TWI307360B - Process for constructing strain having compactin hydroxylation ability - Google Patents

Description

1307360

* I 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於基於微生物產生普伐他、汀之方法及組人 物。本發明之組合物包括微生物之新穎菌株，其可有效羥 基化康巴十（ML-23 6 B)導致普伐他汀之產生。詳古之本 發明之微生物經遺傳設計以表現細胞色素p_45〇及鐵氧化 還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白兩者。本發明另外係 關於該等微生物在經設計以產生普伐他汀之方法中之用 途，普伐他汀用於諸如高膽固醇血症及高脂質血症之疾病 之治療。 【先前技術】 普伐他>丁係HMG-CoA還原酶（3-羥基-3-甲基戊二醯基輔 酶A還原酶）之抑制劑，HMG_c〇A還原酶係膽固醇生物合成 中之關鍵酶。該酶顯著減少血漿膽固醇及脂質含量且藉此 在问膽固醇血症及高脂質血症之治療中具有重要藥理地 私位。[Serizawa等人，j. Antibiot·，36 : 887-891 (1983);

Senzawa等人 ’ j· Antibi〇i，36 : 918_92〇 (1983) ; Sedzawa 等人，J. Antibiot.，36:604-607 (1983); Tsujita等人，Biochim. Biophys. Acta, 877 : 50-60 (1986) ; Arai等人，Ann. Rep. Sankyo Res. Lab·，40 : 1-38 (1988);及 Koga等人，Biochim.

Biophys. Acta, IO45 ： 115-J20 (1990).] 普伐他>'丁藉由]VIL-236B(康巴亭）鈉之微生物羥基化獲 得’ ML-236 B納係由絲狀真菌、桔青黴菌產生之物質。如 在多種專利中所述，該羥基化可由多種不同種屬的真菌（例 106947.doc 1307360

I 如毛黴菌根黴菌（Mucor Rhizopus)、 頭黴菌 (Syncephalastrum)、小克銀漢徵菌（Cunninghamella)、被孢 黴菌（Mortierella))及細菌（例如奴卡菌（Nocardia)、馬杜拉放 • 線菌（Actinomadura)及鏈黴菌（Streptomyces))於不同程度上 實現。[美國專利第 5，179,013、4,448,979、4,346,227、 4,537,859、6,566，120、6,750,366 號；加拿大專利第 1，150，170、1，186,647號；日本專利第58-10572號；及歐洲 $ 專利第0605230號] 由在嗜碳桿菌鏈黴菌中發現之細胞色素p_45〇sca單加氧 酶系統催化之羥基化發生於ML-236B之6位。[Matsuoka等 人，Eur. J. Biochem·，184 : 707-713 (1989);及 Serizawa等 人，Biochimica et Biophysica Acta，1084 : 35-40 (1991)·] 細胞色素P-450sca特徵為以三種形式出現：p_45〇sca i、 P_450sca_2及p-450sca_3 ’根據美國專利第5，179,〇13號其適用 於羥基化方法。 • Serizawa等人從嗜碳桿菌鏈黴菌（Strept〇myces carbophilus)選殖出編碼P_45〇sca 2iDNA。[日本未審查專利 公開案第 6-70780號；及 Watanabe等人，Gene，163 : 8 1-85 (1995).]將2.8 kb DNA插入物與p_45〇sca.2基因之5，_非編碼 • 區域之1 kbP部分一起選殖入多複本質體PIJ702並用於轉形 青紫鏈黴菌（Streptomyces lividans)TK21。經轉形之青紫鏈 黴菌TK2 1將ML-23 6B轉化為普伐他汀快於嗜碳桿菌鏈黴 菌。參閱 Watanabe，1_ 等人，Gene 163 : 81_85 (1995)。

Serizawa與Matsuoka從嗜碳桿菌鏈黴菌純化出nadH_細 106947.doc 1307360 ! 胞色素-P-450-還原酶。彼等使用純化之p_45〇㈣蛋白證明於 純化之黃素蛋白（NADH、細胞色素冬45〇_還原酶）、ΝΑΜ 及〇2存在下活體外經基化活性。彼等揭示p_45〇s』nadh_ 細胞色素-P-450-還原酶再建活體外羧基化活性且未獲得在 嗜碳桿菌鏈黴菌中存在鐵·硫蛋白的任何證據。基於該等發 現，3以^〜3與撾以如〇]^將15_45〇心細胞色素系統歸類為類 似於在真核細胞之微粒體細胞色素系統中發現之彼等的一 丨種兩組伤式系統’其不需要鐵硫蛋白。⑽與 Matsuoka, Biochem et Biophysica Acta, 1084： 35-40 (1991).]

Watanabe等人揭示編碼Cytp_45〇sca 2之基因係經選殖。 該基因具有1233 bp之開放讀架，編碼41〇個胺基酸蛋白。 [Watanabe等人，Gene，163 : 81-85 (1995).]

Watanabe等人揭示P_45〇sca之表現經受轉錄之基質誘 導，意即，發現ML-236B及苯巴比妥（phen〇barbital)使ρ·45〇 之表現增強多達30倍。此由北方墨點法證實，其發現當缺 乏ML-236B時無轉錄，但其發現當存在厘^^紐時有三種 轉錄物。當存在基質時轉錄之水平經六個小時的時間增加 到最大率。5區域之£>να序列係公開的，其編碼類調節因 子蛋白及啓動子序列。[Watanabe等人，Gene 21〇，Μ、〗16 (1998).] 在嗜碳桿菌鏈黴菌中編碼細胞色素p_45〇sca_2之基因之1 kbp長度之5’-非編碼區域具有轉錄啓動子活性，該區域係基 吳可誘導的。當1 kbP區域變短時，轉錄啓動子使蛋白在合 適之表現系統中無需加以誘導而顯著表現。[美國專利第 106947.doc 13.07360 5,830,695 號] 本發明係基於發現編碼鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原 蛋白之蛋白之基因位於細胞色素P-450基因之τα , 土 u又下游，且如圖 3中所述與由Serizawa與Matsuoka提出之二組份系統比較 P-45 0sca細胞色素系統為三組份系統。 【發明内容】 效且高效的方法。 本發明之另一目標係使用細胞色素p_45〇與鐵氧化還」 蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質之共同表現將康巴亭4 化為普伐他·; 丁。 本發明包含可减化康巴亭（ML_236B)並藉此產生普4 他、;丁之新穎微生物。本發明之微生物係經遺傳工程處^ 表現細胞色素P-450及鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原S 白之蛋白質兩者。本發明係基於發現細胞色素p_45〇鱼鐵專 化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質一起之 導致普伐他汀之產生^ =另外包含構築遺傳修飾之微生物之方法 2有 ㈣化能力，該等方法包含用—或多種質體 =體轉形宿主細胞，該㈣築體包含啓動子及編碼細胞 :素-50與鐵氧化還原蛋白或類鐵 質之核醆序列。 反㈡惑蛋白 J1T另—實施例包含使用此項技術中已知之發酵技 術產生普伐他汀之方 <毛酵技 匕3在一定條件下將本發明之遺 106947.doc .1307360

I 傳修飾之微生物培養於含有ML_236B之培養基，i中在咳 等條件下細胞色素P-450及鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化： 原蛋白之蛋白質之表現導致ML_236B催化轉化為普伐他 在本發明之另—態樣中，本方法可料包含自培養基回 收普伐他江及其在治療與膽固醇生物合成相關之病症⑽ 如高膽固醇血症及高脂質血症）十之用途。 本發明亦包含編碼赫爾維第氏鏈黴菌（strept⑽乂… helvaticus)之鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白 質之新賴核酸分子（本文稱為弗德希（fdxshe))。已發現該核 酸分子對應於位於細胞色素P_45G開放讀架下游之188個驗 基對序列。 本發明亦包含含有該核酸分子之載體。 本發明亦包含由弗德希編碼之新穎蛋白質及使用該載體 以產生彼之方法。 本發明之以上及其它目標、特徵及優點將自以下說明而 更好地理解。 【實施方式】 本文描述之内容係發現經遺傳工程處理之微生物中，細 胞色素IM50與鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白質之 蛋白之共同表現導致ml_236b (康巴亭）之經基化以形成普 伐他/T。本發明在下文詳細描述之内容係關於該等微生物 及其在普伐他汀之產生中之用途，普伐他汀用於治療與膽 固酵生物合成相關之病症。該等病症包括（但不限於）高膽固 106947.doc 13.073.60 醇血症或高脂質血症。 如本文所用，ML-236B包括ML-236及其鹽《在較佳實施 例中該ML-236為ML-236鈉。如本文所用，普伐他汀係指普 伐他汀及其鹽。在較佳實施例中，該普伐他汀係普伐他汀 納。 本發明包含用一或多種表現載體轉形之微生物，該或該 等表現載體可編碼細胞色素ρ·45〇及鐵氧化還原蛋白或類 鐵氧化還原蛋白之蛋白質。在本發明之實施中使用之表現 載體之選擇將視待轉形之微生物之類型而定。例如，複製、 轉錄調節、轉擇控制等等需要之表現載體序列必需與經選 擇以轉形之微生物相容。細菌表現載體包括（ =體崎或—且包括彼等適用於該： (僅+例而言，例如放線菌、大腸埃希 =實施例中，使用諸如»pWHM_3之放、_容之表現 雖然本發明之表現載體 現所需者之外的並它特1 ^ 宿主中表 適用的。該等標準内建式選擇標準可能係 ^匕括彼等藉以質體授 現及轉形選擇性夕姓ω 4伯王4 #诸如表 特性，以使表型加以修飾。人 性標記，意即彼等將特定表型授予宿部。適之選擇 性標記基因，例士分 匕括该等抗藥 四環素或氯黴素之抗性 素私卞月黴素、 選擇性標記。 ，…、，應瞭解可使用多種其它 W6947.doc 1307360 熟習此項技術者熟知之方法可用於 表現载體含有編石馬細胞色素p韻之序列及/ =體’該等 還原蛋白或類鐵备儿思 次、扁喝鐵氧化 玄曰次類鐵魏還原蛋白之蛋白質之 錄及轉譯控制序列。 、§的轉 色素鐵氧化體’將包含編喝細胞 之心 乳化遇原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質 乂 -夂之DNA片段與適當的轉錄及轉譯控制序列、 鳇广載體破等轉錄控制序列包括(例如)啓動子序列。兮等 控制序列包括(例如)核糖體結合序列。在本發明之：施 :中’將編碼細胞色素㈣之序列及/或編碼鐵氧化還；蛋 或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質之序列插入單载體。或 者：可將編碼序列插入分離載體，㈣可將該等載體共同 轉形入宿主細胞。在此項重組DNA技術中通常已知之方法 可用於將核酸分子選殖入表現载體，肖等方法描述於

Ausubelf Λ(^^-) , !9935 Current Protocols in Molecular

Bl〇l〇gy, John Wiley & Sons, NY ； AKriegler, 1990, Gene and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press，NY。 對於編碼細胞色素P-450之序列，該等序列可使用多種熟 習此項技術者已知之不同方法得自多種不同微生物。例 如’可使用標記之細胞色素p_45〇探針篩選基因體DNA庫。 對於雜父條件之指導參閱（例如）前述Ausubel等人。另外， 細胞色素P-450核酸序列可藉由執行PCR得到，其使用兩種 基於本文描述之已知細胞色素P-450核苷酸序列之寡核苷 酸引子。在本發明之較佳實施例中，將編碼細胞色素P-450 106947.doc 13073.60 之序列自菌株分離，該等菌 n 寺鹵株不此從放線菌清楚地區分 開較佳的菌株不能從鏈黴菌、、主柱α广 /M , 倣_ /月邊地區分開，更佳的菌株 不月b攸嗜碳桿菌鏈黴_ p, A 徽ι戈赫爾維第氏鏈黴菌清楚地區分 開。參閱watanabe等人， 寸八 uene，163 : 81_85 (1995)。 對於編碼鐵氧化還原蛋白或類镅查# „ s $ 來w 4類鐵氧化逛原蛋白之蛋白質 之序列，έ亥等序列亦可想_自夕α 、 J7TT付自多種不同微生物，其使用上述 用於分離編碼細胞色素ρ_45 ^ ^ /L 、汁夕lj之方法。多種形式的鐵 乳還原蛋自，例如淺灰鏈黴菌（S grise〇㈣之H納 塔爾鏈黴_(S‘n_ensis)之PimF蛋白錢粉酶鏈徽_ s)之幻祕蛋白係已知的且可用於表現載體之構 築β此外，以下描述之新穎編碼鐵氧化還原蛋白或類鐵氧 化還原蛋白之蛋白質之序列可用於表現載體之構築。 本毛月提供彳τ自赫爾維第氏鏈黴菌之新穎鐵氧化還原蛋 白基因。該新賴基因已從赫爾維第氏鏈黴菌中之細胞色素 P-450基因之下游識別並選殖出且被稱為弗德希。本發明之 選殖之弗德希基因為188 bp長且顯示超過8〇%與淺灰鏈黴 菌SauC之鐵氧化還原蛋白同源且超過聰與納塔爾鍵徽菌 (PimF)或澱粉酶鏈黴菌（RimH)i鐵氧化還原蛋白同源。弗 德希之核苷酸序列及推斷之胺基酸序列顯示於圖丨中。本發 明之弗德希核苷酸序列包括：（a)在圖！中顯示2DNA序列； (b)編碼在圖1中顯示之胺基酸序列之核苷酸序列；（c)任何 核苷酸序列，其⑴在嚴格條件下雜交至（a)4(b)中陳述之核 苷酸序列，例如於65°C下在0_5 M NaHP〇.sub_4、7%十二户 基硫酸鈉（SDS)、1 mM EDTA中雜交至濾紙結合DNA，並於 106947.doc •12- 1307360 68〇C 下在 〇·1 X SSC/O.p/oSds 中沖洗（Ausubel F M 等人，編 者，1989, Current Protocols in M〇lecular 扪〇1〇訂第！卷 Green Publishing Associate Inc，及 J〇hn WUey & s〇ns，⑹，

New York’於2.1〇·3頁）’且⑼編碼功能上相當之基因產物。’ 本發明亦包括可編碼或充當弗德希反義分子之核酸分 子，該等分子適用於（例如）弗德希基因調節（在弗德希基因 核酸序列之擴增反應中用於及/或充當反義引子）。本發明亦

包含編碼突變弗德希、弗德希之肽^、截斷弗德希及弗 德希融合蛋白之核苷酸序列。 本發明亦包含⑷含有任何前述弗德希序列及其互補序列 (例如反義、RNAi)之職載體；（b)含有任何前述弗德希序 列之亀表現«，料弗德希序列操作性地與調節元素 有關，該調節元素指導編碼弗德希之序列之表現；及含 有任何前㈣德希序列之遺傳設計之宿主細胞，該等弗押 作性地與調節元素有關，該調節元素指導編碼;、 “希之序列在宿主細胞中 勺心 I中之表現。如本文所用，調節元素 =(但不限於）可誘導及不可誘導之啓動子、操縱子及立它 現。 之兀素，6亥“素驅動並調節基因表 蚵妝丞酸序列。本發明之弗 基I夂序列包括圖1中g 根據多種”之任：咖序列。本發明亦包 ‘準之任一者判定在功能上 之核芽酸序列編碼之弗#希之^由圖1中 於)與細胞色素P-45。 等標準包括(但 ” 起催化ML-236B轉化為普伐他 I06947.doc 1307360 月匕力。6亥4功能上相當之弗；, 醆庠. 田之“、希蛋白包括(但不限於)在胺基 =内具有胺基酸殘基之加成或取代之蛋白，該胺基酸 ^由上述“希核《序列編碼，但該等加成或 致靜止改變，因此甚吐从At L』上 可 此產生功旎上相當之基因產物。 編碼細胞色素P_450及氧 蛋 氧匕定原蛋白或類鐵氧化還原 蛋白質之序列之表現可藉由此項技術中已 2 =擇之特定微生物中起作料調㈣動子調整。該等 ^動切為可誘導的或原構性的。通常較佳地使用具有顯 =動子，以便可達成最大轉 Η 4啓動子包括（但不限於㈣、⑽、eat、M、ptipA、 isr或pkg啓動子。 在本發明之實施例中，可使用位於與放線菌，較佳鍵黴 ’更佳嗜碳桿菌鏈黴菌或赫爾維第氏鏈黴菌之細胞色素 RF直接郇接並與其有關的啓動子。ρ·45〇 〇RF之y 及鄰接之大約1千鹼基區域不必要含有該基因之整個啓動 子區域且根據美料利第5,83M95號（,，第，奶號專利”）戍 動子區域之DNA可大大短於約1Kb，較佳地大於約160bp， 大於.力300 bp。只要所得啓動子仍展示需要的啓動 子活险’本發明之啓動子可根據需要程度而不同於原始5， 啓動子。第|695號專利以引用的方式併入本文以揭示多種尺 寸之啓動子，該等啓動子可用於表現細胞色素？_45()及/或鐵 氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質。 此外下列方法可用於識別具有啓動子活性之DNA序列 用於插入本發明之表現載體。為了識別或測試脈A序列之 】06947.doc -14- 1307360 轉錄啓動子活性’⑴構築重組表現載體，其中編碼合適蛋 白之DNA與假定啓動子DNA接合且插入合適載體中，例如 放線菌質體PIJ702或pWHM-3[Katz，E.等人，（1983)，J. Gen. Microbiol·，129, 2703-2714]，並接著（ii)用該載體轉形合適 之宿主細胞’該宿主細胞使載體穩定複製，例如當使用載 體pIJ7〇2或pWHM-3時該宿主細胞為青紫鏈黴菌。 當轉形體為（例如）鏈黴菌時，轉形可根據Hopwood等人進 行[參看Hopwood，D. A.等人，（1985)，"Genetic Manipulation of Streptomyces ： A Laboratory Manual", The John Innes Foundation，Norwich，UK]。應瞭解在轉形之前用於檢定啓 動子活性之基因通常不應存在或表現於宿主中。 轉錄之水平可易於由（例如）北方墨點法或RNA-PCR[聚 合酶鍵反應’參看lnnis，Μ. A_等人，（1990)，"PCR PROTOCOLS”，Academic Press，New York]證實。產物之表 現水平可藉由測定產生之蛋白之生理活性證實。因此，例 如可製備重組DNA載體，其中將編碼具有所給活性之蛋白 (例如酶）之DNA藉由（例如）接合而操作性地連接至假定啓 動子之3'末端。連接至假定啓動子之〇RF之表現水平可接著 以適合於表現產物之方式加以檢定。 應瞭解可將用於檢定表現產物之方法特異性地適合相關 產物。例如，可將假定啓動子操作性地連接至抗藥性基因， 例如氯黴素乙醯基轉移酶基因[參看G〇rman, c. M.等人， 〇982)，M()1.CeII.Bi()]，2，圓以51]，或連接至螢光素酶 基因[參看de Wet，J. R.等人，（1987)，则扪〇 106947.doc -15- 1307360 7 2 5 - 7 3 7 1，]，其可藉由此項技術中熟知之方法谓測。亦可使 用其它經由表現產物之活性用於檢定表現之方法。 例如，另一用於量測表現之方法係藉由使用適當抗體識 別產物。合適之量測技術包括放射免疫檢定[參看Berson，R. S.4 人 ’（1973), "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology”，第 2A，2B卷，North-Holland Publishing Co.， Amsterdam]、酵素免疫分析法[參看Engvan, e.，（1980)，

Methods in EnZym〇l〇gy，70 (A)，419_439]、西方墨點法[參 看 Harlow，E.等人，（1988)，"Antib〇dies—A ―⑽偷丫

Manual"，第 471 頁，Cold Spring Harbor Laboratory，New

York]及免疫沈澱[參看 Kessier，S. w·等人，（1981)，"Meth〇ds in Enzymology”，73(B)，442_459] ’其取決於量測相互作用 的需要程度，並取決於是否抗體或抗原以任何方式加以標 記。在任何情況下’應瞭解該等技術之討論内容係不完全 的’且熟習此項技術者將易於明白其它方法。 在"亥表現載體編碼細胞色素p_45〇及鐵氧化還原蛋白或 類鐵氧化還原蛋白之蛋白質且質體與青紫鏈黴菌相容之情 ^下，接著可將該質體引入不產生細胞色素P-450及鐵氧化 遇原蛋白之青紫鏈黴菌之菌株，且可接著將轉形體於 肌_2地存在下培養。接著產生之普伐他>'了之量表示由假 疋f動子促進之細胞色素P-450及/或鐵氧化還原蛋白及類 載氧化還原蛋白之蛋白質之表現量。 一旦已證實用作本發明之啓動子之DNA具有作為啓 <5??* . 而/ ,，接著其可用於構築表現載體用於細胞色素 106947.doc 1307360 P-450及/或鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質 之表現。如先前所述’細胞色素p氣_2係較佳的表現產 物’合適之載體為PSCA⑻3舰TA，⑽3/428)，該載體 可自青紫鏈黴菌TK-21分離。 對啓動子序列、編碼鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋 白之蛋白#之序列（意即弗德希）、或編碼細胞色素1>_450之 序列之㈣可通常藉由轉形程序出現，或（例如）為方便起見 用以引入(例如)限制性位點。因此，本發明涵蓋啓動子、鐵 氧化還原蛋白或細胞色素p_450,其可藉由缺失、反轉、插 入及取代變化。較佳地，本發明之啓動子、鐵氧化還原蛋 白及細胞色素P-450與其相關之分子之相應部分共享非常 貫質的序列同源性。 熟習此項技術者將易於明白序列中之其它區別及改變及 用於影響其之方且本發日月包含該等之全冑。本發明之 啓動子鐵氧化還原蛋白及細胞色素p-450以不同於自然變 異之方式變化，其在本文中亦稱為突變體以便只要突變體 及變異體一起作用導致可羥基化厘^^印（康巴亭）以形成 普伐他汀之微生物之產生’則均將其加以涵蓋。 若須要，任何選殖之DNA之核苷酸序列可藉由（例如）

Maxam-Gilbert化學修飾方法[Maxam，A. M.與 Gilbert, W.， (1980)，Methods in Enzymology，65, 499-599]或使用 Ml 3噬 菌體之雙脫氧鏈終止方法[Messing，J.與Vieira, J.，（1982) Gene，19, 269-276]測定。 此外，應瞭解術語”表現產物”、”蛋白質”及”多肽”通常係 106947.doc •17- 1307360 了 乂換的’且在本文之該意義中使用。在特定情況 原始DNA韓螺夕夕rj_ τ〆P ^下’自 °太不係最終產物’而係最終產物之中門 形式’需要後轉移修飾以獲得所需產中間 π it —求， 仕 ^45〇sca-2之情 f中而要將鐵引“紅素if以產n% 產物。因此，雖然術語”表現產物,，、"蛋白質，，及”多肽 文中同義使用，該等術語之間之區別將 ：： 在相關情形t認識到。 “此項技術者 在構築經設計以表現細胞色素p韻及鐵氧化還原蛋白 或類鐵氧化還原蛋白之蛋白質的合適表現載體之後，將談 (等)載體轉形入合適之宿主。較佳的宿主包括放線菌及子囊 菌’然而’亦可使用其它原核生物及真核生物，例如大腸 埃希氏菌及枯草桿菌。在本發明之特定實施例中，轉形青 紫鏈黴菌TK21及桔青黴菌。 使用放線菌之合適之轉形方法包含使用溶菌酶將放線菌 培養物形成為原生質球。接著添加含有重組舰載體及聚 乙二醇之緩衝溶液，以便將表現載體引入宿主細胞，例如 藉由使用Thompson或Hopwood之方法[參看Th〇mps〇n，c】

等人，（1982)，J. Bacteriol·，151，668-677 或 Hopwood，D. Α· 等人 ’（1985)，"Genetic Manipulation of Streptomyces : A

Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich]。在本發明之非限制性實施例中，在表現載體質 體中將抗硫鏈絲菌素（thiostrepton)基因用作選擇性標記[參 看 Hopwood，D. A.專人 ’（1987), "Methods in Enzymology” 153，116, Academic Press，New York]。 106947.doc -18- 1307360 若需要大腸埃希氏菌之轉形，為了在本發明之啓動子控 制下表現產物，則適當之通用方法係其中將相關重組]〇1^八 載體添加至勝任細胞之方法。該等勝任細胞通常於鹽（例如 氯化鈣、氯化鎂及氯化铷）存在下製備[參看Hanahan，d， (1983)，J.M〇l.Bi〇l. 166,557-580]。替代方法包含電穿孔，

其涉及使用高電壓脈衝，該等脈衝施加於包含宿主大腸埃 希氏菌及表現载體之懸浮液’藉此導致載體併人該等細胞 [Electroporation : Dower，w. j 等人，（1988)，A-

Res.，16, 6127及 Calvin，N. Μ,等人，（1988)，j. Bacteri〇1， 170, 2796]。 在枯草桿g用以作為宿主細胞之情況下，則合適之方法 係其中使用溶菌酶將宿主細胞製為原生質體之方法。接著 可將含有重組DNA載體及聚乙二醇之緩衝溶液添加至該等 原生質體，隨後藉由電穿孔將載體併入宿主細胞(前 迷）[Cheng，S.等人，（1979)，M〇1 ⑹κ 168,⑴]。

在較土實施例中’將諸如用於抗氯黴素之抗藥性標記用作 選擇性標記用於轉形之細胞株，但應瞭解可使用多種其它 ’’、、伯主為何，所需轉形體可使用熟習此項技術者熟 方法仁養’同時所需多肽藉由培養物於細胞内或細胞 或細胞内外產生。尤甚 σ養中使用之培養基可合適地選自 吊用於相關宿主細胞之多錄盤别 ^ a 也之夕種類型之培養基。通常，彼等 :用於特定宿主之培養條件亦可用於表現（例如）經 夕、性所需要之任何修都之理想多肽。另外，若表現 106947.doc -19- .1307360 2含有可誘導啓動子，添加可誘導選殖基因之表現之化合 物可為必要的。 使用之特定培養技㈣本發明並不關鍵且任何通常用於 培養之技術可同樣用於本發明。通常，將顧及工苹效率來 選擇使用之技術。用作可吸收碳來源之典型放線菌營養物 包括用作碳源之葡萄糖、薦糖、殿粉、甘油、搬粉糖聚、 檐雀、及大豆油。可吸收氮來源之實例包括大豆粉、麥芽、 肉汁、蛋白脒、玉米毅'乾酵母及硫酸鐘。除上述之外， 2 =諸如氯化納、氯化鉀、碳_或硫酸叙無機鹽及 =輔助微生物生長或促進所需多肽產生之添加劑亦可合 通地組合使用。 通常適宜於所討論宿主之培養技術亦適㈣適合以 :規模生產之經轉形之微生物，該等技術 定… 。養之方法。通常除非另外禁忌或本文指 與。養條件涉及抓與3rc之間之溫度，較佳地在⑽ 胞色辛Γ間。在本發明之啓動子控制下之表現產物（意即細 白質）通常絲化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋 生。予在細胞内或細胞外產生，且有時在細胞内外產 提供使用本發明之遺傳修飾之微生物產生普伐他 之典養其+在本明之實施例中，在含有ML-236B或其鹽 。土中培養該等遺傳修 胞色素P-450月雜备儿忒:t口養在具中細 白質矣 還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋 、 之條件下進仃，藉此使該ML-236B藉由該細胞色 I06947.doc •20· 1307360 素P-45G之催化作㈣化為普伐m接著自料物回收 普伐他ί丁。 亦在本發明之另一實施例中，細胞色素Ρ-450及鐵氧化還 原蛋白可藉由多種程序分離、純化並时，例如熟習此項 技術者熟知之程序，尤其係彼等依賴於多肽之物理或化學 寺f之私序纟β亥等多狀在外部表現之情況下，該等多狀

可藉由例如將培養基離心以移除細胞自所得上清液分離、 純化並回收。 "為了分離並純化已在細胞内聚集之細胞色素ρ_45〇及鐵 乳化還原蛋白蛋白f，首先將該等細胞懸浮於含有蛋白酶 抑制劑之溶液並接著使用熟習此項技術者通f已知之方法 (例如超音波勻漿機）勻漿。 對本發明進行解釋通常不係必要的，應瞭解用於《 離、純化並收集所需多肽之特定方法之實例包括該等例女

、澱超慮、分子筛層析法（凝膠過遽）、吸附層析法 離子乂換層析法、親和性層析法之技術，多種適當類型之 夜相層析法，包括高效液相層析法（HPLC)、透析及其组合, 在=何情況下，應瞭解所需多肽可易於使用本發明在工 業規杈上阿產里且咼純度地生產。亦應瞭解可使用細胞色 '^直5。及鐵氧化還原蛋白或類鐵氧化還原蛋白之蛋白 質/、使用未純化或部分純化之製備樣品由本發明之轉形 ，佰主細胞產生。細胞色素P'450及鐵氧化還原蛋白或類鐵 氧化還原蛋白夕疋人 、 蛋白貝可以上述方式獲得自重組青紫鏈黴 ’並直接用於(例如)普伐他汀之產生。 J06947.doc 21 1307360 由任何本發明之方法產生之普伐他汀可藉由―等 人之方法回收[參看Serizawa，N等人，（i983), l

Antibiotics, 36，608]。在特定營缺 丄 」隹特疋實施例中，青紫鏈黴菌TK_21 可在該方法中使用。 本發明進-步提供包含使用本發明之方法及組合物製備 之普伐他汀或其片段及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合 物。 如本文所用之載劑包括醫藥學上可接受之㈣、賦形劑 或穩定劑，其在使用之劑量及濃度對曝露於此之細胞或哺 乳動物無毒。通常生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶 液。生理學上可接受之載劑.之實例包括緩衝劑例如麟酸 鹽、棒檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低 分子量（小於約Η)個殘基）多狀；蛋白質，例如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙婦〇比略烧嗣；胺 錢：如甘胺酸、麵胺醢胺、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺 :夂，早聽、二酿及其它酿類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精; 合劑例如EDTA;糖醇例如甘露醇醇或山梨 衡離子之鹽例如納；及/或非離 成抗 離子界面活性劑例如 TWEEN®、聚乙二醇（PEG)訊UR⑽cs⑧。 在藉由（例如）界面聚合作用製備之微膠囊中亦可包含活 性成份’例如分別在勝狀藥物傳遞系統(例如月旨質體 '白蛋 白微球體、微乳液、奈米顆粒及毫微膠囊）或在宏乳液中之 :甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（甲基丙烯酸甲醋）微膠 。用於活體内投藥之調配物必須係無菌的。此易於藉由 106947.doc -22· 1307360 通過無菌濾膜之過濾來完成。可製備持續釋放製劑。合適 之持續釋放製劑之實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物 之半通透性基質’該等基質以成形物品之形式存在，例如 - 薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚醋、水凝膠(例 . 如聚（2_羥乙基-甲基丙烯酸_)或聚（乙烯醇））、聚丙交醋（美 國專利第3,773,919號）、L-麵胺酸與7乙基麩胺酸酯之共 聚物、不可降解乙婦-乙酸乙烯醋、可降解乳酸_乙醇酸共聚 • 物（例如LUPR0N膽0下⑧（由乳酸乙醇酸共聚物與醋酸亮 丙瑞林組成之可注射微球體）)及聚_ D_㈠冬經基丁酸。雖 然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸_乙醇酸之共聚物使分子能 夠釋放超過100天，特定水凝朦釋放蛋白達較短時間。 治療意謂動物中之疾病的任何治療且包括：⑴預防疾病 在哺孔動物中發生，該哺乳動物可易患該疾病但尚未經歷 或展不疾病之症狀，例如預防臨床症狀之發作；⑺抑制疾 病，例如阻止其發展；或(3)緩解疾病，例如導致 狀 B 消退。 . 在本發明之特定實施例中，將使用本發明之方法及組合 物製備之普伐他㈣於治療與膽固醇生物合成有關之病 •症。料病症包括（但不限於）高膽固醇血症及高脂質血症。 時療疾病之有效劑量意謂當投予需要其之哺乳動物 、W里足Μ實現對彼疾病之如上定義之治療。 定較佳實施例描述本發明，熟習此項技術者將 =對Λ明書之考慮明白其它實施例。任何未特定定義之 製劑、溶液及其類似物可發現於"M〇iecuiar 106947.doc •23· 1307360

Cloning--A Laboratory Handbook"(上述），其全文以引用的 方式併入本文中。本發明另外根據下列實例定義，該等實 例詳細描述本發明之化合物之製備。熟習此項技術者將明 白多種對材料及方法之修飾可無需脫離本發明之範疇而實 施。 實例 實例1 pWHM-CytP450she質體之構築 使用為酵母及格蘭氏陽性菌修飾之PUREGENE DNA分 離套組自赫爾維第氏鏈黴菌提取總DNA。將cytP45 0she基因 使用基於Genbank (基因庫）序列E06907及E13579之合成寡 核苷酉曼引子 5' TAT AAG CTT TGC GGT AGA CCG CCG CCT TTC 3 '及 5' TTT CTA GAC CAG GTG ACC GGG AGT TCG TTG3'來PCR擴增。將PCR片段自PCR混合物純化（V-基因 PCR純化套組）並於37°C下使用由產商（MBI Fermentas)推薦 之緩衝液及酶用Hindlll及EcoRI限制性酶消化2小時。 將消化反應之產物藉由複脂糖凝膠電泳在1 %w/v瓊脂糖 凝膠上於含有TAE溶液之潛水艇型電泳槽中分離並於1 〇〇 v 運行3小時。將含有相應1 ·2 kb片段之瓊脂糖薄片自凝膠切 離並使用V-基因DNA凝膠提取套組自凝膠提取DNA。將純 化且消化之PCR片段接合至PWHM-3 (Vara等人，1989)載體 (用Hindlll及EcoRI切斷，並類似於PCR片段純化來純化）。 將接合混合物使用BIO-RAD微脈衝電穿孔裝置電穿孔入 大腸埃希氏菌XL 1藍色細胞並塗佈於含有胺苄青黴素之Lb 106947.doc -24- 1307360 =養基。將抗胺f青黴素之菌落分離並在含有_ %編胺 节月黴素之LB h養基中生長隔夜。使用基因快速質體 D N A每日小規模製備套組自隔夜培養物中提取質體丽。 將提取之質體驅用EcoRr Hindm消化並在i %缓脂糖凝 膠上於TAE緩衝液中運行。選擇並定序含有所需尺寸插入 物之質體構築體並用於隨後的工作（pWHM部p45〇she)。 PWHM-CytP450she構築體轉形入青紫鏈黴菌π。： *如H〇pw〇〇d (1985)中所述將質體構築體轉形入青紫鏈黴 菌TK-21原生質體且在含有硫鏈絲菌素之R2YE培養基上選 擇。將抗硫鏈絲菌素之菌㈣移至分離的含有硫鏈絲菌素 之R2YE皮氏培養皿並使於抑下形成抱子。幻〇%甘油中 將孢子分別自各個皮氏培養皿沖洗並於_2〇它儲存直至使 用。從各個中將0.5 mL孢子懸浮液用於接種含有25 pg/g硫 鏈絲菌素之100 mL YEME培養基（Hopwood等人，1985)並使 其生長3天。 將質體DNA用EcoRI及Hindlll純化並消化並在瓊脂糖凝 膠上分離。所有測試質體構築體顯示預期的限制模式。選 擇測試之孢子懸浮液之一並用於隨後工作。 測試載運pWHM-cytP45〇She構築體之青紫鏈黴菌τκ_21之 康巴亭羥基化

將先前選擇之孢子懸浮液用於接種5〇 mL PSI培養基（2% 葡萄糖、0.5%大豆粉、0.5%大豆脒、0.01〇/〇kh2p〇4及 0.1%CaCO3)並培養2天，同時於28。(：下用300印爪持續回轉 式震盪。將該預先培養物用於接種使用丨〇%接種體之5〇 mL 106947.doc -25- 1307360 • . PSF-2培養基（1.8%葡萄糖、5%大豆粉、〇,4%CSL及 0.3%CaCO3 pH = 7.2)。將培養物生長30-40小時並將1 mL 40 mg/ml康巴亭-Na溶液添加至發酵物。將發酵物繼續運行另 外的24-48小時。接著收集樣本並藉由高效液相層析法分 析。普伐他汀產量為0-3 pg/g。 實例2 : 藉由反向PCR分離弗德希基因 使用為酵母及格蘭氏陽性菌修飾之PUREGENE DNA分 離套組自赫爾維第氏鏈黴菌提取總DNA。將基因體DNA用 BamHI消化，稀釋至10倍並自身接合。使用引子5' CGA ACT CCC GGT CAC CTG GTG ACC G3,及 5' GTC ATG CGG CGA CGC GTC CCG TGC T3'完成使用接合合物之PCR。另冬PCR 產物在0.7%瓊脂糖凝膠上分離並見到單PCR產物。將PCR 產物定序：參閱圖1 (SEQ. ID. NO. 1)。 在cytP45 0she基因之下游識別ORF，其顯示與淺灰鏈黴菌 鐵氧化還原蛋白- l(suaB)基因有70%—致，且其稱為弗德 希。 pWHM-cytP450she-弗德希構築體之構築： 基於序列資訊在弗德希終止密碼子之下游設計並定位新 的引子。使用 5’ TAT AAG CTT TGC GGT AGA CCG CCG CCT TTC 3 ’及新設計的 5' AAA GAA TTC GTG ACC GAT CCG CTG TGA CGC C 3’引子，將cytP450she與新識別的弗 德希一起自赫爾維第氏鏈黴菌基因體DNA擴增。如實例1 中將所需尺寸之PCR片段選殖入pWHM-3載體。 106947.doc -26- .1307360 pWHM-CyUMSOshe-弗德希構築體轉形入青紫鏈黴菌 TK-21 ： 以實例1中描述之相同方式將質體構築體轉形入青紫鏈 :. 黴菌τκ-21。以實例1中完成之相同方式製備孢子並選擇所 -需尺寸的插入物。 測試載運PWHM-cytP450she_弗德希構築體之青紫鏈黴菌 TK-21之康巴亭羥基化： φ 將先前選擇之孢子懸浮液用於接種PSI及PSF-2培養基。 如實例1中所述完成發酵。載運pWHM_cytP45〇she_弗德希 質體之青紫鏈黴菌菌落之普伐他汀產量為478_5〇2吨仏。 實例3 :

將CytP450she ORF從起始密碼子（ATG)至終止密碼子 (TGA)作PCR擴增並在pgk啓動子與trpC終止子之間選殖入 PBC-Hygr0載體之MCS (Silar，FGN 42 : 73)。將弗德希 〇rf 從起始密碼子（ATG)至終止密碼子（TGA)作pCR擴增並在 • Pgk啓動子與trPC終止子之間選殖入PBC-Phleo載體之MCS (Silar，FGN 42 : 73)。將構築體藉由限制性酶消化測試並將 、員示預期片&尺寸之合適純系另外藉由測序測試。選擇具 • 有預期DNA序列之純系並用於隨後步驟。 將構築體均依次轉形入桔青黴菌原生質體，分別在200 ug/ml潮黴素及5〇〇ug/ml腐草黴素上選擇。選擇均顯示抗潮 黴素及腐草黴素之分離物並在饋入—劑康巴亭之後測 試康巴亭至普伐他、;丁轉化。另外測試可將康巴亭轉化為普 伐他汀之分離物。 106947.doc -27- 1307360 【圖式簡單說明】

圖1說明弗德希之核酸及胺基酸序列（SEQ. ID 圖2說明普伐他汀及康巴亭定量測定：條顯示在葬） 不同質體構築體之青紫鏈黴菌菌株❹ 日具有 菌隔夜培養之後康巴、 爾維第氏鏈黴 。養之後康巴康巴卜OH)之剩餘可溶形 生之普伐他汀。 〜式及產 圖3說明無鐵氧化還原蛋白之 式及有鐵氧化還原蛋白之本二基化之二組份模 組份模式。 之康巴宁羥基化之新穎三

106947.doc -28- 1307360 ' 1 序列表 <11〇>以色列商泰瓦藥品工業有限公司 <120>用於構築具有康巴亭(COMPACTIN)羥基化能力之 菌株之方法 <130> 2664/83802 <140> TW 094142662 <141> 2005-12-02 <150> 60/633,011 <151> 2004-12-03 <160> 2 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 230 <212> DNA <2]3>青紫鏈黴菌 <220> <221> CDS <222> (21)..(209) <220> <221> inisc_feature <222> (2131..(213) <223> η 為 a，c，g，或 t <400> 1 ccgagcggaa aggaggaccc atg egg gtc tea gcg gac egg gac gtc tgt gtc Met Arg Val Ser Ala Asp Arg Asp Val Cys Val 】 5 10 ggc gcc ggc ctg tgc geg ctg acc geg ccc gac gtc ttt gac cag gac

Gly Ala Gly Leu Cys Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Asp Gin Asp 15 20 25 gac gac ggc ett gtt gac gtg gtc acc ccc gat ccc ggc cag geg cag

Asp Asp Gly Leu Val Asp Val Val Thr Pro Asp Pro Gly Gin Ala Gin 30 35 40 cag gcc geg gcc ege cag gcc ggc aac etc tgt ccg teg ggg geg gtc

53 101 149 197 230

Gin Ala Ala Ala Arg Gin Ala Gly Asn Leu Cys Pro Ser Gly Ala Val 45 50 55 ege ate acc gaa tgangcgacc gtcccgcggc c Arg Ile Thr Glu 60 <210〉 2 <211> 63 <212>蛋白質 <213>青紫鏈黴菌 <400> 2

Met Arg Val Ser Ala Asp Arg Asp Val Cys Val Gly Ala Gly Leu Cys 15 10 15

Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Asp Gin Asp Asp Asp Gly Leu Val 20 25 30

Asp Val Val Thr Pro Asp Pro Gly Gin Ala Gin Gin Ala Ala Ala Arg 35 40 45 106947.doc 1307360

Gin Ala Gly Asn Lea Cys Pro Ser Gly Ala Val Arg lie Thr Glu 50 55 60

106947.doc -2-

Claims (1)

1. ^------- 曰修(更)正:

   ,13073¾¾4142662號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(97年8 十、申請專利範圍： 「種構築經遺傳修_之g株之方法，該菌株具有康巴亭 I基化此力，該方法包含以具有編碼細胞色素之基 因、啓動子DNA序列及編碼弗德希（fdxshe)之基因之質體 構名體轉形宿主’該編碼弗德希之基因具有seq出NO : 1之核苦酸序列或編瑪SEQIDNO:2之胺基酸序列之核苦 酸序列，且該編碼細胞色素？_450之基因可編碼與該編碼 弗德希之基因所編碼之蛋白質一起具有康巴亭羥基化能 籲 力之細胞色素P-450。 2·如請求項丨之方法，其中該宿主係選自下列組成之群：原 核宿主及真核宿主。 3 ·如請求項2之方法，其中該原核生物為放線菌（actin〇mycete)。 4. 如請求項3之方法，其中該放線菌為鏈黴菌（汾以）。 5. 如請求項4之方法，其中該鏈黴菌係選自下列組成之群： 青紫鏈黴菌（*s. //w而似）、嗜碳桿菌鏈黴菌（iS car6叩心7似) 及赫爾維第氏鍵徽菌（<S. /le/vai/cws)。 月求項2之方法’其中該原核生物宿主係選自下列組成 之群·大腸桿菌（Ac/zerk/zk 及栝草桿菌山似 subtilis、。 7·如請求項2之方法，其中該真核細胞宿主為真菌。 8，如請求項7之方法，其中該真菌為桔青黴菌…謂 citrinum) 〇 9·如請求項8之方法，其中該桔青黴菌宿主為產生河[_23紐 (康巴亭）之菌株。 106947-970827.doc 1307360 1〇.如明求項1之方法，其中該編碼細胞色素P-450之基因係自 放線菌獲得。 η·如μ求項10之方法，其中該編碼細胞色素p_45〇之基因係 自鏈黴_獲得。 .如叫求項11之方法，其中該鏈黴菌係選自下列組成之 群.青紫鏈黴菌、嗜碳桿菌鏈黴菌及赫爾維第氏鏈黴菌。 13.如請求項12之方法，其中自嗜碳桿菌鏈黴菌獲得之細胞 色素P-450係選自下列組成之群：cytpjwwad、 cytP45〇Sca_2及 CytP-450sca-3。 如明求項丨之方法，其中該啓動子dna序列係經操作與編 碼細胞色素P-450之基因連接。 如π求項1之方法，其中該弗德希基因具有seq ID 工 之核苷酸序列。 如。月求項1之方法，其中該弗德希基因編碼SEq NO : 2 之胺基酸序列且與SEQ ID N0:丄之序列具有至少8〇%之 一致性。 月长項1 6之方法，其中s亥弗德希基因與SEq①Μ。：直 之序列具有至少85%之一致性。 月求項16之方法，其中§亥弗德希基因與seq①Μ。：工 之序列具有至少90%之一致性。 凊求項16之方法，其中該弗德希基因與seq⑴no : ^ 之序列具有至少95%之一致性。 2〇.如請求項【之方法，其中該弗德希基因編碼seqidn〇:2 之胺基酸序列 106947-970827.doc 1307360 2 1.如請求項丨之方法，其中該質體係選自下列組成之群： pWHM-3 及 PSCA。 22. 如請求項丨之方法，其中該質體為多複本質體。 23. 如請求項22之方法，其中該多複本質體為piJ7〇2。 24. 種用於製備普伐他汀（pravastatin)之方法，其包含：在 包含ML-23 6B之培養基及在可表現細胞色素P_45〇及編碼 弗德希之基因以將ML-236B催化轉化及羥基化形成普伐 他叮之條件下’培養藉由如請求項1至Μ之方法製備的經 遺傳修飾之菌株；並由培養基中回收普伐他汀。 25. 如請求項24之方法，其中該…^以沾係由培養基提供。 26. 如請求項24之方法，其中該河^2363係由桔青黴菌製造， 該桔青黴菌係與該宿主共同培養。 27. 如請求項24之方法，其中該經遺傳修飾之菌株為可製造 ML-236B之桔青黴菌。 28. —種核酸分子，其與SEQ ID N〇 : 1之序列具有至少以％ 之一致性。 29_如請求項28之核酸分子，其與SEQ ID N〇 : i之序列具有 至少90%之一致性。 1之序列具有 30,如請求項28之核酸分子，其與SEQ m N〇 至少95%之一致性。 31. 32. -種核酸分子，其具有SEQIDNq: !之核*酸序列。 -種核酸分子’其編碼或作為如請求項31之核酸分子之 反義核酸分子。 3 3 · —種核酸分子 其在嚴格條件下雜交至如請求項31之核 l〇6947-970827.di 1307360 酸分子。 34,種載體，其包含如請求項28至31中任一項之核酸分子。 35·如請求項34之載體，其中該核酸分子係經操作連接至一 或多種表現控制元素。 36. —種宿主細胞，其包含如請求項34之載體。 37. —種用於製備多肽之方法，其包含於活體外條件下培養 如請求項36之宿主細胞，於該活體外條件下，該核酸分 子編碼之蛋白會表現；並自該培養物回收該蛋白。 除 3 8. —種多肽分子，其與SEq id NO : 2之胺基酸序列具有至 少95%之一致性，其中該多肽分子與細胞色素p_450—起 具有康巴亭羥基化能力。 3 9. —種多肽分子，其具有SEQ ID NO : 2之胺基酸序列。

   106947-970827.doc