TWI351407B

TWI351407B - Method of humanizing immune system molecules

Info

Publication number: TWI351407B
Application number: TW092121957A
Authority: TW
Inventors: C Wong Hing; R Stinson Jeffery; A Mosquera Luis
Original assignee: Sunol Molecular Corp
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2011-11-01
Also published as: KR101212480B1; EP1542725A2; CA2497287C; CN100584946C; JP2005537009A; CA2497287A1; AU2003258118B2; US20030190705A1; WO2004020579A3; CN1688338A; EP1542725B1; AU2003258118A1; TW200500377A; KR20050043919A; ES2436209T3; WO2004020579A2; DK1542725T3; EP1542725A4

Description

1351407 玖、發明說明： · 相關申請案之交又文獻本申請案為美國申請案No. 09/990,586(標題··抑制血液凝、··〇之抗體及其使用方法，Jiao，J等人，i年U月 21曰）之部份連續案，該申請案主張美國臨時申請案ussn 6〇/343,3 06(2001年10月29曰申請）之優先權。美國申請案No.09/990,586係有關美國申請案No. 09/293,854，該申请案為美國申請案No.OS/W4,8。6(現在為美國專利案n〇.鲁籲 5,986,065)之分割案。美國申請案n〇s. 09/99〇 586， 6〇/343,3〇6及美國專利案N〇 5,986,〇65之揭示内容已以引用之方式併入本文中。【發明所屬之技術領域】本發明之特色在於一種製造擬人化免疫系統分子之方法。本發明一方面提供一種抗體擬人化之方法，其涉及使個別抗體架構區之間（而不在於使較大架構或可變功能部位之間）之序列相似性達最適化。本發明有許多用途，包籲_ 括用於生產具有合適結合親和性及儘量降低人類免疫原性之擬人化單株抗體。【先前技術】咸了解抗體有重要用途。例如：許多抗體已知用於檢測具有敏銳專一性之抗原。已有文獻報告多株及單株抗體。一般參見 Molecular Biology of the Cell (B. Alberts 等人編輯，第二版）（1989)Garland Publishing，Inc. New York 及其中摘錄之參考文獻。 92407修正版 1351407 過去即對探討尚未了解之抗體結構及功能有相當大興趣例如.對可變（v)功能部位之結構與功能已有报多了解。幾乎所有抗體V功能部位均包括超變之互補性決定區（"CDRs")及架構區（"FRs")。對大多數抗體分子而言單一 CDR與另一個CDR之間分隔一個Fr。咸了解FRs作為分子骨架，有助於將CDR環定位在適當組態中，供抗原辨識與結合。一般參見上述B. Alberts等人之文獻及其中摘錄之文獻。許多研究者使用”架構”來說明來自單一抗體輕鏈可變功能部位（VL)或重鏈可變功能部位（VH)之完整FRs型。因此’一個抗體v功能部位包括個別架構區亞群（FR1、 FR2、FR3與FR4) ’其中各亞群連接其相應之CDR(cdr1、 CDR2與CDR3)。該架構係由來自單一抗體之完整型架構區亞群組成。至少有些抗體之FRs中胺基酸殘基即被認為應可結合抗原。參見 Foote，J. and G. Winter (1992) J. Mol· Biol. 224 : 487 ° 已有人嘗試使用單株抗體作為醫藥劑。然而，此方法卻受到至少某些抗體之挑戰。例如：有些人類已因暴露到衍生自非人類來源之抗體而發展出不期望之免疫副反應。有些此等反應可能出現嚴重健康問題且可能威脅生命。有人嘗試製造人體免疫上更能接受之抗體。儘管已有人提出人類單株抗體’但此等分子通常很難製造及使用。另一種製造人類較能接受之抗體之方法為引進編碼 6 92407修正版 07 人類抗體之基因至非人類動物（例如：小白鼠）。已有報告指出此等"轉殖基因"動物可製造具有人類序列之抗體。然而，此等動物通很難製造且耗費時間。此外，此等轉殖基因小白鼠有專利權且所擁有之人類抗體内容仍不夠適當。另一個製造免疫上可接受之抗體之方法為使用重組體DNA技術。其.項觀念為選殖及修飾非人類抗體，以產生類似人類抗體之分子。總言之，此等抗體稱為"擬人化 "。參見美國專利案Nos. 5,766,886(頒予Studnicka等人）、 5,693,762(頒予 Queen 等人）、5,985 279(頒予 Waldeman 等人）、5,225,539(頒予 Winter)、5,639,641(頒予 Pedersen 等人）及其中摘錄之文獻。有人提出幾種使抗體擬人化之方法。其中一種方法涉及製造嵌合抗體分子。典型作法為使用抗原接種非人類動物，如：小白鼠。然後採甩一般技術，由該動物製造單株抗體。編碼該單株抗體之基因係採用一般聚合酶連鎖反應（PCR)擴增產生。編碼鼠科抗體可變功能部位之單離序列經標準重組體DNA技術基因融合至編碼人類抗體之恆定功能部位之序列上。此方法已用於製造人類-小白鼠嵌合抗體。參見例如：s L M〇rris〇ri and V.⑴ (1989) Adv. Immunol. 44 : 65。可惜仍有些報告指出有些栽合抗體之製造及使用問題。明確言之，有文獻揭示該抗體投予至人體後會出現無法接受之免疫反應。咸信循環壽命縮短亦為至少有些嵌合抗體之問題》參見例如：Boulianne .等人之Nature 3 12 : 7 92407修正版 1351407 643 (1984)，Junghans 等人之 Cancer Res. 50 : 1495 (1990) and Bruggemann 等人（1989) J.Exp.Med. 17〇 : 2153。其他製造擬人化抗體之方法已有報導。其中一種方法稱為"CDR移植法"（有時稱為"架構移植"或"抗體再造"）。所說明之CDR移植法涉及嵌插鼠科 CDRs至人類V功能部位中。然後改用該鼠科cdRs替代相應之人類 CDRs。參見 E. Padlan M〇I. Jmmun〇1. 28 : 489(1991)。通常，v功能部位之所有FRs均衍生自單一人類抗體。相關領域中有些人預測架構之人類FRs將會使鼠科CDRs定位在結合抗原之正確位置上。此等抗體應可避免被人類免疫系統辨識。參見例如：J〇nes等人之Nature 321 . 522-525 (1986);如上述 junghans 等人之文獻。然而’使用許多CDR移植技術亦有問題。例如·有些"移植"抗體具有無法接受之抗原結合性質。參見 Gorman 等人之 PNAS (USA) 88 : 4181(1991)。改善抗原結合性之方法通常為再將鼠科殘基加回CDR移植之V功能部位中，但總是無法成功。參見Queen等人之 PNAS (USA) 86: 10029 (1989);及 Co 等人之 PNAS (USA) 88 : 2869 (1991)。亦有人嘗試採用所謂之”抗體表面再造"之方法製造擬人化抗體。其中一種方法為以經常出現在宿主抗體中之胺基酸殘基置換已暴露之同種異基因抗體之胺基酸殘基。此作法希望可以降低抗體之免疫原性，同時儘可能保留抗原、、，。s 性功能。參見 R〇guska，等人之 pNAS (USA) 91 : 969 8 92407修正版 1351407 (1994)。可惜許多使用先前之抗體再造之技術仍有問題。例如：許多再造抗體具有無法接受之抗原結合性質。參見 E. Padlan Mol. Immunol. 28 : 489(1991)。此外，大多數再造技術需要詳細了解所要再造之抗體之結構。通常需要有關溶劑可處理性及相關參數之詳細資料。然而此等 >料總是無法自需要擬人化之抗體取得。大多數抗體擬人化技術之共通缺點為該需要擬人化之抗體選用相當大之架構或V功能部位來進行移植或再造處理。使用此等大型抗體節段作為處理非人類抗體之基礎之觀念產生不期望之結果，例如：降低抗原結合親和性及保留無法接受之免疫原性。為了闡明此等缺點，需進一步努力恢復親和性。此等努力之最終目的為在添加足量非人類胺基酸殘基來追加親和性與避免添加太多以致免疫原性提高之間取得妥協。、更特定言之，咸信許多先前之擬人化技術涉及使用無 j接又之大型抗體架構，或更差者，使用整個V功能部位進行操作，使抗體擬人化。根據其中—種方法，使用大型 :非人類架構或V功能部位作為參考物，來判別一組與該物具有可接受之序列—致性之人類架構。所判別之人 2構2與作為參考依據之非人類序列所使狀搜尋參數八最高序列一致性時，則稱為，，最適配（best_fit)”。咸信’過去依據相當大型之架構或〃功能部位之比對、拔最適配之人類架構之作法已阻礙許多擬人化免疫系 92407修正版 9 1351407 統刀子之製造與使用。例如：採用過去抗體擬人化法咸信已錯失許夕有可能之"最適配”符合物。亦即，將"最適配" 符。物群侷限於架構或v功能部位時，即降低擬人化抗體之能力。此外’許乡製造擬人化抗體之先前技藝已採用完整抗體序列搜尋"最適配"符合物。然而，此方法有嚴重缺點。例如.此等搜尋法無法包括來自定序不完整之人類抗體之FR序列。此缺點導致很難自已收集完整之人類抗體序列資料中獲得利益。先前技藝中製造擬人化抗體之方法咸信仍有其他失。、例如•已知許多擬人化抗體不具有最適當之抗原結合親和性β與人類FRs相鄰之非人類CDRs之胺基酸與阳中關鍵位置上之胺基酸殘基（稱為游標區殘基）之間之立體遮蔽性（有時稱為干擾性）被認為是其肇因。由於咸信先前技藝，擬人化法會錯失許多"最適配"之人類fr序列闡明此等及其相關困擾問題之能力亦受到限制。 /若能有一種使免疫系統分子更有效擬人化之方法將會很有用°更明碟言之’若有一種能使個別架構亞群之間，序列相似性達最適化之擬人化抗體分子之製法，以作為製造具有合適結合親和性及儘可能降低人類免疫原性之擬人化免疫系統分子抗體之基礎時將會很適用。【發明内容】本發明之特色在於一種使免疫系統分子擬人化之有 92407修正版 10 1351407 效方法。本發明—方面提供一種製造擬人化抗體及其片段之方法’使個別架構區亞群（FRs)之間達最佳序列相似性。可避免較大抗體架構及/或可變功能部位之間之比對並選拔"最適配"之人類FRs用於製造擬人化免疫系統分子。本發明有多種重要用《，包括用於製造具有合適抗原親和性與儘可此降低人類免疫原性之擬人化免疫球蛋白。 σ等已發現—種使多種免疫系統分子例如：抗體及其抗原結合性片段進行’，擬人化，，之新方&。該方法通常涉及使至少—種非人冑FR亞群與至卜種相應之人_ FR 1 之序列相似性達最適化。典型地係使工、2或3種非人類 FRs更佳為使所有四種FRs(亦即卜抑2 與ρ 之序列相似性遠昜砝几，，λ* + ；、化。此專序列相似性可配合使用目的之需要，一次斜斟_猫，，，，、卞對一種（例如：連續處理FRs如：fiu盥 ^或—次針對多種（例如：同時處理所有四種他㈣進行最適化。選祓屮盥士相似性=非人類FR亞群具有最高序列作。所選拔之人類= 別之…R亞群，供進-步操 FR亞群"最適配，卿本R發亞明群經常稱之為與所比對之非人類最適配"之人類操作法尚涉及改用至少—種" 群。因此，本㈣之Μ —種相應之非人類找亞有個別人類與非人類：用法計畫使至少-種，最好為所可避免在架構群（亦即r^間之序列達最大相似性。可變功能部位之階段^ R1、FR2、FR3與FR4)及整個出最適配之人類卩又仃序列相似性最適化之處理。所選亞群以後即用為組合本文所揭示擬人 924〇7修正版 i35l4〇7 化免疫系統分子之成分。本發明提供許多重要優點。例如：先前技藝之操作法經常依據整個架構群或抗體可變功能部位之間之相似性來檢測最適配之人類架構（亦即FR1-4)。咸信此方法在製造及使用擬人化免疫球蛋白上遇到阻礙，例如：缺乏FR選拔敏感性。此外，並在個別人類FRs之間錯失許多最適配符合物。更明確言之’咸信先前技藝之擬人化法嚴重地限制最適配可能性之數量。反之，本發明操作法則不受此限制。亦即本發明之最佳用法涉及在個別FR亞群階段判別序相似J·生並使之最大化。更可明確地避免更大型之架構群/ 5、抗體可變功⑥部位之間之較不敏感之序列比對。本發明 2提供之此等及其相關優點均可擴大最適配可能性之數置’:型地為與所要擬人化之免疫系統分子上FR亞群數八；"'術限乘。本發明此特色大幅加強製造及使用擬人化 :二：會，有助於降低與擬人化法有關之成本，及提供 :個幾乎可組合任何所需之擬人化免疫系統分子之合理基例中，τ二於擬人化所需之非人類抗體4 例中，可取得供進行序之取得該序列資料人類FR亞群集合數為列之F R序列資^之久自不完全之可變功能部位>

彻、FR3與FR 輕鏈與重鏈上四種架構亞群（FR 數增加至少約4倍,：：算術階乘。關鍵性之結果為集。彳二具體實施例申’因為可自不完 92407修正版 12 丄351407 之v功能部位序列取得最適配FRs，以致集合數甚至更大。此點顯然優於先前技藝之方法。因此加強潛在之最適配人類FR可能性。因此，根據本發明檢測最適配之人類 FR亞群之機會高於過去曾使用之方法。本發明之方法可提供其他重要優點。如上述討論，本發明之目的為針對所要擬人化之各非人類FR亞群進行最適化並選拔最適配之符合物。此方法不同於過去之方法，基本上與目標之免疫系統分子内其他 ^分別獨立進行。因此採用本發明方法可大幅降低不符二胺基酸數量。過去之方法經常受到已完全定序之人類 &及可變功能部位之集合數取得量之限制，但使用本發明方法可提供選拔最適配之人類FR亞群之新機會。本發 ^提供檢測最適配人類FRs之較佳機會，相較於相應之類FR，不符合之例子沒有或很少。操作本發明因 2強製造及使用多種免疫系統分子之機 =1用於製備擬人化抗體及其片段，其抗原結合親和親代之非人類或由其製得之嵌合性分子更大幅保留。本發明方面提供一種製造擬人化抗體可變（V) 、砍之方法。較佳片段僅單獨或與其相應之 k部位、纟。合夥伴或片段組合，而專_ =體實施例中，本方法該包括下列至少—個二大好包括下列所有步驟。酸序：型:佳為由二需:人類抗體FR亞群之至少-個胺基 ·、'、八中、，々4種以下之FRs，更佳為約一種 924〇7修正版 13 1351407 如：FR1或FR2，與相應之人類胺基酸抗體或可變功能部位序列或其片段之集合庫比對。大多數例子中，使用所收集之相應人類抗體架構胺基酸序列進行比對，但其他收集之序列亦可進行一些用途，包括收集之部份架構序列。自與相應之非人類FR亞群具有最適配性之集合庫中選拔出相應之人類FR亞群。一般而言，合適之最適配人類亞群與相應之非人類FR亞群比對時，將具有至少約乃％序列一致性，較佳為至少約8〇%序列一致性，更佳為至少° 約90%至約1〇0%序列一致性。夕隨後，由非人類FR亞群突變成基本上可编碼上述最適配之人類FR亞群。可依下文所述，採用一種標準誘變法或其組合。最好進行非人類抑亞群之誘變法來製造擬人化FR亞群(有時稱為"huFR，，)，其實質上與所選拔之人類 FR亞群相同，亦即與選拔之亞群至少約75%㈣，為至少約80%相同，更佳為至少約9〇%相同至約刚％相本發明之先前擬人化步驟若必要時可以重覆，使非類V功能部位之-個或多個所f FR亞群擬人化。更言之’可重覆該等步驟-次'兩次、三次或甚至更多次，且在可產生多數舰序列之條件下進行，其中各⑽ 列編碼相應之huFR亞群。大多數例子中（例如：當需要6 全擬人化免疫丰缔分70 長糸^刀子時），可重覆該等步驟約三至四次，以使各Η亞群（FR1、FR2、咖與叫擬人化。因此，在需要非人類抗體之具體實施例中，各免疫球蛋白輕鍵與 924〇7修正版 14 1351407 重鏈之各FRS群將進行上述擬人化步帮。本發明之成功操作法不需依賴任何特〜擬人化順序，只要可達到所需結果即可。又之非人類FRs 然後採用標準之重組法，取 dnA序列或其組合取扁碼mr亞群之者，第-個載體至少編碼所要擬人化之非f體中。較佳能部位。“’有些具體實施例中，第之Μ 價連接v功能部位之免疫球蛋白輕鍵或重：:：：：共或其片段。崎技疋功能部位較佳取代步驟通常於其中使用至少_個好 h錢舰序列置換—個或多個由該載體編碼之最好^ 類FR亞群之條件下進行。FR取代作用之順序通常之所需擬人化分子並不重要。因此 ^ , /L ^ J先由非人類FR1 進灯擬人化後’再由非人類FR2進行。或者，非人類加可在非人類FR1之前擬人化。較佳取代步驟可依據—般操作法進行’所產生之^uFR亞群則與一個或多個相應之互補性決定區（CDR)操縱性連接。第一個載體可用於在下文中將討論之多種合適宿主細胞中表現一種或多種所編碼之擬人化免疫系統分子。通常進行較佳之方法，於宿主細胞中表現擬人化抗體v功能部位或其片段。此外，較佳方法可與計畫用於自同時存在之細胞組成分中純化出擬人化分子之方法完全相容。本發明與多種重組法完全相容，該重組法使指定之非人類FR亞群上每個不符合之位置上之非人類胺基酸轉化 15 92407修正版 1351407 成所需之人類胺基酸…項可接受之重組法實例為定點誘變法或相關之以PCR為主之方法。由於根據本發明之潛在最適配人類FR亞群之集合數較高，因此，判別出不符合物較少之人類FR亞群之機率較高。本發明之特色為協助降低FR不符合物之數量，此點係當要使特定之免疫系統分子擬人化時所必需考慮者。此等及其他本發明優點有助於比許多先前技藝之擬人化法更節省成本與時間。如上述討論，大多數先前技藝之擬人化法受到所得分子之無法接受之抗原結合性之阻礙.更明確言之，大多數先前技藝之擬人化抗體對關聯胺基酸抗原之親和性遠低於親代分子。許多親代嵌合抗體之抗原結合特性則優於抗體之擬人化型。在不希望受到理論限制下，咸信此等無法接受之抗原結合性大部份可歸因於鄰近CDRs(游標區殘基）之FR亞群中一個或多個胺基酸所產生之遮蔽性。有報告指出，至少有些抗體之游標區殘基可能造成抗原與抗體v 功能部位結合。過去曾嘗試儘量降低.游標區遮蔽問題，但大多沒有成功或需要更複雜之電腦算式來校正且極依賴分子模型與結構知識。例如.其中一種方法採用電腦協助之模型軟體來協助降低遮蔽性。此等軟體通常很複雜且很難使用。本發明解決此問題之方法為不藉助複雜之軟體即可在最佳條件下檢測及選拔最適配huFR亞群。亦即本發明提供更佳之最適配候選物，藉以降低所要擬人化之免疫系統分子游標區或 16 92407修正版丄:Oi4〇7 任何其他位置出現不符合性之機會。因此，使用本發明可以顯著維持親代免疫系統分子之抗原結合親和性。當所需之非人類抗體對抗原具有不尋常之高度親和性（Kd >丨〇·9μ 或以上）時，本發明之優點特別重要。此等情況下，高親和 ί·生通*要求CDR保持在適當組態。本發明藉由儘量降低或消除游標區之潛在不相容性來滿足.此等要求。過去曾使用以X-射線結晶學或電腦為主之抗體資料來協助解決游標區之不相容性。本發明顯然可降低，許多情況下甚至可避免使用者對此等資料之依賴性。下文中討論本發明其他方面。【實施方式】如上述討論，本發明之特色在於製造擬人化免疫系統分子。此等分子實例包括擬人化抗體可變（V)功能部位、擬人化抗體（嵌合體及單株）及抗原-結合性片段。例如：本發明提供一種使抗體擬人化之新方法，其涉及使至少一種非人類架構（FR)亞群，典型地指其中2、3或4種亞群，與一種或多種相應之人類FR亞群之間序列達最佳序列相似性。以至少一種選拔之擬人化FR亞群（huFR)替代相應之非人類FR亞群，使分子擬人化。本發明之較佳擬人化免疫系統分子之特色為於人體中之良好抗原結合親和性與儘量降低之免疫原性。使用本發明擬人化免疫系統分子之優點可由下文中包括實例6-9之說明證實。如上述討論，過去擬人化法與本發明之差異在於本發明方法尋求最適配之FRse反之， 17 92407修正版 1351407 先前技藝之方法則採用整個架構（通常來自單-抗體可變功能部位）或更差之作法為採用整個可變功能部位來決定最適配性。因此本發明所判別之frs可來自多達四種不同抗體之各抗體鏈或每種抗體共來自8種阳。本發明之特色為大幅增加可以取得之可檢測最適配FRs。這種在搜尋最適配之FRS上之彈性使搜尋過程之限制減少，因此可分析較多FRs。此等有利點有助於在需要進行較少之胺基酸取代作用、較少之游標殘基變化與較佳之同質性或一致性分數下即可達到較#適配性。搜尋整個最適配之架構中，其結果為整個架構之折衷最適配性。有些實例中，兩條鏈之整個架構均來自單一抗體，或在限制範圍較小之搜尋中’各鏈之架構可來自不同抗體。更特定言之’下文令實例6提供過去之抗_TAC抗體擬人化法與本發明方法（本文中有時稱為"FR最適配擬人化法”）之電腦（in silico)比對結果。如本實例所示，採用本發明可提供優越之擬人化結果。亦即，根據本發明之抗_tac 抗體之實質擬人化結果可產生較隹抗體。採用本發明之其他優點可於實例7(Mc3抗體）；實例 8(抗-TF抗體）；與實例9 (抗-LTA抗體）所示之電腦比對結果了解。當與先前技藝之擬人化法比較時，此等實例（包括實例6)中，上述抗體之實質擬人化結果產生極佳之擬人化抗體。因此，本發明之一般用途之一為用於製造及使用多種擬人.化免疫系統分子。如上述討論，本發明可用於擬人化多種免疫系統分 92407修正版 18 1351407 子’如：抗體與其片段。可敕擬人化尸許可傲了採用特定之本發明方法來製造 η變（v)功能部位或其抗原結合性片段。如上二t:性結合抗原之較佳片段典型地係與相應之v功能了 σ夥伴或片段組合一項具體實施例卜該方法包括至>、一個，較佳為下列所有步驟：夕松:^將非人類抗體可變⑺功能部位之架構區(FR)亞群 f酸序列與人類抗體架構或可變功能部位胺或其片段之序列集合庫進行比對， =集合庫t選拔與非人類FR亞群序列具有最高胺土酸一致性之人類FR亞群， c) 誘變非人類fr亞 A，以編碼一種其胺基酸群步驟b)料拔之人類fr亞群相同之擬人化 d) :非人類V功能部位中各FR亞群重覆步驟a)至 c)，以製造許多DNA序列，1中i ηχΓΔ十，人化FR亞群（huFR);及歹1編碼種擬 =來自步驟句之各贿驗序列插入至少編碼非之相能部位之第一載體中，取代該載體所編碼之相應非人類FR亞群；其中該取代作用操縱性連接各二FRs至其相應之互補性決定區(cdr);並將第一載體於伯細胞中’於可製造擬人化抗體V功能部位、完整抗體或其抗原結合性片段之條件下表現。要擬人化之V功能部位或抗原結合性片段將包括至少一個鼠科互補性決定區（CDR)。咸了解’免疫球蛋白輕鏈 92407修正版 19 1351407 與重鍵共有某些結構相似性’例如：各包括四種架構區亞群（FR1 -4)中之一種架構，其序列有相當大幅地保留。各 FR1-4 (FIU、FR2、FR3、FR4)利用三種 CDRs(亦即 CDR1、 CDR2、CDR3)共價連接。咸了解，四種FR主要呈石-層狀組態’而中間連接之CDRs則形成連接環，有些例子中，則形成一部份/5 -層狀結構。大多數CDRs保持密接FRs，且具有來自相反之輕鏈或重鏈之相應CDR，有助於形成抗原結合位置。許多種CDRs與FRs已被揭示。參見例如：

Kabat 等人之 Sequences of Proteins of Immunological

Interest Fifth Edition, U.S.Dept. of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office (1991) NIH Publication No· 91-3242。亦參見EP-A-0239400與美國專利案n〇. 5,985,279 (其說明製造改造抗體之方法，其中CDRs衍生自與FR不同之物種）。 —詞係指專一性結合抗原之至少一

泳法或分子篩析層析法， π抗原結合性片段部份抗體。此等片段音 J υ仟道爾吞之間，更佳為約2 5 卜、採用多種標準方法測定，包括使 t進行之SDS聚丙烯醯胺凝膠電質譜儀測定或胺基酸序列分析法。 20 924〇7修正版 1351407 ^ α適之抗原結合性片段包括至少部份抗原結合 ! 忐。卩位單獨或與關聯恆定（C)功能部位或其片段組合係'代表同一個免疫球蛋白重（Η)或輕（L)鏈之兩種成刀之間之相關性)。典型之c功能部位片段之分子質量在、力5仟道爾吞至約5()仔道爾吞之間，更佳為約工〇什道爾吞j、为40仟道爾吞之間’該分子質量係採用多種標準方法須J疋i括使用適當大小之標記物片段進行之sds聚丙稀酿胺，穋f泳法或分子篩析層析法，質譜儀測定或胺基酸序歹J刀析法。下文將揭示其他合適之抗原結合性片段。專眭結合"或類似名詞係指本文所揭示之分子與另一個刀子結合，藉以形成專一性結合之一對分子《然而，該分子並無法辨識或結合另一個分子，此結果係由例如：西方墨點ELISA、RIA、活動位移分析法（m〇bility shift assay)、酵素-免疫分析法、競爭性分析法飽和分析法或相Μ技藝已知之其他蛋白質結合性分析法測得。一般參見 Sambrook 等人之 MolecuIar cl〇ning: A Lab〇rat〇iy Ma^ai (2d ed. 1989);與 Ausubel 等人之 Current Pr〇t〇c〇ls in

Molecular Biology,John Wiley & Sons, New Y〇rk, i989 〇見 Harlow 與 Lane 之 Antib〇dies : A Lab〇rat〇ry (1988) Cold Spring Harbor，New York 等文獻中例如：檢測分子之間之專一結合性之方法。 "擬人化"一詞指免疫球蛋白中包括至少一種人類亞群’較佳為至少兩種或三種’更佳為四種人類FR亞群及非人類來源之一種或多種CDRs，通常來自嗡齒類如·· 924〇7修正版 21 1351407 大执或小白鼠免疫球蛋白。典型地，本發明較佳擬人化免疫球蛋白包括兩種或多種，較佳為三種cDRs。恆定功能部位不一定存在’但經常適用於協助擬人化抗體於活體内之使用功此。若存在較佳怪定功能部位時，其實質上與人類免疫球蛋白恆定功能部位相同’亦即在胺基酸序列方面至少約90%相同，較佳為至少約95%或以上相同。因此，除了 CDRs可能例外以外，幾乎所有擬人化免疫球蛋白之部份最好與天然人類免疫球蛋白序列之相應部份實質上相同。測定胺基酸序列一致性之方法係相關技藝之標準方法’且包括目視檢查及採用BLAST與FASTA，由電腦協助之方法（可自 National Library of Medicine (USA)網站取传）。大多數具體實施例之較佳配對程式可自國際 ImMunoGeneTicsCIMGT)網站之資料庫取得，且此具體實施例之更佳配對程式為稱為Match之程式，其可自Kabat資料庫取得，參見 johns〇n G，Wu T "Kabat database and 心 application ： Future directions." Nucleic Acids Res. (2001) 29 : 205-206 ° "擬人化抗體"一詞係指抗體中包括擬人化輕鏈與擬人化重鏈免疫球蛋白。參見上述§.L. Morrison ;上述等人之文獻；上述Teng等人之文獻；上述K〇zb〇r等人之文獻；上述Olsson等人之文獻；與先前引用之其他參考文獻。因此，"擬人化抗體片段"係指該抗體之一部份，較佳為可專一性結合抗原之部份。 92407修正版 22 1351407 如上述討論，本發明包括由各個別非人類FR胺基酸序列與所收集人類胺基酸序列，較佳為所收集包括人2員抗體架構胺基酸序列之序列進行比對並最適化之—個或多^ 方法步驟。操料，序列-致性分數最高之人類架構= 應於非人類抗體FR之FR’但搜尋參數並不要求此點。·, 相應"一詞係指來自抗體V功能部位上相同或類似位置之兩種FRS之關係，例如：來自特定抗體輕鏈之嚅齒類相應於來自該輕鏈之人類FR1。相應關係通常由fr編號表示’亦即屬齒類FIU相應於人類FR1，屬齒類fr2相應於人類FR2，等等。不万法之一項具體實施例中，上述v功能部位或片係來自非人類抗體輕鏈。如上述討論，FR亞群擬人化之實順序並不重要。因此’本發明-項具體實施例中，本法步驟a)之輕FR亞群將為第一個可變功能部位架構區义）然而其他具體實施例中，其他FR亞群將在FI 之前擬人化，例如·· FR2、FR3或FR4。刻^上述討論’本方法步驟b)涉及自許多人類胺基酸^ 列中選拔盥非Λ ^ 貞R亞群具有最大胺基酸序列一致性之人類FR亞群。_馆目触一項〃、體貫施例中，所要擬人化之非人_ 永褥為FR1，非乂 ^ ^ F人類抗體輕鏈之FR1與所選拔人類FR亞 80。/ ^序列—致性較佳為至少約7〇%，更佳為至少約 8〇/°’甚至更佳為至少約95%。亦如上述討给，枯― 為連續）進—文D特疋之本發明方法涉及反覆（典型作法订非人類架構區之擬人化。因此，首先操作 23 92407修正版 1351407 =之如具體實施例*，該方法、隨後包括操作叹2、與便:二I,之擬人化確實順序並不重要，但以方。’按數子順序進行，亦即FR1、FR2、FR3與FR4 輕與重架構之擬人化可能較有利。〃非人L此二發明具體實施例中’本方法步驟d)尚包括由人，或重鏈)V功能部位之第二個非人類架構區 1，=二集之序列比對，並選拔與其人類fr亞群(實際上八型地指人類FR2)具有至少約7〇% 類二亞群，較佳為至少約，更佳為至少約9= 法步驟d)尚包括由非人類輕鍵(或重鍵)V功第三個架構區(FR3)與所收集之序列比對，並選拔㈣序lFR亞群（實際上，典型地指人類阳）具有至少約 h致性之人類架構區，較佳為至少約80。/。，更佳 :對2㈣序列一致性。典型地’本方法步驟d)尚包括與所μ類輕鏈（或重鏈）V功能部位之第四個架構區（FR4) 上^之序列比對，並選拔與其相應人類架構亞群（實際構/地指人類FR4)具有至少約鳩序列一致性之人類性。…較佳為至少約8〇% ’更佳為至少約㈣序列一致 ::揭示内容咸了冑，本發明可用於擬人化多種免疫 :处：’包括任何雜二聚合似免疫球蛋白分子之輕鏈V 此#位、重鏈v功能部位，包括（但不限於）：τ_細胞受一'主要組織相容性複合物、抗體；與其抗原結合性片段。 -項具體實施例中，擬人化之輕鏈(或重鏈)包括下列依序 92407修正版 24 1351407 共價連接之成分： huFRl-CDRl-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4。本發明方法亦包括輕鏈或重鏈V功能部位之抗原結合性片段，且分子中尚包括相關之恆定功能部位與其片段。如上述，本發明一項目的為生產擬人化抗體（及抗原結合性片段），其中至少一個V功能部位上之潛在游標區遮蔽問題已儘量降低，最好已消除，本發明之特色有助於使免疫系統分子與其關聯抗原之間之專一結合性達最大程度因此，本發明一項具體實施例中，當非人類FR亞群與抗體V功能部位之相應人類FR亞群比對時，可變功能部位之至少-條輕鏈與重鏈上各FR亞群中游標區胺基酸殘基相同。例如：輕鍵或重鏈上非人類FR1之游標區胺基酸殘基應與人類FR1亞群中相應之殘基相同。本方法使用之第-個载體典型地包括所編碼之免疫系統分子於所需宿主中適當表現所f之序列資料。該免疫 2 =子為擬人化之輕鏈V功能部位之具體實施例中，若 :當合個載體尚包括人類輕鏈恆定功能部位或其片段時，部nr。典型（但非唯―）之作法為人類輕㈣定功能 4位或片段將共價連接擬人化之輕鏈。較佳具體實施例t，人齙私& L Γ ,.. 頰輪鏈恆定功能部位為c /c、或其片段。擬人化之輕鏈片段 on 5 ^ . 方奴之胺基酸長度經常在約 80至約250個胺基酸之間，酸之間，更佳為約_至約至約235個胺基 μ ea , , 25個胺基酸。擬人化之輕鏈月奴大小可由多種標準方 ^ 去決定，包括使用適當大小之標 92407修正版 25 1351407 記物片段進行之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法或分子篩析層析法，質譜儀測定或胺基酸序列分析法。其中擬人化之免疫系統分子為重鏈V功能部位之具體實施例_，擬人化之重鏈片段之胺基酸長度經常在約8 0 至約650個胺基酸之間’較佳為約95至約540個胺基酸之間，更佳為約102至約527個胺基酸，其可由例如：使用適當大小之標記物片段進行標準之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法或分子篩析層析法，質譜儀測定或胺基酸序列分析法測定。如上述討論，本發明之目的為提供住帘|稍〈默，、, 法，其中來自非人類免疫系統分子之各架構區分別與所^ 集之人類架構亞群比對。因此，例如：為嵌合抗體進行$ 人化時，由重鏈（HC)可變功能部位之第一個架構區（FR1: 序列與人類抗體之重鏈可變功能部位中FR 知序列比對。判別出一致性或同質性程度最高之 = 基酸序列中不符合處最少者）。然後最好由HC之各FR2 FR3與FR4重覆該過程。以輕鍵之可變功能部位中❿# 行類似過程。依本發明計晝用途之需要，自相同或不同由體中取出最適配之人類叹亞群。此點顯著不同於其他擴人化法之處在於後者所選拔最適配序列為來自單一體序列中之整個單一架構。本方法之特定具體實施例中，第一個載體尚包括盥指化重鏈共價連接之人類重鏈怪定功能部位或其片段二較佳者，人類怪定功能部位為邮卜哪挪或 924〇7修正版 26 1351407

IgG4同型或其片段中之一者。 "嵌合抗體"或包括複數型式之相關名詞係指抗體之輕鏈與重鏈基因已由屬於不同物種之免疫球蛋白基因節段進行構築，典型地採用基因工程法。例如：來自小白鼠單株抗體之基因之可變（V)功能部位可連接人類恆定（c)功能部位如.71、7*2、*T3、或1Γ4。因此典型之醫療用嵌合抗體為由來自小白鼠抗體之V或抗原·結合性功能部位與來自人類抗體之C或效應物功能部位組成之雜化蛋白質，但亦可使用其他哺乳動物物種。明確之嵌合抗體為下文將說明之抗組織因子抗體CH36與抗_脂壁酸抗體c96_110(有時候稱為All 0)。如上述讨論，本發明方法可由非人類抗體可變（V)功能 σ|Μ立架構區（FR)之胺|酸序列與許多人類胺基酸序列進行比對，較佳為與所收集之人類抗體架構胺基酸序列或其片長之序列進行比對。此等自資料庫收集之序列實例包括完全^序之人類抗體列表。不同於先前技藝之擬人化，所收集資料庫可另包括部份定序之人類抗體中—個或多個胺基酸序列。或者’所收集之資料庫中可基本上僅包括部份定序之人類抗體。此等收集之資料庫包括（但不限於）下列資料庫 GenBank、IMGT、Swiss-Prot 與上述之 Kabat。本發明更特定之實例中，提供一種製造擬人化抗體或其抗原-結合性片段之方法。一項具體實施例中，該方法包括至；一個，最好所有下列步驟： a)將非人類抗體輕鏈可變（v)功能部位架構區（UR)之 27 92407修正版 1351407 胺基酸序列與所收集之人類抗體輕鏈架構胺基酸序列進行比對， b) 自收集資料庫中選拔與㈣具有最高胺基酸序列一致性之人類FR亞群， c) 誘變1-FR中之DNA ’卩編碼與步驟匕）中所選拔人類FR亞群具有實質上相同胺基酸序列之輕鍵擬人化fr 亞群（L-huFR)，句對輕鏈V區中各FR亞群重覆㈣3)至〇,產生許多DNA序列，其中各DNA序列編碼L_huFR， e) 將來自步驟d)之各L_huFR DNA序列插入至少編碼非人類抗體之輕鏈V功能部位之第一載體中，取代該載體所編碼之相應1-FRs ;其中該取代作用操縱性連接各 L-huFRs至其相應之互補性決定區（cdr)， f) 將非人類抗體重鏈可變（V)功能部位架構區（h_FR)之胺基酸序列與所收集之人類抗體重鏈胺基酸序列進行比對， g) 自收集資料庫中選拔與h-FR具有最高胺基酸序列一致性之人類FR亞群， h) 誘變h-FR中之DNA ’以編碼與步驟g)中所選拔人類FR亞群具有實質上相同胺基酸序列之擬人化重鏈亞群（H-huFR)， i) 對非人類重鏈V功能部位中各h-FR亞群重覆步驟 f)至h) ’產生許多DNA序列’其中各DNA序列編碼 H-huFR， 28 92407修正版 1351407 j) 將來自步驟i)之各H-huFR DNA戽列枯 , 八斤列插入至少編碼非人類抗體之重鏈V功能部位之第二載體中机通甲’取代該該抗體之相應h-FRs ;其中該取代作用操縱性連接各至其相應之重鏈CDR，及 k) 將第一與第二載體於宿主細胞中，於可產生擬人化輕鏈與重鏈並製造擬人化抗體或其片段之條件下表現。上述方法之具體實施例中，由第一與第二載體於同一個宿主細胞中表現。另一項具體實施例中，編碼擬人化輕鏈與重鏈或其片段之DNA分子包含在單一載體上，並於同一個宿主細胞中共同表現。適用於上述抗體擬人化法之之第一載體包括所編碼免疫系統分子之適當表現所需之序列資料。例如：可接受之第一載體包括與擬人化輕鏈V功能部位共價連接之人類輕鏈恆定功能部位或其片段。較佳者，該恆定功能部位為 C/c、C<r或其片段。根據本發明方法，較佳之第二载體典型地尚包含與擬人化重鏈V功能部位共價連接之人類重鏈恆定功能部位或其片段。例如：人類恆定功能部位可為IgGi、IgG2、IgG3 或IgG4同型，包括其片段，或其他同型（igA、jgD、igE 或IgM)中之一者。本發明亦可與其他用於自共同天然存在之細胞成分中純化擬人化免疫系統分子之步驟相容。因此，一項具體實施例中，上述方法尚包括一個或多個自宿主細胞中純化擬人化抗體之步驟，以製造實質上純之抗體製劑。較佳者， 29 924〇7修正版 1351407 該實質上純之擬人化抗體與抗原之專—性結合親和性不會比親代非人類抗體低超過約1 〇倍。咸了解，本發明可用於製造許多種擬人化免疫系統分子。例如：本發明之擬人化抗體包括；丨）輕鏈與重鏈架構區（FRs)，其與人類FR亞群之胺基酸序列分別約9〇%相同’較佳為至少95%相同，更佳為至少約％%至相同，2)至少一種來自嚆齒類（如：小白鼠）之CDR，較佳為所有CDR均來自小白鼠，3)以及一免疫球蛋白恆定功能部位，其與相應之人類免疫球蛋白恆定功能部位至少約9〇% 相同，較佳為至少95%至約100%相同。咸了解，枋俨經過"擬人化法"進行"擬人化”，因為所得之擬解人化= 結合之抗原應與提供CDRs之抗體所結合之抗原相同。亦咸了解’本文所揭示之特定擬人化免疫系統分子，通常指擬人化抗體，可另具有—個或多個保留性胺基酸取代，其可依需要為連續或非連續。例如：&等取代作用典 ^•地對抗原結合性或其他免疫球蛋白功能之影響實質上招小或沒有。·•保留性取代"包括多種型式之組合：giy—— ala，va卜———leu ; asp —―咖；_ ——呂匕；如― thr lys —— arg ;與 phe ——tyr 〇 .所揭不之方法與分析法所使用之本發明抗體最好相當純。抗純"意指該抗體或蛋白冑已自其他共同天 :存在之成分中分離。例如：採用標準之免疫親和性或蛋質A親和性純化技術’本發明抗體可自融合瘤中或細胞培養基中，使用天'然TF作為抗原或蛋白f A樹脂純化。 924〇7修正版 30 U51407 问樣地，天然TF可使用本發明抗體，利用標準免疫親和性純化技術得到相當純型。特定言之，當至少跳總蛋白質（占減樣本中總蛋白質重量為本發明抗體或蛋白質時，則該抗體或蛋白質相當純。較佳者該抗體或蛋白質占總蛋白質至少60重量％，更佳為至少75重量％，甚至更佳為至少90重量％，最佳為占總物質至少％重量❶、。 :度报容易依已知方法分析’如：SDS聚丙烯醯胺凝膠電法（PAGE)、管柱層析法（例如：親和性層析法 '分子筛析層析法）、質譜儀或HPLC分析法。此等相當純之擬人化抗體可用於專一性結合多種抗原例如.在一項具體實施例中，本發明所產生之抗體可用於專一性辨識與結合脂壁酸或相關脂肪酸。並製造可專 f辨識與結合人類組織因子之其他擬人化抗體與片段。 '根據本發明擬人化免疫系統分子提供多種重要用途。例如：本發明之擬人化抗體與抗原結合性片段可用於預防或治療人類或動物疾病。其他用途包括用為診斷產品。 _依據本發明之方法擬人化之抗體报容易自多種來源取仔。或者’其可重新製造。其中一種製造此等分子之方 :為使用天然人類TF之純化樣本，或如上述討論之免疫、肽可單獨或與載劑複合，或與輔劑形成混合物，接 :動物。合適之哺乳動物包括典型之實驗室動物如:綿羊、兔子、天竺鼠、大鼠與小白鼠。大鼠與小白鼠，尤 a小:鼠，較適用於取得單株抗體。抗原可依許多任何合適途僅投予，如：皮下、腹膜内、靜脈内、肌内或皮内注 924〇7修正版 31 1351407 3。最佳之接種間隔、接種劑量’等等可在相當大範圍内、可依據示内容試驗決定。纟&之方法涉及在，個月内庄射抗原數次。採用標準技術自已接種之動物血清中收集抗體並篩選發現針對所需抗原之專一性抗體。單株抗體可於會產生抗體之細胞中產生，及於彼等經採用可形成融合瘤細胞之標準融合技術而生產單株抗體之細胞中產生。參見 G. Kohler 等人之 Nature 256 : 456(1975)。典里也此作法涉及由產生抗體之細胞與永續細胞株（如··骨髓細胞瘤細胞）融合，產生融合細胞。或者，單株抗體可由細胞採用Huse等人說明於Science，256: 1275 (1989)中之方法產生。此等抗體若需要時，可採用一般方法定序。有些用途中可能需要使用嵌合抗體作為計畫擬人化之抗體，例如：由非人類動物可變功能部位與人類恆定功能部位組合形成之抗體分子。可製備多種此等嵌合抗體，包括例如··製造人類可變功能部位嵌合體，其中有部份可變功能部位（尤指抗原結合性功能部位之保留區）係來自人類，且僅超變區來自非人類來源。有關擬人化嵌合抗體與其製方法亦參見 S.L. Morrison, Science，229: 1202-1207 (1985) ; 〇i 等人之 BioTechniques 4 : 214 (1986) ; Teng 等人之 Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.，80 : 7308-7312 (1983); Kozobor 等人之 Immunology Today 4 : 72-79 (1983); Olsson 等人之 Meth. Enzymol. 92 : 3-16 (1983)。此外，可使用轉殖基因小白鼠來製造特定之人類單株抗體。例如：已創造出帶有人類抗體組成内容之轉殖基因小 92407修正版 32 1351407 白乳，其可接種所要探討之抗原。來自此等已接種之轉殖基因小白鼠之脾細胞即用於創造可分泌與抗原專一性反應之人類單株抗體之融合瘤。參見N. Lonberg等人之Nature， 368 : 856·859 (1994) ; L.L.Green 等人之 Genet，7 : 13-21 (1994); S.L. M〇rrison，等人之 Pr〇c Natl Acad sci.U.S.A.，81 : 6851-6855 (1984)。編碼本發明抗體之核酸亦可利用聚合酶連鎖反應製備（參見下文中實例1所揭示之引子）。一般參見Sambr〇〇k 等人之Molecular Cloning(第2版1989)。此等核酸亦可依已知方法合成’例如：磷酸三酯法（參見〇lig〇nucle〇tide Synthesis，irl press (M. j. Gait，ed.，1984))或採用可自商品取得自動化寡核苷酸合成儀。所製成之此等本發明核酸可用於利用已知技術表現本發明抗體。例如：編碼本發明抗體之核酸可依已知方法引進至合適之載體中，如：使用限制酶切割載體，供嵌入構築體，然後黏接。含有嵌入核酸序列並與啟動子序列適當地操縱性連接之載體隨後引至要進行表現之宿主細胞中》一般參見上述Sambr〇〇k等人之文獻。合適之載體可依據與選殖法相關之因素進行試驗選出。例如：載體應與所使用之宿主細胞相容且具有適當之複製子。此外，載體必須可適應所嵌入之核酸序列。合適之宿主細胞將包括多種原核生物或真核生物細胞，如：大腸桿菌（E. coli)、枯草桿菌（Bacillus subtilis)、變鉛青鏈被菌（Streptomyces lividans)或其他細菌性宿主、酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)或其他酵母菌，黑曲黴 33 924〇7修正版 1351407 (Aspergillus niger)或其他真菌、或其他微生物宿主 CHO、BK或NSO哺乳動物細胞、鳥類或植物細胞，等等。根據特定之本發明具體實施例，本文所說明方法包括之步驟為於適合載體於彼等細胞中表現之條件匕 '' ^ $丨進一種或多種所需載體型至細胞中。所需之特定植物細胞為擬南芬屬（Arabidopsis)。參見美國專利案ν〇· 6,417 429與其中摘錄之文獻。例如：上述製造V功能部位或其抗原結合性片段之方法中，步驟e)包括將第一個載體引至植物細胞中，^擬南芬屬（Arabidopsis)細胞較佳，並由該等載體於其中表現，產生抗體V功能部位。該方法很容易用於表現完整抗體（包括其抗原結合性片段）。上述製造擬人化抗體或其抗原-結合性片段之方法中，步驟k)包括將第一個與第二個載體引至植物細胞中，以擬南芥屬（Arabid〇psis)細胞較佳，並由該等載體於其中表現，產生所需分子。有些本發明具體實施例中，可改用下文中稱為"mega"之載體替代該第一個與第二個載體。本發明抗體之分子量依數種因素而異，如：計畫用途及該抗體是否包括共軛或重組之融合毒素、醫藥、放射性同位素或可檢測之標記物，等等，分子量亦可依抗體可能進行之任何轉譯後修飾法（如：糖苷化）之性質及程度而異。該修飾法則隨用於表現之宿主為產生非糖苷化抗體之大腸桿菌及產生糖苷化抗體之真核細胞如：哺乳動物細胞而疋通常’本發明抗體之分子量為約2〇至15〇kDa之間。 34 92407修正版 1351407 此等分子量很容易採用分子篩析法測定，如： SDS-PAGE，然後進行蛋白質染色或西方墨點分析法。 ”本發明抗體"或其他類似名詞係指完整之免疫球蛋白及可結合所需抗原之免疫活性片段。該免疫球蛋白與其免疫活性（抗原結合性）片段包括抗原決定基結合性位置（亦即可與辨識抗體之抗原專一性結合之位置或抗原決定基）。抗體片段實例包括例如：Fab、F(v)、Fab,、F(ab,)2片段，"半分子"係由免疫球蛋白、單鏈免疫球蛋白、或其他抗原結合性片段之二硫化物鍵結還原而來（參見例如：Bird 等人之 Science，242:423-426 (1988);HUSt〇n 等人之 PNAS, (USA), 85 . 5879 .(1988) ; Webber 等人之 Mol.

ImmUn〇L，32 : 249 (1995))。抗體或其免疫活性片段可來自動物（例如：噛齒類如：小白鼠或大鼠）、或呈嵌合型（參見

Morrison 等人之 PNAS，81 : 6851 (1984) ; Jones 等人之 Nature，321 : 522 (1986))。本發明之單鏈與擬人化抗體適用於本發明某些用途。因此根據另一項具體實施例，上述方法尚包括其他步驟，以便自擬人化v區製備擬人化單鏈抗體（sc_Fv)。此外，擬人化抗體之片段可依一般方法製造，特定言之F(v)、 F(ab')2、Fab'或Fab ;及其抗原結合性片段。同樣地，"本發明之核酸"係指可表現產生本發明上文中明確說明之抗體之核苷酸序列〇有些例子中’可能需要修飾本發明抗體，以便賦與所需之生物、化學或物理性質。因此本發明方法可與其他用 92407修正版 35 1351407 於使一個或多個擬人化免疫系統分子與醫藥劑共軛（亦即共價連接）之一般步驟相容。此等連接法可採用幾種方法完成，包括使用連接分子如：雜雙功能性蛋白質交聯劑，例如：SPDP、碳化二亞胺，等等，或利用重組法。可與本發明擬人化抗體之用法相容之特定共扼法已揭示pct申請案 WO 99/21572(頒與 Rhode，P.等人）。亦參見 Ausubel 等人之 Current Protocols in Molecular Biology，john wiley &

S_，New York，（1989) ; Harlow 與 Lane 之 Antibodies : A

Laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988)。本發明之特定擬人化抗體可為多株或單株，依需要而定’且可具有（但不限於）：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型或 IgA、IgD、IgE、IgM。本文所揭示擬人化抗體可由下文實例1 _ 9中說明之.一種或多種組合方法製造。實例1與4說明之方法中，採用四種—般步驟為抗體進行擬人化。首先，由來自cH36小白氣_人類嵌合抗體得到小白鼠抗體輕鏈與重鏈之胺基酸序列。第二，決定哪一個人類抗體架構區可產生"最適配”，亦即最類似小白鼠架構區胺基酸序列者，對cH36進行擬人化。第三，由相關之輕鏈與重鏈FR序列進行擬人化及第四，由所單離之編碼擬人化輕鏈或重鏈（或擬人化輕鏈與重鏈，例如：參見下文說明之mega載體）之核酸（群）進行轉染及表現。更特定言之，採用"FR最適配"方法來進行嵌合抗組織 924〇7修正版 36 因子抗體cH36之擬人化β 1Β ίϋ ^ ^ 4- ^ ^ 法中，使用示於第1Α與 2圖之鼠餘鏈與重射變功能部位序列⑽㈣ NOS.: 2與4)來搜尋（，，比對，彡所百了取得之蛋白質資料庫，寻找與鼠科可變功能部位同I ' ………曰门質性最1^之人類抗體可變功能部位序列。參見例如：上 ^ ^ χθ bat等人之文獻。可採用許夕谷易取得之電腦程式進行此舟

.^ Ha 、、琨仃此步驟，如：BLAST、FASTA 與相關之程式。輕鏈與重鍵牟蜓又罙構區^ 2、3與4特別值付注意’因為此等位置幾乎如+ 戍十已疋全了解，足以將CDRs保留在適σ抗原結合之取向上。始么搜尋後之結果輸出典型為與二Γ 序列最具同質性之序列列表，與各序列之 =性百分tb’及各人類序列與相應鼠科序列之排列。該刀析通常分別於輕鏈與重鏈上進行。根據FR最適配方法，所探討小白鼠亞群與人類 R亞群之間不符合之胺基酸數量會降至最少。大多數例子中，合適之人類架構區亞群係依據下列—致性標準選拔。以輕鏈為例，鼠科FR1之胺基酸序列與人類⑽亞群至少約贈〇相同；鼠科FR2與人類FR亞群至少約9〇%相同；鼠科FR3與人類FR亞群至少約9〇%相同；及鼠科剛與人類FR亞群至少肖75%相同。以重鏈為例，所選拔鼠科 _之胺基酸序列與人類FR亞群至少約8〇%相同·鼠科 2與人類FR亞群至少約85%相同；所選拔鼠科與人類FR亞群至少約70%相同；及鼠科FR4與人類FR亞群至少約90%相同。典型地，當評估類似之人類架構區候選序列時，以保留性胺基酸取代作用優先。已梦現，當考 92407修正版 37 1351407 慮此等因素時’所得之人類架構區即可作為嵌合性6 抗體進行擬人化之良好參考點。旦決定製造所需之人類架構區後，即採用重組聚合酶連鎖反應（PCR)技術，於輕鍵與重鏈二者中製造所需之胺基酸取代。典型地，製造募核苷酸，用於使小白鼠可變功此部位架構突變，而因此包含所需之殘基。可採用多種不同長度之寡核苷酸。參見W〇 92/07075中有關重組體 PCR與相關方法之一般說明。通常，採用例行之PCR進行選殖，引進選殖或診斷用核酸内切限制酶切割位置及改變可變功能部位末端位置上之胺基酸殘基。採用以PCR為主之誘變法一次改變多個胺基ISL殘基’尤其當此等殘基位於可變功能部位之中間時。採用定點誘變法一次引進1或2個胺基酸取代。各步驟之後’為部份擬人化純系定序，其中有些可變功能部位則在後來選殖進入表現載體中。進行此等操作法之更明確方法說明於實例中。進行上述”FR最適配"方法為各非人類FR進行擬人化後，使編碼擬人化架構區（huFR)與/或CDR之突變核酸連接編碼輕鏈或重鏈恆定功能部位之適當DNA 。此等構築. 體隨後再選殖進行表現載體中，並轉染至宿主細胞中，以哺乳動物細胞較佳。此等步驟係採用相關技藝已知之重組法與細胞培養技術完成。有一種製造擬人化抗體之一般方法如下： (a)製備第一個表現載體，其包括適合表現宿主之複製 38 924〇7修正版 1351407 子及操縱性連接DNA序列之合適啟動子，該DNA序列至 ^編碼Ig重鏈或輕鏈之可變功能部位，該可變功能部位包含來自所需抗體之各個擬人化之架構區（FR1_4)與鼠科 CDRs 1-3 ; (b) 製備第二個可複製之表現載體，其包括操縱性連接 DNA序列之合適啟動子，該DNA序列至少分別編碼互補 Ig輕鏈或重鏈之可變功能部位，該可變功能部位包含來自抗體之各個相應擬人化架構區（FR1-4)與鼠科CDRs 1-3 ; (c) 使用第一個或兩個已製成之載體轉染細胞株；及 (d) 培養該轉染之細胞株產生該擬人化抗體。步驟（a)與（b)中之DNA序列最好編碼來自人類抗體鏈之合適恆定功能部位。合適之同型包括例如（但不限於）：

IgGl 與 igG4。或者’本發明合適之擬人化抗體可由製造單一可複製之mega載體而製得’該載體包括操縱性連接dna序列之適當啟動子，該DNA序列至少編碼Ig重或輕鏈之可變功能部位’該可變功能部位包含來自所需抗體之各個擬人化架構區（FR1-4)及鼠科CDRs 1-3。一項具體實施例中，mega載體尚包括操縱性連接DNA 序列之適當啟動子，該DNA序列至少分別編碼互補Ig輕鏈或重鏈之可變功能部位，該可變功能部位包含來自cH36 抗體或其他合適CDRs之各個相應擬人化架構區（FR1_4)與鼠科CDRs 1-3。若需要由單一載體表現擬人化抗體時，經常適合使用mega載體。 92407修正版 39 1351407 咸了解’上述製造擬人化CH36抗體之方法报容易用來製造根據本發明其他擬人化抗體與抗原結合性片段。

極適合本發明擬人化法之特定抗體實例揭示於USSN

No. 09/990,5 86 ;與60/343，306申請案及其實例中。 "組合’’意指採用標準重組技術來引進編碼擬人化架構或架構區之所需DNA序列至載體中。此等組合法可依下列一種方法或多種方法之組合進行，包括（但不限於）：引進反複之變化至單一架構或架構區序列中，切割及共同黏貼片段（利用核酸内切限制酶與黏接酶），或利用合成性 ΟΝΛ合成技術。一般參見上述Harl〇w與Lane之文獻，及上述Ausubel等人之文獻。上述擬人化抗體之方法可使用幾乎任何可接受之誘變技術操作。特定言之，相關之方法步驟可使用定點誘變法與/或標準PCR方法，以適當人類胺基酸置換架構中所需之《類胺m亦可採用已修飾之片段或整個編碼區進行DNA合成法，或採用標準重組體DNA進行活體外重組法或基因工程技術或其任何組合來達成。典型地，已修掷（擬人化）之架構或架構區之序列相應於自資料庫中選拔之人類架構或架構區序列。本發明合適之核酸至少編碼一種本文所揭示之擬人化抗體之重或輕鏈或片段。血』

！地該核酸為重組體DNA 載體，其包括單離之核酸。該邊UJNA載體典型地尚包括操 ^ 生連接擬人化免疫球蛋白編碼序列之表現控制聚核苦酸序列’包括天然結合或異源性之啟動子區。較佳者，表現 92407修正版 40 1351407 控制序列為含在可轉化或轉染真核生物宿主細胞之載體中之真核生物啟動子系統，但亦可使用原核生&冑主之栌制 2。-旦載體引入適當宿主中後，宿主即保持在適：高現核㈣序列之條件下，需要時，隨後收集及純化輕鍵、重键、輕/重鍵二聚體或完整抗體、結合性片段或盆他免疫球蛋白型。〃最、’、可表現所需擬人化抗體之本發明核酸序列可由多種不同聚核㈣（基因組或eDNA、RNA、合成性寡核苦酸，等等）與組成分（例如：V、J、D與C區），及採用多種 Z同技術形成。接合適當基因組與合成性序列之方法為目前最常用之製造法’但亦可利用cDNA序列。參見例如：上述S.L. M〇rHS〇n之文獻，上述⑴等人之文獻，上述Teng 等人之文獻’上述Kozbor等人之文獻，上述〇lss〇n等人之文獻；歐洲專利公告案No.0239400與Riechmann L等人之Nature，332:323_327 (1988);與其中㈣之文獻。本發明可用於許多種合適之宿主，例如：哺乳動物、植物或微生物宿主細胞。—項具體實施例中，合適之D财土現載體包括一個或多個選拔標記物，例如：四環素、胺卞青黴素、遺傳黴素（geneticin)、海格黴素（⑷、嘌呤黴素（puromycin)或新黴素（或類似物），以便檢測彼等經所需DNA序列轉化之細胞（參見例如：纟國專利案版 4’704,362’其揭示内容已以引用之方式併入本文”。大腸桿菌為一種特別適用於選殖本發明聚核苷酸之原核生物宿主。其他適用之微生物宿主包括（但不限於）桿菌，如：枯 92407修正版 41 1351407 草桿菌（Bacillus subtUus)，與其他腸桿菌，如：沙門氏菌 (SaimonelU)、沙雷氏菌（Serralia)、多種假單胞菌屬 (Pseudomonas)及其他微生物如：放線菌類（例如：鏈黴菌屬（Streptomyces species))、酵母菌（例如：釀酒酵母菌屬 (Saccharomyces species))或真菌（例如：曲黴屬（Asperg川μ species))。此等原核生物宿主中，亦可製造表現載體，其典型地包含可與宿主細胞相容之表現控制序列（例如：啟動子與複製起點）。此外，任何數量之多種已知啟動子均可存在，如：乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統 '万_ 内醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體_又之啟動子系統。啟動子典型地控制表現，可視需要使用操縱子序列，且具有與核糖體結合位置序列，等等，供啟動及完成轉錄與轉譯。' 其他微生物如：酵母菌，亦可用於表現。釀酒酵母為具有合適載體之較佳宿主，該載體中含有表現控制序列，如：啟動子，包括3-磷酸甘油酯激酶或其他糖原酵解酵素 (glycolytic enzyme)，及依需要含有複製起點、終止序列，等等。除了上述以微生物為主之系統外，亦可使用真核生物宿主來表現及生產本發明之多肽（參見Winnacker，"Fr〇m

Genes to Clones"，VCH Publishers，N.Y.，N.Y. (1987)，其揭示内容已以引用之方式併入本文中）。許多具體實施例中，真核生物宿主通常較佳’典型地使用哺乳動物細胞株（但不限於）包括：CH0細胞株、多種不同c〇S細胞株、NSO細胞、BK細胞、HeLa細胞，較佳為骨髓細胞瘤細胞株，等 42 92407修正版 1351407 等，或融合瘤之轉形B-細胞。此等細胞之表現載體可包括表現控制序列，如：複製起點、啟動子與加強子（Queen等人之Immunol. Rev. 89: 46-68 (1986))，及必要之處理資料位置，如.核糖體結合位置、RNA接合位置、聚腺苷化位置、與轉錄終止序列。較佳表現控制序列為衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、細胞巨病毒，等等之啟動子。其他具體實施例中，真核生物宿主中，若真核生物宿主為植物或植物細胞時通常較佳其包括（但不限於）例如：擬南芥屬（Arabidopsis)、菸草屬（Nic〇tinia)，等等，且植物細胞培養物亦可用於表現與生產本發明抗體。其他具體實施例中，若真核生物宿主為尾蟲細胞、鳥類細胞或轉殖基因動物時通常較佳。、較適合實行本發明之DNA載體包括下列依序操縱性連接之.抗生素抗性標記物，例 > :胺苄青黴素抗性、扪起點與重鏈（HC)或輕鏈（Lc)可變功能部位。該可變功能部位可嵌入適當HC表現載體中，後者包括依序操縱性連接之：HC可變功能部位、人類Igm或工卿，座定功能部位、第-個聚A位置' SV40啟動子、抗生素抗性標記物如：㈣素抗性、第二個聚A位置、細胞巨病毒（cmv)啟動子 /加強子及合適之前導序列。 .其他較佳DNA載體包括操縱性連接囑齒類λ _插入子 (intron)(例如：小白鼠）之lc可變功能部位，該插入子操縱性連接合適之人類恆定功能部位；與抗生素抗性標記物如：新黴素抗性。 43 924〇7修正版 1351407 如上述討論，若能由單一核酸表現本發明擬人化抗體將會極有用。較佳DNA裁體有時候在本文中稱為，,咖〆載體’其包括依序操縱性連接之下列構成要素：sv4〇啟動子、抗生素抗性標記物如：新黴素、第一個聚A位置、第一個CMV啟動子/加強子、丄& a 加通于可變功能部位、嚅齒類_ 插入子（例如：小白鼠）、人類表現子（ex〇n);第二個聚 A位置、第二個CMV啟動子/加強子、hc可變功能部位與人類IgGl或IgG4重鏈值定功能部位。此等咖脬載體之明確實例為擬人化抗-TF IgGl抗體表現載體，其說明於下文中實例1-3。亦參見第2圖。 A.擬人化抗-組織因子結合性抗體之製法擬人化抗組織因子結合性抗體之製法與用途已說明於申請中之美國申請案No. 09/990,586與60/343,306。亦參見下文中實例1-3。簡言之，較佳之抗體結合人類組織因子形成結合複合物。組織因子可為天然或重組之人類（rhTF)。較佳者，因子X或因子IX對複合物之結合性係經抑制。本發明較佳具體實施例中，擬人化抗體對hTF之表觀親和性常數（Ka， Μ·1)低於約1 nM;較佳為低於約0.5nM，更佳為約0.01 nM 至約0.4 nM之間。參見下文中實例1 -3中有關測定擬人化抗體親和性常數之更詳細資料。"專一性結合"意指擬人化抗體與TF(或rhTF)，但不與其他抗原，形成可檢測之結合複合物，其係由標準免疫技術測定如：RIA、西方墨點或 ELISA。 924〇7修正版 44 根據本發明製備之更佳擬人鈇人類TF夕主％匕抗_TF結合性抗體對天 …、人類TF之表觀親和性常數（Κα，Μ·,

H^M·1，其係由袅面皙粉其，·，，夕約1 X T ic Ψ Ψ^ι , ，刀析法測疋（特定言之根據下文r貫例3之BIACore分枳沽、击从从，组八#)’更佳為由表面質粒基因汲刀析法測传之至少約5 l s丨 iVI 對天然人類TF亦#祛之表觀親和性常數先丄顆^亦更佳 /·生常數(Ka，M )為由表面質粒基因組分析法測付之至少約3 χ 1〇9M·!。本贫月抗體之此等相當高之結合親和性顯然與過去文獻所郝又馱所報告之極低之結合親和性相反。因此’可使用相當低有效濃度之擬人化組織因子結合 f抗體例如.可如下文中實例3所述，於活體外分析法中使用相當低濃度之抗體來抑制上述tf功能（例如：至少約95、98或99%抑制性）。已經過本發明方法擬人化之特定組織因子結合性抗體之核酸（SEQ ID N0S.1與3)與胺基酸（剛ID N〇s 2與 4)序列，亦即H36.D2.B7。參見第1A與1B圖。SEq m NOS. 1與2分別為輕鏈可變功能部位之核酸與胺基酸序列’ SEQ ID NOS. 3與4分別為重鏈可變功能部位之核酸與胺基酸序列，其中所有彼等序列中之超變區（CDRs或互補性決定區）以下加線表示。本發明其他組織因子結合性擬人化抗體將與第1A與 1B圖所示輕鏈或重鏈序列中之一或二者之胺基酸序列具有相當高一致性。更特定言之，此等抗體包括彼等與SEq ID NOS. 2及/或4具有至少約7〇%同質性（胺基酸序列一致性）者’更佳為與SEQ ID NOS. 2及/或4具有約80%或以 45 92407修正版 1351407 上之同質性，亦更佳為與SEQ ID NOS. 2及/或4具有約 85、90或95%同質性。更特定言之，本發明之組織因子結合性擬人化抗體與 SEQ ID NOS. 2與4)之超變區具有高度胺基酸序列一致性 (於第1A與1B圖中以雙下加線表示）。明確之抗體將具有輕鏈可變功能部位之1、2或3個超變區，其與H36.D2.B7 之輕鏈可變功能部位之1、2或3個相應超變區具有高度或相同序列一致性（至少90%或95%胺基酸序列一致性），彼等超變區示於第1A圖中，以下加線表示，如下： 1) LASQTID (SEQ ID NO. 5)； 2) AATNLAD (SEQ ID NO· 6);與 3) QQVYSSPFT (SEQ ID NO. 7)。經過本文所述發明方法擬人化且會結合組織因子之其他明確抗體將具有重鏈可變功能部位之1'2或3個超變區，其與H36.D2.B7之重鏈可變功能部位之1、2或3個相應超變區具有高度或相同序列一致性（至少90%或95% 胺基酸序列一致性），彼等超變區示於第1B圖中，以下加線表示，如下： 1) TDYNVY (SEQ ID NO. 8)； 2) YIDPYNGITIYDQNFKG (SEQ ID NO. 9);與 3) DVTTALDF (SEQ ID NO. 10)。本發明某些核酸之長度（較佳為至少約100、200或250 個鹼基對）最好足以結合SEQ ID NO.l與/或SEQ ID N0.3 之序列，其結合條件為下列中度嚴格條件（本文中稱為”正 46 92407修正版 1351407 吊嚴格條件）.採用雜交作用緩衝液，包含2〇%福馬林之 0.9M生理食鹽水溶液/〇〗2鲥檸檬酸鈉（6xssc)緩衝液，溫度 C於3 7 C下以2 X S S C緩衝液洗蘇一次，仍保持結合者。更月禮。之，本發明某些核酸（最好至少約或=0個驗基對）將於下列高度嚴格條件下（本文中稱為"高度嚴格"條件）與SEQ ID N0.1與/或SEQ ID N〇3之序列結合.採用雜交作用緩衝液，包含2〇%福馬林之〇 9M生理食鹽水溶液/0.12M檸檬酸鈉（6xSSC)緩衝液，溫度42<t，於42°C下以1X SSC緩衝液洗滌二次，仍保持結合者。本發明核酸最好包含至少20個鹼基對，更佳為至少約50個鹼基對，亦更佳為本發明核酸包含至少約【⑽、 200、250或300個鹼基對。通常較佳之本發明核酸將表現具有較佳結合親和性及本文中說明之其他性質之本發明抗體。本發明其他核酸亦與第1八與1B圖所示輕鏈或重鏈中之一或二者之序列具有相當高序列一致性。更特定言之，較佳核酸所包含之序列與SEqIDn〇Si與/或3具有至少約70。/。同質性（核苷酸序列一致性），更佳為與少 NOS.1與/或3具有至少約8〇%或以上之同質性亦更佳為與SEQIDNqS1與/或3具有至少約85、9〇或％%或以上之同質性。本發明其他明確之核酸序列與SEq ID N〇s 1與3之超變區具有高度序列一致性（示於第1A與ιΒ圖，以下加 92407修正版 47 1351407 線表示）。此等核酸包括彼等編碼抗體輕鏈可變功能部位且具有編碼超變區之1、2或3個序列且與編碼H36.D2.B7 之相應超變區之1、2或3個序列具有高度或相同序列一致性（至少90%或95%核苷酸序列一致性），彼等超變區示於第1A圖中，以下加線表示，如下： 1) CTGGCAAGTCAGACCATTGAT (SEQ ID NO ： 11)； 2) GCTGCCACCAACTTGGCAGAT (SEQ ID NO： 12)；與 3) CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT (SEQ ID NO : 13)。更明確之核酸亦編碼抗體重鏈可變功能部位且具有編碼超變區之1、2或3個序列且與編碼H36.D2.B7之相應超變區之1、2或3個序列具有高度或相同序列一致性（至少9 0%或95%核苷酸序列一致性），彼等超變區示於第1A 圖中，以下加線表示，如下： 1) ACTGACTACAACGTGTAC (SEQ ID NO. 14)； 2) TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGAC CAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO. 15);與 3) GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC (SEQ ID NO. 16)。本發明與TF結合之更明確之擬人化抗體為彼等其中各架構區（FRs)l、2、3與4與第3A圖所示輕鏈FR序列 (SEQ ID NOS· 72至82)(該序列於第3A圖中以"LC-09”表示較佳）具有至少約90%胺基酸序列一致性，較佳為至少約 48 92407修正版 1351407 _ 年月&籍(fj-.r，·洛頁 -_·一 — 95%或以上之一致性。其他明確之擬人化抗體包括輕鏈值定功能部位與第5A圖（SEQ ID NO. 97)或第6A圖（SEQ ID NO. 99)所示胺基酸序列具有至少約90%—致性，較佳 ,螬為至少約95%或以上之序列一致性。‘ 其他明確之擬人化抗體為彼等其中各架構區（FRs)1、 2、3與4與第4A圖（SEQ ID NOS. 83至96)(該序列於第 4A圖中以"HC-08"表示較佳）所示重鏈序列具有至少約 90%胺基酸序列一致性’較佳為約95%或以上之一致性。其他擬人化抗體之重鏈恆定功能部位與第5B圖（SEQ ID NO. 98)或第6B圖（SEQ ID NO. 1〇〇)所示胺基酸序列具有至少約90〇/〇—致性，較佳為至少約95%或以上之序列一致性。. 某些具體實施例中，擬人化抗體具有IgG1(h〇AT)或 IgG4(hFAT)同型，如申請中之美國申請案N〇. 〇9/99〇,586 與60/343,306所揭示者。本發明亦提供本文所揭示擬人化抗體之功能性片段。此等片段實例包括（但不限於）：彼等與TF結合之親和性常數（Kd)低於約lnM者，較佳為低於約〇 5nM，更佳為約〇.GlnM至約〇.4nM之間。明確較佳者為結合触、 Fab1、與F(ab)2片段之抗原。如上述討論，本發明之特色在於擬人化抗體包括至少 -個鼠科互補性決定區（CDR)，例如：CDri、咖2、鹽3。本發明一項具體實施例中，抗體專— ^ 性結合人類組織因子 (TF) ’形成複合物。典型地，因早口于叉或因子IX與TF或 92407修正版 49 1351407

TF · FvIIa之結合及TF : FVIIa之活化作用受到抑制。如以’較佳CDRs(輕鏈與重鏈）來自嚅齒類，典型為小白鼠。未發明擬人化抗體之一項具體實施例中，抗體尚包括至乂個人類架構區（FR)亞群。較佳者，所有FRs(輕與重鏈）為人類。更特定之具體實施例中，與人類TF結合之重鏈超變品第〜個CDR(CDR1)與第4B圖（SEQ Π) NO. 104)所示之胺基酸序列至少90%相同，較佳為至少約95%或、相同。典型地，該重鏈超變區之第二個CDR(CDR2) 圖（SEQ ID NOS. 9及1 01)所示之CDR2胺基酸序列至小〇 90%相同，較佳為至少約95〇/〇或以上相同。亦較佳

^鏈超變區之第三個CDR(CDR3)與第4D圖（SEQ ID 1〇)所示之CDR3胺基酸序列至少90%相同，較佳為至少約9 5 °/〇或以上相同。本發明另一項具體實施例中，與人類TF結合之輕鏈超變區之第一個CDR(CDRl)與第3B圖（SEQ iD N〇. 1〇3) 所示之CDR1胺基酸序列至少90%相同，較佳為至少約 95%或以上相同。典型地，該輕鏈超變區之第二個 CDR(CDR2)與第 3C 圖（SEQ ID NO. 6)所示之 CDR2 胺基酸序列至少90%相同，較佳為至少約95%或以上相同。亦較佳者’該輕鏈超變區之第三個CDR(CDR3)與第3D圖 (SEQ ID NO. 7)所示之CDR3胺基酸序列至少90%相同，較佳為至少約95%或以上相同。本發明其他擬人化抗體包括結合人類TF之重鏈超變 50 92407修正版 1351407 ___ 區之第一個架構區（FRl)，該FR1與第4A圖（SEQ ID NO. 91)所示胺基酸序列（以，'FR1 HC-08”表示）至少90%相同，較佳約95%或以上相同。一項具體實施例中，FR1包含至少一種下列胺基酸變化：E1變成Q ; Q5變成V ; P9變成 G;LI1變成v;V12變成K;Q19變成R;與T24變成A。較佳者，FR1包括其中2、3、4、5或6種變化，所有彼等胺基酸變化將較適於許多種用途。本發明其他適當結合人類TF之擬人化抗體包括重鏈超變區之第二個架構區（FR2)，該FR2與第4A圖（SEQ ID NO. 91)所示胺基酸序列（以"FR2 hc-os”表示）至少9〇%相同，較佳約95%或以上相同。一項具體實施例中，FR2包括至少一種下列胺基酸變化：H41變成p ;與S44變成G。較佳FR2包括其中這兩種胺基酸變化。本發明之特色亦為結合人類TF之擬人化抗體，其中重鏈超變區之第三個架構區（FR3)與第4A圖（SEQ ID NO. 91)所示胺基酸序列（以”FR3HC_〇8”表示）至少9〇%相同，較佳約95%或以上相同。一項具體實施例中，FR3包括至少一種下列胺基酸變化：S76變成T; T77變成s ; F8〇變成Y ; H82變成E ; N84變成S ; T87變成R ; D89變成 E;與S91變成τ。較佳FR3包括其中2、3、4、5或6種變化，具有所有這7種胺基酸變化通常為較佳者。本發明之特色亦為適當結合人類71?之擬人化抗體，其中重鏈超變區之第四個架構區（FR4)與第4A圖（3£(^ m NO. 91)所示胺基酸序列（以"FR4 Hc_〇8"表示）至少9〇%相 92407修正版 51 1351407 年月^佟认ΐ頁 11 »— — _ _ 同，較佳約95%或以上相同。較佳者，FR4包括下列胺基酸變化：L1 13變成V » 根據本發明其他結合人類11?之擬人化抗體之特色為其中輕鏈超變區之第一個架構區（FR1)與第3A圖（SEQ m NO. 79)所示胺基酸序列（以"FR1 LC_〇9”表示）至少約9〇% 相同，較佳約95%或以上相同。一項具體實施例中，FR1 包括至少一種下列胺基酸變化：QU變成Li5變成v ; E17變成D;與S18變成R。較佳聊包括其中2或3種胺基酉夂變化’具有所有這4種胺基酸變化通常為較佳者。本發明之特色亦為結合人類TF之擬人化抗體，其中輕鏈超變區之第二個架構區（FR2)與第3a圖（seq 79)所示胺基酸序列（以”FR2Lc_〇9"表示）至少9〇%相同，較佳約95%或以上相同。較佳FR2包括下列胺基酸變化： Q37變成L。本發明亦涵括結合人類TF之擬人化抗體，其中輕凝超變區之第三個架構區（FR3)與第3A圖（卿id ν〇· Μ 所示胺基酸序列（以”FR3 Lc_〇9”表示）至少約9〇%相同，較佳、勺95 /。或以上相同。一項具體實施例巾，包括』少-種下列胺基酸變化：K7〇變成D，κ74變成T，A8〇變成P ’ V84變成A ’與N85變成τ。較佳FR3包括其^ 2、3或4種胺基酸變仆，目士 ^ b 具有所有這5種胺基酸變化通$ 為較佳者。本發明其他結合人類TF 區之第四個架構區（FR4)與第之擬人化抗體包括.輕鍵超變 3A 圖（SEQ ID NO. 79)所示 92407修正版 52 1351407 胺基酸序列（以"FR4LC_09"表示）至少約9〇%相同，較佳約95。/◦或以上相同。一項具體實施例中，fr#包括至少一種且最好包括所有下列胺基酸變化：A100變成q;與L1〇6 變成h 本發明亦包括上述擬人化抗體之人類TF結合性片 I又。此等片段實例包括：Fab、Fab'與F(ab)2。有關根據本發明製造之其他較佳擬人化抗_T]p抗體可參見USSN 09/990,586與60/343,3 06專利申請案。如本文中所揭示，下列三種核酸載體：pSUN36 (擬人化抗-TF抗體IgGl-HC表現載體）、PSUN3 7 (擬人化抗-TF抗體Ig4-HC 表現載體）與pSUN38(擬人化抗-TF抗體LC表現載體）已依布達佩斯公約（Budapest Treaty)寄存於美國菌種中心. (American Type Culture Collection)(ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209)。該載體之寄存編號為：PTA-3727 (pSUN36) ; PTA-3728 (pSUN37); 與 PTA-3729 (pSUN38)。製造及使用本發明擬人化抗-TF抗體之合適表現法與純化法已揭示於USSN 09/990,586與60/343,306專利申請案中。 B.擬人化抗-LTA結合性抗體之製法

原始之抗-LTA嵌合抗體為下列專利申請案之主題： "Opsonic and Protective Monoclonal and Chimeric Antibodies specific of Lipotechoic Acid of Gram Positive Bacteria'，申請中之 U.S.S.N. 09/097,055 (已公開為 WO 53 924〇7修正版 1351407 98/57994) 擬人化抗-LTA(1 ipotechoic acid脂壁酸）結合性抗體之製法與用法說明於下文實例4-5中。較佳抗體通常會結合 LTA形成專一性結合複合物。特定之嵌合性抗_LTA抗體結合抗原之表觀親和性常數（Κα,Μ-1)低於約1 ，較佳為低於約100 nM，更佳為約20 nM至約2 nM之間。來見下文實例5中有關抗-LTA抗體特色之進—步說明。脂壁酸為一種出現在某些格蘭氏陽性細菌中之細胞成分，該等細菌包括葡萄球菌屬（Staphyl〇c〇ccus specles)、某些鏈球菌屬（Strept〇c〇ccus邛“丨以）與腸桿菌屬 (Entercoccus)。其已進入細胞壁中成為混合大分子聚合物之一部份，該聚合物之分子量為雜分散性，因此LTA成分可於細胞壁及其片段中發現，其可能具有才目#大分子量範圍。更佳之擬人化抗_LTA結合性抗體對LTA之結合常數 (KA，M )為至少約5xl〇6 M-1，其係由表面質粒基因組分析法測定（特定言之根據下文中實例3之BIAC〇re分析法），更佳為由表面質粒基因組分析法測得之至少約1x1 〇7 M由表面質粒基因組共振分析法測得對LTA之更佳κΑ 為至少約1 X 1 〇8M-1。項具體實％例中，結合LTA抗原之輕鏈超變區之第個CDR(CDRl)與第7A圖（下加線）所示cDR1胺基酸序列至少約9〇%相同’較佳為至少約95%或以上之一致性。八型地輕鏈超變區之第二個cdr(cdr2)與第7八圖（下加 54 92407修正版 1JM4U7

線）所示CDR2胺基酸序列至少的

Qc0/ .. 夕、力90%相同’較佳為至少約 95/〇或以上之一致性。亦較佳為輕鏈超變區之第：個 CDR(CDR3)與第7A圖（下加绩^ 。矛-個線）所不CDR3胺基酸序列至少，.，"〇%相同’較佳為至少約95%或以上之一致性。重鏈超變區方面，其他較佳抗-L 丁 Α抗體與第7Β圖（下加線）所* CDIU胺基酸序列至少約9〇%相同，較佳為至少約95%或以上之一致性。典型地，相同重鏈超變區之第二個CDR(CDR2)與第7B圖（下加線）所示CDR2胺基酸序列至少約90%相同’較佳為至少約95%或以上之一致性。亦較佳為相同重鏈超變區之第三個CDR(CDR3)與第7b圖（下加線）所示CDR3胺基酸序列至少約9〇%相同，較佳為至少約9 5 %或以上之序列一致性。本發明其他明確之抗-LTA抗體包括彼等其中各輕鏈架構區亞群(FRs)l、2、3與4與實例5中表6所示各輕鏈 FR序列具有至少約90%胺基酸序列一致性，較.佳為至少約95%、98%至1〇〇〇/0 —致性者。一項具體實施例中，該架構包括至少一種且最好包括所有下列胺基酸變化：⑴變成Q，S5變成T; L11變成M;E17變成D; M21變成I; S41變成Q; R76變成A; V77變成M;及M102變成K。特別佳之抗-LTA抗體具有實例5之表6中A110-LC所示各L鏈FR亞群中至少一個或最好所有序列，亦即lc_fR1 (SEQ ID NO. 109 的殘基 1 至 23); LC-FR2(SEQ ID NO. 109 的殘基 24 至 38) ; LC-FR3(SEQ ID NO_ 109 的殘基 39 至 70)與 LC-FR4(SEQ ID NO. 109 的殘基 71 至 80)。其他專一性結合LTA抗原之明確擬人化抗體包括彼等其中各架構區（FRs) 1、2、3與4與實例5中表7所示重 55 92407修正版 1351407 !_______ 鏈序列具有至少約90%胺基酸序列一致性，較佳為至少約95%、98%至約1〇〇〇/0 —致性者。一項具體實施例中，該架構包括至少一種且最好包括所有下列胺基酸變化：M3 變成Q;K15變成G;Q78變成K;S79變成N;M8 0變成S ; N87變成S ; M95變成V; V99變成A與L119變成 V。特別佳之抗-LTA抗體具有實例5之表7中A110-HC 所示各Η鏈FR亞群中至少一個或最好所有序列，亦即 HC-FR1(SEQ ID NO. 118 的殘基 1 至 25); HC-FR2 CSEQ ID NO. 118 的殘基 26 至 39) ; HC-FR3 (SEQ ID NO. 118 的殘基 40 至 71);與 HC-FR4(SEQ ID NO. 118 的殘基 72 至 82)。某些具體實施例中，擬人化抗-LTA抗體具有igG 1重鏈恆定功能部位（類似hOAT)或IgG4重鏈恆定功能部位 (類似hFAT)同型。參見申請中之USSN 09/990,586與 60/3 43,3 06專利申請案。其他較佳抗- LTA抗體具有實例5之表6與7所示輕鏈與重鏈FRs。其他較佳擬人化抗- LTR抗體之胺基酸輕鍵可變功能部位與第9A圖（SEQ ID NO. 109)所示胺基酸序列具有至少95%序列一致性，較佳為至少約98%或以上之一致性。更佳為此等抗體之輕鏈可變功能部位與第9A圖（SEQ ID NO_ 109)所不胺基酸序列相同。其他較佳抗體之胺基酸重鏈可變功能部位與第9Ε圖（SEQIDNO. 118)所示胺基酸序列具有至少95%序列一致性，較佳為至少約98%或以上之一致性。更佳者，此等抗體之重鏈可變功能部位與第9Ε 圖（SEQ ID NO. 11 8)所示胺基酸序列相同。本發明特定實例中，提供一種專一性結合LTA之擬人 92407修正版 56 1351407 化抗-LTA抗體，其包括至少一個嗡齒類CDR，通常來自小白鼠。較佳者，該LTA抗原會專一性地結合抗體，形成複合物。亦較佳者，此等擬人化抗-LTA抗體在重鏈上至少包含一個或最好所有下列構成要件： a) 第一個 CDR(CDRl)，其與第 9F 圖（SEQ ID NO. 124) 所示之CDR1胺基酸序列至少95%相同， b) 第二個 CDR(CDR2)，其與第 9G 圖（SEQ ID NO. 125) 所示之CDR2胺基酸序列至少95%相同， c) 第三個 CDR(CDR3)，其與第 9H 圖（SEQ ID NO. 126) 所示之CDR3胺基酸序列至少95%相同， d) 第一個架構亞群（FR1)，其與表6A(SEQ ID NO. 109 的殘基1至23)所示之胺基酸序列（以nLC-FRl"表示）至少 95%相同， e) 第二個架構亞群（FR2)，其與表6A(SEQ ID NO. 109 的殘基24至38)所示之胺基酸序列（以"LC-FR2 ”表示）至少 9 5 %相同， f) 第三個架構亞群（FR3)，其與表6B(SEQ ID NO. 109 的殘基39至70)所示之胺基酸序列（以"LC-FR3”表示）至少 95%相同，及 g) 第四個架構亞群（FR4)，其與表6B(SEQ ID NO. 109 的殘基71至80)所示之胺基酸序列（以”LC-FR4 ”表示）至少 95%相同。特定具體實施例中，擬人化抗-LTA抗體亦在輕鏈上至少包含一個或最好所有下列成分： h)第一個 CDR(CDRl)，其與第 9B 圖（SEQ ID NO. 115) 所示之CDR1胺基酸序列至少95%相同， 57 92407修正版 1351407

• .-4 • . X Λ i) 第二個 CDR(CDR2)，其與第 9C 圖（SEQ ID NO. 116) 所示之CDR2胺基酸序列至少95%相同， j) 第三個 CDR(CDR3)，其與第 9D 圖（SEQ ID NO. 1 17) 所示之CDR3胺基酸序列至少95%相同， k) 第一個架構亞群（FR1)，其與表7A(SEQ ID NO. 118 的殘基1至25)所示之胺基酸序列（以"HC-FRl”表示）至少 95%相同， 1)第二個架構亞群（FR2)，其與表7A(SEQ ID NO. 118 的殘基26至39)所示之胺基酸序列（以"HC-FR2 "表示）至少 95%相同， m)第三個架構亞，群0113)，其與表7B(SEQ ID NO. 118 的殘基40至71)所示之胺基酸序列（以"HC-FR3”表示）至少 95%相同，及 η)第四個架構亞群（FR4)，其與表7B(SEQ ID NO. 1 18 的殘基72至82)所示之胺基酸序列（以”HC-FR4 ”表示）至少 95%相同。較佳者，擬人化抗體尚包括第6A圖（hFAT(IgG4) SEQ ID NO. 99)所示之輕鏈恆定序列。亦較佳者，抗體包括第6B圖（IgG4 SEQ ID NO· 100)所示之重鏈恆定區。本發明尚包括編碼一個或多個分別於第9A(SEQ ID NOS. 109 至 114)與 9E 圖（SEQ ID NO, 118 至 123)所示之胺基酸抗-LTA輕鏈可變功能部位與抗-LTA重鏈可變功能部位之核酸分子。更明確之核酸表現至少一部份抗-LTA結合性抗體，其具有本文所揭示之較佳結合親和性與其他性質。此等核酸之分子量通常低於約1 〇〇〇個鹼基對（bp)，佳為約 200bp至約750bp，其係以一般凝膠電泳法測定。根據本發明之明確較佳核酸為第8圖（pJRS 391)所示 58 92407修正版 1351407 之質體。本發明亦提供本文所揭示擬人化抗_LTA抗體之功能性片段。此等片段實例包括（但不限於）：彼等結合LTA之表觀親和性常數（KA，M-1)低於約1 〇〇nM者，較佳為低於約25 nM，更佳為約lnM至約5 nM。明確較佳為抗原結合性 Fab、Fab·與F(ab)2片段、單鏈Fv及全長度抗體。般，單離本發明核酸，其通常占所指定單離部份中核酸總重量之至少約0.5%，較佳為至少約2%，更佳為至少約5%。部份純化之核酸通常占所指定單離部份中核酸總重量之至少約1 〇%，較佳為至少約3〇% ’更佳為至少約 60。/〇。純核酸通常占所指定單離部份中核酸總重量之至少約80°/。’較佳為至少約90%，及更佳為至少約95%。以下列非限制性實例說明本發明。下列實例與本發明其他方法係用於對鼠科抗組織因子抗體H36與抗-脂壁酸抗體A110進行擬人化。H36亦稱為η% D2與jj36.D2.B7, 但H36為由母純系產生之抗體，H36 D2得自一級純系，而H3 6.D2.B7則得自二級純系。這三個純系所產生之抗體之間，在抗體抑制TF之能力或其他物理性質方面並無差異。一般用法中，H36經常用於指示任何此等純系或可產生該抗體之相關細胞株所產生之抗_TF抗體。H36之小白鼠-人類嵌合型稱為cH36 (亦稱為Sun〇l-CH36)。抗-脂壁酸抗體A11〇亦稱為9611〇、 C96-110與BSYX_A11〇，且為小白鼠_人類嵌合抗體。參見USSN 09/990,586與60/343,306專利申請案中有 92407修正版 59 1351407 關製造與使用H3 6抗體之說明。亦參見美國專利案N〇 5,986,065 〇本文所述及所有文獻之揭示内容已以引用之方式併入本文中。重:例1 -抗組織因子抗艚之擬人化法稱為H3 6.D2(有時候亦稱為H36，如上述討論）之特定鼠科抗體之製造與使用方法說明於美國專利案N〇. 5,986,065中。本實例出示該抗體之擬人化型之製造與使用方法。擬人化H36抗體具有多種用途，包括協助儘量降低對人類抗-小白鼠抗體（HAMA)之潛在免疫反應。此等及其他不期望之反應困擾著H36抗體於人類醫療法中之用途。 A.嵌合抗組織因子抗體（cIi36)之製法前述H36抗體為igG2a鼠科抗體。H36第一個轉化成小白鼠-人類嵌合抗體，供臨床發展。其作法為選殖Η% 之重與輕鏈基因（參見美國專利案N〇 5,986,〇65) ^取重鏈可變功能部位融合至人類IgG4恆定（Fc)功能部位中，取輕鏈可變功能部位融合至人類輕鏈恆定功能部位中。所得 IgG4/c嵌合抗體稱為cH36(亦稱為Sun〇i_cH36)。η刊或 CH36於慢性病患者中有多種用途，以完全擬人化eH36較佳’因此其可降低或消除任何人類抗嵌合抗體（haca^ 疫反應。cH36之擬人化說明如下。 B · cH3 6抗體之擬人化法嵌合抗組織因子 ”FR最適配"法進行。抗體CH36之擬人化法係採用本發明此方法元全利用公開之資料庫可取得 92407修正版 60 1351407 大量已知胺基酸序列之人類IgGs或人類IgG片段之序列之優點。cH3 6中小白鼠重與輕可變功能部位之個別架構區序列將與 Kabat 資料庫（參見 http : //immun〇 bme nwu edu) 中各重或輕鏈可變功能部位或人類架構（或其片段）之序列進行比對。採用下列標準來選拔用於擬人化之所需人類 IgG架構區亞群：（1)儘可能使不符合之胺基酸數量降低。 (2)保留”游標”區内之胺基酸不改變（此區内之胺基酸可調整CDR結構並微調其與抗原之配合性，參見F〇〇te，】a"

Winter，G·，J. 〇f Mol. Bio. 224(2) : 487-499 [1992])。（3)當評估類似候選物時，以保留性胺基酸取代作用優先。用於此比對法之比對程式可參見Kabat資料庫。參見J〇hns〇n(}， Wu T. Kabat database and its application ： Future directions." Nucleic Res (2〇〇1) 29: 2〇5·2〇6。該程式會在 Kabat資料庫令找出小白鼠序列與人類序列之間之同質區，並排列。採用此獨特FR最適配方法，可預期目標Ig(j 之擬人化LC或HC可變功能部位之所有四個FRs可能僅來自一個人類IgG分子或來自多達四個不同人類IgQ分子。 B(0.人類IgG /c _輕鏈可變功能部位架構區之選拔由cH3 6 LC各架構區胺基酸序列與Kabat資料庫中人類IgG /c輕鏈可變功能部位之frs胺基酸序列進行比對。依據上述三個標準選拔最適配FR。選出Kabat資料庫IDNo. 005191之人類IgG/c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列進行CH36 LC FR1之擬人 924〇7修正版 61 1351407 化。選出Kabat資料庫

可變功能部位之胺基酸序列進行eH36 LC FR2之擬人化。由cH3 6 LC FR1進行下列突變法，使人類IgG/c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫id No.005 191 : Q11 變成 L，L15 變成 V，E17 變成 D，S18 變成 r。cH36LC FR2進行一種突變：Q37變成L，使人類IgG κ輕鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫id No. 019308 (參見表1A之序列資料）。選出Kabat資料庫ID No. 038233之人類igG/c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列進行CH36 LC FR3之擬人化。選出Kabat資料庫ID Νο· 004733之人類IgG /c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列進行cH3 6 LC FR4之擬人化。由cH3 6 LC FR3進行下列突變法，使人類igG /c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫idn〇. 038233 : K70變成D，K74變成τ，A8〇變成p，V84變成a，N85變成 CH36 LCFR4進行兩種突變：A100變成Q與L106變成I，使人類IgG /c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列符合 Kabat資料庫IDN〇〇〇4733 (參見表岱之序列資料）。 BGO.人類IgG重鏈可變功能部位架構區之選拔由cH3 6 HC之各架構區胺基酸序列與Kabat資料庫中人類IgG重鏈可變功能部位之FRs胺基酸序列進行比對。依據上述三個標準選拔最適配FR。選出Kabat貧料庫ID No_ 000042之人類IgG重鏈可

變功能部位之胺美龄庄， J 胺基心序列進行cH3 6 HC FR1之擬人化。選 62 92407修正版 1351407 出Kabat資料庫ID Ν〇·〇2396〇之人類igc}重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行cH36HCFR2之擬人化。由cH36 HC FR1進行下列突變法，使人類邮重鏈可變功能部位之胺基fee序列符合Kabat資料庫id N〇〇〇〇〇42 : E1變成 Q，Q5變成V，P9變成G，L11變成V V12變成K，Q19變成 R，T24變成A。CH36 HC FR2進行兩種突變：H41變成p 與S44變成G，使人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫mN〇〇2396〇(參見表2八之序列資料）。選出Kabat資料庫idn〇.037010之人類Ig(}重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行cH36 Hc FR3之擬人化。選出Kabat貝料庫ID No.000049之人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行cH36 HC FR4之擬人化。由CH36 HC FR3進行下列突變法，使人類igG重鏈可變功能部位之胺基0夂序列符合Kabat資料庫ID n〇〇37〇1〇 : S76變成 T，T77變成S’F8〇變成γ，Η82變成E，N84變成S，T87變成 R’D89變成E，S91變成τ。CH36 HC FR2進行一種突變： L113變成V，使人類Ig(3重鏈可變功能部位之胺基酸序列符s Kabat資料庫id n〇.00〇〇49(參見表2B之序列資料）。表1>eH36與人類輕鏈（LC)FR序列之比對 63 92407修正版 1351407 表ΙΑ 名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2(15aa) 1 XO 20 35 49 CH36-LC DIQMTQSPASQSASLGESVTITC WYQQKPGKSPQLLIY 人類-LC L· V DR L 005191 019308

表IB 表2.CH36與人類重鏈（HC)FR序列之比對表2A 名稱 HC-FR1 (30 aa) HC-FR2(14aa) CH36-HC 人類-HC 1 10 20 30 Q V G VK R A 000042 36 49 WVRQSHGKSLEWIG P G 023960 表2B 名稱 HC-FR3 (32 aa) HC-KR4(11 aa) 67 75 85 95 107 117

CH3 6-HC KATLTVDKSSTTAFMHLNSLTSDDSAVYFCAR WGQGTTLTVSS 名稱 LC-FR3 (32 aa) LC-FR4 (10 aa) CH36-LC 57 60 70 80 88 GVPSRFSC3S6SGTKFSPKISSLQAEDFVNYYC 98 107 PGAGTKLELK 人類-LC D T P AT Q I 038233 004733

人類-HC TS YES RET V

037010 000049 一旦決定所需之人類架構區後，即採用下列三種技術於輕與重鏈上進行所需之胺基酸取代：（1)採用一般PCR 進行選殖，引入選殖性或診斷性核酸内切限制酶位置，及改變位在可變功能部位末端之胺基酸殘基。（2)採用以PCR 為主之誘變法，一次改變多個胺基酸殘基，尤其當此等殘基位於可變功能部位中間時。（3)採用定點誘變法，一次引進1或2個胺基酸取代《定點誘變法係依Stratagene公司 64 ?24〇7修正版 1351407 之 QuickChange Site-Dlrected Mutagenesis Kit" (CataI〇g #2005 1 8)所說明之方法進行。繼各步驟之後，為部份擬人化純系定序，其中有些可變功旎部位以後會選殖至表現載體中。採用質體tKMC丨8〇來表現LC突變株，分別採用pJRS 355或pLAM 356載體來表現HC突變株為IgGl或IgG4。有些此等純系隨後組合，再於cos細胞中暫時表現，以定表現程度。選殖抗-TF重與輕可變功能部位之最終完全擬人化型至本文中有時候稱為"mega載體"中，轉染至CH〇與NS〇細胞中，以表現IgG。然後使用穩定之細胞株生產供分析用之足量擬人化抗-TF。所得擬人化型為1〇〇%來自人類（當不考慮CDR序列時）。擬人化IgG4凡型稱為hFAT(擬人化 IgG £0ur Anti-Iissue因子抗體）與IgG1《型稱為h〇AT (kumanized IgG Anti-I：issue 因子抗體）D cH36 之此等元全擬人化型係用於治療慢性病症，如：血栓、癌症 '與炎症。 C.擬人化抗-TF抗體重鏈之形成 1.使用作為权板之質體pJAIgG4TF.A8(嵌合H36之表現載體）與引子TFHC1S2與TFHClas2進行PCR擴增法並選殖至抗-TF mAb CH36重鏈（HC)可變功能部位之pGem T-easy中。引子TFHCls2在起始字碼子上游引進一個 BsiWl位置，並於架構（FR)中引進一個胺基酸變化，由m 變成Q。引子TFHClas在FR4引進一個胺基酸變化，由 LU3變成V。此步驟造成構築體HC01。 924〇7修正版 65 1351407 2. 採用先前之構築體（HC01)與下列四個引子進行以 PCR為主之誘變法，產生構築體HC02。上游PCR使用引子TFHCls2與TFHC7as。下游PCR使用引子TFHC7s與 TFHClas2。使用上游與下游PCR產物作為模板，及使用引子TFHCls2與TFHClas2進行PCR，產生HC02。使用引子TFHC7s與TFHC7as時，在FR2中引進兩種胺基酸變化：H41變成P與S44變成G。 3. 採用HC02作為模板與下列四個引子進行以PCR為主之誘變法，產生構築體HC03。上游PCR使用引子 TFHCls2 與 TFHC5as2。下游 PCR 使用引子 TFHC5s 與 TFHClas2。使用上游與下游PCR產物作為模板及使用引子TFHCls2與TFHClas2進行PCR，產生HC03。使用弓| 子TFHC5s與TFHC5as2在FR3中引進三個胺基酸變化： T87變成R，D89變成E與S91變成T。亦在位置87引進一 Bgl II 位置。 4. 使用引子TFHC2s與TFHC3as，及使用HC03於pGem 中作為模板進行PCR擴增法。TFHC2s位於pGem中選殖位置上游。TFHC3as位於架構3中，並在FR3中引進兩種胺基酸變化：H82變成E與N84變成S。將所得之PCR條帶（band)選殖至pGem中，然後使用BsiWl與Bgl II切出適當大小之嵌段。選殖此片段至HC03中，產生HC04。 5. 使用作為模板之HC04與下列引子，進行以PCR為主之誘變法，產生HC05。上游PCR使用引子TFHC1S2 與 TFHC6as。下游 PCR 使用引子 TFHC6s 與 TFHC1 as2。 66 92407修正版 1351407 使用上游與下游PCR產物作為模板與使用引子TFHCls2 與TFHClas2進行誘變PCR，產生HC05。此步驟在FR3 中引進下列胺基酸變化：S76變成T，T77變成S及F80 變成Y。 6.使用作為模板之HC05與下列四個引子進行以PCR 為主之誘變法，產生HC06。上游PCR使用引子TFHC2s 與 TFHC2as2。下游 PCR 使用引子 TFHC3s2 與 TFHClas2。使用TFHC2as2之擴增法在FR1中引進一種胺基酸變化： P9變成G。引子TFHC3s2使Q19變成R及T24變成A。使用上游與下游PCR產物作為模板及使用引子TFHC1S2 與TFHClas2進行之PCR產生HC06。 7.在構築HC06之同時，於FR1之位置2上引進一個點突變，由I變成Μ。使用HC06作為模板及使用TFHC1S3與 TFHClas2作為引子之PCR擴增法會校正此錯誤取代，並於FR1中引進一個胺基酸變化：Q5變成V。所得構築體為 HC07。 8.構築體HC08係由以PCR為主之誘變法，使用HC07 作為模板及使用下列引子製造。使用TFHC2s與TFHC2as3 作為上游產物。下游產物已先使用TFHCls3與TFHClas2 擴增（參見步驟7)。使用引子TFHC2as3於FR1中引進兩個胺基酸變化：L11變成V及V12變成K。同時進行之點突變造成CDR2中位置64之苯基丙胺酸改成白胺酸（F- > L)。進一步篩選及定序，產生構築體HC08R1，其於CDR2 中位置64具有F之正確序列。 67 92407修正版 1351407 9. 由HC07進行定點誘變法產生兩種構築體：pjc 11與 HC12 °使用兩種互補引子tfhC8sP與TFHC8asP及使用 HC07作為模板’產生hcii，其於FR1中包含三種胺基酸變化：G9變成P’L11變成V，與V12變成K。然後，使 HC 11甲基化’經管柱純化，以便進行下一回合之定點誘變法。使用HC11作為模板及使用互補引子TFHC9sL與 TFHCOasL進行PCR，產生HC12，其在FR1中使VI1突變成L。 10. 構築體HC09係衍生自HC12,其作法為使用HC12 作為模板及使用互補引子TFHClOsK與TFHClOasK進行 PCR。HC09於FR1中包含一種胺基酸變化：κΐ2變成V。 11. 構築體HC10係由HC09製成。使用HC09作為模板及使用互補引子LV-1與LV-2進行PCR，產生HC10，其在FR1中包含一種突變，使lii變成v。繼各突變步驟之後，為部份擬人化或完全擬人化純系定序，有些此等可變功能部位以後再選殖至表現載體中。使用PJRS35 5或pLAM 356載體來表現與人類IgG1或IgG4 之Fc融合之HC突變株。第3A至3D圖綜合說明步驟，並出示在中逐漸引進增加之胺基酸變化。除了 HC08外，所有其他重鍵犬·變株與cH36均於CDR2中位置64上包含F。HC08 在位置64具有一種突變’由ρ變成L。第4B至4D圖出示重鏈CDR序列。 1於重#擬人化法之引子

68 924〇7修正版 1351407 xraci s2 5’ TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC 3， TFHClas2 5* AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG 3* TFHC7s 5' GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG T TFHC7as 5* CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC 3* TFHC5s 5’GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG3 TTHC5as2 5* CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC 3* TFHC3as 5# GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG 3' TFHC2s 5, TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’ TFHC6s 69 924〇7修正版 1351407 5, CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG 3， TFHC6as 5, CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG 3， TFHC2as2 GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC V TFHC3s2 5>CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC3, TFHCls3 5T TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC 3* TFHC2as3 57 GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC 3»

TFHC9sL 5* GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG 3,

TFHC9asL 5' CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC3'

TFHC8sP 5, GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC 3,

TFHC8asP 5’ GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3 ’

TFHClOsK 5’ GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC 3,

TFHClOasK 5, GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC 3’ LV-l 5, CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG 3, LV-2 5’ CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG 3, D.擬人化抗-TF抗體輕鏈之形成 1.使用質體pJAIgG4TF.A8(嵌合性H36之表現載體）作為模板及使用引子TFLC1S2.1與TFLClas進行PCR擴增 92407修正版

70 1351407 法。此步驟在編碼區上游引進一個選殖位置，Agel。亦在 FR4中引進L106I突變。此步驟產生構築體LC03。 2. 使用互補引子TFLC5S與TFLC5as及使用LC03作為模板進行定點誘變法。此步驟在FR2中引進突變Q37L，並增加Pst I位置，供診斷用。此新構築體稱為LC04。 3. 使用LC04作為模板及使用引子TFHC2s與 TFLC2asl進行PCR擴增法。此步驟產生片段A，將用於步驟6中。此步驟在FR1中引進Q11L與L15V突變。 4. 使用LC04作為模板及使用引子TFLC1S2.1與 TFLClasR進行PCR擴增法。此方法於LC可變功能部位末端引進Κρη I位置。選殖此PCR片段至pGEM中，產生 PGEM04K，將用於步驟6中。 5. 使用LC04作為模板及使用引子TFLC2S與TFLC4as 進行PCR擴增法。此步驟產生片段C，將用於步驟6中。此步驟引進三種突變：FR1中之E17D、S18R及FR4中之 A100Q 。 6. 使用片段A與片段C作為模板及使用引子TFHC2s 與TFLC4as進行以PCR為主之誘變法，產生片段D。選殖片段D至pGEM04K中，產生構築體LC05。 7. 使用pGEM04K作為模板及使用引子TFLCls2.1與 TFLC4as進行PCR擴增法。此步驟產生片段Η，其隨後選殖至PGEM04K中。此步驟在FR4中引進A100Q突變，該構築體稱為LC06。 8. 使用LC06作為模板及使用引子TFLC1S2.1與 71 92407修正版 1351407 TFLC3as進行PCR擴增法。此步驟產生片段I，將用於步驟10。此步驟在FR3中引進K70D與K74T突變。 9. 使用LC06作為模板及使用引子TFLC3s2與 TFLC4as進行PCR擴增法。此步驟產生片段F，將用於步驟10。此步驟在FR3中引進A80P突變。 10. 使用片段I與片段F作為模板及使用引子 TFLCls2.1與TFLC4as進;if PCR，產生片段J。選殖片段J 至pGEM中，產生構築體LC07。 11. 使用互補引子TFLC08sds與TFLC08sdsa及使用 LC07作為模板進行定點誘變法。此步驟在FR3中引進突變V84A與N85T。此構築體稱為LC08。 12. 自含有突變 Q11L ' L15V、E17D、S18R 與 Q37L 之LC05中選殖Agel至Eco 01091片段至LC08中。結果產生構築體LC09。 13. 使用LC09作為模板及使用互補引子LC 105與 LC103進行定點誘變法。此步驟在FR3中引進T85N突變，產生構築體LC10。 14. 使用LC10作為模板及使用互補引子LC115與 LC113進行定點誘變法。此步驟在FR3中引進D70K突變，產生構築體LC11。 15. 使用LC11作為模板及使用互補引子LC125a與 LC123a進行定點誘變法。此步驟在FR2中引進K42Q突變，產生構築體LC12。

繼各突變步驟之後，為部份擬人化或完全擬人化LC 72 92407修正版 1351407 純系定序，其中有些可變功能部位以後再選殖至表現載體 tKMC180 中》. 用於輕鏈擬人化之寡核苷酸引子 TFLClas2: 5, TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG 3， TFLCls2.1: 5’ ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC 3, TFLCSs: 5’ GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG 3, TFLCSas: 5’ CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC 3, TFHC2s: 5, TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 3’ TFLC2asl: 5, CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG 3, TFLClasR: 5* TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG 3, TFLC2s: 5, CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC 3’ TFLC4as: 5’ GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG 3， TFLC3as: 5* GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC 3* TFLC3s2: 57 CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC 3' TFLC08sds:

GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG 3T TFLC08sdsa: 5, CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC 3y 73 924〇7修正版

LC105: 5* CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC 3* 1351407 LC103: 55 GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG 37 LC115: 5' CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC 3* LC113: 5, GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG 3’ LC125a: 5, CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG 3’ LC123a: 5' CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG 3* 第5A圖出示人類/c輕鏈恆定功能部位之序列（SEQ ID NO. 97)。第5B圖出示人類IgGl重鏈恆定功能部位之序列 (SEQ ID NO. 98)。第6A圖出示hFAT(IgG4)恆定功能部位序列（SEQ ID NO. 99)。第6B圖提供人類IgG4重鏈恆定功能部位（SEQ ID NO. 100)。亦參見 USSN Nos· 09/990,586 與60/343,3 06中有關上述免疫球蛋白恆定功能部位序列之其他說明。實例2 -擬人化抗-TF抗體之表現與純化將部份擬人化或完全擬人化LC與HC純系選殖至表現載體中。使用質體tKMC 18來表現與人類/c鏈融合之LC 突變株，及使用pJRS 355或pLAM 356載體來表現與人類 IgGl或IgG4之Fc融合之HC突變株。HC與LC純系之有些組合隨後再共同轉染至COS細胞中。採用ELISA分析 IgGs於COS細胞中之暫時表現，評估IgG總產量及與TF 之結合性。有關此等特定載體之揭示内容可參見申請中之 74 92407修正版 1351407 美國申請案 Nos. 09/990,586 與 60/343,306。將抗-TF重與輕可變功能部位之最終完全擬人化型 (HC0 8與LC09之組合）選殖至稱為Mega之表現載體中 (pSUN34，參見第2圖），轉染至CHO與NSO細胞中，以表現IgG。選殖可產生IgG4 /c或IgGl /c擬人化抗-TF抗體之穩定轉染細胞株。然後使用所選拔之穩定細胞株來產生足量擬人化抗-TF供分析用。所得擬人化型約100%來自人類（當不考慮CDR序列時）。擬人化IgG4/c型（由pSUN35 產生）稱為hFAT (擬人化IgG4抗組織因子抗體）及IgGl /c 型（由pSUN34產生）稱為hOAT(擬人化IgGl抗組織因子抗體）。cH3 6之此等完全擬人化型係用於治療慢性病，如：癌症與炎症。取一種表現hOAT(HC08與LC09之組合）之NSO細胞株（OAT-NSO-P10A7)解凍，加至含10 mL補充10%FBS之 IMDM培養基之1 5 mL試管中，離心。取細胞離心塊再懸浮於10 mL新鮮培養基中，移至T25燒瓶中，於37°C與 5% C02下培養。為了製備足量細胞以接種中空之纖維生物反應器，使細胞擴增至總數達6x 1 08個細胞。依製造商之儀器手冊指示，設定生物反應器。收集之細胞離心集結成塊，再懸浮於60mL含3 5% FBS之IMDM中，注射至生物反應器之毛細管外空間。每天追蹤葡萄糖與乳酸鹽濃度，所收集之材料離心及合併。以ELISA分析法測試所收集材料之抗-TF抗體濃度。合併含有抗-TF抗體（hOAT)之樣本後，依下文說明之方法純化與分析。 75 92407修正版 1351407 A. r蛋白質a Sepharose快速流動層析法重組體擬人化抗-TF單株抗體係由兩條輕鏈與兩條重鏈組成。重鏈為小白鼠可變功能部位（未改變或依上述擬人化）與人類IgGl或IgG4 Fc功能部位之融合體，其中輕鏈包含小白鼠可變功能部位（未改變或依上述擬人化）與人類/c功能部位。已知人類I g g F c區對蛋白質A或重組體蛋白質A(r蛋白質A)具有高度親和性。合併所收集之含擬人化抗-TF抗體（h〇AT)材料，每毫升樣本添加 0.08 ml 1 M Tris-HCl，pH 8.0 調至 ρΗ 8.0 ：t〇. 1。然後經低蛋白質結合性之〇·22微米濾器過濾樣本 (例如：使用聚醚碉膜之Nalgene無菌拋棄式組織培養濾器單元’來自 Nalge Nunc International，Cat. No. 167-0020)。添加樣本後，r蛋白質A管柱（來自pharmacia藥廠）經5 倍管柱體積之20 mM Tris-HCl，pH 8.0洗滌，以去除未結 ^之物質，如：培養基蛋白質。由於所收集之培養基含有° 高量牛血清，因此採用逐段之pH梯度洗滌法，以去除管柱中牛賊。該逐段阳梯度係經由提高緩衝液β〇〇〇Ί 乙酸）於緩衝液A(100Mm乙酸鈉）中之相對百分比而形成。典型之逐段pH洗條法採用2〇%、4〇%與6〇%緩衝 ^以職缓衝液以離管柱，依據A28〇收集溶離份。 5併之溶離份經添加1MTris鹼而調至pH8 $ 。 B· Q Sepharose快速流動層析法陰離子交換層析法為-種依據其電荷來分離蛋極有效方法。該溶離份及“蛋…管柱中溶離出並 92407修正版 76 1351407 經調整pH之樣本以兩倍體積之水稀釋，並檢查及調整pH 至8·5。然後添加樣本至已先經20 inM Tris-HCl，pH 8 5平衡之5ml (1.6 x 2.5 cm) Q Sepharose快速流動管柱中，以 ⑴5倍體積20 mM Tris-HCl，pH 8·5;及（2) 4倍體積含1〇〇 mM NaCl 之 20mM Tris-HCl，pH 8.5 洗滌管柱。然後以一倍管柱體積之含 500 mM NaCl 之 20 mM TriS-HCl，PH 8.5 溶離IgG蛋白質。合併蛋白質高峰，使用超過濾裝置與緩衝液交換進入PBS中。採用相同轉染法、細胞培養物、與純化法，亦可製備籲_ hFAT並純化。實例3 -擬人化抗-TF抗體之性質 A.擬人化抗-TF抗體對TF功能之抑制作用抗-TF抗體之重要性質之一為其抑制組織因子引起之血液凝集之能力。以標準PT分析法測定純化之h〇AT與 hFAT抑制TF活性之能力。Ρτ分析法廣泛用於測定依賴組織因子之凝血時間。此分析法之原理在於組織因子（丁F) 與血漿中因子Vila形成複合物。此複合物隨後會活化因子鲁鲁 X形成FXa;FXa再於因子Va與磷脂之存在下轉化凝血酶原形成凝血酶。凝血酶最終形成血凝塊。標準ρτ分析法中，添加脂化之TF至血漿中，啟動凝血過程，採用〇rgan〇n Tekmka Coag-A-Mate凝血分析儀記錄凝血程度。抗-TF抗體H36以一種獨特之機轉抑制人類TF活性。其會結合TF(游離或與因子VIIa形成之複合物），因此阻止因子X及IX與TF:FVIIa複合物結合，進而阻斷TF:FVna 92407修正版 77 1351407 活化FX與FIX之作用（參見美國專利案No. 5,986,065)。 pt試驗法中’凝血時間因添加抗_tf抗體至人類血漿中而延長，表示此依賴TF之凝血過程已受到抑制。凝血時間與TF活性量相關。測定一系列稀釋之TF之PT凝血時間來製作TF標準曲線。由TF標準曲線之數據即可決定抗抗體對TF活性之抑制作用。試劑 Unnovin (Cat N〇 681〇〇_392)與 CiTr〇i 凝血對照試劑（Coagulation Contr〇1)，第 j 級（Cat N〇 681〇〇 336)，:

來自VWR藥廠。依美國專利案N。· 5,98M65所述製造脂化之重組體人類TF。 S 方法：PT試驗法係於37它下，使用凝血分析儀進行。添加0.2 ml脂化重組體人類組織因子（例如：inn〇vi勾至含 0.01ml 緩衝液（50 mM Tris_Hcl，pH 7 5, 〇 1% bsa)或抗 -TF抗體之0.lml人類血t(Ci_Tr〇1對照試劑第^級）中開始PT反應。 1. 依據製造商之指示’添加純水至小瓶中。使試劑回溫至37°C。若該試劑保存在4_8t下時，可安定存放幾天。 2. 添加imL純水至Ci_Tr〇1之各小瓶中。混合溶解: 若使用一個以上之小瓶時，則合併至一個容器中（例如：Η nd試管）。i mLCi-Troi可進行5次分析（每次分析使用2 Χ〇· lml = 0·2 ml)。Ci-Trol可保存在冰上，可維持幾小時。 3. 使用 50mMTdS-HCl，pH7.5,〇 1〇/〇 BSA，自抗·丁f 抗體母液中製成一系列抗-TF抗體溶液（2〇〇 nM至16〇〇 nM)。 92407修正版 78 1351407 4.添加 10 // 1 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% BSA 或 //1稀釋之抗-TF至各含有O.lmlci-Trol之雙孔測光管中。使用附有0.1 ml尖端之定量吸管混合各孔。確保各孔中沒有氣泡。混合抗-TF (或緩衝液）與血漿（Ci-Trol) 後’添加0.2ml Innovin至血漿中，於1〇分鐘内測定凝血時間。

5.製作TF標準曲線時，首先使用50mM Tris-HCl，pH 7·5, 0.1% BSA 稀釋 Innovin (100% TF)至 20%、1〇%、5〇/〇及2.5% 。然後依步驟4所述進行ρτ分析法，但其中改用稀釋之Innovin樣本。表3綜合說明cH3 6、h〇AT與hFAT對ρτ凝血時間尽/響相較於表4之數據，cH3 6、hFAT與hOAT對TF 功能展現極強力之抑制作用。蛋白質濃度高於12·9ηΜ 時’所有抗體均達約95%抑制作用。表3之結果亦顯示， “ 此方法擬人化之抗-TF，cH3 6，對cH3 6抑制活性沒有任何顯著影響’因為謹與h〇AT兩者對抑制依賴饤之凝血作用之能力極類似cH36。抗體（hFAT 與 hOAT)# 表3，嵌合（CH36)與（擬人化）抗_TF 對凝血酶原時間之影響 924〇7修正版 79 1351407 pt分析法中抗-TF抗體濃度 (nM) PT時間（以秒計） cH36 hOAT hFAT 0 12.2 12.2 6.45 14.9 未測得 12.2 9.7 17.8 16.5 未測得 12.9 19.8 18.9 未測得 25.8 40 33.7 20.5 41.7 94.8 51.6 101.3 82.1 所有分析法均使用與表4相同之1〇〇%7Τ活性（濃度）樣本。表4.凝也時間與相對組織因子活性（濃度）相對TF活性（濃度） PT凝血時間（以秒計） 1 0 0 % (無溶劑） 11.90 20% 13.225 10% 14.675 5% 16.700 2.5% 20.000 B.親和性常數之測定法擬人化抗-TF抗體對TF之親和性係採用表面質粒基因組共振分析法（BIAcore，來自Pharmacia Biosensor公司）’使用共價固定在CM5感應晶片上之重組體人類組織因子測定。親和性常數為由四種抗_TF單株抗體濃度（〇125 nM、0.25 nM、0.5 nM與1 nM)依據BIAcore電腦軟體古十算得到之平均值。表5中之結果顯示，採用上述方法擬人化之抗-TF’ cH36’對cH36對TFi親和性沒有任何顯著影響，因為CH36與hFAT兩者對TF具有類似之親和性。 924〇7修正版 80 1351407 表5.抗-TF抗體之表觀親和性與解離常數抗-TF抗體表觀kum·1) 表觀Kd〇vn H36 1·56χ 1〇1ϋ 6.4x10-ττ cH36 7.94x1 〇1 1.26χ ΙΟ·10 hFAT 2.99χ1〇1 3.35χ1〇·10 實例4-抗-LTA抗體之擬人化 A_嵌合抗^TA抗體 Β.抗-LTA抗體之擬人化法嵌合抗-LTA(脂壁酸）抗體，Α110之擬人化法係採用"fr 最適配"法進行。此方法完全利用公開之資料庫可取得大量已知胺基酸序列之人類IgG可變功能部位之優點。A11 〇中h白鼠重與輕可變功能部位之各個架構區將與資料庫（參見http : //immuno.bme.nwu edu)中相應之人類架構進行比對。採用下列標準來選擇用於擬人化之所需人類 IgG架構：（1)儘可能使不符合之胺基酸數量降低。保留"游標"區内之胺基酸不改變（此區内之胺基酸可調整 CDR結構並微調其與抗原之配合性，參見Foote，J. and Winter, G., J. 〇f Mol. Bio. 224(2) ： 487-499 [1992]) 〇 (3) t 評估類似候選物時，以保留性胺基酸取代作用優先。用：此比對法之比對程式可參見〖讣以網際網頁。該程式會在

Kabat資料庫中找出小白鼠序列與人類序列之間之同質

區，並排列。採用此獨特FR最適配方法，可預期目標igG 之擬人化LC或HC可變功能部位之所有四個FRs可能僅來自個人類IgG分子或來自多達四個不同人類IgG分子。 81 1 24〇7修正版 1351407 Β(ι).人類IgG /c _輕鏈可變功能部位架構區之選拔由A11 0 LC.各架構區胺基酸序列與Kab at資料庫中人類IgG /c輕键可變功能部位之相應fr胺基酸序列進行比對。依據上述三個標準選拔最適配FR。選出Kabat資料庫ID No.036〇47之人類IgG/c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列進行A11 〇 LC FR1與FR3之擬人化。選出Kabat資料庫ID No. 037658之人類IgG/c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列進行A 11 〇 LC FR2之擬人化，及選用ID No.004763進行FR4之擬人化。由A11〇 LC進行下列突變法，使人類IgG /c輕鏈可變功能部位之胺基酸序列符合所選拔之FRS:D1變成Q，S5變成T，L11變成M， M21變成I’ S42變成Q’r76變成a，V77變成Μ及M102 變成Κ。（參見表6之序列資料）。 Β(π).人類IgG重鏈可變功能部位架構區之選拔由A110HC之各架構區胺基酸序列與Kabat資料庫中人類IgG重鏈可變功能部位之FRs胺基酸序列進行比對。依據上述三個標準選拔最適配FR。選出Kabat資料庫ID No. 000468之人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行A11〇 HC FR1之擬人化。選出Kabat資料庫；[D No 〇〇〇565之人類Ig(}重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行A11〇 HC FR2之擬人化。選出 Kabat資料庫IDN〇〇〇〇628之人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列進行A11〇HCFR3之擬人化。選出Kabat 貝料庫ID No.031571之人類IgG重鏈可變功能部位之胺 82 924〇7修正版 1351407 基酸序列進行A110 HC FR4之擬人化。由A110 HC FRl 進行下列突變法，使人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫ID No.000468 : M3變成Q，及K15 變成G。A110 HC FR2沒有必要為了符合Kabat資料庫ID No. 000565 FR2序列而進行改變。由A110 HC FR3進行下列6種突變法，使人類IgG重鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫ID No.000628 : Q78變成K ; S79變成N，M80變成S，N87變成S，M95變成V及V99變成A。由A110 HC FR4進行一種突變：L119變成V，使人類IgG 重鏈可變功能部位之胺基酸序列符合Kabat資料庫ID N〇.03 1571(參見表7之序列資料）。表6.A110與人類輕鏈（LC)FR序列之比對

表6A 名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2(15aa) 1 10 20 34 48 A1X0-LC DIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC WYQQKPGSSPKPWIS 人類-LC Q T M D I Q 036047 037G58

表6B 名稱 LC-FR3 (32 aa) LC-FR4(10aa) A110-LC 56 60 70 80 87 GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC 97 106 FGGGTMLEIK 人類-LC AM K 036047 004763 表7.A110與人類重鏈（HC)FR序列之比對 83 92407修正版 1351407

表7A 名稱 HC-FRI (25 aa) HC-FR2(14aa)

A110-HC 人類-HC

1 10 20 EVMLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS Q 000466

G 36 49 WVRQAPGKGLBWVA 未改變 000565

表7B 名稱 HC-FR3 (32 aa) HC-FR4(11 aa)

A110-HC 人類-HC

69 75 85 95 100 RPTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVR

113 123 WGQGTSLTVSS

KNS

S

V

A

V 000628 031571 一旦決定所需之人類架構後，即採用下列三種技術於輕與重鏈上進行所需之胺基酸取代：（1)採用一般PCR進行選殖，引至選殖性或診斷性核酸内切限制酶位置中，及改變位在可變功能部位末端之胺基酸殘基。（2)採用PCR 誘變法，一次改變多個胺基酸殘基，尤其當此等殘基位於可變功能部位中間時。（3)採用定點誘變法，一次引進1或 2個胺基酸取代。定點誘變法係依Stratagene公司之 "QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (Catalog #2005 1 8)所說明之方法進行。繼各步驟之後，為部份擬人化純系定序，其中有些可變功能部位以後會選殖至表現載體中。採用質體tKMC 1 80 來表現LC突變株，分別採用pJRS 355來表現HC突變株為IgGl。有些此等純系隨後組合，再於COS細胞中暫時表現。選殖抗-LTA輕與重可變功能部位之最終完全擬人化型至有時候稱為"mega載體”中，並轉染至COS細胞中， 84 92407修正版 1351407 以表現IgG，並分析LTA結合性。 C_擬人化抗-LTA抗體重鏈之形成 1. 使用作為模板之質體pJRS334(A110之表現載體）與引子HChuFl與HChuR2進行PCR擴增法，並選殖至抗 -LTA mAb A110重鏈（HC)可變功能部位之pGEM T-easy(Prpmega)中。引子HChuFl在可變功能部位之第一個密碼子上游引進一個BsiWl位置，並於架構（FR)1中引進一個胺基酸變化，由M3變成Q。引子HChuF2在FR4 引進一個胺基酸變化，由L119變成V，及引進一個供選殖用之C末端EcoRI限制酶切割位置。此步驟造成構築體 PJRS3 62。此片段再次選殖至表現載體pJRS355中，作為 BsiWl至EcoRI之限制酶切割片段，產生pJRS370。 2. 由抗-LTA mAb A110重鏈（HC)可變功能部位片段使用質體pJRS334(A110之表現載體）作為模板及使用引子 HChuFl與HChuRl用於N-末端片段與使用引子HChuF2 與HChuR2用於C-末端片段進行PCR擴增法。PCR產生之可變功能部位片段在FR3中含有另兩個突變：N8 7變成 S及M95變成V。選殖此片段至pGEM T-Easy中，產生構築體 pJRS364。 3 .採用QuikChange系統（Stratagene)進行定點誘變法，引進另一個突變至重鏈可變功能部位中。由一對互補引子JSS80與JSS81與質體pJRS364組合，使用Pfu Turbo DNA聚合酶擴增。使用Dpnl分解產物後，使用此DNA轉化大腸桿菌XL1B細胞。此操作法於FR3中產生V99變成 85 92407修正版 1351407 A之突變，此構築體稱為pjRS373 ^選殖此片段至表現載體PJRS355中，作為Bsiwi至Ec〇RI限制醇切生質體PJRS380。 4.採用QuikChange系統（Stratagene)進行定點誘變法，引進另一個突變至重鏈可變功能部位中。由一對互補引子JSS82與JSS83與質體pJRS373組合，使用pfu Turb〇 dna聚合酶擴增。使用DpnI分解產物後，使用此轉化大腸桿菌XL1B細胞。此操作法於FRl中產生κΐ5變成 G之突變，此構築體稱為pJRS378 ^選殖此片段至表現載體PJRS355中，作為BsiWI至Ec〇RI限制酶切割片段，產生質體PJRS381 » 5·由抗-LTAmAb A110重鏈（HC)可變功能部位片段使用質體PJRS381(A110之突變HCV之表現載體）作為模板，進行PCR擴增法。使用引子MV-HC前導序列與JSS87 用於N·末端片段及使用引子JSS86與HCV Back用於C· 末端片段。PCR產生之可變功能部位片段在fri中含有3 禮其他突變：Q78變成K，S79變成N，及MS0變成S。遘殖此片段至pJRS355中，作為BsiWI至EcoRI限制酶切割片段，產生構築體PJRS383。用於重鏈擬人化法之引子 p.擬人化抗-LTA抗體輕鏈之形成

1.由抗-LTA mAb A110重鏈（LC)可變功能部位使用質雜pJRS334 (A110之表現載體A110)作為模板及使用引孑LChuFl與LChuR3進行PCR擴增，並選殖至pGEM 86 92407修正版 1351407 T-easy(Promega)中。引子LChuFl在可變功能部位之第一個密碼子上游引進一個Agel位置，並於架構1中引進胺基酸變化，由D1變成Q，S5變成T。引子LChuR3在FR4 中引進一個胺基酸變化，由Ml 02變成L，及引進一個供選殖用之C末端BstBI限制酶切割位置。此步驟產生構築體 pJRS363 。 2. 由抗-LTA mAb A110輕鏈（LC)可變功能部位片段使用質體pJRS334 (A110之表現載體）作為模板及使用引子 LChuFl與LChuRl用於一個N-末端片段（LCN1)及使用引子LChuFl與LChuR2用於第二個N-末端片段（LCN2)，進行PCR擴增法。兩個C-末端片段則來自引子LChuF2與 LChuR3(LCCl)作為其中一個，及以LChuF3與LChuR3作為第二個（LCC2)。亦使用引子LChuF2與LChuR2 (LCI)產生PCR之内片段。 3. 使用片段LCN1與LCC1作為模板及使用LChuFl與 LChuR3作-為引子進行PCR反應，所得產物選殖至pGEM T-easy中，產生質體pJRS365。此反應在FR2中引進另一個突變：S41變成Q。 4. 使用片段LCN2與LCC2作為模板及使用LChuFl 與LChuR3作為引子進行PCR反應，所得產物選殖至 pGEM T-easy中，產生質體pJRS366。此反應在FR3中引進另一個突變：R76變成A，及V77變成Μ。 5. 使用片段LCI與LCC2作為模板及使用LChuFl與 LChuR3作為引子進行PCR反應。使用此新片段及LCN1 87 92407修正版 1351407 作為模板及使用LChuFl與LChuR3作為引子進行第_ 4 PCR。所得產物選殖至pgeM T-easy中，產生質體 PJRS3 67。此作法組合了所有輕鏈突變至一個輕鏈可變功能部位片段中。 6. 然後利用PCR轉化所有LC可變功能部位純系中之 L102形成Κ»使用質體pjRS363、365、366與367作為模板’由可變功能部位使用引子LChuF 1與LChuR4再進行擴增。所得產物再度選殖至pGEM T-easy中，產生質體 pJRS363K、365K、366K 與 367K。 7. 所有四種擬人化可變功能部位隨後選殖至輕鏈表現載體tKMC180中’作為Agel至BstBI限制酶切割片段。供於哺乳動物細胞中表現多種突變輕鏈之最終構築體稱為 PJRS374、375、376 與 377。 8. 由抗-LTAmAb A110輕鏈（LC)可變功能部位片段使用質體pJRS376(含有6種突變之擬人化A110輕鏈之表現載體）作為模板及使用引子MV-LC前導序列與JSS89用於 N_末端片段（LCN1)及引子JSS90與逆LC用於C-末端片段，進行PCR擴增法。使用此等片段作為模板及使用引子MV-LC前導序列與逆LC進行PCR反應，產生含有突變.L11變成Μ及M21變成I之產物。此等產物再選殖至 tKMCl80，LC表現載體中’作為Agei至BstBI限制酶切割片段，產生質體PJRS384。上述所有表現載體構築體於使用COS細胞之共同轉尔貫驗中均展現有能力表現抗體之陽性反應。所有擬人化 88 92407修正版 1351407 重與輕鏈A11 〇可變功能部位之組合均可於ELISA試驗中與LTA結合。隨後構築組合之表現載體，亦即同時具重與輕鏈編碼區之單一質體。由可變功能部位自PJRS383與 pJRS384切割，製造包含所有16個突變（8個在重鏈與8 個在輕鏈）之最終表現質體，稱為PJRS3 94。由ELISA實驗可見，當此質體用於轉染COS細胞時，所產生之抗體可以結合LTA。

用於撰殖之引子：名稱 _ 寡序列

HC-MV 前導序歹1J

HCV back CCCAGAOGTGCTCTTGGAG

HChuFl TGTTTTCGTACGTCTTGTCCGAAGTGCAGCTGOTGGAGTCTG

HChuF2 GAACAQCTTGAAAACTGAGGACACAQCCGTGTATTACTGTOTGAGAC

HChuRl AATACACGGCTGTGTCCTCAGTTTTCAAGCTGTTCATTTGCAGATAGAGCATG

HChuR2 AATTCTGAATTCTGAGGAGACGGTCACTGAGGTTCCTTGACCCC

JSS80 CAGCCGTQTATTACTGTGCGAGACQGOQQGCTTC

JSS81 GAAGCCCCCCGTCTCGCACAGTAATACACGGCTG

JSS 82 GGATTGGTGCAGCCTGGCGGGTCATTGAAACTCTC

JSS83 GAGAGTTTCAATGACCCGCCAGGCTGCACCAATCC

JSS84 GAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCC

JSS85 GGAGAGGCTCTTCTGCGTGAAGCGGTTGTGCAGAGCCTC

JSS86 GATTCAAAAAACAGCCTCTATCTGCAAATGAACAACTTO •參

JSS87 CAGATAGAQGCTGTTTTTTGAATCATCTCTaGAQATGG

CrGACTTTAACTCCTAACATG AATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACAATCACTTGCAGGGCCAGCTC CAAGTGATTGTGACCTTTTCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGQAGACTGOGAG ACTTATACCGQTCAGATCGTTCTCACCCAQTCTCCAGCAATC ACCAGCAGAAGCCAGGATCCCAGCCCAAACCCTGGATTTCTG CAGCGCAATGGAGOCTGAAGATGCTGCC TTGGGCTGGGATCCTGGCTTCTGCTGG CTTCAGCCTCCATTGCGCTGATTGTGAGAGAGTAAG ATTACCTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTTATTTCCAGGTTGGTCCCCCCTCCGAAC ATTACCTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAAC

IiC-MV 前導序列 GAGACCCAAGCTTGGTACC 逆LC JSS88 jssBa LChuFl LChuF2 LChuF3 LChuRl LChuR2 LChuR3 LChuR4 89 92407修正版 1351407 實例5 -擬人化抗_LTA抗體之特徵 A.重組體擬人化C96-110抗體變異株之暫時性產量為了分析抗-LTA抗體之擬人化型之特徵，採用 Superfect (Qiagen)，依製造商之指示，於6孔組織培養中，取貝體pJRS334、391、392、393與394(參見第10圖）轉染至COS細胞中。質體pjrs334編碼C96-110抗體’及質體pJRS391-4編碼C96-110之擬人化變異株。2天後分析上澄液中嵌合抗體產量。然後分析此等抗體，分析所表現之抗體結合金黃色葡萄球菌（S. aureus)LTA抗原之能力。__ 抗體產量分析法係於來自96孔微滴定板之8孔長條板中進行（Maxisorp F8 ; Nunc，Inc.)，孔中塗覆稀釋1 : 500 之山羊抗人類Fc(Pierce广分析板上覆蓋感壓式薄膜，於4 C下培養一夜。然後以诜滌溶液（咪唑/NaC1/〇 4。/❶TWeen-20) 洗務分析板一次。然後添加1 〇〇微升暫時轉染之COS細胞之培養物上澄液稀釋液至兩重覆之孔中，於室溫下之分析板旋轉器上培養60分鐘《以洗滌溶液洗滌分析板7次。以樣本/共扼物稀釋液稀釋山羊抗-人類IgG 籲參 H+L-HRP(Zymed)共軛物1 : 4000，取1〇〇微升稀釋液加至各樣本中，然後於室溫下之分析板旋轉器上培養6〇分鐘。依上述洗滌樣本後，於室溫下與丨〇〇 μ L/孔ABTS展開受質（BioFx)培養1分鐘。添加1〇〇以l/孔Quench緩衝液 (BioFx)中止反應，使用自動化ELISA讀數機（參見表8與第11圖之結果），測量405nm下之吸光度。此分析法證實經此等質體構築體轉染COS細胞所產生之細胞可產生同 90 92407修正版 1351407 時包含人類IgG與/c功能部位之分子。與採用人類單株 IgGl ’濃度〇.5 # g/mL至〇·04 a g/mL之標準曲線系列稀釋液進行比較，可估測各細胞上澄液中抗體濃度。表8.COS細胞中之抗體產量（〇 D 45(>nm) 稀釋度 PJRS391 PJRS392 1:1 1.01 1.09 1:2 0.56 0.65 1:4 0.36 0.44 1:8 0.17 0.34 1:16 0.13 0.19 PJRS393 PJRS394 PJRS334 1.14 1.2 1.05 0.75 0.88 0.68 0.52 0.57 0.41 0.33 0.36 0.27 0.23 0.26 0.18 B.以擬人化變異株分析抗體取來自暫時轉染之cos I LTA之結合性細胞之含抗體之培養物上澄液，分析所表現之抗體與金黃色葡萄球菌LTA結合之能力。該活性分析法係於來自96孔微滴定板之8孔長條板中使用 PBS 進行（Maxisorp F8 ; Nunc，Inc.),孔中塗覆 1 # g/rnL金頁色葡萄球菌LTA(Sigma)。分析板上加蓋，於4 c下培養一夜。然後以PBS洗滌分析板一次。然後添加1〇〇微升i。養物上澄液稀釋液至兩重覆之孔中，於室溫下之分析板旋轉器上培養60分鐘。以洗滌溶液洗滌分析板7次。以樣本/共軛物稀釋液稀釋山羊抗-人類igG H+L-HRP(Zymed)共軛物丨·· 4000 ’取ι00微升稀釋液加至各樣本中，然後於室溫下之分析板旋轉器上培養6〇分鐘。依上述洗滌樣本後，於室溫下與1〇〇 // L/孔ABTS展開受 91 92407修正版 1351407 質（BioFx)培養10-15分鐘。添加100 # L/孔Quench緩衝液（BioFx)中止反應，使用自動化ELISA讀數機（參見表9 與第12圖之結果），測量405nm下之吸光度。此分析法證實經此等質體構築體轉染細胞所產生之細胞可產生一樣多量之擬人化A110抗體。表9.抗體結合性分析法（〇.D.45Qnm) 當量【Ab] ng/mL PJRS391 pJRS392 pJRS393 pJRS394 PJRS334 100.00 1.45 0.86 1 1.1 1.65 50.00 0.9β 0.4 0.45 0.45 0.93 25.00 0.42 0,23 0.27 0.27 0.43 12.50 0.2 0.13 0.16 0.15 0.25 6.25 0.1 0.1 0.1 0.1 0.13 c.採用表面質粒基因組共振（SPR)分析法測定c96_11〇之親和性常數隨後採用表面質粒基因組共振分析法測定此等抗體’以分析此等抗體對金黃色葡萄球菌LTA抗原之結合能力。由表10中所示此等結果可見，pJRS391所產生擬人化 A11 0抗體對LTA之結合能力相當於其親代抗體An〇(或 C96-110)。因此，擬人化型對ιρΑ之表觀結合親和性一定類似其親代。 C-1囊胞製法與固定化依 Kalb 等人之 Biochemica et Biophysica Acta (1992) 1103, 307-316所說明之方法製備含脂壁酸（lta)之囊胞。 92 92407修正版 1351407 簡言之，由含磷脂醯基-乙醇胺亞麻油醯基_棕櫚醯基 (PE-L-P，SIGMA，St. Louis，MO)之氯仿溶液真空蒸發至乾。添加BIAcore溶離液（HBS)與來自金黃色葡萄球菌之

LTA(SIGMA，St· Louis MO)’ 製成含 0.2 mM PE-L-P 之 HBS 溶液與含1%LTA之PE-L-P溶液。激烈渦轉攪拌後，通過聚碳酸酯濾紙8次（孔徑0.1/z m，Nucleop0re Corning)。此溶液立即注射至BIAcore ΗΡΑ晶片上（BIAcore lnc, Piscataway，NJ)，直到得到約1400 RU平頂期為止。囊胞會自行融合至ΗΡΑ晶片表面上。 C-2. SPR分析法於加裝已塗覆PE-L-P/1% LTA之ΗΡΑ晶片之BIAcore 儀器（BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)上測定結合動力學。在表面上注入不同濃度之C96-110 »由於晶片表面無法再生，因此每個表面僅能注射一次。以BIA分析軟體2,〇 (BIAcore Inc·，Piscataway，NJ) ’採用1至2種結合模式測定結合及解離速率。表10. C96-110對不同濃度LTA之表觀親和性常數 LTA濃度 k, [Μ*1 s*1I kdis1) Κα【Μ·1】 0.1% 1.68 x 106 1.68 χ ΙΟ'2 Ιχίο8 1% 1.33 χ 106 Π5χ ΙΟ'2 1.16 χ 1〇8 10% 2.07 χ ΙΟ5 3.51 χ 10"4 5.89 χ 1〇8 實例6.採用本發明FR最適配法擬人化之抗-TAC抗體之 93 924〇7修正版 1351407 電腦比較為了比較各種方法’由利用文獻已公開且進行之擬人化法得到之專一性抗體與採用最適配FR進行擬人化得到之專一性抗體進行比較。當過去進行原始之擬人化法時， Kabat資料庫仍不如進行此電腦比對時來得詳盡。資料庫之擴充增加了可參與進行最適配法之架構數量。為了校正因擴充資料庫而造成之偏差’進行修正之最適配搜尋法，而得到此結果。此貫例中’為抗-TAC抗體進行比對。擬人化細部示於表Π與12。各表中第一行中，出示起始之鼠科抗體序列，第二行為原始擬人化抗體序列（Queen等人之PNas 86 : 10029-1003 3 (1989))，其中輕鏈可變功能部位最適配之架構為03 5921及重鏈可變功能部位之03 5918 »各表中第三行出示此比較時所決定之較佳最適配架構。最後一行出示使用FR最適配法時之較佳序列。進行此比對法時，FR最適配法之利益可由檢討所需胺基酸取代總數、需要改變之游標殘基數量及總體同質性分數可見。藉由儘量減少胺基酸取代數量，可降低真正擬人化法所涉及之時間、成本與勞力。藉由判別其中保留游標殘基作為較佳胺基酸之FRs，可儘量降低對ct)Rs構形之有害影響’應可將對抗體結合親和性之影響降至最低。由 FR最適配法與其他以架構為主之方法比較可見，前者之幸孩鏈與重鏈架構具有較佳總體同質性分數（亦即同質性％)。抗-TAC抗體所採用之原始擬人化法主要係選用 92407修正版 94 1351407 035921 與 03591 s 刀別作為與輕鏈與重鏈最適配之架構。此擬人化而要取代輕鏈架構中％個胺基酸之Μ個（其中5 個為游標殘基）及重鏈架構巾87個胺基酸之29個（其中5 個為游標殘基）。採用已擴充之Kabat資料庫時，〇^八4-8八（00475 2)架構與輕鏈最適配，且八1〇(〇459〇3)抗體 v、重鏈最適配（採用放鬆之標準，其假設該輕與重鏈可變功能部位架構並未來自相同抗體)。此結果比原始之擬人化抗 C更適ge* 所需之總取代數較少（3〇對η)，游標區殘基之變化較少（4對丨0)，及同質性較佳。彳FR最適配法產生更優異之結果，其僅需要取代η 個胺基酸m 3個為游標殘基4科抗·tac與原始擬人化抗-TAC之間之總體同質性為74 3%。使用擴充之資料庫可改善總體同質性成為86.5%，但當採用心最適配法時，則改善為89.6%。抗- TAC輕鍵之擬人化法之比較 aa變化游標同質性％ ·· hu 抗-TAC 28/106 5 73.6% CEA4-8A(004752) 24/106 3 77.4% 最適配FR 18/106 2 83% 抗-TAC重鏈之擬人化法之比較 aa變化游標同質性％ 92407修正版 95 1351407 hu 抗-TAC 29/116 5 75% A10(045903) 6/116 1 94.8% 最適配FR 5/116 1 95.7% 抗-TAC可變功能部位之擬人化法之總體比較 aa變化游標同質性％ hu 抗-TAC 57/222 10 74.3% A10(045903) 30/222 4 86.5% FR最適配 23/222 3 89.6%

表11.採用包括FR最適配法進行擬人化之抗-TAC輕鏈之比較

表11A 名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2 (15 aa) mu 抗-TAC 1 10 20 35 49 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITC WFQQKPGTS PKLWIY hu 抗-TAC D QM STL V DR Y KA LM CEA4-8A E 004752 SSL V DR y KA L 最適配FR E ABO.B1 TL (047269) V DR M G3D10K KA (005121) L ··

表11B 名稱 LC-FR3 (32 aa) LC-FR4(10aa) rmi 抗-TAC 57 60 70 80 98 107 GVPARFSC3SGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC PGSGTKLELK hu 抗-TAC S I EFT SLQPD F Q V V CEA4-8A S 004752 DPT SLQP F G VDI 最適配FR D PRA(037670) SP SLQ V Q HSCX3(03603B) 表12.採用包括FR最適配法進行擬人化之抗-TAC重鏈之 96 92407修正版 1351407 比較

表12A 名稱 HC-FR1 (30 aa) HC-FR2 (14 aa) mu 抗-TAC 1 10 20 30 36 49 QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFT WVKQRPGQGLEWIG hu 抗-TAC V VK 5 V G S R A M A10 {045903} V V D 未改變最適配FR V V D 未改變 Ά10 A10 表12B 名稱 HC-FR3 (32 aa) HC-ER4 (11 aa) mu 抗-TAC 67 75 85 95 107 117 KATLTADKS S STAYMQLS SLTFEDSAVYYCAR WGQGTTLTVSS hu 抗-TAC RV I E TN E RS T F F G EYN GLV A10 (045903) V S V 最適配FR V S 未改變 A10 (04S9D3) SCFll (041948)

實例7.採用本發明FR最適配法擬人化之Mc3抗體之電腦比較如上述實例，於本實例中再度以電腦檢視第二種擬人化抗體，以比較此抗體所採用之擬人化法與FR最適配法之擬人化法。為了校正因擴充資料庫而造成之偏差，進行修正之最適配搜尋法，而得到此結果。此實例中，以Mc3抗體進行比較。擬人化之電腦比對結果示於表13與14。各表中第一行出示起始之鼠科抗體序列，第二行為原始擬人化抗體序列（美國專利案No. 5，639,641)。各表中第三行出示此比較時所決定之較佳最適配架構。最後一行出示使用最適配FR法時之較佳序列。

Mc3抗體之原始擬人化法揭示於美國專利案No. 97 92407修正版 1351407 ，9,641此擬人化法需要取代輕鏈架構中1〇7個胺基酸中之16個殘基（其中沒有任何一個是游標殘基）及重鏈架構令117個胺基酸中之14個殘基（其中沒有任何一個是游標殘基）。使用擴充之Kabat資料庫，VL純系47(〇243〇〇)架構與輕鏈可變功能部位最適配，且A1〇(〇459〇3)抗體與重鏈可變功能部位最適配（採用放鬆之標準，其假設該輕與重鏈可變功能部位架構並未來自相同抗體）。即使使用此等架構，其所產生電腦’擬人化’之抗體仍不如原始之擬人化抗體。其原因為原始之擬人化Mc3之原始方法所建議之其他外加變化所致。來自電腦擬人化法之最適配架構將需要取代35個胺基酸’相較於原始之擬人化法'僅需改變3〇個胺基酸。這兩種擬人化法均不需改變游標區殘基。但本發明之FR最適配法卻產生較佳結果，其僅需要取代26個胺基酸’且不改變游標殘基《鼠科Mc3與細部擬人化實例之間總體同質性為82.2%，而原始擬人化Mc3則為85°/p本發明FR最適配法之總體同質性最佳，達89 7〇/〇。

Mc3輕鏈之擬人化法之比鲂 aa.變化游標同質性％ huMc3(037000) 16/107 0 85% 架構（024300) 19/107 0 82.2% 最適配FR 11/107 0 89.7% Mc3重鏈之擬人化法之比鮫 98 92407修正版 1351407 aa變化游標同質性％ huMc3 (037000) 14/117 0 88% 架構（045903) 16/117 0 86.3% 最適配FR 15/117 0 87.2% Mc3可變功能部仂之擬人化法之嫵體比較_ aa變化游標同質性％ huMc3(03 7000) 30/224 0 86.6% 架構 35/224 0 84.4% 最適配FR 26/224 0 88.4% ··

屈免疫原之模板相對於最適配架構相進行擬人化法之比鲂 Μ ·· 99 92407修正版 1351407 表13A 名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2 (15 aa) 1 10 20 35 49 Mc3-LC DIVMTQSHKFMSTSEGDWVSITC WTQQKPGQ S P KL LIY HuMc3-LC PDSLAV L ERAT 未改變 037000 037000 架構 024300 PSSL A V R T KA 最適配FR PSSL A V R 未改變 047664 047246 表13B 名稱 LC-FR3 (32 aa) LC-FR4 (lOaa) 57 60 70 80 8β 98 107 Mc3-LC GVPDRFSGSGSGTDPTFTISSVQT^EDLAVYYC FGSGTNLEIK HUMC3-LC L L V KV 037000 037000 架構 S L L P FT G KV 024300 最適配FR L L V Q 005062 047666 表14.Mc3重鏈使用免疫原之模板相對於最適配架構相對於F R最適酉己法戶斤進行擬人4匕法之比較 ·· 100 92407修正版 1351407

表14A 名稱 HC-FR1 (30 aa) HC-FR2(14aa) 1 10 20 30 36 44 MC3-HC EVQLQQSGPELVKPGASMKISCEASGYSFT WVKQSHGMNLEWIG HuMc3-HC V 037010 A VK V V K P 架構 Q 045903 A V L K D T RP QG 最適配FR V 050357 A VK V V K RP 045903 QG

Table 14B 名稱 HC-FR3 (32 aa) HC-FR4 (11 aa) 67 75 85 95 107 117 Mc3-HC KATLTVDKSSGTAYMELLSLTSEDSAVYFCAR WGQGTSVTVSS HUMC3-HC 037010 TS S R T L 架構 045903 S Q S Y T 最適配FR 045903 S Q S Y 未改變 041935

實例8 ·抗-TF抗體擬人化之電腦比較：架構相對於FR最適配法擬人化法之另一種比較法係使用來自上述實例1之抗體。由採用整個架構之方法得到之最適配結果與抗-TF抗體所使用之FR最適配法之結果比較。最近再次於電腦上進行與原始擬人化之比較，所得最適配結果並不一定會與實例1之結果相同，因為Kabat資料庫已擴充，以致FRs之適配性較佳。儘管如此，其結論仍是FR最適配法可提供優於架構最適配法之優點。當進行搜尋來判別最適配架構時，其結果示於表1 5 與1 6。表中第一行出示原始鼠科單株抗體序列，第二行為實例1之擬人化抗-TF抗體之原始最適配FR序列，第三行 101 92407修正版 1351407 出示最適配架構之序列，第四行為最近使用fr最適配法所決定之最適配序列。抗-TF抗體輕鏈之最適配架構（表1 5) 為scFl 1(041950)，其需要取代13個胺基酸，改變1個游標區殘基’其同質性為87.9 %。抗-TF抗體輕鏈最近更新之最適配 FR 為 FR1 之 041950，FR2 之 019308，FR3 之 03 823 3及FR4之03 6〇3 8，其需要取代10個胺基酸，改變〇個游標區殘基.，其同質性為90.7%。抗-TF抗體重鏈之最適配架構（表16)為A1 0(045903)，其需要取代20個胺基酸’改變1個游標區殘基，同質性為82.9。/。。抗-TF抗體籲籲重鏈之最適配FR為FR1之000042，FR2之023960，FR3 之045903及FR4之047722，其需要取代15個胺基酸，改變0個游標區殘基’同質性為87.2%。FR最適配法總體需要取代25個胺基酸’不需改變游標區殘基，其同質性為 8 8.8°/。’相對於架構最適配法則需要取代33個胺基酸，改變2個游標區殘基，其同質性為8 5.3 %。逛二功能部位之擬人化法夕输艚γ aa變化游標 %同質性實例1 30/224 0 86.6 架構 33/224 2 85.3 最適配FR 25/224 0 88.8 ·· 102 92407修正版 1351407 表1 5.抗-TF輕鏈使用最適配架構相對於FR最適配法所進行擬人〆匕法之比較

表15A 名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2(15aa) 1 10 20 35 49 CH36-LC DIQMTQS PASQSASLGESVTITC WYQQKPGKSPQLLIY 人類-LC L V DR L 005191 019308 架構 041950 L V T Q V 最適配FR L V τ L 041950 019308

表15B 名稱 LC-FR3 (32 aa) LC-FR4 (10 aa) 57 60 70 80 88 98 107 cH36- -LC GVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVNYYC FGAGTKLELK 人類 -LC D T . P AT Q I 038233 004733 架構 041950 Q L N P GS S I 最適配FR D T P AT Q 038233 036038 103 92407修正版 1351407 表1 6.抗-TF重鏈使用最適配架構相對於FR最適配法所進行擬人化法之比較

表16A

名稱 HC-FR1 (30 aa) HC-FR2 (14 aa) 1 10 20 30 36 49 CH36-HC eiqlqqsgpelvkpgasvqvscktsgysft WVRQSHGKSLEWIG 人類-HC Q V G VK 000042 R A P 023960 G 架構 QV A A10 (045903) KL A D T K RP QG 最適配FR Q V G VK 000042 R A P 023960 G

表16B

名稱 HC-FR3 (32 aa)_HC-FR4Q1 aa) 67 75 85 95 107 117 CH36-HC KATLTVDKSSTTAFMHLNSLTSDDSAVYFCAR WGQGTTLTVSS 人類 -HC 037010 TS Y E s RET 000049 V 架構 A10 (045903) s Y Q s E Y V 最適配FR A10 (045903) s Y Q s Ξ Y 未改變 047722 實例9.抗-LTA抗體擬人化之電腦比較：架構相對於FR最適配法擬人化法之另一種比較法係使用來自上述實例3之抗體。由採用整個架構之方法得到之最適配結果與抗LTA抗體（A11 0)所使用之FR最適配法之結果比較。如實例8所示，最近於電腦上進行與原始之擬人化之比較，所得最適配結果並不一定會與實例3之結果相同，因為Kabat資料庫已擴充，以致FRs之適配性較佳。此例中，不論早期之擬人化法或最近之電腦比對法，最適配之FR均相同。然 104 92407修正版 1351407 而，其結果所支持之結論仍是？11最適配法可提供優於架構最適配法之優點。當進行搜尋來判別最適配架構時’其結果示於表17 與18。表中第一行出示原始鼠科單株抗體序列，第二行為實例4之擬人化抗_lTA抗體之原始最適配FR序列，此結果與最近進行之FR最適配搜尋法之結果相同，第三行出示最近決定之最適配架構。抗_LTA抗體輕鏈可變功能部位之最適配架構（表17)為036047，其需要在1〇7個胺基酸中取代13個胺基酸，改變2個游標區殘基，其同質性為879 ♦籲 %。抗-LTA抗體輕鏈之最適配FR為FR1之036047，FR2 之03 765 8，FR3之03 6047及FR4之004763，其需要取代 9個胺基酸，改變〇個游標區殘基，其同質性為91.6%。抗-LTA抗體重鏈可變功能部位之最適配架構（表1 8)為 028897，其需要在123個胺基酸中取代15個胺基酸，改變 4個胺基酸游標區殘基，同質性為87.8%。抗-LTA抗體重鏈之最適配FR為FR1之000468，FR2之000565，FR3之 000628及FR4之031571，其需要取代9個胺基酸，改變2籲_ 個游標區殘基，同質性為92.7%。FR最適配法總體需要取代18個胺基酸，改變2個游標區殘基’其同質性為92.2%，相對於架構最適配法則需要取代28個胺基酸’改變6個游標區殘基，其同質性為87.8%。 105 924〇7修正版 1351407 砉1 7.抗-LTA輕鏈使用最適配架構相對於FR最洎配法所進行擬人化法之比較

表17A

名稱 LC-FR1 (23 aa) LC-FR2(15aa) 1 10 20 35 49 A110-LC DIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC WYQQKPGSSPKPWIS 人類-LC Q T 036047 Μ D I Q 037658 架構 Q T 036047 Μ D I F T L Y

表17B 名稱 A110-LC 人類 -LC 架構 LC-FR3 (32 a^~ 57 60 LC-FR4 (10 aa)

70 80 88 GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC 036047 036047

AM

98 107 FGGGTMIiEIK K 004763 S K 表18.抗-LTA重鏈使用最適配架構相對於FR最適配法所進行擬人化法之比較

表18A

名稱 HC-FR1 (25 aa) HC-FR2 (14 aa) 1 10 20 36 49 A110-HC EVMLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS WVRQAPGKGLEWVA 人類 -HC Q G 未改變 000468 000565 架構 Q K R R 6 028897 表 18B 名稱 HC-FR3 (32 aa) HC-KR4(11 aa) 67 75 85 9S 107 117 A110- HC RPTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYyCVR WGQGTSLTVSS 人類 -HC KNS s V A V 000628 031571 架構 02ΘΘ97 KNT s V TT G LV ·· 106 924〇7修正版 1351407 年#兌玲頁本發月已參考較佳具體實▲例詳細說明。然而，咸了解，熟於此相關技藝之人士可參考其揭示内容，在本發明之精神與範圍内進行修飾與改善。【圖式簡單說明】第1Α與1Β圖出示H36D2 Β7(鼠科抗組織因子抗體）之輕鏈與重鏈可變功能部位之核酸（Seqidn〇s:丄旬）與胺基酸（SEqIDn〇s: 2與4)序列，其中超變區a· 或互補性決^區）以下加線表示（單-下加線指核駿序列及雙下加.線指胺基酸序列）。第2圖出示擬人化抗—tf ^⑴抗體表現載體之質體圖譜（pSUN-34)。第3 A至3D圖為抗_TF抗體之部份與完全擬人化輕鍵 (LC)可變功能部位之序列（seq①n〇s : μ至8^。第 3Α圖出示之序列稱為”LC_〇9”，其代表完全擬人化…架構（EQ ID NO. . 79)。cH36 與 LC-09 之輕鏈 CDR 序列出不於第3B至3D圖（分別為SEQIDN〇s : 1〇3、6及7)。第4A至4D圖出示抗_TF抗體之部份與完全擬人化重鏈（HC)可變功能部位之序列（SEQ ID NOS.: 83至96)。第圖出示之序列稱為”HC_〇8”，其代表完全擬人化架構（SEQIDNO.·· 91)。咖6與HC〇8之重鏈cdr序列出不於第4B至4D圖（分別為SEQ ID NOS... 104、104、 9、、10 及 1〇)。第5A及5B圖出示IgGl抗-組織因子抗體（h〇A丁）之人類怪定功能部位之序列，第5A圖出示人類凡輕鏈怪定功 92407修正版 107 1351407

年學·日修(t.: . U * 5B圖出示人類Ig(H重鏈 98) °圖中出示hOAT HeGl 能部位（SEQ ID NO. : 97)及第 hOAT (IgGl) 恆定功能部位（SEQ ID NO. : i 恆定功能部位胺基酸序列。

值定功能部位（SEQ ID NO. : 100)。第7A與7B圖出示AU0(嵌合抗_LTA抗體）之輕鏈與重鏈可變功能部位之核酸（SEQIDNOS.: 105及1〇7)與胺基酸（SEQIDNOS: 1〇6及1〇8)序列，超變區（(^以或互補性決定區）以下加線表示（單一下加線指核酸序列及雙下加線指胺基酸序列）。第8圖出示編碼擬人化抗_lta IgCH之表現載體之質體圖譜（pJRS 391)。第9A至9H圖出示抗-LTA抗體之部份與完全擬人化可變功能部位之序列。第9A圖出示擬人化輕鏈（LC)可變功能部位架構區之序列（分別為SEq ID nos. : 1〇9至 114)。第9B至9D圖出示輕鏈CDRs 1-3 (分別為SEQ ID NOS. . U5至117)。第9E圖出示部份與完全擬人化重鏈 (HC)可變功能部位架構區之序列（分別為SEq ID n〇s.: 118至123)。第9F至9K圖出示重鏈CDRS 1-3 (分別為SEQ ID NOS. : 124 至 126)。第10圖係出示生產擬人化A110抗體之質體構築體之分析表。 108 92407修正版 1351407 ' 年月雜7更)jf，.：

-_J 第1 1圖出示擬人化抗-LTA經不同質體處理後之抗體表現結果。第12圖出示LTA結合性結果。 (本案圖式無元件符號） 109 92407修正版 1351407 序列表

<110〉黃慶祥史汀森傑佛瑞L. 摩斯奇拉路易士 A. <120>免疫系統分子之擬人化方法 <130> 71758/58066 <140> <141> <150> 09/990,586 <151> 2001-11-21 <150> 60/343,306 <151> 2001-10-29 <150> 09/293,854 <151> 1999-04-16 <160> 26 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> 新人(Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 1 gac att cag atg acc cag tct cct gcc tcc cag tct gca tct ctg gga 48

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 gaa agt gtc acc ate aca tgc ctg gca agt cag acc att gat aca tgg 96

Glu Ser Val Thr lie Thr Cys Leu Ala Ser Gin Thr lie Asp Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag etc ctg att 144

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45 tat get gcc acc aac ttg gca gat ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc 192

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag ate age age eta cag get 240

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys lie Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80 gaa gat ttt gta aat tat tac tgt caa caa gtt tac agt tct cca ttc 288

Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 aeg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213>新人 1351407 <400> 2

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Gin Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Ser Val Thr lie Thr Cys Leu Ala Ser Gin Thr lie Asp Thr Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys lie Ser Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 ⑻ 105 <210> 3 <211> 351 <212> DNA <213〉新人 <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400〉 3 gag ate cag ctg cag cag tet gga cct gag ctg gtg aag cct ggg get

Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15 tea gtg cag gta tcc tgc aag act tet ggt tac tea ttc act gac tac

Ser Val Gin Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 aac gtg tac tgg gtg agg cag age cat gga aag age ett gag tgg att

Asn Val Tyr Trp Val Arg Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga tat att gat cct tac aat ggt att act ate tac gac cag aac ttc

Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly lie Thr lie Tyr Asp Gin Asn Phe 50 55 60 aag ggc aag gec aca ttg act gtt gac aag tet tcc acc aca gcc ttc

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg cat etc aac age ctg aca tet gac gac tet gca gtt tat ttc tgt

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga gat gtg act aeg gcc ett gac ttc tgg ggc caa ggc acc act

Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr

1 ⑻ 105 HO etc aca gtc tcc tea

Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 117 48 96 144 192 240 288 336 2 351 1351407 <212> PRT <213〉新人 <400> 4

Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Gin Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Asn Val Tyr Trp Val Arg Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly lie Thr lie Tyr Asp Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213>新人 <400〉 5

Leu Ala Ser Gin Thr lie Asp <210> 6 <211〉 7 <212> PRT <213>新人 <400> 6

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>新人 <400> 7

Gin Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213>新人 <400> 8

Thr Asp Tyr Asn Val Tyr 1351407 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213>新人 <400> 9

Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly lie Thr lie Tyr Asp Gin Asn Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213>新人 <400〉 10

Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe <210> 11 <211> 21 <212> 脆 <213〉新人 <400〉 11 ctggcaagtc agaccattga t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213>新人 <400〉 12 gctgccacca acttggcaga t 21 <210〉 13 <211> 28 <212> DNA <213>新人 <400〉 13 caacaagttt acagttctcc attcacgt 28 <210> 14 <211〉 18 <212> DNA <213>新人 <400> 14 actgactaca acgtgtac 18 <210〉 15 <211> 51 <212> DNA <213>新人 <400> 15 tatattgatc cttacaatgg tattactatc tacgaccaga acttcaaggg c <210> 16 <211> 24 4 51 24 241351407 <212> DNA <213>新人 <400> 16 gatgtgacta cggcccttga cttc <210> 17 <211> 23 <212> ΓΜ <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 17 gcacctccag atgttaactg etc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <2Π>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400〉 18 gaartavccc ttgaccaggc 20 <210〉 19 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 19 ggaggcggcg gttctgacat tgtgmtgwcra carte 35 <210> 20 <211〉 45 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列的描述：引子 <400> 20 atttcaggcc cagccggcca tggccgargt yearetkear caryc 45 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 21 cccgggccac catgkccccw rctcagytyc tkg 33 <210> 22 <211> 35 5 1351407 <212〉脆 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 22 cccgggccac catggratgs agctgkgtraa tsctc 35 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400〉 23 atatactcgc gacagctaca ggtgtccact ccgagatcca gctgcagcag tc 52 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 24 gacctgaatt ctaaggagac tgtgagagtg g

31 <210〉 25 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引子 <400> 25 ttaattgata tccagatgac ccagtctcc 29 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列的描述：引子 <400> 26 taatcgttcg aaaagtgtac ttacgtttca gctccagctt ggtcc

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Claims

1351407 公告本 _____________________ 第92121957號專利申請案 100年6月16日修正替換頁拾、申請專利範.一:上 1. 一種製造擬人化抗體可變（v)功能部位之方法，其中該方法包括： a) 將非人類抗體可變（V)功能部位之架構區（fr)之胺基酸序列與人類抗體可變功能部位之架構胺基酸序列之集合庫進行比對， b) 自該集合庫中選拔與該非人類FR具有最高胺基酸序列一致性之人類FR序列， c) 誘變該非人類FR之DNA，以編碼一擬人化馨 FR(huFR)，其胺基酸序列與來自步驟b)之該選拔之人類FR至少83%相同， d) 對該非人類v功能部位中各該FR重覆步驟a) 至c) ’以製造多數DNA序列’其中各DNA序列編碼一擬人化FR ;及 e) 將來自步驟d)之各該huFR DNA序列插入至少編碼該非人類抗體之該V功能部位之第一載體中，取代該載體所編碼之該相應非人類FR ;其中該取代作用操鲁縱性連接各該huFR至其相應之互補性決定區（Cdr)以形成擬人化輕鏈V功能部位及擬人化重鏈v功能部位；及 0將該第一載體於宿主細胞中且於可製造擬人化抗體V功能部位之條件下表現。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該v功能部位係來自非人類抗體輕鏈。 92407修正本第92121957號專利申請索 100年6月16 B修正替換‘ 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中步驟a)之該輕鏈v 功能部位之該架構區（FR)為]PR1。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該非人類抗體輕鏈之該FR1與該選拔之人類fr之間之序列一致性至少為 83% 〇 5·如申請專利範圍第4項之方法，其中步驟d)尚包括將該非人類輕鏈V功能部位之第二架構區（FR2)與該集合庫進行比對’並選拔序列一致性至少83%之人類FR。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中步驟d)尚包括將該非人類輕鏈V功能部位之第三架構區（Fr3)與該集合庫進行比對，並選拔序列一致性至少83%之人類FR。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中步驟d)尚包括將該非人類輕鏈V功能部位之第四架構區（FR4)與該集合庫進行比對’並選拔序列一致性至少83 %之人類FR。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該擬人化輕鏈v 功能部位包括依序共價連接之： huFRl-CDRl-lniFR2-CDR2-huFR3-CDR3-hUFR4。 9·如申請專利範圍第2至8項中任一項之方法，其中該抗體輕鏈V功能部位之該非人類與人類fr中，各FR十游標區胺基酸殘基相同。 10. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該第—载體尚包括與該擬人化輕鏈V功能部位共價連接之人類輕鏈恒定功能部位或該人類輕鏈恆定功能部位之片段。 11. 如申請專利範園第10項之方法，其中該人類輕鍵怪定 92407修正本 2 1351407 第92121957號專利申請案 100年6月16日修正替換頁功能部位為C /c或C T。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該擬人化輕鏈片段之胺基酸長度為95至235個胺基酸之間。 13. 如申凊專利範圍第1項之方法’其中該V功能部位係來自非人類抗體重鏈。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中步驟a)之該重鏈 V功能部位之該架構區（FR)為。 15. 如申请專利範圍第丨4項之方法，其中該fri與該選拔之人類架構FR之間之序列一致性至少為83%。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中步驟幻尚包括將該非人類重鏈V功能部位之第二架構區（FR2)與該集合庫進行比對，並選拔序列一致性至少8 3 %之人類FR。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中步驟d)尚包括將該非人類重鏈V功能部位之第三架構區（FR3)與該集合庫進行比對’並選拔序列一致性至少83 %之人類Fr。 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中步驟幻尚包括將該非人類重鏈v功能部位之第四架構區（FR4)與該集合庫進行比對，並選拔序列一致性至少83 %之人類FR。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該擬人化重鏈v 功能部位包括依序共價連接之： huFRl -CDRl-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4。 20. 如申請專利範圍第13至19項中任一項之方法，其中該抗體重鏈V功能部位之該非人類與人類FR中，各FR 中游標區胺基酸殘基相同。 92407修正本 3 1351407 第92121957號專利申請案 100年6月16曰修正替換頁 21. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該第一載體尚包括與該擬人化重鏈V功能部位共價連接之人類重鏈恆定功能部位β 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該人類重鏈恆定功能部位為IgG 1、IgG2、IgG3或IgG4同型中之一者。 23·如申請專利範圍第1項之方法，其中該集合庫包括完全定序之人類抗體。 24. 如申凊專利範圍第23項之方法，其中該集合庫尚包括部份定序之人類抗體之胺基酸序列。 25. 如申请專利範圍第21項之方法，其中該擬人化重鏈片段之胺基酸長度為95至540個胺基酸之間。 26·—種製造擬人化抗體之方法，其中該方法包括： a) 將非人類抗體輕鏈可變（V)功能部位之架構 (1-FR)之胺基酸序列與人類抗體輕鍵可變功能部位之架構之胺基酸序列之集合庫進行比對， b) 自該集合庫中選拔與該i_FR具有最高胺基酸序列一致性之人類F R序列， c) 誘變該1-FR之DNA，以編碼與來自步驟b)之該選拔之人類FR具有至少83%相同胺基酸序列之輕鏈擬人化 FR(L_huFR)， d) 對該非人類抗體輕鏈V功能部位中各該FR重覆步驟a)至c)’以產生多數DNA序列，其中各dna序列編碼L-huFR， e) 將來自步驟d)之各該L_huFR DNA序列插入至 92407修正本 4 第92121957號專利申請案 1〇〇年6月16日修正替換頁少編碼該非人類抗體之該輕鏈V功能部位之第一載體 t ’取代該載體所編碼之相應1 _FR ;其中該取代作用操縱性連接各該L_huFR至相應之互補性決定區（cdr) 以形成擬人化輕鏈V功能部位， f) 將非人類抗體重鏈可變（V)功能部位架構區 (h-FR)之胺基酸序列與人類抗體重鏈可變功能部位之架構區之胺基酸序列之集合庫進行比對， g) 自該集合庫中選拔與該h-FR具有最高胺基酸序列一致性之人類FR序列， h) 誘變該h_FR之DNA ’以編碼與來自步驟g)之該選拔之人類FR具有至少83%相同胺基酸序列之擬人化重鏈 FR(H-huFR)， i) 對該非人類抗體重鍵V功能部位中各該h_FR重覆步驟f)至h)，以產生多數DNA序列，其中各〇ΝΑ序列編碼H-huFR， j) 將來自步驟i)之各該H-huFR DNA序列插入至少編碼該非人類抗體之該重鏈V功能部位之第二載體中’取代該載體所編碼之相應h-FR ;其中該取代作用操縱性連接各該H-huFR至相應之重鏈CDR以形成擬人化重鏈V功能部位，及 k) 將該第一與第二載體於相同宿主細胞中及於可產生擬人化輕與重鏈並製造擬人化抗體之條件下表現。如申請專利範圍第26項之方法，其中編碼該擬人化輕與重鏈之該DNA係含在單一載體且於相同宿主細胞中 92407修正本 5 ⑺丄407 共同表現。第92121957號專利申請幸 1⑻年6月1^“:2; .如申凊專利範圍第26或27項之方法，其中該宿主為哺乳動物、植物、鳥類或微生物。 29 ·如申請專利範圍第26項之方法’其中該第一載體尚包括與該擬人化輕鏈V功能部位共價連接之人類輕鏈怪定功能部位。 3〇·如申請專利範圍第29項之方法，其中該輕鏈恆定功能部位為C /c或c γ。 31·如申請專利範圍第26項之方法，其中該第二载體尚包括與該擬人化重鏈V功能部位共價連接之人類重鏈忮定功能部位。 32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該人類重鏈恆定功能部位為IgG 1、lgG2、IgG3或IgG4同型中之—者。 33. 如申請專利範圍第26或27項之方法’其中該方法尚包括自該宿主細胞純化該擬人化抗體，以產生實質上純的抗體製劑。 34. 如申請專利範圍第33項之方法，#中該實質上純化之擬人化抗體對抗原之專一性結合親和性不會比親代非人類抗體低超過約1 0倍。 35. 如申請專利範圍第34項之方法，纟中該親代非人類抗體為嵌合性。 36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該抗體專—性辨識並結合脂壁酸。 37. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該抗體專一性辨 6 92407修正本第92121957號專利申請案 100年6月16日修正替換頁識並結合人類組織因子。如申明專利範圍第33項之方法，其中該擬人化抗體係用為醫療產品，丨治療人類或動物疾病。如申。月專利範圍第33項之方法其中該擬人化抗體係用為診斷性產品。 4〇.如申請專利範圍第26項之方法，其中該方法尚包括自該擬人化v功能部位製造擬人化單鍵抗體（sc Fv)。化如申請專利範圍第26或27項之方法，其中該擬人化抗體包括F(ab’)2、Fab，或Fab中之一者。 92407修正本 7