TWI325429B - Designed deimmunized monoclonal antibodies for protection against hiv exposure and treatment of hiv infection - Google Patents

Description

1325429 玖、發明說明： 【發明所屬^技術々貝域】 發明領域 本發明係有關於一種用於保護對抗HIV曝露及HIV感 5染治療的去免疫性單株抗體。 【先前技術j 發明背景 自發現HIV為引起「後天免疫不全症候群（Acquired

Immunodeficiency Syndrome)」之20年中，以及自分子選殖 10與鑑定AIDS病毒開始起18年來，儘管已經進行了相當多關 於AIDS疫苗之研究，HIV免疫療法的發展依然存在著許多 困難。這些困難包括了第一類型HIV的高度變異性，病毒傳 播途徑的多樣性，以及對於抑制HIV所需的免疫反應知識的 缺乏。 15 在Moore等人所發表的一篇文獻中（1)指出，對抗不同 變異性抗原決定區（variable exposed epitopes)的抗體只會對 由自身取得的病毒（autologous virus)或是外套膜蛋白 (envelop protein，env)相當接近的病毒分離株產生有效的中 和作用。再者’可辨識更多env保留區段(conserved region) 2〇 的單株抗體’乃是具有更佳的的免疫治療潛力之研究目 標’不過它們幾乎不會有效中和多種不同之原始分離株 (primary isolate)。對於可以產生廣泛抗各種病毒的抗體 所需的知識依然不甚清楚’因此’目前在HI V疫苗這個 領域内，只能把焦點放在至少可以提供部分保護作用的 1325429 方法上C2)。 HIV-1病毒原始分離株是由AIDS病人的週邊血液單' 核淋巴細胞(peripheral blood monoclear cells，PBMC)或病 患未被感染PBMCs血清的培養所獲得。它們和感染人體的 5 HIV品系很相近(3)。原始分離株可以很快的和實驗室中常 用的T趨性(T- tropic)病毒，例如IIIb/LAI，SF2與MN加以區 別出來，而這些病毒已被完全馴化到可以在人類T淋巴細胞 株中生長與繁殖。

首先，大多數的HIV-1病毒原始分離株是M-趨性的-它 10 們不容易在T細胞株上生長。反而，它們是屬於單核細胞 (monocyte)或巨嗔細胞(macrophage)-趨性的，具備感染初代 T細胞之能力（4)。其次，原始分離株相當不容易在體外（in vitro)被重組可溶性病毒受體蛋白rsCD4中和（neutralization) ，和實驗室的病毒株相比，必須要多到200-2700倍之rsCD4 15 的量才具有相當的中和效果（5)。第三，原始分離株對由 gpl20疫苗的產生的中和抗體有阻抗作用（6)。 在P B M C細胞培養中，原始分離株包括融合誘發分離株 (syncytium-inducing isolate，SI)以及非融合誘發分離株 (non-syncytiun-inducing ’ NSI)兩類。大多數之SI原始分離 20 株可在高度HIV容納性之T細胞株MT2中進行複製，僅少數 可以在較不容納（less permissive)之T細胞株CEM或H9中複 製’ CEM或H9乃實驗室中最常用來培養已經馴化過 (adapted)的分離株。NSI原始分離株只能在來自週邊血液之 初代培養T細胞(primary T cell)中培養。 6 1325429 有一些過於樂觀的誤解存在著—認為來自重組 病毒外套膜之疫苗（如gpl20與gpl60疫苗）可以產生有效的 抗體反應。從實驗的外套膜疫苗臨床試驗所獲得的疫苗血 清’通常只能夠在體外中和實驗室分離的HIV_i病毒病毒(7 5 ，8)。在那時’已在實驗室馴化過的HIV與原始分離株之差 別仍然不是很清楚。當疫苗血清中之抗體被發現無法中和 來自病人之HIV-1病毒原始分離株時，這個樂觀的想法才有 所動搖。 利用疫苗來產生抗體之樂觀想法也部分源自於有關猿 1〇 猴免疫缺乏病毒（Simian Immunodeficiency Virus，SIV)之不 活化(inactivation)研究。由於和HIV-1病毒在型態，遺傳構 ’以及感染與發病模式上的相似’ SIV感染,I*亙河猴（rhesus monkeys)成為研究AIDS疫苗與抗HIV抗體的良好模式。早 期在恆河猴的研究顯示，將於人類T細胞培養出的SIV去活 15 化與佐劑Odjuvent)製備成的疫苗，可以保護恆河猴免於被 高度傳染性，且致病性的以人類T細胞培養出之SIV變異所 感染（10)。出乎意料地是，若在將此SIV培養在同源的猴細 胞中，這層保護作用就喪失了。 之後’有關在猿猴細胞生長之SIV與未感染之人類細胞 20 的免疫研究顯示，先前的實驗所顯示不被SIV感染的保護作 用可能是由於人類宿主細胞對異種（xenogeneic)蛋白所產 生的免疫反應，而不是因為病毒抗原本身之刺激而產生（11) 。涉及SIV之被動免疫(passive immunization)實驗指出，在 缺乏細胞免疫反應（cell-mediated immunity)存在的情況之 7 下’特定之抗細胞抗體(anti-cell antibody)可能可提供保護 宿主不被感染的作用（12)。 抗細胞抗體可以提供免疫保護作用之機制尚未被清楚 描述，其中之一個可能的作用模式是經由阻礙(：1)4與111¥之 結合位（binding site)來完成。長久以來，已知抗CD4抗體的 預防感染作用是與CD4抗原決定區（epit〇pe)有關，而非病毒 株（I3 ’ M)。5八8是一個辨識cm區塊2(d〇main 2)的單株抗 體，貫驗顯示該抗體在被SIV感染的恒河猴身上具有療效 (15)。另外兩個抗CD4單株抗體’ Leu3A與P1，它們是辨識 CD4區塊1之類CDR-2環(CDR2-like loop)，可以阻斷原始分 離株對細胞的感染（5，14)。 抗CD4抗體可抑制SI與NSI品系HIV-1病毒的病毒株 以病毒對細胞（virus -to - cell)或已感染細胞對未被感染 細胞間的傳播（16)。宿主T細胞表面似乎具有一個與cd4 連結在一起的抗原複合體（antigen complex)可以加速病毒 與細胞的結合與進入，此成為一個抗細胞抗體的新研究目 標（17，18)。 鼠源單株抗體B4(MAb Β4)(Π ’ 18)也是一種抗細胞抗 體’它乃是利用表現CD4分子之Τ淋巴球細胞作為一種免疫 原而製造出來的。這些表現CD4之Τ細胞包括有：週邊血液 早核Τ細胞’胸腺細胞’脾臟細胞（Splen〇Cyte)，血癌 (leukemia)或淋巴癌（lymphoma)衍生出來的τ細胞株，如 HPB-ALL或SUP-ΤΙ。MAb B4已經證實不論在體内（in viv〇) 或體外（in vitro)皆具有中和HIV-1病毒原始分離株及相關 1325429 免疫缺乏病毒(Immunideficiency virus)的能力。特別的是， M^b B4可以阻斷HIV與CD4分子之結合，所以它是_種進 入阻斷劑（entry blocker)，這是另一類可以治療HIV感染之 抗反轉錄病毒藥物，它可以作為「高活性抗反轉錄病毒-療 5 法(Highly active anti -retroviral therapy，HAART)」的垂直 治療藥物。 M A b B 4乃直接對抗宿主細胞表面的抗原複合體—包含 CD4蛋白與化學激素（chemokine)受體。B4辨識之位置乃位 於CD4細胞外的區塊1之類CPR2環(CDR2-like loop)，並與 10 Leu3A之結合區不相同。依據美國5912176號專利指出，有 強烈的證據顯示B4抗體具有廣泛的中和活性―對許多不同 之HI V-1病毒原始分離株與HIV-2原始分離株及SIV都具有 中和力。當針對不同細胞表面抗原的單株抗體混合在一起 時，僅那些包含MAb B4的混合物會顯現有效之中合作用 15 (column 24，line 1-10 ; column 47，line 5-10)。再者，在針 對HIV-2原始分離株與SIV的中和力分析中，MAb B4對所有 的品系均呈現出強效的中和作用，但對另一抗體 anti-N-terminal V3 MN ’已知可有效抗實驗室病毒株HIV-1 病毒MN在此一試驗中卻沒有有效之中和效果。（column 45 20 ，line 19-35)。 其他中和性實驗也證實MAb B4在小鼠、黑猩猩與恆河 猴皆具有保護作用。例如，若在帶有人類週邊淋巴細胞(PBL) 之SCID小鼠感染由PBL培養出的HIV-1病毒之後，注射MAb B4抗體可干擾病毒對該細胞株之感染（18)。此外，在黑猩 9 1325429 猩予以感染黑猩猩馴化的HIV_1病毒後施打B4抗體，可阻止 HIV-1病毒之感染（18)。再者’若於恆河猴身上施予一劑 SIVmac251，接著再施打4mg/Kg劑量的MAb Β4，結果發現有 75%之恆河猴可有效被保護不被SIV原始分離株感染（美國 5 5912176號專利，column 50 ’ line 15-22)。 由於HIV之感染過程中需要以CD4作為接受器，此現象 暗示只要不產生不當的免疫調節作用，CD4分子應可成為 免疫治療很好之標的。 然而，使用像B4這樣的鼠源抗體來治療人體或作為體 10 内診斷試劑應用，人體會產生對抗鼠源抗體的免疫反應。 此免疫反應所產生之「人類抗鼠源抗體之抗體（human anti- murine antibody，HAMA)」，會使原來抗體之效用大 為減低。 抗體擬人化(humanization)之技術被設計來減少HAMA 15 反應。例如，鼠源抗體可以被改造成人鼠喪合(chimeric)抗 體，亦即將來自鼠源之變異區（variable region)的DNA序列 與人類的恆定區（constant region)之DNA序列相連接（19)。 另外可藉由鼠源DNA序列可藉由互補決定區移植（CDR grafting)的方法得到較好的擬人化效果。此方法首先將剪出 2〇 (excise)鼠源負責轉譯抗體重鏈(heavy chian)與輕鏈(light chain)變異區（variable region)之六組CDR的DNA，並將之 移植到人類抗體架構區（framwork)之DNA序列上，此被改 造後的鼠源Fv區段可用來作為人類免疫治療。此被改造後 之變異區DNA序列再接著被接合至人類抗體恆定區之區 10 1325429 塊(20)。 然而，不論是嵌合抗體或移植抗體，對人體而言可能 還是具有免疫性。並且，移植CDR至不相關之架構區 (framework)可能會導致目標抗原與抗體間之親合力 5 (affinity)喪失，有人便進一步利用序列同源性（sequence homology)與分子模型計算(m〇iecuiar modeling)將鼠源抗體 擬人化。這些方法被用來選擇對鼠源CDR與人類架構區 (framework)更具同源性而可以保留高度結合親合力 (binding affinity)，並且減少結合所需之鼠源殘基序列。 10 既然將鼠源抗體擬人化是為了減少在人體的免疫刺激 性（immunogenicity) ’ 去免疫性（deimmunization)乃成為另一 個有用的方法。去免疫性技術乃是藉由移除鼠源抗體變異 區（variable domain)可能在人體引發免疫反應之抗原決定 位（epitope) ’來達到減少在人體產生免疫刺激性之目的。 15 事貝上’一個有效的初級免疫反應（primary immune response)對抗治療用抗體包括了 ：處理(pr〇cess)外來抗原， 藉由MHC class II分子將抗原呈現丁細胞抗源呈現位，然後 刺激輔助型T細胞(helper T cell)。然後這些τ細胞誘發並促 進B細胞產生對抗外來治療用抗體的抗體。接著，倘若這些 20治療用抗體上一或多個抗原決定區被不成熟B細胞表面之 免疫球蛋白（slg)結合，同時又有適當的細胞激素(cyt〇kine) 存在’則B細胞會被刺激而進行分化'增殖’以提供可溶性 之slg，這些可溶性slg將與治療用抗體結合而限制其效用， 並且加速其由病人體内清除。因此，為避免這樣的初級免 11 1325429 疫反應發生，治療用抗體的B抗原決定區與T抗原決定區都 應加以減少或修飾。 沒有了 Β細胞或Τ細胞免疫反應，治療用抗體的初級免 疫反應將變得較為緩和或不存在。由Biovation公司 5 (Aberdeen ’ UK)所發展出來之去免疫性技術(22, 23)乃是在 移除抗體分子可能會產生免疫性的B與T細胞抗原決定區。 此技術被利用至本發明以去除Mab B4之免疫性。移除B細 胞抗原決定區乃是利用「veneering技術」將一些替代性胺 基酸來取代可能與引發免疫反應有關的胺基酸(24)。而T細 10 胞抗源決定區的移除則是以胜肽通透(peptide threading)法 ’先辨識出治療用抗體變異區内的可能抗原決定區，再加 以修改（25)。此外’鼠源抗體之恆定區則以人類抗體恆定區 來取代（19)。 以人類、擬人化或去免疫性抗體來進行的被動免疫治 15 療在HIV感染的治療或預防上，扮演了一個重要的角色。已 知人類抗HIV單株抗體2F5、2G12可以中和HIV之原始使分 離株’並且在被HIV感染之病人身上做研究，可以觀察到病 毒量的暫時性下降與CD4 Τ細胞數目的暫時性增加(26)。這 些抗體亦被使用在非人類靈長類動物模式中進行預防母體 20 —嬰兒垂直感染之研究。不論是在胎兒生出前透過靜脈注射 母體’或是在小恆河猴出生後再直接施打（infusi〇n)抗體， 這些初生動物均得到不被SHIV (simian/ human immunodeficiency virus)感染的保護作用。作者的結論是， 利用結合抗病毒單株抗體來進行的免疫預防作用 12 1325429 (immunoprophylaxis)是預防母體-胎兒垂直感染HIV的方法 (27)。

既然特定的抗C D 4單株抗體可以有效阻止淋巴球細胞 與巨嗟細胞不被HIV-1病毒感染，而且所具備的中和力遠好 5過其它單株抗體(5 ’ 18，28)，像MAb B4這樣以受體為導向 的單株抗體可能是更好的預防性抗體及治療性抗體。為達 此目的’5A8已被重新設計過—利用CDR移植之技術一成為 擬人化之IgG4(28)。作為IgG4的isotype，擬人化5A8抗體在 CH2區塊(CH2 domian )上缺少醣化點（glycosylation site)， 10 而此處之醣鍵與補體固定作用（complement fixation)有很大 的關係。這項特性可以令該抗體較不容易導致病人體内之 CD4數下降(deplete)。擬人化5 A8抗體目前已經進入人體臨 床試驗(29)。

此外’抗CD4單株抗體已在人體上顯示治療類風濕性 15 關節炎之臨床效用（30)。另一個人類單株抗體HiMax-CD4 亦已經進入治療風濕性關節炎與牛皮癬之人體臨床試驗 (31)。這些應用顯示出，像mAbB4這樣的去免疫性抗體， 具有治療HIV感染以及與CD4分子有關之自體免疫疾病的 潛力。 20 參考文獻 1_ Moore ’ J.P.，Parren，P.W.H.I. & Burton，D.R. Genetic subtypes ， humoral immunity ， and human immunodeficiency virus type 1 vaccine development. J. Virol. 2001，75(13)，5721-5729. 13 1325429 2. Moore > J.P. AIDS vaccines · On the trail of two trials. Nature 2002 > 415 > 365-366. 3. Sawyer，L.S.W.，Wrin，M.T.，Crawford-Miksza，L. et al. Neutralization sensitivity of human immunodeficiency 5 virus type 1 is determined in part by the cell in which the virus is propagated. J. Virol. 1994，68(3)，1342-1349.

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L 明内 J 發明概要 此發明有關於針對來自鼠源抗體B4之去免疫性抗體， 該抗體具備極高的潛力於免疫治療AIDS及其他與CD4相關 5之疾病。此發明同時也指出以此抗體為主之免疫治療方法 。更特別的是，由#7、#16、#21細胞株所表現的抗體包含 了來自鼠源B4單株抗體之重組基因B4DIVHvl/VKl#7， B4DIVHvl/VKl#16，與B4DIVHvl/VKl#2卜鼠源單株抗體

B 4已經被證實對位於CD4+細胞上HIv病毒之CD4受體複合 10體具有專一性，對多種HIV之原始分離株與相關免疫缺乏病 毒株均具有中和能力（17, 18)(B4已於1999年7月15日取得美 國5912176號專利）。

此重組去免疫抗體之表達是將一段MAb B4 Fv片段與 人類IgGl Fc片段之CDNA嵌合而來。接下來將嵌合基因 15 (chimeric gene)之鼠源Fv片段之核甘酸(nucleotide)序列進 行去免疫作用--利用點突變方法將「對人體而言外來的」T 細胞與B細胞抗原決定區（epitope)予以移除，如此這抗體才 能用於人體治療。共設計4段不同之去免疫VH cDNA與3段 去免疫VK多核甘酸鏈(polynucleotide chain)產生出來。其 2〇 中一抗體並以定點突變之基因工程技術被加以改造，使成 為不具酿鏈（aglycosylated)之IgGl。此種之去醣化抗體將 無法與補體（complement)結合，因此也就不會引發CD4細 胞之「補體媒介細胞溶解（complement-mediated lysis)」 的現象β 23 1325429 這，個新的去免疫性抗體保留了和原來氣源單株抗體一 樣的專一性與中和力。 這些由NSO或CHO細胞所表5見的抗體已經成功地被酬 化成無血清培養模式。這些去免疫性抗體也可能可以轉殖 5植物(t麵genic plant)大量生產以減低生產成本。此抗體之 發明可關於預防HIV感染，治細v感染或治療與CD4分 子有關的自體免疫疾病，如類風濕性關節炎。 圖解 第1圖係為鼠源單株抗體B4重鏈的DNA和胺基酸序列（ 10序列辨識編號：1 and 2)以及限制酵素圖譜。 弟2圖係為鼠源單株抗體B4輕鍵的DNA和胺基酸序列（ 序列辨識編號：3 and 4)以及限制酵素圖譜。 第3圖係為含插入重鏈變異區的重鏈表達載體 pS VgptHuIgG卜用於NSO細胞表現鼠源單株抗體B4重鏈變 15 異區與人類重鍵CH1融合之chimeric IgGl重鍵。Ig enh是重 鍵加強子。 第4圖係為含插入輕鏈變異區的輕鏈表達載體 pSVhygHuK，用於NSO細胞表現鼠源單株抗體B4輕鏈變異 區與人類輕鏈CH1融合之chimeric IgGl輕鏈。Ig enh和 20 Kappa enh分別是重鏈及輕鏈加強子。 第5圖係為鼠源B4重鏈變異區B4M〇VH(序列辨識編號 :2)，以及四個不同的去免疫性重鏈變異區B4DIVHv.l-v.4( 序列辨識編號：5-8)胺基酸序列的比較，框出的區域表示與 B4MoVH胺基酸序列不一樣的位置。 24 1325429 第6圖係為鼠源B4輕鏈變異區B4MoVK(序列辨識編號 :4)，以及三個不同的去免疫性輕鏈變異區B4DIVKv.1-v.3(; 序列辨識編號：9-11)胺基酸序列的比較，框出的區域表示 與B4MoVK胺基酸序列不一樣的位置。 5 第7圖係為鼠源B4重鏈變異區B4MoVH(序列辨識編號 :1)，以及四個不同的去免疫重鏈變異區B4DIVHv.l-v.4(； 序列辨識編號：12-15)核苷酸序列的比較，粗體及劃線表示 與B4MoVH核苷酸序列不一樣的位置。 第8圖係為鼠源B4重鏈變異區B4MoVK(序列辨識編號 10 : 3) ’以及三個不同的去免疫重鏈變異區B4DIVKv.1^3(： 序列辨識編號：16-18)核苷酸序列的比較，粗體及劃線表示 與B4MoVK核苷酸序列不一樣的位置。 第9圖係為B4 chimeric抗體及DIVH1 /VK1 -3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 15 第10圖係為B4 chimeric抗體及DIVH2/VK1-3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 第11圖係為B4 chimeric抗體及DIVH3/VK1-3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 第丨2圖係為表達二羥化葉酸還原酶基因載體： 20 pSI-DHFR 〇 第U圖係為含B4DIVHv.l和人類重鏈恆定區之去免疫 重鏈表達載體，pcDNA3.1(+)Ne〇-DeIgl-S，用於二羥化葉 酸還原酶的細胞(CHO dhf〇表現去免疫重鏈。 第14圖係為含Β4〇ΐνΚν.1和人類輕鏈恆定區之去免疫 25 1325429 輕鍵表現載體，pcDNA3.1Zeo-HuK，用於二經化葉酸還原 酶的細胞(CHO dhfr·)表現去免疫輕鏈。 第15圖係為表現去免疫輕鏈和二羥化葉酸還原酶基因 的載體，pSI-DHFR/ pcDNA3.1 zeo-HuK(DDllN)含 5 B4DIVKv.l及人類輕鏈恆定區，用於二羥化葉酸還原酶的 細胞(CHO dhfr·)共同表現去免疫輕鏈以及二羥化葉酸還原 酶基因。 第16圖係為用醣解酶作用造成分子量變化的 SDS-PAGE分析（Coomassie Blue staining)。 10 第17圖係為補體固定試驗，比較鼠源單株抗體B4和去 免疫性B4#16及#7抗體補體固定力。P values分別為〇〇7和 0.0001 ;分析方法是用 Student’s t-test。 第18圖係為鼠源單株抗體B4和選殖株#7，#16及#21互 補決定區（CDRs)cDNA及胺基酸序列。 15 C實施方式】 較佳實施例之詳細說明 鼠源單株抗體F v片段的去免疫性是利用找尋出位於鼠 源序列上可能於人體產生強烈的免疫性的T和B細胞抗源 決定區並將之移除，而去除T細胞抗源決定區是利用一個三 20維的「胜肽通透」（PePtide threading)法(22，25)分析抗體卜 内可能與MHC class II結合的區塊。並移除變異性區域上 至少一個或全部的裸露在表面且不會妨礙抗體的辨識結合 功能(22，24)的B細胞抗源決定區，接著，將鼠源單株抗體 的恆定區（CH和Ck)整個移除，並用人類IgG1的恆定區的 26 1325429 DNA序列來取代，此嵌合抗體即含去免疫性的鼠源B4單株 抗體變異性區域及人類IgGl的恆定區。 例一底下詳細敘述了 DNA表現鼠源單株抗體B4重鏈 (VH)和輕鏈(Vk)變異性區域的取得、選殖及定序，鼠源B4 5 VHDNA及胺基酸序列表示在圖一，鼠源B4 VkDNA及胺基 酸序列表不在圖二。兩個鍵互補決定區（CDRs)位置的決定 是參考其他抗體的序列庫(32)，B4VH和B4Vk分別被歸類 在小鼠重鏈次級體(heavy chain subgroup)V(B)及小鼠輕鏈 次級體III(kappa chain subgroup 111)(32)，而嵌合抗體即含完 10 整的人類恆定區及完整的鼠源變異區，此例則描述在例二 中。由嵌合抗體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合結果證明 了此變異性區域是正確的。 此cDNA或多核苷酸序列所表現出的鼠源B4 VH和Vk 與人類胚系Vh(33)和Vk(34)序列與人類胚系J區域序列（35) 做比較後，選擇人類架構區DP14和JH6，作為B4 VH參考架 構’而選擇人類架構區B1和JK2作為B4 Vk參考架構。 將B4 VH與Vk架與人類參考架構中不同的胺基酸殘基 核苷酸序列，改成人類參考序列，在這過程中，若此胺基 馱對於抗體結構及結合能力是重要的就不去改變它，這些 Μ 包括ύ Ώ fB4 VH和VK的互補決定區（CDRs)(此CDR列於第18 圖中的序列辨識編號：2〇，22，24，26，28及3〇)及CDR附 L的胺基酸。保留在CDR N端、其他不在表面以及隱藏在 内的胺基酸》 “個過程產生一了個序列被修飾過(veneered)的抗體 27 1325429 ，因為在這個抗體的表面主要是人類的胺基酸序列，而被 包埋在裡面的胺基酸則是原本鼠源的胺基酸序列，這些修 飾過的序列經由與18個不同人類同種異型的（allotype)MHC class II，以胜肽通透法(peptide threading)來鑑定出可能為T 5 細胞抗原決定區的位置。經由此過程產生初級去免疫性的 VH和Vk序列(B4DIVHv.l，BlDIVKv.l)，由於初級去免疫 性序列的產生需要改變一些核苷酸序列，有可能影響最後 去免疫性分子的結合力，因此同時設計其他三個不同的VHS 和兩個Vks。第5圖為鼠源與去免疫性的變異區域胺基酸序 10 列Vh的部分的比較，第6圖為Vk胺基酸序列的比較，第7圖 為其VH核苷酸序列的比較，第8圖則為VK核苷酸序列的比 較。 在例三詳細的敘述去免疫性變異性區域核苷酸序列片 •^又的建構方法’包括了 5，外側序列、領導訊號胜肽(the leader 15 signal PePtlde)、領導插入序列（leader intron)和鼠源免疫球 蛋白啟動子(promoter)，3，外側序列、剪接位置(the spnce site) 以及插入序列（intron)等序列的建構方法。 去免疫性的重鏈和輕鏈變異性區域建構完成後，將它 們移殖到含人類IgGl CH或Ck區域的表現載體中，而篩選 20哺乳類細胞（第3圖，第4圖）的標籤基因也被包含在載體中， 然後將此重組載體送入N S 0細胞中表現，然後從培養基中純 化出被表達的去免疫性抗體，並測試與重組可溶性 CD4(rsCD4)的結合以及對抗!·!^]病毒的中和能力。 由ELISA結果顯示這十二個不同的B4單株抗體對於 28 1325429 rsCD4的結合親合力不同’利用從HIV1病毒次群體a，b， C’ D’ E中的S1原始分離株以及從丁細胞中分離出的HIV_丨_ 做ΜΤ-2微溶體試驗(micr〇plaque assay)(36)結果顯示這十二 個不同的去免疫抗體也具有不同的病毒中和能力 。比較四 5種重鏈的的變異（Vhv，i·4)，所有與去免疫性的κ鏈結合的 版本l(VKv.l)，顯示擁有版本丨重鏈均具有較高的對抗所有 HIV-1病毒原始分離株的病毒中和力，並接近鼠源B4單株抗 體HIV-1vl135 ’ HIV-lUG〇29及HIV-1th036的病毒中和力（表 一）。 10 去免疫性B4抗體對於抗τ細胞株馴化的mv-iMN病毒 是無效的，這一點與鼠源抗體一致。具κ鏈版本2與3的去免 疫性抗體其病毒中和能力較低（表2)。在這十二個不同抗體 的比較結果顯示，含DIVHv.l及DIVKv.l的去免疫性Β4抗體 ’對於所有的HIV-1病毒原始分離株具有高度的中和能力， 15且接近鼠源B4單株抗體對抗HIV-1病毒的能力。 為生產去免疫性的B4單株抗體，任何適當的表達系統 都可能被使用。例如動物細胞之哺乳類細胞株，或植物細 胞等真核細胞。較常見的表達去免疫性抗體系統有哺乳類 細胞像NSO細胞或CHO細胞。NSO細胞是一株來自歐洲動 20 物細胞保存中心（European Collection of Animal Cell Culture ’ P〇rt〇nUK(ECACC no. 85110505)本身不表達免疫 球蛋白產生的小鼠骨髓瘤細胞，而CHO細胞是來自於美國 種源保存中心(Type Culture Collection(ATCC no. CRL-9096) 種缺乏二說化葉酸還原酶（dihydrofolate reductase)的細 29 1325429 胞(CHO dhfr·)。 為了高度表達重組抗體，二羥化葉酸還原酶(dhfr)缺損 的CHO細胞是最常被用來做基因複製、重組的哺乳類表達 系統，因為這些細胞被發現會隨著基因重複數目的增加而 5 增加產量，有文獻顯示可以產出專一性抗體產量高達 100pg/106 細胞/天（42)。 在這些例子，傳統用來於哺乳類細胞表達的啟動子 (promoter)，如病毒系統中常被使用的人類cyomegalovirus immediate early(CMV)啟動子(37)，其他哺乳類細胞表現啟 10動子在在專利中適合基因表現的也能被使用，如反轉錄病 毒(retrovirus)，多瘤病毒（polyomavirus)，腺病毒（adenovirus) 和猴類病毒40(SV40)或哺乳類細胞衍生的啟動子像是人類 延長因子（elongation factor)l α啟動子（38，39)。其中免疫 球蛋白啟動子常被使用在像NS0細胞的淋巴細胞，此載體的 15設計包含了免疫球蛋白啟動子、領導訊息胜肽(leadersignal peptide)、領導插入序列（leader intron)、剪切位置（Splice site) 、插入序列（intron)及含為了插入任何變異性區域的適合限 制酵素切位’而其建構的描述見例二。這些載體可方便於 NS0細胞以ELISA及生物活性篩選表達去免疫性抗體。 20 在哺乳類動物細胞中，重組蛋白質的高度表現可經由 轉植DNA的放大而篩選出穩定的細胞株，所重組的基因在 基因放大期間會跟著篩選標識基因共同放大。本發明中使 用CHO dhfr·細胞及DHFR基因作為放大篩選的標示；另一 方面，由於骨髓瘤及融合瘤細胞株短缺的内生性(38活性， 30 1325429 因此麩胺醯胺對這些細胞生長是絕對需要的，因此麩胺醯 胺合成酶(glutamine synthetase，GS)基因可被用來當作一個 主要的筛選標識，轉植GS基因可使骨髓瘤及融合瘤細胞株 生長在沒有麩胺醯胺的培養基中（41)。 5 例子5為表現抗體及DHFR在CHO dhff細胞的質體建 構描述，利用逐漸增加methotrexate(MTX)濃度（42)以放大 DHFR基因表現的程度來增加去免疫性B4抗體的產量（42) 〇 經由幾次逐漸增加培養基中MTX濃度以培養細胞，篩 10 選後得到具專一性抗體產量達10-30 pg/細胞/天的重組 CHO(rCHO)細胞。 雖然去免疫性抗體多表現在像N S 0或C Η Ο細胞的哺乳 類細胞，但為了降低大量的生產成本，也可能用轉植植物 來表現；見例十。 15 所有的抗體都是屬於醣蛋白，IgGl在CH2(43)區域有 一個雙叉的複雜N-端連結的碳水化合物，這些礙水化合物 對抗體所擁有之作動器功能（effector function)像是補體 固定作用（fixation)和依抗體性細胞毒性（antigen-dependent- cellular- cytotoxicity ， ADCC)是重要的， 這些作 20動器功能會使得抗體標的細胞(44)被移除(44)。而B4抗體目 標是CD4接受器複合體，因此經由IgGl的作動器功能與補 體結合可能造成CD4+細胞的破壞及CD4+細胞功能的抑制 ;因此，去醣的去免疫性B4單株抗體比沒去醣的IgGl抗體 其導致CD4+細胞被破壞耗盡及免疫毒性較少。利用突變方 31 1325429 法可去除IgGl Fc區域的酿基以阻止igGi與人類fcri結合 ，進而活化的補體進而與Clq結合(45)。 有兩個常用的去酷方法：利用tunicamycin處理抗體產 生細胞’抑制其碳水化合物的前趨物吸附到天門冬醯胺 5 (asparagines ’ Asn)(46);或用突變方法將第297位置的胺基 酸Asn改成其它胺基酸’本發明中的去免疫性抗體與n連結 St化作用有關的第297Asn胺基酸已被移除。利用定點突變 PCR將重鏈表現載體中第297 Asn胺基酸的AAC密碼改成 His胺基酸的CAC密瑪’並以CHO細胞表達去醣化去免疫抗 10 體（第16圖）。 對於用來做人類治療藥物’去免疫性單株抗體的功能 特性及安全性是重要的’所以它們需要被定性。在此發明 中’已經在體外（in vitro)評估本去免疫性單株抗體的： 中和HIV-1病毒病毒；（2)補體固定作用；（3)對人類淋巴細 15 胞引的免疫性。 以MT-2微溶體試驗法比較B4鼠源單株抗體及得自 CHO細胞去免疫性單株抗體的HIV-1病毒中和力（36);表3 顯示由21號細胞株表現去免疫性抗體DH1DK1CHO# 21， 與由B4融合瘤細胞產生的鼠源抗體HIV-1病毒中和力比較 2〇 結果。而50%中和五種品系HIV病毒(A-E品系）的效果與鼠 源B4抗體比較，去醣去免疫性抗體DH1DK1CH0#7顯示有 明顯較高的中和品系8的病毒23135 '品系〇的病#11〇046 以及品系E的病毒TH036能力（表3)。 補體消耗試驗（a complement consumption assay)是用 32 來評估比較去免疫性抗體及它們原本極相像的鼠源B 4單株 杬體補體固定作用（fixation)的特性(例子7)，從這試驗結果 得到B4去免疫性抗體可使補體固定作用（fixati〇n)的特性降 低（第17圖）’由收集反應的上清液顯示，去免疫性抗體比鼠 源單株抗體剩餘較多的補體，意味著去免疫性抗體比鼠源 單株抗體在與人類CD4+細胞和CD4複合體結合時，較不會 引起補體固定作用（fixation)，而原本的鼠源抗體在和CD4 細胞表面複合體結合時，會較有效的固定補體；因此從 混合物的上清液試驗反應表示鼠源B4抗體剩餘較少的補體 去溶解致敏化的羊紅血球（sensitized SRBC)。這個研究得 到一個結果，從它們降低補體固定（fixation)的能力，可知 去免疫性抗體DH1DK1CH0# 7和DHlDKlCHO#2l比鼠源 B4單株抗體具較高的安全性，而其中以去醣去免疫性抗體 最不會與補體結合。 鼠源單株抗體在當作人類治療用藥所產生的免疫性 (immunogenicity)，可能會引發人類T和B細胞的反應而產生 對抗治療用抗體的抗體，而引起T細胞活化的結果會製造調 節人類免疫反應的細胞激素，其可對抗特殊感染或癌症。 因此由氣源抗體引起的細胞激素的混亂’可能引發不平衡 或損害對抗病源或癌症的免疫反應。 B細胞的活化會引起宿主產生人類對抗鼠源抗體的抗 體，而導致抗原抗體免疫複合體形成及這些複合體在不該 存在的組織中存積，進而可能造成人體的發炎或病變。另 外，人類對抗鼠源抗體的抗體也會與所施予的抗體藥物結 1325429 合，而降低4几體有效濃度’進而降低治療用抗體藥物到達 它所該達到的標的，例如CD4+細胞。 基於以上的考量’我們測试去免疫性單株抗體和鼠源 單株抗體B4，在體外（in vitro)人類週邊血液單核細胞 5 (PBMC)的免疫性（見例8)。此研究結果如表4所示，純化的 鼠源B4抗體會刺激人類週邊血液单核細胞（pbmc)產生 IL-10和TNF-α，而一般被認為可被抗原活化-phi CD4細胞 所產生的IFN- τ'和IL-2 ’以及被Th2 CD4細胞所產生的il_4 都沒有被偵測到。 10 相反的’去免疫性抗體DH1DK1CHO # 16和去醣 DH1DK1CHO # 7在相同的試驗中顯示都不會刺激人類週 邊血液單核細胞(PBMC)分泌這五種細胞激素，此結果顯示 這些去免疫性單株抗體有較高的藥物安全性。 • 本發明中也建立無血清培養基以降低生產成本及法規 15 對於由於血清的疑慮。由於細胞培養過程中常使用動物血 >月’有機會伴llsc而來的一些不預期病原例如病毒或其他感 染原（例如狂牛症）的污染。再者，使用動物血清當一個原始 的材料對於大量細胞培養過程的經濟效益具有負面的衝擊 。最後，若哺乳動物細胞分泌的蛋白質生物製劑是分泌到 20培養基中’不含血清培養基的使用則大大的簡化開發及下 游蛋白質純化的製程。 重組CH0細胞依賴血清生長的特性需要馴化成為不需 血清、懸浮的培養以利於產程放大。例子6描述成功的馴化 重組CH0細胞株適應懸浮的生長，並於血清的培養基中所 34 1325429 表現的抗體量，與細胞在單層培養與含1〇%牛血清培養基 寸‘且抗體的迅乂-1病毒中和力要與這些抗體在單層 培養與含10%牛企清培養基時相同。 總體而言，這些結果強力地支持本去免疫性抗體可作 5為安全的治療性藥物以治療並預防HIV病毒感染。 特殊給藥的方式有各種技巧，抗體給藥的方式不限定 在腸月外的，和直接注射在罹患位置，包含腸胃外的給藥 方式但不限定在靜脈、肌肉、腹腔以及皮下。 本專利包括上述去免疫性抗體的組成，適合腸胃外施 1〇藥方式，包含但不限定無菌等張溶液，這些溶液包括但不 限定用於靜脈、肌肉、腹腔、皮下注射，或直接注射在罹 患位置或其他位置的鹽類以及破酸鹽溶液。 以本專利發明的去免疫性抗體用予接受治療的哺乳動 物時，特別是人類，施打抗體的劑量與哺乳類動物的年齡 15 、體重、身高、性別、一般醫療情況、過去醫療病史以及 喜好等因子相關，而決定適當劑量、給藥方式及頻率等技 術知識已知，其他治療性抗體的劑量可推算本抗體之用量 ，在此專利發明的範圍不需過多的實驗來決定。 本專利發明中的去免疫性抗體可能施打於病人，藥學 20 上可接受的劑量形式，適合施打於靜脈、皮下以及肌肉的 形式，此種劑量形式包含藥學上可接受的固有、無毒和無 治療性的攜帶者，包括離子交換劑（ion exchangers)、紹化 物（alumina)' 硬 g旨 |呂酸(aluminum stearate)、卵碟脂（lecithin) 以及血清蛋白（serum proteins) ’例如人類血清蛋白，緩衝溶 35 1325429 劑例如磷酸、甘胺酸、甘露醇、山梨酸、鹽酸、山梨酸鉀 、飽和植物脂肪酸的乾油脂混合物、水、鹽類，或如硫酸 鉀、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉以及磷酸鈉等電解質。 去免疫性抗體常被配成O.MOOmg/ml的濃度。 5 藥物組成可以被製成已知技藝的配方，例如

Remington s Pharmaceutical Science(51)中所描述的。 一般而言，提供去免疫性抗體給治療者的最初劑量， 範圍在1〜100mg/kg，常用的劑量是在丨〜乃吨/以，更被常用 的疋在1〜l〇mg/kg ’敢被常用的是在2〜5mg/ kg，例如，採 10用一或多次分別或持續的注射。一般而言，抗體以靜脈(IV) 或肌肉（IM)注射，重複施打幾天或更久’依據情況重複治 療直到疾病發生的症狀抑制，或至病人病情已達改善。此 治療也可能重複施行一段期間從一週一次到每六個月一次 。最適劑量、.施打方式及頻率為現今之工藝，類似其他去 15免疫性抗體的劑量，在此專利發明的範圍中不需過多的實 驗來決定。 此專利發明的去免疫性抗體亦被用於與其他抗HIV專 一性的抗體結合使用’例如抗gp41和gp 120的抗體。這些包 括但不限定，如Hofmann-Lehmann等人的描述對gp41具專 20 一性的2F5抗體及對gpl20具專一性的2G12抗體(27)。 下面的例子闡述本專利發明應用性之不同過程，這些 例子僅說明目的，並不被限定為此專利發明的範圍。 例子1 鼠源單株抗體B4基因的選殖及定性 36 1325429 1 ·總RNA的製備 以 Promega(Madison，WI)之SV40 Total RNA Isolation System(Cat.No. Z3100)，根據操作手冊，萃取5xi〇6個融合 5 瘤B 4細胞之總RNA。 2 ·將鼠源的重鏈變異區（VH)及輕鏈變異區（VL)之 cDNA進行放大

使用 GeneAmp RNA PCR Kit(Perkin Elmer，Norwalk， CT ’ part no. N8080017)，根據操作手冊，合成單股cDNA 10 並且放大重鏈變異區（VH)及輕鏈變異區（VL) 簡言之，鼠源的重鏈變異區（VH)及輕鏈變異區（VL)的 單股cDNA是從1 ug的總RNA藉由MuLV反轉錄酶(Reverse Transcriptase)及募酸苷酸(oligodT)當引子，進行RT-PCR而 來的。反應混合物乃於42°C反應15分，在99°C反應5分，然 15 後在5°C反應5分。

鼠源的重鏈變異區（VH)及輕鏈變異區（VL)的單股 cDNA是以AmpliTaq DNA聚合酶進行放大，所使用的放大 引子為”The mouse-specific Ig Primer Sets”(Novagen， Madison，WI，cat. no. 69831-1)。反應混合物起始加熱溫度 20 為95°C，反應1分45秒，之後在95°C反應15秒接下來60°C反 應30秒，共35個循環。之後這反應混合物維持在72°C，10 分鐘。所得到的放大DNA用洋酯瓊膠(gel)純化並將它轉殖 至pGm T Easy(Promega，cat. no. A1360)的質體上。而所得 到的這些VH及Vk的細胞株，再以聚合酶連鎖反應(PCR)進 37 1325429 行篩選，來確認所要插入序列的大小。 利用雙去氧鏈終止法（Dideoxy chain termination method)將VH及Vk的DNA插入序列進行DNA定序。互補決 定區域(complementarity determining regions，CDR)的位置 5 是參考其他抗體序列庫所決定的（32)。B4 VH被分配至鼠 源重鍵次級群體V(B)而B4 Vk被分配至鼠源kappa鍵次級群 體III(32)°DNA、胺基酸序列及VH及Vk的互補決定區域 分別表示於第1圖及第2圖》 例子2 10 構築嵌合B4抗體基因（chimeric B4 antibody genes)及利 用NS0細胞表現 1.構築嵌合B4抗體基因 嵌合B4抗體基因包含鼠源-人類的抗體鏈 (mouse-human antibody chain)，這是將鼠源的單株抗體B4 15 的變異區域基因（variable region genes)與人類的免疫球蛋 白恆定區域（constant region genes)結合，在某種程度上與 Morrison等人所描述的内容相似。以這種方式，此完整地鼠 源變異區域被連到人類的恆定區域。當要測試經過去免疫 性變異區域(deimmunized variable regions)的B4抗體，此嵌 20 合抗體提供了一個有用的含有相同人類恆定區域的無去免 疫性控制組(undeimmunized control)作為比較。 為了構築嵌合B4抗體，VH-PCR1及VK-PCR1質體(20) 被使用來當模板以引入5’邊端序列一包括領導訊息胜肽 (leader signal peptide)、領導插入序列（leader intron)及鼠源 38 1325429 免疫蛋白啟動子（murine immunoglobulin promoter)，及3,邊 端序列（flanking sequence) —包括剪切位置（splice site)及插 入序列（intron sequences)，接於VH及Vk的周圍。鼠源HV及 VJ表現卡匣（expression cassettes)被接入pUC 19而且整個 5 DNA序列也進行轉認。 鼠源VH及VL表現卡匣從pUC 19以Hindlll及B ami被切 出。之後再轉至表現載體pSVgpt及pSVhyg中（20)(第3圖及 第4圖），分別包括人類IgGl(48)或是κ恆定區域(49)及在哺 乳動物細胞中的篩選標識(selection of marker)。利用DNA 10 定序去確認在pSV表現載體上的VH及Vk。 2.表現B4嵌合抗體的寄主細胞 表現抗體的寄主細胞為NS0，NS0這種細胞本身是不會 產生免疫球蛋白的鼠源骨髓癌細胞，購自歐洲動物細胞培 養保存中心（European Collection of Animal Cell Cultures， 15 PortonUK(ECACCNo.85110505))。藉由點轉染法，嵌合重 鏈及輕鏈表現載體被共同轉染（cotransfect)至NS0。表現gpt 基因的細胞乃於含有10%胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，0.8 ug/mL mycophenolic acid及 25〇 ug/mL xanthine 中被篩選0 2〇 3.利用人類IgG ELISA作抗體表現之偵測 藉由ELISA偵測人類IgG的產量。方法如下：將溶於 carbonate/bicarbonate coating buffer pH 9.6(Sigma ? cat. No. C3〇41)的抗人類k抗體覆蓋於ELISA微定量盤孔表面上，作 用於37°C，1 小時。再以PBST(PBS含0.05% Tween 20)洗3 39 1325429 次。此步驟是會形成固相免疫吸附層以捕捉培養基中的k 鏈。

從轉染細胞培養出的培養基覆蓋於定量盤孔中，作用 於37°C，1小時，然後倒掉。再以PBST洗3次。二級抗體為 5 過氧化酶嵌合的羊抗人類IgG γ鏈的專一性抗體 (Peroxidase-conjugated sheep anti-human IgG γ chain specific antibody)(The Binding Site > Cat.no. AP004)，而 o-phenylenediamine(OPD)溶液（Sigma，cat. No. P7288)為呈 色指示劑。分泌人類抗體的細胞株以此被挑選及放大。 10 4.嵌合抗體的生產

分泌最高量的嵌合抗體之NS0轉植株被挑選及放大。 抗體是用Prosep A親和色層管柱（Millipore Cat. No. 113112722)從500 mL至1000 mL之培養基中純化而來。抗 體以0.1M甘胺酸（glycine)pH 3.0引流出並中和以及以PBS

15 透析β純化好的抗體經過過濾使呈無菌並儲存於4°C。抗體 的濃度以IgG ELISA與參考標準品(U，卜5，10 ng比較來 定量（The Binding Site，cat. No· BP078) 5.比較rsCD4對嵌合抗體與鼠源抗體的相對結合親合 力（relative binding affinity) 20 嵌合抗體對重組可溶性CD4(rsCD4)的相對結合親合力 由ELIS A所測定 將 0.25 ug/ml rsCD4(American Biotechnologies 5 Columbia MD)溶方t碳酸溶液（carbonate buffer)pH9.5 並用 含3% BSA，0.05% Tween 20的PBS進行去活化。加入不同 40 1325429

稀釋倍率的嵌合抗體、鼠源抗體及正性控制組◊嵌合及鼠 源抗體的彳貞測分別是用過氧化酶嵌合的羊抗人類IgG (peroxidase conjugated goat anti-human IgG)及羊抗鼠源的 IgG(sheep anti-mouse IgG)。用 〇pd 呈色。 5 當加入固相rsCD4,在所有的嵌合及鼠源抗體濃度下， A492的吸光讀值增加。這個試驗確定所選殖的及定序的重鏈 及輕鏈的可變區域仍保有正確的辨認位置。與原鼠源抗體 相比較’肷合抗體在八492中顯示減少1〇倍。 例子3 10 去免疫可變區域序列之設計及構築 6.去免疫序列之設計 畎源B4 VH及Vk的胺基酸序列與人類胚源¥1{及Vk的 序列進行比對並且也與人類胚源j區域序列進行比對（49) 人颏胚源VH，J區域，Vk序列對於鼠源B4 VI^Vk有高 15同源性，所以被選來作為人類架構區的參考序列。 k著人類架構區參考序列的確認，在B4 vh及Vk架構 品表面曝露的某些非完全相同的胺基酸及其殘基，被改成 二人麵參考序列相對應的胺基酸(24)。而對於抗體結構及結 5目關的重要殘基，不被包括在此過程並且保持不變。舉 說月，在N端的鼠源殘基及位置靠近抗體cDRs，的重要 $基破保留下來。這過賴產生的序列大致上與「被修飾 的抗It ( 岐」（veneered antibody)過程相似，將抗體表面.的殘基 為人頦的殘基而埋藏在内的殘基則保持原始鼠源序列。 接著將上述序列之胜肽通透(peptide threading)法的電 41 1325429 腦計算方法與18種不同的人類，MHC class II allotypes進行 分析以鑑定出具有與MHC Class II分子有結合潛力的T細 胞抗原決定區（25)。初級的去免疫的VH及Vk胺基酸及 cDNA序列被設計出來（B4DIVHv. 1，第5圖及第7圖； 5 B4DIVk.l，第6圖及第8圖）。初級的去免疫序歹的產生需要 進行小量的胺基酸取代，此取代可能會影響最後的去免疫 性分子的抗原結合力，因此另三種不同的VhS(B4DIVHv. 2 ，B4DIVHv4.，第 5圖及第 7圖）及二種VkS(B4DIVkv. 2， B4DIVkv.3，第6圖及第8圖）同時被設計出來，以防止上述 10 情形。 7.去免疫性抗體序列之構築 按照上述設計藉由定點突變P C R去構築去免疫性的變 異區域（QuickChangeTM Site-Derected Mutagenesis Kit， Stratagene 5 Cat. No. 200518) 15 將選殖的鼠源VH及Vk基因為模板，合成包含擬突變之 序列引子以突變法(mutagenesis)將架構區轉成所需的去免 疫性序列。所產生的去免疫性的V區域被選殖至pUC19並且 將每一去免疫性的VH及Vk作完整的DNA序列分析並確定 DNA序列的正確性。 20 將位於pUC 19上包含去免疫性的重鍵及輕鍵之V-區之

Hindlll至BamHI的DNA片段切出來。並轉移至抗體表現載 體pSVgpt及pSVhg上（第3圖及第4圖）。並確認於抗體表現載 體上的去免疫性VH及VkDNA序列的正確性。 例子4 42 1325429 N S 0細胞表現的去免疫性抗體之定性 8.去免疫性抗體之表現 用來表現抗體的寄主細胞NSO，來自歐洲動物細胞培 養保存中心（European Collection of Animal Cell Cultures， 5 卩〇1^〇111；1<：(£€入(：€>^〇.85110505))，其為一不會產生免疫球 蛋白的鼠源骨髓癌細胞。 藉由電轉染法(electroporation)將去免疫性重鏈及輕鏈 表現載體之各種的組合（12種組合）共同轉染至NS0。表現gpt 基因之細胞株在含有10%胎牛血清，0.8 ug/ml mycophenolic 10 acid 及 250 ug/ml xanthine 之 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medmm(DMEM)中進行篩選。 藉由ELIS A定量由轉染的細胞株產生的人類IgG產量 ，挑選其中會分泌抗體的細胞株並放大培養。 放大表現去免疫性B4抗體之NS0。挑選抗體產量最高 15 的細胞株放大培養。並以ProSep A(Millipore，cat. No. 113112722)親合力層析管柱純化500 mi_i〇〇〇 ml培養基中 的去免疫性B4抗體。用〇·1 Μ甘胺酸(Glycine) pH 3.0洗提 ，中和後並以PBS透析。用過濾的方式使純化好的抗體無菌 並保存在4°C。以ELISA定出抗體濃度。 20 1〇. B4去免疫性抗體的rsCD4結合親合力 4種去免疫性B4重鏈結合3種去免疫性輕鏈之12種去免 疫性B4抗體與rsCD4結合力結果顯示於第9-11圖。 由去免疫性重鏈版本1結合去免疫性輕鏈版本1，2 ,或 3所構成之抗體與嵌合抗體比較結果，顯示與1*50〇4結合力 43 1325429 相當。 由去免疫性重鏈版本2，3或4結合去免疫性輕鏈版本1 或2所構成之抗體與嵌合蛋白比較，其結合力減低3倍。由 去免疫性重鏈版本2，3或4結合去免疫性輕鏈版本3所構成 5 之抗體與嵌合抗體比較顯示與rsCD4結合力減低5倍。 11.病毒中和性分析

病毒種株。A次型病毒分離株UG/92/029是由世界衛生 組織HIV分離及定性組織（WHO Network for HIV Isolation and Characterization)所獲得。次型C病毒分離株ZIM748是 10 由Stanford大學之D. Katzenstein，所贈。次型D病毒分離株 UG266與次型ESI病毒分離株TH32036是由U.S. Military HIV Research Program(Silver Spring，MD)所提供。次型E 病毒分離株1^ 32036是由沌八1〇(1^111，66化63(13，]\/1〇)之1. Bradac所贈。從病人分離之病毒株在PBMC中進行繼代培養 15 。除了一個MN樣品在PBMC中繼代培養之外，T細胞.|)1丨化 之HIV-1病毒分離株MN是在H9細胞中生長。

將NSO細胞所產生的B4去免疫性抗體進行HIV-1病毒 中和活性分析。MT-2微溶體分析法如（36)描述，除了以下 條件稍有不同，其中熱不活化血清是以50%高葡萄糖 2〇 DMEM其含15 %胎牛血清，抗生素，2%楚胺酿胺 (Glutamine)及碳酸氫鈉溶液（bicarbonate buffer)，加入50% 去纖維化的人類血清進行系列稀釋。而抗體對於HIV-1病毒 於mitogen-stimulated PBMC之中和力分析方法如（50)所描 述0 44 1325429 由NSO細胞所產生之去免疫性B4 IgGl之病毒中和力與 不加抗體的控制組比較其50% plaque inhibiti〇n。50〇/〇 Plaque inhibition的終端抗體濃度是由抗體稀釋濃度之内插 法所算出。比較4個重鏈變異株(VHv.1-4)，與去免疫化k鏈 5 版本WVKv·1)結合之4個去免疫性B4抗體，顯示有版本1重 鏈抗體對於所有的HI V -1病毒原始分離株有較高的中和力 .’接近鼠源B4單株抗體對抗HIV-1VL135，HIV-1ug〇29& HIV-1th〇36的活性（表一）0 去免疫性B4抗體對於τ細胞株馴化的HIV-1MN病毒無 10 效。去免疫性抗體包含k鏈版本2或3，其病毒中和力相較較 低。12個不同免疫性B4抗體，其中有著DIVHv. 1重鏈以及 DIVKv· 1之抗體對mv-i病毒原始分離株有較高的病毒中 和力，活性接近鼠源B4單株抗體。 例子5 15 穩定且高表達去免疫性B4抗體之CHO細胞株之建立 B4DIVHv. 1及B4DIVKv. 1分別被選為於CHO細胞中表 達之抗體重鏈及輕鏈。 12.細胞株 以CHO dhfr-之中國倉鼠卵巢細胞為生產級的抗體表 20 達系統，CHO dhfr-之中國倉鼠卵巢細胞由取自台灣食品工 業研究所之細胞及菌種保存中心（Culture Collection and Research Center(CCRC，60113)of Food Industry Research and Development Institute 5 Taiwan) ° 細胞培養在含10%透析過的胎牛血清(DFCS，Gibco cat 45 1325429 no. 26400—44) ' hypoxanthine及 thymidine(Gibco，cat no. 11067-03m)之Isocoves Modified Dulbecco’s Medium(IMDM ’ Sigma cat. No. 1-3390)。利用二經化葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase)做為放大及篩選的標識。藉由dhfr 5 抑制劑metrotrexate(MTX)的刺激，放大dhfr基因表現。 當dhfr基因被大量放大時，其他鄰近基因時常會一起被 放大。所以在每一回放大之後，經由篩選可篩得高產率的 細胞株。 13.載體建構 10 表現dhfr基因的載體；DHFR基因的cDNA乃利用 GENEAMP RNA PCR KIT(PERKIN ELMER PART NO. N808-0017)合成自NSO的細胞株。將合成的DHFR基因 cDNA以EcoRI限制酶切位放入在動物細胞表現載體 pSI(PROMEGA CAT.NO.E172A)中，位於 SV-40 增進子 15 (enhancer)與早期啟動子及SV-40終止子(terminator)中間。 B4DIVH.1重鏈表達載體：表現重組B4重鏈的DNA片 段是來自用DNA合成酶以pSVgpt B4IgG(第3圖）當作模版 所合成出來的。將炭合IgG(chimeric IgG)基因的cDNA利用 HinDIII和EcoRI限制酶切過之後，放入動物細胞表現載體 20 pcDNA3.1 neo(INVITROGEN ， CARLSBAD ， CA ， CAT.NO. V790-20)中位於CMVS V-40增進子與早期啟動子 後面，及BGH poly A訊號和轉錄終端子前面，以促進高表 現量及增加mRNA的穩定性。然後，以限制酶HinDIII和 BamHI切除崁合IgG基因的變異區，並接入B4DIVHV.1的變 46 1325429 異區而成為B4DIVHv.l重鏈表現載體（pcDNA3.1neo DelgG-S，第 13 圖）。 B4DIVH.1去-醣化重鏈表達載體：利用定點突變的技術 將IgGIFc中的N-醣化位置移除，已經被證實可以將IgGu〇 5 FctRI結合的能力、激發補體的能力，以及和補體中ciq 結合的能力去除。因此’去醣化及去免疫性的B4單株抗體 其導致CD4的細胞受損的免疫毒害可能性比醣化抗體少。

為了去除N端醣鏈，B4DIVH.1重鏈中的Asn297基因碼 ACC 以定點突變的技術（site direct mutagenesis PCR， 10 Invitrogen)被改為 His基因碼 CAC。

B4DIVH.1輕鏈表達載體：B4DIVH.1輕鏈全長由 DIVKv.l的變異區及人類的免疫球蛋白中輕鏈恆定區組成 。以PUC19-B4DIVH.1為模版利用DNA合成酶將DNA放大 複製DIVKv.l區域是；人類k鏈怪定區則是以B4崁合重組k 15 鏈pSVhyghuck為模版複製而來。B4DIVH.1全部輕鏈DNA 片段利用限制酶Hindlll和EcoRI切位被接入 pcDNA-zeo(Invitrogene cat ηο·ν860-20)，接入的位置介於 CMV增進子（enhancer)與早期啟動子及BGH poly A訊號和 轉錄终端子前面，以促進高表現量及增加mRNA的穩定性 20 。 同時表現dhfr和B4DIVH.1輕鏈的表達載體：同時擁 有dhfr基因和B4DIVH.1輕鍵的表現單元是由dhfr在前，k 輕鏈在後的方式建構而成。DHFR基因表現單元是以 pSI-dhfr當模版，用PCR方式放大表現而來。且從Bglll限 47 1325429 制酶切位轉殖進載體pcDNA3.1zeo B4DIVH.1(第15圖）。

14.表現B4抗體的卵巢母細胞 將表達重鏈的pcDNA3 · 1 zeoB4DIVHv. 1和表達DHFR和 輕鍵基因載體pcDNA3 · 1 zeoB4DIVkv. 1 /dhfr同時利用電轉 5 染法送入缺乏dhfr基因的CHO細胞，利用含有10%胎牛血清 及抗生素geneticin(GIBCO，CAT，NO. 10131-027)和 0·05 uM MTX(SIGMA，St. LOUIS，MO，Cat.no. M8047)及缺乏HT 補充的培養基中篩選有DHFR表現的細胞株，將表現DHFR 和重鏈基因的細胞株篩選出並放大培養。 10 15.利用MTX媒介DHFR基因放大的方式建立B4去免疫 性的高產量細胞株 利用漸進式增加MTX濃度的方式來提升DHFR和IgG 基因的放大，藉以提高去免疫性B4單株抗體的產量。將細 胞株培養在含MTX的培養基中，濃度逐量從〇.〇5 v Μ增加 15 到5 A Μ，且每個處理濃度持續約3至4週，在每個基因被放 大的循環之間，細胞株再一次被篩選以增加IgG的產量。

16利用單一細胞的篩選以建立穩定去免疫性B4高產量 細胞株 利用限制細胞數稀釋的方式來挑選產量最好的細胞株 20 。將細胞懸浮在選擇性培養基中，並稀釋成每200#1中含 有約0.1 ’ 0.5 ’和0.25個細胞濃度後接種在96孔盤中，每個 孔注入200//1，再一次選擇細胞株。將細胞培養約3至4週 後進行篩選’每個孔中取出10" 1培養基，利用ELISA的方 法來偵測人類IgG的表現量。經由此篩選過程獲得高產量細 48 1325429 胞株，並放大培養建立了低溫保存的細胞庫，這株細胞在 放大後IgG產$約為1 〇-2〇pg/細胞/天，這種產量已經由原來 最早的O.lpg/細胞/天被放大了 1〇〇到2〇〇倍了。 17以CHO細胞生產N-醣化抗體和N_去醋化抗體 5 將野生型重鏈基因及在第297號胺基酸由Asn變成His 的突變種基因轉染入CHO細胞中並加以放大培養。抗體由 500至1000ml培養末期的細胞培養液以pr〇sep a親和性的層 析管柱（Millipore Cat.n〇_113112722)加以純化。並以 O.lmol 濃度的甘胺酸(glycine)及ρΗ3·0的緩衝液析出抗體後以磷酸 10鹽緩衝液加以中和及透析純化後的抗體，利用過滤達到無 菌並儲存在4°C ’以ELISA方法偵測抗體的濃度。 18利用含有SDS的瓊膠來確認N醣化的情形 將野生型重鏈基因及在第297號胺基酸由Asn變成His 的抗體純化出來，以N去St酶處理過後，利用含有；§DS的 15 的電泳膠並以Commassie blue及醋化蛋白染色後加以 分析（Gelcode Glycoprotein Stain，cat.no.24562，Pierce ,Rockford Illinois) ° 在第297號胺基酸由Asn變成His的抗體比醣化去免疫 的抗體在膠中擁有較塊的游動能力，當N去醣化酵素f處理 20 過之後，對於Asn突變抗體在膠中游動能力及醣蛋白染色並 沒有影響，但是對野生型抗體卻有加速在膠中游動能力及 降低醣蛋白的染色情形。N去醣酶處理過後（第16A圖），野 生和Asn突變抗體在膠中游動能力及醣蛋白染色幾乎一樣（ 第16B圖），此結果確認Asn突變抗體的去醣化情況。 49 1325429 19由CHO細胞生產的去免疫性B4抗體病毒中和力的 測試 MT-2中和病毒能力的測試法和之前陳述的一樣。由 CHO細胞生產的去免疫性B4抗體，以含有抗體和未含抗體 5比較下在降低百分之50的溶菌斑其所需抗體濃度（表3)定義 出其中和病毒能力’並由一系列稀釋抗體中計算其降低百 分之50的溶菌斑所需抗體濃度。 例子6 酬化去免疫性B4抗體CHO細胞株成為無血清的懸浮培養 10 2 0懸浮細胞培養的馴化 在T75規格的培養瓶中長滿會去免疫性b4抗體CH0細 胞’利用蛋白水解酶將細胞懸浮化並種入5〇 mlIMDM(IMDM ’ Sigma ’ cat. no. 1-3390)含有 1〇%透析過的 胎牛血清(DFCS，Gibco cat. no. 26400-044)培養液的旋轉培 15 養瓶中（Spinner Flask，Bellco，Vineland，NJ)，旋轉培養瓶 培養是由磁力控制旋轉，並置於和培養單層貼壁細胞一樣 溼度、溫度及二氧化碳濃度的培養箱中培養。 每二至三天’利用加入新鮮培養基將活著的細胞數調 整至每ml約1-3χ105個細胞，緊密監視細胞生長速度和細胞 20 存活率數週。 21馴化細胞至無血清培養基 一但懸浮細胞培養穩定之後，細胞將被離心並打散接 種至無血清培養基（SFMII,Gibco BRL ’ Rockville，MD，cat no. 31033-020)。每2至3天利用加入新鮮培養基，將活著的 50 1325429 細胞數調整至每ml約1_3χ ι〇5個細胞。緊密監視細胞生長速 度和細胞存活率數週。 22去免疫性Β4抗體CHO細胞株馴化到無血清的懸浮細 胞後的抗體生產 5 將已馴化成無血清的懸浮培的去免疫性Β4抗體CHO細

胞。以每宅升2>< 1〇5個細胞濃度種在含有Gibco SFMII培養 基的100 ml旋轉培養瓶中（Benc0)，當細胞濃度達到每毫升6 X 105個細胞時將培養細胞轉移到250至500毫升的旋轉培 養瓶中’並一系列慢慢將培養體積放大。抗體由5〇〇⑹的 10培養細胞液中利用prosep A親和性的層析管柱（Millipore cat.no. 113112722)加以純化，抗體由含有o.i mol濃度的甘胺 酸(glycine)及pH3.0的緩衝液析出，並用磷酸鹽緩衝液加以 中和跟透析。純化後的抗體利用過濾達到無菌並儲存在 ，利用ELISA的方法偵測抗體的濃度。 15 例子7

CHO細胞株生產的去免疫性B4抗體在補體固定力分析 補體消耗測試被利用於評估鼠源B 4抗體和去免疫性抗 體之補體固定力。此測試是需要B4單株抗體對新鮮準備且 含有人類CD4複合體於在細胞表面的CD4+細胞進行結合， 20 這個結合可使抗體和一部分已知量的兔子補體結合，接著 以敏感化的羊红血球細胞分析在反應中剩下的補體量。 此分析試驗以來自正常捐獻者靜脈中抽出以抗凝血因 子處理過的週邊血中含有CD4+複合體的人類細胞來進行， 全血在50 ml的離心管（購自NUNC cat. no.373660)中以等倍 51 1325429 體積不含血清RPMI-1640(Gibco ’ cat· no. 21870-076)培養基 加以稀釋，10.0 ml稀釋過的全血隨後加在9.0毫升的Ficoll HagueTM Plus(購自 Amersham Biosciences，cat.no. 17-1440-02)上面。 5 利用在室溫將全血以每分鐘2000轉離心30分鐘後，達

到分離淋巴球效果，在Ficoll hagueTM内面的buffy外層為週 邊血單核球，其與稀釋的血清一起被收集起來。利用pH7.6 含有鎮定劑（Veronal buffer)的緩衝液洗三次，此緩衝液由 9.1mM sodium barbital(merck cat.no.1.06318.0100) ； 15.6 10 mM barbital(Merck » cat.no. 1.00276.0100) ； 0.73 M sodium chloride ; 2.5 mM magnesium chloride ; 2.5 mM calcium chloride所組成。週邊血單核球(PBMC)隨即以17.0x l〇7/ml 個細胞懸浮在同樣的鎮定劑緩衝液中。

補體分析步驟，首先於準備好裝有200# 1共3.6χ 106 15個PBMC細胞的微量離心管中加入3Qμ 1之各個不同的純化 單株抗體。這些混合物將在室溫中培養兩個小時。9〇ul的 兔子補體(Rockland ’ cat· no. C304-0010)，先以含有鎮定劑 緩衝液稀釋16倍’再加入反應混合物中。補體的消耗將在 最終產物於37°C培養時被啟動。準備致敏化的羊紅血球細 20胞’取3_0 ml丨〇〇%的羊紅血球細胞（購自Rockland，cat .no. R406)’以含有ι〇〇βΐ抗體血清（購自R〇ddand cat no. 113_4139)及含有鎮定劑的緩衝液在37°C下洗兩次，每次30 分鐘。 最後直接加入致敏化羊紅血球（s RB c)懸浮細胞（成份 52 1325429 以10.0 ml含有鎮定劑的缓衝液組成），所有的反應混合物將 在37°C下培養1個小時後，反應的管子以微量離心機在5〇〇〇 轉離心一分鐘將完整的羊紅血球細胞(SRBC)離心下來以測 定補體在反應混合物中殘存的量。 羊紅血球細胞（S RB C )溶解是以利用15 0 " 1的上清液分 管自母一官反應管中’置入96孔盤中（Becton Dickinson，cat. ηο·353915) ’以波長540nm的吸收光波加以偵測讀值。結果 以相對於控制組（未處理單株抗體）細胞溶解的百分比來計 算（第17圖）。 10 例子8 去免疫性抗體的免疫力分析 利用體外培養人類PBMC系統測試單株抗體(如B4單株 抗體’ DIVHvl/VKl 7號單株抗體，或是DIVHvl/VKl 16 號單株抗體）’對人類PBMC細胞的免疫刺激性，在這個測 15 試中所使用到的P B M C分離和以上範例7中所陳述的方法一 樣。 體外培養的P B M C細胞以2 · 5 X 106個細胞於每孔含有 1.5ml添加抗生素Penicillin及Streptomycin(Gibco，cat. no. 10378-016)和胎牛血清（Gibco，cat. no. 10099141)的 20 RPMI-164完全培養基的 24孔盤（Corning，cat. no.3254)中培 養。加入10.0# g/ml的個別單株抗體至PBMC細胞培養中。 以加入2.0/ig/ml的 Concanavalin A(Sigma，cat. no. C5275) 或10.0"邑/1111的？〇让6\¥6€(11]111;〇经611(81§11^，〇3【.11〇.1^-8777) ，作為正面控制組而以未加入mitogen及單株抗體的當作負 53 1325429 面控制組，每一組不同測試的刺激條件均重複兩組，在第3 ，5，7，9天時收集培養上清液並存放在_7(rc直到被用來 檢驗。 利用賭自eBioscience(USA)的細胞激素試驗組來測試 5 在抗原或mitogen刺激後的人類PBMC細胞培養的上清液中

’是否含有 Interleukin-2(IL-2)，Interleukin-4(IL-4)， Interleukin-lO(IL-lO)，干擾素gamma(IFN-r)，跟腫瘤細胞溶 解因子（TNF-a)。這些細胞激素試驗組分別是乩-]…^ no.88-7026-22) ； IL-4(cat. no. 88-7046-22) ； IL-10(cat. no. 10 88-7106-22); IFN-r (cat. no. 88-7316-22);跟TNF-a (cat. no. 88-7346-22)。 此s式驗是按照廠商提供的步驟來執行，結果顯示在表4。 例子9 去免疫性抗體的臨床評估 15 去免疫性單株抗體如DH1DK1#16或DH1DK1#7將在人

類單一劑量及劑量試驗中研究其安全性、免疫刺激性、藥 物動力及靜脈注射的效力。此試驗使用兩組已有兩次進行 HAART治療失敗經驗的愛滋病人，每一組有兩人。此次試 驗沒有只給安慰劑的組別，第一和第二組是分別施與相當 20 1 mg/kg跟 5 mg/kg DH1DK1NS0#16 或 DH1DK1NS0#7 的 抗體，在第0天施以大劑量的靜脈注射。 血液及血清的樣品在第零天注射前及大約注射後10分 鐘及第1和12小時後收集起來，隨後血液跟血清在24跟48小 時及3、7、14、21、28、35、42、49、56天被收集起來。 54 1325429 女全性則疋檢測生理功能，血液化學、血球細胞計數 跟副作用的紀錄，每週間隔的血樣品以免疫螢光化學分析 淋巴球表面標的物的方法加以分析其免疫抑制力。 已有驗證過的方法檢驗以下的標的物：CD3/CD4， 5 CD3/CD8 ’ CD14/CD45，跟 HTC 嵌合的抗人類 IgGl(anti-human IgGl-FITC)。DIH1DK1#7 或DIH1DK1#16 於血漿的量在每一次取血後，利用酵素螢光免疫方式測試 得知。使用rsCD4為免疫接受器的固相來作為藥物動力的偵 測。免疫刺激性是以利用ELISA方法分析血清中對抗 10 DIH1DK1#7或DIH1DK1#16抗體的抗體含量的程度。 對於有效性試驗’利用定量的RT-PCR偵測每一週愛滋 病毒RNA含量。 例子10 在轉殖基因植物的生產B4去免疫性抗體 以轉殖基因植物生產去免疫性抗體是一種較經濟的方 法。煙草（％^仏仙彷1^叫111)，一種雙子葉植物，可利用根 瘤桿菌中轉殖帶有去免疫性及去If化的重鏈及輕鏈的7號 cDNA質體，是一種有用的生產B4去免疫性抗體的植物生物 反應器。 利用專一性酵素Hindlll和EcoRI由載體pdDNA3.1 (+)Neo-DeIgl(B4DIVHv_l)-S(第13圖）上切下帶有完整表現 去免疫性抗體DIH1DK1#7的重鏈cDNA，其包含去醣化 IgG 1 CH，B4DIVHv. 1 VH ’跟前導序列。另一方面利用專一 性酵素Hindlll和EcoRI由載體pcDNA3」⑴ 55 1325429

Zeo-HUK(B4DlVKv· 1)-S(第14圖）上切下帶有完整表現糾去 免疫性抗體輕鏈的k cDNA，其包含人類k &，B4 divj^^ vK，跟前導序列。將表現免疫球蛋白鏈的eDNA片段被接入 PMON53G，此«是-個包含花椰菜鑲嵌病毒说啟動子 5 在植物中持續表現的載體。 這個重組載體將被送入大腸桿gDH5_a而轉染過的 大腸桿菌將利用有放射性的PCR產物來篩選免疫球蛋白鏈 cDNA存在與否轉化成功的轉殖載體將被引入根瘤菌中， 利用帶有重組基因的根瘤菌培養液接種在煙草植物的葉面 10上，從轉殖基因植物的細胞重新建立莖和根植株。 萃取葉片並以酵素免疫螢光方式偵測人類的重鏈和輕 鏈表現，將那些表現重鏈和表現輕鏈的植物交叉受粉，這 些步驟已經在(52)陳述過了。 萃取葉片並以酵素免疫螢光方式偵測有完整表現去免 15疫性抗體DIH1DK1NS0#7的轉殖基因植物，選出表現7號抗 體的殖株並萃取抗體，測量其rsCD4結合力跟病毒中和力。 在例子4已經陳述作rs c D4結合力跟病毒中和力方法。 另一個選擇，玉蜀黍（Zea mays)，一種單子葉植物， 更勝於雙子葉植物，常被用於改良轉殖基因植物產量和穩 20 疋度°此植物特別有利於seed-storage promoter於特定之在 玉米内胚層組織表現。 玉蜀黍蛋白基因的啟動子對於這種特定之在玉米内胚 層組織表現效果很好。玉蜀黍蛋白是一種儲存蛋白，它是 合成發生在發展玉蜀黍内胚層時，玉蜀黍蛋白基因的啟動 56 1325429 子被提南調控直到穀粒成熟。依據此情形，分別可從 pcDNA3.1 (+) Neo-Delgl (B4DIVHv.l) _ s (第 13 圖）和 pcDNA3.1 (+) Zeo-HuK (B4DIVKv.l)- s (第 14圖）切下表現 去免疫性抗體DIH1DK1#7的重鍵和k輕鏈的CDNA。 5 這個cDNA片段將被接入帶有玉蜀黍蛋白基因啟動子 跟選擇標識蛋白如發光酶的植物轉殖載體中。這個重組载 體將送入大腸桿菌中，並篩選免疫球蛋白cDNA的存在。利 用粒子轟擊的方式送入載體致年輕的玉蜀黍種子中。粒子 準備、DNA包覆’以PDS1000/He放射元素轟擊（Bi〇_Rad 10 Laboratories ’ Hercules CA)，並利用螢光計偵測轉染過的玉 蜀黍的蛋白萃取物的方法如（55)所述。 個別轉殖的基因玉蜀黍來自正反應之植胚並培育至成 熟。隨後做交叉受粉產生可生產完整去免疫性B4抗體的植 株，去免疫性抗體的選擇跟特徵跟之前所陳述的相同。 15 20 57 1325429 表1 由NSO細胞產生的去免疫性B4抗體 5 (DIVHV.1-4/VKV.1)的中和力 HIV-1病毒 分離株 Clade B4抗體 50%抑制效時之抗 體濃度（Kg/ml) VL135 (PBL) B DIVHv.l/VKv.l 0.21 DIVHv.2/VKv.l 0.53 DIVHv.3/VKv.l 0.26 DIVHv.4/VKv.l 0.26 murine mAb B4 0.16 ZIM748 (PBL) C DIVHv.l/VKv.l 0.45 DIVHv.2/VKv.l 0.63 DIVHv.3/VKv.l 0.42 DIVHv.4/VKv.l 0.28 murine mAb B4 0.21 UG029 (PBL) A DIVHv.l/VKv.l 0.47 DIVHv.2/VKv.l 0.79 DIVHv.3/VKv.l 0.63 DIVHv.4/VKv.l 0.35 murine mAb B4 0.44 UG046 (PBL) D DIVHv.l/VKv.l 2.10 DIVHv.2/VKv.l 0.98 DIVHv.3/VKv.l 0.99 DIVHv.4/VKv.l 1.10 murine mAb B4 0.40 UG266 (PBL) D DIVHv.l/VKv.l 0.82 DIVHv.2/VKv.l 1.20 DIVHv.3/VKv.l 2.20 DIVHv.4/VKv.l 7.00 murine mAb B4 0.40 TH036 (PBL) E DIVHv.l/VKv.l 0.31 DIVHv.2/VKv.l 0.50 DIVHv.3/VKv.l 0.58 DIVHv.4/VKv.l 0.35 murine mAb B4 0.25 MN (H9 cells) B DIVHv.l/VKv.l >100 DIVHv.2/VKv.l >100 DIVHv.3/VKv.l >100 DIVHv.4/VKv.l >100 58 murine mAb B4 14 1325429 表2 由NSO細胞產生的去免疫性B4抗體 (DIVHV.1-4/VKV.2-3)的中和力 HIV-1病毒 分離株 Clade B4抗體 50%抑制效時之抗體 濃度(pg/ml) DIVHv.l/VKv.2 0.24 DIVHv.2/VKv.2 0.23 DIVHv,3/VKv,2 0.35 VL135 B DIVHv.4/VKv.2 0.30 (PBL) DIVHv.l/VKv.3 0.39 DIVHv.2/VKv.3 0.67 DIVHv.3/VKv.3 0.62 DIVHv.4/VKv.3 0.48 murine mAb B4 0.17 DIVHv.l/VKv.2 0.73 DIVHv.2/VKv.2 0.73 DIVHv.3/VKv.2 0.92 UG029 A DIVHv.4/VKv.2 0.48 (PBL) DIVHv.l/VKv.3 1.00 DIVHv.2/VKv.3 1.20 DIVHv.3/VKv.3 1.10 DIVHv.4/VKv.3 1.10 murine mAb B4 0.28 DIVHv.l/VKv.2 0.51 DIVHv.2/VKv.2 0.63 DIVHv.3/VKv.2 0.70 TH036 E DIVHv.4/VKv.2 0.32 (PBL) DIVHv.l/VKv.3 0.77 DIVHv.2/VKv.3 0.62 DIVHv.3/VKv.3 0.44 DrVHv.4/VKv.3 0.63 murine mAb B4 0.24 59 表3. 由CHO細胞(7號及21號選殖株)產生的去免疫性B4抗體 (DIVHV.1/VKV.1)的中和力 HIV-1病毒 分離株 Clade B4抗體 50%抑制效時之抗 體濃度(pg/ml) U. , — UG029 A DIVHv.l/VKv.l #7 0.25 DIVHv.l/VKv.l #21 0.30 murine mAb B4 0.31 1 · ··»' ^ 23135 B DIVHv.l/VKv.l #7 0.032 DIVHv.l/VKv.l #21 0.089 murine mAb B4 0.12 ZA/98/009 C DIVHv.l/VKv.l #7 0.022 DIVHv.l/VKv.l #21 0.015 murine mAb B4 0.033 UG046 D DIVHv.l/VKv.l #7 0.22 DIVHv.l/VKv.l #21 0.68 murine mAb B4 0.43 TH036 E DIVHv.l/VKv.l #7 0.22 DIVHv.l/VKv.l #21 0.68 murine mAb B4 0.43 0.021 CM235 E DIVHv.l/VKv.l #7 DIVHv.l/VKv.l #21 0.022 murine mAb B4 0.022 1325429 表4 B4單株抗體及其去免疫性抗體在體外（in vitro)所引發的 細胞激素(cytokine)釋放反應 培養時所加之抗原 2 x 106 PBMC培養所產生之細月 包激素之濃度(ng/ml) IFN- 7 IL-2 TNF-a IL-4 IL-10 PWM >5.0 >5.0 0.43 BDLd >0.93 B4a BDLd BDLd 0.36 BDLd 0.68 DHlDKlCHO#16b BDLd BDLd BDLd BDLd BDLd DH1DK1CH0#7C BDLd BDLd BDLd BDLd BDLd 60 1325429 b & 10.0 pg/mld BDL，低於 L圖式《簡翠~彭^明】 5 第1圖係為鼠源單株抗體B4重鏈的DNA和胺基酸序列（ 序列辨識編號：1 and 2)以及限制酵素圖谱。 第2圖係為鼠源單株抗體B4輕鍵的DNA和胺基酸序列（ 序列辨識編號：3 and 4)以及限制酵素圖譜。

第3圖係為含插入重鏈變異區的重鏈表達載體 10 pSVgptHuIgGl，用於NS0細胞表現鼠源單株抗體财重鏈變 異區與人類重鏈CH1融合之chimeric IgGl重鏈。Ig enh是重 鏈加強子。 第4圖係為含插入輕鏈變異區的輕鏈表達載體 pSVhygHuK ’用於NS0細胞表現IL源單株抗體B4輕鏈變異 15 區與人類輕鏈CH1融合之chimeric IgGl輕鏈。Ig enh和 Kappa enh分別是重鏈及輕鏈加強子。

第5圖係為鼠源B4重鏈變異區B4MoVH(序列辨識編號 :2)，以及四個不同的去免疫性重鏈變異區B4DIVHv.1-v.4( 序列辨識編號：5-8)胺基酸序列的比較，框出的區域表示與 20 B4MoVH胺基酸序列不一樣的位置。 第6圖係為鼠源B4輕鏈變異區B4MoVK(序列辨識編號 :4)，以及三個不同的去免疫性輕鏈變異區B4DIVKv.1-v.3( 序列辨識編號：9-11)胺基酸序列的比較，框出的區域表示 與B4MoVK胺基酸序列不一樣的位置。 25 第7圖係為鼠源B4重鏈變異區B4M〇VH(序列辨識編號 61 1325429 :1)，以及四個不同的去免疫重鏈變異區B4DIVHv.1-v.4( 序列辨識編號：12-15)核苷酸序列的比較’粗體及劃線表示 與B4MoVH核苷酸序列不一樣的位置。 第8圖係為鼠源B4重鏈變異區B4MoVK(序列辨識編號 5 ·· 3)，以及三個不同的去免疫重鏈變異區B4DIVKv.l-v.3( 序列辨識編號：16-18)核苷酸序列的比較，粗體及劃線表示 與B4MoVK核苷酸序列不一樣的位置。

第9圖係為B4 chimeric抗體及DIVH1/VK1-3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 10 第10圖係為B4 chimeric抗體及DIVH2/VK1-3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 第11圖係為B4 chimeric抗體及DIVH3/VK1-3去免疫抗 體與重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親和力。 第12圖係為表達二羥化葉酸還原酶基因載體： 15 pSI-DHFR。

第13圖係為含B4DIVHV.1和人類重鏈恆定區之去免疫 重鏈表達載體，pcDNA3.1(+)Neo-DeIgl-S，用於二經化葉 酸還原酶的細胞(CHO dhf〇表現去免疫重鏈。 第14圖係為含B4DIVKv. 1和人類輕鏈恆定區之去免疫 20輕鏈表現載體，pcDNA3.1Zeo-HuK，用於二羥化葉酸還原 酶的細胞(CHO dhfr·)表現去免疫輕鏈。 第15圖係為表現去免疫輕鏈和二羥化葉酸還原酶基因 的載體，pSI-DHFR/ pcDNA3.1 zeo-HuK(DDllN)含 B4DIVKv.l及人類輕鏈恆定區，用於二羥化葉酸還原酶的 62 1325429 細胞(CH〇 dhf〇共同表現去免疫輕鏈以及二經化葉酸還原 酶基因。 >' 、 第16圖係為用醣解酶作用造成分 τ Ϊ變化的 SDS-PAGE分析（Coomassie Blue staining)。 5 第17圖係為補體固定試驗，比較鼠源單株抗體B4和去 免疫性B4#16及#7抗體補體固定力。p values分別為〇 〇7和 0.0001 ;分析方法是用 Student’s t-test。 第18圖係為鼠源單株抗體B4和選殖株#7，#16及#21互 補決定區（CDRs)cDNA及胺基酸序列。 ® 10 【圖式之主要元件代表符號表】 (無）

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Claims (1)

1325429 第093100896號專利申請案申請專 利範圍修正本 修正日期：99年2月’ 公告本 拾、申請專利範圍： 1. 一種去免疫性重組單株 1丨夂止 #2月〇4日4充 •抗•娃，該抗體係七 3以下核苦酸之融 合體(fusion)所表現：一編碼一鼠源B4抗體之去免疫性1^ 片段的核苷酸，該鼠源B4抗體之去免疫性Fv片段包含VH 5 及變異鏈以及該鼠源B4抗體變異鏈之互補決定區序列 辨識編號·· 20、22、24、26、28及30 ;以及一編碼人類免 疫球蛋白恆定區之核苷酸；其中該鼠源B4抗體之去免疫性 Fv片段係藉由以下步驟以去免疫性(deiinmunize):將出自 該鼠源B4抗體Fv區域(domain)之良源VH重鍵替換成編碼 10 一去免疫性的鼠源B4抗體VH鏈之一核苷酸序列，且該去 免疫性的鼠源B4抗體VH鏈之核苷酸序列係選自於由 DIVHv.l(序列辨識編號：5)、DIVHv.2(序列辨識編號：6) 、DIVHv.3(序列辨識編號：7)及DIVHv.4(序列辨識編號： 8)所構成之群組；及將出自該鼠源B4抗體Fv區域之VK鏈替 15 換成編碼一去免疫性的鼠源B4抗體VK鏈之一核苷酸序列

，且該去免疫性的鼠源B4抗體VK鏈之核苷酸序列係選自於 由DIVKv_l(序列辨識編號：9)、DIVKv.2(序列辨識編號： 10)及DIVKv.3(序列辨識編號：11)所構成之群組。 2. —種重組宿主細胞，其分泌如申請專利範圍第1項之去 20 免疫性單株抗體。 3. 如申請專利範圍第1項之去免疫性重組單株抗體，其中 該人類免疫球蛋白恆定區之Asn297 ’係藉由將Asn之AAC 密碼子替換成His之CAC密碼子以被N-去畴化。 4. 一種去免疫性單株抗體’係包含重變異鏈序列辨識編號 1325429 :5及輕變異鏈序列辨識編號：9 β 5 5. —種去免疫性去醣化單株抗體，係包含重變異鏈序列辨 識編號：5及輕變異鏈序列辨識編號：9，且其中該人類 免疫球蛋白恆定區之八如297，係藉由將Asn之AAC密碼子 替換成His之CAC密碼子以被N_去醣化。 6. 種重組伤主細胞，其分泌如申請專利範圍第3項之去

免疫性去醣化單株抗體。 7·如申請專利範圍第1項之去免祕單株抗體，其中該人 類免疫球蛋白係IgGl。 10 8. 15 請專職_卜3至5及7射任—項之抗體於 二 製造-圍二:3至5及7項中任-項之抗體於 之HIV感染。、 '"樂物係用於預防或治療人類體内

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