛋白酶-1之生成，且可促進膠原蛋白之生成。
實驗F、活化子蛋白質-1基因轉錄因子之表現分析
紫外光照射細胞誘導JNK、p38活化c-Jun進入細胞核後，c-Fos會受ERK及p38之調控而進入核內，兩次單元c-Jun及c-Fos結合成活化子蛋白質-1(AP-1，activator protein 1)基因轉錄因子並參與基因表達，且促進基質金屬蛋白酶-1之訊息RNA(mRNA)之轉錄增加，另一方面也可以減少前膠原蛋白-Iα1(procollagen α1 of Type I collagen)的基因表現。因此，於此實驗中，使用西方點墨法進一步分析細胞核內活化子蛋白質-1蛋白質的表現，結果顯示於第6圖。如第6圖所示，WS1人類真皮纖維母細胞在紫外線照射後24小時，細胞核內c-Jun及c-Fos蛋白質的表現量增加。但在收集細胞前，以委陵菜酸處理1小時，則可抑制c-Jun及c-Fos之表現。
此試驗說明，本發明之醫藥組合物可藉由抑制紫外光誘導之有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化來影響活化子蛋白質-1進入細胞核內，從而抑制基質金屬蛋白酶-1與前膠原蛋白-Iα1的基因轉錄。
[實施例4]動物試驗
實驗G、皮膚皺紋分析
使用7週齡之雄性SKH-1無毛小鼠(購自Charles river Lab，美國)進行以下試驗。將小鼠分為控制組(6隻)及UVB(中波紫外線)組(24隻)。UVB組每週照射UVB三次(即，週一、三、及五)，其中，UVB的照射強度除第1週為90毫焦耳/平方公分外，第2週起至第12週照射強度增強為120毫焦耳/平方公分。
UVB組又進一步分成三組，每組8隻。三組分別為僅照射UVB組、照射UVB及施用霜劑基劑組(以下簡稱為「基劑組」，基劑成分為0.5重量%野葛根(Pueraria mirifica )萃取物、5重量%角鯊烯(squalane)、2重量%維他命C磷酸鈉鹽(sodium ascorbyl phosphate)、5重量%之1,3-丁二醇、2重量%二伸丙甘醇、3重量%聚乙二醇400、0.5重量%黃原膠(xanthan gum)、5重量%甘油、及77重量%純水)、以及照射UVB及施用含有0.5重量%之枇杷葉萃取物(含有委陵菜酸)之霜劑組(以下簡稱為「萃取物組」)。其中，基劑組和萃取物組在每次照光結束後，立即在小鼠背部塗上0.2毫升基劑乳液或0.2毫升含有0.5重量%枇杷葉萃取物之霜劑。
於小鼠最後一次進行紫外線照射的隔天，測量小鼠皮膚厚度，並照相記錄觀察小鼠皮膚，依Bissett’s評估方法將皺紋程度分成0、2、4、6等四級評分(此可參見Kimet al .,Effects of ginseng saponins isolated from red ginseng on ultraviolet B-induced skin aging in hairless mice,Eur J Pharmacol . 2009;602:148-156，該文獻全文併於此處以供參考)。實驗結果顯示於第7圖。
如第7圖所示，相較於控制組，小鼠於紫外線照射12週後，背部皮膚厚度較厚，且產生明顯的皺紋，而萃取物組小鼠的皮膚厚度及皺紋程度顯著低於僅照射UVB組的小鼠，基劑組則無明顯改善效果。此試驗說明，委陵菜酸具有抗皮膚光老化之功效。
實驗H、組織染色分析-表皮層、真皮層及膠原蛋白分析
皮膚皺紋分析結束後，以二氧化碳麻醉並犧牲小鼠，取下其背部皮膚，分成6塊。相同位置的一塊浸泡在30重量%的糖水溶液中，以供製作冷凍切片，另一塊浸泡在10重量%的福馬林溶液中，供作石蠟切片，其餘四塊則分別放入夾鏈袋中標示收集，並保存在-80℃下。
取經浸泡於10重量%福馬林中達1週的皮膚組織，進行石蠟包埋及切片，並進行兩種染色，一種為一般的蘇木精及伊紅染色(hematoxylin and eosin stain，HE染色)，另一種則為膠原蛋白的特殊染色法，即，天狼星紅染色(Sirius Red stain)。將每隻小鼠的HE染色切片之影像檔隨機選取10個區塊，並利用影像分析軟體(Image-Pro Plus 5.1，購自Media Cybernetics，MD，美國公司分析表皮層和真皮層的厚度，計算兩者與整個皮膚厚度的比值，此試驗結果顯示於於第8圖。另一方面，分析計算天狼星紅染色切片之膠原蛋白佔整體皮膚之百分比，此結果顯示於第9圖。
如第8圖所示，HE染色結果說明，相較於控制組，小鼠經紫外線照射12週後，表皮層明顯增厚而真皮層明顯變薄，而枇杷葉萃取物可以減少表皮層厚度及增加真皮層厚度，基劑組則僅減少表皮層的厚度，對真皮層厚度沒有影響。
如第9圖所示，天狼星紅染色結果顯示，相較於控制組，小鼠經紫外線照射12週後，背部皮膚膠原蛋白明顯減少，而萃取物組小鼠皮膚內的膠原蛋白顯著多於僅照射UVB組，基劑組則沒有明顯改善的效果。
實驗H之結果說明，本發明醫藥組合物可增加皮膚真皮層中膠原蛋白的含量。
實驗1、組織染色分析-基質金屬蛋白酶-1分析
進行冷凍切片製作。取出實驗H中浸泡於30重量%糖水溶液中達24小時的皮膚組織，以冷凍包埋液包埋之，並放置在-80℃冰箱中。染色前，以冷凍切片機(Leica CM3050S，購自Leica公司，德國)切下6微米厚的皮膚組織樣本，並貼於一載玻片上，再立即用冰丙酮於室溫下固定10分鐘。之後，進行基質金屬蛋白酶-1之免疫組織螢光染色、COX-2(環氧化酵素-2，cyclooxygenase-2)免疫染色及過氧化氫染色。
基質金屬蛋白酶-1之免疫組織螢光染色係以下述方式進行：將冷凍切片以磷酸鹽緩衝液(PBS)沖洗三次，再將切片浸泡在5重量%牛乳中，並反應30分鐘，再以PBS沖洗三次。接著，添加基質金屬蛋白酶-1抗體(購自Santa Cruz)，以石蠟覆蓋切片並放入一濕潤的盒子中，於4℃下放置一晚後，再以PBS沖洗切片三次。添加螢光二級抗體(Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG(H+L)，購自Invitrogen)，用石蠟封口膜覆蓋切片並放入濕潤的盒子中，於室溫下避光放置45分鐘。再以PBS沖洗切片三次，在濕潤的狀態下覆上蓋玻片，避免產生氣泡，並立刻使用螢光顯微鏡拍照。利用影像分析軟體分析基質金屬蛋白酶-1所佔皮膚的面積比率，結果顯示於第10圖。
如第10圖所示，相較於控制組，小鼠經紫外線照射12週後，背部皮膚的基質金屬蛋白酶-1明顯增加，而萃取物組小鼠的基質金屬蛋白酶-1表現量低於僅照射UVB組。由於基劑組沒有明顯改善的效果，說明抗皮膚老化的效果主要是來自枇杷葉萃取物的作用。
實驗J、組織染色分析-抗發炎分析
COX-2免疫染色的部分則係將實驗H中之冷凍切片以PBS沖洗三次，將切片浸在0.3重量%過氧化氫/PBS中，於室溫下靜置10分鐘後，以PBS輕微沖洗切片。再將切片浸泡在一阻隔緩衝液(blocking buffer)中，於室溫下靜置30分鐘後，以PBS沖洗三次。添加COX-2一級抗體(購自Cell Signaling)，以石蠟封口膜覆蓋切片，並放入濕潤的盒子中，於4℃下放置一晚後，再以PBS沖洗三次。添加二級抗體，並於室溫下反應30分鐘，再利用免疫偵測套組(購自BioGenex，San Ramon，加拿大)及二胺基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)進行呈色，再以蘇木精染色後，脫水並封片，結果係如第11圖所示。
第11圖顯示，相較於控制組，小鼠經紫外線照射12週後，背部皮膚COX-2的表現明顯增加，而萃取物組小鼠的COX-2的表現低於僅照射UVB組，基劑組則沒有明顯改善的效果。此結果說明，含有委陵菜酸的枇杷葉萃取物能經由抗發炎作用來達成抗皮膚老化的效果。
實驗K、組織染色分析-抗氧化分析
過氧化氫切片染色係依照Dannenberg等人之方法進行(此可參見Dannenberget al .,Histochemical demonstration of hydrogen peroxide production by leukocytes in fixed-frozen tissue sections of inflammatory lesions.J Leukoc Biol. 1994;5:436-43，該文獻全文併於此處以供參考)。將實驗F中之冷凍切片浸泡在包含1毫克/毫升葡萄糖和1毫克/毫升二胺基聯苯胺之0.1莫耳濃度Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)中，放入37℃培養箱內6小時。之後，以PBS沖洗切片三次，再以蘇木紫染色，略微沖洗後，在濕潤的狀態下覆上蓋玻片，避免產生氣泡，並立刻以顯微鏡拍照。利用影像分析軟體分析過氧化氫所佔的面積比率，結果顯示於第12圖。
如第12圖所示，相較於控制組，小鼠經紫外線照射12週後，背部皮膚的過氧化氫的量明顯增加，萃取物組小鼠的過氧化氫量低於僅照射UVB組，基劑組則沒有明顯改善的效果。此結果說明，含有委陵菜酸的枇杷葉萃取物能經由減少氧化壓力之傷害來達成抗皮膚老化的效果。
以上實施例顯示本發明之醫藥組合物具有改善、調理及/或修補皮膚的功效。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。
第1圖所示為枇杷葉細胞萃取物中委陵菜酸的高效能液相層析圖；
第2圖所示為委陵菜酸抑制基質金屬蛋白酶分解明膠活性的染色圖及直條圖；
第3圖所示為委陵菜酸抑制基質金屬蛋白酶分解膠原蛋白酶受質活性的直條圖；
第4圖所示為WS1人類真皮纖維母細胞中之前膠原蛋白-1及基質金屬蛋白酶-1的蛋白質電泳圖；
第5圖所示為WS1人類真皮纖維母細胞中之未磷酸化及磷酸化之有絲分裂原活化蛋白激酶(JNK、ERK及P38蛋白質)的蛋白質電泳圖第6圖所示為WS1人類真皮纖維母細胞中之細胞核內活化子蛋白質-1的蛋白質電泳圖
第7圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚厚度及皺紋變化的照片及直條圖；
第8圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚表皮層及真皮層厚度之變化的染色圖及直條圖；
第9圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚真皮層膠原蛋白所佔面積比率之變化的染色圖及直條圖；
第10圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚中基質金屬蛋白酶-1所佔面積比率之變化的染色圖及直條圖；
第11圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚中環氧化酵素-2之變化的染色圖；以及
第12圖所示為小鼠照射紫外線後皮膚中過氧化氫所佔面積比率之變化的染色圖及直條圖。

Claims (5)

  1. 一種使用式(I)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯於製造藥劑之用途： 其中該藥劑係用於抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及/或促進膠原蛋白生成。
  2. 如請求項1之用途，其中該基質金屬蛋白酶為基質金屬蛋白酶-1，且該有絲分裂原活化蛋白激酶包含c-Jun氨基末端激酶、細胞外訊息調控蛋白激酶及p38蛋白質。
  3. 如請求項1之用途，其中該膠原蛋白係第一型膠原蛋白。
  4. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於改善、調理及/或修補皮膚。
  5. 如請求項1之用途，其係用於抗皮膚之光老化。
TW099129879A 2010-09-03 2010-09-03 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途 TWI413646B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW099129879A TWI413646B (zh) 2010-09-03 2010-09-03 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途
US12/955,336 US8853271B2 (en) 2010-09-03 2010-11-29 Method for inhibiting activity and/or expression of matrix metalloproteinase, inhibiting phosphorylation of mitogen-activated protein kinase, and/or promoting expression of collagen using tormentic acid
EP11167430A EP2425832A1 (en) 2010-09-03 2011-05-25 Tormentic acid for the treatment of skin disorders
JP2011119563A JP2012056937A (ja) 2010-09-03 2011-05-27 マトリックスメタロプロテアーゼの活性及び／若しくは発現を抑制し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制し、並びに／又はコラーゲンの発現を促進するための医薬組成物、並びにその使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW099129879A TWI413646B (zh) 2010-09-03 2010-09-03 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201211060A TW201211060A (en) 2012-03-16
TWI413646B true TWI413646B (zh) 2013-11-01

Family

ID=44720523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW099129879A TWI413646B (zh) 2010-09-03 2010-09-03 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8853271B2 (zh)
EP (1) EP2425832A1 (zh)
JP (1) JP2012056937A (zh)
TW (1) TWI413646B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014177454A (ja) * 2013-02-18 2014-09-25 Kagoshima Univ ねじめびわ茶抽出物を含有する飲食品及び医薬品
JP2016140270A (ja) * 2015-01-30 2016-08-08 富士電機株式会社 排水処理性能の評価方法
CN105106222B (zh) * 2015-09-14 2020-05-08 新乡医学院 吐曼酸在制备治疗或预防雌激素缺乏引起的阿尔茨海默病药物中的应用
JP2018058800A (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 国立大学法人九州大学 メラニン抑制剤

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001213778A (ja) * 2000-02-03 2001-08-07 Pola Chem Ind Inc 負荷ストレス軽減剤及びそれを含有する皮膚外用剤
DE10359153A1 (de) * 2003-12-16 2005-07-28 Krutmann, Jean, Prof. Dr.med. Verwendung von Triterpen-Derivaten zur systemischen Behandlung und Prophylaxe von UV-induzierten Dermatosen und unerwünschten Langzeitfolgen von UV-Bestrahlungen
WO2006010147A2 (en) * 2004-07-14 2006-01-26 Eldridge Gary R Control of biofilm formation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2940964B2 (ja) 1989-12-15 1999-08-25 株式会社資生堂 テストステロン―５α―レダクターゼ阻害剤
JP3188019B2 (ja) 1993-03-15 2001-07-16 株式会社東芝 洗濯機
US7387801B2 (en) * 2002-12-10 2008-06-17 The Chinese University Of Hong Kong Organic extract of Geum japonicum Thunb variant and use thereof
US8652534B2 (en) * 2009-10-14 2014-02-18 Berry Pharmaceuticals, LLC Compositions and methods for treatment of mammalian skin

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001213778A (ja) * 2000-02-03 2001-08-07 Pola Chem Ind Inc 負荷ストレス軽減剤及びそれを含有する皮膚外用剤
DE10359153A1 (de) * 2003-12-16 2005-07-28 Krutmann, Jean, Prof. Dr.med. Verwendung von Triterpen-Derivaten zur systemischen Behandlung und Prophylaxe von UV-induzierten Dermatosen und unerwünschten Langzeitfolgen von UV-Bestrahlungen
WO2006010147A2 (en) * 2004-07-14 2006-01-26 Eldridge Gary R Control of biofilm formation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Moon et, al.,"The effect of erythrodiol-3-acetate on the expressions of matrix metalloproteinase-1 and type-1 procollagen caused by ultraviolet irradiated cultured primary old aged human skin fibroblasts.",Phytomedicine, 2006, Vol. 13, p.707-711 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201211060A (en) 2012-03-16
US20120059059A1 (en) 2012-03-08
JP2012056937A (ja) 2012-03-22
US8853271B2 (en) 2014-10-07
EP2425832A1 (en) 2012-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010132639A (ja) Ｄｎａ損傷抑制剤及びマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤
KR101972071B1 (ko) 피부톤 개선 또는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물
KR20090098732A (ko) 항염증, 항산화 또는 항세균 조성물
CN110997694A (zh) 可用于治疗和/或护理皮肤、毛发、指甲和/或粘膜的化合物
CN102421412B (zh) 含有日本扁柏多糖的皮肤外用组合物
TWI413646B (zh) 用於抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、及／或促進膠原蛋白生成之醫藥組合物及其用途
JP6437342B2 (ja) 特定の波長域を有する光を照射して栽培したエキナセアの抽出物を含有する皮膚外用剤や内用剤。
JP2011016726A (ja) 皮膚外用組成物
JP3619185B2 (ja) 化粧料
KR101685251B1 (ko) 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법
KR102261105B1 (ko) 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 aesis-1p3 및 이의 용도
JP2009184960A (ja) 美白化粧料
KR20080068077A (ko) 섬유아세포 활성화제 및 섬유아세포 활성화 방법, 콜라겐합성 촉진제 및 콜라겐 합성 촉진 방법, 및 피부 노화방지제 및 피부 노화 방지 방법
JP6779627B2 (ja) 月下美人のカルス作出方法及び、その抽出物を有効成分とする皮膚外用剤や内用剤など
KR101074132B1 (ko) 함초 캘러스 추출물과 채널드랙 추출물을 함유하는 피부주름개선 또는 탄력증진용 화장료 조성물
KR20090036904A (ko) 하고초 추출물과 아데노신을 함유하는 화장료 조성물
JP5155543B2 (ja) エンドセリン−１産生抑制剤、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤、抗炎症用／美白用皮膚外用剤、エンドセリン−１の産生抑制方法及びヘキソサミニダーゼの遊離抑制方法
US20230172825A1 (en) Composition for improving skin comprising amino acid complex as active ingredient
KR102052522B1 (ko) 인삼 다당체와 녹차 다당체를 함유하는 항산화용 조성물
KR102206085B1 (ko) 들깨박 유래 비검화물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물
US20230002449A1 (en) Derived peptide of lactoferrin and method thereof for promoting and/or increasing lipid synthesis
TW201501727A (zh) 以纖維二糖酯作為有效成分之賦活化劑及膠原蛋白產生促進劑
JP2024038890A (ja) エクソソームの機能亢進剤
CN111265467A (zh) 一种利用干细胞提取物和复合植物提取物混合制备的抗敏修复剂及其制备方法
US8481095B2 (en) Method for anti-oxidation, inhibiting activity and/or expression of matrix metalloproteinase, and/or inhibiting phosporylation of mitogen-activated protein kinase using flemingia macrophylla extract

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees