TWI358301B - Hcv vaccines - Google Patents
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Description
1358301 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種c型肝炎疫苗。 【先前技術】 免疫系統係一複雜網絡，其涉及具相互關連之細胞類型 及分子’其演化用以保護多細胞生物免於遭受微生物之感染。 免疫系統可分為演化上較原始之先天性〔或天然的〕免疫，以 及適應性〔或後天性〕免疫。該先天性免疫系統辨識之开^式對 致病原而言通常是屬於共通且基本的。由於分子結構之數量有 限，因此由胚源細胞〔germ-line〕轉譯之受器已經演化。相較 之下，適應性免疫之細胞，亦即B及T淋巴細胞，其則可辨 識極大量之抗原結構。根據表達抗原之細胞類型，受器區分為 B細胞受器〔BCR，其水溶形態稱為抗體〕及τ二胞^器 〔TCR ’僅存在細胞表面形式〕，其係由體細胞重組而成，^ 具有無性繁殖之分佈力。因此，最初該類細胞僅為具有某種專 一性之少量細胞。依照遇到的抗原而定，該類細胞g開始分裂 〔無性繁殖擴張〕，以產生一有效數量對抗抗原。在除去抗^ 後，具抗原專一性之細胞的特定子群將存留做為免疫記憶。儘 管該適應性免疫系統反應較慢〔相較於先天性免疫〕，缺而其 卻具有專一性，且能在重複曝露於預定致病原/抗 ；& 的進行改良。 T細胞扮演適應性免疫之中心角色。τ細胞之受器 〔TCRs〕巧識主要組織相容複合體〔maj〇r 腿以 complex，簡稱]vine或HLA〕，亦即位於細胞表面之胜狀複 合體。該類胜肽亦稱為τ細胞抗原決定部位〔epit〇pe〕，其代 表抗原之分解產物。τ細胞有二種主要類型：CD8+細胞毒性τ 細胞〔CTL〕，其專一於第工型纖〇分子；及CD4+辅助性τ 細胞〔HTL〕’其專-於第„型分子。ΗΊχ細胞係· ——6—— 性免疫之許多賴表賴不可或缺者，例如：“專業抗原呈現 細胞〔APCs〕”的活化、免疫球蛋白〔Ig〕類型之轉換、增生 ^心之反應及免疫球蛋白之親和力成熟現象、免疫反應之調 .及MHC分子收集細胞内胜肽，並將胜肽呈現於細胞表面， 供T細胞之TCRs辨識等。mhc分子有二種主要類型：第工 型可由CD8+之CTL細胞所辨識，及第π型可由€1)4+之htl 細胞所辨識。 第I型MHC分子係由一細胞膜鑲嵌^鏈〔長度45kDA〕 及一非共價性微球蛋白〔b2m，長度12kDA〕所組成。以 X光晶體學〔Stem and Wiley, 1994〕之3D結構解析顯示α鏈 具有一裂縫〔cleft〕，其二端呈封閉，且能容納8至u個胺 基酸長度的胜肽。第I型MHC分子普遍的呈現分佈，其呈現 之胜肽多源自於細胞質之蛋白。該類胜肽係由蛋白酶體 〔proteasome〕進行分解’而產生的胜肽片段則主動傳送至内 質網〔ER〕。在内質網中，藉助於某些伴隨蛋白 〔chaperone〕，其形成MHC及胜肽片段之複合體，並傳送至 細胞表面〔Heemels, 1995〕。因此，第j型mhc分子可將一 細胞的蛋白組〔Proteome〕反映在其細胞表面，並使τ細胞能 辨識細胞内之致病原或惡性細胞。 第II型MHC分子係由二個細胞膜鑲嵌蛋白質〔^及冷 鏈，長度分別為35Kda及30kDA〕所組成ό該二蛋白質共同 形成一裂縫，其二端開放，並能容納各種長度之胜肽，其長度 通常介於12至25個胺基酸。儘管第I及η型mhc分子存在 差異’但二者仍存在極高的結構相似性〔Stem⑽Wiley， 1994〕。第II型MHC分子僅表現於專業抗原呈現細胞，其包 含樹突細胞〔DC〕、B細胞及巨噬細胞/單核細胞。該類細胞 專門用以佔據及修改在核内體路徑上之抗原。在上述生物合成 後’第II型MHC分子立刻藉由所謂的恆定鏈〔invariant chain，Ii〕形成複合，以避免胜肽鍵結於内質網。當含有第π 型mhc及π之複合體的囊泡溶入含有外來抗原分解產物之核 =體時，Ιι將持續分解，一直到MHC分子結合之裂縫僅與所 明的CLIP胜形成複合為止。CLIP胜肽係藉助於hlA_dm等 伴隨蛋白’而與抗原胜肽進行互換〔ViUadang〇s，2〇〇〇〕。最 後，MHC及胜肽之複合體將再次呈現於之表面，並以 各種方式與HTL相互作用。 由於具有多基因性及多形性，該MHC系統係極為複雜。 對人類之MHC-Ι型分子之^鏈而言，其具有三個基因位，分 別為HLA-A、HLA-B及HLA-C。同樣的，第π型mhc分子 亦存在三個α鏈基因位〔DRA、DQA、DPA〕；第π型mhc 分子之召鏈基因位則更為複雜，其具有四個不同之DR万鏈 〔DiU、DR2、DR3、DR5〕及 DQB 與 DPB。除了 DRo：鏈 DRA的多形性之外，各基因位更在種群中表現出各種不同之 對偶基因〔數十個至數百個〕〔Klein, 1986〕。不同之對偶基 因具有極大區別的胜肽結合專一性。舉例而言，對偶基因係可 稱為：HLA-A*0201 、 HLA-DRB 1*〇4〇1 或 HLA-DPA*0101/DPB*04(U。 / T細胞之抗原決定部位係可藉由多種方法辨識〔Van den Eynde，1997〕。例如，在COS細胞轉移感染適當之hla分子 之下，T細胞株及無性繁殖系可用以篩選cDNA表現資料庫。 另外，亦可使用生化方法，其涉及由標的細胞表面之mhc分 子分離出天然之配合基〔ligand〕、藉由數道色層分析步驟將 該類胜肽分離出、在抗原決定部位重建分析法中分析其與淋巴 細胞的反應活性，並藉由質譜儀加以定序〔Waifd等，1994〕。 最近，高敏感度之細胞激素檢測方法，例如干擾素酶 免疫斑點試驗〔ELIspot〕，其使用活體外之淋巴細胞，以筛 選重疊之合成胜肽〔Maecker，2001 ; Kem，2000 ; ifobery 2001〕。首先，Kem等人〔1999&2000〕使用陣列資料庫，其’ —8 — 1358301 具9個胺基酸長度i9mer〕之胜肽^製試管内 f _ T細胞抗原決定部位的序列。最後，Tobeiy等人 基酸县声rtf上、述方法’並證實含有64組胜肤（各具20個胺 )〕之陣列f料庫可用於篩選老氣之⑽+型及 .汰名、細胞抗原決定部位。上述二種方法皆基於藉由細胞 2曰nm Γ 〔Kem et吡2000〕或酶免疫斑點試驗〔Tobery等 測量干擾素產物，供監測抗原專-反應。當所 冷n蛋白質皆做為抗原時，藉由使用具15個胺基酸長度 =混合物時’㈣+型τ _反縣幾乎相陳檢測值， 預料般的，CD8+型Τ細胞反應係顯著的高於平常利用 艰/合性蛋白質刺激所測得的極微弱反應。再者，CD8+型Τ細 日15個胺基酸長度〔lw〕的胜肽混合物的反應係相 二：8至12個胺基酸長度〔8_12mer〕的胜肽混合物的反 應丄該類胜肽係篩選’以供代表第！型刪^分子之最小抗原 決，定部位。細胞膜上最可能的胜肽酵素係用以在其環境下“切 割”胜肽至最佳長度〔Maecker等，2001〕。 另一有效的替代方法係利用特定淋巴細胞篩選人工合成 之重組胜肽庫。例如，由2〇〇個混合物組成之十胜 〔decapeptide〕胜肽資料係排列在一陣列掃描板，其成功的用 以辨識胜肽配合基’該胜肽配合基係可刺激τ細胞之無性繁殖 系群〔Wilson 等，J. Immunol” 1999,163:6424-6434〕。 許多T細胞抗原決定部位係藉由所謂的“逆免疫法” 〔Rammensee，1999〕加以辨識。在上述方法中，蛋白質有燴力 做為T細胞抗原決定部位，其主要序列係掃描其結合主 體結構〔motif〕。該方法通常合成數十至數百個可能的胜肽 或一整套之重疊胜肽’並分別測試其與HLA的結合力。通常， 選擇最佳結合力之胜肽，以進一步進行確認其與τ細胞之反應 活性特性。如此，藉助於HLA轉殖基因鼠，使τ細胞在試管 内或活體内接觸抗原。 1358301 c型肝炎病毒〔HCV〕屬於一種黃病毒 〔Flaviviridiae〕’其慢性感染世界上大約一億七千萬的人口。 據記載至少存在6種HCV的基因型及超過50種的亞型。在美 國、歐洲及曰本，最常見到第1、2及3型的基因型。HCV基 因型的地理分佈在美國及部份西歐地區主要流行種類為第lb 型基因型’然而不同的是’南歐及中歐的主要流行種類則為第 lb型基因型。 ^ HCV係經由親代或經皮方式傳染，並在肝細胞中進行複 製。大約15%的病人經歷急性自限肝炎，並可以清除病毒及復 原。大約80%的感染病人則變為慢性帶原者。感染通常進展緩 慢而無症狀的持續數年，然而最後HCV將成為肝硬化、^期
肝病及肝癌的主因〔Liang，2000〕《HTL及CTL兩者的反肩 強度及〇口質皆可決疋疋否病患已經復原〔自發性復原或因 療而復原的結果〕或發展成慢性感染〔Liang, 2000〕。
HCV之標準治療包含組合使用聚乙烯二醇化干擾素 及抗病毒藥三唑核苷〔ribavirin〕。病毒學反應係依照其基g 型而變，其可元成大約50%的病患治療。但是，該治療的低巧 耐受性及頗多的副作用顯然需要新的治療干預方法，例如治痛 疫苗〔Comberg，2002〕。然而，目前仍無法詳細瞭解到底飼 種抗原決定部位與MHC組合後可產生成功的免疫反肩 〔yard，2002〕。因此，需要進行T細胞對整個HCV的反^ 之複雜分析，以發展治療用的抗原決定部位型疫苗。 HCV病毒粒子包含9.5kb的正型單股g基因组，苴可 轉錄成大約3000個胺基酸長度之極大單一聚蛋白。該取^白 進一步藉由宿主及HCV轉錄的蛋白質水解活性修飾 個蛋白質〔Liang, 2000〕。最重要的是，該Hcv的抓 RNA聚合酶常具發生賴的傾向，其造成病毒 〔quas邵ecies〕演化，及形成抗免疫之變種〔Farci 2_〕。 —10 — 1358301 雖然該領域在最近十五年内做了很多建議方案，且同時 期提出很多有可行能的候選抗原，然而在市場上仍缺乏HCV 疫田〔亦無令人滿意的治療方法；唯一可獲得的治療方法就是 上述干擾素-α及三唑核苷的組合用藥，但其僅對少數病人有 效〕。在早期公開HCV序列之後，大量的抗原決定部位及抗 原係建議可用以做為對抗HCV疾病的有效方法〔例如:K〇ziel 等，J. Virol. 67(12)，7522-7532 ; Shirai 等,J. Virol. 68(5)(1994), 3334-3342，Leroux-Roels 等，Hepatology 23(1)(1996), 8-16 ;
Hoffmann 等，Hepatology 21(3)(1995), 632-638 ; Sarobe 等 J
Clin. Invest· 1〇2(6)(1998)，1239-1248 ; Battegay 等，】.他〇1’· 69(4)(1995), 2462-2470 ； Wentworth f, Int. Imunol. 8(5)(1996),籲 651-659 ; Rehermann 等，J. Virol. 70(10)(1996), 7092-7102 ;，
Diepolder f, J. Vir〇l. 71(8)(1997), 6011-6019 ； Lamonaca #, Hepatology 30(4)(1999), 1088-1098 ; PCT 專利第 WOOO/11186 號、第 W095/12766 號、第 W095/27733 號、第 WO94/20127 號、第 W095/25122 號、第 W095/22317 號、第 WO94/25601 號、第WO92/03458號及第W093/00365號〕。再者，亦已對 黑猩猩進行重要的體外原理求證〔pr〇〇f_〇f_principle〕之免疫 中和研究，除了現代人種以外的其他物種皆有可能感染慢性之 HCV。的確’關於在人體及黑猩猩體内所引發的急性或慢性感 · 染的免疫反應研究’到目前為止僅在建立活病毒感染之後得到 潛在保護免疫反應的描述。然而，非口服性免疫後的預防性免 疫保護係在曝露於HCV之前廣泛的在肝外形成交互反應。僅 有有限的疫苗效力研究在黑猩猩上進行，該類研究顯示在利用 可引起免疫及刺激的極相同之複製試劑進行低劑量的同源刺 激之後，其最多可保護七分之五的動物免於感染。再者，HCV 具有同度變異性’其造成HCV有能力不受疫苗或感染引發的 免疫反應作用。在考量上述問題之下，建議組合使用大量不同 的蛋白貝片I又做為一 DNA疫苗，以做為替代性的疫苗策略 —11 — 1358301 〔Rollier 等，J_ Virol. 78(1)(2004), 187-196 ; Dunas-Carrera 等，
Biotech. Appl. Biochem. Imm. Publ. (29.September 2003; ， BA20030112)〕。 ’ 儘管在最近十五年内，特別是最近十年内，已完成了所 有進展，但仍有發展新的HCV治療方法及疫苗策略的迫切需 求〔Heile 等，J. Virol. 74(15)(2000), 6885-6892〕。 而 【發明内容】 本發明之主要目的係提供一種C型肝炎〔HCV〕疫苗， 其提供C型肝炎病毒的有效治療方法及疫苗策略。 根據本發明之C型肝炎〔HCV〕疫苗，其包含至少二抗 _ 原決定部位，各抗原決定部位源自於不同之一熱區抗原決定部 位，其中一熱區抗原決定部位係指一抗原決定部位含有選自下 列族群之胜肽片段： KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK > GYKVLVLNPSVAAT、 AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、 DLMGYIP(A/L)VGAPL > GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA ' ® VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(FA")TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL ' AAWYELTPAETTVRLR、 GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK ' FTDNSSPPAVPQTFQV、 LEDRDRSELSPLLLSTTEW、 YLVAYQATVCARAQAPPPSWD ' MSTNPKPQRKTKRNTNR ' LINTNGSWHINRTALNCNDSL ' —12 — 1358301 TTILGIGTVLDQAET、 FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、 ARLIVFPDLGVRVCEKMALY > AFCSAMYYGDLCGSV、 GVLFGLAYFSMVGNW、 WCCSMSYTWTGALITPC、 TRVPYFVRAQGLIRA 及 TTLLFNILGGWVAAQ 〇 在20〇3年8月27曰申請的PCT專利第W004/024182號 的申請案中〔主張2002年9月13日的奥地利第A1367/2002 號專利權〕，其揭示一種分離HCV胜肽以用於疫苗接種的新 方法，特別是指HCV的T細胞抗原決定部位。在該申請案中 第一次使用HCV熱區抗原決定部位”的概念：一個hcv抗原 決定部位的“熱區〔hotspot〕，，係指一短胜肽片段至少包含二 個以上的T細胞抗原決定部位。例如，二個以上的抗原決定部 位可相互緊鄰〔緊鄰係指少於5至1〇個胺基酸長度〕、直接 鄰接、局部連接，甚至整個重疊。熱區可僅包含第工或π型 MHC分子的抗原決定雜或^者的抗凝料她合。執區 的抗原決定部位可具有不同的HLA限制條件。 … 般呈^ ϋ之抗魏理#、如紐技術所述 雜度夕選擇性的路徑，因此無法輕易在一多肽的 管，丨τ/頁^找細胞抗原決定部位。儘管廣泛使用電腦演 ^及偽=部位测的f職算仍具有高比例之偽陰 囚此 一多肽的射3的T細私原決定雜未觀的出現於 問題。本發丄合數ΙΓ同物立亦可能發生此種 定部位，JL方法包=以_Τ細胞抗原決 ，、匕5取純原決定部位、HLA轉殖基因動物 —13 — 1358301 以重疊含有用的抗原之胜==有方法皆係有系統的用 辨識。在該種複雜的分析雜的抗原決定部位 決定部位之熱區變得原決定部位，以使抗原 區的特性。因此，相顯示熱 重=== 位之抗原決定部位時〕可*各種τ ▲ R 限制
細胞係各源自不同的非HLA相符之個^ 作用’該T 純由抗原決定部位製成之疫苗’到目前為止係著重於選擇 優，對偶基因，例如HLA-A2，其大約出現^近丰3 m 士種身ΐ。由於其他的對偶基因出現頻率低，因此適 =王世界人口之抗原決定部位型疫苗必需包含許 穩②如胜肽〕數量受限於製造、 當熱區藉由有限的胜肽數量提供大量的潛在抗原決定部 位時，熱區㈣使得可義於全世界人σ之抗原決定部位 型疫苗有機會成真。的確，先前技;^〔如上述已提及之抗原決鲁 定部位相關參考文獻，事實上仍未發展出—HCV疫苗〕目前 清楚顯示發展HCV疫苗已被視為是具有不確定性，且儘管最 近十年揭示了在數種感染模式下引發體液性及細胞性免疫反 應的HCV抗原效力相關豐富參考文獻，但是發展HCV疫苗 及治療方法通常仍告失敗。HCV感染的治療及預防必需在複 雜性及嚴重的不可預測性之下進行。 本發明的概念在於首次基於HCV的熱區抗原決定部位特 徵提供HCV疫苗，故一 HCV疫苗接種系統可做為HCV感染 病患的適當、專一的預防疫苗接種以及有效治療療法，特別是 —14 — 1358301 對慢性感染病患而言。 本發明顯示HCV疫苗只使用一種或二種專一性抗原決定 部位疋不足以在疫苗接種時產生令人滿意的結果。再者，提供 HCV蛋白質混合物〔例如以蛋白質的核心、幻及E2做為一 DNA疫苗；Duenas-Carrera等（2003)〕或HCV蛋白質大片段 混合物〔例如以蛋白質的核心、E1、E2及NS3做為L dna 在-田’ Rollier專，（2004)〕的概念並不會產生預期的結果。 本發明之HCV疫苗包含短胜肽，其含有上述具有熱區的 抗原決定部位。本發明之疫苗不具有DNA疫苗的相關風險及 =確定性〔缺少長期持續的免疫反應、大量的肝外反應、反應 鲁 模式或局部化等〕。再者，本發明在製造完整蛋白質或長鏈g 白質片段上亦不會面臨嚴重的製造問題。 本發明揭示之熱區抗原決定部位已經由功能性分析加以 辨識，其主要係在讀出資料時使用Thl/Tcl型反應〔亦即干擾 素-7〕。已知〔整個或至少一大段之〕抗原不僅包含作用部 〔agonist〕之抗原決定部位，而且亦可轉錄拮抗部 〔antagonist〕的配合基。拮抗部潛在於整個抗原内，但未出現 在熱區中，該拮抗部可能阻礙產生免疫能力及疫苗的效力。再 者’完整之抗原幾乎必然引發一體液性免疫反應。該類抗體反籲 應本身/、對細胞内的HCV具有微弱的效用，但卻可能嚴重的 引起預期的T細胞反應。由本發明之熱區所衍生之抗原決定部 位口為具備有限長度，因此僅具有極低機率會引發不必要的抗 體反應。最後’僅有姉少量的HCV抗原可師的存留於不 同的基因型之間。因此，使用在疫苗中之整個病毒可能引發對 非同源性之區域或抗原決定部位的反應，其對於大多數病患而 言皆為不適當。相反的’本發明揭示之熱區係衍生自主^的 HCV基因型第1、2及3型之間同源〔c〇nserved〕程度大 80%的區祕。 —15 — 1358301 fA超型〔揭示於pCT專利帛w〇〇1/2聊號〕顯示在 ，二/、例中HLA-I型的τ細胞抗原決定部位並未完全限制於 卜HLA對偶基因，但另—腦對偶基因亦可藉由τ細胞 加以辨識〔例如，一胜肽可結合HLA-B*0702及 ^LA=*3J01〕。鋪天細紐找勒具有較大的同源 性，因此有利於做為候選疫苗。 上相較之下，由於本發明之熱區係一胜肽區域，其可在蛋 内顯示異常大量的不同鄰接及重4性抗原決定部位，因此 =明之T細胞熱區抗原蚊部位顯著的不同於上述的瓜a 熱1i可在—較短區域中完成大量的抗原決定部位，同 時該抗原決定部位必然在熱區内進行適當修飾。 的確本發明之熱區I貞示了在不同的種|貞之間且有 ，較低的變異，其使得該熱區更適合 =^^使时數乡祕财纽異雜的可能。無Z α本毛明之抗原決定部位不超過100個胺基酸長度 而言，短。本發明之抗原決定部位的長度較佳係至少^ 7般 ⑽、11或12個胺基酸長度，最大長度係13、15、20、 25、30、40或50個胺基酸長度。
本發明用於疫苗之抗原決定部位可能選自上述 ^。虽然，疫苗中可提供整個酿區域或其 I 如2、3、4、5或6個〕的抗原決定部位，且 其含有一_上抗原喊部位的—區域時，其ς形^ ii、明使狀抗縣定部位可為相變異，錢在如上所 =熱區之“主序列”内具有缺位〔ddeti〇n〕 二 1、2、3、4、5、6或7個胺基酴Ί。姑袖β广 ’、缺少 佳不致改變該抗原決定部位；當缺 ^；=歹&内的缺位較 其亦需保留至少-抗原決定部^儘官S亥熱區内具有缺位， —16 # Α ί☆田内較么係&供抗原決定部位的混合物，其中一胜 肽族群^具有單-抗原決定部位，而另—胜肽族群則具有一個 以上之t原決定部位。例如，一疫苗較佳包含至少一個或至少 個具單抗原決定部位之胜肽及至少一個或至少二個具一 個以上抗原決定部位之胜肽〔例如整個熱區序列〕。 該抗原決定部位係以未經修飾或經修飾之多肽進行使 =，經修狀多肽可適當經由某些化學或生物修飾，特別是基 二可洛性或配製因素〔如PCT專利第wool/78767號所 2。本發明之HCV疫苗所使用之抗原決定部位係包含整個 二Γf的鄰近片段〔包含熱區中之至少—抗原決定部 1 L或者包含熱區之非鄰近片段〔然*，亦包含熱區中之至 Π決定部位；此時’一個以上之連接子(例如胺基酸或 肽之連接子linker)可設於該熱區之各非鄰近片段之間〕。 h 一根據本發明之較佳實施例，本發明之HCV疫苗係包含至 ^種’ _是至少四種之抗縣定雜，各 源自不同之熱區抗原決定部位。 Ρ 疫苗最雜岭至少五種抗原找雜，各抗原 邱ΐ麵自不同讀區抗原決定雜。軸抗原決定 疫斜原決定部㈣數量衫常造成配製問題愈 Ϊ是4、5或6個抗原決定部位係在保護能力的最廣 衣缺點〔特別是關於工業規模的製造〕之間所能取 仵的联佳平衡點。 二因此，本發明之較佳實施例的HCV疫苗亦可包含至少六 原決定部位’各抗原決定部位同樣係源自不同之敎區抗原 決疋邛位。該熱區抗原決定部位之最佳數量亦取決於 始 相互作用^經證實係—疫苗中的某些短鏈多肽 組合物的主要問題所在。 本發明之HCV疫肖哺徵在於該抗原妓雜係選自下 ~~~ 17 — 1358301 列族群：KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL ' YLLPRRGPRL ' LPRRGPRL、GPRLGVRAT、RLGVRATRK ; GYKVLVLNPSVAAT、AYAAQGYKVL、 AYAAQGYKVLVLNPSVAAT ； DLMGYIPAV' GYIPLVGAPL > DLMGYIPLVGAPL ; CINGVCWTV、 GEVQWSTATQSFLAT、 GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV ； HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA ' MWNFISGIQYLAGLSTLPGN ' NFISGIQYLAGLSTLPGNPA ' QYLAGLSTL ' HMWNFISGI ； VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL ' DYPYRLWHYPCTVNPTIFKI ' DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV ' VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL ' DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI' DYPYRLWHY > TVNYTIFKI' TINYTIFK ' TVNFTIFKV ' HYPCTVNYTI > HYPCTVNFTI > RMYVGGYEHR ； AAWYELTPAETTVRLR > TPAETTVRL ； GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、TAYSQQTRGLLGCIV、 TAYSQQTRGLLG、GQGWRLLAPITAYSQ、RLLAPITAY、 GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV > GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLG、AYSQQTRGLL、 AYSQQTRGL ; IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、 ILAGYGAGV、VAGALVAFK、GYGAGVAGAL ; VVCCSMSYTWTGALITPC、SMSYTWTGALITP、 SMSYTWTGAL、SYTWTGALI ; FTDNSSPPAVPQTFQV ; LEDRDRSELSPLLLSTTEW、LEDRDRSELSPLLLST、 RSELSPLLL、ELSPLLLST、DRDRSELSPL、LEDRDRSEL、 LEDRDRSEL ； YLVAYQATVCARAQAPPPSWD ' —18 — YLVAYQATV ； MSTNPKPQRKTKRNTNR ' PQRKTKRNTNR ' QRKTKRNTN ' RKTKRNTNR ' MSTNPKPQR ' MSTNPKPQK ； LINTNGSWHINRTALNCNDSL、NGSWHINRTALNCNDSL、 LINTNGSWHI > RTALNCNDSL ' LINTNGSWHINRTALN > SWHINRTALN ; TTILGIGTVLDQAET、TTILGIGTV、 TILGIGTVL ； FDSSVLCECYDAGAAWYE > FDSSVLCECYDAGCA、VLCECYDAGA、 VVLCECYDAGAAWYE ； ARLIVFPDLGVRVCEKMALY ' ARLIVFPDL、RLIVFPDLGV、RVCEKMALY、 AFCSAMYVGDLCGSV ； GVLFGLAYFSMVGNW ； TRVPYFVRAQGLIRA ; TTLLFNILGGWVAAQ 及 LLFNILGGWV。 一般而言’僅具單一抗原決定部位的族群係選擇用以達 成較佳結果。當然，並非所有上述的熱區抗原決定部位都具有 相等之效力’其效力可能在不同族群之間發生變化。一個別疫 苗接種策略較佳主要基於HLA同源性而使用各族群。因此， 本發明之一較佳HCV疫苗的特徵係在於包含至少一抗原決定 部位，該抗原決定部位係選自至少二種，較佳係至少三種，更 佳係至少四種之下列熱區抗原決定部位： KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK > AYAAQGYKVLVLNPSVAAT > DLMGYIP(A/L)VGAPL、 GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV 及 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA ° 再者，本發明之HCV疫苗亦可包含至少一抗原決定部 位’該抗原決定部位係選自至少二種，較佳係至少三種，更佳 係至少四種之下列熱區抗原決定部位： VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL、 AAWYELTPAETTVRLR ' GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV、 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK、 FTDNSSPPAVPQTFQV > LEDRDRSELSPLLLSTTEW、 YLVAYQATVCARAQAPPPSWD ' MSTNPKPQRKTKRNTNR 及 LINTNGSWHINRTALNCNDSL ° 另外’本發明之HCV疫苗亦可包含至少一抗原決定部 位’該抗原決定部位係選自至少二種，較佳係至少三種，更佳 係至少四種之下列熱區抗原決定部位： TTILGIGTVLDQAET、 FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE、 ARLIVFPDLGVRVCEKMALY ' AFCSAMYVGDLCGSV、 GVLFGLAYFSMVGNW > TRVPYFVRAQGLIRA 及 TTLLFNILGGWVAAQ。 根據本發明 上述精雉之沉原及抗原決定部位的另一種 方式係在疫苗内使用抗原/抗原決定部位的變異。較佳之變異 係根據同源〔包含一個以上置換係出現在同源的HCV品^ 中〕或異源之抗原決定部位加以設計。在較佳的變里之中有^ 伤變異係藉由同源胺基酸置換方式改變序列。該置換係利 之另—胺基酸置換—多肽中之—預續基酸。、一般的同 源置換係指：在脂肪族胺基酸Aia、Val、Leu及ne之中進」 =換；親水性胺基酸Ser及Thr的互換；酸性胺基酸A I Glu的互換；醯胺類胺基酸Asn及Gh的置換；鹼性胺美 1358301
Lys及Arg的互換；及芳香族類胺基酸phe及Tyr的互換。 在此方面’變異較佳係在任一多肽之胺基酸序列具有1、 2、3、4或5個胺基酸形成置換、缺位或插入之任意組合。其 中較k係隱性之置換、插入及缺位，如此不會改變本發明之多 肽的特性及活性。在此方面，更佳係屬同源性置換。特別適合 的胺基酸置換係包含上述同源序列。因此，本發明揭示之抗原 或抗原決定部位的合適序列變異係包含一個以上之變異，該變 異係出現在一個以上之HCV品系或微生物型〔較佳係有i、 2、3、4或5個胺基酸互換係屬該種同源變異〕。該類抗原包 含之序列可能為天然序列或人工創新序列。較佳之抗原變異係 鲁 基於該類天然序列變異，例如形成一“混合序列，，用於本發明之 多之抗原區域。例如，本發明之一預定HCV序列可藉由包 含一個以上該類變異進行修改，因而創造出該預定序列〔天然 的〕之一人為變異〔亦即非天然的〕。 明顯的，該抗原決定部位或胜肽亦可衍生自本發明之抗 原決定部位或胜肽，其經由胺基酸互換改良、同源化或至少不 顯著的妨礙該抗原決定部位的T細胞活化能力，該抗原決定部 位或胜肽係包含於本發明之抗原決定部位或胜肽。因此，本發 明之抗原決定部位或胜肽亦可不包含衍生自一 HCV特別品^ 之原始序列，但必需能引發相同或較佳之一 τ細胞改善反應 該類抗原決定部位係視為“異源性，，，該抗原決定部位可引^如 同原始抗原決定部位所引發的相同τ細胞，且較佳在體内或試 管内皆具有更強的之T細胞活化能力。本發明亦包含源自不同 HCV品系之各個同源抗原決定部位。 異源的抗原決定部位可藉由合理設計製得，亦即計算各 殘基〔residue〕對於結合mHC/hlA之貢獻度〔Ramensee等 1999, Immunogenetics 50·· 213-219;或 Stumiolo 等 1999, Nature
Biotechnology 17: 555-562〕，同時考量能與TCR潛在相互作 —21 — ί ίΐί互換，並直接 τ細胞測試所得序列，且與原始抗 實驗下完成。 』田热恋忒項技術者在不需過多 、土〜另一可行性係包含利用τ細胞筛選胜肽庫並與原如抗肩 選對。較佳方法係利用合成胜肽庫進“置筛 等，1=係雜的揭不於〔Blake et a1，1996〕及〔Hemmer 序列i m于ft定部位代表係同源的HCV衍生胺基酸 序=或異源认躲定雜’或模擬該抗原蚊部位的 歹可使用‘胜肽模擬物〔peptidemimetica〕，，戋“逆及胜壯 C retro-inverso-peptides ] » 〇 -飞 $ 反胜狀 伽另—化學族群’制是胺級雜、連接子〔及結合於 ίΐΐΐ加速傳遞鱗等，亦可增位於本發明之HCV疫苗的 Ϊ定部位之Ν•端及/或C•端。胺基酸之連接係揭示於PCT 專利弟WO01/78767號。 、 另一方面，該改良熱區抗原決定部位之設計係利用可声 加刺激T細胞能力❾物質進行配製或修改。該類設計包含輔^ 性τ細胞之抗原決定部位、脂質或脂粒〔lip〇s_〕 PCT專利第WO01/78767號所述之較佳修改方式〕。 增加抗原決定部位之T細胞刺激能力的另一方法係利用 抗體、細胞激素或化學激素進行配製，例如白間質η小〗丨_7、 11-12、11-18、干擾素第απ型〔IFN，特別是IFN_a〕、顆 粒性巨噬細胞菌落刺激因子〔GM_CSF〕、腫瘤壞死因子 〔TNF-α〕、flt-3配合基藥物及其他物質。 田 另一方面，本發明係提供一 HCV抗原決定部位或HCV 胜的使用方法，以供製備一 HLA限制型疫苗，用以治 預防C型肝炎病毒〔HCV〕感染。 ’ 22 — 本發明之較佳HCV疫苗係包含至少二種下列抗原決定部 位： KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK ' DLMGYIPAV ' LEDRDRSELSPLLLSTTEW' DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV ' GYKVLVLNPSVAAT、CINGVCWTV、 AAWYELTPAETTVRLR ' YLVAYQATVCARAQAPPPSWD ' TAYSQQTRGLLG、HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK 及 SMSYTWTGALITP ° 該HCV疫苗較佳係包含至少四種，更佳係至少五種、至 少六種、至少八種或全部十二種之上述抗原決定部位。 本發明之另一較佳HCV疫苗係包含至少二種下列抗原決 定部位： KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK ' DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV ' AAWYELTPAETTVRLR ' TAYSQQTRGLLG ' HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA ' IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK 及 SMSYTWTGALITP 〇 該HCV疫苗較佳係包含至少四種，更佳係至少五種、至 少六種、至少八種或全部十二種之上述抗原決定部位。 本發明之HCV疫苗較佳係包含至少一 A2抗原決定部位 及至少一 DR1抗原決定部位。 本發明之HCV疫苗較佳係包含至少一 DR7抗原決定部 位0 下列的抗原決定部位組合物係視為特別有效〔由至少二 個族群(1)至(5)所選出的至少—個〕： (1) ' KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK > 1358301 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL ' YLLPRRGPRLGVRATRK ' YLLPRRGPRL ' LPRRGPRL ' LPRRGPRLGVRATRK ' GPRLGVRATRK ' RLGVRATRK ' KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK ； (2) 、AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、AYAAQGYKVL、 AAQGYKVLVLNPSVAAT ' KVLVLNPSVAAT ' GYKVLVLNPSVAAT、AYAAQGYKVLVLNPSV、 AYAAQGYKVLVLNPSVAA ' AAQGYKVLVLNPSVA ' AYAAQGYKVLPSVAAT ' AYAAQGYKVLAAT ； (3) 、DLMGYIP(A/L)VGAPL、DLMGYIPALVGAPL、 DLMGYIP(A/L)VG ' DLMGYIP(A/L)VGAP ' DLMGYIP(A/L)V、DLMGYIPLVGAPL、DLMGY-IPLVGA、 DLMGYIPLY ； (4) 、GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV、 GEVQVVSTATQSFLAT、CINGVCWTV、 VSTATQSFLATCINGVCWTV、TQSFLATCINGVCWTV、 GEVQVVSTATQSFLATCING、GEVQVVSTATQSFLAT ;及 (5) 、HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、 MWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA > HMWNFISGI ' MWNFISGIQYLAGLSTLPGN、NFISGIQYLAGLSTLPGN、 QYLAGLSTL、HMWNFISGIQYLAGLSTL、 HMWNFISGISTLPGNPA > HMWQY-LAGLSTLPGNPA ' MWNFISGIQYLAGLSTLPGN ； 特別是，經證實一 HCV疫苗包含GYKVLVLNPSVAAT、 DLMGYIPAV、CINGVCWTV 及 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA之抗原決定部位時將特別 有效。 —24 — 1358301 特別是，本發明之HCV疫苗較佳係提供適合的輔助物 質。因此’經證實使用某種形式的免疫刺激物質係有利於本發 因此’ 一較佳HCV疫苗另包含具RrXZXZNXZX-R2序列 的胜肽，N係介於3至7的整數，較佳係5 ; X係帶正電之天 然及/或非天然的胺基酸殘基;Z係選自下列族群的一胺基酸殘 基·· L、V、I、F及/或W ;而艮及&係分別獨立的選自下列 族群：-H、-NH2、-COCH3、-COH、含20個胺基酸以上之胜 肽、胜肽反應基、含/不含胜肽之胜肽連接子；x_r2可能為胜 肽之C-端胺基酸殘基之醯胺基、酯基或硫酯基〔“胜肽a”〕。 該HCV疫苗之另一較佳實施例係包含一免疫刺激寡核苷 酸分子〔ODN〕，其具有下列分子式I的結構： X2 B-~me— NMPa—x3——Ρ-Χ4——CH2 R1 NMPb-Ε 其中， 係選自次黃嗓呤〔hypoxanthine〕及尿哺咬 〔uracile〕； 任一 X係為氧〇或硫S ; 任NMP係2去氧核苷〔2’ deoxynucleoside〕之單鱗酸 孤〔monophosphate〕或單硫•酸鹽〔mono^iophosphate〕， 其係選自下列族群：去氧腺嗓吟核苦_〔 de〇xyaden〇sine_〕、去 —25 — 氧鳥糞嗓吟核普-〔deoxyguanosine-〕、去氧次黃嗓吟核苦-〔deoxyinosine-〕、去氧胞嘧咬核苷-〔deoxycytosine-〕、去氧 尿癌咬核苦-〔deoxyuridine-〕、去氧胸腺嘴咬核皆-〔deoxythymidine-〕、2-曱基-去氧次黃嘌呤核苷-C 2-methyl-deoxyinosine- ) 、5-曱基-去氧胞嘧啶核苷-C 5-methyl-deoxycytosine-]、去氧假尿嘧啶核苷-〔deoxypseudouridine-〕、去氧核糖嘌呤核苷 〔deoxyribosepurine-〕、2-胺基-去氧核糖嘌呤核苷_ 〔2-amino-deoxyribosepurine-〕、6-硫-去氧鳥糞嗓呤核苷-〔6-S-deoxyguanine-〕、2-二曱基-去氧鳥糞嘌呤核苷_ 〔2-dimethyl-deoxyguanosine-〕、正-異戊基-去氧腺嘌呤核苷_ 〔N-isopentenyl-deoxyadenosine 〕 的單磷酸鹽 〔-monophosphate〕或單硫磷酸鹽〔-monothiophosphate〕； NUC係2'去氧核普〔2' deoxynucleoside〕，其選自下列 族群：去氧腺嘌吟核普-〔deoxyadenosine-〕、去氧鳥糞嗓吟核 苷-〔deoxyguanosine-〕、去氧次黃嘌呤核苷_ 〔deoxyinosine-〕、去氧胞嘧啶核苷-〔deoxycytosine-〕、、去 氧尿嘧啶核苷-〔deoxyuridine-〕、去氧胸腺喂咬核苦_ 〔deoxythymidine-〕 、曱基-去氧尿嘧啶核苷_ 〔2-methyl-deoxyuridine·〕、5-曱基-去氧胞嘧啶核苷 _ 〔5-methyl-deoxycytosine-〕、去氧假尿嘧啶核苷 _ 〔deoxypseudouridine-〕、去氧核糖嘌呤核苷 〔deoxyribosepurine-〕、2-胺基-去氧核糖嘌呤核苷_ 〔2-amino-deoxyribosepurine-〕、6-硫-去氧鳥糞嘌呤核苷 _ 〔 6-S-deoxyguanine- 〕 、 2- 二曱基 -去氧 鳥糞嘌 呤核苷 _ 〔2-dimethyl-deoxyguanosine-〕或正-異戊基_去氧腺嘌呤核苷_ C N-isopentenyl-deoxyadenosine ]； a及b係0至100的整數，但a+b係介於4至丨5〇之間· 及 B ’ 1358301 〔“二及二係核㈣子的5,或3爾 瓦本發明之HCV疫苗另可包含一聚陽離子化合物，較佳係 一聚陽離子聚合物’更佳係一聚陽離子胜肽，特別是聚精胺酸 〔polyargmme〕、聚離胺酸〔p〇iylysine〕或一抗微生物胜肽。 本發明使用之聚陽離子化合物可為任一聚陽離子化合 物,’ $需具有PCT專利第w〇97/3〇721號所述之特殊效果: ，聚陽離子化合物較佳係選自祕纽、有齡陽離子、驗性 聚胺基酸或其混合物。練性雜紐需具有至少4個胺基酸 殘基之鏈長，特別是較佳為含肽鍵之物質，例如聚離胺酸、聚修 精胺酸、多肽類、胺基酸殘基或其混合物，其中該多肽類係含 有20%以上，特別是5〇%以上的鹼性胺基酸，且數量範圍在8 巧以上，特別是20個以上。其他較佳的聚陽離子化合物及其 藥物組成物係揭示於PCT專利第WO97/30721號〔例如次^ 亞胺(polyethyleneimine)〕及 PCT 專利第 w〇99/38528 號。該 ^肽類較佳包含20至500個胺基酸殘基，特別是3〇至^ 胺基酸殘基。該聚陽離子化合物可利用化學或重組方式製成， 或由天然來源衍生製得。
陽離子型胜肽〔多肽〕亦可為聚陽離子之抗菌、抗微当 物之胜肽。該陽離子型胜肽〔多肽〕可源自於原核生物、動彩 或植物，或可利用化學或重組方式製成。胜肽亦可屬於防贺^ 〔defensins〕。該宿主防禦性胜肽或防禦素亦可做為本發g之 聚陽離子化合物雜佳形式。-般而言，—化合物若可做為遣 應性免疫系統的最終產物活化〔或下位調節〕或較佳可藉由 APCs〔包含樹突細胞〕調節時，則該化合物亦可做為聚^ 子化合物。 本發明之方法所使用的聚陽離子物質係組織蛋白酵素抑 制素〔cathdicidin，一種抗菌多狀〕所衍生之胜肽或其衍生物 —27 — 號〕，特別是該抗微生物胜 if Γ動物之_蛋_素抑制素，較佳係人類、牛 1人ί T成素或亦可為神經活性化合物，例如 類成長激素〔如PCT專利第WO01/24822號所述〕。 衍生自天然來源的聚陽離子化合 HIV-TAT〔衍生性陽離子雌、_ = 3 HI^^V ^ 素〔chitosan〕或其他幾丁質衍生物 =ape ia)甲"又 化或重組產物之錄或蛋白 ::織=?ί〔:，或組織蛋白酵素 素抑制素。組織蛋白酵素之相關或衍生素及 織蛋白酵素分子中。該組織蛋白酵素分 胜齡合物進彳恤合。細，令人科暇=== 酵素分子姆實可做為有效的抗原_，而不需縣加盆 劑。因此’柯使職組· _素分子做為 ^ 佐劑，其同時使用或不使用其他免疫刺激物 =田略之有效 本發明之HCV疫苗較佳另包含氫氣 〔Al2(OH)3〕及/或聚陽離子胜肽。 乳化！呂佐劑 根據本發明之一較佳實施例，上述 KLKI^KLK及/或上述iWU-QDN係寡d(IC)i3分子胧A係 根據本發明之某些實關，前cv疫苗較 去氧核醣核酸〔ODN〕，其包含一 CpG主體結構〔咖二养 本發明之HCV疫苗較佳係冷凍乾燥形式，i 下、15分鐘内重新恢復結構。但是，由於取決^cv^ ^ 之各抗原決定雜，因此製備翻難的工作。因此，^ = 1358301 提供配製該HCV疫苗的有效方法。
本發明之HCV疫苗所包含之各種抗原 介於l〇//g至10mg之間〔每單位劑量〕。 1诅各里刀另J 依使用方式不同，各胜肽之數量及豆 在本發明讀_謝，該HCV=== 至5mg/ml、較佳係⑽—至 5 g/ml至3mg/ml之容忍範圍進行投藥。 文彳土係1〇〇// 由於本發明進行冷凍乾燥程，因此本發 HCV疫苗較健包含微量魏。
另一方面，本發明亦關於Hcv疫苗的使用方法，苴 製t藥劑，以供預防及治療HCV的感染，亦即注射以明 之HCV疫苗的有效免疫劑量至人體，特別是Hcv病串、或具 有感染風險的人體〔例如醫院人員、臨床研究人厂、;： 血人員等〕。 、
M If解本發明之腳疫苗等胜肽混合物係十分困 難。因此’本發明之另一目的係提供本發明之Hcv胜狀混入 物的溶解方法’亦即胜肽混合物係由二_上胜肽組成 是由親水性及疏水性的胜肽組成。另一目的係一製造方: 以無菌及選擇性冷凍乾燥含胜肽混合物的藥劑。 因此，本發明另一方面係提供一製備藥劑之方法，苴 含溶解本㈣HCV職混合物的步驟，其賊在於該胜^ 合物係藉由一水溶液進行溶解，該水溶液含有至少一有機酸g 自下列族群：曱酸、醋酸、丙酸、丁酸及其鹵化或氫氧化形式。 為了延長該可溶性胜肽混合物的保存壽命，其係可進—步進行 滅菌〔藉由過濾、輻射、熱處理、化學滅菌或其他 ^ 凍乾燥。 夂今 在一較佳實施例中，該胜肽混合物包含親水性及疏水性 —29 — 1358301 之胜肤。當然’本發明之方法亦可使用僅含一種胜肽的胜肽混 合物〔特別是用以含有二種以上疏水性胜肽的混合物〕。 f另一較佳實施例中，。該胜肽係可藉由本發明之水溶液 加以/谷解，該水溶液包含至少6個，較佳係至少8個，更佳係 至少10個，特別是至少12個胺基酸。本發明可溶解最多包含 30、4〇_或50個胺基酸的胜肽及多肽〔或甚至包含100個胺基 酸’儘讀於具有過長抗原#段的缺點而絲長的抗原決定部 位較不適用〕。 本發明之胜肽的特徵在於溶解度。胜肽若僅以小於1〇〇 #g/ml的濃度溶解於一水溶液，則視為疏水性。另一方面，親 水性胜肽彰认於1G()/zg/ml的濃度鱗於—麟水溶液 水性胜肽3分為陽離子型〔>2G%之祕胺級，包含離胺 =精胺酸、組織胺酸〕、陰離子型〔>2〇%之酸性胺基酸胺 =，門冬驗、麵紐〕、富含絲之雖〔>观之 基胺基酸，例如絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸〕。 工 因^ ’另一方面，本發明係關於本發明Hcv疫苗 方法’其特徵在於包含下列步驟： 〔1〕化子合成至少二個上述定義之抗原決定部位；
/2〕、藉由一水溶液溶解該抗原決定部位，該水 J至少4舰，該有機酸係選自下列 忿液J 酸、丁酸及其鹵化或氫氧化形式； 醋騃、丙 〔3〕、混合上述已溶解之抗原決定部位，·及 ⑷、選郷料絲上魏合之抗縣定部位。 該HCV胜肽混合物可低溫冷;東〔 東 時〕，以利儲藏。 果乾燦步驟 本發明之雖混合物之胜肽係藉由鮮化學方法所合成 ~ 30 — 1358301 固相合成法〕。當然'，該胜肽亦可藉由重电 在所有 ，其 古，系直接藉原核及真核細= 二錢的概或纽在冷綠燥及共同混合 需要另外進行純化。 J Da 酸’錢擇性的包含乙腈
»亥實驗顯示，依該胜狀混合物之組成不同該 有機酸濃度必需至少佔10%，較佳係至少2G%，更佳係至少 30% ’特別是至少4G%，尤其是至少5〇%，最佳係至少6〇%。 在^些情況下’在該水溶液巾添加有機_生物〔例如 乙腈〕係有助於轉含有大量疏水性職之職混合物。再 者，有機溶液，例如DMSO〔二甲基亞砜〕及DMp〔二甲美 曱醯胺〕，亦可用以提升胜肽混合物之轉度，以使胜狀混= 物包含較高濃度之疏水性職。然而，水溶性胜肽混合物^ DMSO及/或DMF時將無法進行冷康乾燥。
在一較佳實施例中，當產物欲進行冷凍乾燥時，填補材 料〔bulking agents〕係加入該胜肽混合物中。特別是，在低胜 肽濃度時，不一定能形成良好的冷凍乾燥塊狀物。因此，需添 加低量的胜肽填補材料。較佳的填補材料係山梨糖^ 〔sorbitol〕、甘露醇〔m_it〇1〕、聚乙烯吡咯酮 〔polyvinylpyrrolidone，PVP〕及其混合物。 ，另一較佳實施例中，溶解之胜肽混合物係藉由過濾進 行滅菌。為了提升產物的恢復力及進行大量胜肽混合物的過 濾，所含的胜肽必需完全溶解及不形成膠狀。 —31 — f=祕錄娜性滅g的胜肽 d，或在裝人玻璃管後再進行冷_。 ，為料胜肽混合物的—種有用且有 如上 ^冷康乾燥調継有已溶解_肽，並包含最多5 = 办液〔溶液系統内的水〕及微量的有。戔留 ;;重新恢復結構，該緩衝水溶液 之^濁财液或清激溶液〔視雛狀混合物 Ϊ速重新恢復結構能力對緊急事件而言特 別有其β性，-纽制雜必f在數 -冷束試管的整份劑量。 里王冷解 【實施方式】 本發明將町列實_詳細朗，然其並_以限制本 發明之範圍。
根據PCT專利第W004/024182號，經由重疊活性HCV 胜或避免半胱胺酸等關鍵性殘基可合成數種新胜肽合成序 列。再測試該序列對第Π型HLA可溶性分子的親和力，及其 結果係與原始數據加以比較如下列表一： 1358301 表一'選用之HCV-衍生胜肽及其15個胺基酸長度[l5-mer〕的對應物結 合至第II型HLA可溶性分子〔“+++”高親和力、“++”中親和力、“+”低親和力、 無親和力' “nd”未取得資料：核心結合主體結構係標示底線〕。 胜脚^號胜胳序列 結合至可溶性HLA-DRB1*分子 0101 0401 0404 0701 1101 1798 TaJ.C,K\r\,\rDTl,AGYGAGVAGAJMAVK - - + ++ +/- B84 a^raj.aKViMDTi,Aa + + + - B86 TnjiGKVLVDI LAGYC： + ++ + + +/- B88 TiGKVLYDILA^Y^An + ++ + B92 LVDILAGYGAGVAGA + - B94 ηττ.ΑΠΥ〇ΑΓ；νΑ(；Ατ.ν + - - - B96 LAGYGAGVAGALVAF ++ ++ - + /- +/- 1799 AAWYRT.TPAF.TTVRT.R +++ 十 + - +/- B46 AGAAWYELTPAETTV +++ +++ +++ - +/- B48 AAWYELTPAETTVRL +++ +++ +++ - + /- 1827 TAY^OOTRC^TiC； ++ - +/- + + C114 TAYSQQTRGLLGCIV +++ + /- + /- + ++ 1829 .q^YTWTnAT.iTP + - - + +/- 1604 WCCSMSYTWTGALITPC + + ++ ++ + 1650 VnYPYRT.WHYPrTVNFTTFKVRMYVGGVRHRT. A130 nYPYRT.WHYPrTVNF + ++ +/- A131 YPYRLWHYPCTVNFT - A135 t.whypctVNFT I - - ++ A141 T VN PT T PKVRMyvnf； - - + /- ++ A145 TIFKVRMYVGGVEHR +/- - 1651 VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL 1800 nYPYRT.WHYPrTVNYTTFKT - - + /- ++ - A147 DYPYRLWHYPCTVNY - - A152 LWHYPCTVNYTIFKI - - A158 TVNYTIFKIRMYVGG - - +/- A162 TIFKIRMYVGGVEHR +/- - 1817 RMYVGGVEHRL - - + /- 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA + + ++ ++ + 1425 NFISGIQYLAGLSTLPGNPA ++ ++ ++ nd nd 1006 MWNFISGIQYLAGLSTLPGN ++ + ++ nd nd —33 — 1358301 胜肽1798對DRB1*0101及DRB1*0401分子的無親和力 係與其較短對應物〔B84至B96〕相互比較，其原因大概係因 長序列〔26個胺基酸長度〕可能具有二級結構會阻礙結合。 因此’預測在體内實驗中’依蛋白質水解分解程度，胜肽1798 將變成一個較短的第II型抗原決定部位。移除胜肽1827及 1829〔分別為胜狀C114及1604的衍生物〕的半胱胺酸〔c〕 殘基似乎對其DRB1*0401分子的結合有所幫助，但基本上未 能改變對於上述測試的其他DR亞型之親和力。 丄jicv熱區抗原決定部位之辦識及定饽 如上所述，一 T細胞熱區抗原決定部位〔一“熱區”〕係 ，為一短胜肽序列，其必需至少包含一個以上之τ細胞抗原決 疋。卩位例如一個或一個以上之抗原決定部位，其可選擇緊密 的相鄰〔緊密係定義為少於5至1()個胺基酸〕、直接相鄰、 f部或甚至整個重疊。熱區可能僅包含單一第j型或第π型的 抗原決疋部位，或包含兩者之組成物。熱區内之抗原決定 可能具有不同之HLA限制位。 、 if帛1型及第Π侧抗原料财具有高複雜度及多 性路#〔如先前技術所述〕，因此無法輕§由-多肽之序 τ έ 找到Τ細胞抗原決定部位。儘管廣泛使用電腦演算， 及偽田ίί原決定部位預測的電腦演算仍具有高比例之偽陰性 -多τ細胞抗原決定部位未明顯的出現於 門顳。太fn:、區的τ細胞抗原決定郜位亦可發生此種 定部位ΛϋΊ種不，的實驗方法，以辨識τ細胞抗原決 及匕3取得抗原決定部位、吼八轉殖基因動物 以重管内刺激。上述所有方法皆係有系統的用 辨識。在該種複雜的分析之下，不限於 ^位 —34—— 1358301 可在能的標的抗原決定部位，以使抗原 區的特性。因=2::在熱:==的序列顯示熱 且处部位之熱區提供重要的優點:熱區可活化 位:抗原;定;位時r:種f細胞當產^^^ 細胞係各源自不同的非HLA相符之個體。 作用該丁 拉、4 ί 雜定雜製成之疫關目前為止皆著重於選擇較 二偶基因，例如见从2，其大約出現在近半數 田二二人種身由於其他的對偶基因出現頻率低，因此適 用王，界人口之抗原決定部位型疫苗必需包含許多不同的抗 原決疋部位。一疫苗的化學體〔例如胜肽〕數量受限於 配製及生蓋穩定性等限制要件。 當熱區藉由有限的胜肽數量提供大量的潛在抗原決定部 位時，熱區的使用將使得適用全世界人口使用之抗原決定部位 型疫苗成真。 表二、^HCV之同源區域內的τ細胞熱區抗原決定部位。熱區〔包含某 些變異）籠示· ’包含在祕_抗原決定部位縫示—般字^此處揭 示胜數子及序列及第I型、第II型之HLA分子。來源資料若未揭示於PCT專 利第W004/024182號時，請參照表中列舉之參考文獻。 胜肽編號 胜肽序列 第I型 第II型 涵龅 * (除PCT專利第 W004/024182 之 1835 KFPGGGQIVGGVyULPRRGPRLGVRATRK A2, A3, B7 DR11 7r) 83 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL A2 B7 DR11 1051 YLLPRRGPRL A2 Bategay 1995 1843 LPRRGPRL B7 第三實施例 GPRLGVRAT B7 Koziel 1993 RLGVRATRK A3 Chang 1999 84 GYKVLVLNPSVAAT DR1, 4,7,11 AYAAQGYKVL A24 該PCT専利 —35 — 1358301 84EX AYAAQGYKVLVLNPSVAAT A24 DR1,4,7,11 87 DLMGYIPAV A2 Sarobe 1998 GYIPLVGAPL A24 該PCT專利 87EX DIMGYIPLVGAPL A2fA24 89 CINGVCWTV A2 Koziel 1995 1577 GE VQ WS T ATQS FLAT DR 4, 7 Θ9ΕΧ GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV A2 DR 4, 7 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA A2 DR1,4,7,11 1006 MWNFISGIQYLAGLSTLPGN 1425 NFISGIQYLAGLSTLPGNPA QYLAGLSTL A24 該pct專利 1334 HMWNFISGI A2 Wentworth 1996 1650 VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMyVGGVEHRL Cw7/A2/A24/ DR1,4,7,11 All, A3 1836 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI Cw7fA2;A24/ DR1,4,7,11 All 1846 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV Cw7,A2;A24, DR1,4,7,11 All 1651 VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL 1800 D YPYRLWHYPCTVNYTIFKI Cw7,A24,All DR7 1754 DYPYRLWHY Cw7 Lauer 2002 1815 TVNYTIFKI All 該PCT專利 1816 TINYTIFK All Koziel 1995 TVNFTIFICV All 該PCT專利 HYPCTVNYTI A24 該PCT專利 HYPCTVNFTI A24 該PCT專利 RMYVGGVEHR A3 Chang 1999 1799 AAWYELTPAETTVRLR B7? B35 DR1, 4 1818 TPAETTVRL B7? B35 Ibe 1998 1827EX GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV A2,A3rA24 DR1,4,7,11 ΒΘ C114 TAYSQQTRGLLGCIV A24, B8? DR1,4,7,11 1827 TAYSQQTRGLLG A24, ΒΘ DR1, 7,11 C112 GQGWRLLAPITAYSQ A3?,A2?, DR1 RLLAPITAY A3 該PCT專利 C114EX GQGWRLLAPI TAYSQQTRGLLGCIV A24,A3?,A2? ,DR1,4,7,11 B8? 36 — 1358301 A24/A3?/A2?/ DR1, 7,11 1827EX GQGWRIiLAPI TAYSQQTRGLLG B8? 1801 AYSQQTRGLL A24 1819 AYSQQTRGL A24 Kurokohchi 2001 1798 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK A2,24,3,11 DR1,4,7 1820 ILAGYGAGV A2 Bategay 1995 1821 VAGALVAFK A3, 11 Chang 1999 GYGAGVAGAL A24 該PCT專利 1604 WCCSMSY TWTGALITPC A2,A24,B7 DR1,4,7,11 1829 SMSYTWTGALITP A2/A24,B7/ DR1, 7,11 SMSYTWTGAL A2, B7 該PCT專利 SYTWTGALI A24 該PCT專利 1579 FTDNSSPPAVPQTFQV A1,2;B7,51 DR53=B4*01 表、五 1624 LEDRDRSELSPLLLSTTEW Al,2,3,26 DR7 B8,27,4402,60 1848 LEDRDRSELSPLLLST Al,2,3,26, DR7 B8,27,4402,60 RSELSPLLL A1 該PCT專利 ELSPLLLST A2, A3 該PCT專利 DRDRSELSPL A26,B27 該PCT專利 LEDRDRSEL B08,B4402 該PCT專利 1824 LEDRDRSEL B60 Wong 2001 1547 YLVAYQATVCARAQAPPPSWD A2 DR1,4,7,11 1822 YLVAYQATV A2 Wentworth 1996 A1A7 MSTNPKPQRKTKRNTNR A11,B08,B27 A3A7 PQRKTKRNTNR B08,B27 QRKTKRNTN B08 該PCT專利 RKTKRNTNR B2705 該PCT專利 MSTNPKPQR All 該PCT專利 MSTNPKPQK All Wong 1998 A122EX LINTNGSWHINRTALNCND SL A2,2,3,B8 DR1,4,7,11 A122 NGSWHINRTALNCNDSL A2 DR1,4,7,11 LINTNGSWHI A2,3 該PCT專利 RTALNCNDSL .A2 該PCT專利 1825 LINTNGSWHINRTALN A2,3,B8 該PCT專利 1826 SWHINRTALN B8 該PCT專利 A241 TTILGIGTVLDQAET A2,A3 DR1, 4 TT工LGIGTV A2 該PCT專利 —37 — 1358301 TILGIGTVL A3 該PCT專利 B8B38 B8 FDSSVLCECYDAGAAWYE FDSSVLCECYDAGCA VLCECYDAGA Al,2,3,26 A3,A26 A2 該PCT專利 B38 WLCECYDAGAAWYE A1 C70EX C64-C70 1831 1832 ARLIVFPDLGVRVCEKMALY ARLIVFPDL RLIVFPDLGV RVCEKMALY A2,A3,B27 B*2705?,*2709? A2 A3 Gruener 2000 Wong 1998 C92 AFCSAMyVGD：LCGSV A2,B51 DR1,4 C97 GVLFGLAYFSMVGNW A2,3,26, B2705/51 DR1,4,7 C106 TRVPYFVRAQGLIRA A3,24, B7,B8,B2705 DRl,4,7 C134 1823 TTLLFNILGGWVAAQ LLFNILGGWV A2 A2 DR1, 7,11 Bateqav 1995 簋；實施例·· HCV熱區抗原決定部位IpeDl426免含？ 之耶A-A*0201及數個任意之第Π帮τ細胞抗及決宕部相 本實施之主要目的係用以比較“熱區，，lpl426及個別抗原 決定部位的致免疫能力，該熱區Ιρ1426包含至少一 HLA-A*0201抗原決定部位〔Ιρ1334〕及2個任意之第π型抗 原決定部位〔Ipepl〇〇6及ipepi425〕。為達此目的，取自數個 HLA。型健康捐血者之周邊血液單核球細胞〔pBMC〕係在試 管内單獨利用Ipl426或混合利用Ipi334、Ipl〇〇6及Ιρ1425之 混合物j行刺激。進行三次刺激後，結果產生少量的τ細胞 株。接著，抵抗所有四種胜肽之反應係藉由干擾素_ ^〔IFN_ r〕酶免疫斑點試驗〔ELIspot〕分析法進行評估。 當個別的抗原決定部位在胜肽1426内時，該胜肽1426 引發T細胞反應。特暇，將能成功造成⑽+之τ 細胞直接抵絲HLA-AMm _蚊抗縣定部位。 個HLA型健康個體’並經由三次試管二= 1358301 1006+1425+1334之混合物。該類細胞株之CD4 +及CD8+之T細胞活性係藉由干 擾素-r酶免疫斑點試驗分析法進行評估〔干擾素-r分泌：“+++”極高、 “++”高、“+”明顯，或無〕。 捐血者之HLA A*0201, A*03, B7, B60; DRB1*1501, -Bl*1302 A*0206, A*01, DRB1*0401, B27, B50; -Bl*1402 抵抗1426 抵抗 抵抗1426 抵抗 胜腿號 1006+1425+1334 im'im 1006+1425+1334 ⑽胞株 1006 ++ + + + + + + 1425 +++ + + + + + + + + 1334 + + - - 1006+1425+1334 ++ + + + + + + 1426 +++ + + + + + + + + 84 (HCViii生陰性 對照控制） - — - -
第四實施例：藉由五種不同之HCV衍生胜肽、抗摄生物 胜肽KLK及合成寡核苷酸〇-d(IOn之组合注射引發有效的 HCV專一性之第I型細胞反廒 鼠類：HLA-A*0201轉殖基因鼠(HHD.1) 胜肽 胜肽p83、p84、p87、p89、pl426用以疫苗接種 p83:HCV-衍生胜肽， (KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL) p84: HCV-衍生胜肽， (GYKVLVLNPSVAAT) p87: HCV-衍生胜肽， (DLMGYIPAV) —39 — p89:HCV-衍生胜肽， (CINGVCWTV) pl426:HCV-衍生胜肽， (HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA) pl274用於重新刺激，並做為無關之胜肽 (YMDGTMSQV ; HLA-A*0201 限制位） 所有胜肽係藉由標準固相；F-moc合成法合成，高性能 液相層析法HPLC純化，及利用質譜儀進行純化分 析。 劑量：20pg每胜肽/鼠 KLK KLKLLLLLKLK-COOH係藉由MPS合成(多重胜肽 系統公司 Multiple Peptide System，USA) 劑量：lOnmol/鼠 寡-d(IC)13(= ODNla) ODN 5’ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CICIC3’係利用Purimex核酸技術合成，G6ttingen公 司 劑量：0.4nmol/鼠 配製 10mM Tris/135mM NaCl ; pH 〜7 實驗設定(5鼠/組)： 1 ' HCV peptides 2 ^ HCV peptides + KLK + o-d(IC)13 在第〇天時，14隻及28隻之HHD.l老鼠係在二後腳腳 趾皮下注射總劑量為ΙΟΟμΙ/鼠〔50//1/腳趾〕之上述化合 物。在第35天時〔在最後一次免疫接種後7天〕，利用磁性 分離法〔MACS， 取得CD4+及CD8
Miltenyi〕由脾臟細胞之單細胞懸浮液分離 侍CD4及CD8+之T細胞。T細胞係利用介質〔背景控制〕 培養丄或者利用原始老鼠之輻射處理脾臟細胞〔如用 以疫苗接種且表現不随肽之APC抗原呈_胞〕或不相關 之胜肽pl274進行再刺激。在隔夜培養後，該厕·^產物係 利用ELIspot分析法進行分析。 第1圖揭示上述共同注射該五種HCV衍生胜肽及
KLK/o d(IC)丨3 後’引發 了由抗 p84、p87、p89、pl426 之 CD4+T 細胞I產生大夏的IFN-γ。再者，亦偵測到由抗p87、p89之 CD8+T細胞產生的強烈IFN_ r產物。
該胜肽混合物含有p83、p84、p87、p89、pl426及 胜肽做為免疫物質〔如表四〕，其中p83及p84係可溶於水及 DMSO ’ p87及P89係具有低水溶性’但易溶於DMS〇】似 僅溶於DMSO。就-懸浮調劑之製造而言，其首先需要將p83 5 PH於Γ緩衝水溶液並將P87及p89溶解於DMS0 中。在殺函過濾後，該溶液可組合成為最終懸浮液。 水/乙腈之混合物如同DMS〇及DMp般，並飪法柞兔梭
殺菌過濾。 1358301 .表四、胜肽混合物。 胜雌號 胜 83 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL 84 GYKVLVLNPSVAAT 87 DLMGYIPAV 89 CINGVCWTV 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA · 下列實施例〔第五之一至五之十二之實施例，如表五至 十六所示〕揭示本發明之胜肽混合物包含至少二種不同長声 及胺基酸組成之胜肽，其適合進行溶解化。再者，各表揭厂、二 胜狀對第I型及第II型HLA分子的已知親和力。 ^ 第五之一實施例 表五、胜混合物Π 胜_號 1835 ~ 87 1624 ~ 1846 84 89 1799 1547 1827 1426 1798 1829
胜 KFPGGGOIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK DLMGYIPAV LEDRDRSELSPLLLSTTEW ~~ DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV GYKVLVLNPSVAAT ^ CINGVCWTV ： AAWYELTPAETTVRLR YLVAYQATVCARAQAPPPSWD TAYSQQTRGLLG_ HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK SMSYTWTGALITP
DR7Ματ〇ΙΙ32πτ
—42 — 1358301 第五之二實施例： 表六、胜肽混合物皿 胜雌號 胜肽關 第I型HLA 第II型HLA 1835 KFPGGGOIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK A2，A3，B7 DR11 1846 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV A2，All，Cw7 PR1,4, 7,11 1799 AAWYELTPAETTVRLR B35 t)Rl,4 1827 TAYSOQTRGLLG A24 DR1,7, 11 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA A2 DR1,4, 7, 11 1798 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK A2, A3, All DR1,4,7 1829 SMSYTWTGALITP A2,B7 DR1,7,11 第五之三實施例： ·
表七、胜肽混合物IV
胜_號 胜肽序列 第I型HLA 第II型HLA C134 TTLLFNILGGWVAAQ A2 DR1,7,11 1815 TVNYTIFKI All 1006 MWNFISGIQYLAGLSTLPGN
第五之四實施例： 表八、胜肽混合物V
胜腿號 胜肽序列 第I型HLA 第II型HLA 84 GYKVLVLNPSVAAT DR1，4, 7, 11 87 DLMGYIPAV A2 89 CINGVCWTV A2 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA A2 DR1,4, 7, 11 —43 — 1358301
第五之五實施例： 表九、胜肽混合物VI 胜廳號 胜肽· 第I型HLA 第II型HLA 1051 YLLPRRGPRL Α2 84 GYKVLVLNPSVAAT DR1,4,1, 11 87 DLMGYIPAV Α2 89 CINGVCWTV Α2 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA Α2 DR1,4, 7, 11
第五之六實施例： 表十、胜肽混合物W 胜關號 胜肽序列 第I型HLA 第II型HLA 1006 MWNFISGIQYLAGLSTLPGN 1827EX GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV B8 第五之七實施例： 表十一、胜肽混合物Μ
胜腿號 胜肽顾 第I型HLA 第II型HLA 1604 VVCCSMSYTWTGALITPC 83 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL B8 A130 DYPYRLWHYPCTVNF B46 AGAAWYELTPAETTV —44 — 1358301 笫五之八實施例：
表十二、胜肽混合物IX 胜肽· 第I型HLA 第Π型HLA IB84 GSIGLGKYLVDILAG t)Rl,4 (B96 LAGYGAGVAGALVAF t)Rl,4, 7,11 1829 SMSYTWTGALITP A2, B7 t)Rl,7,11 A135 LWHYPCTVNFTIFKV pR7 A130 DYPYRLWHYPCTVNF pRl,4 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA A2 DR1,4, 7, 11 1817 RMYVGGVEHRL DR4 87EX DLMGYIPLVGAPL A2, 24 1816 TINYTIFK All
第五之九實施例：
表十三、胜肽混合物X 胜腿號 雌關 第I型HLA 第II型HLA 1650 VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGG VEHRL Cw7,A2,A24,All, A3 DR1，4,7，11 1836 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI Cw7,A2,A24,All DR1，4,7, 11 1846 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV Cw7, A2,A24,A1, All PR1,4,7,11 1651 VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGV EHRL 1800 DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI Cw7，A24，All DR7
第五之十實施例：
表十四、胜肽混合物XI 胜腿號 胜肽麵 第I型HLA 第II型HLA 1835 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR K A2, A3,B7 DR11 83 KJFPGGGOIVGGVYLLPRRGPRL A2 B7 DR11 84EX AYAAQGYKVLVLNPSVAAT A24 DR1，4,7，11 87EX DLMGYIPLVGAPL A2,A24 89EX GEVQWSTATQSFLATCINGVCWTV A2 DR 4, 7 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA A2 DR1，4,7，11 —45 — 1358301 第五之十一實施例： 表十五、胜肽混合物χπ 胜腿號 胜肽麵 第I型HLA 第II型HLA C114 TAYSOOTRGLLGCIV IA24, B8 DR1,4,7,11 1798 IGLGKYLVDILAGYGAGVAGALVAFK IA2,24,3,11 DR1,4,7 1604 YVCCSMSYTWTGALITPC lA2,A24,B7 DR1,4,7,11 1624 LEDRDRSELSPLLLSTTEW IA1,2,3,26 DR7 第五之十二實施例： 表十六、胜肽混合物ΧΠΙ 胜腿號 胜肽賴 第I型HLA 第II型HLA 1547 YLVAY〇ATVCARA〇APPPSWD A2 DR1,4,7,11 A1A7 MSTNPKPQRKTKRNTNR A11，B08,B27 A122EX LINTNGSWHINRTALNCNDSL A2,2,3,B8 DR1,4,7,11 A241 TTILGIGTVLDQAET A2,A3 DR1，4 B8B38 FDSSVLCECYDAGAAWYE A1,2,3,26 C70EX ARLIVFPDLGYRVCEKMALY A2,A3,B27 C92 AFCSAMYVGDLCGSV A2,B51 DR1，4 C97 GVLFGLAYFSMYGNW Α2,3,26, B2705, 51 _ DR1，4,7 C106 TRVPYFVRAQGLIRA A3,24,B7，B8，B270 5 DR1，4,7 C134 fTTLLFNILGGWVAAO A2 DR1,7,11
—46 — 1358301 第六實施例：本發明設計其他HCV疬苗蠻化之原理 “熱區I”之較佳组合。 七 號 胜肽麵 HCV抗 原 ; HLA對鹏因 第1型HLA 第II型HLA 1835 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK 核心部A2，A3，B7 DR11 87 DLMGYIPAV 核心部A2 1624 LEDRDRSELSPLLLSTTEW E2 B60 DR7 1846 DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV E2 A2,All,Cw7 DR1,4, 7,11 84 GYKVLVLNPSVAAT NS3 DR1,4, 7,11 89 CINGVCWTV NS3 A2 1799 AAWYELTPAETTVRLR NS3 B35 DR1,4 1547 YLVAYQATVCARAQAPPPSWD NS3 A2 DR1,4, 7,11 1827 TAYSQQTRGLLG NS3 A24 DR1, 7, 11 1426 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA NS4 A2 DR1，4,7 11 1798 IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK NS4 A2, Α3,ΑΠ DR1,4,7 1829 SMSYTWTGALITP NS5 A2, B7 DR1，7, 11 熱區I之較佳組合的特徵： 胜肽數量：12 胜肽經由半胱胺酸形成之潛在交互作用：3個胜肽中之4 個半胱胺酸〔pl846、p89、pl547〕；胜肽潛在形成同構及異 構之二聚體〔dimer〕及寡分子〔〇lig〇mer〕。 所涵蓋之HCV抗原數量：5〔核心部、E2、NS3、NS4、 NS5〕。 .所涵蓋之第I型HLA對偶基因：至少8種，A2〔8次〕、 A3〔2#〕、A11〔2#〕、A24〔^〕、B7〔2&〕、b35 〔1 次〕、B60〔 1 次〕、Cw7〔丨次〕。 所涵蓋之第II型HLA :數個散佈性胜肽，DR1〔 8次〕、 〇尺4〔6次〕、〇尺7〔8次〕、〇尺11〔7次〕。 -熱區I之較佳組合係由12種胜肽所組成，其衍生自5個 不同HCV抗制同龍域〔在第丨小㈣基目射具有〉· 之同源性〕。在所有種類中，涵蓋了至少8種重要的第j型 —47 — 1358301 HLA對偶基因〔分別為1至8次〕，其提供之族群涵蓋範圍 包含83%至91%之歐洲高加索人、89%至91%之美國高加索人 及87%至89%之日本人〔由Gjertson及Terasaki等研究之hla 普遍性數量進行評估：HLA 1998, American Society of Histocompatibility and Immunogenetics, Lenexa, Kansas USA〕。相似的，涵蓋了數種重要的第n型吼八對偶基因，’ 其稱為散佈性胜肽〔結合於一個以上之第Π型HLA對偶基因 上〕。特別普遍之個別對偶基因〔DR卜DR4、DR7、DR11〕 係分別出現了 6至8次。最重要的是’ DR11出現了 7次。該 對偶基因的出現係相關於HCV感染之自發性復原〔Thursz ^ 1999 Lancet: 354(9196):2119-24〕。 ’ 該熱區組合包含之大量抗原決定部位不但可確保涵蓋廣 大族群以增加疫苗的可應用性’而且對利用該組合治療的個體 亦能產生較大的免疫反應。由於HCV感染之自發性復原相關 於了直接抵抗十個以上抗原決定部位的較大的免疫反應，因此 上述要求成為疫苗效力之先決條件。 由於抗原決定部位同時使用愈多，愈難使病毒同步發生 變化’因此可抵抗多重抗原決定部位之τ細胞反應亦可減^產 生無HCV抗原決定部位之變種〔亦即Hcv病毒不具有免疫 反應所瞄準的抗原決定部位〕的機率。黑猩猩的實驗/建立後， 該類無HCV抗原決定部位之變種係維持慢性感染的重要機制 〔Weiner et al，1995 Proc Natl Acad Sci U S A.: 92(7):2755-9〕。 最後，代替僅使用單一 HCV抗原，針對數種HCV抗原 〔核心部、E2、NS3、NS4、NS5〕係提供重要的優點：例如「 由於抗原處理的不同或每個人之特定乱人單型不同，因此不 同的抗原可能由不同的τ細胞所辨識。再者，在HCV的生活 週期期間，不同的抗原係具有不同的功能性角色。 熱區I的組合物包含衍生自熱區之各抗原決定部位 —48 — 1358301 〔Ipep87 衍生自 Ipep87EX，及 lpep89 衍生自 Ipep89EX〕。上
述衍生性對於特定抗原決定部位的預期反應係具有深遠重要 性的優勢。例如，使用Ipep89可確保產生HLA-A2限定之CTL 反應，然而使用Ipep89EX則可能導致HLA-A2限定之CTL 反應，但可能造成污染物DR4或DR7限定之辅助性T細胞反 應。
使用熱區之組合物具有數個優點而勝於使用完整長度之 抗原，其形式可為重組蛋白質或DNA疫苗。如上所述，在某 $情況下，使用個別抗原決定部位可能優於使用熱區或完整贫 抗原。再者，本發明揭示之熱區係利用功能性分析加以辨識， 其主要係在讀出資料時使用一 Thl/Tcl型反應〔亦即干擾素 r〕。已知抗原不僅包含作用部〔agonist〕之抗原決定部位， 而且亦Y鱗魏部〔__&〕的配合基。該難抗部潛在 於整個抗原内，但未出現在熱區中，該拮抗部可能阻礙產生免 疫能力及疫苗的效力。再者，整她原職乎必然引發一體液 性，疫反應、。該類抗體反應本身只對細胞内的HCV具有微弱 的效用’細卩可嚴重的狀職的τ細胞反應。鏡若具備有 Τ長f二其將僅具有極低機率會引發不必要的抗體反應。最 後，僅有树少量的HCV抗原可獅的存留於不_基因型 =’/吏用在疫苗中之整個抗原可能引發對非同源性之 ς域，抗縣定部位的反應，其對於大多數病患而言皆為不適 :目反的’本發明揭示之熱區係衍生自主要的HCV基因型 第、2及3型之間同源程度大於80%的區域。 —49 — 1358301
胜肽 編號 胜肽麵 〜 1835 1846 KJPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRX' DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV 1799 1827 AAWYELTPAETTVRLR --' TAYSQQTRGLLG 1426 1798 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK 1829 SMSYTWTGALITP ~~— HCV core E2 ~NS3~ NS3 lm NS4 ~NS5~ 表十八、“熱區II”之較佳組合 HLA對鱗因 第I型HLA 第II型HLA A2，A3，B7 DR11 A2,All,Cw7 DR1,4, 7, 11 B35 DR1,4 A24 DR1,7, 11 A2 DR1,4, 7,11 A2,A3,Ail DRL4.7 A2, B7 DR1，7, 11 — 熱區II之較佳組合的特徵： 胜肽數量：7 胜肽經由半胱胺酸形成之潛在交互作用：丨個半胱胺酸 Cpl846 )； 胜肽pi846潛在形成同構二聚體。 所涵蓋之HCV抗原數量：5〔核心部、E2、NS3、NS4、 NS5〕。 所涵蓋之第I型HLA對偶基因：至少7種，A2〔5次〕、 八3〔2次〕、八11〔2次〕、八24〔1次〕、37〔2次〕、丑35 〔1 次〕、Cw7〔 1 次〕。 所涵蓋之第II型HLA :數個散饰性胜肽，dri〔 6次〕、 DR4C5 次〕、DR7〔5 次〕、DR11〔5 次〕。 熱區II之較佳組合係由7種胜肽所組成，其衍生自5個 不同HCV抗原的同源區域〔在第ι、2、3型基因型中具有 之同源性〕。在所有種類中，涵蓋了至少7種重要的第工型 HLA對偶基因〔分別為丨至5次〕，其提供之族群涵蓋範圍 包含81%至90%之歐洲高加索人、89%至91%之美國高加索人 及至88%之日本人〔由Gjertson及Terasaki等研究之HLA 普遍性數量進行評估：HLA 1998, American kdety Qf 1358301
Histocompatibility and Immunogenetics, Lenexa, Kansas, USA〕。相似的，涵蓋了數種重要的第n型hlA對偶基因， 其稱為散佈性胜狀〔結告—個以上之第II型HI^A對偶基因 上〕。特別普遍之個別對偶基因〔DR1、DR4、DR7、DR11〕 係分別出現了 5至6次。最重要的是，DR11出現了 5次。該 對偶基因的出現係相關於HCV感染之自發性復原〔Thursz等, 1999Lancet: 354(9196):2119-24〕。 相較於熱區I之組合，熱區II之組合具有明顯較少的胜 數量〔7種比12種〕，其更具製造、配製及產品競爭上的 潛在優勢。最重要的是’僅有一種胜肽具有一半胱胺酸侧鍵存 在〔pl846〕。因此’在該組合中僅形成pi846的同構二聚體， 但不會形成異構二聚體或寡分子。 同時’熱區II之組合涵蓋相同於熱區I組合之五種HCV 抗原及相似數量的第I及II型HLA對偶基因。因此，前段論 點對熱區II之組合而言仍舊成立。 由配藥的觀點來看，熱區II之組合具有數個優點勝於熱 區I之組合〔相對於12種成份，僅具有7種成份〕。更重^ 的是’僅有一種胜肽〔pl846〕具有自由的半胱胺酸侧鏈。.因 此，僅會形成pl846的同構二聚體，但不會形成異構二聚體或 寡分子。 蓋主實施例：由HCV疫苗的102稚避極佳化試驗敗得 1細胞致免涛性 數種胜肽/聚精胺酸之混合物做為疫苗，並在健康的自願 者身上進行床试驗。各組由12個實驗者組成，具 陽性。實驗者每月接受4種疫苗接種〔出診視察3至6次〕。 在第1至6次出診視察、最後疫苗接種後—個月〔第7次出啥 祝察〕及最後疫苗接種後三個月〔第8次出診視察〕時，分別 抽取血液，以供免疫分析。為監測臨床試驗，利用Intercell技 ——51 —- 1358301 術建立最新τ細齡析法，叫驗glp/gq>決定免疫終點·· 干擾素-7之ELIspot分析法，τ細胞增生分析，四聚體 /FACS分析。上述分析法可靠制量由治雜HCV疫苗所引 發的抗原決定部位專-性T細胞反應。該疫苗引發之τ細胞 免疫反應可做為效力賊錄數〔Kd_ #，；ImmunQthen 2002 Mar-Apr;25(2):97-138〕。 第-點’T細胞致免疫性係藉由τ細胞增生分析法檢測： 該增生分析法可檢測人類血液等生物樣品中的胜肽專一 性T細胞。該分析法的原理在於τ細胞可受胜肽刺激，並由 其τ細胞受II進行專-性辨識，且藉由分泌細胞激素及增生產, 生反應。細胞的增生可藉由數種方式測量；在敏感度最高的方 法中可在細胞分裂前，將放射性標定胸腺嘧啶併入合成之 ί^ΝΑ中。該反應可在96孔的培養盤中進行。各孔包含固定數 量之細胞’該細胞係利用抗原/胜肽培養2天。在最後的16至 20小時，則加入用氚標示的胸腺嘧啶〔H3_thymidine〕。接著， 將細胞收集在一濾網上，並洗除含游離放射性之介質，然而 DNA仍黏附在該濾紙上。加入之放射性可藉由閃爍計數器 進行疋里。$用之輸出使係每分鐘多少數量〔cpm〕。 第二點，τ細胞致免疫性係藉由干擾素_ r之ELI 癱 析法檢測： — 酶免疫斑點試驗〔ELIspot〕可對人類血液等生物樣品中 的胜肽專一性或功能性的T細胞進行定量。該分析法的原理在 於I細胞可受胜肽刺激，並由其T細胞受器進行專一性辨識， 且藉由分泌干擾素_r等細胞激素產生反應。該反應可在96孔 的培養盤中進行。該濾紙及培養盤之孔係塗覆具干擾素1專 一性之一種單株抗體〔Mab〕。結果，可分泌干擾素_7的各 細胞形成一干擾素斑點，其可在隨後的一顏色反應中顯出 顏色。利用自動培養盤讀取器計算斑點數量。所得之數量可供 —52 — 1358301 測量該樣品中具胜肽專一性且能分泌干擾素_7的τ細胞出現 頻率。 第三點，進行HLA四聚體/FACS之分析： 第I型HLA四聚體係HLA分子及抗原胜肽的複合物之 Ιΐ解ί組形態，其結合可辨識T細胞之抗原專一性T細胞 受益。藉由使用流式細胞儀及螢光四聚體，將能可靠的計算具 抗原專一性之CD8+T淋巴細胞的數量及定性。該分析法^用'
Beckman Coulter Immunomics 公司的 HLA-A*0201 客製化 iTagTM四聚體，該四聚體並與疫苗之第j型抗原決定部 位形成複合。 若於第4至8次的出診視察顯示明顯的τ細胞反應及在 治療前沒有任何反應時，實驗者將歸類為有反應者。“ 最大的有反應者出現比例〔在第4至8次的出診視察可 顯不出抵抗任何胜肽的反應，即可在該三種τ細胞分析法中任 種为析達到92% ’相較於僅接受生理食鹽水之25個實驗者 的控制組則僅測得25%〕 、 每種胜肽IpeP89、Ipep84及lpepl426之有反應者出現比 例： 本發明之實施例出現抵抗T細胞抗原決定部位之熱區胜 狀Ipep89〔第I型T細胞抗原決定部位〕、Ipep84及Ipepl426 的反應。在4個月的疫苗接種周期後可獲得上述反應。對B 組而言，該疫苗僅包含聚L-精胺酸。對c組而言，該疫苗包 合五種胜肽的混合物，其包含Ipep89、lpej)84及Ipepl426。對 G組而言’該疫苗包含相同於c組之五種胜肽的混合物，再加 上聚L-精胺酸，以做為完整合成的τ細細胞佐劑。表19揭示 控制組Β在ELIspot及HLA四聚體/FACS的分析法中皆無反 應’及全部僅出現3個陽性反應的出診視察。該陽性反應可解 —53—— 1358301 讀為增生分析法巾的偽陽性反應者之出現比例。 在C組中則僅包含胜肽，但不包含聚L_精胺酸，其中！ 個反應者在ELIspot分析法中驗出抗Ipep84的反應，5及4個 反應者分別在增生分析法中驗出抗Ipep84及Ipepl426的反 應’及4個反應者在hla四聚體"Acs的分析法中驗出抗 Ipep89的反應。 最後，G組〔相同於c組之五種胜肽的混合物加上聚l-精胺酸〕則在所有的分析法中顯示出現反應者。最重要的是， 特別具有一致性〔所有三種胜肽〕及持續性〔參照所有陽性 出診視察之數量〕的ELIspot反應，其顯示功能性T細胞係依考 聚L-精胺酸〔做為合成的τ細細胞佐劑〕而變化。 表十九、B、C及G組中之各種胜肽的反應者及陽件反應屮診視窣的數量。 治療 胜肽 REV/REIV 有反應者 n/N(%) 所有斷 反應的出 診視察 N RPII 有反應者 n/N(%) 所有陽性 反應的出 診視察 N RFI 有反應者 n/N(%) 所有陽性 反應的出 診視察 N 疫苗 有反應者 n/N(%) 所有陽性 反應的出 診視察 N B(僅有聚 Ipep89 0 0 __ __ 0 0 0 0 精胺酸） 】pep84 0 0 3 3 __ __ 3 3 Ipepl426 0 0 0 0 _· __ 0 0 c(僅有胜 Ipep89 0 0 __ ’ __ 4 4 4 4 肽） Ipep84 1 1 5 14 — 一 6 15 Ipepl426 0 0 4 9 __ __ 4 9 G(胜狀及 Ipep89 3 5 ·· __ 5 5 5 8 聚精胺酸) Ipep84 3 6 6 11 —— — 8 17 Ipepl426 5 13 5 11 — — 7 17
註：REV/REIV有反應者=ELIspot分析法有反應者〔第I或II型〕； n/N(%)=每胜肽有反應者除以該治療組中所有有反應者的比例 RPII有反應者=T細胞增生分析法有反應者〔僅第II型〕； RFI有反應者=HLA四聚體/FACS分析法有反應者〔僅第I型〕； 疫苗有反應者=任一REV/REIV、RPII或RFI分析法有反應者： 1、 T細胞增生分析法有反應者在lpepl426僅有計算値。 2、 FACS有反應者在IPeP89僅有計算値。 一個案之實施例：G组之實驗者5 下列表廿揭示G組〔5種胜肽+聚L-精胺酸〕中的一特別 實驗者的一連串抽血所得到的干擾素-r ELIspot分析結果。 —54 — 1358301 在弟5次出诊視察’即在第二次疫苗接種後的一個月，已經對 二種第II型抗原決定部位Ipep84、Ipepl426具有反應《在第 二次疫苗接種後，所有的反應達到一峰值，且對第I型抗原決 定部位Ipep89具有反應。再者，在第8次出診視察，即在最 後一次疫苗接種後的三個月’其甚至維持對Ipepl426具有反 應。 表廿、G，之實驗者5的Ipep89 ' Ipep84、Ipepl426之ELIspot全程分枏_。 出診視察 第1次 第3次 第4次 第5次 第6次 第7次 第8龙 Ipep89 0 0 0 0 22 0 〇 Ipep84 0 0 0 18 45 0 〇 Ipepl426 0 0 0 22 92 16 16 參考文獻:
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—57 —
Claims (1)
1358301 本 97.05.13第93120579號申請專利範圍修正本。 .十、申請專利範園： 公告本 1、 一種C型肝炎疫苗，其包含至少一抗原決定部位，該抗雇 ' 決定部位係選自至少三至四種之下列熱區抗原決定部 - 位：KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、 AYAAQGYKVLVLNPSVAAT ' DLMGYIP(A/L)VGAPL ' GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV 及、 HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。 2、 依申請專利範圍第1項所述之c型肝炎疫苗，其中包含下 列抗原決定部位：GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、 CINGVCWTV 及 ΗΜλνΝΡΚΟΙΟΥΙΑΟΙ^ΊΧΡΟΝΡΑ 〇 3、 依申請專利範圍第1或2項所述之c型肝炎疫苗，其中包 含下列抗原決定部位： KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK ° 4、 依申請專利範圍第1或2項所述之c型肝炎疫苗，其中包 含下列抗原決定部位：DLMGYIPAV。 5、 依申請專利範圍第1或2項所述之C型肝炎疫苗，其中包 含下列抗原決定部位：CINGVCWTV。 6、 依申請專利範圍第1或2項所述之c型肝炎疫苗，其中包 含下列抗原決定部位：HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。 7、 依申請專利範圍第1或2項所述之C型肝炎疫苗，其中包 含下列抗原決定部位：GYKVLVLNPSVAAT。 一 .8、依申請專利範圍第1或2項所述之C型肝炎疫苗，其中另 包含一胜肽，該胜肽具的序列，N係 ' 介於3至7的整數，例如5 ; X係帶正電之天然、非天然 的胺基酸殘基；Z係選自下列族群的一胺基酸殘基：[、v、 I、F、W ;而R1及R2係分別獨立的選自下列族群：_H、 •NH2、-COCH3、-COH、含20個胺基酸以上之一胜肽、 一胜肽反應基、含/不含胜肽之一胜肽連接子；X_R2可為 該胜肽之C-端胺基酸殘基之醯胺基、醋基、硫酯基〔“胜 < S). —58 — 1358301 97.05.13第93120579就申諸專利篏圊你B 肽A”〕 9、依申請專利範圍第1或2項所述之c型肝炎疫苗，其中包 含一免疫刺激寡核苷酸分子〔ODN〕，其具有下列分子式 I的緯構：
其中， R1係選自次黃嘌呤〔hypoxanthine〕及尿嘧啶〔〕； 任一X係選自氧Ο或硫S ; 任一NMP係2去氧核普〔2 deoxynucleoside〕之單填酸鹽 〔monophosphate〕或單硫碟酸鹽 〔monothiophosphate〕，其係選自下列族群：去氧腺嘌呤 --核苷-〔deoxyadenosine-〕、去氧鳥糞嘌呤核苷_ 〔deoxyguanosine-〕、去氧次黃嘌呤核苷· 籲 去氧尿嘧啶核苷-〔deoxyuridine-〕、去氧胸腺嘧啶核苷_ 〔 deoxythymidine-〕 、 2-甲基-去氧次黃嘌呤核苷_ 〔2-methyl-deoxyinosine-〕、5·曱基-去氧胞嘧啶核普_ 〔5-methyl-deoxycytosine-〕、去氧假尿嘧啶核苷_ 〔deoxypseudouridine-〕、去氧核糖嘌呤核苷 〔de〇xyrib〇Sepurine-〕、2-胺基-去氧核糖嘌呤核苷_ 〔2-amino_deoxyribosepurine-〕、6-硫-去氧鳥糞嘌呤核苷· 〔6-S-deoxyguanine·〕、2-二曱基-去氧鳥糞嗓吟二‘二· 一 59—— < s)- 1358301 第93120579號申請專利範圍修正本一 〔2-—。一：^ 苷-〔N-isopentenyl_deoxyadenosine〕的單磷酸鹽 丁 7 乂 〔-monophosphate〕或單硫碟酸鹽现 C -monothiophosphate ]； NUC係2·去氧核苷〔2' deoxynucleoside〕，其選自下列於 群·去軋腺嗓吟核苦-〔deoxyadenosine-〕、去氧島糞 核苷_〔deoxyguanosine-〕、去氧次黃嘌呤核苷” 不7 〔deoxyinosine-〕、去氧胞嘧啶核苷-〔deoxycytosine-〕、、去氧尿嘧啶核苷_ 〔deoxyuridine-〕、去氧胸腺嘧啶核普_ 〔deoxythymidine-〕、2-甲基-去氧尿嘧啶核苷- 籲 〔2-methyl-deoxyuridine-〕、5·甲基·去氧胞嘧啶核苷-〔5-methyl-deoxycytosine-〕、去氧假尿嘧啶核苷· 〔deoxypseudouridine-〕、去氧核糖嘌呤核苷 〔deoxyribos印urine-〕、2-胺基-去氧核糖嘌呤核苷_ 〔2-amino-deoxyribosepurine-〕、6-硫-去氧鳥糞嘌呤核苦· 〔6-S-deoxyguanine-〕、2-二甲基-去氧鳥糞嘌呤核苷-〔2-dimethyl-deoxyguanosine-〕或正-異戊基_去氧腺嘌呤 核苷-〔N-isopentenyl-deoxyadenosine〕； a及b係0至100的整數，但a+b係介於4至15〇之間. 麄 及 ，零 B及E係核苷酸分子的5'或3,端的共用官能基 〔“I-/U-ODN”〕。 & 10、 依申請專利範圍第9項所述之c型肝炎疫苗，其中另包含 一氫氧化鋁佐劑〔A12(OH)3〕。 .’、 3 11、 依申請專利範圍第9項所述之C型肝炎疫苗，豆中另包 一聚陽離子胜肽。 ~ 12、 依申請專利範圍第8項所述之C型肝炎疫苗，其中該胜 A 係 KLKL5KLK。 < S) 一 60—— 7年5月13曰修(更)正替換頁 ~~I r I I , . -. ,； · *.·^ίν^Α^ 97.05.13第93120579號申請專利範面、 13、^專利範圍第9 I-/U-ODN 係寡 d(IC)13 分子。 甲 Μ、依，，細第9項所述之c型肝炎疫苗，其中另包含 券去氧核醣核酸，其包含一 CpG主體結構。 15依申5月專利範圍第！或2項所述之 =肝炎疫苗係-料乾燥形式，其可 内重新恢復結構。 3刀經 16 tϋ利範圍第1或2項所述之C型肝炎疫苗，其中包 17、決定部位含量分別介$1〇以至，之間。 ί型1或2項所述之〇型肝炎疫苗，其中該 疫糸進行冷;東乾燥，並包含微量醋酸。 1或2項職之㈣肝炎疫苗，其中該 的减染炎疫田係用以製備一藥劑，以供預防及治療HCV 1 士含，二一 c™，其⑽ 請專利範财1至17撕之至少二 [2] 魏顧定部位，該水包含至少 機酸係選自下列族群：甲酸、醋酸、丙酸、 丁酸及其鹵化或氫氧化形式； =、混合上述已溶解之抗原決定部位；及 [4]、選擇性林絲上麵合之賊蚊部位。
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| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |