TWI357906B

TWI357906B - Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccin

Info

Publication number: TWI357906B
Application number: TW093140145A
Authority: TW
Inventors: David E Junker; Mark D Cochran
Original assignee: Schering Plough Ltd
Priority date: 2003-12-31
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2012-02-11
Also published as: US7585648B2; US20080227156A1; NO20063478L; SG153874A1; ZA200605227B; MXPA06007514A; US7892561B2; WO2005066204A2; CN1902221A; TW200526683A; ECSP066683A; JP2011083290A; US7371726B2; PE20051050A1; US20050143306A1; RU2006127314A; US20090311282A1; AU2004312411B2; CA2551877A1; AU2004312411B8

Description

1357906 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於蛋白質第8生長分化因 E . 儿你關於第8生長为化因子之抗原性胜肽片段，及相關免疫原、疫苗，及處理動物以調節第8生長分化因子之活性的方法。田【先前技術】 ° 第8生長分化因子為一種分類於轉形生長因子^ (transforming growth fact〇卜p; TGF_p)總科之的蛋白質。 -般而言，TGF-β總科之蛋白質最初係以前驅體（㈣前激素）表現，其自該前驅體蛋白質c端約第11〇_14〇胺基酸的鹼性殘基簇處進行蛋白質裂解。在各狀況下，該具活性、或成熟之TGF-β物質據仏為一種經切割之前驅體蛋白質匸端區域之二硫化物連接之二聚體。第8生長分化因子（下文稱GDF8)亦在技術上已知為gdf_ 8或肌肉生長抑制素。吾人已自大範圍之有機體中選殖出編碼GDF8前驅體（下文之”前驅體GDF8")的基因。此等包括人類及鼠科之前驅體GDF8 [Nestor等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 14938-43 ;美國專利第 5,827,733號，其内容以引用之方式全部倂入本文中]。亦已報導GDF8免疫反應性在人類骨骼肌之丨型及2型纖維中均可偵測到。用以偵測GDF8之抗體及分析（例如）揭示於美國專利第 6,096,506號中。已進一步報導如藉由GDF8剔除小鼠所證實（McPherron 等人，1997，Nature 387 : 83-90)，GDF8參與負調節或抑 98360-961102.doc 1357906 制月路肌生長及發育。為此，尤其在畜牧業領域中，早先已、二有嘗忒為増強各種食用動物之生長及/或相對肌肉質 1而負調節GDF8活性之目標來藉由多種方式在動物中調節GDF8活性。例如，美國專利第6,399,3 12號描述一種前驅體GDF8* 因啟動子及分析法，建議用該分析法來識別該啟動子之理論上的抑制劑。美國專利第ό，656,475號描述一種藉由使細胞與一競爭GDF8受體之GDF8前結構域接觸而抑制gDF8對、’田胞作用的方法，且報導成熟GDF82C端可改變。美國專利第6,004,937號描述使用卵泡抑素作為GDF8之可能拮抗劑。此等方法均未在畜牧業領域或臨床應用（無論人類亦或獸醫學）中產生任何實際應用。他人亦已試圖將抗體及疫苗技術用於負調節GDF8功能。諸如，美國專利第6,369,2〇1號[其内容以引用之方式全部併入本文甲]描述胜肽（意即GDF8蛋白之片段）及一種用於引發抗-GDF8抗體的疫苗。該專利亦報導了在經多種經報導GDF8胜肽片段免疫之齧齒動物中相對於對照組未具體說明之生長或增重。亦已描述GDF8之其它生理作用。例如，美國專利第 6’368,597號[其内容以引用之方式全部倂入本文中]已提示例如）藉由對患有Η型糖尿病之患者投與抗-(}1^8抗體或抗-GDF8疫苗，抑制GDF8功能可用於治療此病況。. 然而，此項技術中仍長期需求用於引發抗_gdf8免疫反應之經改良抗原及免疫原，以及能夠高度特異性結合 98360-961102.doc 1357906 GDF8之經改良GDF8抗體。不應將本文中之任何參考文獻之引征解釋為容許此文獻作為本發明之"先前技術"提供。【發明内容】本發明藉由提供包含GDF8之特異中和抗原表位的GDF8 胜肽（例如具有50個或更少殘基的GDF8胜肽片段）解決此項技術中之此等或其它不足。在本發明之一實施例中，吾等提供GDF8胜肽，其包括 (例如）包含天然人類前驅體GDF8(SEQ ID ΝΟ:1)之約第312 殘基至約第36 1殘基的經分離胜肽。較佳地，本發明之 GDF8胜肽包含天然人類前驅體GDF8之約第320殘基至約第 350殘基，更佳包含約第321殘基至約第346殘基且最佳包含約第327殘基至約第346殘基。為方便起見，以單字母及三字母碼將例示之GDF8胜肽（下文中標記為DJ5)連同基於 SEQIDNO:l之前驅體GDF8編號之殘基圖示如下。 _DJ5(SEQIDNO:8)_ 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 VHQANPRGSAGPCCTPTKMS Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 在本發明之另一實施例中，GDF8胜肽視情況包括保守單一胺基酸取代。簡單藉由實例之方式，其可為該胜肽中一個直至至少五個胺基酸位置。在一特殊實施例中，（例如）在GDF8的第327至346殘基之間至少有一個保守胺基酸取代。在另一實施例中，GDF8胜肽於該胜肽中不多於五個胺基酸位置處包括保守胺基酸取代。在另一實施例中，在 GDF8之第327至346殘基之間有兩個保守胺基酸取代。在又一實施例中，在GDF8之第327至346殘基之間有三個保 98360-961102.doc 1357906 守胺基酸取代。在另一實施例中，在GDF8之第327至殘基之間有四個保守胺基酸取代。較佳地’相對於藉由圖2之種間比對之胺基酸變體所標記之天然人類前驅體GDf8(SEq id ΝΟ:1)而言，該等胺基酸殘基取代係處於一或多個位置上。該等位置處於第 328、329、331、333及335殘基及其組合處，其中， (a) 第328胺基酸殘基為His、Leu或Asn ; (b) 第329胺基酸殘基為Gln或Lys ; (c) 第331胺基酸殘基為Asn或Ser ; (d) 第333胺基酸殘基為Arg或Lys;及/或 (e) 第335胺基酸殘基為Ser、Pro或Thr。較佳地’此等經改質之GDF8胜肽包含一抗-GDF8抗體之特異中和抗原表位且因此保持特異性結合抗_GDF8抗體的特性’其中該抗體為如下文中例示之mAb 788及/或山羊抗-GDF8多株抗血清的igG部分。在本發明之另一實施例中，吾等提供編碼上文提及之 GDF8胜肽的核酸分子（意即聚核苷酸）。較佳地，該等核酸分子包括天然存在之人類前驅體 GDF8基因的一段，其為（Genebank編號NM_0059259，人類GDF8基因；SEQ ID N0:2)的約第1112核苷酸至約第 1171核苷酸。此節段編碼如前所述之胜肽DJ5。注意該 NM_0059259記錄包括大量側接實際編碼區域之序列。技術人員亦應瞭解DJ5係對應於GDF8前激素之實際編碼區域的第979-1038核苷酸。 98360-961102.doc 1357906 亦提供包含該等核酸分子之可複製選殖載體，及原核或真核宿主細胞’以及生產GDF8胜肽的方法，其包括培養伯主細胞、表現經編碼胜肽、及回收該胜肽之步驟。技術人員亦應瞭解藉由任何標準、技術已知之化學合成方法亦將很容易生產本發明之GDF8胜肽。在本發明之另一實施例中’亦提供包含本發明之GDF8 胜肽（或其融合蛋白）的疫苗組合物，（例如）其較佳包括以胜肽或蛋白質為主的疫苗組合物的一或多種佐劑及其它技術標準元素。亦提供在動物中引發抗_GDF8免疫反應的方法’其包含對動物投與有效劑量疫苗組合物。在另一實施例中，提供一種自複數種抗體或抗體片段之中選擇一種抗-GDF8抗體或抗體片段的篩選方法，其包含使該胜肽與一或複數個抗體或抗體片段接觸，且偵測選擇性結合該胜肽之抗體或抗體片段。本發明於另一態樣中提供一種負調節動物中GDF8活性的方法。在—此實施例中，該方法包含以有效負調節動物 MDF8活性之劑量及持續時間對該動物投與—種抗體或抗體片段（其中該抗體特異性結合該胜肽），或藉由以本文所述疫苗組合物使動物免疫。該動物較佳為脊椎動物，且更佳為•乳動物、禽類或魚類。較佳地，該哺乳動物為馴養動物(例如’畜牧業中所使用之動物’或者伴侣動物)，然而可視情況為需求負調節GDF8之人。 *本：明亦涵蓋併入本發明之如職肽的融合蛋白。該等融口蛋白可包括信號肽結構域’用以增強GDF8融合蛋 98360-961102.doc 白之分泌或細胞表面表現及/或容許以選擇性結合系統純化。此外，該等融合蛋白經涵蓋以在一種單載體蛋白質中連接一或多個GDF8胜肽以增強GDF8胜肽結構域之免疫抗原性。在一特殊實施例中，本發明之融合蛋白包含一種由 50或少於50個胺基酸殘基組成的GDF8胜肽，該等殘基包含SEQ ID ΝΟ:1之第327至346胺基酸殘基。在一此類型之相關實施例中，該融合蛋白包含此種GDF8胜肽的一抗原亞片段，該GDF8胜肽例如包含來自DJ5(SEQ ID NO:8)之約10個連續胺基酸殘基的GDF8胜肽。該等經比對之胜肽具有下列序列號編號。綠頭鴻(Anas platyrhynchos)(鴨)AAL3 5275 灰雁(Anser anser)(鵝)AAL35276 灰雁(Anser anser)(鶴)AAR18246 特羅斯牛(Bos taurus)(母牛)AAB86687 家犬(Canis familiaris)(犬)AAR14343 (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) 山羊(Capra hircus)(山羊)AAR12161 鴣(Columba livia)(鹤子)AAL35277 小鶴鶉(Cotumix chinensis)(鶴鶴)AAL3 5278 斑馬魚(Danio rerio)(斑馬魚)AAB86693 馬(£9111^〇&匕&11113)(馬)3八816046 (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19) (SEQ IDNO:20) 原雞(Gallus gallus)(雞)AAK18000 原雞(Gallus gallus)(雞)AAR18244 人類(Homo sapiens)(人類)NP-005250. 斑點叉尾鮰(I. punctatus)(餘魚)AAK84666 草兔(Lepus capensis)(野兔)AAN87890 (SEQIDNO:21) (SEQIDNO:22) (SEQIDNO:8) (SEQIDNO:23) (SEQ IDNO:24) _食蟹猴(Macaca fascicularis)(狼)AAL17640 火雞(Meleagris gallopavo)(火雞)AAB86692 金眼狼鱸(Morone chrysops)(白鱸)AAK28707 小家鼠(Mus musculus)(家鼠)AAC531 67 虹鱒(0. mykiss)(鱒魚)AAK71 707 (SEQIDNO:25) (SEQ IDNO:26) (SEQIDNO:27) (SEQIDNO:28) (SEQIDNO:29) 綿羊(Ovis aries)(綿羊)AAB86689 (SEQ ID NO:30) 阿拉伯狒狒(Papio hamadryas)(狒狒)AAB86686 (SEQ ID NO:31) 98360-961102.doc 11 褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)AAB86691 (SEQ ID NO:32) 大西洋鮭魚(Salmosalar)(鮭魚)CAC1 9541 (SEQIDNO:33) ;_(Spams aurata)(海網)AAL05943_(SEQ ID NO:34) S^(Sus scrofa)(豬)AAC08035 (SEQIDNO:35) _野豬(Sus scrofa)(豬)AAR18245_(SEQ ID NO:36) 【實施方式】因此，本發明識別作為對於多株抗-GDF8山羊抗血清及其它某些特異抗-GDF8抗體之特異令和抗原表位的GDF8結構域。此等抗原表位亦用以提供可用於在活體外（例如用於偵測GDF8蛋白）及在活體内（用於負調節GDF8活性）均引發針對GDF8蛋白之活性及特異免疫反應的GDF8蛋白片段。此等片段在本文中一般稱為GDF8胜肽或胜肽片段。此等GDF8胜肽之用途包括用作引發動物中抗-GDF8免疫反應之免疫原，及在GDF 8相關分析中用作高特異抗體結合目標。 GDF8之特異性結合抗原表位係藉由使抗-GDF8抗血清與一組重疊GDF8胜肽接觸，且測定在該等胜肽與抗血清IgG 抗體間之結合活性程度來識別。自經具有最適化表現及抗原性之結構的前驅體GDF8蛋白所免疫的山羊中獲得了該抗· G D F 8抗血清。為更充分地瞭解本發明，提供下列定義。為描述方便使用單數術語絕非意欲進行限制。因此，舉例而言，對包含 "一多肽"之組合物的引用包括對一或多個此等多肽的引用。本文中所用術語"近似"可與術語"大約”互換使用，且表示一數值係在所示數值的百分之二十之内，意即一含有 98360-961102.doc • 12· "近似"50個胺基酸殘基的胜肽可含有在4Q個與的個之間的胺基酸殘基。亦應瞭解，由於此等組‘態、方法步驟及材料可稍作變化’本發明並不限於文中所揭示之特殊組態、方法步驟及材料。亦應瞭解，由於本發明之範疇將僅由附加之申請專利範圍及其等價物限制，因此本文中所使用之術語僅用於描述特殊實施例之目的而並非意欲進行限制。本文中所用術語，，多肽，，可與術語"蛋白質”互換使用，且表示種包含藉由胜肽鍵連接的兩或兩個以上胺基酸的聚合物。較佳地，除非文中另作規定，術語”多肽，，由尺寸或鏈長區別於文中所使用之術語"胜肽"，其中一"胜肽"係指一種具有約五十或少於五十個胺基酸的聚合物鏈，且多肽或蛋白質係指包含多於約50個胺基酸之聚合物鏈。視情況而定’ 一胜肽或多肽可缺少某些經基因或mRNA編碼之胺基酸殘基。例如，基因或mRNA分子可在一多肽^^端編碼一胺基酸殘基序列（意即一信號序列），該胺基酸殘基序列自該多肽分裂且因此可不為最终蛋白質之部分。根據本發明之"GDF8胜肤"為一源自GDF8蛋白之相對較短片段。甚至此等胜肽之亞片段亦可稱為GDF8胜肽。儘管吾專不欲限制本發明之GDF8胜肽之最大尺寸，然該胜肽之最大尺寸較佳為約50個殘基，更佳該最大尺寸為約4〇個殘基’甚至更佳該最大尺寸為約30個殘基，且仍更佳該最大尺寸為約25個殘基。更一般而言’ GDF8胜肤之尺寸範圍較佳在約10至約50個胺基酸殘基長度内，更佳為約15至約 98360-961102.doc 13 1357906 3 0個胺基酸殘基，且尤其為約20個胺基酸殘基之長度。作為本發明之其它GDF8胜肽之較小亞片段的GDF8胜肽（例如一包含來自DJ5(SEQ ID ΝΟ:8)之約10個連續胺基酸殘基的 GDF8胜肽）較佳包含一來自較大GDF8胜肽的抗原部分（例如一抗原表位）。在一特殊實施例中，GDF8胜肽包含一對於經天然存在之人類GDF8前驅體（SEQ ID ΝΟ:1)之第327-346殘基編號 (SEQ ID ΝΟ:8)所定義之胜肽具有約50%至100%同源性範圍内之同源程度的胜肽結構域。上文所標明之同源性變異較佳為保守取代及/或保留由特定特異抗-GDF8抗體特異性識別之本發明抗原結構的變異《此等保守取代表示藉由種間同源比較（例如參見圖2)顯示以保存GDF8功能之殘基取代及/或表示在具有類似化學（例如人體的）與電子結構之胺基酸間的殘基取代，因而其保存及/或最適化本發明之 GDF8胜肽的抗體結合特異性。此等保守胺基酸取代之實例包括：以諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或曱硫胺酸之一疏水殘基置換另一殘基，或以等量電荷之一極性殘基置換另一殘基，例如精胺酸取代離胺酸，麩胺酸取代天冬胺酸，或麩醯胺酸取代天冬醯胺酸。詳言之，根據本發明之GDF8胜肽亦將包括一抗-GDF8抗體之特異中和抗原表位，意即一將特異性結合經以下實例描述之PGA抗-GDF8 IgG多株抗體，及/或特異性結合市售大鼠單株抗體（nmAb")目錄號MAB788(R&D Systems Inc.， Minneapolis，MN)的抗原表位或抗原區域。 98360-961102.doc -14- 1357906 本文中所用術語"經純化，，或"經分離"係指於減少或去除非相關材料（意即污染物）存在的狀況下分離的材料，該等非相關材料包括自其獲得該材料之原生材料。例如，經純化或經分離之蛋白質較佳不含可於一細胞内發現的其它蛋白質或核酸。經純化之材料可含有少於約50%、較佳少於約75%、且最佳少於約9〇%與其最初相關之細胞組份。可藉由層析、凝膠電泳、免疫分析、組份分析、生物分析及其它此項技術中已知之方法評估純度。自-功能態樣，根據本發明之經分離GDF8胜肽為一種自包括前驅體gdfs蛋白及/或成熟GDF8蛋白在内的其它材料中充分分離之胜月太’以使得能夠引發對（}1)178胜肽特異之免疫反應。純化方法於此項技術中為人所熟知。例如，可藉由沉澱、層析、超速離心及其它方式純化核酸。可藉由包括 (並無限制）製備型圓盤凝膠電泳、等電聚焦、HPlc、逆相 HPLC、凝膠過濾、離子交換及分配層析、沉澱及鹽析岸析、萃取及逆流分配在内的各種方法純化蛋白質及多狀以及胜肽。為此目的，較佳在其中蛋白質包含一段有助於純化之額外序列標記的重組系統中產生多肽，該額外序列諸如但並不限於一聚組胺酸序列或一特定性結合一種抗體 (諸如FLGA®及GST)的序列。接著可藉由層析法於—種適當固相基質上自宿主細胞之粗溶胞產物中純化該多狀。或者’可將針對該多肽產生之抗體或其結合片段用作純化試劑。術語"實質上純的"表明使用此項技術中已知之習知純化 98360-961102.doc •15- 1357906 技術可達成之最高純度，且意謂不含其它源自原始來源有機體或重組DNA表現系統之雜質蛋白、核酸及其它生物分子的核酸、多肽、胜肽、或其它材料。實質純度可藉由標準方法分析且通常將超過至少約75%，較佳為至少約 90%，更佳為至少約95%且最佳為至少約99%之純度。可進行基於質量或莫耳濃度之純度評估。 ”聚核苷酸"或"核酸分子"為包含核苷酸之分子，其包括但不限於RNA、cDNA、基因組DNA及甚至合成DNA序列。亦預期該等術語涵蓋包括DNA及RNA之任何此項技術已知之驗基類似物的核酸分子。 ’’載體"或"複製載體”為諸如質體、噬菌體、或黏接質體之複製子，另一DNA節段可連接或倂入於其上以達成所連接節段之複製。該術語亦包括一種包括所討論之經倂入或經連接之DNA片段在内的複製子。可用於本發明中之載體包括微生物之質體、病毒、噬菌體、可整合DNA片段及其它可有助於將核酸整合至宿主基因組中之媒介物。質體為最常用之載體形態，但是所有其它提供等同功能且在此項技術中已知或變為已知之載體形態均適用於本文中。參見（例如）P〇uwels等人，Cloning Vectors: A Laboratory Manual，1985及增補，Elsevier, N.Y.，及 Rodriguez等人（主編），Vectors : A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston，MA。當編碼本發明GDF8胜肽之DNA及一載體之末端均包含相容之限制性位點時，很容易達成將該編碼本發明GDF8 98360-961102.doc -16- 1357906 胜肽之DNA插入至該載體中。若此不能夠完成，則有必要藉由消化經限制型内切核酸酶切割生成之背面單股DNA突出端而改質該DNA及/或載體之末端以產生鈍端，或藉由以適當DNA聚合酶填充該單股末端達成相同之結果。或者，（例如）可藉由將核苷酸序列（連接子）接合至末端上來生成所要之位點。此等連接子可包含定義所要限制位點之特異寡核苦酸序列。亦可經由使用聚合酶鏈反應（pcR)生成限制位點。參見（例如）Saiki等人，Science 239 : 487(1988)。若需要，則亦可藉由均聚加尾改質經切割之載體及DNA片段。本發明中所使用之重組表現载體通常為包含編碼一種本發明之GDF8胜肽的自我複製罐或舰構築，通常將該胜肽可操作地連接至能約在相容宿主細胞内調節核酸表現的適當基因控制元件上。基因控制元件可包括原核啟動子系統或真核啟動子表現控制系統，且通常包括轉録啟動子、控制轉録起始之可選操縱子、為提昇W表現程产之轉録強化子、編碼適當核糖體結合位點之序列、及^ 轉録及轉譯作用之序列。表現載體亦可含有一容許… 獨立於宿主細胞進行複製的複製起點。 °〆編碼本發明GDF8胜肽之核酸之表現㈣可^知在原核或真核細胞任一者中進行。序列，，或特殊蛋㈣或胜狀"編碼序列"為— 進行轉錚及韓嗖占也夕 ' 體卜或，舌體内仃轉錄及轉澤成為多肽之魏序列。編媽序列之邊界係 98360-961102.doc 1357906 以5'端處之啟動密碼子及3'端處之轉譯終止密碼子決定。編碼序列可包括但不限於：原核序列、來自真核mRNA之 cDNA、來自真核（例如哺乳動物）DNA之基因組DNA序列、及甚至是合成DNA序列。轉錄終止序列通常位於編碼序列之3'端處。本文中所用術語”融合蛋白”及"融合胜肽”可互換使用，且包含"嵌合蛋白及/或嵌合胜肽”及融合内含肽蛋白/胜肽”。融合蛋白包含本發明GDF8胜肽之至少一部分，其中本發明GDF8胜肽係經由一胜肽鍵與另一蛋白之至少一部分相連接的。例如，融合蛋白可包含標記蛋白或胜肽，或有助於本發明GDF8胜肽之分離及/或純化及/或抗原性的蛋白或胜肽。GDF8融合蛋白可包含非GDF8蛋白之至少一部分，該非GDF8蛋白係經由一胜肽鍵與GDF8多肽之至少一部分相連接的。在較佳之實施例中，GDF8之一部分具有功能性，意即保持其抗原性。非GDF8序列可為GDF8序列之胺基端或叛基端。編碼此種融合蛋白的重組DNA分子包含一編碼與GDF8 編碼序列以順讀方式連接之非GDF8蛋白之至少一部分的序列，且較佳在該GDF8序列與非GDF8序列間之接合點處或靠近該處可編碼特異蛋白酶（例如凝血酶或第十因子 (Factor Xa))的切割位點。在一特定實施例中，該融合蛋白係於CH0細胞中進行表現。藉由使用對該融合至GDF8胜肽中之蛋白及/或標記具有特異性之親和管柱，此融合蛋白可用來分離本發明GDF8胜肽。舉例而言，接著藉由使用 98360-961102.doc -18· 1357906 諸如上文提及之蛋白分解酶及切割位點自該融合蛋白中釋放出經純化之GDF8胜肽。在一此實施例中，可製備嵌合GDF8胜肽，（例如）麩胱甘肽硫轉移酶（GST)融合蛋白、麥芽糖結合蛋白（MBp)融合蛋白、或聚組胺酸標記之融合蛋白以用於在任何細胞或者在無細胞系統中之表現。例如’ GST結合共棘至固態載體基質上之麩胱甘肽，MBP結合麥芽糖基質，且聚組胺酸螯合Ni螯合载體基質。以適當緩衝液，或藉由以對通常在 GDF8胜肽與如下例示之融合搭配物（例如QST、、 FLAG®)或如前所述之聚組胺酸之間設計的切割位點特異的蛋白酶處理，可自特定基質中溶離出該融合蛋白。本文中所用”異源性核苷酸序列"為一核苷酸序列，其係藉由重組方法添加至本發明之核苷酸序列中以生成不在自然界中天然生成的核酸。此等核酸可編碼融合（例如嵌合）蛋白。因此該異源性核苷酸序列可編碼含有調節及/或結構特性的胜肽及/或蛋白。在另一此實施例中，該異源性核苷酸序列可編碼蛋白或胜肽，其於表現該重組核酸之後充當一種偵測由本發明之核苷酸序列所編碼之蛋白或胜肽之構件的功能。在另一實施例中，該異源性核苷酸序列可充當一種偵測本發明之核苷酸序列之方式的功能。一異源性核苷酸序列可包含包括限制位點、調節位點、啟動子及其類似物的非編碼序列。一"宿主細胞"為一種暫時性或永久性地含有或能夠含有及表現外源核酸分子的細胞。當已將外源性DNA引入至一 98360-961102.doc 1357906 細胞膜内時，該細胞已藉由此外源基因進行"轉形"。外源性DNA可經或可不經整合（共價連接）至組成該細胞之基因組的染色體DNA内。舉例而言，在原核生物及酵母菌中，該外源性DNA可保持在諸如質體之游離型元件上。就真核細胞而言，經穩定轉形之細胞為其中外源性DNA已變為整合至染色體中以便由子細胞藉由染色體複製所繼承者。藉由該真核細胞建立包含含有外源性DNA之子細胞群體的細胞株或細胞純系的能力證實此穩定性。原核生物包括革蘭氏陰性及陽性有機體，例如大腸桿菌 (Ε· coli)及枯草桿菌（Β. subtilis)。高等真核細胞包括來自動物細胞之經建立組織培養細胞株，該等動物細胞包括非哺乳動物源（例如昆蟲細胞及鳥類）與哺乳動物源（例如人類、靈長動物及齧齒動物）兩者。原核宿主載體系統包括對於眾多不同物種之廣泛多種載體。本文中所用大腸桿菌（E. coli)及其載體一般將用以包括在其它原核生物中所使用之等同載體。用於擴增DNA之代表性載體為pBR3 22或其眾多衍生物。可用來表現 GDF8、及/或GDF8胜肽之載體包括但不限於：彼等含有 lac啟動子（pUC-系列）；trp啟動子（pBR322-trp) ; Ipp啟動子 (pIN-系列）；λ-ρΡ 或pR啟動子（p〇TS);或諸如 ptac(pDR540) 之雜合啟動子者。參見Brosius等人，"Expression Vectors Employing Lambda-, trp-，lac-，and Ipp-derived Promoters"，在 Rodriguez and Denhardt(主編)Vectors : A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses » 1988 » Buttersworth > Boston » 98360-961102.doc •20- 第205-236頁中β 酵母以及高等真核組織培養細胞為用於重組生產本發明之GDF8胜肽及/或抗-GDF8抗體及/或彼等抗體之片段的較佳宿主。儘管可使用包择桿狀病毒（bacui〇virus)表現系統在内的任何高等真核組織培養細胞株，然較佳為哺乳動物細胞。此等細胞之轉形或轉染及增殖已成為常規程序。可用之細胞株實例包括人類子宮頸癌細胞（HeLa)cell、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株、鼠嬰腎（BRK)細胞株、昆蟲細胞株、鳥類細胞株、及猴（COS)細胞株。此等細胞株之表現載體通常包括（例如）複製起點、啟動子、轉譯起始位點、RNA剪接位點（若使用基因組DNA)、聚腺苷化位點及轉録終止位點。此等載體亦通常含有選擇基因或放大基因。適當之表現載體可為載有衍生自（例如）诸如腺病毒、SV40、小病毒、牛殖病毒、或巨細胞病毒來源之啟動子的質體、病毒、或反轉録病毒。適當表現載體之代表性實例包括pCR®3_l、pCDNAl、pCD [Okayama等人，Mol. Cell Biol. 5 : 1 136(1985)]、pMClneo Poly-A [Thomas 等人，Cell 51 ： 503(1987)]、pUC19、pREP8、 pSVSPORT及其衍生體，及諸如pAC 373或pAC 610之桿狀病毒載體。通常所使用之原核表現控制序列包括啟動子，其包括彼等衍生自β·内醯胺酶及乳糖啟動子系統[Chang等人， Nature，198 : 1056(1977)]、色胺酸（trp)啟動子系統 [Goeddel等人，Nucleic Acids Res. 8 : 4057(1980)]、XPL啟 98360-961102.doc -21 - 1357906 動:系統[shimatake等人，㈣㈣，m : i28(i9川]及加啟子[以 B〇er等人，Pr〇c. Natl. Acad. Sci· USA 292 : 128(1983)]者。含有此等控制序列的大量表現載體均係此項技術中已知且可市售獲得。可操作性連接，，係指元件之排列，其中經此描述之組份係、星配置以便執仃其慣常功能。因此，可操作性連接至一、.扁碼序列上之控制元件有能力實現該段編碼序列之表現。〇等控制元件毋而與編碼序列批鄰，只要它們執行功能來引導其表現即可。因此，舉例而言，可在啟動子與編碼序列之間存在介人之非經轉譯但經轉録序列，且仍可認為該啟動子”可操作性連接"至該編碼序列上。本發明亦包括特異性結合本發明之GDF8胜肽的多株及單株(mAb)抗體。本文中所用術語”抗體"係指免疫球蛋白及/或其片奴。天然發生之免疫球蛋白係由一或多種實質上經免疫球蛋白基因編碼之多肽組成。公認之免疫球蛋白基因包括〖、人、。1”、§、£及以亙定區基因，以及無數種免疫求蛋白可區基因。根據本發明之_或多種抗體亦涵蓋抗體片段’意即抗原結合片段，例如&、、及 F(ab )2，經。又汁之單鏈結合蛋白（例如⑽等人，

Natl. Acad. Sci. U.S.A.，85，5879-5883(1988)及 Bird 等人’ Science ’ 242 ’ 423-426(1988) ’據此以引用的方式全部倂入本文中，以及雙功能雜合抗體（例如Lanzavecchh等人，Eur. J. Immun〇1. 17, 1〇5(1987))。[一般參見 H〇〇d 等人，Immunology，Benjamin，Ν γ，第二版（1984)， 98360-961102.doc •22· 1357906

Harlow及 Lane，Antibodies. A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab〇rat〇ry(1988)及 HunkapiUer 及 Hood，

Nature，323，15-16(1986)，其所有内容以引用的方式全 _ 部倂入本文中。] 例如，可直接使用自使用標準方法經本發明之〇〇1?8胜肽免疫之動物中產生的血清，或可使用血漿分離交換術或以諸如IgG特異性吸附劑（諸如經固定之蛋白a或蛋白G)進灯吸附層析法的標準方法自血清中分離出Ig(}部分。或者，可製備單株抗體，及視情況衍生自此等mAb之抗原結 _ 合片段或重組結合蛋白。可視情況藉由技術中已知之方法將此等大鳥MAb或其片段人源化。藉由熟知之技術生成產生選擇性結合本發明之GDF8胜肽之mAb的融合瘤細胞。通常，該方法包括一永生化細胞株與產生所需抗體之B-淋巴細胞的融合。或者，可使用生成永生抗體生產細胞株的非融合技術，例如病毒誘導轉形 [Casali 等人，Science 234 : 476(1986)]。永生化細胞株通常為經轉形之哺乳動物細胞，尤其為齧齒動物、牛及人源馨* 之骨髓瘤細胞。為了方便及實用性起見，最經常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。自注射以抗原的哺乳動物中獲得抗體生成之淋巴細胞的技術為人所熟知。大體上，若採用人源細胞則使用外周血液淋巴細胞（PBL)，或使用來自非人類哺乳動物來源的脾細胞或淋巴結細胞。將一宿主動物注射以重複劑量之純化抗原（在活體外敏化人類細胞）’且使該動物生成在為與永 98360-961102.doc •23- 1357906 生細胞株融合而被收穫之前的所要抗體產生細胞》融合技術亦在此項技術中為人所熟知，且一般而言包括使該等細胞與諸如聚乙二醇之融合試劑混合。藉由諸如HAT(次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷）選擇法之標準程序選擇融合瘤細胞。使用諸如西方墨點法、ELIS A(酶聯免疫吸附分析法）、RIA(放射免疫分析）或其類似方法之標準免疫分析法來選擇彼等分泌所要抗體者。使用標準蛋白純化技術[Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]自介質中回收抗體。眾多參考文獻可用來提供應用上文技術之指導[Kohler等人，Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) ； Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (El sevier, Amsterdam, 1985) ； Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984) ； Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications(CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]。亦可使用熟知之噬菌體庫系統生成單株抗體。參見（例如）Huse等人，Science 246: 1275(1989); Ward等人，Nature，341 : 544(1989)。可藉由免疫親和層析使用如此所生產之抗體，無論多株的還是單株的，（例如）以藉由熟知之方法結合至固體載體上之固定形態來純化GDF8胜肽。亦可使用針對該等GDF8胜肽之未經標記或經標準方法 98360-961102.doc -24- 1357906 標記的抗體作為免疫分析之基礎以偵測或定量GDF8。所使用之特殊標記物將視免疫分析之類型而定。可使用之標記物實例包括但不限於：放射性標記，諸如32P、I25〗、3h 及14C;螢光標記物，諸如螢光色素及其衍生物、薔薇紅及其衍生物、丹醯基及傘形花内酯；化學發光劑，諸如榮光素及2，3 -二氫呔嗪基二酮；及酶，諸如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、溶菌酶及葡萄糖_6_磷酸脫氫酶。可藉由已知方法以此等標記物標記抗體。例如，可使用諸如搭、碳化二醯亞胺、二馬來醯亞胺、醯亞胺酯、號轴醯亞胺、雙偶氮化聯苯胺（benzadine)及其類似物之偶合劑來以螢光、化學發光或酶標記物標記該等抗體。相關之普遍方法在此項技術中為人所熟知且例如描述於

Immunoassay : A Practical Guide，1987，Chan(編），Academic

Press，Inc·，Orlando，FL·中。此等免疫分析可實施（例如）於受體純化期間所獲得之片段。亦可使用本發明之抗體來識別在表現選殖系統中表現 GDF8相關多肽的特殊cDNA純系。亦可使用對受體之配位基結合位點特異的中和抗體作為拮抗劑（抑制劑）來阻斷或負調節GDF8功能。藉由常規實驗可很容易識別出此等中和抗體’如由下文所提供之實例例示。使用完全抗體分子或諸如Fab、Fc、F(ab)2及Fv片段之熟知的抗原結合片段可達成GDF8活性之拮抗作用。此等片段之定義可如上文所述，或（例如）於Klein，lmmunol〇gy(John

Wiley ’ New York，1982) ; Parham，第 14 章，於 Weir 主編 98360-961102.doc ·25· 1357906

Immunochemistry，第 4版（Blackwell Scientific Publishers， Oxford，1986)中發現。亦已述及抗體片段之使用及生成，例如：Fab 片段[Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]、Fv片段[Hochman 等人，Biochemistry 12: 1130(1973); Sharon等人，Biochemistry 15 : 1591(1976) ; Ehrlich等人，美國專利第 4,355,023號]及抗體半分子（Auditore-Hargreaves，美國專利第4,470,925 號）。製備基於已知抗體重鏈及輕鏈可變區序列之重組Fv 片段的方法進一步已（例如）由Moore等人（美國專利第 4,642,334號）及由 Pliickthun [Bio/Technology 9 : 545(1991)] 描述。或者可藉由標準方法化學合成它們。本發明亦包括使用前述抗體作為抗原生成的多株及單株抗獨特型抗體。此等抗體係有用的’原因在於其可模擬配位體之結構。胜肽合成由於本發明之GDF8胜肽（例如下文中例示之DJ5胜爿太）才目對較短（例如，較佳為50個胺基酸殘基或更少），因此其 4 藉由技術上已知之胜肽合成方法製備。使用固相、液相、或胜肽縮合技術、或其任意組合之熟知技術所製備的合成胜肽或多肽可包括天然及非天然胺基酸。用於胜肽合成之胺基酸可為具有MerriHeld [J. Am. Chem. Soc.，第85卷第 2 149-2154頁（1963)]之原始固相程序的標準脫保護、中和、偶合及清洗方案的標準Boc(Na-胺基經保護第=> ^ Τ 氧基羰基）胺基酸樹脂，或首先由Carpino及Han [J. 〇

rS 98360-961102.doc -26- 1357906

Chem.，37 : 3403-3409( 1972)]描述之鹼性可變Να-胺基經保護9-第基甲氧基幾基（Fmoc)胺基酸。Fmoc及Boc Να-胺基經保護胺基酸均可獲自Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、 Bachem、或Peninsula Labs或彼等實施此項技術者熟悉之其它化學品公司。此外，本發明之方法可使用彼等熟習此項技術者熟悉的其它Να-保護基團。固相胜肽合成可藉由彼等實施此項技術者熟悉之技術達成且提供（例如）於 Stewart 及 Young，SOLID PHASE SYNTHESIS，第二版， Pierce Chemical Co.，Rockford，111.(1984) ; Fields 及 Noble > Int. J. Pept. Protein Res. 35 ： 161-214( 1990)中，或使用諸如售自 ABS [Applied Biosystems，850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404 USA]之自動合成儀。因此，本發明之GDF8胜肽可包含D-胺基酸、D-胺基酸與L-胺基酸之組合、及各種”設計體"胺基酸（例如β-甲基胺基酸、Ca-曱基胺基酸、及Να-甲基胺基酸，等等）以傳送特定性質。合成胺基酸包括對於離胺酸之鳥胺酸、對於苯丙胺酸之氟苯丙胺酸、及對於白胺酸或異白胺酸之正白胺酸。此外，藉由在特定偶合步驟分配特定胺基酸，可生成 a-螺旋、β轉折、β折疊、γ-轉折、及環形胜肽。抗-GDF8抗血清本發明之方法包括一種篩選針對多株抗-GDF8抗血清之 GDF8胜肽的方法。此方法識別某些抗-GDF8抗體以高特異方式與之結合之抗原表位。藉由以前驅體GDF8免疫動物 98360-961102.doc -27- 1357906 獲得了該抗-GDF8抗血清。對前驅體GDF8基因進行修飾以提供表現及免疫性最適化之形態。例如，為哺乳動物及病毒表現系統中之表現而最適化了 GDF8前激素之天然DNA 序列（SEQ ID NO:2)。此外，做出改造以避免病毒宿主關閉機制之負效應。通常，病毒宿主關閉基質包括轉録控制、RNA穩定性（剪接）等等。此等改造使核酸具有更少宿主相似性及更多病毒相似性。進一步，該DNA序列較佳經設計以盡可能地異於哺乳動物核酸序列。例如，使用酵母偏好密碼子反轉譯前驅體 GDF8之胺基酸序列。檢視了所得序列保持其對人類GDF8 核酸序列之同源性的密碼子。有可能時，此等密碼子經編碼相同胺基酸的次最偏好酵母密碼子取代。

所得最適化基因（SEQ ID NO:3)可表現在任何適當宿主系統中，包括（例如）技術已知之昆蟲、°甫乳動物、細菌、病毒及酵母表現系統。例如，諸如桿狀病毒系統之昆蟲細胞表現系統為技術上已知的且（例如）由Summers及Smith， Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555( 1987)描述。桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法可以套組形式尤其講自Invitrogen，San Diego Calif.("MaxBac"套組）。同樣地，細菌及哺乳動物細胞表現系統為此項技術中所熟知且（例如）由Sambrook等人 (MOLECULAR CLONING ： A LABORATORY MANUAL ； DNA Cloning，第I及II卷；D. N. Glover編）描述。酵母表現系統亦為技術中已知且（例如）由YEAST GENETIC 98360-961102.doc -28- 1357906 ENGINEERING (Barr等人編 ’ i989)Butterworths，London 描述》眾多其它此等表現系統均為技術已知且可以套組形式購得。如本文中所例示，經修飾之前驅體GDF8基因 (SEQ ID NO:3)表現於 Flp-In™ CH〇表現系統（Invitr〇gen， Carlsbad，CA)中，其由下文實例1作更詳細描述。前驅體GDF8蛋白及成熟GDF8蛋白之胜肽可倂入至任何蛋白相容性或胜肽相容性疫苗組合物中。此等疫苗組合物在技術上為人所熟知且包括（例如）生理相容性緩衝液及鹽水及其類似物，以及下文中更詳述之佐劑。該包括前驅體 _ GDF8蛋白之疫苗組合物係用於引發用於篩選及識別對於抗-GDF8抗體特異之中和抗原表位的抗血清。如本文中所例示，將由包含SEQ ID n〇:3之載體表現的經純化前驅體GDF8蛋白在包括i g經乳化至弗氏（Freund，s) 完全佐劑（CFA)中之前驅體GDF8蛋白的疫苗組合物中注射至一山羊内。該疫苗組合物較佳經皮下方式（sc)注射至山羊外皮下。較佳隨後加強免疫。可於適當額外時間間隔以相同或經減少劑量之蛋白投用加強免疫，例如於最初注射鲁後2-5週範圍内之時間間隔。自最初注射之後約兩週開始，但較佳自更長時期（例如自一至十五週或更久）之後開始，根據需要自經免疫之動物中收集▲清。接著較佳藉由習知免疫球蛋白純化程序以適當之配位體純化及/或分級分離所收集之血清，該等純化程序諸如蛋白A-瓊脂糖凝膠、蛋白G·瓊脂糖、經雄灰石層析、凝夥電泳、透析、或親和層析。如本文中所例示， 98360-961102.doc •29- 1357906 在蛋白-G瓊脂糖管柱上進一步分級分離血清之IgG部分。如藉由下文之實例3中所更詳細描述，該抗-GDF8抗血清IgG部分即可供篩選成熟GDF8之胜肽範圍。 GDF8結合抗原表位將適當抗-GDF8單株或多株抗體與GDF8蛋白接觸一段足以使該抗體選擇性結合至該蛋白上的時間。其後，GDF8 生物分析證實了該抗體實質上中和了所有GDF8蛋白活性。儘管任何GDF8生物分析法均可用於此種目的，然如藉由下文中實例3所例示，較佳為根據Thies等人，2001， (Growth Factors 18，25 1)之活體外轉録激活分析法。大體上，可用作本發明之抗原或結合抗原表位的GDF8 胜肽包括GDF8(SEQ ID ΝΟ:1)之約第312殘基至約第361殘基。詳言之，根據本發明之胜肽包括GDF8(SEQ ID ΝΟ:1) 之約第320殘基至約第350殘基。該胜肽較佳包括 GDF8(SEQ ID ΝΟ:1)之約第327殘基至約第346殘基。技術人員應瞭解可很容易修飾本發明之GDF8胜肽以包括至少一處保守胺基酸取代，且於任何位置。較佳地，該胜肽特異性結合如下文例示之大鼠單株抗體788。此等保守取代可包括（例如）於第328、329及335殘基及其組合處之變異，其中第328胺基酸殘基為His、Leu、Asn或Val ;第 329胺基酸殘基為Lys或Leu ;且第335胺基酸殘基為Ser或 Pro或Thr。如圖2所示，前驅體GDF8第328、329及335殘基在GDF8蛋白序列交叉物種間變化，但儘管如此，成熟 GDF8仍有功能性。 98360-961102.doc -30- 1357906 圖1說明GDF8活性區（其形成成熟蛋白）在其前驅體蛋白之全序列内容中的圖譜。該GDF8活性區圖譜上之疊合部刀為七個重疊胜肽的位置。此等重疊胜肽經設計以提供識別一或多個GDF8之抗體結合抗原表位之目標。由所例示山羊抗-GDF8抗血清之IgG部分作為對於所例示抗血清之 GDF8唯一顯著結合抗原表位進行篩選而識別出標記為dj5 之胜肽。此胜肽具有一段對應於前驅體GDF8(SEq⑴ NO: 1)之第327殘基至第346殘基的序列（SEQ ID NO:8)。 GDF8胜肽疫苗組合物較佳將上述GDF8胜肽調配至疫苗組合物中。可採用此等疫苗組合物來免疫一動物以引發高特異性抗_GDF8免疫反應。免疫作用之結果將在該經免疫之動物中負調節 GDF8功能。此等疫苗組合物在此項技術中為人所熟知且包括（例如）生理相容性緩衝液、防腐劑及鹽水及其類似物，以及佐劑。 "佐劑”為非特異地增加對特定抗原之免疫反應、因此減乂、為產生對所討論抗原之充分免疫反應而在任何給定疫苗中之所需抗原量及/或所需注射頻率的試劑。用於動物接種之適當佐劑包括但不限於：佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇單甘油酯及單硬脂酸鋁）；弗氏完全或不完全佐劑；礦物凝膠，諸如氮氧化鋁、磷酸鋁及礬；界面活性劑’諸如十六烧基胺、十八院基胺、溶血卵填脂、二曱基雙十八统基演化銨、N，N-雙十八烧基-Ν'，Ν.'-雙（2-經曱基）丙二胺’甲氧基十六烷基甘油及普朗尼克（plur〇nic)多醇； 98360-961102.doc •31 · 1357906 聚陰離子，諸如哌喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸及聚羧乙烯（carbopol);胜肽，諸如胞壁醯二肽、二甲基甘胺酸及吞噬刺激素；及油乳液。亦可在倂入至脂質體或其它微載體中之後投與蛋白或胜肽。關於佐劑之咨訊及免疫分析之各種態樣係揭示於（例如）p. Tijssen，Practice and The〇7 of Enzyme ImmunoassayS，第 3版，1987，,

York中之叢書，其以引用的方式倂入本文中。該疫苗組合物包括足量所要免疫原（諸如本發明之GDF8 胜肽）以引發一免疫反應。投藥量相對於動物重量可在約 0-0001 g/kg至約〗·〇 g/kg範圍内。很容易採用任何適當脊椎動物來獲得多株抗血清。較佳該動物為哺乳動物，且包括但不限於：齧齒動物(諸如小鼠、大鼠)、兔類、馬類、犬科動物、科動物、牛科動物、綿羊科動物（例如山羊及綿羊）、靈長動物（例如冑、大型猿類及人類）及其類似物種0 可很容易藉由包括靜脈内 . 腹膜内-

内（尤其對於家禽）、及/或口服在内的任何標準途徑投與疫苗。對於魚類，投與疫苗組合物或免疫原組合物之方包括前述’以及將魚浸入至包含一定抗原濃度之胜肽的 I，當魚短暫地脫離水時以—定抗原濃度之胜肤喷塗魚，等等。技術人員應、瞭解較佳適當調配該疫苗組合物適於备類型之受試動物及投藥途徑。 · 適當之動物對象可包括彼等野生動物、畜養動物（例為肉、乳、乳酪、蛋、皮毛、皮革、羽毛及/或羊毛而 98360-961I02.doc -32- 1357906 養）、負重畜類、研穿叙从 " 九動物、伴生動物、以及彼等為物園中飼養者、辟^ 野生捿息動物及/或馬戲團動物。在— 實例中胃動物為諸如大獲獲之大型猿類，或為人。、 —較佳實施例中，該動物為"產食"動物，且相對於 :工免疫之動物，免疫作用之結果會使動物體重增加尤其為肌肉質量。為達成本發明之目的，應瞭解術語”產食”動物包括所有為人. ^ 類及7或其它動物消費或為生產諸如蛋或礼之4費而養瘦之動物。此等動物之非限制清單包括禽類（例如雞、火雞、鴨、鵝、鴕鳥）、牛（例如食用牛/犢牛乳牛月種牛、水牛）、豬（例如肥豬或肉豬）、羊（例如山羊或綿羊）、馬類（例如馬）以及包括甲殼類動物及魚類 (諸如鱒魚或鮭魚）之水生動物，及其它為人類消費而飼養或捕獲之物種。為達成本發明之目的，應瞭解術語，，魚類"未加限制地包括：真骨（Teleosti)魚類，意即硬骨魚類。鮭目 (Salmoniformes)(其包括鮭科（Salm〇nidae))及鱸目 (Perciformes)(其包括棘臀魚科（Centrarchidae))均包含在真骨魚類中潛在之魚類受域者之實例包括鮭科（Salm〇nidae)、態科 (Serranidae)、鯛科（Sparidae)、慈鯛科（Cichlidae)、棘臀魚科（Centrarchidae)、三線雞魚（parapristip〇ma trilineatum)、及藍眼豹魚（Plecostomus spp)。 98360-961102.doc •33- 1357906 鮭科分類名常用名 Coregonus clupeaformis 緋形白鮭 Coregonus hoyi 霍氏白鮭 Oncorhynchus keta 狗鮭 Oncorhynchus gorbuscha 粉紅鞋； Oncorhynchus kisutch 銀鞋:(銀鞋） Oncorhynchus masou 櫻花鉤吻鮭(鱒鮭） Oncorhynchus nerka 紅鮭 Oncorhynchus tshawytscha (國王鮭） Prosopium cylindraceum 真柱白鮭 Oncorhynchus clarki 克氏鱒 Oncorhynchus mykiss 虹缚 Salmo salar 大西洋鮭 Salmo trutta 褐鱒 Salmo trutta X S. fontinalis 石斑雜合鱒 Salvelinus alpinus 北極嘉魚 Salvelinus confluentus 強壯紅點鮭 Salvelinus fontinalis 溪鱒 Salvelinus leucomaenis 曰本嘉魚(白斑點嘉魚） Salvelinus malma 花羔紅點鮭(宮邊紅點嘉魚） Salvelinus namaycush 湖蹲 Thymallus thymallus 茴魚缩科部分成員分類名常用名 Centropristis ocyurus 岸海鱸 Centropristis philadelphicus 岩海鱸 Centropristis striata 黑海鱸 Diplectrum bivittatum 侏沙黯 Diplectrum formosum 美麗沙鮪 Epinephelus flavolimbatus 黃邊石斑 Epinephelus morio 紅點石斑 Serranus phoebe 光鑛節鱸 Serranus tortugarum 堊鱸鯛科部分成員分類名常用名

98360-961102.doc -34- 1357906

Archosargus probatocephalus 羊頭鯛 Archosargus rhomboidalis 海鯛 Calamus penna 羊頭蘆鯛 Lagodon rhomboides 菱體兔牙鯛 Pagrus Major 真鯛 Sparus aurata 金頭鯛 Stenotomus chrysops 門齒鯛慈鯛科（Cichlidae)部分成員 {學名}分類名常用名 Aequidens latifrons 寬體寶麗魚 Cichlisoma nigrofasciatum 黑帶麗體魚 Crenichichla sp. 梭子鯛 Pterophyllum scalare 天使魚 Tilapia mossambica 莫三鼻克種吳郭魚 Oreochromis sp. 吳郭魚 Sarotherodon aurea 金黃吳郭魚棘臀魚科部分成員 {學名}分類名常用名 Ambloplites rupestris 岩鱸 Centrarchus macropterus 曰鱸 Elassoma evergladei 黑斑小日驢 Elassoma okefenokee 小日鱸 Elassoma zonatum 橫帶小曰鱸 Enneacanthus gloriosus 藍點太陽魚 Enneacanthus obesus 暗點太陽魚 Lepomis auritus 紅胸太陽魚 Lepomis cyanellus 綠太陽魚 Lepomis cyanellus X L. gibbosus 綠X駝背太陽魚 Lepomis gibbosus 駝背太陽魚 Lepomis gulosus 大口突脆太陽魚 Lepomis humilis 橙點太陽魚 Lepomis macrochirus 藍肥太陽魚 Lepomis megalotis 長耳太陽魚 Micropterus coosae 淺灘黑鱸 Micropterus dolomieui 小口黑鱸 Micropterus punctulatus 斑點黑驢 Micropterus salmoides 大口黑鱸 Pomoxis annularis 白刺蓋太陽魚

98360-961102.doc •35- 1357906 黑刺盖太陽魚

Pomoxis nigromaculatus 在另-較佳實施例中，該動物為—同㈣物或人，且投該疫田讀供GDF8的長效負調節作用以用於任何對應於該GDF8負調節作用之獸醫學或#學目@。為達成本發明之目的，應瞭解術語"同伴"動物包括所有動物—馬(馬科）、_苗科）、狗（犬科）、齧齒動物（包括小鼠、大鼠、勝鼠）、兔類、及禽類，諸如轉、料及其類似物種。 -匕接又此等接種或抗體之鳥類可與商業或非商業養禽業相關聯。此等包括（例如）：鴨科（Anatidae)，諸如天鶴；續鴒科（Columbidae)，諸如野鹤或轉子（例如家镑）；錐科 (Phasianidae)，例如鹧鴻及松雞；鸚鵡科，鸚鹤屬（PS1ttacines)，例如長尾麟鶴（parakeet)、金剛鹤鵡 (macaw)及鸚鵡’（例如）為寵物或收集者市場而養殖者，及平胸鳥（Ratite)之成員。在另-較佳實施例種中，免疫上文所引述動物中之任一種（較佳為非人類）以獲得特異性結合本發明之胜肽的抗_ GDF8抗體，且收穫經引發之抗體以用於分析中，及/或用於獸醫學或人類醫學中（例如）以提供達成對應於gdf8負調節作用之任何獸醫學或醫學目的之〇DF8負調節作用。、參考下列作為本發明之示範而提供的非限制性實例可更好地瞭解本發明。介紹下列實例以便更充分地閣明本發明之實施例而決不應將其等解釋為限制本發明之廣泛範疇。實例實例1 98360-961102.doc -36· 1357906 材料&方法 A.前驅體GDF8(GDF8前激素）之表現及純化為在哺乳動物及病毒表現系統中之表現而最適化了前16 體GDF8或前激素之天然DNA序列（SEQ ID NO:2)。為避免病毒宿主關閉機制之負效應，該DNA序列經設計以盡可能地異於哺乳動物核酸序列。為達成此目的，使用酵母偏好密碼子逆轉譯GDF8前激素之胺基酸序列。檢視了所得序列保持對人類GDF8核酸序列之同源性的密碼子。有可能時，此等密碼子經編碼相同胺基酸之次最偏好酵母密碼子取代。商業合成了所得核酸分子（SEQ ID NO:3)以用於倂入至適當表現載體中。使用 Flp-In™ CHO表現系統（Invitrogen，Carlsbad ’ CA) 來表現經最適化之GDF8前激素。簡言之，藉由將編碼經修飾之GDF8前激素之基因插入至質體pCMVtag4B (Stratagene，San Diego，CA.)中來構築了含有 C 端 FLAG® (Sigma-Aldrich Corp.，St· Louis，MO)抗原表位融合的 GDF8前激素構築。該FLAG®融合標記有助於在抗-FLAG® 凝膠管柱上分離FLAG®融合蛋白》接著將含有經修飾之 GDF8前激素-FLAG®基因的PCR DNA片段選殖入質體表現載體 pcDNA5/FRT(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。藉由以含有GDF8-FLAG®基因之Flp-In™表現載體及Flp重組酶表現質體POG44共轉染Flp-In™ CHO細胞株來產生表現GDF8 前激素-FLAG®融合蛋白的Flp-In™ CHO細胞株。藉由位點特異性DNA重組作用於經整合之FRT位點處Flp重組酶介導 98360-961102.doc -37- 1357906 將Flp-In表現卡匣插入至基因組中。使用濕黴素B選擇作用得到了表現及分泌含有FLAG®抗原表位之GDF8前激素的穩定細胞株。使用標準技術將表現含有FLAG®標記之GDF8前激素的穩定CHO細胞株調適成在無血清培養基中懸浮培養物。使用WAVE生物反應器系統（WAVE Biotech LLC ， Bridgewater，NJ)生成含有經分泌之GDF8前激素的改良性培養基。藉由使用抗-FLAG® M2親和性凝膠⑻层!!^-Aldrich Corp. ’ St. Louis ’ MO)之親和層析達成了 FLAG® 標記之GDF8前激素的純化。 B.DJ5特異性抗趙純化作用藉由親和管柱層析法純化DJ5(SEQ ID NO: 8 ;參見下文表2)特異性抗體部分。藉由將10 mg DJ5合成胜肽偶合至〇.8 g經溴化氰活化的瓊脂糖凝膠4B(Sigma Genosys， Woodlands ’ TX)上來製備親和管柱。以PBS清洗且平衡管柱。將近似11 ml山羊IgG部分（10 mg/ml)施加至親和管柱中且以25 ml PBS清洗。收集1.0 ml的部分溶液且監控280 nm處之光吸收。以近似1〇以〇·2 Μ甘胺酸（pH 1.85)溶離出經結合之材料。收集1.0 ml的部分溶液且以0.25 ml 0.5 Μ磷酸鈉、0.75 M NaC1(pH 7 4)將其中和。分析1-1〇未經結合部分及25-35經結合部分的近似25 μΐ等分試樣對DJ5胜肽的ELIS Α反應性。發現未經結合部分對DJ5反應性為陰性。經結合部分展示出對DJ5胜肽反應性的強峰值。彙集 1-Π未經結合部分及26-34經結合部分。如下文所示，濃縮 98360-961102.doc • 38 · 1357906 所彙集樣品且以磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)交換其緩衝液。藉由 OD 280方法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY， 2.7.3，John Wiley & Sons ’ Inc.)測定樣品濃度。將未經結合之樣品調至10 mg/ml，且將經結合之樣品調至1 mg/ml，以備隨後使用。實例2 山羊抗-GDF8多株IgG血清藉由下列方法自經免疫之山羊中得到山羊抗-前驅體 GDF8 IgG。 A. 山羊之免疫作用如下文以經純化之重組GDF8前激素（如上文實例1所述獲得）免疫一隻撒能（Saanen)(乳用）山羊（近似2歲，雄性）。將半毫克蛋白質在弗氏完全佐劑（CFA)中乳化且皮下（SC) 注射至該山羊外皮下。隨後於第三、六、及十週SC投藥之加強免疫含有0.3 mg經乳化於弗氏不完全佐劑（IFA)中之蛋白質。以一注射器及針頭自頸靜脈收集血液且以真空瓶及真空管容納之。將血液收集至含有抗凝血劑的瓶中且於 2500 RPM下離心20分鐘以去除紅血球《將血漿複鈣以生成血清。將最初免疫15週之後收集的血清樣品用於進一步分析。 B. 山羊多株IgG之收集及純化 15週之後自該山羊中收穫血清，且如下文自此血清中純化 IgG部分。根據製品方案（Kirkegaard and Perry Laboratories， Inc.，Gaithersburg，MD)於蛋白G瓊脂糖凝膠管柱上純化山羊 98360-961102.doc •39- 1357906 血清的IgG部分。彙集、濃縮經溶離之部分，且利用 Centriprep 離心過遽器（Centriprep YM-10， Millipore Corporation，Billerica, ΜΑ)以破酸鹽緩衝鹽水（PBS)交換緩衝液。藉由 OD 280 方法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Id)測定樣品濃度且將其調至1 〇 mg/m卜實例3 山羊抗血清之表徵上文實例2所提供之山羊抗血清命名為PGA。據預期 PGA IgG部分含有針對GDF8前激素分子上之各種抗原表位的抗體。如下文藉由活體外轉録激活分析法表徵該PGA抗血清。用來定量量測GDF8生物中和作用的活體外轉録激活分析法大致為 Thies 等人（Growth Factors 18，251(2001)) 之方法。以1.0xl〇5個細胞/孔的A204橫紋肌肉瘤細胞 (ATCC HTB-82)接種經九十六孔組織培養物處理之亮度計 ViewPlateTM 分析板（perkinElmer Life and Analytical Sciences ’ Inc.，Boston，ΜΑ)，且將其培育於 37°C、 5%C〇2之濕潤箱中。完全A2〇4培養基由McCoy’s 5A培養基、10°/。胎牛血清、2%1_麩醯胺酸、及1%青黴素/鏈黴素組成。達到大於80%匯合度後，使用FUGENE轉染試劑 (Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)之製造商所推薦之方案以質體pDPC4-螢光素酶與HCMV IE-lacZ 之混合物短暫轉染該等細胞，且於37°C、5%C〇2之濕潤箱中培育16小時。質體pDPC4-螢光素酶含有四個源自人類血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（PAI-1)的CAGA框複本，其 98360-961102.doc • 40- 賦予異源性啟動子報導體構築以GDF8回應性。質體HCMV IE-lacZ含有一在組成型人類巨細胞病毒即刻早期啟動子控制下之β-半乳糖苷酶基因。加入此基因作為種對轉染效率正規化之控制物。接著以1 〇〇納克/孔 GDF8 蛋白（r&d Systems Inc.，Minneapolis，ΜΝ)處理細胞且將其於37〇c、5%c〇2之濕潤箱中再培育16小時。使用雙光束螢光素酶分析（Tropix，Applied Biosystems，Foster

City，CA)於該等經處理之細胞中定量螢光素酶及半乳糖苷酶。各樣品一式兩份（2個孔）進行操作。以螢光素酶訊號除以β-半乳糖茌酶訊號再乘以1〇〇計算出各孔之訊號。該樣品訊號計算為兩孔之平均值。為測試抗體樣品之生物中和活性，處理細胞之前，以 GDF8蛋白培育各種濃度的純化IgG部分（於下近似丨6小時）。以100-(lOOx樣品訊號）/(僅有GDF8之訊號—未加入 GDF8之訊號）計算出抑制百分&。活體外轉録㈣分析之結果由下文表1所概述。 98360-961102.doc •41- 1357906 表1 山羊血清PGA之GDF8中和滴度樣品(itg IgG) 山羊-正常(250) 山羊-PGA(250) 山羊-PGA(125) 山羊-PGA(63) 山羊-PGA(31) 山羊-PGA(16) GDF8活性之抑制％ 0 95 86 62 22 3 中和作用分析證實了經收穫之山羊血清IgG部分含有能籲夠中和用於此活性分析中之至少95%GDF8的抗體。實例4 山羊多株抗體定義 GDF8蛋白之一特異中和抗原表位為測定中和免疫反應之特異性，以一組七個跨越活性 GDF8蛋白之完整編碼區域的重疊胜肽（DJ1-7，參見表2及圖1)分析了 PGA IgG部分之反應性。藉由酶聯免疫吸附分析（ELISA)分析法測定了山羊PGA IgG對各單獨胜肽之反應 ® 性。大致上如 Protein Detector™ ELISA套組 HRP，ABTS 系統 (Kirkegaard and Perry Laboratories ， Inc. ， Gaithersburg，MD)中所述進行GDF8胜肤ELISA。將下列修改用於該分析中。於吾等指導下由ProSci，

Inc.(Poway，CA)定製合成出合成胜肽DJI-7(參見下表2)。以每孔500 ng合成胜肽及每孔250 ng經純化GDF8前激素包覆板子。一級抗體為來自各種樣品中之IgG部分。二級抗 98360-961102.doc • 42· 1357906 體以1:2000稀釋使用。對於山羊一級抗體樣品，該二級抗體為兔過氧化物酶標記之抗山羊IgG抗體。對於大鼠一級抗體樣品，該二級抗體為山羊過氧化物酶標記之抗大鼠

IgG抗體。以一 ELISA板讀取器讀取OD 405 nm 15分鐘。以OD 405/分鐘乘以1000計算出ELISA反應性。表2 GDF8活性區胜肽名稱座標1 胺基酸序列 DJ1 267-286 DFGLDCDEHSTESRCCRYPL SEQ ID NO: 4 DJ2 282-301 CRYPLTVDFEAFGWDWIIAP SEQ ID NO: 5 DJ3 297-316 WIIAPKRYKANYCSGECEFV SEQ ID NO: 6 DJ4 312-331 ECEFVFLQKYPHTHLVHQAN SEQ ID NO: 7 DJ5 327-346 VHQANPRGSAGPCCTPTKMS SEQ ID NO: 8 DJ6 342-361 PTKMSPINMLYFNGKEQIIY SEQ ID NO: 9 DJ7 357-375 EQIIYGKIPAMWDRCGCS SEQ ID NO: 10 *相對於人類GDF8前激素(Genebank編號NP_005250) 該等ELISA結果總結於下表3中。表3 PGA IgG(10 mg/m丨)對GDF8活性區胜肽之ELISA反應性 OD 405 /分鐘 X1000 抗原 1:20 1:40 1:80 DJI1 23 10 1 DJ21 3 0 0 DJ31 0 10 0 DJ41 3 0 0 DJ51 121 37 27 DJ61 3 0 0 DJ71 10 1 0 前 GDF82 194 196 199 98360-961102.doc -43 · 1 胜肽，2前激素 2 PGA IgG部分與經純化之GDF8前激素及與DJ5胜肽均特 1357906 異性反應。在該等GDF8活性區胜肽之中，IgG部分特異且獨佔地與DJ5胜肽反應。其有力說明此血清之中和能力導向針對DJ5胜肽所定義之抗原表位。為證實此假設，純化了 PGA IgG的DJ5特異部分。此係藉由如材料及方法中所述之親和層析法達成。將該等PGA抗體分為DJ5胜肽結合及未結合部分。分析了兩部分針對GDF8蛋白之尹和活性。表4中之結果表明多數GDF8中和能力屬於特異性結合 DJ5胜肽之抗體。此清楚地證實DJ5胜肽定義GDF8蛋白之中和抗原表位。表4 DJ5特異抗體之GDF8中和作用活性樣品 ins IsG) GDF8活性之抑制％山羊-正常(250)1 7 DJ5 未結合 IgG(250) 26 DJ5 結合 IgG(25) 90 98360-961102.doc • 44- 1 正常山羊IgG為一負對照組，其自未經免疫之山羊血清（市售）中純化。奇怪的是，於一預備實驗中當以結合至透孔螺血藍蛋白上之人類DJ5抗原注射兩隻兔子時，並未得到中和GDF8抗體。如圖2可見，對應於兔及人類GDF8之DJ5的胺基酸序列是相同的，而山羊DJ5之胺基酸序列不同。因此，考慮到上文所提供之山羊數據，預備實驗之兔數據表明有利條件為使用包含與宿主動物GDF8之對應區域/部分之胺基酸序列不同者的DJ5抗原。因此，在該狀況下重組人類GDF8 1357906 前激素於山羊中誘導生物中和抗體之能力可至少部分歸因於，所用抗原包含一段藉由在GDF8之DJ5區域/部分中之單一胺基酸取代[參見圖2中第333胺基酸殘基]而不同於宿主序列者的胺基酸序列。更特定言之，如圖2所示，人類序列中之Arg333經山羊序列中之Lys3 3 3殘基置換。此單保守胺基酸取代可構成足夠顯著至將”外來"蛋白呈遞給山羊免疫監視系統的變體。實例5

GDF8中和大鼠mAB 788定義 GDF8蛋白之一特異中和抗原表位大鼠單株抗體788係經報導以中和小鼠GDF8生物活性 (R&D Systems Inc.，目錄號 MAB788，Minneapolis， MN)。為證實此結果，吾等分析了該單株抗體針對GDF8 蛋白之中和活性。經如上文實例2所述表徵該抗體。此分析之結果如下總結於表5中。

表5 GDF8活性之抑制％ 47 17 單株抗體788之GDF8中和滴度樣品(ug IgG) MAB-788(12.5) MAB - 788(6.3) MAB-788(3.1) MAB-788(1.8) 0 MAB-788(0.1) 表5證實此抗體能夠中和GDF8蛋白之活性。為測定此中和免疫反應之特異性，以一組七個跨越活性GDF 8蛋白之 98360-961102.doc 45- 1357906 整個編碼區域的重疊胜肽（DJl-7，參見表2及圖1)分析了該大鼠單株抗體之反應性。藉由ELIS A分析（參見材料及方法）測定該單株抗體對各獨立胜肽之反應性。表6 大鼠MAB 788(10 mg/ml)對GDF8活性區胜肽之ELISA反應性 OD 405/分鐘 xl 000 抗原 1:20 1:40 1:80 DJ1* 4 0 0 DJ2* 0 0 0 DJ3* 0 0 0 DJ4* 0 0 0 DJ5* 133 118 102 DJ6* 0 0 0 DJ7* 0 0 0 前 GDF8** 132 127 132 *胜肽，**蛋白質大鼠單株抗體與經純化之GDF8前激素及與DJ5胜肽均特異性反應。通常一單株抗體具有對單個抗原表位之單特異性。在GDF8活性區胜肽之中，此單株抗體特異且獨佔地與DJ5胜肽反應。此結果提供DJ5胜肽定義GDF8蛋白之中 · 和抗原表位的另一獨立證據。熟習此項技術者所將很容易瞭解到可進行本發明之多種修改及變化而不脫離其精神及範疇。本文中所描述之特殊實施例僅以實例之方式提供，且本發明僅受所附申請專利範圍之條款連同授予該等申請專利範圍之均等完全範疇所限制。本說明書中引述大量參考文獻，包括經公開及/或經互聯網公開之核酸及多肽/蛋白序列的Genebank編號，其揭示内容以引用的方式全部倂入本文中。 98360-961102.doc • 46- 1357906 【圖式簡單說明】圖1圖示在前驅體GDF8序列之第266至375殘基之GDF8 活性區（意即成熟GDF8)中的重疊胜肽DJ1至DJ7。圖2圖示人類DJ5胜肽序列（SEQ ID NO:8)與處於所引用之另外動物物種之前驅體GDF8蛋白中的類似20殘基胜肽相比較之比對。第32 1至347胺基酸殘基處係基於人類前驅體GDF8。Genebank編號（以引用之方式倂入本文中）識別該物種之全部公開之蛋白序列。

98360-961102.doc 47- 1357906 序列表 <11〇>瑞士商先靈葆雅有限公司 <120>中和以抗原表位為主的生長增強疫苗 <13〇> AH 06148 <140 093140145 <141> 2004-12-22 <150> 60/533,719 <151> 2003-12-31 <160> 36 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213>人類- <220> <221> Peptide <222> (267)..(286) <223> DJ1 <220> <221> Peptide <222> (282)..(301) <223> DJ2 <220> <221> Peptide <222> (297)..(316) <223> DJ3 <220> <221> Peptide <222> (312)..(331) <223> DJ4 <220> <221> Peptide <222> (327)..(346) <223> DJ5 <220〉 <221> Peptide <222> (342)..(361) <223> DJ6 <220> <221> Peptide <222> (357)..(375) <223> DJ7 <400> 1

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu Ser Lys Leu 50 55 60 98360.doc 1357906

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Val lie Arg Gin Leu 65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp Val 85 90 95

Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125

Met Gin Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lys lie Gin Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gin He Leu Arg Leu 165 170 175

He Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gin Ser He Asp Val 195 200 205

Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr .225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Val 355 360 365 • 2·

98360.doc 1357906

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 23W類 228DNA人 0>1>2>3> 11 11 «1 —λ <2<2<2<2 <220> <221> raise feature <222> (134)..(1261) <223> 編碼GDi?8前驅想 <220> <221> Peptide <222> (1112)..(1171) <223> 编碼 DJ5 _ <400> 2 agattcactg gtgtggcaag ttgtctctca gactgtacat gcattaaaat tttgcttggc 60 attactcaaa agcaaaagaa aagtaaaagg aagaaacaag aacaagaaaa aagattatat 120 tgattttaaa atcatgcaaa aactgcaact ctgtgtttat atttacctgt ttatgctgat 180 tgttgctggt ccagtggatc taaatgagaa cagtgagcaa aaagaaaatg tggaaaaaga 240 ggggctgtgt aatgcatgta cttggagaca aaacactaaa tcttcaagaa tagaagccat 300 taagatacaa atcctcagta aaettegtet ggaaacagct cctaacatca gcaaagatgt 360 tataagacaa cttttaccca aagctcctcc actccgggaa ctgattgatc agtatgatgt 420 pcagagggat gacagcagcg atggctcttt ggaagatgac gattatcacg ctacaacgga 480 aacaatcatt accatgccta cagagtctga ttttctaatg caagtggatg gaaaacccaa 540 atgttgcttc tttaaattta gctctaaaat acaatacaat aaagtagtaa aggcccaact 600 atggatatat ttgagacccg tcgagactcc tacaacagtg tttgtgcaaa tcctgagact 660 catcaaacct atgaaagacg gtacaaggta tactggaatc cgatctctga aacttgacat 720 gaacccaggc actggtattt ggeagageat tgatgtgaag acagtgttgc aaaattggct 780 caaacaacct gaatccaact taggeattga aataaaagct ttagatgaga atggtcatga 840 tcttgctgta accttcccag gaccaggaga agatgggctg aatccgtttt tagaggtcaa 900 ggtaacagac acaccaaaaa gatccagaag ggattttggt cttgactgtg atgagcactc 960 aacagaatca cgatgctgtc gttaccctct aactgtggat tttgaagett ttggatggga 1020 ttggattatc gctcctaaaa gatataagge caattactgc tctggagagt gtgaatttgt 1080 atttttacaa aaatatcctc atactcatct ggtacaccaa gcaaacccca gaggttcagc 1140 aggcccttgc tgtactccca caaagatgtc tccaattaat atgetatatt ttaatggcaa 1200 agaacaaata atatatggga aaattccagc gatggtagta gaccgctgtg ggtgctcatg 1260 agatttatat taagcgttca taacttccta aaacatggaa ggttttcccc tcaacaattt 1320 tgaagctgtg aaattaagta ccacaggcta taggcctaga gtatgctaca gteaettaag 1380 cataagctac agtatgtaaa ctaaaagggg gaatatatgc aatggttggc atttaaccat 1440 ccaaacaaat catacaagaa agttttatga tttccagagt ttttgagcta gaaggagatc 1500 aaattacatt tatgttccta tatattacaa catcggcgag gaaatgaaag cgattctcct 1560 98360.doc 1357906 tgagttctga tgaattaaag gagtatgctt taaagtctat ttctttaaag ttttgtttaa 1620 tatttacaga aaaatccaca tacagtattg gtaaaatgca ggattgttat ataccatcat 1680 tcgaatcatc cttaaacact tgaatttata ttgtatggta gtatacttgg taagataaaa 1740 ttccacaaaa atagggatgg tgcagcatat gcaatttcca ttcctattat aattgacaca 1800 gtacattaac aatccatgcc aacggtgcta atacgatagg ctgaatgtct gaggctacca 1860 ggtttatcac ataaaaaaca ttcagtaaaa tagtaagttt ctcttttctt caggggcatt 1920 ttcctacacc tccaaatgag gaatggattt tctttaatgt aagaagaatc atttttctag 1980 aggttggctt tcaattctgt agcatacttg gagaaactgc attatcttaa aaggcagtca 2040 aatggtgttt gtttttatca aaatgtcaaa ataacatact tggagaagta tgtaattttg 2100 tctttggaaa attacaacac tgcctttgca acactgcagt ttttatggta aaataataga 2160 aatgatcgac tctatcaata ttgtataaaa agactgaaac aatgcattta tataatatgt 2220 atacaatatt gttttgtaaa taagtgtctc cttttttatt tactttggta tatttttaca 2280 ctaaggacat ttcaaattaa gtactaaggc acaaagacat gtcatgcatc acagaaaagc 2340 aactacttat atttcagagc aaattagcag attaaatagt ggtcttaaaa ctccatatgt 2400 taatgattag atggttatat tacaatcatt ttatattttt ttacatgatt aacattcact 2460 tatggattca tgatggctgt ataaagtgaa tttgaaattt caatggttta ctgtcattgt 2520 gtttaaatct caacgttcca ttattttaat acttgcaaaa acattactaa gtataccaaa 2580 ataattgact ctattatctg aaatgaagaa taaactgatg ctatctcaac aataactgtt 2640 acttttattt tataatttga taatgaatat atttctgcat ttatttactt ctgttttgta 2700 aattgggatt ttgttaatca aatttattgt actatgacta aatgaaatta tttcttacat 2760 ctaatttgta gaaacagtat aagttatatt aaagtgtttt cacatttttt tgaaagacaa 2820 aaa 2823

<210> 3 <211> 1164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF8前激素FLAG tag融合蛋白 <220> <221> sig_peptide <222> (10)..(75) <220> <221> misc_feature <222> (76)..(1131) <223> &碼前驅體GDF8 <220> <221> Peptide <222> (985)..(1044) <〇编碼DJ5勝肽 <220> <221> misc feature <222> (1132)..(1161) <223>訑碼〇：端？1^0邮 <400> 3 atggatctac agaagttgca gttgtgtgtc tacatctatt tgttcatgtt gatcgtcgcc 60 -4 -

98360.doc 1357906 ggacctgttg acttgaacga aaattctgaa cagaaggaga acgttgagaa ggaaggtttg tgcaacgctt gtacatggcg tcaaaataca aagtcctctc gtattgaagc tatcaagatt caaattttgt ctaagttgag attggaaact gccccaaata tttctaagga cgtcattcgt caattgttgc caaaggcccc acctttgaga gaattgatcg accaatacga tgttcaaaga gacgattctt ctgacggttc ccttgaagac gatgactacc atgccactac tgaaactatt atcactatgc caactgaatc cgactttttg atgcaggttg atggtaagcc aaagtgctgt tttttcaagt tctcttccaa gattcaatac aacaaggttg ttaaagctca attgtggatt taccttcgtc cagttgaaac accaactact gtgtttgttc agattttgcg tttgattaag ccaatgaagg atggaactag atacacaggt attagatcct tgaagttgga tatgaatcct ggtacaggaa tctggcaatc tatcgacgtt aaaactgttc ttcaaaactg gttgaagcaa ccagagtcta atttgggtat cgagattaag gccttggacg aaaacggaca tgacttggcc gttacttttc ctggtcctgg tgaagacggt ttgaacccat ttctggaagt taaggttact gatactccta agcgttccag gagagacttc ggattggatt gtgatgaaca ttctactgag tctagatgtt gtagatatcc attgaccgtt gatttcgagg ccttcggttg ggattggatc attgccccaa agagatacaa agctaactat tgttccggtg aatgtgagtt cgttttcttg cagaagtacc cacataccca tttggttcat caggctaatc caagaggatc tgctggtcca tgttgtaccc caactaaaat gtcccctatc aacatgttgt acttcaacgg taaggagcag attatttacg gtaagatccc tgctatggtt gttgatagat gtggttgttc tctcgaggat tacaaggatg acgacgataa gtag

<210> 4 <21l> 20 <212> PRT <213>人類 <220> <221> misc_featurc <223> DJI " <400> 4

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp GIu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15

Arg Tyr Pro Leu 20

<210> 5 <211> 20 <212> PRT d1%人類 <220> <221> misc_feature <223> DJ2 " <400> 5

Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp 15 10 15 98360.doc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1164

1357906 lie lie Ala Pro 20 > > > Q1 z 3 •^1 11 11 11 <2<2<2<2

<220> <221> misc_feature <223> DJ3 " <400> 6

Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu 15 10 15

Cys Glu Phe Val 20 ^ > > > ^U123 1ί 11 11 <2C<2<2

<220> <221> misc feature <223> DJ4 ' <400> 7

Glu Cys GIu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 15 10 15

His Gin Ala Asn 20 &123 11 11 1i 11

<220> <221> misc feature <223> DJ5 ' <400> 8

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 > > > Q164 3 22 2 2 <220> <221> misc_feature <223> DJ6 " 98360.doc 1357906 <400> 9

Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu 15 10 15

Gin lie lie Tyr 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213>人類 <220> <221> misc_feature <223> DJ7 " <400> 10

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213>綠頭鴨 <400> 11

Va! His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20

<210> 12 <211> 20 <212> PRT <213>灰雁 <400> 12

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213>灰雁 <400> 13

Val Leu Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 7- 98360.doc 1357906 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213>特羅斯牛 <400> 14

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 1 5 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213>家犬 <400> 15

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213>山羊 <400> 16

Val His Gin Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210〉 17 <211> 20 <212> PRT <213> <400> 17

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT 小捣鶴 <400> 18

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 1 . 5 10 15

Thr Lys Met Ser 20 98360.doc 1357906

b > > >^ Q 1 z 3 灯 It 1 11 «1 <2<2<2<2<4C 19

20 PRT 斑馬魚 19

Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly TTir Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> 馬 <400> 20

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213>原叙 <400> 21

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213>為雞 <400> 22

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20

<210> 23 <211> 20 <212> PRT <213>斑點又尾鮰 <400> 23

Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 9- 98360.doc 1357906 rg 0 pr n s A 5 a Γ 1 60 A S2 T 兔lnet 2420™草24g m s s fe> Λ >^HiLy ¢123 & <2<2<2<2<4(valTh se r0 pr Thr15 s cy s cy r0 <210> 25 <21i> 20 <212> PRT <213>食蟹猴 <400> 25 Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213>火難 <400> 26 Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213>金眼狼竣 <400> 27 Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 b > Λ > α123 n 11 n n <2<2<2<2 <400> 2820 PRT 小家鼠 28

Val His Gin Ala Asn Pro Arg 1 5 Thr Lys Met Ser 20 ly Ser Ala G 10 ly Pro Cys Cys Thr Pro 15 98360.doc 10- 1357906 <210> 29 <21i> 20 <212> PRT <213〉虹鳟- <400> 29

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213>鋅羊 <400> 30

Val His Gin Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213>阿拉伯狒狒 <400> 31

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20

<210> 32 <211> 20 <212> PRT <213>揭家鼠 <400> 32

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213>夫西洋鮭魚 <400> 33

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 -11 - 98360.doc 1357906 <2i0> 34 <211> 20 <212> PRT <21h黑鯛 <400> 34

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213>許豬 <400> 35

Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> 野豬 <400> 36

Val Leu Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro 15 10 15

Thr Lys Met Ser 20 12- 98360.doc

Claims

1357906

第093140145號專利宇請案____ 十、申請專④备本中文申請專利範啤替換^一 4-'7Ίι ) 1. 一種由或少於50個胺基酸殘基組成之經分離胜肽，其包含SEQ ID ΝΟ:1之第327至346胺基酸殘基。 2. 如請求項1之經分離胜肽，其包含SEq id ν〇:1之第321 至346胺基酸殘基。 3. 如請求項2之經分離胜肽，其包含SEQ ID ΝΟ:1之第320 至350胺基酸殘基。 4. 如請求項3之經分離胜肽，其包含SEQ ID ΝΟ:1之第3 12 至361胺基酸殘基。 5. —種由5 0或少於5 0個胺基酸殘基組成之經分離胜肽，其包含包括經胺基酸取代之SEQ ID ΝΟ:1之第327至346胺基酸殘基；其中在第327至第346胺基酸殘基間不多於五個胺基酸取代作用；且其中該胜肽係以特異性方式結合至大鼠單株抗體788。 6·如請求項5之經分離胜肽’其包含胺基酸取代作用位置係選自由第328、3 29、331、333及335殘基，及其組合處所組成之群，其中， (a)第328胺基酸殘基為His、Leu、或Asn; 〇)第3 29胺基酸殘基為〇111或1^; (c) 第331胺基酸殘基為Asn或Ser ; (d) 第333胺基酸殘基為Arg或Lys ;及/或 (e) 第335胺基酸殘基為Ser、Pro、或Thr。 7.如請求項6之經分離胜肽，其在前驅體GDF8之第327殘基 98360-970709.doc 1357906 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 至第346殘基之間包含不多於一個胺基酸取代，其限制條件為該胜肽係以特異性方式結合至大鼠單株抗體788。如請求項1之經分離胜肽，其包含對於抗_GDF8抗體之特異中和抗原表位。如請求項8之經分離胜肽，其中該抗體係選自由大鼠抗-GDF8單株抗體788及山羊抗_GDF8多株抗血清之IgG部分所組成之群。一種融合蛋白’其包含如請求項1之胜肽或該胜肽之抗原亞片段。一種核酸分子，其編碼如請求項10之融合蛋白。一種核酸分子’其編碼如請求項6之胜肽。一種核酸分子，其編碼如請求項1之胜肽。如請求項13之核酸分子，其包含一段SEQ ID Ν〇:2之第 1112核苷酸至第1171核苷酸之核酸序列。種可複製選殖載體’其包含如請求項13之核酸分子。一種宿主細胞，其包含如請求項15之可複製選殖载體。如睛求項16之宿主細胞，其係經該選殖載體轉形。如請求項16之宿主細胞，其為真核細胞。一種製備GDF8胜肽之方法，其包含培養如請求項以之宿主細胞、表現該經編碼之胜肽及回收該胜肽之步驟。一種疫苗蛆合物，其包含如請求項1之胜肽。一種疫苗組合物，其包含如請求項1〇之融合蛋白。如請求項20之疫苗組合物，其進—步包含佐劑。一種如請求項1之經分離胜肽之用途，其係用以製造用於 98360-970709.doc 弓1發動物體中抗-GDF8免疫反應之藥物。 .種篩選方法，其係用以自多種抗體或抗體片段中選擇出抗-GDF8抗體或抗體片段，該方法包含使如請求項^之胜月太與包含一或多種抗體或抗體片段之樣品接觸，及積測可選擇性結合至該胜肽之抗體或抗體片段。 5.—種以特異性方式結合至如請求項1之胜肽之抗體或抗體片奴之用途，其係用以製造用於負調節動物體中gDF8活性之藥物。 26·—種如請求項2〇之疫苗組合物之用途，其係用以製造用於負調節動物體中GDF8活性之藥物。種如明求項10之融合蛋白之用途，其係用以製造用於負調節動物體中GDF8活性之藥物。 28. -種融合蛋白，其包含請求们或請求項5之胜狀。 29. 一種核酸，其編碼請求項28之融合蛋白。 3〇·種載體’其包含請求項29之核酸。 98360-970709.doc