TWI401317B - 於酵母菌中產生衣康酸的方法 - Google Patents
於酵母菌中產生衣康酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI401317B TWI401317B TW098140774A TW98140774A TWI401317B TW I401317 B TWI401317 B TW I401317B TW 098140774 A TW098140774 A TW 098140774A TW 98140774 A TW98140774 A TW 98140774A TW I401317 B TWI401317 B TW I401317B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- yeast
- promoter
- itaconic acid
- producing itaconic
- producing
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 50
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 43
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000009836 Aconitate hydratase Human genes 0.000 claims description 19
- 108010009924 Aconitate hydratase Proteins 0.000 claims description 19
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 claims description 17
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 claims description 16
- 102100038248 Cis-aconitate decarboxylase Human genes 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 101710082464 Cis-aconitate decarboxylase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 102100024088 40S ribosomal protein S7 Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 101000690200 Homo sapiens 40S ribosomal protein S7 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010033405 ribosomal protein S7 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 26
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 10
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108030001549 Cis-aconitate decarboxylases Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 101900086590 Aspergillus terreus Cis-aconitate decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101900305070 Escherichia coli Citrate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108030005611 2-methylcitrate dehydratases Proteins 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000173529 Aconitum napellus Species 0.000 description 1
- 229920002972 Acrylic fiber Polymers 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010036824 Citrate (pro-3S)-lyase Proteins 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000212961 Helicobasidium Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 1
- 101100215634 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) XPR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010048430 aconitate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 229940023019 aconite Drugs 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N cis-aconitic acid Chemical class OC(=O)C\C(C(O)=O)=C\C(O)=O GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 101150118781 icd gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本發明係關於一種產生衣康酸(itaconic acid)的方法，且特別關於一種以甘油為基質於酵母菌中產生衣康酸(itaconic acid)的方法。
於化學工業中高度需要之衣康酸(itaconic acid,IA)為一前驅化合物一般使用於多種產品之製造，例如丙烯酸系纖維(acrylic fiber)、橡膠、人工鑽石與鏡片。特定絲狀真菌(filamentous fungi)(例如黑穗菌(Ustilago
)、膏藥病菌(Helicobasidium
)與麴菌(Aspergillus
))將單醣轉換為此化合物。已發現順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)於衣康酸之生物合成中扮演一關鍵角色。
本發明基於非預期發現，當將經基因修飾表現順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)之解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica
)細胞培養於含甘油之培養基中時，其高度產生衣康酸(itaconic acid)。
因此，本發明以使用甘油作為基質於酵母細胞中產生衣康酸的方法為特徵。此方法包括(i)提供一經基因修飾之酵母菌宿主細胞，其包含一第一表現框(expression cassette)，第一表現框包括一第一酵母菌啟動子
(promoter)，第一酵母菌啟動子可操作地被連結至編碼出順-烏頭酸脫羧酶的一核苷酸序列，(ii)在允許甘油轉換為衣康酸的適合條件下，培養酵母菌宿主細胞於一含有甘油濃度為5至700 g/L(例如，5至250 g/L)之培養基中，以及(iii)收集此培養基以分離衣康酸。在此方法中，甘油可為合成衣康酸之唯一基質。酵母菌宿主細胞(例如，一解脂耶氏酵母)可更包含一第二表現框，與視需要包含一第三表現框，其各包括一酵母菌啟動子，被操作地連結至編碼出檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS)或烏頭酸酶(aconitase,Aco)的一核苷酸序列。上述之任何酵母菌啟動子可為hp4d、pTEF
、pRPS7
或pG3P
。三個表現框的每一個可包括一引導序列(leader sequence)於編碼出順-烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶或烏頭酸酶之核甘酸序列的上游且讀框定向(in-frame with)至編碼出順-烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶或烏頭酸酶之核甘酸序列。在一例子中，引導序列編碼出MSAILSTTSKSFLSRGSTRQCQNMQKALFALLNARHYS之胺基酸序列(序列辨識號：9)。在另一例子中，其編碼出MKLATAFTILTAVLA(序列辨識號：10)。
也在本發明範圍中者為一核酸序列，其包括一第一、一第二，與視需要而定一第三表現框，各表現框包含一酵母菌啟動子，其與編碼出衣康酸合成相關之一酵素的核苷酸序列操作性連結。在一例子中，核酸包含兩個表現框，編碼出一順-烏頭酸脫羧酶的第一表現框與編碼出檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的第二表現框。在另一實施例中，核酸
包含編碼出一順-烏頭酸脫羧酶、一檸檬酸合成酶與一烏頭酸酶的三個表現框。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
此處所述為使用甘油(可為生質柴油副產品)101作為基質於經基因工程之酵母細胞103中(經發酵作用105)產生衣康酸(itaconic acid)107(生物材料之構成要素)的方法。參見第1圖。
設計經基因修飾之酵母菌(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae
)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe
)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica
)、嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris
)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis
)與Pseudozyma antarctica
)以高程度表現一順-烏頭酸脫羧酶，與視需要而定以高程度表現檸檬酸合成酶及/或烏頭酸酶。
此處使用之措辭“順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)”或“CAD”意指一自然發生之順-烏頭酸脫羧酶(例如，敘述於Dwiarti et al.,J.Bioscience and Bioengineering,94(1)：29-33,2002 and WO 2009/014437中之土麴菌(Aspergillus terreus
)順-烏頭酸脫羧酶)與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供為一示範之土麴菌
(Aspergillus terreus
)順-烏頭酸脫羧酶的核甘酸序列(序列辨識號：1)與胺基酸序列(序列辨識號：2)：土麴菌(Aspergillus terreus
)順-烏頭酸脫羧酶
此處使用之措辭“檸檬酸合成酶”與“烏頭酸酶”分別將意指將草醯乙酸(oxaloacetate)轉換為檸檬酸(citrate)，與將檸檬酸或異檸檬酸(isocitrate)轉換為烏頭酸的酵素，其包括兩者自然發生之酵素與其功能等同物(functional equivalent)。以下提供為大腸桿菌(Escherichia coli
)檸檬酸合成酶(citrate synthase)的核甘酸序列(序列辨識號：3)與胺基酸序列(序列辨識號：4)、烏頭酸酶A(aconitase A)的核甘酸序列(序列辨識號：5)與胺基酸序列(序列辨識號：6)以及烏頭酸酶B(aconitase B)的核甘酸序列(序列辨識號：7)與胺基酸序列(序列辨識號：8)：大腸桿菌(Escherichia coli
)檸檬酸合成酶
大腸桿菌(Escherichia coli
)烏頭酸酶A(aconitase A)
大腸桿菌(Escherichia coli
)烏頭酸酶B(aconitase B)
其他檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的例子列於下方表1中：
如此處所使用，一參考酵素(即，土麴菌(Aspergillus terreus
)順-烏頭酸脫羧酶或下方所提之任何酵素)之功能等同物為一多胜肽，其具有一胺基酸序列至少60%(例如，85%、90%、95%或99%)相同於參考酵素之胺基酸序列，且如參考酵素處理相同酵素活性。
使用於Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993中修飾之Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990的演算法來測定兩個胺基酸序列的相同百分比(percent identity)。此一演算法與Attschul,et al.J.biol.Biol.215：403-10,1990之BLASTN與BLASTX程式(version 2.0)整合。可以BLASTX程式，分數(score)=50、字長(wordlength)=3來執行BLAST蛋白質搜
尋，以獲得同源於本發明蛋白質分子的胺基酸序列。差距存在於兩序列間之處，可利用如於Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997中所述之差距BLAST(Gapped BLAST)。當利用BLAST與差距BLAST程式時，可使用個別程式(例如，BLASTX與BLASTN)之隱含值參數(deault parameter)。
也可將於本發明方法中使用之經基因工程之酵母菌進行修飾以表現與衣康酸合成相關之其他酵素(例如，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶/羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxylases/carboxykinase)、2-甲基檸檬酸合成酶(2-methylcitrate synthases)、檸檬酸分解酶(citrate lyases)與2-甲基檸檬酸脫氫酶(2-methylcitrate dehydratase))或去除與衣康酸降解相關之基因(例如，編碼出異檸檬酸脫羧酶(isocitrate decarboxylase)之icd
基因)。參見美國專利申請號12/463,677與WO 2009/014437。
藉由一般重組技術可構築上述經基因修飾之酵母菌(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press.)。
更特別地，可如下獲得過度表現一或多個上述酵素的酵母菌菌株。可獲得編碼出一或多個上述酵素的一DNA片段，藉由來自其自然來源的聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction)，基於其編碼序列，此DNA片段可檢索自GenBank。若需要的話，基於在酵母菌中之最佳編碼使用，使編碼序列編碼進行最佳化。較佳地，將編碼出一訊息胜肽(signal peptide)之一引導序列(leader sequence)讀框定向
(in-frame with)連結於編碼序列的5’端。一訊息胜肽為一多胜肽之N端片段，其幫助多胜肽運送進入或穿過膜，或幫助其之分泌進入細胞外基質(extracellular medium)。引導序列的例子包括，但不限於編碼出prepro-CS(MSAILSTTSKSFLSRGSTRQCQNMQKALFALLNARHYS)(序列辨識號：9)與pre-XPR2(MKLATAFTILTAVLA)(序列辨識號：10)之訊息胜肽。
之後將由此製備之DNA片段插入一適合之酵母菌表現載體以產生表現上述酵素之DNA構築物(DNA construct)。在由此製備之DNA構築物中，將DNA片段可操作地連結至一適合之酵母菌啟動子(promoter)以形成一表現框。在一實施例中，一表現框包括一可操做地被連結至一啟動子之編碼序列。在另一實施例中，一表現框包括多個編碼序列，其全部與一啟動子操作性連結。
如此處所使用，“酵母菌啟動子”意指一核苷酸序列包含一單元其於酵母菌中起始經可操作連結之核酸序列的轉錄。在一最小情況下，一啟動子包含一RNA聚合酶結合位。其可更包含由定義為促進轉錄之一或多個促進單元(enhancer element)，或，一或多個控制啟動子開/關狀態之調控單元(regulator element)。示範之酵母菌啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase)啟動子、甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)啟動子、半乳糖激酵素(galactokinase,GAL1)啟動子、半乳糖異構酵素(galactoepimerase)啟動子、醇脫氫酶
(alcohol dehydrogenase,ADH)啟動子、hp4d啟動子(參見，Nicad et al.,FEMS Yeast Research 2(3)：371-379,2006)、轉譯延長因子(translation elongation factor)1-α啟動子(pTEF
)、核糖體蛋白(ribosomal protein)S7啟動子(pRPS7
)與甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)啟動子(pG3P
)。
之後將包含於一或多個表現構築物中的上述表現框引入一適合之酵母菌細胞中，以產生此處所揭露之經基因修飾之酵母菌。選擇正轉化體(positive transformant)並藉由本技術領域所知的方法，例如，免疫墨點或酵素活性分析，來確認一或多個上述酵素之過度表現。
為了產生衣康酸，將經修飾之酵母菌培養於一含甘油濃度為5-700 g/L之適合培養基中。甘油可為在培養基中對於衣康酸產生而言的唯一基質。在一有效培養期間後，收集培養基且將被分泌之衣康酸分離。較佳為，選擇於甘油中生長快速之經修飾之酵母菌的複製(clone)作為使用於衣康酸產生中的菌株。
經由一般重組技術構築顯示於第2A圖中之DNA片段(a)、(b)、(c)與(d)。經由Sal I與Cla I限制位將這些片段複製進入載體pYLE，以產生適合於酵母菌中表現順-烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸酶的表現構築物。參見第
2B圖。在這些構築物中之編碼序列與調控序列，即啟動子與終止子(terminator)概括於下方之表2中：
藉由一一般法將上述構築物引入解脂耶氏酵母細胞中。於白胺酸缺乏之植物(Leucine-deficient plant)上選擇正轉化體且藉由酵素活性分析測定目標酵素之表現。
將過度表現土麴菌順-烏頭酸脫羧酶之解脂耶氏酵母菌株YL
-cad01-40在28℃，隔夜培養於一YPD培養基，其包含10 g/L酵母菌萃取物、10 g/L消化蛋白質(peptone)與50 mM檸檬酸緩衝溶液(pH 4.0)與10 g/L葡萄糖。將此隔
夜培養物接種(1%)進一豐富之YPD培養基，其包含10 g/L酵母菌萃取物、10 g/L消化蛋白質與10 g/L葡萄糖，且培養於28℃，168小時。之後，收集培養之培養基且藉由色層分析(chromatography)測定於其中之衣康酸的量。結果顯示在培養基中之衣康酸濃度為約1.05 g/L。
將相同之解脂耶氏酵母菌株培養於50 ml之上述YPD培養基中，直到培養之培養基在波長600 nm的光學密度(OD600
)達到100。收取解脂耶氏酵母細胞，以冰-冷滅菌水清洗兩次，且之後將其接種進一氮限制(nitrogen-limited)之培養基YPG(包含100 g/L甘油、0.268 g/L酵母菌萃取物與50 mM檸檬酸緩衝溶液，pH 4.0)中。將細胞培養於28℃，168小時且之後收集培養之培養基。發現於培養基中之衣康酸濃度為約2.65 g/L。
比較使用葡萄糖或甘油作為基質之衣康酸產量如下。
YL
-cad01-40細胞生長於一豐富之YPD培養基中，直到培養物之OD600
值達到150。細胞經由離心來收集，以冰-冷滅菌水清洗兩次，且之後接種進一添加100 g/L甘油或100 g/L葡萄糖之氮限制YPD培養基(包含0.268 g/L酵母菌萃取物與50 mM檸檬酸緩衝溶液，pH 4.0)中以達到150之OD600
值。將細胞培養於28℃，且於多個時間點(即，48小時、60小時、72小時、96小時、120小時、144小時、168小時、264小時與288小時)收集培養之培養基測定其衣康酸濃度。如第3圖所示，於含甘油之培養基中的衣康酸濃度比於含葡萄糖之培養基中的衣康酸濃度大得多，其指出，使用甘油為基質於酵母菌細胞中產生高產量的衣康
酸。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
101‧‧‧甘油
103‧‧‧經基因工程之酵母細胞
105‧‧‧發酵作用
107‧‧‧衣康酸
第1圖為一圖式，其顯示於表現一順-烏頭酸脫羧酶、一檸檬酸合成酶與一烏頭酸酶之經基因修飾的解脂耶氏酵母細胞中甘油至衣康酸的轉變。
第2A圖為一圖式，其顯示表現順-烏頭酸脫羧酶(框a)、順-烏頭酸脫羧酶與檸檬酸合成酶(框b)、順-烏頭酸脫羧酶與一烏頭酸酶(框c)，及順-烏頭酸脫羧酶、檸檬酸合成酶與一烏頭酸酶(框d)的DNA框。
第2B圖為表現載體pYLE之地圖。Sal I與Cla I為複製上述讀框之限制位。
第3圖為一曲線圖，其顯示在不同時間點，於含甘油與葡萄糖之培養之培養基中的衣康酸濃度。
【序列編號】
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 於酵母菌中產生衣康酸的方法
<160> 10
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 土黴菌
<400> 1
<210> 2
<211> 490
<212> PRT
<213> 土黴菌
<400> 2
<210> 3
<211> 1284
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 3
<210> 4
<211> 427
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 2676
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 5
<210> 6
<211> 891
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 6
<210> 7
<211> 2598
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 7
<210> 8
<211> 865
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 8
<210> 9
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 9
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 10
101‧‧‧甘油
103‧‧‧經基因工程之酵母細胞
105‧‧‧發酵作用
107‧‧‧衣康酸(itaconic acid)
Claims (9)
- 一種於酵母菌中產生衣康酸(itaconic acid)的方法，包括：提供一經基因修飾之酵母菌宿主細胞，該宿主細胞包含一第一表現框(expression cassette)，其包括一第一酵母菌啟動子(promoter)，該第一酵母菌啟動子可操作地被連結至編碼出順-烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase)的一核苷酸序列，且其中該酵母菌宿主細胞為一解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica )細胞；培養該酵母菌宿主細胞於一含有甘油濃度為5-250 g/L之培養基中；以及收集該培養基以分離衣康酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該經基因修飾之酵母菌宿主細胞更包含一第二表現框，其包括一第二酵母菌啟動子，該第二酵母菌啟動子可操作地被連結至編碼出檸檬酸合成酶或烏頭酸酶的一核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第2項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中於該第二表現框中之該核苷酸序列編碼出一檸檬酸合成酶，且該經基因修飾之酵母菌宿主細胞更包含一第三表現框，該第三表現框由一第三啟動子所組成，該第三啟動子可操作地被連結至編碼出烏頭酸酶的一核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該甘油為產生衣康酸之唯一基質。
- 如申請專利範圍第1項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子係擇自由hp4d、轉譯延長因子(translation elongation factor)1-α啟動子(pTEF )、核糖體蛋白(ribosomal protein)S7啟動子(pRPS7 )與甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)啟動子(pG3P )所組成之群組。
- 如申請專利範圍第2項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為pTEF ，且該第二啟動子為pRPS7 。
- 如申請專利範圍第3項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一酵母菌啟動子為pTEF 、該第二酵母菌啟動子為pRPS7 ，且該第三酵母菌啟動子為pG3P 。
- 如申請專利範圍第1項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該第一表現框更包括一引導序列(leader sequence)於編碼出順-烏頭酸脫羧酶之該核苷酸序列的上游。
- 如申請專利範圍第8項所述之於酵母菌中產生衣康酸的方法，其中該引導序列編碼出MSAILSTTSKSFLSRGSTRQCQNMQKALFALLNARHYS(序列辨識號：9)或MKLATAFTILTAVLA(序列辨識號：10)之胺基酸序列。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12/546,834 US8192965B2 (en) | 2009-08-25 | 2009-08-25 | Producing Itaconic acid in yeast using glycerol as the substrate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201107482A TW201107482A (en) | 2011-03-01 |
| TWI401317B true TWI401317B (zh) | 2013-07-11 |
Family
ID=43625489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW098140774A TWI401317B (zh) | 2009-08-25 | 2009-11-30 | 於酵母菌中產生衣康酸的方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8192965B2 (zh) |
| CN (1) | CN101993899A (zh) |
| TW (1) | TWI401317B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10633677B2 (en) | 2016-12-27 | 2020-04-28 | National Tsing Hua University | Butanol expression cassette, recombinant plasmid and butanol production related gene expression method |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150291986A1 (en) * | 2012-11-23 | 2015-10-15 | Dsm Ip Assets B.V. | Itaconic acid and itaconate methylester production |
| TWI628191B (zh) * | 2014-03-19 | 2018-07-01 | 財團法人工業技術研究院 | 融合多胜肽、編碼此融合多胜肽之核酸分子、含此核酸分子之載體或細胞以及藉由此細胞產生衣康酸的方法 |
| CN104928272A (zh) * | 2014-03-19 | 2015-09-23 | 财团法人工业技术研究院 | 融合多肽、编码它的核酸分子以及使用它产生衣康酸的方法 |
| LU92409B1 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-22 | Philipps Universit T Marburg | Means and methods for itaconic acid production |
| US20180245106A1 (en) * | 2014-05-29 | 2018-08-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for producing itaconic acid and itaconic acid esters under anaerobic conditions |
| US20170191091A1 (en) * | 2014-05-29 | 2017-07-06 | Dsm Ip Assets B.V. | Recombinant cells producing itaconic acid and methyl esters thereof |
| CN107429273A (zh) | 2015-02-16 | 2017-12-01 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法 |
| EP3377639A2 (en) * | 2015-11-17 | 2018-09-26 | Global Bioenergies | Methods for producing isobutene from 3-methylcrotonic acid |
| KR101751684B1 (ko) * | 2015-11-25 | 2017-06-28 | 한국생명공학연구원 | 아미노 말단을 동의코돈으로 치환한 CadA 유전자를 이용한 이타콘산의 생산방법 |
| CN107058144A (zh) * | 2017-02-15 | 2017-08-18 | 江南大学 | 一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用 |
| US10738333B2 (en) | 2018-04-30 | 2020-08-11 | Ut-Battelle, Llc | Production of itaconic acid and related molecules from aromatic compounds |
| CN108795789A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-11-13 | 山东省食品发酵工业研究设计院 | 一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用 |
| CN113462588A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-10-01 | 北京化工大学 | 一种利用乙酸生产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1112916A (zh) * | 1993-03-12 | 1995-12-06 | 罗纳·布朗克化学公司 | 由发酵制备衣康酸的方法 |
| US7479381B1 (en) * | 2006-12-15 | 2009-01-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of itaconic acid by Pseudozyma antarctica |
| EP2017344A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-21 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Production of itaconic acid |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5702902B2 (ja) | 2007-01-29 | 2015-04-15 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | ｃｉｓ−アコニット酸脱炭酸酵素およびそれをコードする遺伝子 |
| JP2009027999A (ja) | 2007-07-30 | 2009-02-12 | National Univ Corp Shizuoka Univ | シス−アコニット酸デカルボキシラーゼをコードするｄｎａ、シス−アコニット酸デカルボキシラーゼの製造方法、及び、イタコン酸の製造方法 |
| CN101509020A (zh) * | 2009-03-25 | 2009-08-19 | 中国科学院生态环境研究中心 | 利用纤维素热解产物发酵生产衣康酸 |
| US8143036B2 (en) * | 2009-05-11 | 2012-03-27 | Industrial Technology Research Institute | Genetically modified microorganisms for producing itaconic acid with high yields |
-
2009
- 2009-08-25 US US12/546,834 patent/US8192965B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-11-30 TW TW098140774A patent/TWI401317B/zh not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-08-25 CN CN2010102633797A patent/CN101993899A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1112916A (zh) * | 1993-03-12 | 1995-12-06 | 罗纳·布朗克化学公司 | 由发酵制备衣康酸的方法 |
| US7479381B1 (en) * | 2006-12-15 | 2009-01-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of itaconic acid by Pseudozyma antarctica |
| EP2017344A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-21 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Production of itaconic acid |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10633677B2 (en) | 2016-12-27 | 2020-04-28 | National Tsing Hua University | Butanol expression cassette, recombinant plasmid and butanol production related gene expression method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20110053232A1 (en) | 2011-03-03 |
| TW201107482A (en) | 2011-03-01 |
| US8192965B2 (en) | 2012-06-05 |
| CN101993899A (zh) | 2011-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI401317B (zh) | 於酵母菌中產生衣康酸的方法 | |
| TWI421342B (zh) | 提高衣康酸表現量之基因修飾微生物及以此微生物生產衣康酸的方法 | |
| CN108949601B (zh) | 利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法 | |
| JP5772594B2 (ja) | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 | |
| CN109536398A (zh) | 用于产量增加的方法中的重组体微生物 | |
| JP4963488B2 (ja) | 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法 | |
| CN110423705A (zh) | 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法 | |
| EP3415628B1 (en) | Recombinant mutant microorganism having malonic acid production capability and method for producing malonic acid using same | |
| WO2016017736A1 (ja) | 分泌シグナルペプチドならびにそれを利用したタンパク質の分泌および細胞表層提示 | |
| CN112725210B (zh) | 抑制乳酸代谢和乙醇产生的重组耐酸酵母及使用其生产乳酸的方法 | |
| WO2014162063A1 (en) | Production of acid(s) and alcohol from sugars using yeast | |
| JP5813977B2 (ja) | Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 | |
| KR101779890B1 (ko) | 레반 과당전이효소 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 디프럭토스 언하이드리드 iv 생산방법 | |
| CN1894404B (zh) | 有机酸存在下的启动子及其用途 | |
| KR102237465B1 (ko) | 이눌로수크라제 활성이 도입된 효모 및 이를 이용한 프럭토올리고사카라이드 생산방법 | |
| JP5827055B2 (ja) | Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 | |
| KR102306725B1 (ko) | 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 및 이를 이용한 아세토인 생산방법 | |
| WO2020078474A1 (zh) | 提高苹果酸产量的新突变蛋白 | |
| KR102171224B1 (ko) | 이눌린 과당전이효소 활성이 도입된 효모 및 이를 이용한 디프럭토스 언하이드리드 iii 및 프럭토올리고당의 생산방법 | |
| JP6253465B2 (ja) | Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 | |
| CN109477078A (zh) | 使用经遗传修饰的真菌细胞来进行经改善的从半乳糖醛酸的内消旋半乳糖二酸产生 | |
| WO2023108503A1 (zh) | 一种工程菌的构建方法及其应用 | |
| KR101960450B1 (ko) | 당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 이용하여 산물을 생산하는 방법 | |
| KR101828580B1 (ko) | 자일로스 이소머라제의 분비발현을 통하여 자일로스를 탄소원으로 이용하는 방법 | |
| KR101392968B1 (ko) | 신규한 자기복제서열 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |