TWI363096B - Primer pairs and probes for measuring free dna concentration and measuring method thereof - Google Patents

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1363096 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關一種測量游離DNA濃度之引子對及其方法，尤 其有關一種用以粒線體DNA測量游離DNA濃度之引子對及i 超敏感方法。 〃 【先前技術】 許多文獻?指出游離DNA在-些代謝相關疾病或癌症患者 的身上’和正常人相比’有上升情形發生。目前已有一些伽 離DNA的方法，但受限於靈敏度及檢體處理過程的差異所造 的景>響’而未能作為臨床方面的檢測。由於游離DNA濃度的 化對疾病治療_的評估具雜大的潛在驗，故轉發展盆臨 床用途。 〃 -個細胞有㊉達針個mtDNA存在，但只有—套核D 如果-個細胞死亡，除了體染色體會釋出 也^一；因此，若要以PCR的方_麟_ DlT =NA疋比核DNA更好的選擇。，然而，使用⑽财當作 度變異性，其變異性大職至可絲作為人身鑑軸 是^内自由基產生最多的地方，但偏偏粒線體| (Histone)包圍保護，所以，mtDNA可 从，蛋白 (polymorphism)。也因此，报難設計出任何’人都=的夕f性 冗引子。财讀上航_⑽體奸= 多型性位點（polymorphismsite)。 ·、，、忒凡王避開 為解決上述問題點，本發明人等從全球的基 資訊的比對，.應用生物資訊的方法，收集 資仃 型性的位點，從其中設計可以使用的引子對及“。因 4 1363096 發明。 【發明内容】 因此’本發明有關一種測量游離DNA濃度之方法，其係一 種以粒線體DNA測量游離DNA濃度之超敏感方法。本發明之 測量游離DNA濃度的超敏感方法，不但可應用在臨床上，更可 以應用在實驗動物身上，以縮短常規的臨床前研究時間。 本發明人等預定先以電腦程式收集資料庫當中可用的序 列，包括人類以及一些實驗動物，並藉由電腦程式ClustalX U3 進行序列排整及校正的動作。經過整理後的序列，利用java程式 將未曾被發表過的多型性位點特別計算出來，並加以標示。依據 最後所產生的結果’在所產生的區域内，設計理論可行的引子 對，並以實驗驗證其確實可行^ 據此，本發明有關一種可用於定量DNA之引子對，其具有 下列核苷酸序列： 正向引子序列：5，-CAAGTTACCCTAGGGATAACA-3，(n.t 2920-2940)(序列編號 1) · 反向引子序列：5’-TAATCGGTTGAACAAACGAACC-3，〇n.t 3〇31_3〇51)(序列編號 2) 探針：5’-ACGACCTCGATGTTGGATCAGGA-3,（n.t 2981-3003) (序列編號3)。 本發明又有關一種可用於定量DNA之引子對，其具有下列 核苷酸序列： 正向引子序列：5，-AATTTCGTGCCAGCCACCGC-3，(n.t 881-900) (序列編號4) 反向引子序列：5，-CCCAGTTTGGGTCTTAGCTAT-3， 1〇54·1〇74)(序列編號 5) 探針：5’-CTACGAAAGTGGCTTTAACA-3,（n.t 1020-1039)(序列 編號6)。 本發明進而又有關一種游離DNA濃度之測量方法，包括以 粒線體DNA的保守區域作為偵測目標，在選自下列兩對引子對 5 1363096 中之至少一對引子對存在下，對檢體中之DNA進行即時定量聚 合酶反應，藉此檢測游離DNA濃度： 引子對A : 正向引子序列：5，-CAAGTTACCCTAGGGATAACA_3，(；iLt 2920-2940)(序列編號 1) · 反向引子序列：5’-TAATCGGTTGAACAAACGAAa：_Htit 3031-3051)(序列編號 2) . 探針.5 -ACGACCTCGATGTTGGATCAGGA-3’（n.t 2981-3003) (序列編號3);

引子對B : 正向引子序列：5，-AATTTCGTGCCAGCCACCGC-3，(n.t 881-900) (序列編號4) 反向引子序列：5，-CCCAGTTTGGGTCTIA(}CTAr_3，iiLt 1〇54_1074)(序列編號 5) 探針：5’-CTACGAAAGTGGCTTTAACA_3,（n.t 1020-1039)(序列 編號6)。 本發明中之DNA可為任何DNA，例如存在於血液、血清、

灰漿、體液、組織等之DNA均可，而無任何限制。且待測DNA

之物種並無限制，而可為任何物種如小鼠、大鼠、天竺鼠、中國 $鼠、兔子、豬、牛、狗、短尾猴、黑觀及人類，較好為人類 DNA 〇 依據本發明之測量方法，該兩對引子對避開了目前人類所有 突變位點，且具有下列特徵：⑴不具有多型性，故不論受 ^者為何均可㈣；⑺其相符合㈣PCR引子及 件；以及(3)可應用於大多數實驗動物。 【實施方式】 本發明人將現今文獻所提過的檢麟離DNA的檢測方法作 =理’取最多人使用且靈敏度最佳的方法，預定和本公司以生 ^貧訊為基礎所設計驗财法，作專—㈣及敏雜的比較測 6 1363096

述如^發明人對讀進行整理，將目祕測游離DNA 固ί i:將待測之DNA或奶八變性後 推—雜^ 然後加入過量已標記好的DNA或_探針以 化ί凝ί雷、特點是操作簡事先不用限制性内切酶消 2 樣品，可在同-張膜上同時進行多= ί㈣ΪΪ ΐ點是不能歡所測基因的相對分子質量，而且 /右有—定比㈣假陽性。文獻指出其靈敏度在

: 公骑㈣細紐，將已知 /辰度DNA及未知k度的待測物，以適#

=繼行反應。隸驗會有不咖色A 雜一 已知/辰度DNA作-比較即可知其濃度，原理類似 雜父法。 3.PiC〇^reen dsDNA套組：心細卿公司所出的檢測套組，其 主要為-核酸螢光染劑’可與雙股測入鍵結並發出螢光 非常簡單，錄紐於DNADipstiek套組和斑雜交法/'

的方法敘 4·核JDNA即時疋量聚合酶連鎖反應讲從以脱卩⑶#，彳& 文簡稱’’nDNAPCR”）：為目前檢測游離DNA的相關文獻中，最 丰被使用的實驗方法。這是一種在pCR反應過程中同時可以偵 測PCR反應增幅情形與增幅趨勢的技術；利用偵測pcR反應 之增幅趨勢，可以計算出檢測樣品中，目標〇1^八的含量。目前 文獻以4貞測所謂”家管基因(h〇use keeping gene)”為夫老;ί*= 標，與欲偵測的目標作一比較。常用的家管基因有 GAPDH、β-肌動蛋白(actin)、β_球蛋白(gl〇bin)等。 茲將上述所提的四種方法中，取靈敏度較佳的pic〇green dsDNA套組與nDNAPCR與本發明之粒線體DNA即時定量聚合 酶連鎖反應(real-time PCR of mtDNA，後文簡稱，，mtDNA PCR^ 方法作比較，如下表所示： 7 1363096 項目 指標或規格 功能輿應角 國内外既有水 Picogreen 200次分析 /1ml 核酸螢光染寄，染劑 與雙股DNA鍵結後 會發出螢光，藉此偵 測檢體中雙股DNA 含量 Invitrogen的上市產 品。目前應用以研究 為主，尚未使用在臨 nDNA PCR 以家管基因 為偵測目標 nDNA PCR可偵測 微量DNA含量，藉 由擴增反應及其反 應動力學，可得知檢 體的原始澧膚 已被臨床及研究灭 使用，主要以家管基 因為偵測目標， 如:hTERT, GAPDH, β-actin, β-globin 箄 mtDNA PCR |以粒線體基 因轉化區域 作為偵測目 標 HCE ； 有文獻使用，但無避 開多型性位點 本實驗將取30位成年人的血液，作以上3種試驗，並比較 其實驗結果之差異與靈敏度，來證實本發明的理論择實可行。 藉由本發明之測量游離之mtDNA的方法可解決,目前對DNA 檢查中所遇到的問題，本發明之測量游離之mtDNA的方法之特 徵在於以粒線體DNA取代細胞核DNA作為檢測的目標。 1·可用於粒線體序列資料庫建檔： 本發明以MITOMAP (人類粒線體基因體資料庫)的修正後劍 橋標準序列(Revised Cambridge Reference Sequence)(.rCRS )作為 人類粒線體基因的對照基礎，自mtDB(人類粒線體基因組資料^ http://www.genpatuu.se/mtDB/)收集公開的粒線體基因體，至2〇〇8 年3月15日為止，mtDB共收集2469筆人類粒線體序列，將這 些序列自GenBank下載。 ^以人類粒線體多型性位點的資料庫繪製人類mtDNA保守 變異條碼(conservation-variation bar_code)圖，並標示連續2〇個以 上核苷酸保守之區域，所得結果如圖1〜4所示。 ' 圖1顯示為人類粒線體基因，全長16569個驗基對的第 1〜4000個位點，其多型性分布情形；位點下方為此序列片段所 對應的官能基。比較同一位點其2469筆的人類序列，只要有j 筆序列和其他筆顯示不同，則此序列以藍線標示；沒有任何一筆 8 H貝ί標示白色。因此白色部份代表2469筆的序列皆為相同的 ，土酸’也就是保守的位點。由於—般引子的長度大約在2〇 左右，因此若有連續20個保守位點，則將此區域以粉紅 並標示其連續保守位點的個數。 ’ 由於即時疋1聚合酶連鎖反應的產物大小若超過兕，合 導致效率變差，因此，將長度纖P内含有2個上述步驟所標^ 區域的部分’晝為一區塊，保守區域分別設計為正向、反 或正向、反向引子及目標探針(taq_probe)的參 依上述屌則，人類粒線體基因全長共得到7個 塊，分別在圖1以S·4、圖2以s·6二 圖2顯不為人類粒線體基因，全6569 4對0多型性分布情形，健下方為此序 ，應的s此基。依照前述原則作標示。由圖2可知，有 t二個轉可以作為設利子_參考區域，射 作為sybgreen的設計參考區域。 h t* 圖3顯示為人類粒線體基因，全長16569個鹼基對的第 张個健衫型性分雜形，位點下方為此序列片段 =對應的官能基。依照前述原則作標示^由圖3可知，僅有 此區塊可以作為設計引子對的參考區域。 q 削為人類減體翻，全長16569鑛基對的第 所斜;触點其多型性分布情形，位點下方為此序列片段 2能基。依照前述原則作標示。由圖4可知，此區只有 考區Γ工㈣’但彼此相距太遠，不適合做為設利子對的參 顯干可財到β·1(Κ)ρ區為藍色線條最頻繁的區域， 顯不此區域具有極高_異性，可作為人身辨識之用。 絲2469筆人練線體基因多型性的比對圖， 並找出可作為設計引子對_在區塊，將此7傾塊詳列於表】。 9 1363096 表1.潛在可用於設計引子對及探針的區塊 區域 位點 位置 長度(bp) Seql* 607..1148 tKNAPhe~12SrRNA 542 Seq2 1346..1692 12SrRNA~16SrRNA 347 Seq3 1900..2204 16S rRNA 305 Seq4 2416..3276 16SrRNA 〜tRNALl 861 Seq5 4263..4417 tRNAIle-tRNAMet 155 (僅能設計 sybgreen) Seq6 5394..5874 ND2~tRNATyr 481 Seq7 10428..10723 tRNAArg~ND4L 296 *由於20S^icro/a並無tRNAPhe的位置，故tRNAPhe此一區域的分析物種數僅 160。

2·設計目標引子對以及探針並進行合成 本發明人已利用生物資訊方式得到粒線體基因的7個適合設 計引子對及探針的區塊，其中，Seq5僅能設計sybgreen，以及Seq7 此一區塊接近300bp，且引子對的Tm值差距太大，聚合酶連鎖 反應的效能會不夠好’因此先將此2區捨棄(表1藍色標示處）。 接著’選定常見實驗動物的物種。常見實驗動物共選取9種（表2)，自NCBI下載具有完整粒 線體基因體的序列，至2008年3月15曰為止，共有180筆可進 行分析。

表2.本實驗所採用常見實驗動物物種 物種 俗名 Mus musculus & Mus musculus domesticus 小鼠 Rattus norvegicus 大鼠 Cavia porcellus 天竺鼠 Cricetulus griseus* 中國倉鼠 Oryctolagus cmiculus 兔子 Sus scrofa 豬 Bos Taurus 牛 Cams familiaris 狗 Macaca mulatta 短尾猿 Pan troglodytes 黑猩猩 總計 *無_Α之註解’故捨棄，故最後分析物種數為18〇 (12) 數量 ^0 (3)6(2)2 (1) 2 (1) 2(1) 33(1) 77(1)36⑴ 2(1) 2(1) 182 (13) 1363096 接下來，針努所選取的5個區塊·裁切相對應的當見實驗動 物序歹:丨，與rCRS進行多序列韓§己(1饥丨hiple sequence alignment) (iMSA) - MSA 由 ClustalX ] .83 (Thompson e7 “/.· ] 997)執行，f吏用 預設參數：將MSA結果與人類粒線體多型性位點資料彙整於圖 5-9，其中 lns1表示此位點之後有insertion，數字表示所插八的核苷毁數目 _表示此位點為人紐生彡型性的位點 A表示此位點為人類以及常見實驗動物皆conserved的位點 C表示此位點為人類以及mouse, rat皆conserved的位點 6或77表示此位點為實驗動物有多型性的位點，數字表示此位 點多型性的頻率= 由圖可知，設計時應避免1ns1，_，6，77的位點。 針對所選取之5個區塊，以PrimerExpress version 2.0進行分 析，得到1400種引子/TaqManMGB探針組合= 根據圖1-4的人類粒線體多型性位點的資訊，篩選1400種 引子/TaqManMGB探針組合，得到9種完全落於人類保守區域的 組合，詳列於表3，但圖5-9的常見實驗動物比對結果卻顯示， 這些組合均不適用於常見實驗動物。 1363096

1 1.-A Λ-1 」vv\ 乙\-\--|-V-VVM- 11-. )\ V! > .Λ \ \ .>\ \--l->.-\ \-u I---〆 VM .)〆 \ \ . Λ \ -二 I ! >.-vvul ll-uv V-.U VV. U v--M c l\ \ U i.i 1.--\Λ m .nvv- n v三-!--〆 v i- …ΑΛ V: -v\ \ .u v--llulvvll --1-.-\·-) 乙\ \ v-\ 〆---!ulvvl- 三Λη-\)ν\ v -η V!--· c lv\-.l ul.'uv-.)\ \_\-\ \·---!')1\ V U ΥΓ- Ι:ί~-η1------ --¾ ΪΓ£ s-u"--· -\-)！--·-)"--)--){>-〆'·--Η:--- -ν-νΌονΛι.ν-·--.·--/·;-Λ) ί-ΙΛκ-Γ s--T—：-- s-)' s-ϋ5. svm-〔-h svoi--u -m--- H--T-;-- oro'--u -ν-'-)Λ〕！)\-'---!)ί)-.--Η·--5, --!-ν 寸--’-一 ΜΗ, I 〆-)！ )Λ--)ν-! )-!-----)'-m· -!-ν>!Α\·-)-'---ν·〔0'二 ο·' -\-')νί)：)\-')Ιν!)！) ι-!)-ν-)ΛΙΛ〕~二 0TSX" 一"-!·-)"-^;·-,)--.!)-.」)·-.'--.)--m.-s'- 」-ν.)ν!)！>ν-).Ιν!'-)Μ !-ν!--.)-)0'*2" ΛΙν-ν!)！)νΛΙν!)！).ι-!-ν! ).-.)-H"is?rl -ν-ν--νΛΙν---Ξιν!---z.l.i'?1 Λ一 ν-ν!)！)ν\-ν!--)-Μ-ν·)-ι'-·-Ιο'·-'- --..--^------,)-3--.) Λ1ν-ν!5ν--ν!'·)-1*-ν!χ- -1IHS- -ιο'έ-ϋ 1363096 以表3引子下aqManMGB探針組合·在其纪近區域中，設計 長度及GC圆形相匁的引子和探奸，得到一組同Ξ寻適用於人類及 當見實驗動物的引子TaqMan.MGB探針，位置如31 10所示，其 中： lns1表示此位點之後有insertion，數字表示所插八的核苦竣數目 表示此位點為人類發生多型性的位點 A表示此位點為人類以及常見實驗動物皆conserved的彳立點 c表示此位點為人類以及mouse, rat皆conserved的位點 6或77表示此位點為實驗動物有多型性的位點，數字表示此位 點多型性的頻率：

其引子對序列詳列如下-引子對A 正向引子序列：5’-CAAGTTACCC 丁AGGGATAACA-3* (n.t 2920-2940) 反向引子序歹L 5，-TAATCGGTTGAACAAACGAACC-3’（n.t 3031-3051) 探針:5 ^ -ACGACCT C GATGTTGCj ATCAGGA-3' (n.t 2981-3003)。 另外挑選不同區塊，設計長度及GC圖形相似的引子和採 針’得到另一組同時適用於人類及較少常見實驗動物的引子 /TaqManMGB探針，位置如圖11所示’其中： =表示此位點之後有insertion，數字表示所插入的核苷酸數目 國表示此位點為人類發生多型性的位點 A表不此位點為人類以及常見實驗動物皆c〇nserved的位點 c表示此位點為人類以及mouse，rat皆c〇nservcd的位點 6或77表示此位點為實驗動物有多型性的位點，數字表示此位 點多型性的頻率： ' 其引子對序列詳列於下：

引子對B 1363096 正向引子序列：5，-AATTTCGTGCCAGCCAOX}C^，〇it 881-900) 反向引子序列：5，-CCCAGTTTGGGTCnAGCTAT_3, 〇it 1054-1074) 探針：5，-CTACGAAAGTGGCTTTAACA-3，(n.t 1020-1039)。 3·對所設計的引子對的專一性測試 引子對A及引子對B藉由NCBI的序列比對來證實，皆確認 ，、僅能辨，粒線體基因序列，並以pCR測試，將所夾出的單一 片段，以定序方式確認其序列，確為粒線體基因之序列。 4·建立收集血清或血漿檢測游離DNA的標準程序並收 成年人的血液，以標準程序抽取DNA 、 。本發觀參雜篇麟DNA的文獻，以及實制試，建立 敢佳化之標準程序如下： 4-1抽取紫頭管(EDTA管）1管約3mL 4-2充分混合避免凝塊 4-3 3000rpm離心5分鐘，取血漿至微量離心管 4-4可於-70 ◦保存或繼續進行以下步驟 4-5取1管微量離心管+2〇mL反應緩衝液(2 5%τ·η_2〇， 50mMTris » lmMEDTA) 4-6加入20此血漿 4-7加入1队蛋白酶κ(操作ρκ濃度為16_此） 4-8於50 C保持40分鐘，於95°C保持5分鐘 4-9加入i59pL TE緩衝液 4-10以l〇〇〇〇g離心5分鐘 4-11取出上清液15〇μΙ； 以此方法所得出的1此上清液相當於〇1此血清DNA。 本發明中之此最佳化_雜序所得的血清·Α盘以 市面所販售萃取DNA套組作比較’有下列幾項優點/、敗 a.重覆性較佳:以同-技術員操作同一個檢體，並作3次 驗’以本實驗的最佳化鮮㈣所得的_ DNA的重覆性 14 (CV=0.7%)比-般市面職售萃取DNA綠(cv=2 ί产因，以通管柱為主的萃取DNA套组，其最終 /辰度又限於下列2項可能因素:a結合膜能力(binding咖灿麗 cap^y)’此會因每根管柱而有些微不同。b.沖提dna時的回收 率未達1〇〇%。她於本發明所建立的萃取游離dna的方法 =素所造成的誤差，所反應之誤差值料微量吸 好0 如前麻，_则執行，在訓練人 ，乂及處理檢體的速度上，可以輕㈣處職速且A量的檢 置0 本巾之萃取游離dna的標準程序，其所需試 ，及耗材成本，相較於一般市面所販售萃取DNA套組約僅 ，大大降低所需費用，若應用於臨床，可達到降 皮Ϊ以亡(f述可得知，本發明中使用的萃取游離DNA標準程 用。：’、簡單、效果佳又便宜的方法，非常適合於臨床應用所使 技術使用之2種方法以及本發明方法檢測游離DNA濃 驗分取⑽㈣11即時定量聚合酶反應、核而八⑼ 白)即時定量聚合酶反應、及本發曰月之粒線體職即時& ίί S33種方法檢測％位正f人其血㈣離DNA濃度， 徂姓^\增幅定量係使用R〇Che^LightCycler儀器，包含在95。〇 正10为鐘，接著在炊變性15秒、在6(rC退火1〇秒及在72。 之長1〇秒，最後冷卻至贼，此設為一循環，共計進行45循環。 轴序所抽取的醜(模板疆)依下述配方配製 最終濃度 試劑

l〇L 15 lx 5χ Quanti Probe PCR Master Mix1) 4 〇.4μΜ 正向引子2) 0.8 〇.4μΜ 反向引子 0.8 〇.2μΜ 探針4) 0.8 無Rnase之水 11.6 模 tDNA 2 1363096 20 )獲自 Roche 之 LightCycler® Fast DNA MasterPLUS HybProbe 2) 正向引子具有下列核苷酸序列： 5 ’ _AATTTCGTGCCAGCCACCGC-3，(n.t 881 -900) 3) 反向引子具有下列核苷酸序列： 5,-CCCAGTTTGGGTCTTAGCTAT-3, (n.t 1054-1074) 4) 探針具有下列核苷酸序列： 5,-CTACGAAAGTGGCTTTAACA-3, (n.t 1020-1039) 並將Picogreen檢測結果示於下表4及圖η，核DNA (β-肌動蛋 白)檢測結果示於下表5及圖12,及粒線體DNA檢測結果示於下 表6及圖13: 16 1363096

表4 : Picogreen法檢測游離DNA濃度結果

No. Γ 測定(ng/ml: 2 測定(ng/ml: 平均數 標準差 變異像數(％) 1 2.25 2.16 2.21 0.06 2.89 2 2.54 2.52 2.53 0.01 0.56 3 2.54 2.28 2.41 0.18 7.63 4 3.53 2.41 2.97 0.79 26.67 5 3.01 2.98 3.00 0.02 0.71 6 5.27 2.68 3.98 1.83 46.07 7 2.23 2.29 2.26 0.04 1.88 8 2.36 2.35 2.36 0.01 0.30 9 3 3.09 3.05 0.06 2.09 10- 3.04 3.45 3.25 0.29 8.93 11 2.54 2.59 2.57 0.04 1.38 12 2.36 2.67 2.52 0.22 8.72 13 2.76 2.43 2.60 0.23 8.99 14 2.57 2.62 2.60 0.04 1.36 15 2.68 2.71 2.70 0.02 0.79 16 2.42 2.3 2.36 0.08 3.60 17 2.63 2.54 2.59 0.06 2.46 18 2.19 2.07 2.13 0.08 3.98 19 2.24 2.23 2.24 0.01 0.32 20 2.74 2.86 2.80 0.08 3.03 21 3.35 3.4 3.38 0.04 1.05 22 2.77 2.92 2.85 0.11 3.73 23 2.64 Γ 2.94 2.79 0.21 7.60 24 2.37 2.35 2.36 0.01 0.60 25 2.42 2.3 2.36 0.08 3.60 26 2.49 2.47 2.48 0.01 0.57 27 2.4 2.65 2.53 0.18 7.00 28 2.65 2.76 2.71 0.08 2.88 29 2.39 2.36 2.38 0.02 0.89 30 2.38 2.56 2.47 0.13 5.15 由以上30位正常人2重覆數據可得，以picog^en法檢測其 游離DNA濃度，其範圍落在2.〇7〜5 27ng/ml，平均濃度乂 2.65ng/ml，平均變異係數為5.51%，但最大變異可達牝〇7〇/〇。 17 1363096 表5:核DNA®-肌動蛋白）即時定量聚合酶反應法檢測游離DNA 濃度結果

No. 第1次測定値 第2次測定値 平· 標準差 變異係數 1 18.6 21.1 19.9 1.7 8.8 2 8.4 11.8 10.1 2.4 23.4 3 26.2 26.5 26.4 0.2 0.9 4 24.0 27.4 25.7 2.4 9.2 5 17.9 18.2 18.0 0.2 0.9 6 39.5 39.0 39.3 0.4 0.9 7 70.3 71.3 70.8 0.7 0.9 8 15.6 19.5 17.6 2.8 157 9 25.3 34.9 30.1 6.8 22.5 10 9.9 10.3 10.1 0.3 2.8 11 62.1 76.6 69.3 10.2 14.8 12 28.3 39.8 34.1 8.1 23.8 13 34.9 34.5 34.7 0.3 0.9 14 42.5 39.8 41.1 1.9 4.6 15 ND ND ND ND ND 16 4.9 5.2 5.0 0.2 4.6 17 30.6 30.8 30.7 0.1 0.5 18 9.6 10.0 9.8 0.3 3.2 19 ND 2.0 2.0 ND ND 20 34.0 37.0 35.5 2.1 6.0 21 13.9 19.6 16.8 4.1 .24.3 22 13.5 17.0 15.3 2.5 16.1 23 17.8 20.3 19.0 1.8 9.2 24 57.4 58.9 58.2 1.1 1.9 25 36.8 37.3 37.0 0.3 0.9 26 18.3 21.4 19.8 2.2 11.1 27 20.3 19.0 19.6 0.9 4.6 28 23.9 25.3 24.6 1.0 4.2 29 6.2 6.4 6.3 0.1 1.4 30 20.4 21.8 21.1 1.0 4.6

由以上30位正常人2重覆數據可得，以即時定量聚合酶反應 法檢測其游離核DNA拷貝數，其範圍落在ND〜70.8，平均值為 26.5，平均變異係數為8.0%，最大變異可達24.3%，但有的檢體 會有測不到的問題(如No.15)。 18 1363096 表6 :本發明之粒線體DNA即時定量 DNA濃度結果

No. 第1次測定個 第攻測定催 平觸 標準差 變iS] 1 299.2 265.2 282.2 241 8.5 2 19399.7 18509.9 18954.8 629.2 3.3 3 5800.6 9787.7 7794.1 2819.3 36.2 4 9401.6 11117.9 10259.8 1213.6 11.8 b 7434.5 9657.2 8545.9 1571.7 18.4 6 21889.1 21889.1 21889.1 0.0 0.0 I 10679.4 12130.9 11405.1 1026.3 9.0 8 12049.8 9853.5 10951.6 1553.0 14.2 9 15443.9 15136.2 15290.0 217.5 1.4 10 13059.7 12972.4 13016.1 61.7 0.5 丄1 4807.4 3801.5 4304.5 711.3 16.5 12 16738.3 130597 14899.0 2601.1 17.5 13 5106.5 4617.8 4862.2 345.6 7.1 丄4 「11652,4 1 12212.5 11932.4 396.1 3.3 15 4232.2 5609.3 4920.7 973.8 19.8 16 2508.2 2986.0 2747.1 337.9 ^ 12.3 U 3026.4 3006.1 3016.2 14.3 0.5 18 8332.4 7897.1 8114.7 307.8 3.8 19 4232.2 3150.6 3691.4 764.8 20.7 20 2268.1 2361.3 2314.7 65.9 2.8 21 3258.1 4495.5 3876.8 875.0 22T 22 12212.5 14637.0 13424.8 1714.4 12.8 26 11652.4 11343.9 11498.1 218.1 1.9 Μ 5647.0 3801.5 4724.3 1305.0 27.6 2b 20332.2 19530.3 19931.2 567.1 2.8 2b 9152.7 16626.4 12889.6 5284.7 41.0 λ) 11420.2 16850.9 14135.6 3840.1 27.2 2ϋ 4586.9 4775.3 4681.1 133.2 2.8 29 13596.0 12212.5 12904.2 978.3 7.6 iU 29011.4 28054.6 28533.0 676.6 2.4

聚合酶反應法檢測游離 由^上30位正常人2次重·據可得，以本發明之 聚合酶反應法檢測其游離粒線體DNA拷貝數，复内里 282.2〜28533.0，平均值為收削，平均變異係數為' =、、f 大變異可達41%，所有檢體均可量測。 ，琅 19 1'.^ 1'.^ Θ年U月q y修(正替換頁

範圍/單位 2.07-5.27 ng/ml 由以上結愚 方法

Picogreen 法 nDNA/β-肌 動蛋白法 本發明之粒 線體DNA 法 ND-70.8 _拷貝數 282.2〜28533.0 拷貝數

26.5 第098102746號專利申.請案 說明書替換頁(100年12月)— 10193 平均變異 最大變異 __係數(％) (%) 5.51 46.07 8.0 24.3 11.9 41 _ 濃度之測量絲i目前^味龍祖測量舰 較，並以小規模的S3 離DNA所常用之方法比 萃取其_ DISiA，# $成年人受試者的血液並

Pic_enr罄朵St /、個體間所呈現的變異度的確比 ;νΓ这即時聚合酶連鎖反應偵測細胞核 以發規$ Α ’幼働^_細雜DNA的結果可 粒線體細胞核眶，但_游離 、&am纟#γ»χγδ 發生，邱&以上所述，可以確認以偵測 对其錄度㈣可哺帛。 個』:全長16569個驗基對的第 4觀^麵働基對的第 麵圖人類㈣體基目，纟長16569麵基對的第 8000〜13000個位點其多型性分布情形。 弟 noofiHJ:人類粒線體基因’全長16569個驗基對的第 13000〜16569個位點其多型性分布情形。 圖5A至圖5B顯示表1中seql區域與表2所列 及人類粒線體多型性位點資料進行MSa ^結果。 20 1363096 第098丨02746號專利申請案 說明書替換頁(100年12月/ 圖6顯示气 1 + seq2區域i賴之實驗動物及人類粒 線體夕型性位點資料進行MSA之結果。 始骑^中_區域與表2所列之實驗動物及人類粒 線體多型性位點貢料進行MSA之結果。 _======所狀實驗動物 體糊之錄祕及人類粒線 探針圖K)顯示適用於人類及常見實驗動物的引子/τ_·β 圖11顯示適用於人類及較少當 /TaqManMGB探針。 貝驗動物的引子 3示度結果柱狀圖。 離DL農iii =蛋白)即時定量聚合酶反應檢測游 離㈣量—測游 【主要元件符號說明】 21 1363096 ’ _ - ’ 和年J月（1日修(武)正冬 專利申請案第098102746號 補充序列表 - (98年3月12曰補送)

SEQUENCE LISTING <110>定勢生醫科技股份有限公司 <120>用以測量游離DNA濃度之引子對及其測量方法 <160>6 /* % <210> 1

<211>21

<212>DNA <213>人工序列 <220> <223>正向引子 <400〉1 caagttaccctagggataaca

<210>2 <211>22

<212>DNA <213>人工序列 <220> <223>反向引子 <400> 2 iaatcggttgaacaaacgaacc 1 11363096 <210>3 <211>23

<212>DNA <213>人工序列 <220> <223>探針 <400> 3

acgacctcgatgttggatcagga

<210 4 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220

<223>正向引子 <400> 4

aatttcgtgccagccaccgc <210> 5 <211>21 <212〉DNA <213>人工序列 <220> <223>反向引子 2 1363096 4 <400> 5 cccagtttgggtcttagctat <210>6 <211>20

<212>DNA <213>人工序列 <220>

<223>探針 <400> 6 ctacgaaagtggctttaaca

Claims (1)

1. 第098102746號專利声·缘案一"一T" 申請專利範圍替換頁(1〇〇年 七、申請專利範圍： （__^ 1. 一種可㈣定量雜DNA之引子對及騎組合，其具^ 核苷酸序列： 贺告本 正向引子序列：5’-CAAGTTACCCTAGGGATAACA-3，（序列編 號1) 反向引子序列：5，-TAATCGGTTGAACAAACGAACC-3,（序列 編號2) 探針:5’-ACGACCTCGATGTTGGATCAGGA-3,(序列編號 3)。 2. ^申請專利範圍第1項之用於測定游離DNA濃度之引子對及 探針組合，其中該DNA係存在於選自由血液、血清、血漿、 體液、組織所組成組群之一或多種中之DNA。 3. ^申請專利範圍第2項之用於測定游離DNA濃度之引子對及 探針組合，其中該DNA係小鼠、大鼠、天竺鼠、中國倉鼠、 兔子、豬、牛、狗、短尾猴、黑猩猩及人類之至少一種DNA。 4· 一種測量游離DNA濃度之方法，包括以粒線體DNA的保守 區域作為偵測目標，在如申請專利範圍第1項之可用於定量游 離DNA之引子對及探針組合的存在下，對檢體中之DNA進 行即時定量聚合酶反應，藉此檢測檢體中之游離DNA。 5.如申請專利範圍第4項之測量游離DNA濃度之方法，其中該 檢體係選自由血液、血清、血漿、體液、組織所組成組群之一 或多種。 6.如申請專利範圍第5項之測量游離DNA濃度之方法，其中該 檢體係選自小鼠、大鼠、天竺鼠、中國倉鼠、兔子、豬、牛、 狗、短尾猴、黑猩猩及人類之至少一種檢體。