TWI398257B - 新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯及其醫藥組合物 - Google Patents

Description

新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯及其醫藥組合物

本發明係有關於一種海洋天然物，特別係有關於一種新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯。

關於中樞神經系統的疾病，如脊髓或腦創傷(trauma)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)以及帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)等，在臨床上大都是因為神經細胞出現死亡的現象，導致感覺、運動功能出現障礙。這些因神經細胞出現死亡現象產生的神經退化性疾病(Neurodegenerative diseases,ND)，會隨著年齡增加越發嚴重，然而到目前為止，有關神經退化性疾病尚無有效的治療方式及藥物，臨床上只能針對症狀給予藥物進行改善，然而長期使用這些藥物多會伴隨嚴重的副作用產生，尤其是用於治療帕金森氏症藥物所伴隨產生的副作用尤為嚴重(Waldmeier et al.,2004)，因此積極篩選具有神經保護活性與抑制發炎過程之藥物為非常重要之議題。

本發明之主要目的係在於提供一種新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯(Thioflexihilolide A)，其結構式為：

請參閱第1圖，其係本發明之一較佳實施例，一種新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯(Thioflexibilolide A)，其結構式為：

該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯係由柔軟指形軟珊瑚分離萃取而成，並可製成一醫藥組成物以治療發炎作用及具有神經保護作用，此外，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯係可與醫藥學上可接受之賦形劑組合以製成該醫藥組合物，在本實施例中，該醫藥組合物係可視投藥途徑不同做成錠劑、無菌非經腸溶液或懸浮液、散劑、膠囊、丸劑、噴霧劑或栓劑等形式。

接著，有關於該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯之萃取分離方法係詳細說明如下：首先，利用丙酮自柔軟指 形軟珊瑚進行萃取，以提取一萃取液，在本實施例中，該柔軟指形軟珊瑚係為柔軟指形軟珊瑚碎片，其係將解凍的柔軟指形軟珊瑚樣品〔濕重2.1kg〕切碎形成碎片。接著，利用丙酮反覆多次，取得該萃取液，並將該萃取液減壓濃縮。進而利用二氯甲烷/水將該萃取液進行分配，以取得一二氯甲烷層及一水層，並將該二氯甲烷層以正向矽膠膠體管柱層析法進行初步分離〔preliminary isolation〕，之後，利用正己烷/乙酸乙酯進行沖提，在不同比例逐漸升高極性下，以取得數個劃分層提取液，其中該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯係由正己烷/乙酸乙酯比例為1：1的劃分層分離出，接著，進一步利用高效能液相層析儀以逆向層析管住在甲醇/水比例為2.3：1之下，取得該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯15.2mg。由外表觀之，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯係為無色油狀物，在高解析質譜儀〔ESIMS〕圖譜的主要離子峯為725.4059[M+Na]⁺；紅外光光譜〔IR〕v_max3460、1722cm^-1，此外，請參閱第2圖，將該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯與過去文獻及利用核磁共振儀解析比對發現其為新化學結構化合物，因此將該新穎之化合物命名為硫柔指珊瑚丙酯〔Thioflexibilolide A〕。

接著，利用小鼠巨噬細胞進行離體抗發炎活性分析及利用人類兒茶酚胺類神經母瘤細胞株進行神經保護活性分析：

小鼠巨噬細胞實驗：

小鼠巨噬細胞(mouse macrophage cell line,RAW 264.7)係購自於American Type Culture Col- lection(ATCC,No.TIB-71)，本實驗係先將細胞置於DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medi-um)〔Invitrogen Corporation，Carlsbad，Cali-fornia，USA〕中，並將細胞置於37℃、5%CO₂、95%空氣的培養箱〔Thermo electron corporation,Waltham，USA〕中培養，其中DMEM培養基係包含有10%熱鈍化〔heat-inactivated〕胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2毫莫耳濃度(mM)穀胺醯胺〔glutamine〕、1mM丙酮酸鹽〔pyruvate〕、4.5g/l葡萄糖〔glucose〕、50U/ml盤尼西林〔penicillin〕及50μg/ml鍊黴素〔streptomycin〕。

細胞繼代培養：

將RAW 264.7解凍置於DMEM培養基中，培養細胞於溫度37℃、5%CO₂、95%空氣的培養箱環境中。當細胞增殖至九分滿時，以適量之磷酸鹽緩衝溶液〔phosphate buffered saline，PBS〕〔137mM NaCl、2.68mMKCl、10 mMNa₂HPO₄、1.76mMKH₂HPO₄、pH7.2〕潤洗細胞一次，移除磷酸鹽緩衝溶液後加入適量之胰蛋白酶〔0.25% trypsin EDTA〕〔TrypLE^TM Express Stable Trypsin Replacement Enzyme without Phenol Red，Invitrogen Corporation，USA〕處理，以肉眼觀察到大部份細胞飄起之情形後，再以大量細胞培養液將全部細胞沖刷下來，統一收至離心管離心〔180xg，時間8分鐘，溫度25℃〕，離心後將上清液移除，加入新鮮細胞培養液後，依照適當細胞數量將細胞分至6公分培養皿，在溫度37℃、5%CO₂、95%空氣的培養箱中培養24小 時以進行實驗。

離體抗發炎活性分析：

RAW 264.7巨噬細胞再繼代培養完經24小時後，進行該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯之離體抗發炎測試。其係將實驗組別區分為2組，第一組係RAW 264.7巨噬細胞於6公分培養皿〔culture dish〕中單純給予酯多醣〔0.01g/ml；sigmaL2654〕18小時後收集細胞。第二組則為該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯加入培養皿後10分鐘再加入酯多醣，之後同時將第一組及第二組之RAW 264.7巨噬細胞收集下來後，加入溫度4℃之裂解緩衝液(lysis buffer)〔50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，1%TritonX-100，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，100μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride，1g/ml aprotinin，20mM NaF，0.2mM Na3VO4〕200微毫升。樣本經處理後，在溫度4℃之下，以14,000g離心30分鐘，去除掉不溶解的部分並取出上清液部分後，以洛瑞(Lowry)法〔Lowry et al.，1951〕定量這些上清液內的蛋白質含量。使用Bio-Rad公司蛋白質定量檢測試劑盒(Bio-Rad DC protein assay kit)〔Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA〕及酶測讀儀〔ELISA reader，Thermo Electron Corporation，USA〕分析上清液的吸光值，以測定各標本之蛋白質量。將經校正後取等體積加入等量之標本緩衝液〔sample buffer；2% SDS，10% glycerol，0.1% bromophen-ol bule，10% 2-mercaptoethanol，50mM Tris〕，利用7%、10%之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 (polyacrylamide SDS-PAGE)分離蛋白質。再將膠體電泳上之蛋白質轉印〔transfer〕至聚偏氟乙烯膜(PVDF membrane)〔0.45mm pore size，Immobi-lon-P，Millipore，Bedford，MA，USA〕上〔1.5安培，4℃，2.5小時〕。轉印後的聚偏氟乙烯膜以含5%脫脂奶粉之吐溫-20三羟甲基氨基甲烷緩衝鹽液(Tween 20-Tris-buddered saline,TTBS)〔Tris-HCl 20mM，NaCl 137mM，pH 7.4，0.1% Tween 20〕在室溫下處理40分鐘，之後將第一組分別再與1：1000稀釋比例的一級抗體誘發型一氧化氮合成酶〔BD Pharmin-gen，San Diego，CA，USA；catalog No.6103322；polyclonal antibody〕及病態型環氧化酶〔Cay-man Chemical，USA；catalog No.160106；poly-clonal antibody〕在室溫下反應2小時及將第二組分別再與1：1000稀釋比例的一級抗體誘發型一氧化氮合成酶〔BD Pharmingen，San Diego，CA，USA；cata-log No.6103322；polyclonal antibody〕及病態型環氧化酶〔Cayman Chemical，USA；catalog No.160106；polyclonal antibody〕在室溫下反應2小時。隨後以吐溫-20三羟甲基氨基甲烷緩衝鹽液清洗三次，再與HRP-conjugated之二級抗體兔子免疫G球蛋白(anti-rabbit IgG)抗體〔1：2000〕在室溫中反應1小時30分鐘，再以TTBS清洗三次，最後利用增強化學發光檢測試劑盒(enhanced chemiluminescence detec-tion kit)與聚偏氟乙烯膜反應，並以影像分析處理設備(UVP Biospectrum AC System,UVP Inc, U.S.A.)偵測冷光反應，紀錄蛋白質的表現量，以電腦分析軟體(VisionWorks LS Acquisition and analys-is software,copyright 2007,LLC,U.S.A.)偵測並計算相對量。並以單獨加入酯多醣組別為100%，並以β型機動蛋白(β-actin)作為內控制組。

實驗結果：

請參閱第3圖，其係為進行離體抗發炎活性實驗之實驗結果，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯濃度在10微毫莫耳濃度(μM)之下，可看到該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯對酯多醣〔0.01μg/ml〕刺激巨噬細胞之誘發型一氧化氮合成酶和病態型環氧化酶蛋白質表現之影響。該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯濃度在10微毫莫耳濃度時，具有顯著抑制誘發型一氧化氮合成酶蛋白質表現之作用，同時有些微抑制病態型環氧化酶蛋白質表現之作用，但對於內控制組(β-actin)則無抑制作用。

人類兒茶酚胺類神經母瘤細胞株實驗：

SH-SY5Y為人類兒茶酚胺類神經母瘤細胞株〔Amer-ican Type Culture Collection，No.CRL2266〕。本實驗係先將細胞置於DMEM培養基(Dulbecco’s Mod-ified Eagle Medium)〔Invitrogen Corporation ，Carlsbad，California，USA〕中，並將細胞置於37℃、5%CO₂、95%空氣的培養箱〔Thermo electron corporation,Waltham，USA〕中培養，其中DMEM培養基係包含有10%熱鈍化〔heat-inactivated〕胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2毫莫耳濃度(mM)穀胺醯胺〔glutamine〕、1mM丙酮酸鹽〔pyruvate〕 、4.5g/l葡萄糖〔glucose〕、50U/ml盤尼西林〔penicillin〕及50μg/ml鍊黴素〔streptomycin〕。

細胞繼代培養：

將SH-SY5Y解凍置於DMEM培養基中，培養細胞於溫度37℃、5% CO₂、95%空氣的培養箱環境中。當細胞增殖至九分滿時，將細胞培養液收至離心管備用，以適量之磷酸鹽緩衝溶液〔phosphate buffered saline，PBS〕〔137mM NaCl、2.68 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.76 mM KH₂HPO₄、pH 7.2〕潤洗細胞一次，移除PBS後加入適量之胰蛋白酶〔0.25% trypsin EDTA〕〔TrypLE^TM Express Stable Trypsin Replacement Enzyme without Phenol Red，Invitrogen Cor-poration，USA〕處理，以肉眼觀察到大部份細胞飄起之情形後，再以大量細胞培養液將全部細胞沖刷下來，統一收至離心管離心〔180xg，時間8分鐘，溫度25℃〕，離心後將上清液移除，加入新鮮細胞培養液後，依照適當細胞數量將細胞分至96小格培養盤〔2×10⁴顆/孔〕與直徑10公分培養皿中，在溫度37℃、5% CO₂、95%空氣的培養箱中培養24小時以進行實驗。細胞繼代超過四次後，便丟棄不再使用。

神經保護活性分析： 1.阿拉莫爾藍色測試(Alamar blue assay)

在活細胞的粒線體作用下可使原本為藍色的阿拉莫爾藍色〔Biosource，Camarillo，CA〕轉變成粉紅色，透過吸光質的讀取及計算，可回推出活細胞於全部細胞中之比例關係。將SH-SY5Y細胞以2×10⁴顆/孔的數量 培養於96小格培養盤中。在溫度37℃、5%CO₂、95%空氣的培養箱中培養24小時，待細胞完全和96小格培養盤底部貼附後，開始以各種不同藥物進行處理，而後以六羥基多巴胺(6-OHDA)處理15小時，加入10%的阿拉莫爾藍色，繼續培養3小時；然後，利用酵素免疫判讀機〔ELISA reader〕〔Thermo electron corporation,Multixkan EX，USA〕測量吸光值，藉此分析六羥基多巴胺對神經細胞產生的毒性。其係先以該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯預處理1小時，再加入六羥基多巴胺，藉以分析該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯對神經細胞是否具有保護作用。計算公式仿自李等人〔2005〕所發表之方法，透過公式計算後，便可以得知細胞存活率：[(實驗組-背景值)/(控制組-背景值)]*100

依照李等人〔2006〕發表之方法則可推估相對保護率〔Relative protection〕：[(治療組-6OHDA組)/(控制組-6OHDA組)]*100

2.末端轉移的缺口末端標記法(Tunelst aining as-say)

末端轉移的缺口末端標記法為細胞凋亡時針對末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxy-uridine triphosphate,dUTP)進行標記。將欲培養之細胞收集至離心管後，以等量相同細胞數目培養於預先放置於已放置並滅菌蓋玻片的10公分培養皿中培養，待投予該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯處理後，於適當時間下以鑷子移置蓋玻片，並利用磷酸鹽緩衝溶液的置 於6公分培養皿中在4℃冰箱中清洗3次，再以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)在4℃冰箱中固定5分鐘後，以PBS清洗每次5分鐘清洗4次，加入冷滲透溶液(permeabilisation solution)(0.1%Triton X-100、0.1%Sodium citrate)反應30分鐘，再以PBS緩衝溶液清洗8分鐘1次，在加入封閉液(磷酸鹽緩衝溶液、3%bovine serum；Blocking Buffer)下搖晃反應60分鐘後，再加入末端轉移的缺口末端標記反應混合物(TUNEL reation mixture)(螢光顯微鏡下為綠色)在37℃下反應90分鐘後，再以磷酸鹽緩衝溶液清洗5分鐘3次，在加入封閉液下搖晃反應60分鐘後，加入原位細胞凋亡試劑(converter-POD solution)搖晃反應30分鐘，磷酸鹽緩衝溶液清洗5分鐘3次，而後將玻片進行風乾後並封片，再以正立螢光顯微鏡與影像輸出系統進行拍攝紀錄影像，並進行分析。

實驗結果： 1.阿拉莫爾藍色測試(Alamar blue assay)

請參閱第4圖，其係為不同濃度之該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯預處理1小時，再加入六羥基多巴胺30μM後之實驗結果，結果證實該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯可以抑制因六羥基多巴胺造成的SH-SY5Y細胞死亡現象。在分別給予10^-3、10^-2、10^-1、1及10微毫莫耳濃度之該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯作前處理的組別中，SH-SY5Y細胞的相對保護率可達12.14%、49.92%、44.27%、40.64%及14.18%，其相對保護率較單純給予六羥基多巴胺組顯著增加，因而證實該新穎之化合物硫柔指珊瑚 丙酯具有神經保護活性。

2.末端轉移的缺口末端標記法

請參閱第5圖，在末端轉移的缺口末端標記法結果顯示，當SH-SY5Y細胞添加二甲基亞颯(DMSO)及六羥基多巴胺時，SH-SY5Y細胞表現出較多的綠色螢光，其係代表細胞凋亡時之末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸表現之現象，但若SH-SY5Y細胞同時添加二甲基亞颯(DMSO)、該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯及六羥基多巴胺時，SH-SY5Y細胞表現出較少的綠色螢光，較佳地，若同時利用單位面積下計算，添加該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯與未添加該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯在細胞凋亡的數目上，有顯著性的差異，因此證實該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯具有神經保護活性，此外，若單純給予該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯時亦不會引發細胞凋亡現象。

本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準，任何熟知此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內所作之任何變化與修改，均屬於本發明之保護範圍。

第1圖：依據本發明之一較佳實施例，一種新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯之示意圖。

第2圖：依據本發明之一較佳實施例，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯利用核磁共振儀解析之結果。

第3圖：依據本發明之一較佳實施例，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯對於離體抗發炎活性分析之結果。

第4圖：依據本發明之一較佳實施例，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯對於神經保護活性分析之結果。

第5圖：依據本發明之一較佳實施例，該新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯對於細胞凋亡時之末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸表現之結果。

Claims (4)

1. 一種新穎之化合物硫柔指珊瑚丙酯，其結構式為：
2. 如申請專利範圍第1項所述之硫柔指珊瑚丙酯，其係由柔軟指形軟珊瑚分離萃取而成。
3. 一種醫藥組合物，其特徵在於包含有根據申請專利範圍第1項之新穎之化合物。
4. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物，其另包含有賦形劑。