TWI405595B - 對玻尿酸溶液滅菌之方法及經滅菌之玻尿酸水溶液 - Google Patents

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Description

對玻尿酸溶液滅菌之方法及經滅菌之玻尿酸水溶液
本發明係關於含有玻尿酸之經過濾滅菌之水溶液，及製備商業量之包含玻尿酸之無菌溶液的方法。
不幸的是，許多生物聚合物對常用滅菌程序(例如加熱滅菌)敏感。加熱滅菌通常可導致生物聚合物之物理化學性質顯著改變，使得所得無菌生物聚合物變得不適合其預定用途。
目前應用於醫學材料之滅菌方法包括例如熱處理、高壓蒸氣滅菌(例如高壓釜滅菌)、環氧乙烷氣體(EOG)滅菌、超臨界二氧化碳滅菌及輻射滅菌。參見例如美國專利第6,891,035號、美國專利第6,149,864號、美國專利第5,621,093號、美國專利第4,263,253號、US 2006/0292030及US 2007/0009578。通常關於待滅菌之特定生物聚合物之穩固性來評估可利用之滅菌方法。舉例而言，僅可在生物聚合物可承受高溫及高壓之程度下對生物聚合物使用高壓蒸氣滅菌。然而，極少數生物聚合物(包括玻尿酸)可承受該等高溫及高壓。EOG滅菌可為適用的，因為該方法抑制生物聚合物之熱分解。然而，組合物中存在之殘餘環氧乙烷可能造成問題。
玻尿酸為非免疫原性物質且由於其黏彈性及親水性，多年來玻尿酸已用作眼睛玻璃體或關節液替代物或用作眼科手術中之支援性介質，如例如Balazs之美國專利第4,141,973號中所揭示。在關節液中，玻尿酸溶液用作潤滑劑以提供細胞之保護性環境，且因此，其用於治療膝關節發炎。Chemedica S. A.之EP-A-0 698 388揭示用作人工眼淚之眼用製劑，其含有玻尿酸鹽作為黏度增稠劑。包括玻尿酸之產品之消費使用需要製造商將消費產品滅菌，且若以開放多劑量調配物形式使用，則必須採取其他步驟以保存調配產品。
玻尿酸為一種已知對加熱消毒法非常敏感之生物聚合物。已知玻尿酸之加熱滅菌加速玻尿酸之水解或氧化，由此導致該生物聚合物之平均分子量的顯著且通常不利之減小。對於許多醫藥應用而言，調配物中相對低分子量形式之玻尿酸不合需要。通常，低分子量形式之玻尿酸不提供所需的高分子量形式之玻尿酸之流變學性質。為補償上述加熱滅菌方法中分解之玻尿酸，可能以具有比所需更高之分子量之玻尿酸開始。然而，此調節導致方法低效，因為當生物聚合物之平均分子量增加時玻尿酸之產物產率降低。
對玻尿酸進行滅菌之另一已知方法為過濾。工業方法中使用常用過濾法來製備濃縮形式之純玻尿酸鹽，通常呈乾粉形式，藉此使水溶液通過過濾器且隨後乾燥。該種過濾法描述於歐洲專利申請案EP 867453及WO 00/44925中。美國公開案第2006/0052336號描述一種在相對較低之玻尿酸濃度下以降低溶液之黏度對高分子量玻尿酸進行過濾滅菌的方法。過濾步驟之後，藉由施加真空及移除水來濃縮溶液中之玻尿酸濃度以獲得所要更濃縮形式之玻尿酸。
美國專利第5,093,487號描述一種製備含有高分子量形式玻尿酸(較佳大於1.2 MDa)之水溶液的方法，藉由降低溶液黏度，該溶液可更容易地過濾。據稱可藉由「受控熱處理」或藉由「在高壓或真空下經由小孔膜過濾最低濃度溶液」來實現此溶液黏度之降低。此等降低黏度之方法亦產生隨時間保持較低黏度之玻尿酸形式，亦即據稱黏度之誘導降低不可逆。詳言之，描述在一個月處理期間在不同加熱溫度下(30℃、40℃及50℃)對初始重量平均分子量為1.1 MDa之1 wt.%玻尿酸溶液進行熱處理。對於每一玻尿酸溶液均未報導重量平均分子量減小。'487專利亦報導出於滅菌需要，經熱處理之玻尿酸溶液可經由0.22微米孔徑過濾器過濾。
Blumberg等人在Changes in Physical Characteristics of Hyaluronate 第1454-61頁中報導玻尿酸溶液的物理性質隨氯化鈉濃度之變化而改變。就黏度而言，溶液之離子強度增加導致黏度降低。在添加相對少量之鹽後觀測到黏度降低。「在約0.5 M[NaCl]之後，[黏度]逐漸下降，且在1.3 M之後，即使添加大量鹽，黏度亦只有極小改變。(After approximately 0.5 M[NaCl],the drop[in viscosity]is gradual and after 1.3 M,there is very little change with the addition of even large amounts of salt.)」同上，第1456頁。換言之，在恰低於生理鹽水之濃度的情況下，黏度對鈉離子濃度之改變非常敏感，而在超過「約0.15之鈉離子強度後，玻尿酸鹽相對不敏感(sodium ion strength of approximately 0.15,the hyaluronate is relatively insensitive.)」同上，第1459頁。
基於上述內容，可見生物聚合物水溶液(且尤其玻尿酸之水溶液)之滅菌根本不循常規，且關於得到實質上無降級之無菌溶液存在許多技術挑戰。若目標為商業規模批量生產，則此等技術挑戰亦放大。
本發明係關於一種對包含玻尿酸之溶液進行滅菌的方法。該方法包含提供重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸的水溶液，且玻尿酸之濃度為0.04重量%至0.8重量%。該水溶液亦具有相當於3重量%至30重量%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。製備高鹽玻尿酸水溶液後，即將該溶液保持在40℃至80℃之溫度下至少1小時且不超過6天。熱處理步驟之後，將該水溶液經由滅菌過濾介質過濾以得到經滅菌之高鹽玻尿酸溶液。
在一實施例中，該方法包含提供重量平均分子量為0.8 MDa至2.2 MDa之玻尿酸的水溶液，且玻尿酸之濃度為0.1重量%至0.5重量%。該水溶液亦具有相當於4重量%至18重量%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。製備高鹽玻尿酸水溶液後，即將該溶液保持在50℃至75℃之溫度下至少1小時且不超過18小時。熱處理步驟之後，如所述將該水溶液經由滅菌過濾介質過濾。
本發明亦係關於一種水溶液，其包含0.04重量%至0.8重量%的重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸。玻尿酸水溶液亦包含4重量%至18重量%之氯化鈉、氯化鉀或其任一混合物，且該溶液經過濾滅菌。
本發明亦係關於一種高鹽玻尿酸水溶液，其包含相當於在1公升溶液中對於每1 g玻尿酸而言約25 g至60 g氯化鈉之離子強度。溶液中玻尿酸之濃度為0.05重量%至0.4重量%。
「無菌」組合物為如使用USP無菌性測試所測定不含有活力微生物的組合物。參見「美國藥典(The United States Pharmacopeia)」，第30修訂版，美國藥典委員會(The United States Pharmacopeial Convention)：2008。
術語「玻尿酸」係指包含重複的玻尿酸雙醣次單元之聚合物。該術語亦包括雙醣次單元之D-葡糖醛酸及/或D-N-乙醯葡糖胺重複次單元之一或多個位置經衍生化的聚合物。因此，術語玻尿酸包涵玻尿酸、玻尿酸之衍生形式及鹽形式(亦稱為玻尿酸鹽，例如玻尿酸鈉)。
玻尿酸為以由經β(1-3)及β(1-4)醣苷鍵連接之D-葡糖醛酸及N-乙醯基-D-葡糖胺組成之重複雙醣單位形成的線性多醣(長鏈生物聚合物)。玻尿酸因為不含與蛋白質及磺酸基團之共價連接而不同於其他葡糖胺聚糖。玻尿酸普遍存在於動物體內，最高濃度發現於軟結締組織中。其在體內之機械及輸送方面均起重要作用；例如其對關節提供彈性且對脊椎盤(vertebrate disk)提供剛性，且其亦為眼睛玻璃體之重要組分。
玻尿酸在眼科界中公認為可保護生物組織或細胞免受壓力影響之化合物。因此，已提出使用玻尿酸作為白內障手術中之黏彈性眼用組合物之組分。玻尿酸之黏彈性質(亦即在靜態條件下具有硬彈性而在小剪切力下具有較小黏性)使玻尿酸基本上能夠起細胞及組織減震器之作用。玻尿酸亦具有相對較大的吸收及固持水分之能力。玻尿酸之所述性質與分子量、溶液濃度及生理pH值有關。在低濃度下，個別鏈扭結並在溶液中形成連續網狀結構，此使系統具有令人感興趣的性質，諸如顯著黏彈性及低濃度下水溶性聚合物所獨具之假塑性。
已知玻尿酸溶液對熱及酸水解敏感，且因此若溶液經受促進多醣鍵水解之條件，則重量平均分子量通常隨時間而減小。在玻尿酸水溶液之情況下，在80℃以上(例如用於加熱滅菌之條件)延長加熱並不適合，觀測到玻尿酸之重量平均分子量實質上減小。使用0.22微米孔徑過濾器來對具有相對較高重量平均分子量玻尿酸之玻尿酸水溶液進行滅菌亦不適合，較小分子量部分容易通過過濾器而平均分子直徑大於0.2 μm之大的部分(平均MW為約0.6 MDa或0.6 MDa以上)通不過。然而申請人已發現，選擇處理條件促進對具有0.6 MDa至3.6 MDa重量平均分子量之玻尿酸之水溶液進行過濾滅菌。
所述處理條件提高玻尿酸水溶液之過濾效率。詳言之，所述處理條件使相對大規模批量生產之玻尿酸水溶液之滅菌成為可能。申請人證明含有重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸且玻尿酸濃度為0.04重量%至0.8重量%之水溶液的無菌過濾可經由0.22微米孔徑過濾器過濾，且因此可以大規模商業批量生產來進行滅菌。所述方法基本上依賴於溶液之指定熱處理及該溶液具有相對較高之離子強度。
一種製程條件涉及熱處理。在此情況下，將玻尿酸水溶液保持在40℃至80℃之溫度下至少1小時且不超過6天。然而，必須小心不能將溶液溫度保持在此溫度範圍之高端超過24小時，否則將會開始觀測到玻尿酸之重量平均分子量顯著減小。將溫度保持在80℃或80℃以上持續較長時間可能導致多醣鍵水解降解或氧化降解。考慮到關於使所觀測到的玻尿酸重量平均分子量減小最小熱處理持續時間與維持溫度之間的相關性，對於重量平均分子量為約0.6 MDa至1.6 MDa之玻尿酸所推薦之熱處理列於表1中。同樣，對於重量平均分子量為約1.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸所推薦之熱處理列於表2中。
第二製程條件涉及玻尿酸水溶液之離子強度。離子強度值說明及描述為相當於氯化鈉之指定水溶液濃度。申請人有時將玻尿酸水溶液之離子強度增加稱為聚合物之「鹽收縮纏繞(salt shrink wrapping)」。玻尿酸之「鹽收縮纏繞」最佳由以下水溶液中無規捲曲玻尿酸的示意圖描述。
因此，將足量一或多種鹽化合物與玻尿酸組合以提供高鹽玻尿酸水溶液，其具有相當於3 wt.%至30 wt.%、4 wt.%至18 wt.%或8 wt.%至14 wt.%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。
理想地，用於增加玻尿酸水溶液離子強度之一或多種鹽為所要產物調配物中所存在之鹽。舉例而言，若必需對調配物進行緩衝，則該等鹽之一可為緩衝液之鹽組分。在經硼酸鹽緩衝之調配物的情況下，該鹽可為鹼金屬硼酸鹽，例如硼酸鈉。同樣，在經檸檬酸鹽或磷酸鹽緩衝之調配物的情況下，該鹽可分別為鹼金屬檸檬酸鹽，例如檸檬酸鈉，或鹼金屬磷酸鹽，例如磷酸氫二鈉。一般技術者將瞭解任何鹽緩衝組分可用來增加玻尿酸水溶液之離子強度。
在製備眼用製劑之情況下，通常使用諸如NaCl或KCl之鹼金屬氯化物來控制製劑之滲透壓度。因此，可使用NaCl、KCl或該兩種鹽之某些組合來增加玻尿酸水溶液之離子強度。或者，可使用其他常見鹽，包括第II族金屬鹽，例如氯化鎂或氯化鈣。
在一實施例中，高鹽玻尿酸溶液之離子強度將為相當於在1公升溶液中對於每1公克玻尿酸而言約25 g至60 g氯化鈉。舉例而言，0.1 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約25 g至60 g氯化鈉之離子強度。同樣，0.2 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約50 g至120 g氯化鈉之離子強度。0.3 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約75 g至180 g氯化鈉之離子強度。
視情況添加酸
亦觀測到溶液之pH值影響玻尿酸水溶液通過0.22微米孔徑之滅菌過濾介質的效率。溶液之pH值亦可影響熱處理步驟中所使用溫度下之玻尿酸水解速率。pH值降至約4.2至約6.2之值，較佳pH值為約5.2至約6.2，亦可促進玻尿酸溶液之無菌過濾製程。通常，將添加與最終調配產物中所存在之緩衝鹽有關之緩衝酸。舉例而言，若必需對調配物進行緩衝，則將使用相應游離酸。在經硼酸鹽緩衝之調配物的情況下，可能將添加硼酸。同樣，在經檸檬酸鹽緩衝之調配物的情況下，可能將添加檸檬酸。
然而，若欲製備pH值小於約6.4之玻尿酸水溶液，且隨後使用所述方法過濾滅菌時，則需要權衡取捨。如所述，玻尿酸之水溶液對水解(亦即多醣鍵之水解性裂解)敏感，此導致玻尿酸之重量平均分子量不當減小。本申請人認為水解反應受所存在之酸催化，且因此較低pH值將通常對應於水解速率增加。因此，此項技術者面臨兩種競爭因素，且對於選定等級之玻尿酸必須決定最佳化無菌過濾製程之製程條件。溶液之較低pH值使得溶液黏度降低，且因此得到流經滅菌過濾器之較高流動速率。同時，較低pH值可導致水解速率增加且產生重量平均分子量較低之玻尿酸。
類似地，玻尿酸之水解速率亦在相對較高鹼性條件(例如pH值為至少7.8或7.8以上)下加速。因此，製備高鹽玻尿酸溶液所添加之較佳鹽為中性鹽，例如第I族或第II族金屬氯化物。所述玻尿酸之無菌過濾的較佳pH值範圍為約6.4至約7.2。
本申請人研究了兩種過濾玻尿酸溶液之孔徑為0.22微米之滅菌過濾介質：雙層聚醚碸(PES)介質及疏水性聚偏二氟乙烯(PVDF)介質。兩種過濾介質在實驗室規模下均操作良好，然而在商業製程環境中，較大之PVDF濾筒在批次與批次之間提供之流動速率更一致。
圖1為展示在各種不同製程條件下，處理約740 kg玻尿酸水溶液時所需之10吋濾筒之估計數目的條形圖。使用47 mm濾盤利用約2 L玻尿酸溶液進行實際研究。此等研究中之變數包括：玻尿酸濃度；如由溶液中之氯化鈉濃度所報導之溶液離子強度；所用過濾介質(PES或PVDF)；及溶液中不存在或存在硼酸。申請人試圖儘可能在研究進行中保持玻尿酸重量平均分子量一致，然而在研究批次中玻尿酸之重量平均分子量有微小變化。玻尿酸鈉之分子量及分子量分佈藉由具有線上三重偵測(on-line triple detection)之水溶液尺寸排阻層析法進行測定。參見Liu,X.M.等人。Detailed Characterization of Cationic Hydroxyethylcellulose Derivatives using Aqueous Size-Exclusion Chromatography with on-line Triple Detection. J. Chromatogr. A. 1104,2006. 145-153。
如熟習此項技術者所瞭解，所述無菌過濾製程受高鹽玻尿酸水溶液之黏度限制。因此，高鹽玻尿酸溶液中之玻尿酸濃度小於0.8 wt.%，因為玻尿酸濃度之任何進一步增加均將致使溶液過黏而難以過濾，即使對經熱處理之高鹽溶液亦如此。再次將溶液加熱超過80℃持續足以將較高濃度之玻尿酸過濾滅菌之時間將可能造成多醣鍵之顯著熱水解，從而導致重量平均分子量顯著減小且可能導致所要產物調配物最初所尋求之有益黏彈性喪失。
在許多實施例中，高鹽玻尿酸溶液中之玻尿酸濃度為0.04 wt.%至0.8 wt.%或0.1 wt.%至0.4 wt.%，例如約0.2 wt.%、約0.3 wt.%、約0.4 wt.%或約0.5 wt.%。
實例1 ，圖1。藉由在攪拌下將10.0 g玻尿酸(HA)與250 g NaCl(12.5 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約70℃下之1740.0 g純水中來製備0.5 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約1.8 MDa。在約20分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫且儲存於兩個塑料瓶中。該溶液之錐/板黏度在1 rpm下為304 cP，在17 rpm下為111 cP。
溶液A. [比較實例A]　藉由在攪拌下將10.0 g玻尿酸(HA)緩慢添加至不鏽容器中保持在約70℃下之1990.0 g純水中來製備0.5 wt.%玻尿酸。在約47分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫且儲存於兩個塑料瓶中。該溶液之錐/板黏度在1 rpm下為1343 cP，在17 rpm下為192.2 cP。
溶液B. [比較實例B]　藉由在攪拌下將20.0 g玻尿酸(HA)緩慢添加至不鏽容器中保持在約70℃下之1980.0 g純水中來製備1.0 wt.%玻尿酸。在約75分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫且儲存於兩個塑料瓶中。由於該溶液具有明顯高黏度，所以未獲得黏度量測值。
溶液C. [比較實例C]　藉由在攪拌下將15.0 g玻尿酸(HA)緩慢添加至不鏽容器中保持在約70℃下之485.0 g純水中來製備3.0 wt.%玻尿酸。在約150分鐘後HA呈現完全溶解。產物導致形成極黏稠、非可傾注凝膠，且實際上開始提昇攪拌軸。未獲得黏度量測值。
在一實施例中，所述無菌過濾製程包括以下針對0.22微米孔徑PES或PVDF濾筒之製程及溶液條件。商業上獲得呈精細乾粉狀的重量平均分子量為約0.7 MDa至約1.7 MDa之玻尿酸。將適量無水玻尿酸與適量氯化鈉一起添加至乾摻合容器中。兩種粉末經乾摻合有效地將玻尿酸稀釋於氯化鈉中。同時將純水添加至混合槽中且將水之溫度加熱至40℃至80℃且維持在40℃至80℃。將乾摻合之玻尿酸鹽/NaCl緩慢添加至純水中且攪拌溶液直至玻尿酸明顯地呈現完全溶於溶液中(亦即溶解)。隨後將高鹽玻尿酸溶液在40℃至80℃之溫度下加熱處理至少1小時且不超過6天。此外，應瞭解維持溫度愈高，熱處理持續時間愈短。熱處理之後，較佳將高鹽玻尿酸溶液冷卻至約45℃至55℃，當然，假設維持溫度高於55℃。
在許多實施例中，玻尿酸之重量平均分子量將為0.6 MDa至3.6 MDa、0.8 MDa至2.2 MDa、0.8 MDa至1.6 MDa或1.1 MDa至1.4 MDa。
實例2 ，圖1。藉由在攪拌下將10.0 g玻尿酸(HA)與500 g NaCl(12.5 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約78℃下之3490.0 g純水中來製備0.25 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約1.8 MDa。使溶液冷卻至室溫。該溶液之錐/板黏度在30 rpm下為16.3 cP。
實 例3 ，圖1。藉由在攪拌下將5.0 g玻尿酸(HA)與250 g NaCl(6.25 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約73℃下之3745.0 g純水中來製備0.125 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約1.4 MDa。在約75分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫。該溶液之錐/板黏度在60 rpm下為6.4 cP。
實例4 ，圖1。藉由在攪拌下將5.0 g玻尿酸(HA)與250 g NaCl(6.25 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中含有160 g硼酸(4 wt.%)保持在約76℃下之3485.0 g純水中來製備0.125 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約1.4 MDa。使溶液冷卻至室溫。該溶液之錐/板黏度在60 rpm下為3.5 cP。
如由圖1中所報導之資料所表明，具有4 wt.%硼酸之實例4之溶液通過PVDF濾盤之效率幾乎為無硼酸之比較溶液(亦即實例3之溶液)的兩倍。此外，實例4之溶液通過PES濾盤之效率為實例3之溶液的5倍。
實例5 ，圖1。藉由在攪拌下將5.0 g玻尿酸(HA)與250 g NaCl(12.5 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約75℃下之1745.0 g純水中來製備0.25 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約0.8 MDa。在約30分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫。該溶液之錐/板黏度在60 rpm下為8.3 cP。
實例6 ，圖1。藉由在攪拌下將4.0 g玻尿酸(HA)與200 g NaCl(12.5 wt.%)之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約73℃下之1396.0 g純水中來製備0.25 wt.%玻尿酸。HA之報導重量平均分子量為約0.7 MDa。在約30分鐘後HA呈現完全溶解。使溶液冷卻至室溫。該溶液之錐/板黏度在60 rpm下為8.7 cP。
維持溫度對分子量之影響
實例7A. 如實例2中所述製備含有0.26 wt.%玻尿酸及13 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下將5.2 g HA與260 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在69℃下之1734.8 g熱蒸餾水中。在約105分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為66℃。在約10分鐘內將溶液冷卻至約40℃且保持在約40℃下。在0小時、1小時、2小時、3小時、4小時及18小時時抽取樣品，在該時間期間溶液溫度在38℃(18小時)至44℃(4小時)之間變化。使用水溶液GPC三重偵測系統來測定各樣品之重量平均分子量。亦在12 rpm下對各樣品進行錐/板黏度測定。GPC分子量資料及黏度資料列於表3中。
實例7B. 如實例2中所述製備含有0.26 wt.%玻尿酸及13 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下將5.2 g HA與260 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在67℃下之1734.8 g熱蒸餾水中。在約115分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為69℃。在約10分鐘內將溶液冷卻至約50℃且保持在約50℃下。在0小時、1小時、2小時、3小時、4小時及18小時時抽取樣品，在該時間期間溶液溫度在46℃(18小時)至54℃(3小時)之間變化。使用水溶液GPC三重偵測系統(Integrated PL-GPC50，其具有2×Waters Ultrahydrogel Linear，7.8×300 mm)來測定各樣品之重量平均分子量。亦在12 rpm下對各樣品進行錐/板黏度測定。GPC分子量資料及黏度資料列於表4中。
實例7C. 如實例2中所述製備含有0.26 wt.%玻尿酸及13 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下將5.2 g HA與260 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在70℃下之1734.8 g熱蒸餾水中。在約125分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為67℃。在約5分鐘內將溶液冷卻至約61℃且保持在約60℃下。在0小時、1小時、2小時、3小時、4小時及18小時時抽取樣品，在該時間期間溶液溫度在56℃(18小時)至61℃(0小時)之間變化。使用水溶液GPC三重偵測系統來測定各樣品之重量平均分子量。亦在30 rpm下對各樣品進行錐/板黏度測定。GPC分子量資料及黏度資料列於表5中。
實例8A至8C. 　重複實例7，但使用第二批次玻尿酸且維持溫度為約50℃(8A)、55℃(8B)及60℃(8C)。分子量測定列於表6中。
實例9. 　製備含有0.26 wt.%玻尿酸及13 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下經5分鐘將5.2 g HA與260 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約66℃下之1734.8 g熱蒸餾水中。在約107分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為約70℃。在約5分鐘內將溶液冷卻至約50℃且保持在約50℃。在50℃下用水預沖洗Vmax 47 mm盤過濾器(STW 0.2 EverluxTM 0.45/0.22微米)5分鐘。將經熱處理之高鹽玻尿酸溶液在27 psi下經由該過濾器過濾。使用Millipore轉換程式，對於777 L溶液體積，盤式過濾將需要約2.7個10吋濾筒。
實例10. 實驗與實例9類似，但HA及NaCl濃度降低25%。製備含有0.195 wt.%玻尿酸及9.75 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下經5分鐘將3.9 g HA與195 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約69℃下之1801.1 g熱蒸餾水中。在約100分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為約69℃。在約7分鐘內將溶液冷卻至約51℃且保持在約51℃。在50℃下用水預沖洗Vmax 47 mm盤過濾器(STW 0.2 EverluxTM 0.45/0.22微米)5分鐘。將經熱處理之高鹽玻尿酸溶液在27 psi下經由該過濾器過濾。使用Millipore轉換程式，對於777 L溶液體積，盤式過濾將需要約2.6個10吋濾筒。
實例11. 實驗與實例9類似，但HA及NaCl濃度降低50%。製備含有0.13 wt.%玻尿酸及6.5 wt.% NaCl之高鹽玻尿酸溶液。在攪拌下經5分鐘將2.6 g HA與130 g NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約68℃下之1867.4 g熱蒸餾水中。在約97分鐘後HA呈現完全溶解，此時溫度為約69℃。在約8分鐘內將溶液冷卻至約49℃且保持在約49℃。在50℃下用水預沖洗Vmax 47 mm盤過濾器(STW 0.2 EverluxTM 0.45/0.22微米)5分鐘。將經熱處理之高鹽玻尿酸溶液在27 psi下經由該過濾器過濾。使用Millipore轉換程式，對於777 L溶液體積，盤式過濾將需要約3.0個10吋濾筒。
在一實施例中，描述一種以適當過濾介質對玻尿酸水溶液進行滅菌之方法。該方法包含提供重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸的水溶液。溶液中之玻尿酸濃度為0.04重量%至0.8重量%。此外，為促進過濾效率，該水溶液具有相當於3重量%至30重量%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。鹽之存在降低玻尿酸溶液之溶液黏度。申請人認為玻尿酸在相對較高離子強度之溶液中更緊密纏繞會使得生物聚合物之迴轉半徑減小。使高鹽玻尿酸溶液經受熱處理，此進一步降低溶液黏度。因此，將高鹽玻尿酸溶液保持在40℃至80℃之溫度下至少1小時且不超過6天。接著將經熱處理之溶液經由滅菌過濾介質過濾。該過濾介質具有0.25 μm或0.25 μm以下之平均孔徑(例如0.22 μm孔徑)以提供經滅菌之高鹽玻尿酸溶液。為促進玻尿酸添加至水中後玻尿酸溶解(通常玻尿酸可以精細乾粉形式購得)，較佳將玻尿酸與鹽(例如NaCl)乾摻合。接著在攪拌下將乾摻合之鹽/玻尿酸混合物緩慢添加至適量純水中。
在一實施例中，高鹽玻尿酸溶液之熱處理包括將該溶液保持在40℃至70℃之溫度下，不過一般將該溶液保持在50℃至70℃之溫度下持續1小時至12小時。此外，維持溫度愈高，所需維持時間愈短。舉例而言，若將高鹽玻尿酸水溶液保持在55℃至65℃之溫度下，則在該熱種處理下推薦維持時間為至少1小時且不超過12小時。
該經滅菌之高鹽玻尿酸溶液中玻尿酸之濃度較佳為0.15重量%至0.6重量%，且較佳離子強度相當於4重量%至16重量%之氯化鈉水溶液濃度。
如所述，pH值可在玻尿酸聚合物之水解速率中起作用，咸信該水解在酸或鹼存在下被催化。因此，高鹽玻尿酸溶液較佳在6.4至7.2之pH值下製備以限制生物聚合物之水解裂解，藉此玻尿酸之重量平均分子量隨時間降低。
在一些實施例中，使用經熱處理經過濾滅菌之高鹽玻尿酸溶液來製備醫藥調配物，包括眼科應用中以及骨關節炎治療中所用之醫藥調配物。因此，經無菌過濾之高鹽玻尿酸溶液可與包含其他醫藥調配物組分(包括緩衝組分，例如硼酸及硼酸鈉)之預先滅菌水溶液混合。在眼用調配物之情況下，將pH值自6.4調節至7.2。藉由將調配物水溶液分成商業加工之兩個獨立部分或相，需要過濾滅菌之調配物之體積顯著減小。在許多情況下，可將經滅菌之高鹽玻尿酸溶液稀釋至少10倍以提供醫藥調配物中所要之玻尿酸濃度；藉此只有少於1/10之調配物需要過濾滅菌。在另一情況下，可將經滅菌之高鹽玻尿酸溶液稀釋至少5倍。視醫藥調配物中之其餘組分而定，調配物之大部分體積可經加熱滅菌(例如高壓釜)，或此部分亦可經過濾滅菌(當然，假定大體積調配物可高效過濾)。
傳統上，滅菌過濾介質為當用最小濃度為每cm2 具有107 個群落形成單位(CFU)之測試生物體缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta(B. diminuta))挑戰時得到無菌流出物的介質。對於指定高鹽玻尿酸溶液，過濾介質在過濾流動速率(公升/分鐘)中具有作用。許多過濾介質可用於滅菌過濾器中。此等介質包括聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)及聚醚碸(PES)。接著將過濾膜組裝於濾筒中。舉例而言，Durapore疏水性膜濾筒為在最小差壓下提供無菌性保證、高流動速率及高輸送量之滅菌級過濾器。其適用於在小及大體積系統中過濾液體。Durapore0.22 μm疏水性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在滅菌應用中可靠地消除污染物及微生物。用於支撐過濾器結構之結構材料(例如籠、核心、端帽及轉接器)通常為聚丙烯或聚碸。
在另一實施例中，一種對包含玻尿酸之溶液進行滅菌之方法包括製備高鹽玻尿酸水溶液。玻尿酸之重量平均分子量為0.6 MDa至2.2 MDa，且玻尿酸之濃度為0.08重量%至0.5重量%。玻尿酸溶液將具有相當於4%至18%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。藉由添加一或多種離子型鹽(例如氯化鈉或硼酸鈉)來提供離子強度相對較高之溶液。使高鹽玻尿酸溶液在50℃至75℃之溫度下經受熱處理持續至少1小時且不超過18小時。接著將經熱處理之溶液經由如上所述之滅菌過濾介質過濾。此外，為促進玻尿酸溶解於水中，較佳將玻尿酸與鹽(例如NaCl)乾摻合。接著在攪拌下將乾摻合之鹽/玻尿酸混合物緩慢添加至水中。
在另一實施例中，熱處理高鹽玻尿酸溶液包含0.1重量%至0.4重量%之玻尿酸，及8重量%至16重量%之氯化鈉。接著使溶液經受如所述之熱處理。此外，維持溫度愈高，所需維持時間愈短。舉例而言，若將高鹽玻尿酸水溶液保持在55℃至65℃之溫度下，則推薦維持時間為至少2小時且不超過8小時。
用於含有玻尿酸之水溶液之所述過濾滅菌法可用來製備經滅菌之水溶液，其包含：0.04重量%至0.8重量%的重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa之玻尿酸。水溶液將具有相當於4重量%至18重量%氯化鈉之氯化鈉水溶液濃度的離子強度且將該溶液過濾滅菌。
在一實施例中，經過濾滅菌之高鹽玻尿酸溶液之離子強度將為相當於在1公升溶液中對於每1公克玻尿酸而言約25 g至60 g氯化鈉。舉例而言，0.1 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約25 g至60 g氯化鈉之離子強度。同樣，0.2 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約50 g至120 g氯化鈉之離子強度。0.3 wt.%玻尿酸溶液將包括相當於約75 g至180 g氯化鈉之離子強度。
在另一實施例中，所述無菌過濾法可用來製備商業規模批量生產之隱形眼鏡保養溶液。該方法將類似於上述方法，但最終調配物亦將包括適用於隱形眼鏡保養溶液之組分。就玻尿酸而言，一些此等組分可能更適合於無菌過濾而其他可能適合於加熱滅菌。可製備最終總溶液體積為5,000 L至40,000 L之生產批次。
此外，可首先製備高鹽玻尿酸水溶液。玻尿酸之重量平均分子量為0.6 MDa至3.6 MDa，且玻尿酸之濃度為0.04重量%至0.8重量%。玻尿酸溶液將具有相當於3%至30%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度。藉由添加一或多種離子型鹽(例如氯化鈉或硼酸鈉)來提供離子強度相對較高之溶液。使高鹽玻尿酸溶液在55℃至75℃之溫度下經過熱處理持續至少1小時且不超過12小時。接著將經熱處理之溶液經由如上所述之滅菌過濾介質過濾。
接著將經滅菌之高鹽玻尿酸溶液與第二水溶液組合，該第二水溶液可含有隱形眼鏡保養溶液之大部分或所有其餘組分，例如緩衝組分、一或多種界面活性劑、一或多種螯合劑及一或多種抗微生物組分。此外，藉由組合兩種水溶液，該經滅菌之高鹽玻尿酸溶液稀釋至少5倍，或在一些情況下稀釋至少10倍。
如所述，眼鏡保養溶液亦將包括一或多種選自四級銨化合物(包括小分子)及聚合物及低與高分子量雙胍的抗微生物組分。舉例而言，雙胍包括阿來西定(alexidine)、氯已定(chlorhexidine)、六亞甲基雙胍及其聚合物之游離鹼或鹽，及其組合。在一較佳實施例中，眼鏡保養溶液將包括稱為聚(六亞甲基雙胍)(PHMB或PAPB)之聚合雙胍，其可以商標CosmocilTM CQ自Zeneca,Wilmington,DE購得。眼鏡保養溶液中之PHMB含量為0.2 ppm至5 ppm或0.5 ppm至2 ppm。
一種更常用四級銨化合物為α-[4-參(2-羥乙基)-氯化銨-2-丁烯基]聚[1-二甲基氯化銨-2-丁烯基]-ω-參(2-羥乙基)氯化銨，在此項技術中亦稱為聚四級銨(polyquaternium)-1。四級銨化合物在此項技術中一般稱為「聚四級銨」消毒劑，且由該名稱之後之特定數字來標識，諸如聚四級銨-1、聚四級銨-10或聚四級銨-42。眼鏡保養溶液中之聚四級銨-1含量為0.5 ppm至3 ppm。有趣的是，試圖使溶液中聚四級銨-1之濃度增加超過3 ppm時，會導致形成沈澱。咸信沈澱物為玻尿酸與聚四級銨-1之錯合產物。
兩種抗微生物組分之一種更佳組合包括濃度為0.5 ppm至1.5 ppm之PHMB與濃度為0.5 ppm至1.5 ppm之聚四級銨-1的混合物。在該種調配物中，玻尿酸以0.002 wt.%至0.04 wt.%存在。
隱形眼鏡保養溶液亦可包括0.01 wt.%至1 wt.%之通式I兩性界面活性劑。某些通式I之磺基甜菜鹼相較於其他化合物更佳。舉例而言，磺基甜菜鹼3-10，其中R1 為具有十(10)個碳之直鏈飽和烷基，R2 及R3 各為甲基且R4 為-CH2 CH2 CH2 -(三個碳，(3))。可用於眼用組合物中之其他磺基甜菜鹼包括相應磺基甜菜鹼3-08(R1 為具有八個碳之直鏈飽和烷基)、磺基甜菜鹼3-12(R1 為具有十二個碳之直鏈飽和烷基)、磺基甜菜鹼3-14(R1 為具有十四個碳之直鏈飽和烷基)及磺基甜菜鹼3-16(R1 為具有十六個碳之直鏈飽和烷基)。因此，一些更佳眼用組合物將包括通式I之磺基甜菜鹼，其中R1 為C8 -C16 烷基且R2 及R3 為甲基，且R4 為-CH2 CH2 CH2 -。
隱形眼鏡保養溶液中可包括之其他組分描述於2008年9月3日申請的同在申請中之美國專利申請案第12/203,384號中。
在一實施例中，製備通式I之磺基甜菜鹼、PHMB及聚四級銨-1之水溶液，且使其通過與用於處理高鹽玻尿酸溶液之過濾介質類似的滅菌過濾器。接著將該等經過濾滅菌之溶液之每一者添加至常用混合槽中。
實例12. 　以四個獨立階段製備商業規模批量生產之隱形眼鏡多用途清洗及消毒溶液(水溶液)且在主要混合槽中組合。
第1階段. 　向配備有攪拌之適當尺寸之316不鏽鋼夾套壓力容器中添加足量純水以達成最大攪拌。第1階段水體積應為總批料體積之約60-96%。加熱水至達成及/或保持水溫不低於70℃。開始攪拌且在該批料之整個處理期間保持攪拌。以所列出之順序添加並溶解以下批量：乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、硼酸鈉及保麗視明(poloxamine)1107。混合溶液持續不少於20分鐘以確保保麗視明1107完全溶解。抽取溶液樣品且測定pH值。必要時，以1 N NaOH或1N HCl調節pH值至7.3-7.7。密封反應器且使用經確認之循環且出於處理及文件要求參考藉由加壓蒸汽對溶液進行滅菌之一般程序(General Procedure for Solutions Sterilized by Steam Under Pressure)來在121-124℃下將第1階段溶液加熱滅菌持續30-45分鐘。在滅菌週期完成後，即冷卻第1階段溶液至低於40℃。
第II階段. 　第II階段為純水、0.26 wt.%玻尿酸及13 wt.%氯化鈉之水性混合物。組合及乾摻合該批量玻尿酸及氯化鈉。在混合適量水時，將NaCl/玻尿酸之乾摻合混合物緩慢傾入混合槽中。在保持65-75℃溫度範圍下混合NaCl/玻尿酸溶液直至玻尿酸完全溶解。目視檢驗溶液，必要時使混合器減速，以便目視檢驗任何懸浮之玻尿酸。
當玻尿酸完全溶解時，冷卻溶液至50-55℃。經由經滅菌之Millipore CVGL過濾器將NaCl/玻尿酸溶液過濾進入第I階段混配槽中。差壓應不超過30 psi。
第III階段. 　在低於40℃之溫度下向配備有攪拌之適合壓力容器中添加總批重0.50%-4.95%之純水及批量磺基甜菜鹼粉末，從而製得0.05 wt.%-10.0 wt.%溶液。混合該溶液持續至少20分鐘。在無菌條件下將磺基甜菜鹼溶液經由無菌0.22 μm Millipore過濾器(與第II階段轉移中所用之過濾總成不同)過濾進入第1階段溶液中。混合第I階段溶液持續不少於10分鐘。
第IV階段. 　向配備有攪拌之適合壓力容器中添加總批重0.078%-1.98%之冷水(低於40℃)及批量聚(六亞甲基雙胍)及聚四級銨-1，從而製得0.03%-1.00%溶液。混合該溶液持續至少10分鐘。在無菌條件下將PHMB/PQ-1溶液經由無菌Millipore 0.22 μm過濾器過濾進入第I階段溶液中。
實例13. 　如下製備隱形眼鏡再濕潤滴眼劑調配物。製備含有3.0 wt.%硼酸NF、2.1 wt.% NaCl USP、0.7 wt.% KCl USP及0.5 wt.%玻尿酸(平均分子量為約0.8 MDa)之高鹽玻尿酸鹽水溶液。在攪拌下經5分鐘將HA與NaCl之乾摻合混合物緩慢添加至不鏽容器中保持在約68℃下之熱蒸餾水中。在約100分鐘後HA呈現完全溶解。在約8分鐘內將溶液冷卻至約55℃且保持在約55℃不少於3小時。將KCl及硼酸添加至冷卻的經熱處理之HA溶液中，且將該溶液攪拌10分鐘。藉由在55℃之溫度下使溶液通過PVDF 0.22 μm過濾介質來對溶液進行無菌過濾。另外，製備含有1.75 wt.%十水合硼酸鈉、0.03 wt.%脫水氯化鈣USP、0.03 wt.%六水合氯化鎂及0.025 wt.%穩定氧氯化物錯合物(碳酸鈉(purite))的第二經滅菌水溶液。可藉由使用習知加熱滅菌法將此第二鹽溶液滅菌。或者，可使用製備HA溶液中所使用之相同過濾器對此溶液進行無菌過濾。對第二鹽溶液進行滅菌之後，將第二溶液與經熱處理之高鹽玻尿酸鹽溶液分別以4:1之體積比組合。表7中提供最終眼用調配物，其可用作隱形眼鏡再濕潤滴眼劑調配物。
圖1為展示對於所列出之各種製程條件，處理約740 kg玻尿酸水溶液所需之10吋濾筒之估計數目的條形圖。
(無元件符號說明)

Claims (17)

  1. 一種對溶液進行滅菌之方法，該方法包含：提供重量平均分子量為0.6MDa至3.6MDa之玻尿酸的水溶液，且該玻尿酸之濃度為0.04重量%至0.8重量%；其中該水溶液具有相當於3重量%至30重量%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度，以提供高鹽玻尿酸溶液；將該高鹽玻尿酸水溶液保持在40℃至80℃之溫度下至少1小時且不超過6天；及經由滅菌過濾介質過濾該經加熱之高鹽玻尿酸溶液，提供經滅菌之高鹽玻尿酸溶液，其中該過濾介質具有0.25μm或0.25μm以下之平均孔徑。
  2. 如請求項1之方法，其中該玻尿酸之該濃度為0.1重量%至0.5重量%。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該玻尿酸之該重量平均分子量為0.8MDa至2.2MDa。
  4. 如請求項1或2之方法，其中提供該高鹽玻尿酸溶液，其包括組合及混合適當乾重之鹽與玻尿酸，形成該鹽與玻尿酸之乾摻合物，及將該乾摻合物添加至適量純水中。
  5. 如請求項4之方法，其中將該純水預熱至40℃至70℃之溫度。
  6. 如請求項1或2之方法，其中保持該高鹽玻尿酸水溶液，其包括保持在50℃至65℃之溫度下至少1小時且不超過12小時。
  7. 如請求項1或2之方法，其進一步包括將該經滅菌高鹽玻 尿酸溶液與包含緩衝劑組分之水溶液組合，及將pH值自6.4調整至7.2，且藉由組合該兩種水溶液，得以將該經滅菌高鹽玻尿酸溶液稀釋至少10倍。
  8. 如請求項7之方法，其中該緩衝劑組分包含硼酸及硼酸鈉。
  9. 如請求項1或2之方法，其中該經滅菌高鹽玻尿酸溶液之pH值為6.4至7.2。
  10. 如請求項1或2之方法，其中該經滅菌高鹽玻尿酸溶液中該玻尿酸濃度為0.15重量%至0.6重量%且為氯化鈉水溶液，其中氯化鈉之濃度為4重量%至16重量%。
  11. 如請求項1或2之方法，其中該滅菌過濾介質為聚偏二氟乙烯濾筒。
  12. 如請求項1或2之方法，其進一步包括將該經滅菌高鹽玻尿酸溶液與包含緩衝劑組分之水溶液組合，其中該緩衝劑組分選自由硼酸、硼酸鈉及磷酸二氫鈉組成之群，及將pH值自6.4調整至7.2，且藉由組合該兩種水溶液，得以將該經滅菌高鹽玻尿酸溶液稀釋至少5倍。
  13. 如請求項12之方法，其中該經組合水溶液進一步包含防腐有效量之穩定氯。
  14. 如請求項12之方法，其中該經組合水溶液進一步包含聚(六亞甲基雙胍)，其含量為0.5ppm至2.0ppm，或α-[4-參(2-羥乙基)-氯化銨-2-丁烯基]聚[1-二甲基氯化銨-2-丁烯基]-ω-參(2-羥乙基)氯化銨，其含量為0.5ppm至3ppm。
  15. 一種經滅菌水溶液，其包含：0.04重量%至0.8重量%的重量平均分子量0.6MDa至3.6MDa之玻尿酸；其中該水溶液具有相當於4重量%至18重量%之氯化鈉水溶液濃度的離子強度，且該溶液經過濾滅菌。
  16. 如請求項15之水溶液，其包含0.1重量%至0.4重量%之玻尿酸及8重量%至16重量%之氯化鈉。
  17. 如請求項15或16之水溶液，其中該玻尿酸之重量平均分子量為0.8MDa至2.2MDa。
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