CN105803043B - 一种氧化酶试剂 - Google Patents
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Abstract
一种氧化酶试剂，包括盐酸二甲基对苯二胺，还包括硫脲和维生素C，所述氧化酶试剂由如下成分构成：盐酸二甲基对苯二胺0.5%~2%；硫脲0.15%~0.35%；维生素C0.01%~0.03%。本实施例的氧化酶试剂，适用于检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶，且显色时间快，阳性结果判读时间为30s，该氧化酶试剂保存时间长，且不会影响其检测效果，且阳性结果保存时间长，不会出现因为错过结果判读时间而出现检测结果错误的情况。该氧化酶试剂用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该菌属细菌均为阳性。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别鉴定，前者为阳性，后者为阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属均为阳性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及细胞色素氧化酶检测领域，具体地，本发明涉及一种氧化酶试剂。
背景技术
细菌的氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，为细菌的生命活动提供能量。
细菌氧化酶试验是临床细菌学鉴定的关键性试验之一，现有技术中，氧化酶试验的原理是氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺氧化，产生蓝色或红色的颜色反应。，细菌氧化酶试验用于检测细菌是否存在氧化酶。
但是，单纯的利用盐酸四甲基对苯二胺或盐酸二甲基对苯二胺配制的试剂稳定性差、准确性较差，阳性的持续时间较短，不便于观察、判断结果。
朱启勇于1992年03期在《临床检验杂志》上发表的文章“细菌氧化酶试剂的改进及应用”中，为了氧化酶试剂保存时间较短的问题，在氧化酶试剂中加入少量硫脲、延长了试剂保存时间，取得了满意效果。
王晋于1993年2期在《现代检验医学杂志》上发表的文章“对氧化酶试剂的改进及三种保存方法的观察”中，添加少量维生素C来解决氧化酶试剂保存时间较短的问题。
但是以上现有技术不能达到反应快且保存时间长的效果。
发明内容
为了克服现有技术中的技术问题，本发明提供一种氧化酶试剂，该氧化酶试剂能长时间保存，稳定性好、准确性好，阳性结果持续时间长。
为了达到这样的目的，本发明采用如下方案：
一种氧化酶试剂，包括盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺，还包括硫脲和维生素C。
优选的是，所述氧化酶试剂由如下成分构成：
盐酸二甲基对苯二胺 0.05％～2％
硫脲 0.15％～0.35％
维生素C 0.01％～0.03％。本发明中所涉及百分比均为浓度百分比。
上述任一方案优选的是，所述氧化酶试剂由如下浓度百分比成分构成：
盐酸二甲基对苯二胺 0.8％～1.8％
硫脲 0.18％～0.32％
维生素C 0.01％～0.03％。
当盐酸二甲基对苯二胺的含量处于上述范围内，阳性菌株显色时间短，且阳性结果保存时间长。当盐酸二甲基对苯二胺的含量过多会使阳性菌株显色时间相差不大，如果低于0.8％，则会导致阳性菌株显色时间变慢。
当硫脲的含量处于上述范围内，阳性菌株显色时间短，且阳性结果保存时间长。硫脲的含量过多会使阳性菌株显色时间较慢，如果高于0.32％，则会使阳性菌株显色时间变慢，如果低于0.18％，则也会导致阳性菌株显色时间变慢。
当维生素C的含量处于上述范围内，阳性菌株显色时间短，且阳性结果保存时间长。维生素C的含量过多会使阳性菌株显色时间较慢，如果高于0.03％，则会使阳性菌株显色时间变慢，如果低于0.01％，则会导致阳性结果保存时间短。
上述任一方案优选的是，所述氧化酶试剂由如下浓度百分比成分构成：
盐酸二甲基对苯二胺 1％～1.5％
硫脲 0.2％～0.25％
维生素C 0.01％～0.02％。
上述任一方案优选的是，所述氧化酶试剂包括如下浓度百分比成分：
盐酸二甲基对苯二胺 1％
硫脲 0.25％
维生素C 0.01％。
当维生素C的含量为0.01％时，阳性菌株的显色时间和阳性结果保存时间达到最佳平衡。
本发明提供的氧化酶试剂，显色反应时间很快，且纸片保存时间长，该氧化酶试剂保存时间长，可由7-14天的保存时间延长至一年，且不会影响其检测效果，不易氧化，阳性结果保存时间长，便于观察、判断细菌中是否存在氧化酶。
具体实施方式
为了更加清楚、正确地理解本发明的发明内容，下面结合具体实施例对本发明的发明内容作进一步说明、解释。
实施例1
一种氧化酶试剂，由以下浓度百分比成分组成：
本实施例的氧化酶试剂，可用于检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶，且显色时间快，该氧化酶试剂保存时间长，可由7-14天的保存时间延长至一年，且不会影响其检测效果，且阳性结果保存时间长，不会出现因为错过结果判读时间而出现检测结果错误的情况。
本实施例中的氧化酶试剂，通过如下方法制备：
第一步：准备工作，将纸片裁剪成合适的尺寸；
第二步：根据试验配方进行称量、溶解，此溶液为氧化酶试剂；
第三步：此氧化酶试剂需避光浸泡。
本实施例的氧化酶试剂，通过如下方法检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶：
步骤A：取适量氧化酶试剂；
步骤B：向步骤A中的氧化酶试剂中滴加1-2滴菌液；
步骤C：判读结果，阴性反应(-)判读时间为60s，即60s以内不出现红色，则判定为阴性，即受检细菌中不存在细胞色素氧化酶；阳性反应(+)判读时间为30s，即30s内出现红色均判读为阳性，即该细菌中存在细菌细胞色素氧化酶。若判读时间30s至60s出现红色即为延迟反应，判读为阳性。
本实施例的氧化酶试剂还可以通过以下方法检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶：
步骤一：取纸片在所述氧化酶试剂中浸泡，浸泡时间为3-20min；
步骤二：将浸泡后的纸片进行干燥，干燥方式可以选用烤干或烘干，温度35℃左右；也可以选择真空干燥，直到纸片干燥为止，优选干燥时间短的方式进行干燥；
步骤三：干燥后的纸片避光密封保存待用，如放入密封的棕色瓶中，也可以直接用来检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶；
步骤四：沾取试验菌的菌落少许涂抹在纸片上，待30s和60s后，判读结果：60s以内不出现红色，则判定为阴性，即受检细菌中不存在细胞色素氧化酶；30s内出现红色均判读为阳性，即该细菌中存在细菌细胞色素氧化酶。若判读时间30s至60s出现红色即为延迟反应，判读为阳性。
实施例2
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下成分组成：
实施例3
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下成分组成：
实施例4
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下成分组成：
实施例5
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下成分组成：
实施例6
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下浓度百分比成分组成：
实施例7
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下浓度百分比成分组成：
实施例8
一种氧化酶试剂，与实施例1基本相同，不同的是，本实施例中的氧化酶试剂由以下浓度百分比成分组成：
对比实验
实验配方一：0.1g盐酸二甲基对苯二胺+0.003g Vc+0.015g硫脲+10ml水(实施例7)；
实验配方二：0.1g盐酸二甲基对苯二胺+0.001g Vc+0.015g硫脲+10ml水(实施例8)；
实验配方三：0.1g盐酸二甲基对苯二胺+0.001g Vc+10ml水；
实验配方四：0.1g盐酸二甲基对苯二胺+0.015g硫脲+10ml水。
称量精度为0.002g。进行实验时，将纸片在四个液体试剂中浸泡，浸泡时间为15min或者20min；然后将浸泡后的纸片进行干燥，干燥方式为35℃(温度不宜过高，防止失效)或抽真空，本发明中，采用烘干对纸片进行干燥，直到干燥为止(干燥时间要快)，本发明的实验中，干燥时间为15-30min；然后放入密封棕色瓶保存，4℃避光保存。
进行氧化酶检测时，将菌液或细胞液滴试验菌株的菌落涂抹在纸片上，众所周知，铜绿假单胞菌中含细胞色素氧化酶，而大肠杆菌中不存在细胞色素氧化酶，所以，该实验过程中，所用质控菌株为：ATCC27853铜绿假单胞菌作为阳性标准，ATCC25922大肠埃希菌作为阴性标准。
注意，试验时应避免含铁物质，防止被氧化。本发明中所用水均为无菌纯净水。
判读标准：阴性反应(-)判读时间为60s，即60s以内不出现红色，则判定为阴性，阳性反应(+)判读时间为30s，即30s内出现红色均判读为阳性，即该细菌中存在细菌细胞色素氧化酶。
将现制的以上四种配方的试剂用于对比实验，得到下列各种细菌出现阳性反应(+)即反应出现红色的时间结果如表1所示。
表1现制的试剂出现阳性反应(+)即反应出现红色的时间
其中，“-”表示阴性反应，即未出现红色。从以上对比试验可以看出，实验方案四不可行，虽显色反应时间很快，但纸片保存时间不长，易氧化。
实验方案一和实验方案二比较，结果如下：
Vc含量多会使阳性菌株显色时间较慢，因此实验时不得加入过多的Vc.
实验方案二和实验方案三比较，结果如下：
加入硫脲后，阳性菌株显色时间会比较快，因此为加快菌株的显色时间可适当加入些许硫脲。
从以上结果可以看出，加入硫脲，并不像背景技术中提到的，能延长氧化酶试剂的保存时间，而只能使得菌株显色时间加快，并不能延长阳性结果保存时间，加入维生素C只能延长阳性结果保存时间却不能使得显色时间加快，而本发明中的配方，延长了氧化酶试剂保存时间，还加快菌株显色的同时，并使得阳性结果保存时间延长，便于观察、判读检测结果，不会出现因为错过判读时间，而出现检测结果判读错误。
将配制的以上四种配方的试剂长时间保存(超过一个月)后，，然后用于以上对比实验，得到下列各种细菌出现阳性反应(+)即反应出现红色的时间结果如表2所示。
表2试剂长时间保存后出现阳性反应(+)即反应出现红色的时间
从表2可以看出，以上四种试剂，保存一年后，方案三和四的试剂，用于检测多种细菌，均未出现阳性反应，表明这两种试剂已经完全丧失检测细胞色素氧化酶的功能，不能用于检测细菌中是否存在细胞素色氧化酶；而本发明的实施例7和8(方案一和方案二)，在长时间保存后，其检测细菌中是否存在细胞色素氧化酶和阳性标准相差无几，说明，试剂的保存时间延长。
同时，还进行了如下实验：
实验配方五：0.1g盐酸四甲基对苯二胺+0.003g Vc+0.015g硫脲+10ml水。
结果显示，使用盐酸四甲基对苯二胺阳性结果不稳定，且会褪色。
也就是说，本发明提供的氧化酶试剂显色快、保存时间长，且阳性结果保存时间长，利于检测细菌色素氧化酶及观察其结果。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (1)
1.一种氧化酶试剂，其特征在于：所述氧化酶试剂由如下成分构成：
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