TWI329739B - - Google Patents

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Γ329739 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種微生物之染色劑，更詳言之，係 關於一種可以用比習知方法更短的時間對細菌、真菌等微生 物進行染色之染色劑及利用其之微生物檢驗方法。 【先前技術】 習知之細菌、真菌等微生物之檢驗，係使用：對試料 進行前處理之後進行鏡檢之直接鏡檢法、或是在培養試料 中之微生物後進行檢查之培養檢查法。特別是在醫療現 場，因為比較方便，所以直接鏡檢法常被使用。 此直接鏡檢法之前處理，已知有苛性驗法、添加二甲 亞砜（DMSO)之苛性鹼法、及帕克墨水-苛性鹼法（"Jpn. J, Med. Mycol."、1 995、Vol.36、p.6 卜86 ;山口 英世等，日 本醫真菌學會標準化委員會報告）。 其中，苛性鹼法及添加二甲亞颯之苛性鹼法，因為未 對細菌染色，而存在有不容易檢驗出皮屑芽胞菌 (M a 1 a s s e z i a )，以及檢驗時必須熟練顯微鏡下之測定等問題 點。另一方面，帕克墨水-苛性鹼法，雖然可以對細菌染色， 但是有著至染色為止須花費數小時至一個晚上之問題點存 在。而且，此方法也有著能使用於染色之墨水的種類受到 限制、以及因為墨水本身並非單一成分所以墨水之處方變 更等會造成細菌染色性產生變化之問題點存在。 因而，本發明之課題，係提供一種染色劑及利用此染 3 1329739 色劑之微生物染色、檢驗方法，該染色劑能夠消除習知直接 鏡檢法中之前處理問題點，並能夠在更短的時間對微生物染 色。 【發明内容】 本發明者等鑑於此情形，為了解決上述課題而專心研 究，結果發現藉由使用含有鹼物質和特定之染料作為用於 微生物染色之染色劑時，可以在短時間對微生物進行染 色、檢驗，而完成本發明。 亦即，本發明係提供一種微生物染色劑，其特徵在於 含有：鹼物質；及重氮系染料或是二笨并哌喃系染料。 又，本發明係提供一種微生物檢驗方法，其特徵在於： 將上述染色劑添加於含有微生物之試料而將微生物染色， 接著檢驗被染色之微生物。 【實施方式】 本發明微生物染色劑（以下稱為「本發明染色劑」）， 係含有鹼物質和重氮系染料或是二笨并哌喃系染料。 本發明染色劑所使用之鹼物質中，無機系鹼可以舉 出：氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋇、碳酸鉀、碳酸鈉、 碳酸銨、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、 氨等，有機系鹼可以舉出：曱胺、乙胺、異丙胺等烷基胺 類；甲醇胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、異丙醇胺、 二異丙醇胺等烷醇胺類。此等鹼物質中，可舉出較佳者為 4 Γ329739 氫氧化鈉及氫氧化鉀，特佳者為氫氧化鉀。又，本發明染 色劑中的鹼物質之調配量為 1 0〜40 質量％(以下，僅稱 「％」），以1 5〜3 0%為佳。 另一方面，本發明染色劑所使用之染料，其中作為重 氮系染料，以芝加哥天藍6B、伊凡氏藍、直接藍15、錐 蟲藍、苯紅紫4B、剛果紅等為佳，以芝加哥天藍6B為特 佳。在本發明染色劑中的重氮系染料之調配量為 0.0 1〜2 %，以0 · 1〜1 %為佳。 又，本發明染色劑所使用之染料，其中二笨并哌喃系 染料，以若丹明B、若丹明B基、若丹明123水合物、若 丹明6G、若丹明110、若丹明575等為佳，以若丹明B為 特佳。本發明染色劑中的二苯并哌喃系染料之調配量為 0.001〜1%，以 0.005〜0.5%為佳。 本發明染色劑，依照必要，除了上述成分之外可以調 配甲醇及/或二曱亞砜。本發明染色劑中的曱醇調配量，以 0〜30%為佳，以0~20%為特佳。又，二甲亞硬調配量，以 0~20%為佳，以0~10%為特佳。 上述甲醇及/或二甲亞砜之調配，雖會抑制對細胞之染 色性，但是因為對微生物之染色性不會有所影響，所以可 以使本發明染色劑對微生物之染色清楚，使微生物之檢驗 更為容易。又，重氮系染料或是二苯并哌喃系染料之中例 如若丹明B之類對鹼溶液溶解性低之物，從提升其溶解性 這點來考慮，則亦以調配有此等為佳。 本發明染色劑之調製，係將上述鹼物質溶解在水中調 5 1329739 製成鹼溶液，接著在此溶液中添加重氮系染料或是二 哌喃系染料，並依照必要而添加曱醇及/或二甲亞砜並 混合。又，上述染料中，對鹼溶液之溶解性較低者， 先將其溶解在甲醇或是二甲亞砜之一種以上當中，然 與驗溶液混合為佳。 如此所得到之本發明染色劑，可以對例如白癣菌 膚絲狀菌、念珠菌、皮屑芽胞菌等真菌、革蘭氏陽性 革蘭氏陰性菌等細菌進行染色。 以下，說明使用本發明染色劑進行檢驗微生物之； 使用本發明染色劑進行檢驗微生物，首先，從懷 此等微生物存在的部位採取試料，使此試料與本發明 劑發生作用，在此狀態放置20〜3 0分鐘左右，來對微 進行染色。所使用之試料，可以依照採取之部位而利 種物體。例如，作為微生物而檢驗足部和長毛部的白 時，可以利用鱗屑、小水疮、小水疮蓋片、丘療之角 位等，檢驗指甲之白癬菌時，可以利用指曱下層和指 角質等，又，禿瘡（kerion)、鬚瘡（sycosis)時，可以利 灶中容易脫落的病毛。又，對於試料的本發明染色劑 加量，數滴之程度即可β 又，因為本發明染色劑之熱安定性高，為了用更 時間進行染色，所以將本發明染色劑添加於試料後， 以藉由定溫熱板等以60~80°C加溫2〜5分鐘左右。 又，本發明染色劑發生作用之試料，例如，將其 載玻片上，接著被覆蓋玻片，以玻璃棒等輕壓蓋玻片 苯并 加以 以預 後再 等皮 菌和 r法。 疑有 染色 生物 用各 癖菌 質部 甲下 用病 之添 短的 亦可 放在 上面 6 1329739 而將試料展開成薄狀後，以顯微鏡等使用100〜200倍之倍 率觀察，檢驗有無染色。 然後，確認已有染色時，進而用400倍左右之倍率進 行鏡檢，可以觀察試料中的皮膚絲狀菌、念珠菌、皮屑芽 胞菌等真菌之寄生形態，藉此可以檢驗出其存在。另一方 面，若試料中的微生物係革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等 細菌時，用1000倍左右之倍率進行鏡檢，可以檢驗出其存 在。 本發明染色劑，使用重氮系染料時的特佳形態，可以 舉出：含有鹼物質 1 5〜3 0%、重氮系染料 0.1 ~ 1 %、曱醇 0〜20%、二曱亞礙0~2%者。又，使用二苯并哌喃系染料時 的特佳形態，可以舉出：含有鹼物質1 5〜30%、二苯并哌 喃系染料0.005〜0.5%、甲醇0〜30%、二甲亞颯5〜20%者。 相較於習知微生物之染色方法，藉由使用以上說明之 本發明染色劑，可以在短時間更正確地對微生物進行染 色、檢驗。 (實施例） 以下，舉出實施例更詳細地說明本發明，但本發明並 不限定於此等。 (實施例1) 染色劑（1): 在20 %氫氧化鉀溶液中添加芝加哥天藍6B(關東化學 株式會社製）使成為 0.5%濃度，予以混合、溶解而調製成 染色劑" 7 1329739 (實施例2) 來自真菌感染部位之菌之染色、檢驗（1) 從懷疑是表在性真菌症的部位，採取病灶組織（鱗屑） 作為檢查試料。將此試料放在載玻片上，滴下實施例1之 染色劑，在室溫放置20〜3 0分鐘使病灶組織軟化。組織充 分軟化後，被覆蓋玻片，以玻璃棒等輕壓蓋玻片上面將試 料展開成薄狀後，以光學顯微鏡進行觀察。 鏡檢結果，使用100〜200倍之倍率可以確認微生物之 染色（藍色）。進而使用400倍左右之倍率，亦可以觀察皮 膚絲狀菌、念珠菌、皮屑芽胞菌等寄生形態而確認其存在。 第1圖係顯示使用4 0 0倍之倍率之顯微鏡照片。 (實施例3) 來自真菌感染部位之菌之染色、檢驗（2) 除了在定溫熱板上以60〜80°C加溫2〜5分鐘來代替放 置於室溫之外，和實施例2同樣地進行染色、鏡檢。 鏡檢結果，使用 1〇〇~200倍之倍率可以確認染色（藍 色）。進而使用 4 0 0倍左右之倍率，亦可以觀察皮膚絲狀 菌、念珠菌、皮屑芽胞菌等寄生形態而確認其存在。又， 得知本發明染色劑藉由加溫可以在更短的時間染色。 (實施例4) 在微生物檢驗時曱醇及二甲亞颯之影響（1): 將芝加哥天藍6B濃度固定為0.5%、KOH濃度固定為 8 Γ329739 2 0%，再對曱醇（MeOH)濃度及二甲亞颯（DMSO)濃度作各種 之變化，而調製下述染色劑，並藉由下述基準來評價檢體 細胞之染色程度及微生物之染色程度。又，對染色劑特性 進行综合評價。結果如表1所顯示。 (染色劑之MeOH及DMSO濃度） 染色劑 A : M e Ο Η 0 % / D M S Ο 0% 染色劑 B : M e Ο Η 1 0 % / D Μ S Ο 0% 染色劑 C: MeOH 20%/ DMSO 0% 染色劑 D: MeOH 30%/ DMSO 0% 染色劑 E: MeOH 40%/ DMSO 0% 染色劑 F : M e Ο H 0 % / D M S O 1% 染色劑 G : M e Ο H 1 0 % / D M S O 1% 染色劑 H : M e Ο H 2 0 % / D M S O 1% 染色劑 I : MeOH 0%/DMSO 2.5% 染色劑 J : MeOH 10%/DMSO 2.5% 染色劑 K: MeOH 20%/ DMSO 2.5% (評價基準） 檢體細胞的染色程度 評分： 内容 + + + : 染色極浪 ++ : 染色濃 + : 略有染色 土 ： 染色淡 — : 未染色 9 1329739 微 生物的染 色 程 度 評 分： 内 容 + + + : 染 色 極 濃 + 4 染 色 濃 + 略 有 染 色 土 染 色 淡 — 未 染 色 綜 合評價 評 分： 内 容 ◎ 染 色 劑 之 實 用 性 A 〇 可 以 作 為 染 色 劑 使 用 Δ 作 為 染 色 劑 在 使 用 上有問題 X 不 能 使 用 作 為 染 色 劑 (結果） 10 1329739 表1 染色劑 染色之程度 綜合評價 檢體細胞 微生物 染色劑A 土〜+ + + ~ + + + ◎ 染色劑B --+ + +〜++ + ◎ 染色劑C —--(- + + + ◎ 染色劑D 土〜+ + + +〜+ + + 〇 染色劑E ±~+ + +〜+ + △ 染色劑F — +--h + 〇 染色劑G 士 + + ◎ 染色劑Η _ 〜士 + +〜+ + + ◎ 染色劑I — +〜+ + 〇〜△ 染色劑J 土 + ~ + + 〇 染色劑Κ — + + 〇 (實施例5 ) 染色劑（2): 在20 %之氫氧化鈉溶液中，添加芝加哥天藍6B 0.5% 及曱醇20%，予以混合、溶解而調製成染色劑。 (實施例6) 染色劑（3): 將5mg之若明丹B(舆瑞奇公司（Aldrich Corporation) 製）與lmL之二曱亞颯予以混合、溶解後，添加水4mL。 11 Γ329739 將其與4 Ο %之氫氧化鉀溶液，以1 : 1比率予以混合、溶解 而調製成染色劑。 (實施例7) 來自真菌感染部位之微生物之染色、檢驗（3) 除了使用實施例6之染色劑來作為染色劑之外，和實 施例2同樣地進行染色 '鏡檢。第2圖顯示使用400倍之 倍率之顯微鏡照片。 鏡檢結果，使用 100〜200倍之倍率可以確認染色（紅 色），藉此可以確認細菌之存在。進而使用400倍左右之倍 率，亦可以觀察皮膚絲狀菌、念珠菌、皮屑芽胞菌的寄生 形態。第2圖顯示使用4 0 0倍之倍率之顯微鏡照片。 (實施例8) 在微生物檢驗時甲醇及二曱亞砜之影響（2): 若丹明B濃度固定為0.05%、KOH濃度固定為20%， 而對MeOH濃度及DMSO濃度作各種變化來調製下述染色 劑，藉由與實施例4相同之基準來評價檢體細胞之染色程 度及微生物之染色程度。又，對染色劑特性也同樣地進行 综合評價。結果如表2所顯示。 (染色劑之MeOH及DMSO濃度） 染 色 劑 L ： MeOH 1 0 % / D M S Ο 0% 染 色 劑 Μ ： ：MeOH 2 5 % / D M S Ο 0% 染 色 劑 Ν ： MeOH 0 % / D M S Ο 10% 12 1329739 染 色 劑 0 ： MeOH 1 0 % / D M S 0 10% 染 色 劑 P ： MeOH 2 0 % / D M S 0 10% 染 色 劑 Q : MeOH 3 0 % / D M S 0 10% 染 色 劑 R ： MeOH 4 0 % / D M S 0 10% 染 色 劑 S ： MeOH 0 % / D M S 0 25% (結果） 表2 染色劑 染色之程度 综合評價 檢體細胞 微生物 染色劑L + + + + χ~Δ 染色劑M + + + + X 染色劑N 土--l· + + + ◎ 染色劑〇 ±~ + + + + ◎ 染色劑P + ~ + + + +〜+ + + 〇 染色劑Q 土 + + 〇 染色劑R — + Δ 染色劑s — + Δ 實施例9 染色劑（4): 將5mg之若明丹B與lmL之二曱亞砜予以混合、溶 解後，添加水4mL。將其與40%之灸氧化納溶液，以1:1 比率予以混合、溶解而調製成染色劑。 13 1329739 比較例1 比較染色劑（1): 在 20%氫氧化卸溶液中加入 1%苯胺藍（aniline blue)(和光純藥工業株式會社製）並予以混合、溶解而調製 成比較染色劑。使用此染色劑，和實施例2同樣地進行染 色、鏡檢，但是無法確認染色、無法檢驗出微生物。 比較例2 比較染色劑（2): 對20%氩氡化钟溶液添加亮藍R(brilliant blue)(西格 瑪公司（Sigma Corporation)製）使成為0.5%漢度、添加二甲 亞颯使成為1 0%，予以混合、溶解並調製成比較染色劑。 使用此染色劑，和實施例2同樣地進行染色、鏡檢，但是 無法確認染色、無法檢驗出微生物。 比較例3 比較染色劑（3): 將白金備用墨水藍黑墨水管（白金鋼筆株式會社製）與 4 0 %氫氧化鈉溶液，以1 : 1比率予以混合、溶解而調製成 比較染色劑。使用此染色劑，和實施例2同樣地進行染色、 鏡檢，但是無法確認染色、無法檢驗出微生物。 比較例4 比較染色劑（4): 14 1329739 將 Uni-Ball Signo(Uni-Ball Shigno)用替換芯 UMR-85N藍黑（三菱鉛筆株式會社製）與 40%氫氧化鈉溶 液，以1 :1比率予以混合、溶解而調製成比較染色劑。使 用此染色劑，和實施例2同樣地進行染色、鏡檢，但是無 法確認染色、無法檢驗出微生物。 [產業上之可利用性] 本發明染色劑，可以在短時間對真菌、細菌等微生物 進行染色、檢驗。又，本發明染色劑之保存安定性和熱安 定性高，不會發生因為長期保存及染色時之加熱而使染色 性降低之問題。 因此，本發明染色劑，係極為有效之真菌、細菌等微 生物的染色劑。 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示使用實施例1之染色劑染色之顯微鏡照片 (x400) 〇 第2圖係顯示使用實施例7之染色劑染色之顯微鏡照片 (x400)。 【元件代表符號簡單說明】 無 15

Claims (1)

1329739 七、申請專利範圍： 種生物染色劑’其特徵在於含有：15〜30質量％之鹼物質: 及選自芝加哥天藍6B或是若丹明B之染料。 2.如申請專利筋囹笛1 c ^ . 111第1項所述之微生物染色劑，其中進而含有甲 醇及/或二甲亞；β 3種微生物染色劑，其特徵在於含有：15〜30質量％之鹼物質、 〇.1 1質量/〇之芝加哥天藍6Β、〇〜20質量％之甲醇、〇〜2質量％ 之二甲亞碾β 4. 種微生物染色劑，其特徵在於含有：15〜30質量％之鹼物質、 0.005 〇.5質量％之若丹明B、〇〜3〇質量〇/〇之曱醇、5〜20質量％ 之二甲亞碾》 5. 一種直接鏡檢法中的微生物檢驗方法，其特徵在於：將如申請 專利範圍第1項至第4項中任一項所述之微生物染色劑添加於 含有微生物之試料而將微生物染色，接著檢驗被染色之微生物。 6·如申請專利範圍第5項所述之直接鏡檢法中的微生物檢驗方 法其中該含有微生物之試料，是從懷疑有微生物存在的部位採 取之試料。 16 1329739 7. 如申請專利範圍第5項所述之直接鏡檢法中的微生物檢驗方 法’其中將如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之染色 劑，添加於試料後，以60〜80°C加溫2〜5分鐘》 8. 如申請專利範圍第5項所述之直接鏡檢法中的微生物檢驗方 法，其中該微生物是真菌。 .9·如申請專利範圍第5項所述之直接鏡檢法中的微生物檢驗方 . 法，其中該微生物是細菌。 17