TWI400077B - 活化免疫細胞的組成物及其製備方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於活化動物體內免疫細胞活性的組成物及其製備方法。
近年來有許多研究發現菇蕈菌絲體或子實體中含有相當多的生理活性成分，包含多醣體、三帖類(triterpenoids)、蛋白質、核酸、類固醇等，上述成分具有抗腫瘤、增強免疫力、降低高血壓、降血糖、抑制血小板凝集、抗病毒等功效。
已知多醣體具有抗腫瘤的功效，其生理活性可依多醣體之分子量大致區分為三類：(A)分子量在3,000~5,000左右者，具有降低血糖之功能，(B)分子量在10,000~100,000之間者，具消炎的作用，(C)分子量在30,000以上者，則具有抗腫瘤作用，且分子量愈大效用愈佳。
以往菇蕈多醣體大多萃取自子實體，但是子實體來源有限；近來研究已知約有50%菇蕈類可於液態培養中產生胞外多醣體，所以可取其培養液進行多醣體純化；相較於子實體培養，液態培養較為迅速而簡單。
目前市面上菇蕈萃取物之產品眾多，特別是含有菇蕈萃取物之健康食品。因此，增加菇蕈萃取物營養價值之配方、菇蕈萃取物之新應用或新產品等相關需求，仍有其必要性。
在健康食品的領域中，益生菌亦是研究重點之一。人體的腸道內所分布的菌相，據估計有超過100種以上的細菌存在，其中由30~40種細菌構成99%的菌量，且厭氧菌較好氧菌占優勢，約多一百到一萬倍。消化道不同區域存在著不同的菌種及不同的數量分佈。這些腸內菌群彼此形成共生、拮抗的關係，而在健康的個體中維持菌叢生態的平衡。其中，少部分細菌對人體有害，例如：產氣莢膜桿菌(Clostridium perfringens
)及金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus
)，會因宿主免疫力下降而伺機增生，造成疾病；然而，棲息於健康人體腸道的細菌絶大多數對人體有益，一般稱為益菌(beneficial bacteria)，其中以乳酸菌群(Lactic acid bacteria)或雙叉乳桿菌群(Bifidobacterium
)最為人所知。
已有許多研究報告指出，益菌具有多種促進人體健康之功能，包括：(1)維持腸道正常微生物相：藉由益菌代謝所產生的醋酸和乳酸，使腸道有效維持在較低的pH值，使病原性及腐敗性細菌不易生長；(2)活化免疫系統：益菌具有刺激免疫系統、增加抗體或巨噬細胞的活性，其細胞壁含有某些抗原成分，可誘發宿主免疫系統活化、抑制腫瘤，或使宿主產生抗體以抑制病原菌吸附在腸黏膜表面上；(3)提高營養價值：以雙叉桿菌為例，其具有酸化作用及蛋白質水解活性，可改變食物中含氮化合物組成而提高蛋白質消化率，並可促進鈣及其他營養之吸收，進而預防骨質疏鬆症，甚至，某些菌株可合成多種維生素與葉酸；(4)促進乳酸代謝；(5)改善腹瀉便秘：益菌產生的有機酸能增進腸道蠕動，提高糞便中的水分含量，以降低腸阻滯；(6)降低血中膽固醇：雖然此功能仍具爭議，但由部分體外試驗結果得知，某些益菌能使膽固醇與去結合型膽鹽共沈澱而隨糞便排出人體，亦有動物試驗結果顯示，攝食乳酸菌可降低血中膽固醇的濃度；(7)抑制高血壓：益菌的某些代謝物能抑制血管收縮素轉化而使血壓降低。
科學家研究益菌的作用機制而發現益菌會生產益菌助生質(Prebiotics)，對人體健康的促進或維護有最良好的作用。
因此，本發明依上述概念並因應市場需求，開發出具保健功效的新穎組合物。
本發明之一目的在提供一種活化動物體內免疫細胞活性的組成物。
為達上述及其他目的，本發明的組成物係包括：菇蕈成分、益菌成分，及賦形劑。
根據本發明，菇蕈成分包含菇蕈菌絲體。本發明組成物之菇蕈成分包含菇蕈多醣體，特別是β－葡聚糖。本發明的菇蕈成分除了菇蕈多醣體之外，亦可包含菇蕈代謝產物，例如：蛋白質、多肽類、三帖類、多種胺基酸、生物鹼、酯類和有機酸等物質。本發明之組成物，可包含單一種菇蕈成分，或多種菇蕈成分之混合物。
根據本發明，所述菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue
)、巴西蘑菇(Agarics blaze
)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis
)、靈芝(Ganoderma lucidum
)、雲芝(Coriolus versicolor
)、樟芝(Anthodia camphorate
)、桑黃(Phellinus linteus
)、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus
)、香菇(Lentinula edodes
)、柳松菇(Agrocybe aegerita
)、猴頭菇(Hericium erinaceus
)、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig
)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula
)、金針菇(Flammulina velutipes
)及上述菇蕈之組合。
根據本發明，益菌成分包含益菌菌體，且該益菌係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum
)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei
)、腸球菌(Enterococcus faecium
)及其組合。
根據本發明，益菌成分包含益菌菌種於培養過程中所產生的益菌助生質。
根據本發明，益菌成分係益菌菌體、益菌助生質或其混合物。
根據本發明，賦形劑係，舉例但非限制，薏仁、乳糖、白糖、D－甘露醇、澱粉、玉米澱粉、纖維素晶體，或無水矽酸；於較佳實施例中，賦形劑為乳糖；於另一較佳實施例中，賦形劑為薏仁。
本發明之組成物進一步包含添加物，該添加物可為藥學上、食品上、或美容上可接受之添加物。
於本發明之實施例中，添加物為食品；於較佳實施例中，添加物係選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻及其混合物；於更佳實施例中，添加物為糙米、玉米，或兩者之混合物。
本發明之另一構想係提供包含一種或多種菇蕈成分、一種或多種益菌成分及賦形劑的組成物。於較佳實施例中，該菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue
)、巴西蘑菇(Agarics blaze
)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis
)、靈芝(Ganoderma lucidum
)、雲芝(Coriolus versicolor
)、樟芝(Anthodia camphorate
)、桑黃(Phellinus linteus
)、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus
)、香菇(Lentinula edodes
)、柳松菇(Agrocybe aegerita
)、猴頭菇(Hericium erinaceus
)、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig
)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula
)、金針菇(Flammulina velutipes)及其組合；該益菌係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum
)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei
)、腸球菌(Enterococcus faecium
)及其組合；且該賦形劑為乳糖或薏仁。
根據本發明，該組成物可供直接使用，或可視需要混合載體、藥物、食品、美容產品，或其他成分以供後續使用。
本發明之另一構想係提供包含一種或多種菇蕈成分、一種或多種益菌成分及添加物的組成物。於較佳實施例中，該菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue
)、巴西蘑菇(Agarics blaze
)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis
)、靈芝(Ganoderma lucidum
)、雲芝(Coriolus versicolor
)、樟芝(Anthodia camphorate
)、桑黃(Phellinus linteus
)、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus
)、香菇(Lentinula edodes
)、柳松菇(Agrocybe aegerita
)、猴頭菇(Hericium erinaceus
)、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig
)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula
)、金針菇(Flammulina velutipes)及其組合；該益菌係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum
)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei
)、腸球菌(Enterococcus faecium
)及其組合；該添加物係選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻及其混合物。於更佳實施例中，該添加物為糙米、玉米，或兩者之混合物。
根據本發明，該組成物可供直接使用，或可視需要混合載體、藥物、食品、美容產品，或其他成分以供後續使用。
本發明之另一目的在提供一種製備活化動物體內免疫細胞活性的組成物之方法，係包括下列步驟：取菇蕈菌絲體進行液態培養，以獲得菇蕈成分；以適當培養基培養益菌，以獲得益菌成分；及混合該菇蕈成分、益菌成分與賦形劑，以獲得該組成物。
根據本發明，該菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue
)、巴西蘑菇(Agarics blaze
)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis
)、靈芝(Ganoderma lucidum
)、雲芝(Coriolus versicolor
)、樟芝(Anthodia camphorate
)、桑黃(Phellinus linteus
)、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus
)、香菇(Lentinula edodes
)、柳松菇(Agrocybe aegerita
)、猴頭菇(Hericium erinaceus
)、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig
)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula
)、金針菇(Flammulina velutipes)及其組合。
根據本發明，液態培養所得之菇蕈成分包含菇蕈菌絲體，及/或菇蕈多醣體。
根據本發明，該益菌係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum
)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei
)、腸球菌(Enterococcus faecium
)及其組合。
根據本發明，經適當培養基所獲得之益菌成分包含益菌菌體、及/或益菌助生質。
根據本發明，該賦形劑係薏仁、乳糖、白糖、D－甘露醇、澱粉、玉米澱粉、纖維素晶體或無水矽酸；於較佳實施例中，該賦形劑為乳糖；於另一較佳實施例中，該賦形劑為薏仁。
本發明之方法進一步包含加入添加物以形成該組成物，其中該添加物係選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻，及其混合物。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本發明之其他優點與功效。
本發明可使用的菇蕈菌株如裂褶菌(Schizophyllum commue
)、巴西蘑菇(Agarics blaze
)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis
)、靈芝(Ganoderma lucidum
)、雲芝(Coriolus versicolor
)、樟芝(Anthodia camphorate
)、桑黃(Phellinus linteus
)、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus
)、香菇(Lentinula edodes
)、田頭菇屬(Agrocybe
sp.)如柳松菇(Agrocybe aegerita
)、猴頭菇(Hericium erinaceus
)、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig
)、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula
)、金針菇(Flammulina velutipes)等，但不限於上述菌株。選擇其一進行培養。
將菌種接種於YM瓊脂培養基(YM瓊脂培養基包含0.3%(w/w)酵母菌萃取物、0.3%麥芽萃取物、0.5%消化蛋白(peptone)、1.0%右旋糖(dextrose)、1.5%洋菜(agar)等)上，置於28℃培養，其中依菌種不同，菌絲體長滿固體培養基所需培養時間約7天~20天；例如：裂褶菌約培養後2－3天可見菌絲體，約5－7天可長滿固體培養基。
將上述固態培養菌絲體切一小塊植入YM培養液50毫升(ml)，於80 T的T型動物細胞培養盒中，在28℃培養一週，作為液態前置醱酵的菌種。
於廣口血清瓶中配製800毫升的YM培養液，並放入攪拌子後滅菌，將在T型塑膠培養盒培養完成的菇蕈菌液接種於血清瓶內，接種比例為每10毫升新鮮培養液接種入1毫升菌液，而後將血清瓶置於磁石攪拌機(轉速300 rpm)上，於室溫下攪拌，以進行第一次前置醱酵，培養72至96小時後，胞外多醣體濃度達最高。
以相同步驟，於10公升血清瓶中配製約8公升培養液(1公升培養液中含10克消化蛋白、10克牛肉萃取物、5克酵母菌萃取物、20克右旋糖、1克Tween 80、2克檸檬酸銨、5克CH3
COONa、0.1克MgSO4
C．7H2
O、0.05克MnSO4
C．H2
O與2克K2
HPO4
；並將酸鹼值調成pH 6.2－6.5)，接種第一次前置醱酵完成之菌液，進行第二次前置醱酵。
當然，得視需要進行多次的前置醱酵。接著，將前置醱酵完成之醱酵液進行大量醱酵。
於20公升聚碳酸樹脂(Polycarbonate,PC)培養容器中配製13公升最適化的生產培養基(包含4%葡萄糖與0.5%酵母菌萃取物)，攪拌均勻後，蓋上矽膠塞，以高溫高壓滅菌，其中滅菌條件為121℃、15分鐘，放涼至室溫。而後，將2－3公升上述第二次前置醱酵完成之菌液接種入聚碳酸樹脂培養容器中，放置於搖擺機上，設定轉速為80 rpm，於常溫(約25℃)下進行醱酵至生長曲線的靜止期(stationary phase)，此時期的菌絲體細胞數與多醣體濃度係維持衡定，即停止醱酵。所得培養液體包含蕈菇多醣體、蛋白質、多肽類、三萜類、多種胺基酸、生物鹼、酯類和有機酸等物質。
進行益菌菌種培養，其中該益菌係為嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus
)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum
)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei
)，或腸球菌(Enterococcus faecium
)。
將菌種接種於平面固體培養基(1公升培養液中含10克消化蛋白、10克牛肉萃取物、5克酵母菌萃取物、20克右旋糖、1克Tween 80、2克檸檬酸銨、5克CH3
COONa、0.1克MgSO4
C．7H2
O、0.05克MnSO4
C．H2
O、2克K2
HPO4
與15克洋菜，並將酸鹼值調成pH 6.2－6.5)，置於37℃培養。依菌種不同，約1天~3天可於培養基上長出菌落。
挑單一菌落進行小量液態培養，接著進行大量培養，利用不同的習知生長培養基成分可獲得不同的益菌代謝物與益菌助生質。培養液可直接用於後續組成物製備，亦可將菌體與培養液以離心方式分開，而僅以菌體供後續使用。
(實例一)將由上述方法所得的菇蕈醱酵液與益菌培養液混合後，利用高速均質機以12,000 rpm處理10分鐘而得均質溶液。而後加入乳糖賦形劑，其中均質溶液與賦形劑之比例為1：1，混合均勻後，經冷凍後，以低溫真空乾燥(lyophilization)處理，其中低溫真空乾燥的操作條件為－40℃、0.3 Mpa，藉以將混合物濃縮至形成含水率低於5%的粉末。
可視需要將乳糖替換為其他賦形劑，例如：薏仁、白糖、D－甘露醇、澱粉、玉米澱粉、纖維素晶體，或無水矽酸。
(實例二)將由上述方法所得的菇蕈醱酵液與益菌培養液混合，經由高速均質機以12,000rpm處理10分鐘而得均質溶液，再加入預先磨碎的糙米顆粒(醱酵液：糙米的比例為2：1)，均勻混合後進行冷凍乾燥處理。將冷凍乾燥後的混合物在10℃下利用高速均質機磨成粉末，以獲得含有菇蕈成分與益菌成分的組成物粉末。
可視需要將糙米替換為其他穀類，例如：米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻，及其混合物。
動物模式：選用五週齡的雄性Wistar大白鼠(來源：台灣大學動物中心)，重量為380~450克。實驗前將大白鼠分別單獨飼養，室溫控制於21±2℃、濕度65±5%，光暗循環時間為12D：12L，待適應兩星期後開始進行實驗。
以本發明組成物餵食大白鼠三天，每天0.2毫升。三天後使用LIVE/DEAD Cell－Mediated Cytotoxicity套組(Molecular Probes)測定血液中自然殺手細胞活性，實驗步驟如下：將YAC－1細胞濃度調成1×106
細胞/毫升。依比例加入DIOC18
(10 μ L DIOC18
/毫升YAC－1細胞懸浮液)並混和均勻。於37℃培養20分鐘。將細胞濃度調成1×106
cell/毫升。
以RPMI 1640培養基(Hyclone)將淋巴球細胞調成細胞濃度2×106
cell/毫升。將染色後的YAC－1細胞20微升加入的脾臟淋巴球懸浮液200微升中，並加入220微升的PI溶液(40微克/毫升)染色，以1000×g離心30秒後，再於37℃培養2小時。以流式細胞儀測量淋巴球活性。
結果如第2圖所顯示，與對照組相比較，本發明組成物確實可提升自然殺手細胞之活性。
本發明的組成物除可活化免疫細胞活性外，更具有以下所述之優點與功效：本發明之組成物復具有其他保健功效，如抑制有害細菌生長、補充營養、吸附有毒物質、改善膚質等，故可增進動物體或人體之健康、減少疾病損害。
本發明之組成物所包含的益菌助生質包含有機酸(如乳酸或醋酸)與抗菌因子，可抑制對動物體或人體有害細菌之生長。
本發明之組成物可提供豐富營養成分，主要為菇蕈及益菌在培養過程中所生成，例如：菇蕈多醣體、蛋白質、多肽類、三帖類、多種胺基酸、生物鹼、酯類、有機酸、維生素B群及酵素等，可添加至食品或飼料，供動物體或人體所需之營養，做為添加用。
另外，本發明之組成物可中和與吸附毒素，故可減低人體對硝胺及苯酚類的吸收而降低致癌風險。本發明之組成物亦可降低膽固醇吸收率、強化單雙醣之應用並降低其體內吸收率，可應用於糖尿病患者之飲食控管與營養補充。
本發明之組成物可溶於水，取其水溶液塗抹於皮膚，可迅速被皮膚吸收，並活化皮膚組織中的免疫細胞(如吞噬細胞及製造膠原蛋白的纖維母細胞)，可改善膚質並預防皮膚病。
上述實施例僅例示性說明本發明之組成物與製備方法，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發明之權利保護範圍如後述申請專利範圍所載。
第1圖為本發明之菇蕈與益菌組成物製備流程。
第2圖係長條圖，其係根據本發明之實施例，顯示本發明的菇蕈與益菌組成物對於大白鼠體內自然殺手細胞活性之影響；其中Control為對照組、A與B為餵食益生菌組、C與D為餵食本發明組成物組。
Claims (12)
- 一種用於活化、維持及穩定動物體內自然殺手細胞活性的組成物，包括：菇蕈成分，其中，該菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue )、巴西蘑菇(Agarics blaze )、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis )、靈芝(Ganoderma lucidum )、雲芝(Coriolus versicolor )、樟芝(Anthodia camphorate )、桑黃(Phellinus linteus )、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus )、香菇(Lentinula edodes )、柳松菇(Agrocybe aegerita )、猴頭菇(Hericium erinaceus )、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig )、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula )、金針菇(Flammulina velutipes)及上述菇蕈之組合，以及其中，該菇蕈成分包含菇蕈多醣體，及/或菇蕈代謝物；益菌成分，其中，該益菌成分包含該益菌於培養過程中所產生的益菌助生質，且該益菌係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum )、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )、腸球菌(Enterococcus faecium )或其組合；及賦形劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該菇蕈成 分包含菇蕈菌絲體。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該益菌成分包含益菌菌體。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中該賦形劑為乳糖、薏仁、白糖、D-甘露醇、澱粉、玉米澱粉、纖維素晶體，或無水矽酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物，進一步包括穀類。
- 如申請專利範圍第5項所述之組成物，其中該穀類係選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻及其混合物。
- 一種製備用於活化、維持及穩定動物體內自然殺手細胞活性的組成物之方法，係包括下列步驟：取菇蕈菌絲體進行液態培養，以獲得菇蕈成分，其中，該菇蕈係選自裂褶菌(Schizophyllum commue )、巴西蘑菇(Agarics blaze )、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis )、靈芝(Ganoderma lucidum )、雲芝(Coriolus versicolor )、樟芝(Anthodia camphorate )、桑黃(Phellinus linteus )、珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus )、香菇(Lentinula edodes )、柳松菇(Agrocybe aegerita )、猴頭菇(Hericium erinaceus )、杏鮑菇(Pleurotus eryngiig )、花瓣茸(Sparrasis crispa)、木茸(Auricularia auricula )、金針菇(Flammulina velutipes)及上 述菇蕈之組合，以及其中，該菇蕈成分包含菇蕈多醣體，及/或菇蕈代謝物；以適當培養基培養益菌，以獲得益菌成分，其中，該益菌成分包含益菌菌種於培養過程中所產生的益菌助生質，且該益菌菌種係選自嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus )、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum )、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )、腸球菌(Enterococcus faecium )或其組合；及混合該菇蕈成分、益菌成分與賦形劑，以獲得該組成物。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中，該賦形劑為乳糖或薏仁。
- 如申請專利範圍第7項之方法，進一步包含加入穀類。
- 如申請專利範圍第9項之方法，其中，該穀類係選自米類、麥類、黍類、豆類、芝麻、蓖麻，及其混合物。
- 如申請專利範圍第7項之方法，該菇蕈成分包含菇蕈菌絲體。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該益菌成分包含益菌菌體。
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