TWI332844B - Fully human antibodies against human 4-1bb - Google Patents

Description

1332844 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關完整人類抗體且，更特定言之，有關針 對人類4-1BB的完整人類抗體。 【先前技術】 有大量的證據不容置疑地證明在人類與動物體內存在 著對抗癌症的某種程度之免疫回應。於癌症患者體內，免 疫系統的細胞成分能夠辨識腫瘤細胞所表現出的抗原，例 如瘤胎抗原的分化或突變基因產物（S. Rosenberg， Nature,41 1 : 3 8 0-4 ( 2 00 1 ) ； P.van der Bruggen et a 1.,

Immunological Rev” 188: 51-64 ( 2002))。有許多臨床 硏究證明腫瘤摻入性淋巴細胞具有有利的豫後重要性（E. Halapi, Med. Oncol.,15 ( 4) ： 203 - 1 1 ( 1 998 ) ； Y. Naito et al., Cancer Res., 5 8 ( 1 6 ) : 3 49 1 -4 ( 1 99 8 ) ； L.Zhang et al.，N.E.J.Med.，3 4 8 ( 3 ) ： 2 0 3 - 1 3 ( 2 0 0 3 ))。再者， 用免疫調制劑，例如細胞介素或細菌產物、癌疫苗、或過 繼性免疫療法進行的治療已導致許多患者的腫瘤退化（S. Rosenberg, Cancer J. Sci. Am.6 ( S ) :2 ( 2000 ) ； P.

Bassi, Surg. Oncol.,11 ( 1-2 ) ： 77-83 ( 2002 )； S.Antonia et al., Current Opinion in Immunol·，16 : 130-6 (2 004 ))。雖然有此等回應，針對癌症的免疫性常不能 有效地消除腫瘤細胞。此種失敗的肇因可以分類成三主要 類項：（i)免疫細胞的腫瘤辨識受損，可能來自腫瘤抗 -5- (2) (2)1332844 原的變異性表現或第I類主要組織相容性複合物（MHC ) 的表現減少；（i i )免疫壓制性腫瘤微環境，係腫瘤細胞 分泌抑制性細胞介素之結果（如，TGF- /3 );及（山）因 爲在腫瘤細胞上缺乏共一刺激性分子的表現導致不良的腫 瘤免疫原性，其可導致腫瘤細胞不能有效地刺激T-細胞。 對於腫瘤抗原辨識和免疫效應子功能的要求之了解表明增 強抗-腫瘤免疫回應的一項潛在策略爲透過輔助分子提供 共-刺激。腫瘤抗原-特異性T-細胞需要共刺激來起始且維 持效應子功能。因此，標的共刺激性分子可以用來調制與 增強對腫瘤的免疫回應。 現行對T-細胞活化的模型假設天然T_細胞需要兩種 信號來完全活化：（i ) 一透過由第I類主要組織相容性複 合體（MHC )分子對呈現給T-細胞受體的經處理抗原之結 合所提供的信號；（Π )經由 T-細胞表面上的共-刺激性 分子與彼等在抗原呈現細胞上的配體之間的交互作用所提 供的額外信號。抗原被天然T-細胞的辨識本身不足以觸發 T-細胞活化。沒有共-刺激性信號，T-細胞可能因死亡或 活動力缺乏的誘導而消除掉。透過CD28共刺激性分子的 信號顯然爲T -細胞因應的起始之關鍵，不過，CD137 (4-1BB)訊號發出業經證明爲維持和擴展對抗原的免疫回應 以及記億T-細胞的產生等之根本。 CD137(4-1BB)爲腫瘤壞死受體（TNF-R)基因族的 一員，其包括涉及在細胞增生，分化和程序細胞死亡等的 調節中之蛋白質。CD137爲一 3 0kDa的第I類膜糖蛋白， (3) (3)1332844 經表現爲55kDa均二體物。該受體最初係在小鼠體內描述 (B.Kwon et al.,P.N.A.S. USA, 8 6: 1 96 3 - 7 ( 1 98 9 ))-而後來在人體內鑑別出（M. Alderson et al.，Eur. J. Immunol·, 24 : 2 2 1 9-2 7 ( 1 994 ) ; Z. Zhiu et a 1., Immunol

Lett·，45: 67 ( 1995))。人類與鼠類形式的CD137在胺 基酸層次上有60%的相同率。保守性序列出現在細胞質域 內，以及5個其他分子區中，表明此等殘基對於CDI37分 子的功能可能具重要性（Z· Zhou et al.，Immunol. Lett·, 45:67(1995) ) »CD137的表現業經證明主要發生在淋 巴系細胞上例如經活化的T-細胞，經活化的天然殺手（ NK)細胞、NKT·細胞、CD4CD25調節性T-細胞，以及在 活化胸腺細胞，和上皮內淋巴細胞上。此外，CD137也經 證明係在脊髓源細胞，如樹突細胞、單核細胞、嗜中性細 胞，和嗜伊紅白血球等之上表現。即使CD 1 3 7表現主要限 制在免疫/炎性細胞，仍有報告述及其在締合著少數來自 炎性部位和腫瘤的組織之內皮細胞上表現。 CD 137對T-細胞的功能活性業經廣泛地示性過。在亞 最優劑量的抗-CD3之存在中透過CD137之信號發出業經 證明可誘發T-細胞增生及細胞介素合成（主要爲IFN-T )，及抑制經活化的細胞死亡。此等效應已用鼠類和人類 T-細胞觀察過（W. Shuford et al·，J. Exp. Med·，186 ( 1) :47-55 ( 1997) ; D. Vinay et al.. Semin. Immunol., 1 〇 ( 6 ) 481-9 ( 1998 ) ; D. Laderach et al·, I n t.

Immunol., 1 4 ( 1 0 ) :1155-67 ( 2002))。於人類和小鼠 (4) (4)1332844 體內，共·刺激可增強效應子功能，例如IFN- r產生和細 胞毒性，其係經由增強抗原-特異性和效應子CD8 + T-細胞 之數目所致者。於沒有抗-CD3信號化之存在中，透過 CD 137的刺激就不會變更T-細胞功能，表明cdi 37爲一 種共-刺激性分子。 在CD137對T-細胞刺激後觀察到的生理事件係由各 具不同生理功能的NF-zcB和PI3K/ERK1/2信號所媒介。 NF- κ B信號係觸發Bcl-XL (—種抗-細胞凋亡分子），因 而導致增加的存活率，而PI3K和ERK1/2兩信號則特異性 地促成 CD137-媒介細胞循環進展（H. Lee et al., J. Immunol.，1 69 ( 9 ) : 4 8 8 2 - 8 ( 2 0 0 2 ) ) 。C D 1 3 7 活化對於 抑制經活化誘發細胞死亡之效應業經Hurtado et al.，在試 管內證明過（[Hurtado et al.，J. Immunol·,】58(6): 2600-9( 1997))，且也在一活體內（in vivo)系統中， 抗-CD137單株抗體（mabs)經證明可經由防止細胞系缺 失（clonal deletion而產生經超抗原活化的CD8 + T-細胞之 長期存活顯示出（C. Takahashi et al.，J· Immunol.，162 : 5 03 7 ( 1 999 ))。其後，有兩份報告證明，在不同實驗條 件下，CD137信號可調節CD8 + T-細胞的細胞系擴充與存 活（D.Cooper et al.5 Eur. J. Immunol.. 32 ( 2) : 5 2 1 -9 ( 2002 ) ; M. M a u s et a 1., Nat. Biotechnol.. 2 0 ； 1 4 3 ( 2 0 0 2 ))。在共刺激後觀察到的細胞凋亡之減低可與CD8 + T-細胞中Bc1-xl的含量增加相關聯，而Bcl-2表現則保持不 變。透過4-1BB的抗-凋亡性基因Bc1-xl與bfl-Ι之向上 (5) (5)1332844 調節經證明係由NF- /c B活化所媒介，因爲PDTC (—種 NF-zcB-特異性阻斷劑）可抑制4-1BB-媒介的Bcl-XL之向 上調節之故（Η· Lee et al.5 J. Immunol_s169 ( 9) : 4882- 8(2002))。另一方面，活化T-細胞的細胞系擴充顯然 係經由胞轉蛋白（c y c 1 i n ) D 2，D 3，和Ε的增加表現’及 p2 7kipl蛋白的向下調節所媒介。此等效應係以IL-2相關 性與不相關性兩種方式發生 （H_ Lee et al.,J. Immunol., 1 69 ( 9 ) ： 4 8 82 - 8 ( 2002 ))。 總而言之，CD137刺激導致對新誘發的CD8 + T-細胞 經由部份，直接地作用於此等細胞而使其有增加的擴充， 存活，及效應功能。CD4+和 CD 8 +兩種細胞都經證明對 CD 137刺激有回應，不過，顯然地，T·細胞功能的增進大 於 CD8 +細胞(W. Shuford et al.5 J. Exp.Med.,186 ( 1 ): 47-55 ( 1997) ; I. Gram ag 1 i a et al ·，Eur. J.Immunol.,30 ( 2 ) : 392-402 ( 2000 ) ; C.Takahashi et al·, J. Imm u no 1.5 162: 5037 ( 1999))。基於 CD137 刺激對於 CD8 + T-細胞 功能與存活的關鍵作用，CD137/CD137L系統的操作可提 供似乎可靠的治療腫瘤和病毒致病原之作法。 最近，於小鼠體內展示出在新離析樹突細胞（DCs) 上的 CD137 之組成表現（R. Wilcox et al_，J. Immunol., 169 ( 8 ) ： 4230-6 ( 2002 ) ； T.Futagawa et al..Int.

Immunol.;1 4 ( 3 ) :275-86 ( 2002))，且也在人體內展 現（S · Pau1 ty et al ·, J ·Leukoc.Bio 1. 72 ( 1 ) : 3 5-42 ( 2002 ))。此等報告顯示出CD 137對DCs的刺激導致IL-6和 (6) (6)1332844 IL_12的分泌，及，更重要者，其可增進DC刺激細胞 對同種抗原（alloantigen)的回應之能力。再者，Pan et al.證明DCs中的CD137信號會導致第I類MHC和共刺激 性分子的向上調節’且產生增加的DCs滲入腫瘤內之能力 (P. Pan et a 1., J. Immunol.,172 ( 8) : 4779-89 ( 2004) )。所以，CD137對DCs的共刺激顯然爲DCs增生，成 熟與移動之新穎途徑。 經活化的自然殺手（NK )細胞在用細胞介素刺激之 後會表現出 CD137 ( I. Melero et al.，Cell Immunol‘，190 ( 2 ) : 1 6 7- 72 ( 1 998 ) ； R.Milcox et al.,J.Immunol.,169 ( 8 )42 3 0-6 ( 2 002 )。有數份報告證明NK細胞對於激動性 CD 1 3 7抗體所誘發的抗腫瘤免疫回應之調制顯得具有關鍵 性（I. Me 1 ero et al., C e 11 I mmunο 1., 1 90 ( 2 ) ： 1 6 7*72 ( 1 9 9 8 ) ； R.Miller et a 1., J . I m m u η o 1., 1 6 9 ( 4 ) 1792-800 (2 0 0 2 ) ； R.Wilcox et a 1., J . I m mu η ο 1., 1 6 9 ( 8 ) : 423 0-6 ( 2002) ) >NK細胞的耗乏會明顯地減低抗- CD137mabs 的抗腫瘤活性。將CD 137連接到NK細胞上會誘導增生及 IFN- r分泌，但不會影響彼等的細胞溶解活性。値得注意 者，經試管內CD137剌激的NK細胞會對CD8 +細胞溶解 性T-細胞呈現免疫調節性或”助手〃活性，導致活化T-細胞的擴充。所以，CD 137在NK細胞上的信號可調制對 腫瘤的天然免疫性。 對於CD 137刺激已有述及一種矛盾性效應，在於激動 性CD1 37抗體可誘發靈長類與小鼠模型中對T-細胞抗原 -10- (7) (7)1332844 的體液回應之壓制（H.Hong et al.，J.Immunother.，23 ( 6) 6 1 3 -2 1 ( 2000 ) ； R.Mittler et a 1., J . Ex p . M e d ., 1 9 0 ( 10 ):1535-40(1999))，且使自體免疫性疾病相關的徵 候產生明顯的改善（J.Foell et al.，N.Y.Acad.Sci.，9 8 7 : 230-5 ( 2003) ； Y.Sun et al.,Nat.Med.,8 ( 12) ： 1405-13 (2002 ))。經推測 CD1 37信號達到經抗原活化的 CD4 + T-細胞時會導致IFN- 7·分泌的誘發而活化巨噬細胞 。經活化的巨噬細胞轉而對B細胞產生死亡信號。透過 CD137對CD4 + T-細胞的連續信號傳達可能隨後誘導此等 CD4 + -活化T-細胞的活化-誘發細胞死亡（AICD)。所以 ，經由消除掉經抗原活化的T-細胞和B細胞，可觀察到 減低的抗體回應且因而，觀察到Th2-媒介炎性疾病之急劇 減低（B.Kwon et al.,J.Immunol. ,168 ( 11 ) :5483-90 ( 2002 ))。此等硏究推測出激動性CD1 37抗體對於炎性或 自體免疫性疾病的治療，而不會誘發免疫系統的全盤壓制 ，之作用。 CD137的自然配體，CD137配體（CD137) ’ 一種 TNF-超族的34kDa糖蛋白成員，主要是在經活化的抗原呈 現細胞（APC )上偵檢到，例如在B細胞、巨噬細胞、樹 突細胞，以及在鼠-B-細胞淋巴瘤、活化T-細胞’和人類 上皮源癌系細胞之上 （R. Goodwin et al.，Eur· J.Immunol.,23 ( 1 0 ) : 263 1 -4 1 ( 1 993 ) ： Z.Zhou et al., Immunol.Lett.,45 67 ( 1 995 ) ； H.Salih et al.,

J.Immunol.,165 ( 5 ) ： 2903 - 1 0 ( 2000 ))。人類 CD137L -11 - 1332844 ⑻ 與鼠類對等物共有 36%的同質率（M.Alderson et a 1., Eur . J · Immuno 1. ,24 ： 22 1 9-27 ( 1 994 ))。 除了輸送信號給CD1 37表現性細胞之外，CD 137對 CD137L的結合會起始雙向信號，導致對CD137L·表現性 細胞的功能效應。Langsteinetal.證明CD137-1^融合蛋白 對經活化單核細胞上的CD137L之結合會誘導出IL-6、IL-8，和TNF-α的產生，向上調節的ICAM，與經抑制的IL-10 ， 導致增力卩的黏連性 （J.Langstein et al.,J.Immunol.,l 60 ( 5 ) ： 2 4 8 8 - 9 4 ( 1 9 9 8 ))。此外，單 核細胞的增生經證明會伴隨著較高的細胞凋亡率（ J.Langstein et a 1 _，J · L e u k o c . B i ο 1 ·，6 5 ( 6 ) 8 2 9- 3 3 ( 1 999 ))。此等觀察都獲得 ju et al.的硏究所確定（S.Ju.et al.,Hybrid Hybridomics >22 ( 5 ) : 3 3 3 - 8 ( 2003 ))，其 中顯示出功能性抗-CD 13 7L抗體會誘發周圍血液單核細胞 的高增生率。封阻配體會導致T細胞活化的抑制。此外， 在風濕性關節炎的血液惡質病患者的血淸內發現有可溶性 CD 1 3 7L ( H.Salih et a 1 ·，J · I mm uno 1.，1 6 7 ( 7 ) : 4059-66 ( 2001))。因此，CD137與CD137L的交互作用會影響且 產生對T-細胞和APC之功能性效應。 於T-細胞功能的另一重要方面中，經證明激動性抗· CD 137抗體在老年小鼠體內會救回T-細胞對蛋白質抗原的 回應。業經充分展示者，會發生年齡相關連的對抗原之免 疫回應的遞減，一種稱爲免疫老邁（immunosenescence) 的程序（R.Miller:Science;273 : 7 0-4 ( 1 996 ) ； -12- (9) (9)1332844 R _ M i 11 e r，V a c c i n e , 1 8 : 1 6 5 4 - 6 Ο ( 2 Ο Ο Ο ) ; F.Hakim et al. ,Curr. Opinion I m m u η ο 1 ·，1 6 : 1 5 1 · 1 5 6 ( 2 0 0 4 ))。此 現象似乎是因爲在細胞擴增程度與細胞存活或死亡之間的 平衡發生變更所致。Bansal-Pakala曾測試過下述假說：透 過CD137的二次共刺激可以用來在因CD3或CD28的減 低表現，或因減低的信號品質導致T-細胞沒有收到充足的 刺激之情況中，增強T-細胞回應。他們的硏究顯示老年小 鼠具有相對於年輕小鼠爲缺乏的試管內回復回應（ P . B ansa 1 - P ak a 1 a et a 1., J . Immuno 1., 1 6 9 ( 9 ) : 5 0 0 5 - 9 ( 2002))。不過，在用抗-CD137 mabs處理老年小鼠時， T-細胞的增生與細胞介素回應都相同於在年輕小鼠中所觀 察到的回應。雖然促成此效應的特定機制尙未解開，不過 經推測抗-凋亡分子如Bcl-XL的表現，及活體內IL-2分泌 的促進，兩者之增強都可能在回復缺乏性T-細胞回應中有 其作用。此等硏究證實激動性抗- CD137抗體對於回復老 年免疫受損個體內的弱T-細胞回應之潛在性’且對於抗-CD137抗體在癌症患者的用途具有明顯溫義。 CD137目標導向療法在癌症治療中的角色係由使用激 動性抗-鼠CD137單株抗體進行的小鼠活體內效力硏究所 推測出。於Melero et al.的論文中’激動性抗-小鼠CD137 抗體在P815肥大細胞腫瘤’及在低免疫原性腫瘤模型 Agl04 中產生治療（I.Melero et al.，Nat.Med.，3(6): 6 82 - 5 ( 1 997 ))。抗腫瘤效應需要CD4 +和CD8 +兩種T-細胞和ΝΚ細胞，因爲每一亞群的選擇性活體內缺乏都會 -13- (10) (10)1332844 導致減低或完全喪失抗腫瘤效應。此外，也證實要使抗· CD137治療有效用需要有最低的免疫回應誘導。有數位硏 究員使用抗-CD 137抗體來展示此種作法對於癌症治療的 實用性（J.Kim et al.5Cancer Res.,61 ( 5) ： 2 03 1 - 7 ( 2 00 1 )；0.Martinet et al..Gene Ther.,9 ( 1 2 ) : 786-92 ( 2002 ):R.Miller et al., J. I m m u no 1., 1 6 9 ( 4 ) : 1 7 9 2-800 ( 2 0 0 2 ) ； R.Wilcox et al.,Cancer Res.,62 ( 1 5 ) : 44 1 5-8 ( 2002 ) ) 〇 於用激動性CD 137抗體對抗腫瘤效力數據的支持中， CD 1 3 7L所提供的信號業經證明可誘發CTL活性與抗腫瘤 回應（M.DeBeenedette et al.，J.Immunol.，163 ( 9) : 4 8 3 3 - 4 1 ( 1 9 9 9 ) ； B.Guinn et al., J. I mm u η o 1., 1 6 2 ( 8 ) : 5 003 - 10 ( 1999))。有數份報告證明CD137配體基因轉移到鼠 癌內會導致腫瘤排斥，證明共刺激在產生足量免疫回應中 的需要性（S.Mogi et al·，Immunology，101 ( 4) ： 5 4 1-7 (2 0 0 0 ) ； I.Melero et al.,Cell Immunol.,190 ( 2) ： 167- 7 2 ( 1 9 9 8 ) ; B.Guinn et al., J . Immunol., 1 6 2 ( 8 ) : 5 00 3 - 10 ( 1999) ) 。Salih et al·報導在人類癌與人類癌細胞系 中的 CD137L 表現（H.Salih et al.，J.Immunol.，165(3)： 2903-10 ( 2000))，且證明表現該配體的腫瘤細胞能傳 送一共剌激信號給T_細胞而導致IFN- 7和IL-2之釋出， 且此種效應係與腫瘤上面的 CD 13 7L含量相關聯者。 CD 137在人類腫瘤中的表現是否可以使此等腫瘤對激動性 CD 137抗體更敏感仍屬未知。 -14 - (11) (11)1332844 CD137L-/-小鼠已強調了 CD137/CD137L系統在對病 毒與腫瘤的T -細胞回應中之重要性（M.DeBenedetle et al.;J.Immunol.,163 ( 9 ) ： 483 3-4 1 ( 1 999 ) ； J.Tan et al.,J.Immunol., 1 64 ( 5 ) ： 2320-5 ( 2000 ) ； B.Kwon et al. ,J.Immunol., 1 68 ( 1 1 ) : 5483 -90 ( 2002 ))。使用 CD137-和CD137L-缺乏小鼠的硏究已證明CE)137共刺激 在接枝一對一宿主疾病，及抗-病毒性細胞溶解T-細胞回 應中之重要性。CD 13 7-缺乏小鼠具有增強的T-細胞增生 ，但細胞介素產生和胞毒性T-細胞活性都減低（B.Kwon et a 1..J . I m m unο 1., 1 68 ( 1 1 ) : 5483-90 ( 2002 ) ； D.Vin ay et al ·，I m m u η o 1. C e 11 B i o 1., 8 1 ( 3) ： 1 7 6 - 8 4 ( 2 0 0 3 ))。 更最近者，經證明者剔除基因型小鼠（CD 1 3 7-/-)相對於 對照小鼠具有較高的腫瘤轉移頻率（4-倍）。此等數據推 測經由使用激動性抗-CD137抗體的CD137信號發出之回 復爲增強對病毒病原和癌症的細胞免疫回應之可行性措施 〇 除了在小鼠活體內模型中的數據支持CD137的信號發 出有涉及在抗腫瘤免疫回應中的論點之外，於原人類腫瘤 樣品中進行的硏究確定了 CD 137在產生效應子T-細胞中 的角色。於有Ewing肉瘤的患者中，Zhang H_et al.證明腫 瘤內效應子T-細胞呈現出CD3 + /CD8 + /CD28-/CD137 +表現 型（phenotype) 意料之外者，也觀察到進展性腫瘤生長 及抗腫瘤免疫性（效應子T-細胞）之共同存在。用患者的 細胞進行的活體外（Ex vivo)刺激硏究展示出腫瘤誘導 -15- (12) (12)1332844 T-細胞增生與活化都需要使用 CD 13 7L共刺激。用抗-CD3/CD13 7L對PBL進行刺激，但沒有用抗CD3/抗- CD28 時，可誘發腫瘤溶解效應子。此等硏究對於CD137媒介共 刺激可能導致腫瘤反應性CTLs的擴增提供進一步的證據 (H.Zhang et al.，Cancer Biol. Ther.,2 ( 5 ) 5 79-8 6 ( 2 003 ))。另外，於肝細胞癌（HCC )中於腫瘤滲入性淋 巴細胞內經展現出有 CD137的表現（Y.Wan et al.,World J. Gastroenterol > 1 0 ( 2 ) 195-9 ( 2004))。經由 RT- PCR在19個HCC中偵檢出19個CD137表現，而以免疫 螢光染著則偵檢出13/19。相異地，於相同患者的周圍單 核細胞中沒有偵檢到CD 1 3 7。在健康供給者的肝組織中進 行的分析沒有展現出CD 1 3 7的表現。此等硏究沒有嘗試將 臨床疾病與CD137表現相關聯。例如，在Ewing肉瘤和 肝細胞癌中進行的硏究揭露出表現CD137的TIL之存在 ，伴隨著疾病的進展。於 Ewing肉瘤中，經證實 CD137 + TILs能夠在活體外殺死腫瘤細胞，可推測於此等 病人體內CD137途徑係完整者，且可能是腫瘤徵環境中的 壓抑因子抑制彼等的功能。因此，可以推測系統性投服激 動性CD137抗體可能提供此等效應子T-細胞擴增所需的 信號。 除了其在對癌症的免疫性發展中之作用之外，也有報 導過CD137在自體免疫性疾病與HIV中的作用（B.Kw〇n et al.,Exp.Mol.Med.,35 ( 1 ) : 8 - 1 6 ( 2 003 ) ; H.Salih et al.:J.Immunol., 1 67 ( 7 ) : 4059-66 ( 200 1 ) ; E.Kwon et -16- (13) (13)1332844 a 1 ·，P · N . A · S · U S A ’ 9 6 : 1 5 Ο 7 4 - 7 9 ( 1 9 9 9 ))。 因此，根據4-IBB在調制免疫回應中的角色，有需要 製造具有激動活性的抗-人類4-1BB抗體，其可用來治療 或預防人類疾病例如癌症。 【發明內容】 本發明提供完整人類抗體’其可結合到人類4-lBB( H4-1BB)且可使H4-1BB結合到人類4_1BB配體（h4-1BBL)。因此’本發明係有關可結合H4-1BB但不封阻 H4-1BB對H4-1BBL的結合之抗體，由是其可促成本發明 抗體與H4-1BBL兩者都結合到H4-1BB。此等抗體可用爲 抗-腫瘤免疫回應的免疫增強劑。 於一方面中，本發明提供可特異地結合到4_1Bb的單 株抗體或其抗原結合性部份，其包括一輕鏈可變區及一重 鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括一 CDR1 (互補決定區 1) ，一 CDR2(互補決定區2) ’與一 CDR3(互補決定 區3) ’如圖4中所繪示者，且該重鏈可變區包括一 CDR1 (互補決定區1) ’一 CDR2(互補決定區2)，與 —CDR3(互補決定區3) ’如圖3中所繪示者。該單株 抗體可爲’例如’ 一 IgG4抗體或IgGl抗體。 於另一方面中’本發明提供一單株抗體或其抗原結合 性部份，其中該輕鏈包括一可變區如圖4中所繪示者，且 該重鏈包括一可變區如圖3中所繪示者。 於另一方面中，本發明提供一包括一輕鏈和一重鏈的 -17 - (14) (14)1332844 單株抗體，其中該輕鏈包括SEQ ID NO : 6的胺基酸殘基 21-236且該重鏈包括SEQ ID NO: 3的胺基酸殘基20-467 〇 本發明也提供包括本發明抗體或其抗原結合性部份與 藥學上可接受的載劑之藥學組成物。該藥學組成物可單獨 給用或與一藥劑，如治療癌症作用藥劑如化療劑或疫苗組 合給用。 本發明抗體具有廣範圍治療應用，其係作用疾病例如 癌症、自體免疫性疾病、炎性疾病，和傳染性疾病之免疫 調制劑。因爲H4-1BB在效應CD8 + /CD + T-細胞和NK細胞 上的表現，所以抗-H4-1BB抗體具有明顯的潛在腫瘤應用 。本發明進一步提供治療患者的癌症之方法，其包括將一 治療有效量的本發明抗體給患者服用。於一方面中，此方 法進一步包括給用一疫苗。適當的疫苗包括，例如，腫瘤 細胞疫苗、GM-GSF-改質腫瘤細胞疫苗，或抗原裝載樹突 細胞疫田。癌症可爲，例如，目LI列腺癌、黑瘤，或上皮癌 〇

本發明也提供經離析的懸核苷酸，包括一選自下列之 中的核苷酸序列：（a)編碼SEQ ID NO: 3的胺基酸殘基 20-467的胺基酸序列之核苷酸；（b)編碼SEQ ID NO: 3 的胺基酸序列之核苷酸；（c)編碼SEQ ID NO: 6的胺基 酸殘基2 1 -2 3 6的胺基酸序列之核苷酸；及（d )編碼SEQ ID NO : 6的胺基酸序列之核苷酸。本發明經離析聚核苷 酸包括編碼至少一圖3中的CDR或至少一圖4中的CDR -18- (15) (15)1332844 之核苷酸序列。本發明進一步提供包括SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO : 4核苷酸序列之經離析聚核苷酸。 本發明也提供包括選自由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO : 6所構成的群組中的胺基酸序列之經離析多肽。於另 一方面中，本發明提供經離析的多肽，其包括SEQ ID NO :3胺基酸殘基2 0 - 4 6 7的胺基酸序列；且提供經離析的多 肽，其包括SEQ ID NO: 6胺基酸殘基21-236的胺基酸序 列。 本發明進一步包括一種對H4-1BB具有結合特異性之 免疫球蛋白，該免疫球蛋白包括一抗原結合區。於一方面 中，該免疫球蛋白的爲本發明抗體的Fab或F ( aV ) 2。 本發明也包括一細胞系，其可產生本發明抗體或其抗 原結合性部份。 【實施方式】 本發明係有關用於癌症治療中的人類免疫球蛋白之製 備與鑑定，該免疫球蛋白能特異地結合到H4-1BB。本發 明的人類抗體呈現出對H4-1BB的高親和性且在共刺激檢 定出可以有效地誘發IFN-τ產生，但不會影響H4-1BB對 其相應的配體，H4-1BBL之結合，且不會固定補體。 本發明抗體及其抗原結合性部份可以用廣多種重組 DNA技術產生，可最終在經轉染細胞，較佳者不死化真核 生物細胞，例如骨髓細胞瘤或融合瘤細胞內表現出。 本發明抗體及其抗原結合性部份可單獨使用，或與其 -19- (16) (16)1332844 他治療劑一起使用’例如與放射療法、激素療法、胞毒劑 疫苗，及其他免疫調制劑，例如細胞介素和生物回應調節 劑一起使用。此等化合物特別可用來治療癌症及其他免疫 增生性失調症。 於一方面中，本發明提出單株抗體（mab ) 20H4.9-IgG4。圖 1 和圖 2 分別提出 pD17-20H4_9.ha 和 pD16gate-20H4.9.LC之質體輿圖，可用來製造mab 20H4.9-IgG4。 圖3(圖3A-3H)提出質體pD17-20H4.9.h4a的核苷酸序 列，包括密碼股（SEQ ID NO: 1)，互補股（SEQ ID NO :2)，與密碼股所編碼的胺基酸序列（領導肽爲S E Q ID NO: 3的胺基酸殘基1-19;重鏈爲SEQ ID NO: 3的胺基 酸殘基20-467 )。圖4 (圖4 A-4F )顯示出質體pD 16gate-20H4.9.LC的核苷酸序列，包括密碼股（SEQ ID NO: 4) ’互補股（SEQ ID NO : 5 )，與密碼股所編碼的胺基酸序 列（領導肽爲SEQ ID NO : 6的胺基酸殘基1-20 ;輕鏈爲 SEQ ID NO: 6的胺基酸殘基21-236)。

於另一方面中，本發明提供單株抗體（mab) 20H4.9-IgGl。圖5和6分別示意地顯示，mab 20H4.9-IgGl的重 鏈和輕鏈部份序列構成物。圖7提出圖5的重鏈部份序列 構成物之核苷酸序列（密碼股（SEQ ID NO : 7 )和互補股 (SEQ ID NO ： 8 ))，及密碼股所編碼的胺基酸序列（領 導肽爲 SEQ ID NO : 9的胺基酸殘基1-9 ;部份重鏈爲 SEQ ID NO: 9的胺基酸殘基20-149)。圖8提供圖6的 輕鏈部份序列構成物所具核苷酸序列（密碼股（SEQ ID -20- (17) (17) 1332844 NO : 10 )與互補股（SEQ a NO : 1 1 ))，及密碼股所編 碼的胺基酸序列（領導肽爲SEQ ID NO: 12的胺基酸殘基 1-20;部份輕鏈爲SEQ ID NO: 12的胺基酸殘基21-235) 〇 本發明也涵蓋對H4-1BB結合不具實質影響的具有得 自SEQ ID N03和6中所示重鏈和輕鏈胺基酸序列的保守 胺基酸取代之抗體及其抗原結合性部份。保守性取代典型 地包括用一胺基酸取代另—有相似特性的胺基酸，例如， 在下列各組之內的取代：纈胺酸、甘胺酸；甘胺酸、丙胺 酸；纈胺酸 '異白胺酸 '白胺酸；天冬胺酸、穀胺酸；天 冬胺醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸 :及苯丙胺酸 '酪胺酸。 編碼本發明多肽的聚核苷酸典型地進一步包括一經可 操縱地聯結到多肽密碼序列之表現控制序列，包括自然伴 隨的或異源的啓動基因區。較佳者，該表現控制序列的真 核生物啓動基因系統，置於能夠轉形或轉染真核生物宿主 細胞的載體（vector )之內。不過也可以使用原核生物宿 主的控制序列。於載體已摻加到恰當宿主體內之後，即將 宿主保持在適合高水平表現核苷酸序列的條件之下，且， 於合意時，可接著收集和純化可變輕鏈、重鏈、輕/重鏈 二體物或完整抗體，結合性片段或其他免疫球蛋白形式。 (麥閱，S.Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis ，Academic PresS5N.Y. ( 1 97 9 ))。單鏈抗體也可以經 由將本文所揭示的編碼VL和HL區之核酸序列與編碼一 -21 - (18) (18)1332844 多肽連結質（polypeptide linker)接合而產生。 原核生物宿主，例如大腸桿菌，和其他微生物，例如 酵母菌，可以用來表現本發明抗體。除了微生物之外，也 可以使用哺乳動物組織細胞培養物來表現與產生本發明抗 體。真核生物細胞可能爲較佳者，因爲已經有許多種能夠 分泌完整免疫球蛋白的適當宿主T-細胞系被開發出來之故 ，包括，例如，CHO (中國田鼠卵巢）細胞系、COS (非 洲綠猴纖維母細胞系）細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞 系，及融合瘤。此等細胞所用的表現載體可包括表現控制 序列，例如啓動基因或增強子（enhancer)，與所需的處 理資訊部位，例如核糖體結合部位，RNA接合部位，聚腺 苷酸化部位，及轉錄終止基因序列，全部都是技藝中所知 者。 含有目標D N A節段（例如，重鏈及/或輕鏈密碼序列 和表現控制序列）之載體可用熟知方法轉染到宿主細胞內 ，依細胞宿主的類型而變異。例如，氯化鈣轉染爲常用於 原核生物細胞者，而磷酸鈣處理或電穿剌 （ electroporation)可用於其他細胞宿主（參看，例如， T.Maniatis et al..Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press ( 1 982 ))。 於表現之後，可以根據技藝中的標準程序，例如硫酸 銨沈澱，親和性管柱、管柱層析術、凝膠電泳，和類似者 純化出本發明抗體，彼等的二體物，個別的輕鏈和重鏈， 或他種免疫球蛋白形式。較佳者爲有至少90至95 %同質 -22- (19) (19)1332844 率，且最佳者有98至9 9%或更大的同質率之實質純免疫 球蛋白。 本發明抗體和其抗原結合性部份可用來治療抗體媒介 及/或T-細胞媒介的失調症。可合治療的典型疾病狀態包 括癌症、傳染性疾病，和自體免疫性疾病，例如多發性硬 化、風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡，和重症肌無力。 本發明也提供藥學組成物，包括至少一本發明抗體或 其抗原結合性部份及一藥學上可接受之載劑。該藥學組成 物可進一步包括額外的治療疾病作用藥劑。於一方面中， 該藥學組成物包括一治療癌症、傳染性疾病、或自體免疫 性疾病作用藥劑。本發明抗體和其抗原結合性部份，及藥 學組成物也可以與另一種藥劑，例如第二種抗體，共一刺 激性分子，或免疫調制劑共同給用或分開給用。 本發明抗體，其抗原結合性部份，及藥學組成物特別 可用於非經腸給用，亦即，皮下、肌肉內或靜脈內。非經 腸給藥所用的藥學組成物可包括溶解在一可接受的載劑， 較佳者水性載劑之內的抗體溶液。有廣多種水性載劑可供 使用，全部都是技藝中熟知者，例如，水、緩衝水、食鹽 水、甘胺酸，和類似者。此等溶液皆爲無菌且通常不含粒 狀物質。此等藥學組成物可用傳統熟知滅菌技術予以滅菌 ’該等組成物也可包含藥學上可接受之輔助物質，以視需 要接近生理狀況，例如pH調節劑與緩衝劑，毒性調整劑 和類似者，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳 酸鈉、或人類白蛋白。 -23- (20) (20)1332844 可與載劑物質混配以製成單一劑型的活性成分之量通 常爲可產生治療效用的組成物之量。特別有利者爲將非經 腸組成物調配成單一劑型以容易給藥及使劑量一致。 含有本發明抗體的組成物可經投服以供預防性及/或 治療性治療所用。於治療性應用中，係將組成物投用於已 患有疾病的病人，其用量足以治癒或至少部份停止疾病和 其倂發症。足以完成此之量係經定義爲"治療有效量〃。 對此有效用的量係決定於疾病狀態的嚴重性及病人自身的 免疫系統之一般狀態，且可以由諳於此技者所決定。 於預防應用中，含有本發明抗體的組成物係沿尙未處 於疾病狀態的人服用以增強患者對疾病狀態的抗性。此種 量經定義爲”預防有效劑量〃。於此用途中，正確量係決 定於患者的健康狀態及一般免疫性水平且可由諳於此技者 決定出。較佳的預防用途爲用於腫瘤復發的預防。 實施例 實施例1:抗體的產生 材料和方法 對人類CD137(4-1BB)受體的完整人類單株抗體係 在 HuMab-Mouse® ( Medarex .Inc.,Cal ifornia )中產生。 HuMab小鼠係用25微克的人類CD137細胞外結構區（ domain )在 RIBI 佐劑（Ribi Immunochemical)中經腹膜 內（ί·Ρ )和皮下（s.c.)免疫化五次。於融合之後，用相 同量的抗原經靜脈內（i · ν ·)強化小鼠。將得自經免疫化 -24- (21) (21)1332844 的小鼠，具有足夠滴度的抗huCD137之抗體的脾細胞採用 標準程序融合到骨髓細胞瘤細胞。

抗人類CD3 mab (殖株：HIT3a) ’用於人類和猴子 IFN-7的 ELISA套組，細胞計數珠粒陣列（cytometric bead array )( CBA )套組，及所有用於流動細胞計數法 所用的拼合抗體都是購自 BD Pharmingen( San Diego, California)。人類IgGi λ和人類IgGi/c都是購自8丨§111&-Aldrich ( St.Louis，Missouri ) 。CEM 細胞（ATCC-CRL 2265 )係購自 ATCC。培養基（RPMI )，和胎牛血淸（ FBS)都購自 Mediatech Inc. (Herndon, Virginia)。 Sheep Red Blood Alsevers 係購自 Colorado Serum Co.( Denver,Colorado ) 。 融合瘤篩選。以ELISA偵檢對huCD137之結合：爲 鑑定會分泌抗-人類CD 137抗體的融合瘤之時，係用人類 CD137-小鼠IgG2b融合蛋白在PBS中以濃度1微克/毫升 在4°C下塗覆EISA板（Nunc MaxiSorp)整夜。然後用有 0.01%Tween-80的 PBS(PBS-T)洗該等板 3次，且隨後 用PBS-T加1%牛血淸白蛋白（BSA)在室溫下封斷20分 鐘。於諸板中加入50微升在PBS-T中稀釋1-3的上澄液 ，如上述般洗滌諸板，且經由與鹼性磷酸酶一拼合山羊F (ab') 2 抗-人類1gG 抗體（Jackson Laboratories, West Grove，Pennsylvania)溫浸而偵檢抗體的結合。用pNPP 將諸板顯像且在405奈米讀取。 封斷檢定：對可分泌以ELISA鑑定爲可辨識huCD137 -25- (22) (22)1332844 的抗體之26種融合瘤評估彼等促成CD137-CD137L交互 作用之能力。此等分析於最初係以ELISA模式進行。使用 人類CD137-mulgG2b以0.2微克/毫升，100微升/洞塗覆 諸板。於諸板中加入在PBS-T和1 %牛血淸白蛋白中稀釋 的mab 20H4.9-IgGl，或對照樣抗體之系列稀釋液。於諸 洞中添加濃度爲0.2微克/毫升之CD137L-CD8融合蛋白。 使用經生物素化的抗- CD8抗體（0.2微克/毫升，Ancell) 偵檢諸抗體的結合。於數次洗淸之後，加入鏈黴菌抗生物 素蛋白·鹼性磷酸酶（1: 2000 )和pNPP用以偵檢經結合 的抗體，並在405奈米讀取諸板。 爲了確定所選抗體不會變更CD 13 7-CD 13 7L結合，乃 以BIAcore分析進一步鑑定經純化的抗體。所有實驗都在 BIAcore 3000 儀器上進行（BIAcore Inc.，Piscataway，New Jersey ) 。在 BIAcore 感測器晶片（BIAcore

Inc.，Piscataway,New Jersey)的經竣基甲基化葡聚糖表面 上以高密度共價鍵形成固定化人類CD137。以在10mM乙 酸鹽緩衝液，pH 5.0中的2微克/毫升進行注射。未經佔據 的活性中心於隨後經由注射超量的乙醇胺予以封斷。使用 10mM甘胺酸，pH2.0完成表面的再生。 將經純化的抗-CD137抗體樣品用HEPES緩衝食鹽水 ，ρΗ7·4，增補 0.151^\3(：1和 0.005%界面活性劑？20( HBS-EP )予以稀釋到在200與ΙΟΟΟηΜ之間的濃度。使用 人類CD137L-CD8融合蛋白（huCD137L)作爲CD137配 體源。於抗- CD 137抗體之前注射huCD 13 7L，或相反順序 -26- (23) (23)1332844 之方式進行實驗。以5微升/分之流速實施注射。經由使 用10mM甘胺酸緩衝液’ ρΗ2·0進行再生而移除經結合的 配體與抗體。 人類Τ-細胞純化：Τ-細胞或PBMCs係從健康人類供 給者獲得。血液係收集在EDTA中，懸浮在沖洗緩衝液（ RPMI，含有2.5mM EDTA，10微克/毫升多黏桿菌素B ) 中，置於淋巴細胞分離培養基之下（LSM,MediateCh Inc.,Herndon, Virginia)，且以 1800rpm 離心 25 分鐘。收 集細胞介面，且以1 5 00rpm離心10分鐘。其後，將細胞 碎片再懸浮於沖洗緩衝液與洗過的綿羊紅血球（SRBC，1 :1 〇稀釋）之中，且在冰上溫浸1小時。然後將細胞置於 LSM下且以25 00rpm離心25分鐘。移除介面並用SRBC 溶裂緩衝液溶裂SRBC。將離析出的T-細胞洗滌且再懸浮 於 1 0%FBS/RPMI 之中。 流動細胞計數分析：以流動細胞計數法測定抗-人類 CD137抗體對細胞上表現出的CD137之結合。於此等硏究 中使用人類T-細胞白血病細胞系（CEM)，或犬面猴周圍 血液單核細胞（PBMC )。此等細胞不會組成地表現 CD137，不過可經由用大戟二萜醇肉豆蔻酸酯（PMA，10 毫微克/毫升）和離子黴素（1 μΜ )刺激1 8小時而誘發受 體。然後洗淸細胞且與不同濃度的抗體在染著緩衝液中溫 浸（磷酸鹽緩衝食鹽水，PBS，加1%?05，和0.01%疊氮 化鈉）。使用螢光素（FITC )或藻紅蛋白（ΡΕ )拼合山羊 抗-人類 IgG ( Jackson Immunoresearch.West Grove. -27 - (24) (24)1332844

Pennsylvania)偵檢諸抗體對經刺激或未經刺激的細胞之 結合。將樣品固定在1 %福馬林中，保存在4°C，且以流動 細胞計數法讀取。 功能檢定：使用經固定化的抗-C D 3抗體刺激得自健 康供給者的原人類T-細胞或猴子PBMC以提供對T-細胞 活化的第一信號，並用人類抗-人類CD 137抗體共刺激。 作爲非-特異性對照樣者，以相同的抗體濃度使用人化的 抗-癌抗體（BR96)。使用抗- CD3抗體（0.5-1微克/毫升 )在4°C下塗覆諸板整夜。於次日以105/洞的濃度 平板培養Τ-細胞或PBMC。在37°C下培養72小時之後以 細胞計數珠粒陣歹!J ( CBA )或以ELIS A測量IFN- 7的合成 細胞介素檢定 ELISA :在不同時間刺激T-細胞之後，將諸板離心且 移除培養基。以 ELISA 根據製造商的說明（BD Pharmingen，San Diego，California)偵檢細胞介素含量。槪 述之，於經抗-細胞介素塗覆的96-洞板中加入試樣與標準 品。於周溫下溫浸2小時之後，在PBS-Τ中洗諸板3次， 然後先與操作偵檢器抗體溫浸，接著添加受質。於405奈 米讀取吸光度，並根據標準曲線計算濃度。 細胞計數珠粒陣列：測定試管內細胞介素產生作用的 另一種方法爲使用BD pharmingen開發出的細胞計數珠粒 陣列（CBA )進行的流動細胞計數法。將用製造商的說明 -28- (25) (25)1332844 測量培養液上澄液中的IFN - r、IL-2、IL-5、IL-4、IL -1 Ο 與TNF-a的含量。使用CBA分析軟體以流動細胞計數法 分析所得結果。 結果 將可分泌出經顯示可結合到人類CD137的抗體之融合 瘤進一步擴增，且分殖。將分泌出的抗體純化及檢驗彼等 結合到huCD137及促成CD137-CD137L交互作用之能力。 於所評定的抗-人類CD137抗體組合中，選出mab 20H4.9-IgG 1以根據其結合型態和非封阻性質進一步評估。圖9 ( 圖9A-以ELISA檢定的對人類CD137之結合；圖9B- mab 20H4.9-IgGl對 CD137-CD137L交互作用的影響）提供 mab 20H4.9-IgGl 的初始鑑定。對 mab 20H4.9-IgGl、 2 6 G 6 (—種封斷性抗體），或破傷風類毒素（T T，陰性 對照樣）的系列稀釋樣評估彼等變更C D 1 3 7對C D 1 3 7 L結 合的能力。濃度高達1 0微克/毫升的mab 20H4.9-IgG 1不 會封阻CD137L結合。 也檢驗mab 20H4.9-IgGl對於在用PMA和離子黴素 刺激過的人類T·細胞（CEM )與犬面猴周圍血液單核細胞 (PBMC )上面表現的CD 137之反應性。先前硏究測定出 CD137在用PMA和離子黴素活化後的T-細胞上係向上調 節。對照分子包括不相關的人類IgG抗體（陰性對照樣） 或CD137L-CD8融合蛋白（陽性對照樣，BD Pharmingen ，San Diego, California)。得自此等硏究的結果指出mab -29- (26) (26)1332844 20H4.9-IgGl會結合到經活化的人類CEM和犬面猴PBMC ，對未刺激細胞有最小的結合。用mab 20H4.9-IgGl或 CD 1 3 7偵檢到類似百分比的陽性細胞。圖〗〇提供mab 20H4.9-IgGl對經PMA-離子黴素刺激的人類細胞或犬面 猴細胞之結合結果。人類CEM (圖10A)或猴子PBMC( 圖10B)係與20H4.9-IgGl或人類CD137融合蛋白溫浸。 加入二級抗體且以流動細胞計數法讀取樣品。 其次，測定mab20H4.9-IgGl是否可能在抗- CD3刺激 的存在中於共刺激檢定中誘發IFN- 7之增強，一種激動性 CD137抗體所需之關鍵功能。評估mab 20H4.9-IgGl在功 能硏究中於人類和猴子淋巴細胞中之共-刺激活性。根據 初始數據，於此等硏究中使用20微克/毫升抗- CD137抗體 (超量抗體）之濃度。試驗在0.2-1微克/毫升之間的抗· CD3抗體含量，導致10-20%CD137-陽性淋巴細胞。於培 養72小時之後測量上澄液中的IFN_ r含量。如圖1 1中所 示者，mab 20H4.9-IgGl可增進在人類和猴子兩種共刺激 檢定中的IFN- r合成到明顯地高於對照樣之水平。使用從 8個健康人類供給者離析出的T-細胞進行硏究之結果顯示 其中6個，相對於對照樣，mab 20H4.9-IgGl會增進IFN· 7合成達2.2-4.3倍。增進水平優於用hu39E3.G4所觀測 到者；此 hu39E3.G4 爲一種在 PCT 申請 WO 04/010947 ( 以引用方式倂於本文）提出的人化抗-CD137抗體，其顯 示出在8個供給者中有5個在IFN-γ，上低於20H4.9-IgGl 較低之增進效果（1.5-2倍增進）（圖11A)。於猴子共 -30- (27) (27)1332844 刺激硏究中，mab 20H4.9-IgGl也證明增進的功能活性， 導致相對於對照樣爲明顯的IFN- 7增進（圖1 1 B )。如在 人類硏究中者，IFN- 7的增進一致地高於使用hu39E.G4 所得者。 超過對照樣水平的TNF- α合成之誘導也在人類培養 物中觀察到，雖則以比IFN- 7遠較爲低的水平發生。由單 獨抗-CD3抗體所誘導的TNF- α (基線）比IFN- 7，基線水 平較低約20-50倍。mab 20H4.9-IgGl在8個供給者的3 個誘導出~2-4.7倍的增加。再度地，111139£.04(倂行試驗 )在相同供給者中但以較低水平誘導出〜2 -倍的增加。其 他試驗到的細胞介素，I L - 2、I L - 5、I L -1 0和I L - 4對任一 處理都沒有明顯的改變。 與此等硏究一起證明者mab 20H4.9-IgGl可在人類和 猴子體內經由誘發Th 1-型回應而呈現合意的功能活性。明 顯地，由於活體內抗·腫瘤活性係關聯著抗-CD1 37抗體所 具誘發IFN- r合成之能力，因此，此等硏究可支持針對同 型（isotype)轉換的 mab 20H4.9-IgGl 之選擇。 實施例2 :試管內鑑定 根據此結合動力學，不能封阻CD137-CD137L交互作 用之能力，及對人類 T-細胞的功能影響，選擇 mab 20H4.9-IgGl 用於轉換成 IgG4 形式。mab 20H4.9-IgGl 的 IgG4形成爲20H4.9-IgG4 (繪示於圖3和4之中）。 此等硏究的第二階段包括mab 20H4.9-IgG4與mab -31 - (28) (28)1332844 20H4.9-IgGl所具試管內性質之比較。於此階段中，敘述 到此兩種抗體在人類和猴子兩淋巴細胞中的結合動力學硏 究，和功能效應。 結合動力學 抗-人類CD137抗體的動力學硏究使使用 BIAcore 3 000儀器經由表面電漿子共振來評估。將抗原，人類 €0137-鼠4〇23，以低密度經由共價鍵固定化在〇1^5感測 晶片的表面上。將 mab 20H4_9-IgG4 和 mab 20H4.9-IgGl 以介於25與200nM之間的濃度注射入。圖12所示爲mab 20H4.9-IgGl 和 mab 20H4.9-IgG4 以 ΙΟΟηΜ 的注射結果。 使用Β ΙΑ評估軟體（二價模型，整體曲線匹配分析）計算 數據導致對兩種抗體都相似的動力學參數（參看表1)。 對 mab 20H4.9-IgGl 和 mab 20H4.9-IgG4 的解離常數經定 出分別爲11.2與16.6nM。 -32- (29) (29)1332844 表 1 mab 20H4.9-IgG4 與 mab 20H4.9-IgGl 的結合動力學之比 較 抗體 ka)(l/Ms) kdi(l/s) ka2(l/RUs) kdl(l/s) Rmax(RU) KA1 KD1 (nM) 20H4.9- IgGl 3.43E+04 3.85E-04 2.30E-05 1.51E-03 262 8.91E+07 11.22 20H4.9- IgG4 3.92E+04 6.51E-04 0.0755 0.105 409 6.02E+07 16.61 細胞/功能檢定 爲了確定mab 2〇H4.9-IgGl同型轉換程序不會變更抗 體活性，乃進行試管內硏究以在猴子PBMC與人類T-細胞 中比較 mab 20H4.9-IgG4 相對於母體 mab 20H4.9-IgGl 之 活性。測定出 mab 20H4.9-IgG4對人類 T-細胞與猴子 PBMC的功能效應且與其母體分子，mab 20H4_9-IgGl比 較。對得自健康供給者的原人類細胞或猴子PBMC使用 抗-CD3抗體（0.5微克/毫升-1微克/毫升）+/-抗-人類 CD137抗體予以刺激。於37°C培養72小時後以細胞計數 珠粒陣列（CBA )測量人類樣品或以ELISA測量猴子樣品 的IFN_ r合成。於共刺激檢定由在次最優濃度的抗-CD 3 抗體（1微克/毫升）或刀豆素A (concavaHn A) ( 1微克 /毫升）（只有供給者M5170和81)的存在中試驗該等抗 體。將結果表爲相對於對照樣以微微克/毫升爲單位之倍 -33- (30) (30)1332844 數增加。由於供給者之間的可變性背景回應’乃將數據相 對於對照處理（=1 )歸一化。圖13A提供人類T-細胞結 果而圖13B提出猴子PBMC結果。如圖13A-13B中所示 者，mab 20H4.9-IgG4證明有在人類和猴子細胞中產生比 相對於對照樣較高IFN_ 7水平之共刺激性質。IFN- r合成 的增進水平係與其母分子在人類和猴子樣品中可相比者。 隨後，評估抗體交聯對mab 20H4.9-IgG4所具功能效 應之影響。經證明抗體的交聯可能導致彼等的發信號能力 之增強。因此，乃進行硏究以測定數批mab 20H4.9-IgG4 土抗-人類IgG抗體之功能活性。如圖14A中所示者，對 所有受試驗的批料，於沒有交聯抗體的存在中，都觀察到 IFN- r合成的明顯增進，平頂値在400毫微克/毫升濃度處 。mab 20H4.9-IgG4的IFN-r合成增強作用在添加抗-人類 IgG交聯性抗體之下進一步增進，如圖14B中所示者。不 同批次的mab 20H4.9-IgG4具有可相比的細胞活性。 如此，mab 20H4.9-IgG4的交聯導致抗體誘發IFN-r 合成的能力之增進。活體內抗體交聯可能由免疫球蛋白的 Fc部份之細胞受體或經由抗體二體化而發生。mab 20H4.9-IgG4爲IgG4同型，其，相較於他種IgG同型，具 有對Fc受體的低親和性。不過，IgG4可以結合到於單核 細胞和親中性白血球上表現的FcrRI( CD64 )。目前， 尙不知道此結合是否會對人體內的mab 20H4_9-IgG4發信 號有影響。 -34- (31) (31)1332844 其他細胞基檢定 使用兩種其他的檢定來進一步鑑定mab 20H4.9-IgG4 :(i)對T-細胞存活的影響和（i〇對胞轉蛋白D2表現 的影響。爲了測定mab 20H4.9-IgG4是否可透過人類T-細 胞上的CD 137誘發信號化及提供共刺激信號給T-細胞以 導致細胞存活和擴增’乃對用抗-CD3抗體+/-mab 20Η4·9-IgG4於已知會誘發IFN-r合成的濃度刺激過的人類Τ -細 胞以 annexin-V與碘化丙錠染著以測定出活細胞數（ Annexirx V/碘化丙錠陰性），且使用胞轉蛋白D2測定共 對細胞進展的影響。圖15顯示出4不同批的mab 20H4.9-IgG4對於胞轉蛋白D2表現及T-細胞存活之影響。濃度 0.4-10微克/毫升的mab 20H4.9-IgG4可導致約1.8-2倍的 活細胞數之增加，且產生胞轉蛋白D2-表現性T-細胞數目 之明顯增加（2 · 5 - 3倍）。 雖然本發明已經由示範說明和實施例針對澄淸與了解 目的而以某種詳細程度說明過，不過要了解者可在後附申 請專利範圍的範圍內實施出某些種改變與修飾。 【圖式簡單說明】 圖1顯示出pD17-20H4.9h4a之質體輿圖。 圖2顯示出pD16gate-20H4.9.LC的質體輿圖。 圖3 (圖3A-3H)顯示出質體pD17-20H4.9h4a的核苷 酸序列’包括密碼股（SEQ ID NO : 1 )，互補股（SEQ ID NO = 2 )，與該密碼股所編碼的胺基酸序列（領導肽爲 -35- (32) (32)1332844 SEQ ID NO: 3的胺基酸殘基1-19;重鏈爲SEQ ID NO: 3 的胺基酸殘基20-467 )。 圖 4 (圖 4A-4F)顯示出質體 pD16gate-20H4.9.LC 的 核苷酸序列，包括密碼股（SEQ ID NO : 4 )，互補股（ SEQ ID NO ： 5 )，及密碼股所編碼的胺基酸序列（領導肽 爲SEQ ID NO: 6的胺基酸殘基1-20;輕鏈爲SEQ ID NO :6的胺基酸殘基2 1 -23 6 » 圖5示意地顯示出20H4.9重鏈部份序列構成物。 圖6示意地顯示出2 0H4.9輕鏈部份序列構成物。 圖7顯示出圖5的20H4.9重鏈部份序列之核苷酸與 胺基酸序列。 圖8 (圖8a-8b )顯示出圖6的20Η4.9輕鏈部份序列 之核苷酸和胺基酸。 圖 9(圖 9Α-9Β)闇示出以 ELISA 從 mab 20Η4.9-IgGl對人類CD137結合所得結果（圖9A)及mab H4.9· IgGl對於CD137-CD137L交互作用的影響（圖9B)。 圖 10(圖 10A-10B)闡示出從 mab 20H4.9-IgGl 對經 PMA-離子黴素刺激人類或犬面猴細胞的結合所得結果。 將人類 CEM (圖 10A )或猴子 PBMC (圖 10B )與 20H4.9-IgGl或人類CD137L融合蛋白一起溫浸。 圖11(圖11A-11B)闡示出在用抗- CD137抗體的共 刺激硏究中，誘發IFN- Τ所得結果，其經表爲相對於對照 像之增加倍數，單位爲微微克/毫升（pg/ml )。由於在供 給者之間的可變異性背景回應，乃將數據相對於對照處理 -36- (33) (33)1332844 (=1 )歸一化。使用抗-CD3單獨刺激人類T-細胞（圖 11Α)或猴子PBMC (圖11Β)所得中間IFN-r基線含量 分別爲592微微克/毫升和505微微/毫升。 圖 12 提出將 mab 20H4.9-IgG4 和 mab 20H4.9-IgGl 對 人類CD137結合之電漿子共振標繪圖。 圖13(圖13A-B)闡示出在用抗- CD137抗體的共刺 激硏究中IFN- r的誘導。其結果表爲相對於對照樣的增加 倍數，單位爲微微克/毫升。由於供給者之間的可變性背 景回應，乃將數據相對於對照處理（=1 )歸一化。用抗-CD3單獨刺激人類T-細胞（圖13A)或猴子PBMC (圖 13B)所得中間IFN_r基線含量分別爲5 92微微克/毫升與 5 05微微克/毫升。 圖 14(圖 14A-14B)闡示出以 mab 20H4.9-IgG4(圖 1 4A )對IFN- r合成的劑量相關性增強所得結果，及經由 添加交聯性抗-人類IgG抗體（7微克/亮升）的抗體交聯 效應（圖1 4 B )。 圖15闡示出mab 20H4.9-IgG4對於T·細胞存活和細 胞周期進展的影響。人類T-細胞係用抗-CD3(1微克/毫 升）±mab 20H4.9-IgG4於所示濃度下共刺激。檢定起始6 天後，收集細胞且用 Annexin-V與碘化丙錠（propidium iodide)染色以測定活細胞數（Annexin V/PI陰性），或 用PE-拼合胞轉蛋白D2染著以偵檢循環的細胞。結果表 出併行檢驗的4批mab20H4.9-IgG4之平均値（±SD)。 -37- 1020 1332844 cagtagacac gtccaagaac cagttctccc tgaagctgag ctctgtgacc gccgcggaca cggctgtata ttactgtgcg agggactatg gtccggggaa ttatgactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg gtcactgtct cctcagctag caccaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccacct tgcccacctt gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaatgat ctagagggcc ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccgggc ctctcaaaaa agggaaaaaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 -2- ggaggcctag gcttttgcaa aaagcttgga cagctcaggg ctgcgatttc gcgccaaact 2820 tgacggcaat cctagcgtga aggctggtag gattttatcc ccgctgccat catggttcga 2880 ccattgaact gcatcgtcgc cgtgtcccaa aatatgggga ttggcaagaa cggagaccta 2940 ccctggcctc cgctcaggaa cgagttcaag tacttccaaa gaatgaccac aacctcttca 3000 gtggaaggta aacagaatct ggtgattatg ggtaggaaaa cctggttctc cattcctgag 3060 aagaatcgac ctttaaagga cagaattaat atagttctca gtagagaact caaagaacca 3120 ccacgaggag ctcattttct tgccaaaagt ttggatgatg ccttaagact tattgaacaa 3180 ccggaattgg caagtaaagt agacatggtt tggatagtcg gaggcagttc tgtttaccag 3240 gaagccatga atcaaccagg ccaccttaga ctctttgtga caaggatcat gcaggaattt 3300 gaaagtgaca cgtttttccc agaaattgat ttggggaaat ataaacttct cccagaatac 3360 ccaggcgtcc tctctgaggt ccaggaggaa aaaggcatca agtataagtt tgaagtctac 3420 gagaagaaag actaacagga agatgctttc aagttctctg ctcccctcct aaagctatgc 3480 atttttataa gaccatggga cttttgctgg ctttagatct ctttgtgaag gaaccttact 3540 tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata 3600 taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga 3660 ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc 3720 tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg 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<212> DNA <213>人造物 <220> < 2 2 3 >人造序列 <400> 2 gctacatgcc cggtctatat gcgcaactgt aactaataac tgatcaataa ttatcattag ttaatgcccc agtaatcaag tatcgggtat atacctcaag gcgcaatgta ttgaatgcca tttaccgggc ggaccgactg gcgggttgct g999gcgggt aactgcagtt attactgcat acaagggtat cattgcggtt atccctgaaa ggtaactgca gttacccacc tgataaatgc catttgacgg gtgaaccgtc atgtagttca catagtatac ggttcatgcg ggggataact gcagttactg ccatttaccg ggcggaccgt aatacgggtc atgtactgga ataccctgaa aggatgaacc gtcatgtaga tgcataatca gtagcgataa tggtaccact acgccaaaac cgtcatgtag ttacccgcac ctatcgccaa actgagtgcc cctaaaggtt cagaggtggg gtaactgcag ttaccctcaa acaaaaccgt ggttttagtt gccctgaaag gttttacagc attgttgagg cggggtaact gcgtttaccc gccatccgca catgccaccc tccagatata ttcgtctcga gagaccgatt gatctcttgg gtgacgaatg accgaatagc tttaattatg 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7057 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 1332844 ctgagtgata tccctctggg aggaccaccg tcgagggtct ctgacaactt cggaagcctc caccaatgat gacctcgacc tttagttagt accacctatg gtcatctgtg caggttcttg gccgacatat aatgacacgc agaccccggc accgtgggac agggggaccg cgggacgagg agttcctgat gaaggggctt cgcacgtgtg gaagggccga actggcacgg gaggtcgtcg ggtcgttgtg gttccacctg cgggtcgtgg actcaaggac tgtgagagta ctagagggcc ttctggggct ccaggtcaag gtttcggcgc cctcctcgtc acgtggtcct gaccgacttg gcaggaggta gctcttttgg tgtgggacgg gggtagggtc agtttccgaa gatggggtcg tgttgatgtt ctggtgcgga ccgattggca cctgttctcg tactccgaga cgtgttggtg gatctcccgg gataagatat cacggaagat caacggtcgg cttccacggt gagggtgaca tcatccacag taagataaga cttctgttat cgtccgtacg tggtcgaccc cgagetcccc ttcgaaccat ggcggtactt acccaggaca gggtccacgt tgggacaggg agtggacgcg tatgcggtca ggggtctctt cagtggatgt taggcaggga gtcaagaggg acttcgactc tccctgatac caggcccctt cagtgacaga ggagtcgatc tcctcgtgga ggctctcgtg ggccactgcc acagcacctt caggatgtca ggagtcctga aacccgtgct tctggatgtg ttctctcaac tcaggtttat ccccctggta gtcagaagga tggggactcc agtgcacgca ttgaccatgc acctaccgca aagttgtcgt gcatggcaca ccgttcctca tgttcacgtt tagaggtttc ggtttcccgt ctcctctact ggttcttggt ctgtagcggc acctcaccct gggcacgacc tgaggctgcc tccaccgtcc tccccttaca atgtgtgtct tctcggagag cacagtggat ttacgatctc tagacaacaa acggggaggg ggaaaggatt attttactcc ccccccaccc caccccgtcc acccctacgc cacccgagat cetaggggtg cgcgggacat tgtggacacc aagaaggagg tgatgtcgtc accccgcgtc acagatacca cccaggaagt ccccgacctc acctaacccc gctctcagct cagtggtata gagacactgg cggcgcctgt aatactgacc atgaagctag gtggttcccg ggtaggcaga tcggcgggac ccgacggacc gagtccgcgg gactggtcgc gatgagggag tcgtcgcacc gacgttgcat ctagtgttcg accaggtgga acgggtggaa caaggggggt tttgggttcc ccaccacctg cactcggtcc cctccacgta ttacggttct ccagtcgcag gagtggcagg ccagaggttg tttccggagg cggggctctc ggtgtccaca ccagtcggac tggacggacc ctcgttaccc gtcggcctct gaggaagaag gagatgtcgt gaagagtacg aggcactacg ggacagagac ccatttacta gagcgactag tcggagctga ggcacggaag gaactgggac tttaacgtag cgtaacagac tgtcgttccc cctcctaacc accgaagact ccgcctttct cgccgcgtaa ttcgcgccgc 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 -6- 1332844 ccacaccacc aatgcgcgtc gcactggcga tgtgaacggt cgcgggatcg cgggcgagga 2520 aagcgaaaga agggaaggaa agagcggtgc aagcggcccg gagagttttt tccctttttt 2580 tcgtacgtag agttaatcag tcgttggtat cagggcgggg attgaggcgg gtagggcggg 2640 gattgaggcg ggtcaaggcg ggtaagaggc ggggtaccga ctgattaaaa aaaataaata 2700 cgtctccggc tccggcggag ccggagactc gataaggtct tcatcactcc tccgaaaaaa 2760 cctccggatc cgaaaacgtt tttcgaacct gtcgagtccc gacgctaaag cgcggtttga 2820 actgccgtta ggatcgcact tccgaccatc ctaaaatagg ggcgacggta gtaccaagct 2880 ggtaacttga cgtagcagcg gcacagggtt ttatacccct aaccgttctt gcctctggat 2940 gggaccggag gcgagtcctt gctcaagttc atgaaggttt cttactggtg ttggagaagt 3000 caccttccat ttgtcttaga ccactaatac ccatcctttt ggaccaagag gtaaggactc 3060 ttcttagctg gaaatttcct gtcttaatta tatcaagagt catctcttga gtttcttggt 3120 ggtgctcctc gagtaaaaga acggttttca aacctactac ggaattctga ataacttgtt 3180 ggccttaacc gttcatttca tctgtaccaa acctatcagc ctccgtcaag acaaatggtc 3240 cttcggtact tagttggtcc ggtggaatct gagaaacact gttcctagta cgtccttaaa 3300 ctttcactgt gcaaaaaggg tctttaacta aaccccttta tatttgaaga gggtcttatg 3360 ggtccgcagg agagactcca ggtcctcctt tttccgtagt tcatattcaa acttcagatg 3420 ctcttctttc tgattgtcct tctacgaaag ttcaagagac gaggggagga tttcgatacg 3480 taaaaatatt ctggtaccct gaaaacgacc gaaatctaga gaaacacttc cttggaatga 3540 agacaccaca ctgtattaac ctgtttgatg gatgtctcta aatttcgaga ttccatttat 3 600 attttaaaaa ttcacatatt acacaatttg atgactaaga ttaacaaaca cataaaatct 3660 aaggttggat accttgacta cttaccctcg tcaccacctt acggaaatta ctccttttgg 3720 acaaaacgag tcttctttac ggtagatcac tactactccg atgacgactg agagttgtaa 3780 gatgaggagg ttttttcttc tctttccatc ttctggggtt cctgaaagga agtcttaacg 3840 attcaaaaaa ctcagtacga cacaaatcat tatcttgaga acgaacgaaa cgataaatgt 3900 ggtgtttcct ttttcgacgt gacgatatgt tcttttaata cctttttata agacattgga 3960 aatattcatc cgtattgtca stattagtat tgtatgacaa aaaagaatga ggtgtgtccg 4020 tatctcacag acgataatta ttgatacgag tttttaacac atggaaatcg aaaaattaaa 4080 catttcccca attattcctt ataaactaca tatcacggaa ctgatctcta gtattagtcg 4140 gtatggtgta aacatctcca aaatgaacga aattttttgg agggtgtgga gggggacttg 4200 1332844 gactttgtat tttacttacg ttaacaacaa caattgaaca aataacgtcg aatattacca atgtttattt cgttatcgta gtgtttaaag tgtttatttc gtaaaaaaag tgacgtaaga tcaacaccaa acaggtttga gtagttacat agaatagtac agacctagcc gacctactag gaggtcgcgc ccctagagta cgacctcaag aagcgggtgg ggttgaacaa ataacgtcga atattaccaa tgtttatttc gttatcgtag tgtttaaagt gtttatttcg taaaaaaagt gacgtaagat caacaccaaa caggtttgag tagttacata gaatagtaca gacatatggc agctggagat cgatctcgaa ccgcattagt accagtatcg acaaaggaca cactttaaca ataggcgagt gttaaggtgt gttgtatgct cggccttcgt atttcacatt tcggacccca cggattactc actcgattga gtgtaattaa cgcaacgcga gtgacgggcg aaaggtcagc cctttggaca gcacggtcga cgtaattact tagccggttg cgcgcccctc tccgccaaac gcataacccg cgagaaggcg aaggagcgag tgactgagcg acgcgagcca gcaagccgac gccgctcgcc * atagtcgagt gagtttccgc cattatgcca ataggtgtct tagtccccta ttgcgtcctt tcttgtacac tcgttttccg gtcgttttcc ggtccttggc atttttccgg cgcaacgacc gcaaaaaggt atccgaggcg gggggactgc tcgtagtgtt tttagctgcg agttcagtct ccaccgcttt gggctgtcct gatatttcta tggtccgcaa agggggacct tcgagggagc acgcgagagg acaaggctgg gacggcgaat ggcctatgga caggcggaaa 9agggaagcc cttcgcaccg cgaaagagtt acgagtgcga catccataga gtcaagccac atccagcaag cgaggttcga cccgacacac gtgcttgggg ggcaagtcgg gctggcgacg cggaataggc cattgatagc agaactcagg ttgggccatt ctgtgctgaa tagcggtgac cgtcgtcggt gaccattgtc ctaatcgtct cgctccatac atccgccacg atgtctcaag aacttcacca ccggattgat gccgatgtga tcttcctgtc ataaaccata gacgcgagac gacttcggtc aatggaag.cc tttttctcaa ccatcgagaa ctaggccgtt tgtttggtgg cgaccatcgc caccaaaaaa acaaacgttc gtcgtctaat gcgcgtcttt ttttcctaga gttcttctag gaaactagaa aagatgcccc agactgcgag tcaccttgct tttgagtgca attccctaaa accagtactc taatagtttt tcctagaagt ggatctagga aaatttaatt tttacttcaa aatttagtta gatttcatat atactcattt gaaccagact gtcaatggtt acgaattagt cactccgtgg atagagtcgc tagacagata aagcaagtag gtatcaacgg actgaggggc agcacatcta ttgatgctat gccctcccga atggtagacc ggggtcacga cgttactatg gcgctctggg tgcgagtggc 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ggaaaaaaaa taggggatac acgagggacg gttccgttcc acgaagc tatcaaacgc cataccgaag acacgttttt gtcacaatag attctacgaa ccgctggctc gaaattttca gcgacaactc aatgaaagtg cttattcccg cgtaaatagt ttgtttatcc ctctagacga attaaaataa cagctgagag aacacacaac gaactggctg gttgcaacaa taagtcgagg tcgccaatcg tgagtaccaa aagacactga aacgagaacg cgagtagtaa taggtcaagc gtcgcaaaga ctgtgccttt cccaataaca ccaaggcgcg tccactggac aataaaataa tcatgttaga ctccagcgac ttaacgtact 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7057 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 3

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 15

Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 80

Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 . 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 225 230 235 240

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin 275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335

Lys Glu Tvr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie 340 345 350

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460

Leu Gly Lys 465 <210> 4 <211> 6435

<212> DNA <213>人造物 <220> <223 >人造序列 <400> 4 1332844 gacggatcgg gagatctgct agcccgggtg acctgaggcg cgccggcttc gaatagccag 60 agtaaccttt ttttttaatt ttattttatt ttatttttga gatggagttt ggcgccgatc 120 tcccgatccc ctatggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 180 gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 240 tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 300 tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta 360 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 420 ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 480 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 540 ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 600 gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 660 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 720 gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 780 aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 840 tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 900 ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 960 cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagcttat caacaagttt gtacaaaaaa 1020 gcaggctggt accatggaag ccccagctca gcttctcttc ctcctgctac tctggctccc 1080 agataccacc ggagaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg 1140 ggaaagagcc accctctcct gcagggccag tcagagtgtt agcagctact tagcctggta 1200 ccaacagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca acagggccac 1260 tggcatccca gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag 1320 cagcctagag cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtagca actggcctcc 1380 ggcgctcact ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc 1440 tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg 1500 cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct 1560 ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag 1620 cctcagcagc accctgacgc tQagcaaagc 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cgatttcgcg ccaaacttga cggcaatcct agcgtgaagg 2520 ctggtaggat tttatccccg ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt 2580 gtcccaaaat atggggattg gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga 2640 gttcaagtac ttccaaagaa tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt 2700 gattatgggt aggaaaacct ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag 2760 aattaatata gttctcagta gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc 2820 caaaagtttg gatgatgcct taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga 2880 catggtttgg atagtcggag gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca 2940 cctcagactc tttgtgacaa ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga 3000 aattgatttg gggaaatata aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca 3060 ggaggaaaaa ggcatcaagt ataagtttga agtctacgag aagaaagact aacaggaaga 3120 tgctttcaag ttctctgctc ccctcctaaa gctatgcatt tttataagac catgggactt 3180 ttgctggctt tagatctgat ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg 3240 gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa 3300 tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat 3360 gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg 3420 ccatctagtg atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag 3480 agaaaggtag aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct 3540 -13 - 1332844 gtgtttagta atagaactct tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca 3600 ctgctataca agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct ttataagtag gcataacagt 3660 tataatcata acatactgtt ttttcttact ccacacaggc atagagtgtc tgctattaat 3720 aactatgctc aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt gtaaaggggt taataaggaa 3780 tatttgatgt atagtgcctt gactagagat cgatcataat cagccatacc acatttgtag 3840 aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 3900 atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 3960 gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 4020 aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcggctggat gatcctccag cgcggggatc 4080 tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 4140 aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 4200 gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 4260 gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 4320 cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 4380 aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 4440 agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 4500 ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 4560 ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 4620 tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 4680 tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 4740 gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 4800 ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg . 4860 tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 4920 agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4980 atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 5040 acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 5100 actacggcta cactagaagg aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 5160 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 5220 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 5280 arcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 5340 -14- 1332844 atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 5400 tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 5460 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 5520 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 5580 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 5640 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 5700 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 5760 atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 5820 aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 5880 atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 5940 aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 6000 aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 6060 gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 6120 gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 6180 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 6240 ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 6300 ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 6360 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 6420 gtgccacctg acgtc 6435 <210> 5 <211> 6435 <212> DNA <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 5 ctgcctagcc ctctagacga tcgggcccac tggactccgc gcggccgaag cttatcggtc 60 tcattggaaa aaaaaattaa aataaaataa aataaaaact ctacctcaaa ccgcggctag 120 agggctaggg gataccagct gagaatcatg ttagacgaga ctacggcgta tcaattcggt 180 catagacgag ggacgaacac acaacctcca gcgactcatc acgcgctcgt tttaaattcg 240 atgttgttcc gttccgaact ggctgttaac gtacttctta gacgaatccc aatccgcaaa 300 -15- 1332844 acgcgacgaa gcgctacatg cccggtctat atgcgcaact gtaactaata actgatcaat 360 aattatcatt agttaatgcc ccagtaatca agtatcgggt atatacctca aggcgcaatg 420 tattgaatgc catttaccgg gcggaccgac tggcgggttg ctgggggcgg gtaactgcag 480 ttattactgc atacaagggt atcattgcgg ttatccctga aaggtaactg cagttaccca 540 cctcataaat gccatttgac gggtgaaccg tcatgtagtt cacatagtat acggttcatg 600 cgggggataa ctgcagttac tgccatttac cgggcggacc gtaatacggg tcatgtactg 660 gaataccctg aaaggatgaa ccgtcatgta gatgcataat cagtagcgat aatggtacca 720 ctacgccaaa accgtcatgt agttacccgc acctatcgcc aaactgagtg cccctaaagg 780 ttcagaggtg gggtaactgc agttaccctc aaacaaaacc gtggttttag ttgccctgaa 840 aggttttaca gcattgttga ggcggggtaa ctgcgtttac ccgccatccg cacatgccac 900 cctccagata tattcgtctc gagagaccga ttgatctctt gggtgacgaa tgaccgaata 960 gctttaatta tgctgagtga tatccctctg ggttcgaata gttgttcaaa catgtttttt 1020 cgtccgacca tggtaccttc ggggtcgagt cgaagagaag gaggacgatg agaccgaggg 1080 tctatggtgg cctctttaac acaactgtgt cagaggtcgg tgggacagaa acagaggtcc 1140 cctttctcgg tgggagagga cgtcccggtc agtctcacaa tcgtcgatga atcggaccat 1200 ggttgtcttt ggaccggtcc gagggtccga ggagtagata ctacgtaggt tgtcccggtg 1260 accgtagggt cggtccaagt caccgtcacc cagaccctgt ctgaagtgag agtggtagtc 1320 gtcggatctc ggacttctaa aacgtcaaat aatgacagtc gtcgcatcgt tgaccggagg 1380 ccgcgagtga aagccgcctc cctggttcca cctctagttt gcatgccacc gacgtggtag 1440 acagaagtag aagggcggta gactactcgt caactttaga ccttgacgga gacaacacac 1500 ggacgactta ttgaagatag ggtctctccg gtttcatgtc accttccacc tattgcggga 1560 ggttagccca ttgagggtcc tctcacagtg tctcgtcctg tcgttcctgt cgtggatgtc 1620 ggagtcgtcg tgggactgcg actcgtttcg tctgatgctc tttgtgtttc agatgcggac 1680 gcttcagtgg gtagtcccgg actcgagcgg gcagtgtttc tcgaagttgt cccctctcac 1740 aatctgggtc gaaagaacat gtttcaccaa ctagatctcc cgggataaga tatcacagtg 1800 gatttacaat ctcgagcgac tagtcggagc cgacacggaa gatcaacggt cggtagacaa 1860 caaacgggga gggggcacag aaggaactgg gaccttccac ggtgagggtg acaggaaagg 1920 attattttac tcctttaacg tagcgtaaca gactcatcca cagtaagata agacccccca 1980 ccccaccccg tcctgtcgtt ccccctccta acccttctgt tatcgtccgt acgaccccta 2040 cgccacccga gataccgaag actccgcctt tcttggtcga ccccgagatc ccccataggg 2100 -16- 1332844 gtgcgcggga catcgccgcg taattcgcgc cgcccacacc accaatgcgc gtcgcactgg 2160 cgatgtgaac ggtcgcggga tcgcgggcga ggaaagcgaa agaagggaag gaaagagcgg 2220 tgcaagcggc ccggagagtt ttttcccttt ttttcgtacg tagagttaat cagtcgttgg 2280 tatcagggcg gggattgagg cgggtagggc ggggattgag gcgggtcaag gcgggtaaga 2340 ggcggggtac cgactgatta aaaaaaataa atacgtctcc ggctccggcg gagccggaga 2400 ctcgataagg tcttcatcac tcctccgaaa aaacctccgg atccgaaaac gtttttcgaa 2460 cccccctgtc gagtcccgac gctaaagcgc ggtttgaact gccgttagga tcgcacttcc 2520 gaccatccta aaataggggc gacggtagta ccaagctggt aacttgacgt agcagcggca 2580 cagggtttta tacccctaac cgttcttgcc tctggatggg accggaggcg agtccttgct 2640 caagttcatg aaggtttctt actggtgttg gagaagtcac cttccatttg tcttagacca 2700 ctaataccca tccttttgga ccaagaggta aggactcttc ttagctggaa atttcctgtc 2760 ttaattatat caagagtcat ctcttgagtt tcttggtggt gctcctcgag taaaagaacg 2820 gttttcaaac ctactacgga attctgaata acttgttggc cttaaccgtt catttcatct 2880 gtaccaaacc tatcagcctc cgtcaagaca aatggtcctt cggtacttag ttggtccggt 2940 ggagtctgag aaacactgtt cctagtacgt ccttaaactt tcactgtgca aaaagggtct 3000 ttaactaaac ccctttatat ttgaagaggg tcttatgggt ccgcaggaga gactccaggt 3060 cctccttttt ccgtagttca tattcaaact tcagatgctc ttctttctga ttgtccttct 3120 acgaaagttc aagagacgag gggaggattt cgatacgtaa aaatattctg gtaccctgaa 3180 aacgaccgaa atctagacta gaaacacttc cttggaatga agacaccaca ctgtattaac 3240 ctgtttgatg gatgtctcta aatttcgaga ttccatttat attttaaaaa ttcacatatt 3300 acacaatttg atgactaaga ttaacaaaca cataaaatct aaggttggat accttgacta 3360 cttaccctcg tcaccacctt acggaaatta ctccttttgg acaaaacgag tcttctttac 3420 ggtagatcac tactactccg atgacgactg agagttgtaa gatgaggagg ttttttcttc 3480 tctttccatc ttctggggtt cctgaaagga agtcttaacg attcaaaaaa ctcagtacga 3540 cacaaatcat tatcttgaga acgaacgaaa cgataaatgt ggtgtttcct ttttcgacgt 3600 gacgatatgt tcttttaata cctttttata agacattgga aatattcatc cgtattgtca 3660 atattagtat tgtatgacaa aaaagaatga ggtgtgtccg tatctcacag acgataatta 3720 ttgatacgag tttttaacec atggaaatcg aaaaattaaa catttcccca attattcctt 3780 ataaactaca tatcacggaa ctgatctcta gctagtatta gtcggtatgg tgtaaacatc 3840 -17- 1332844 tccaaaatga acgaaatttt ttggagggtg tggaggggga cttggacttt gtattttact 3900 tacgttaaca acaacaattg aacaaataac gtcgaatatt accaatgttt atttcgttat 3960 cgtagtgttt aaagtgttta tttcgtaaaa aaagtgacgt aagatcaaca ccaaacaggt 4020 ttgagtagtt acatagaata gtacagacct agccgaccta ctaggaggtc gcgcccctag 4080 agtacgacct caagaagcgg gtggggttga acaaataacg tcgaatatta ccaatgttta 4140 tttcgttatc gtagtgttta aagtgtttat ttcgtaaaaa aagtgacgta agatcaacac 4200 caaacaggtt tgagtagtta catagaatag tacagacata tggcagctgg agatcgatct 4260 cgaaccgcat tagtaccagt atcgacaaag gacacacttt aacaataggc gagtgttaag 4320 gtgtgttgta tgctcggcct tcgtatttca catttcggac cccacggatt actcactcga 4380 ttgagtgtaa ttaacgcaac gcgagtgacg ggcgaaaggt cagccctttg gacagcacgg 4440 tcgacgtaat tacttagccg gttgcgcgcc cctctccgcc aaacgcataa cccgcgagaa 4500 ggcgaaggag cgagtgactg agcgacgcga gccagcaagc cgacgccgct cgccatagtc 4560 gagtgagttt ccgccattat gccaataggt gtcttagtcc cctattgcgt cctttcttgt 4620 acactegttt tccggtcgtt ttccggtcct tggcattttt ccggcgcaac gaccgcaaaa 4680 aggtatccga ggcgggggga ctgctcgtag tgtttttagc tgcgagttca gtctccaccg 4740 ctttgggctg tcctgatatt tctatggtcc gcaaaggggg accttcgagg gagcacgcga 4800 gaggacaagg ctgggacggc gaatggccta tggacaggcg gaaagaggga agcccttcgc 4860 accgcgaaag agtatcgagt gcgacatcca tagagtcaag ccacatccag caagcgaggt 4920 tcgacccgac acacgtgctt ggggggcaag tcgggctggc gacgcggaat aggccattga 49S0 tagcagaact caggttgggc cattctgtgc tgaatagcgg tgaccgtcgt cggtgaccat 5040 tgtcctaatc gtctcgctcc atacatccgc cacgatgtct caagaacttc accaccggat 5100 tgatgccgat gtgatcttcc ttgtcataaa ccatagacgc gagacgactt cggtcaatgg 5160 aagccttttt ctcaaccatc gagaactagg ccgtttgttt ggtggcgacc atcgccacca 5220 aaaaaacaaa cgttcgtcgt ctaatgcgcg tctttttttc ctagagttct tctaggaaac 5280 tagaaaagat gccccagact gcgagtcacc ttgcttttga gtgcaattcc ctaaaaccag 5340 tactctaata gtttttccta gaagtggatc taggaaaatt taatttttac ttcaaaattt 5400 agttagattt catatatact catttgaacc agactgtcaa tggttacgaa ttagtcactc 5460 c9tggataga gtcgctagac agataaagca agtaggtatc aacggactga ggggcagcac 5520 atctattgat gctatgccct cccgaatggt agaccggggt cacgacgtta ctatggcgct 5580 ctgggtgcga gtggccgagg tctaaatagt cgttatttgg tcggtcggcc ttcccggctc 5640 -18- 1332844 gcgtcttcac cgatctcatt tagcaccaca tccgctcaat tagcaacagt ttaagagaat ttcagtaaga ctattatggc cccgcttttg cgtgggttga ccttccgttt gagaaggaaa tataaactta cacggtggac caggacgttg catcaagcgg gtgcgagcag gtactagggg cttcattcaa gacagtacgg ctcttatcac gcggtgtatc agagttccta ctagaagtcg tacggcgttt aagttataat cataaatctt tgcag aaataggcgg tcaattatca caaaccatac gtacaacacg ccggcgtcac taggcattct atacgccgct gtcttgaaat gaatggcgac tagaaaatga tttcccttat aacttcgtaa tttatttgtt aggtaggtca aacgcgttgc cgaagtaagt ttttttcgcc aatagtgagt acgaaaagac ggctcaacga tttcacgagt aactctaggt aagtggtcgc tcccgctgtg atagtcccaa tatccccaag gataattaac aacaacggta c9a99ccaag aatcgaggaa accaataccg actgaccact gaacgggccg agtaaccttt caagctacat aaagacccac cctttacaac taacagagta gcgcgtgtaa aacggccctt acgatgtccg ggttgctagt gccaggaggc tcgtgacgta catgagttgg cagttatgcc tgcaagaagc tgggtgagca tcgtttttgt ttatgagtat ctcgcctatg aggggctttt 5700 57 60 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6435 <210> 6 <211> 236

<212> PRT <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 6

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu 20 lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr

Leu Ser 25 30

Ser Gin Ser

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala 65 70 75 80 -19- 1332844

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205

Qlu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 7 <211> 550 <212> DNA <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 7 gaattcgccc ttctaatacg actcactata gggcaagcag tggtatcaac gcagagtacg 60 cgggggtgct ttctgagagt catggacctc ctgcacaaga acatgaaaca cctgtggttc 120 ttcctcctcc tggtggcagc tcccagatgg gtcctgtccc aggtgcaact acagcagtgg 180 ggcgcaggac tgttgaagcc ttcggagacc ctgtccctca cctgcgctgt ctatggtggg 240 tccttcagtg gttactactg gagctggata cgccagtccc cagagaaggg gctggagtgg 300 -20- 1332844 attggggaaa accatatcag gcggacacgg ttcgatctct tcggtcttcc tcaatcatgg tagacacgtc ctgtatatta ggggccgtgg tggatacgtc caagaaccag ctgtgcgagg caccctggtc acctacaatc ttctccctga gactatggtc actgtctcct cgtccctcga agctgagctc cggggaatta cagcctccac gagtcgagtc tgtgaccgcc tgactggtac caagggccca 360 420 480 540 550 <210> 8 <211> 550 <212> DNA <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 8 cttaagcggg aagattatgc tgagtgatat cccgttcgtc accatagttg cgtctcatgc gcccccacga aagactctca gtacctggag gacgtgttct tgtactttgt ggacaccaag aaggaggagg accaccgtcg agggtctacc caggacaggg tccacgttga tgtcgtcacc ccgcgtcctg acaacttcgg aagcctctgg gacagggagt ggacgcgaca gataccaccc aggaagtcac caatgatgac ctcgacctat gcggtcaggg gtctcttccc cgacctcacc taaccccttt agttagtacc acctatgcag tggatgttag gcagggagct ctcagctcag tggtatagtc atctgtgcag gttcttggtc aagagggact tcgactcgag acactggcgg cgcctgtgcc gacatataat gacacgctcc ctgataccag gccccttaat actgaccatg aagctagaga ccccggcacc gtgggaccag tgacagagga gtcggaggtg gttcccgggt agccagaagg <210> 9 <2ia> 149 <212> PRT <213> 人造物 <220> <223> 人造序列 <400> 9

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 15

Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 60 120 180 240 300 360 420 480 540 550 -2\ * 1332844

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45

Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 80

Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin 35 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 115 120 125

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe 145 <210> 10 <211> 736 <212> DNA <213>人造物 <220> c223>人造序列 <400> 10 ggaactgctc agttaggacc cagagggaac catggaagcc ccagctcagc ttctcttcct 60 cctgctactc tggctcccag ataccaccgg agaaattgtg ttgacacagt ctccagccac 120 cctgtctttg tctccagggg aaagagccac cctctcctgc agggccagtc agagtgttag 180 cagctactta gcctggtacc aacagaaacc tggccaggct cccaggctcc tcatctatga 240 tgcatccaac agggccactg gcatcccagc caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga 300 cttcactctc accatcagca gcctagagcc tgaagatttt gcagtttatt actgtcagca . 360 gcgtagcaac tggcctccgg cgctcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaacg 420 aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg 480 aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg 540 -22- 1332844 gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 600 caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 660 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag 720 cttcaacagg ggaagg 736 <210> 11 <211> 736 <212> DNA <213>人造物 <220> <223>人造序列 <400> 11 ccttgacgag tcaatcctgg gtctcccttg gtaccttcgg ggtcgagtcg aagagaagga 60 ggacgatgag accgagggtc tatggtggcc tctttaacac aactgtgtca gaggtcggtg 120 ggacagaaac agaggtcccc tttctcggtg ggagaggacg tcccggtcag tctcacaatc 180 gtcgatgaat cggaccatgg ttgtctttgg accggtccga gggtccgagg agtagatact 240 acgtaggttg tcccggtgac cgtagggtcg gtccaagtca ccgtcaccca gaccctgtct 300 gaagtgagag tggtagtcgt cggatctcgg acttctaaaa cgtcaaataa tgacagtcgt 360 cgcatcgttg accggaggcc gcgagtgaaa gccgcctccc tggttccacc tctagtttgc 420 ttgacaccga cgtggtagac agaagtagaa gggcggtaga ctactcgtca actttagacc 480 ttgacggaga caacacacgg acgacttatt gaagataggg tctctccggt ttcatgtcac 540 cttccaccta ttgcgggagg ttagcccatt gagggtcctc tcacagtgtc tcgtcctgtc 600 gttcctgtcg tggatgtcgg agtcgtcgtg ggactgcgac tcgtttcgtc tgatgctctt 660 tgtgtttcag atgcggacgc ttcagtgggt agtcccggac tcgagcgggc agtgtttctc 720 gaagttgtcc ccttcc 736 <210> 12 <211> 235 <212> PRT <213>人造物 <220> d23>人造序列 <400> 12 Met Glu Ala 1 Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu 5 10 Leu Leu Trp Leu Pro 15 •23 · 1332844

Asp Thr Thr Gly Glu He Val . Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin.Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60

Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 B0

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 9.0 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gl-π Arg Ser 100 105 110

Asn Trp Pro.. Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 115- 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140

Glu Gin Leu 145

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Le\i 165 170 175

Gin Ser Gly Asn Ser <51n Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 1S5 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Arg 225 230 235 24·

Claims (1)

1332844 十、申請專利範圍 附件3A : 第93 1 30653號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 年月日修(更)正替換頁 1. 一種特異性結合4-1 BB之單株抗體或其抗原結合部 份，其包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中： 該輕鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1 具有SEQ ID NO: 6之胺基酸44至54，該CDR2具有 SEQ ID NO: 6之胺基酸70至76且該CRD3具有SEQ ID NO: 6之胺基酸109至119;且 該重鏈可變區包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1 具有SEQ ID NO: 3之胺基酸50至54，該CDR2具有 SEQ ID NO: 3之胺基酸69至84且該CDR3具有SEQ ID NO: 3之胺基酸117至129。 2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結合部 份，其中： 該輕鏈包含具有SEQ ID NO: 6之胺基酸21至129的 可變區；且 該重鏈包含具有SEQ ID NO: 3之胺基酸20至140的 可變區。 3. —種包含輕鏈和重鏈之單株抗體，其中該輕鏈包含 SEQ ID NO: 6之胺基酸殘基21至236;且該重鏈包含 SEQ ID NO: 3之胺基酸殘基20至467。 Γ C Λ 1332844 4.一種藥學組成物，其包含： 如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結合部份 ;及藥學上可接受之載劑。 5 .—種藥學組成物，其包含： 如申請專利範圍第3項之單株抗體；及 ' 藥學上可接受之載劑。 -* 6 · —種如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結 # 合部份於製造供治療癌症之藥物上之用途。 7. —種單離之聚核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍 第3項之單株抗體或其抗原結合部份的重鏈的胺基酸序列 之核苷酸序列。 8. 如申請專利範圍第7項之聚核苷酸，其包含SEQ ID NO : 1之核苷酸序列。 9. 一種單離之聚核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍 第3項之單株抗體或其抗原結合部份的輕鏈的胺基酸序列 # 之核脊酸序列。 1 〇 .如申請專利範圍第 ID NO : 4之核苷酸序歹IJ。 項之聚核苷酸’其包含SEQ