TWI296930B - Recombinant enterovirus 71 neutralizing antibodies and use thereof - Google Patents

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Description

1296930 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明與一具生物活性，特別是用於針對腸病毒所造成的疾病之一系列抗 體有關。本發明亦與抗病毒治療方式，特別是與重組抗人類EV71病毒單株抗體 • 有關。本發明同時與將此抗體用於診斷EV71感染的應用有關。 鳥 【先前技術】 手足口病（Hand，foot and mouth disease , HFMD)通常是一輕微的疾 病’且僅發生於嬰兒與幼童身上。感染腸病毒71 (enkrovinjs 71，EV71)是 造成手足口病的第二大病因（CDC報告，1998年八月七日；CDC報告，1998年 八月十一日）。感染EV71常常併發嚴重的神經炎症，包括病毒性腦（脊)膜炎(viral (aseptic) meningitis)，腦炎（encephalitis)，以及類似小兒麻痺的癱瘓。 ❿ EV71首次在1969年被分離與描述（Schmidt ，1974，/ //?/e 129:304)。關於EV71流行的報告自1998年開始出現，主要是發生於東南亞地區 • (Lam，1998，Emerg· Infect· Dis· 4:145 ; WHO 報告，1998 年 6 月；WHO 報告， 1998年7月）。世界衛生組織曾發佈香港、馬來西亞與台灣為流行區域。最嚴重 的流行爆發發生於台灣的1998年4月到7月，造成了約320例嚴重併發症，並 有 73 人死亡（Wu et al·，1999，€肥叹· //7/ect ，5:458 ; Wang et al·， 1999 » Clin. Infect Dis. 1:184 ； Komatsu et al. » 1999 » Pediatr. Neurol 6 1296930 20:17)。 自EV71感染到出現症狀約為3至β天。第一個常見的症狀為發燒。在發燒 出現後的一到兩天，病人口中常出現瘡（s〇res)並常轉變成潰瘍（ulcers)。皮 膚紅疹出現於第1至2天，通常是在手掌或腳底出現。大部分的病人會在丨到2 週内恢復（WHO報告，1998年6月；CDC報告，1998年8月7日）。有些病例， 主要是小於3歲的兒童，會出現嚴重的併發症。他們出現短期（2-4天）的發燒 病（febrile illness)，之後突然的惡化，並在第12到24小時内死亡（CDC報 告，1998年8月7日）。目前還不清楚為何某些受感染的兒童能恢復，而其它的 卻在感染後快速的產生併發症。 有報告指出猴子可在受EV71感染後14到20天内產生IgM抗體(Hashinmoto 與 Hagiwara，1982，即#Λ从也9人 8:149 ; Hashinmoto 與
Hagiwara，1983，也鉍伽/ 60:266)。報告指出病童的快速死亡，通 祐發生於第七天，是源自於他們無法及時產生足夠的中和抗體。目前尚無有效的 试劑或治療方式可治療EV71的感染。目前已有的手足口病治療多僅針對症狀， 包括減輕發燒、頭痛與虛弱（malaise)。掌控併發症是目前臨床照顧EV71感染 最重要的著眼方向（CDC報告，1998年8月11曰）。因此，一個能有效抑制病毒 增生與清除病毒顆粒的治療方法是有高度商業價值的。 利用雜合瘤（hybridoma)製造單株抗體的技術首先在1975年出現（c〇ttona 7 1296930 與 Milstein，1973,舱 *//^244:42;1(〇11^1'與組1316比，1975，舱*//^256:495)。 在過去兩個世紀，已產生了數種應用於臨床的單株抗體。這些單株抗體能辨認特 定疾病的重要分子或致病原，並能促使免疫反應消滅他們。到2〇〇1年為止，已 有11個老鼠的基因改造單株抗體在市場上銷售（Glennie與Johnson，2〇⑻， Immunol. Today 21:403 ； Ezzell ^ 2001 ^ Sci. Am. 285:34) 〇
EV71是一正向（positive)單股醒病毒。病毒的被包裹在4個結構蛋 白質上：病毒蛋白1 (viral pr〇tein 1，VP1)，VP2，VP3與VP4，皆是由同一 裸前驅蛋白（naked precursor protein)經後轉譯（post-translation)切割 而成。在這些病毒蛋白之中，VP1被認為是負責將病毒與目標細胞連接的蛋白質 (Graham et al·，1989，/· fe/?· Γ//Ό人70:625)，因此具有中和病毒主要的 抗原決定位（antigenicdeterminants)(Pfaff etal·，1988，/·厂/m/· 62:2033; Rueckert，1990，Virology/Lippin-cott-Raven，ρ· 507)。許多以不同的病毒 株進行的免疫學研究，分別指出數種單株抗體的主要表位（epitope)應該在VP1 上（Philip et al·，1986，/·命/?· F/m/· 67:1283 ; Tapani et al·，1993， I Clin. Microbiol. 31:1083 ； Timo et al. ^ 1998 ^ J. Gene. Virol. 78:1) 〇 數個研究發現引發保護性的免疫反應需要EV71的短支，並據此設計了寡肽 (oligopeptides) (US 4，694，071，US 4，75卜 083，US 4，875，643)。懷 孕的ICR鼠以VP1蛋白或EV71的DNA免疫，亦發現其體内會產生足以保護新生 鼠不受 EV71 感染的中和抗體（Wu，C.N· et al·，2002，20:895)。 8 1296930 雖然EV71是一基因上變異度大，且演化快速的病毒，但研究者發現自6個 以上的國家所分離出的VP1的三種基因型，包括原型株BrCr-CA-70,其彼此之間 至少有 94%的同一性（identity) (Brownetal·，2000，/· Γ/α/· 74:12003)。 在EV71在台灣的流行中，研究者取得與分離了許多病理樣本，發現這些在台灣 不同區域獲得的VP1蛋白具有幾乎相同的序列。將GenBank中VP1的胺基酸序列 互相比對，亦發現不同的分離株序列有高度的相似性（>96%)，且在同一基因型 中有高於98.9%的相同序列（\^呢6七81.，2002，/67//7.#/(^6^9人40:10; Shih et al·，2000，Γ/ms ifes· 68:127)。這些資料顯示VP1是一非常保留的 區段，並且在受感染的個體中並未進行顯著的突變。因此VP1是EV71有潛力的 中和決定位與合適的抗原目標。 在過去15年中，製造抗體的技術因抗體工程與轉殖基因技術的增進而快速 進步。新一代的抗體--完全人類單株抗體（fully humanmonoci〇nai aj^ibodies) 在臨床上應用。表現人類單株抗體最常見的方式為將人類的單股Vh-^庫（single chain Fv library，scFv library)表現在噬菌體表面，以轉殖基因鼠準備抗 體，將人類重鏈（heavy chain)的基因採集並以人類的癌症細胞製成的雜合瘤 產生抗體（Soderlind et al·，1993，汾加ecMA 11:503 ; Vaughan et al·, 1998 ^ Nat Biotechnol. 16:535 ； Karpaset al. ^ 2001 ^ Proc. Natl. Acad. Sci. /¾¾ 98:1799)。實驗數據顯示這類的單株抗體在人類病患中引發較低的免疫性 (immunogenicity)，具有較長的半衰期以及較強的免疫反應。 9 1296930 最近有研究者在酵母菌中建立了一高速製造/篩選人類抗體系統（us 6406863)。相較於噬菌體表現系統，以酵母菌製造的抗體在表現之後可自然折 疊，功能上應與人類抗體更相近。除此之外，在酵母菌中利用酵母菌雙雜合 (two-hybrid)系統可以輕易的篩揀抗體-抗原關連，因此相較於傳統方式可省 下許多時間與金錢。因此，酵母菌雙雜合系統提供一有效且經濟的方式篩選人類 抗體。 酵母卤抗體庫的另一個好處是酵母菌内發生的同源重組（homologous recombination)。VH與Vl序列的重組更增加了 scFv library可能的複雜度，並 可在maturation後提高篩選後的scFv的連接親和力。 【發明内容】 抗體本發明提供一種針對腸病毒EV71型的VH具有專一性之抗體。 在此『抗體』係指包括完整抗體（即包含兩個重鏈與兩個輕鏈的抗體），或 具有能連接抗原的部分抗體片段，例如Fab，F (ab，）2，Fv或單股Fv (scFv) 片段。本發明較佳的實施例為scFv抗體（single chain Fv，scFv)。scFv由抗 體的輕鏈可變區域（Vl)與重鏈可變區域（v„)以-可f曲的連接物⑴nker) 組合而成。scFv因此可以連接抗原並可在細菌中快速生產。 1296930 本發明係提供一種抗腸病毒EV71型之抗體，其係包含邠(311)船.：14、15、 16 ' 19、20、2卜22、23、24、25或26的胺基酸序列或其活性同系物 (active h〇m〇l〇gUes)。本發明較佳的抗體，其胺基酸序列係為SEQ ID N〇·洲， 此序列可進一步用以設計具有相似專一性的抗體。在較佳具體實施例，本發明之 抗體為人類單株抗體。在更加具體實施例，本發明之抗體為一單股Fv抗體(single chain Fv，SCFV)。 另外’本發明之抗體包含一雙重專一性（bispecific antibody)的抗體， 其包含兩個可變區域，至少其中之—是本發明之抗體的可域。最佳者為兩個 可變區域皆為本發明之抗體的可變區域。 本發明的抗體可連接至一抗病毒藥品（agent)或是可偵測的標記。這使得 抗體可以將此藥品或是可偵測的標記置放到目標病毒上，並造成目標病毒的損毀 /消滅。因此，本發明的抗體可用於治療或手術，作為對人類或動物的療程或手 術（例如放射免疫導向手術，mdioimmunoguided surgery)所需要的抗體；或 疋用於診斷人類或動物。本發明特別適用於針對腸病毒感染（如EV71型）的手 術或療程，或是針對腸病毒感染的診斷。 連接於抗體的抗病毒藥品可以是任何能損毁或消滅與抗體相接的病毒，或與 抗體相接内有病毒的細胞。例如，抗病毒藥品可以是有毒製劑例如化療製劑，放 射性製劑或是放射性同位素，也可以是酵素、前驅藥物（pr〇drug)或是細胞介 1296930 素（cytokine)。 適合的化療藥品已在文獻中詳細記載，包括anthracycl ines (如dau_ycin 或 doxorubicin)，methotrexate，vindesine，neocarzinostatin，cis-platinum， chlorambucil ’ cytosine arabinoside ， 5-fluorouridine ， melphalan ， ricin 與 calicheamicin。 可用於抗病毒製劑的合適放射性同位素已在文獻中詳細記載。 連結於抗體的抗病毒藥品亦可能是可啟動藥物前驅物的酵素，如此可在受感 染的區域將藥物前驅物啟動至活化狀態，這又被稱為『抗體導向酵素藥物前驅物 療法（antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)』。在臨床應用上， 將抗體-酵素接合物施予病人，使其能集中在被感染區域並治療感染部分。再將 藥物前驅物施予病人，使得藥物前驅物在酵素的催化下，能在被感染區域轉化成 有毒殺性的藥物。 與抗體接連的可偵測標記，可以是能呈像的藥品或是短半衰期的放射性同位 素’例如 luIn，1251 或 99mTc。 本發明的抗體與可偵測的標記連接，除可用於診斷外，亦可用於放射免疫導 向手術（radioimmunoguided surgery，RIGS)。放射免疫導向手術包含將一標記 12 1296930 好的抗體施予病人，之後以手術方式移除被抗體標記的組織。因此，被標記的抗 體能使手術醫師有效的針對受感染的組織。 本發明的抗體，其中可偵測的標記可應用於檢測或定量腸病毒，檢測方法包 括：（a)將樣本與抗體接觸，（b)偵測或定量標記的抗體，其中腸病毒可為完整 ♦ ❸病毒顆粒或是vpl次單位。本發明包含體外定量VP1，例如，抗體可以用於酵 • 素免疫为析法（enzyme—linked immunoassay , ELISA)，西方墨潰法（Western 籲 bl〇ttlng)或是在組織樣本中原位（//? s"")檢測腸病毒的感染。因此，本發 明包含以本發明之抗體用於在樣本中定量νρι的方法，這個方法包括：⑷將樣 本與有標記的本發明之抗體接觸，與(b)偵測或定量任何與νρι連接的抗體。 • 一般用本發明的標記抗體，以ELISA定量樣本中VP1的方法包括：（a)將一 未標記的本發明之抗體固定在一固定支標物上；⑹將樣本加入，使得樣本中的 腸病毒能被攫取；（c)依照發明加入標記好的本發明之抗體；與(d)偵測或定量任 ® 何連接至VP1的標記抗體。 本發明的抗體也可用於組織的原位測定或EV71的定量，例如用於免疫螢光 或免疫電子顯微鏡。要進行原位測定或定量，可先將組織自病人中移出，並讓一 才示疋的抗體能連接至樣本中的νρι。經由此方法，不但可以知道是否有EV71的存 在，也可標定其空間分佈。 13 1296930
本發明的抗體亦可用於純化VP1。一般傳統純化抗原的方法包括免疫沈澱與 免疫親和力管柱技術。在免疫親和力管柱技術中，一般先將本發明中的抗體與管 柱中惰性（inert)的基質連接，再將含有目標VP1的樣本通入管柱，因此Vpj 會被留在管柱之中。研究者再以化學或生物方法析出νρι。在以上測定、量化與 純化方法中，含有VP1的樣本可能是組織樣本或是自病人取得的細胞萃取物(cei J extract)。樣本也可能是以重組dna技術所製造而成，例如萃取物或是表現νρι 的宿主細胞。 用於體外的標記抗體，其標記可以是放射性同位素（例如32p*35s)，bi〇tin (可用與 peroxidase 連結的 avidin 或 steptavidin 測定），digoxigenin， alkaline phosphatase 或是螢光標記（例如 fluorescein 或 rh〇damine)。 本發明所包含之抗體，其胺基酸序列係由一包含序列SEQ ID N〇. :1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、η、12或13的多聚核酸編碼所譯出（encode)。 本發明另提供一種獲得本發明抗體的方法，包括··（a)自酵母抗體庫中選定 含有该抗體之酵母細胞，（b)將宿主細胞在能表現該抗體的條件下培養，與&)自 培養液中收集選定的抗體。本發明方法中，酵母表現庫是由以下步驟製作：（a) 自周邊血液細胞以RT-PCR準備Vh與Vl的DNA區段，（b)將Vh與Vl的編碼區段 以連接物（linker)接起，與(c)將含有連接好的▽1}與仏的載體轉形酵母菌。酵 母表現庫中，載體係用於複製與表現可做出前述抗體之去氧核醣核酸(DNA)。此 載體係選自於質體、病毒或噬菌體載體，除具有複製起點（〇rigin 〇f replication)外，其上可能另有啟動子與前述DNA功能上的連接。『功能上的連 接』意指啟動子與編碼抗體的序列的關係，足以使編碼序列的表現受啟動子的控 1296930 制。載體亦可以包含啟動子的調控子（regulator)。載體可能包括一或多個標記 基因，例如使用細菌載體時用的抗青黴素（ampicillin)基因，或是使用哺乳動 物細胞載體時用的抗新霉素（neomycin)基因。此載體可用於體外，例如利用DNa 產生相對應的RNA，亦可用於轉形或轉染宿主細胞。
本發明另提供一種製造本發明抗體的方法，其包括：（a)在能表現抗體的條 件下培養宿主細胞，與(b)自培養物中收取抗體，其中宿主細胞經過轉形或轉染 而可以表現本發明之抗體。宿主細胞一般選擇與載體相容的，因此可為細菌、酵 母菌、昆蟲或哺乳動物細胞，在較佳實施例中宿主細胞為酵母菌。 本發明另提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體連結於抗病毒之藥品或 可偵測的標記，以及醫藥上適用的載體（carrier)或溶劑。在臨床上，抗體將 以非口服方式施予，例如以靜脈注射或是腹膜注射方式施予，因此此醫藥組合物 一般是適用於以非口服方式施予的。如此的組合物可輕易的包含抗體，並以等張 的鹽水（saline)或碳酸氫鹽（bicarbonate)為溶劑。抗體的最終用量仍須由 醫師決定，並應該考慮各種因素，例如治療方式、診斷結果、病人體重、狀況、 年齡等。合適的抗體用量已載於相關文獻中。一個合宜的人類用量可能介於0 01 至100 mg，較佳者為〇· 1至1〇 mg。本發明的抗體可用於類似已知的腸病毒。 以下實例係用於示範而非用於侷限本發明之範圍。 【實施方式】 15 Ϊ296930 實例1建構scFv library，VP1融合蛋白。以酵母菌雙雜合系统篩選可能的抗逋 人類抗體Vh與Vl的DNA片段係自周邊血液細胞取得。收集的血液細胞以數 組引子（oligonucleotide primer)利用RT-PCR增幅人類vH與Vl的cDNA片段 (Orlandi et al·，1989，户/w·舱ί/·也故/·免乂顺 86:3833)。這些引子 的設計是參考不同Ig基因家族的共同序列（引子序列請參照仍6，406，863)。 這些增幅的片段再與spacer/linker序列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 4相連形成單 股抗體（single-chain antibodies，scFv)。此些單股抗體的基因片段可接入載 體成為單股抗體庫，並可進一步轉形進入酵母菌細胞。 為了咼速篩選抗體’研究者將準備好的scj?v library作為酵母菌雙雜合系 統中的測驗蛋白（US 6，406，863)。每一個測驗蛋白皆為一個SC|?V蛋白與啟動 區段（active domain，AD)的融合蛋白。酵母菌細胞則被修飾為能表現一重組 蛋白，其包含-轉錄活化子（transcriptionactivator)的DNA連接區段(binding domain，BD)與目標抗原，EV71的VP1 (序列37)。酵母菌並被改造為能表現一 報導基因，其表現係受一特定DNA連接區域調控。當scpv與目標抗原相連時， AD就會被帶近BD，造成BD連接的臟連接區域下游的報導基因（LacZ/HIS3) 的轉錄活化（圖1)。陽性的克隆可用組織胺酸（histidine)缺乏的培養基篩選， 而表現程度可以 ONPG (CMiitrophynyl，召-D-galactopyranoside)試驗測量。
為準備目標抗原的基因片段，發明者首先將EV71-B (TW/1743)與EV71 -C 1296930 (TW/2086)分別自病人組織中分離出來，並在Vero與RD細胞中繁衍。增幅之 後，將病毒顆粒以蔗糖梯度離心（sucrose gradient centrifugation)方式純 化。蔗糖梯度離心之流程可參考Abraham與Colonno，1984，/. 57:340 ;
Smyth et al·，1993，/· ifo人价从 230··667。病毒 RNA 係以 RNA 純化套組， 遵照製造商的操作流程進行（Qiagen Co.，USA)。 發明者將自兩種基因型取得的VP1基因片段以RT-PCR增幅，並克隆至轉錄 活化子的BD的下游。病毒RNA則自被/7(¾/感染的細胞以一商業套組純化（QIAamp viral RNA mini kit，Qiagen Inc.，Santa Clara , CA)。第一股 cDNA 是以反 轉轉錄酶（reverse transcriptase) (Promega，USA)與和 VP1 的病毒基因 3’ 端互補的引子（序列 38 : TCCTCCTGCGAAGCTGCTGACT)生成（Wu et al·，2002， feaw/?ei^:895)。發明者再以 pfuDNA 聚合酶與一對引子（EnvplF : CACTCTTCCA TGGATATCCTACAGACAGGCA » EnvplR ： TCCTCTTCTAAGGAGAGTG GTRATTGCTGTGCGAC ) ? PCR增幅35次整個VP1蛋白的雙股基因（94Χχΐ min，55ccxi min與72Xx2min)。
EnvplF與EnvplR是根據VP1基因已知的N端與C端序列設計的。發明者再 將增幅後的VP1DNA經EcoRI切割位引入pcDNA3载體中（Invirt〇gen，)。 發明者將構築好的scFv表現載體與EV71表現載體分別引入不同的單倍 (haploid)酵母菌細胞（US 6406863專利案）。經兩個單倍酵母菌細胞交配後， 使scFv表現載體引人酵母菌中。研究者將兩種單倍酵母菌細胞（如&1咖與& 型酵母菌）’分別攜有scFv纽載體與VP1表現載體，交配後成為攜有兩種表現 17 1296930 栽體的雙倍酵細胞。如圖丨所示，原本含有目標抗原表現·的單倍酵母菌 細胞’在特定DNA連結位置的下游亦有報導基因。因此兩個單倍酵母細胞交配之 後，如果可能的scFv抗體能連接到目標νρι上，AD就會被帶近仙，造成報導基 因轉錄的活化。發明者由觀察報導基因的表現程度與其他可選擇的標記，可以筛 選出能有效與抗原VP1連接的scFv抗體，並再克隆這選定的_抗體。發明者 之後分離並定性含有這些有潛力的scFv抗體的質體。 發明者總共選擇了 10個親本的（parental)克隆（序列14—23)。利用突變 PCR (mutagenic PCR)，發明者可將這些克隆的親和力再次提升，並另外選擇了 13個成熟的克隆⑽序列卜13，蛋白f序列24—36)。其中發明者细酵母雙 雜合系統，比較了 6個控制組（control baits)，與部分抗體與_ νρι陽性 克隆的抗原連接專-性；分別以藏，laminC，IL—8, _，卿，與前作為 控制組，與啟動區段⑽开Μ重組蛋白，利用酵母雙雜合系統檢測與mi ypi 疋否會產生連接’於培養基上觀察是否可形成菌落（圖2)，結果顯示，6個控制 組皆無法形成菌落，僅有篩選出來的scFv克隆產生菌落，證明抗體與_則 的抗原連接專一性。 實例2純化候選scFv 為了在酵母雙雜合系統確認所選擇的sCFv克隆的抗原特一性，發明者將選 定的scFv克隆的DNA片段引入i：⑺//的表現載體pET27b+中（N〇vagen c〇.， 18 J296930
Germany)，與BL21 (pLys)型£⑺厂。在經過1 mM IPTG在37T的誘導表現4
hrs後，發明者將經過（His)6標籤與HSV標籤的scFv蛋白在包含物（inclusion body)中表現與沈澱。再將包含物溶於6M Guanidine-HCl緩衝液（5mM imidazole ’0· 5M NaH，20mM Tris-HCl)並在 4°C 下搖晃過夜。在離心（i6〇〇〇xg， 20min)後，收集上清液並以〇· 45 //m濾紙過濾，並通過2 ml的Ni-NTA親和管 柱。以 10ml Wash Buffer I ( 6Μ Guanidine-HCl buffer，5mM imidazole，0· 5Μ NaCl，20mM Tris-HCl)與 Wash Buffer II (6M Guanidine-HC1 buffer，20mM
imidazole，〇.5MNaa，20mMTris-HC1)清洗管柱。最後，以析出緩衝液（6M
Guanidine-HC1 buffer，50mM imidazole，0·5Μ NaCl，20mM Tris-HC1)析出 scFv (圖3)。將純化出的scFv蛋白與恢復變性緩衝液（renaturingbuffer)透 析2天來恢復蛋白質折叠，恢復變性緩衝液包含〇· 5ML-arginine (100mMTris， ρΗ8· 0，lmM EDTA，ImM DTT，20% glycerol，〇· 5% Sarkosyl，〇· 5M L-arginine) (Lin et al.，2001，如5/·万瓜 294:44)。 實例3純化VP1 為了暸解scFv的活性’發明者將在酵母菌表現載體中的vpi基因區段引入 載體 pETblue2 vector 中（Novagen Co·，Germany)成為重組的 VP1 蛋白，並以 (His) 6標籤修飾其C端。表現、純化與重新折疊vpi蛋白的流程與scFv類似 (圖 4)〇 19 1296930 實例4利用ELISA檢驗scFv的連接專一性（binding specificity) 發明者利用ELISA檢驗選定的克隆對重組VP1的連接專一性（圖5)。將純化 的VP1以500 ng/孔，0· 1M NaC〇3，ρΗ=9· 6的條件塗抹在96孔培養槽中，並在 4°C下培養過夜。再將塗抹過的培養基以3〇〇 β 1/孔，5%脫脂奶在pBS中，在 37DC下阻斷1小時。將培養盤以有〇· 〇5%Tween-20的PBS棚//1/孔清洗5次。 純化的scFv抗體分別以含〇· 1% gelatin的PBS稀釋至0.5 eg/ml，1.0 "g/ml ’ L5 /zg /ml與2.0 /zg /ml，在每一塗抹後的培養盤中加入100以/ 孔。在37°C培養2小時。將所有盤真空抽吸，並以含有〇· 〇5% Tween_20的PBS 以棚"1/孔清洗5次。將二抗老鼠抗HSV (mouse anti-HSV)以20 ng/孔加入， 在37°C下反應1小時。將所有盤真空抽吸，並以含有〇 〇5%Tween_2()的4〇〇 孔PBS β洗5次。以與抗老鼠lg(j的抗體（1:5000稀釋至1 mg/ml，100 " 1/well) 接合的辣根過氧化酵素偵測已附著的抗體，在37°C下作用1小時。將所有盤真空 抽吸，並以含有〇· 05% Tween-20的400 /z 1/孔PBS清洗5次。最後將所有盤以 100 // 1/well TMB受質呈色，並以650 nm為標準記錄450 nm的吸收值（圖5)。 以BIAcore2000 (PharmaciaCo·，USA)測量抗體與重組VP1的連接親和力 (圖6)。首先將選定的scFv蛋白2〇〇 _接上Ni-NTA小片（PharmaciaCo.， USA)。再將不同濃度的VP1蛋白（5〇 nM到1000 nM)通過小片，並以BIAcore 程式計算連接相關圖。由此可以畫出不同濃度的VP1之連接與分離曲線圖，並可 1296930 計算選定的ScFv的親和力。 實例5計算scFv的中和反應 將純化的scFv蛋白與病毒顆粒（virions )共同培養以計算其中和力價（Baxt etal. Ί984^/. Virol 51:298 ； Wiley et aL ^ ^ Viral Immunol. 3:137)° 首先在進行中和檢驗之前一天，將2xl04 cells/孔人類橫紋肌肉瘤細胞 (rhabdomyosarcoma，RD )植入96孔培養盤中。隔天，以病毒m· 〇·丨·（ mu 11丨p丨丨ci ty of infection) =1(T3兩倍稀釋scFv蛋白（2-1〜2-1D)，培養在37χ下！小時後，塗 抹在含2%的幼牛血清（fetal bovine serum )的DMEM培養液中的單層RD細胞 上’再培養3天。以10%福馬林（formalin)固定培養細胞，並以1% crystal violet染色存活的細胞。 scFv的中和活性是以每一孔在的570 nm的光學密度計算。每個樣本皆有三 次重複。scFv的IG。為能夠阻止EV71 50%的感染性的scFv濃度。發明者檢驗 了其中兩個scFv克隆，scFv-G334與scFv-G336，並以一無關的克隆sCFv-G74 作為控制組。根據實驗結果scFv-G334與scFv-G336對EV71的IC5〇分別為3 /zg/ml 與 5 /zg/ml (圖 7)。 實施例6以溶菌斑減少測驗（plaque reduction assay)測定scFv的中和活性 21 1296930 將EV71病毒顆粒（200病毒顆粒）與稀釋後的scFv蛋白或是控制組PBS混 合’在37T下反應1小時，再加至6孔盤内的雙倍或三倍單層RD細胞1小時， 進行病毒吸收。將未附著的病毒顆粒洗掉後，將細胞以含〇· 3 %瓊脂糖的培養液 收割’在37T下’ 5% C〇2下培養4天。將細胞固定後，以crystal violet染色 以計算溶菌斑數。 發明者檢測了 8個scFv克隆，分別為scFv-G333〜cFv-G336， scFv-G621 〜scFv-G625，對 EV71-B (圖 8A)與 EV71-C (圖 8B)的中和活性。每 個待測抗體濃度為5 /zg/ml。實驗發現由scFv來的抗體，相較於PBS控制組， 可減少溶菌斑數10%〜50%。 實例7以桿狀病毒表現系統製造完全抗體 為製造完全的抗體，發明者以IgG重鏈訊息胺基酸（signal peptide)， scFv-G625 重鏈可變區域（VH)與 IgGr 1 固定區域（PCEF/DB625-huCgl，圖 9A) 組成IgG重鏈。另外以IgG/c輕鏈訊息胺基酸，scFv-G625輕鏈可變區域（vL)， 與IgG/c固定區域（pCEF/DB625-huCk，圖9B)組成IgG輕鏈。發明者以PCR增 幅G625重鏈，流程為使用ThermalAce DNA聚合酶（Invitrogen，USA)與一對 引子 H625F (5’ -TGC TCT AGA GCC ACC ATG AAG CAT CTG TGG TTC)與 H625R (5, -TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAC )，進行 PCR 30 循環（94°Cx30 sec，60 °Cx30Sec 與72Tx2 min)。將增幅後的重鏈片段在Xba I與Stu I切割位克隆入桿狀病 22 1296930 毒載體 pAcDB3 (Pharmigen，USA)，成為載體 pAd)B3-G625Crl (圖 9C)。 發明者以PCR增幅G625輕鏈，流程為使用Thermal Ace DNA聚合_
(Invitrogen，USA)與一對引子Small (5，-TCC CCC GGG GCC ACC ATG AGG GTC CCC GCT CAG)與 L625R (5’ -GGA AGA TCT TCA ACA CTC TCC CCT GTT)，進行 PCR 30 循環（94°Cx30 sec，60 °Cx30sec 與 72 °Cx2 min)。將增幅後的輕鏈片段 在Xma I與Bgl II切割位引入桿狀病毒載體pAcDB3-G625Crl，成為載體 pAcDB3-G625CrlCk (圖 9)。 發明者根據 BaculoGold Expression System (Pharmigen，USA)準備重組 桿狀病毒。將579細胞在無血清的培養液（Gibc〇)中懸浮培養，再以m 〇· i·為 10的重組桿狀病毒感染細胞。將病毒與細胞在27°c下培養72小時。 將細胞以離心1000 xg l〇min收割，以丨x PBS清洗細胞兩次，再將細胞以 含有ImM PMSF與1% Tween-20的PBS在冰上溶解20 min。將上清液經離心20 分鐘20000 xg後收集，再以Protein A親和管柱純化。 首先將有 1 ml 的 Protein A resin (HiTrap rProteinA lml，Pharmacia， USA)管柱以1〇ml i χ pBS平衡，再加入上清液，再以1〇 ml 〇· 1M μ卿讨此pH =4· 5的溶液沖洗管柱，並以〇·丨M Glycine pH = 3· 〇析出蛋白質。將析出的部 分及合併與透析緩衝液（10mM HEPES，150mM KC1，ImM EDTA，50% Glycerol， 23 1296930 1 一.^·義晰t _μ. 年暴·\4{更)正替換頁 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 ρΗ=8· 0 )透析。 發明者以如上述的溶菌斑減少試驗檢驗完全G625抗體的中和反應。首先發 明者讓稀釋的完全 G625 抗體（1，5 與 10 /zg/ml)、l〇eg/ml human IgG (Sigma， USA)，與透析緩衝液接受檢驗。實驗發現與控制組相較，完全G625抗體(5 # g/ml) 能減少75°/◦的EV71-B溶菌斑（圖10A)與50°/◦的EV71-C溶菌斑（圖10 B)。人類 IgG與透析緩衝液所減少的溶菌斑數則與只有病毒的控制組無顯著差別。這個結 果證實EV71對宿主細胞的感染與增值，可以被某些針對VP1的單株抗體所阻止。 【圖式簡單說明】 圖1以高速酵母菌雙雜合系統篩選抗體示意圖。EV71 vpl: EV71的衣殼蛋白 (capsid protein) VP1。scFv :抗體的單股 Fv 區段。DNA-BD : DNA 連接區 域。AD :轉錄-啟動區段。GAL1 UAS : GAL1的上游啟動序列。（A) DNA-BD/EV71 vpl蛋白與GAL1 UAS連接，但在缺少AD的情況下無法啟動轉錄。（B)AD/scFv 抗體庫蛋白無法落在UAS因此無法啟動轉錄。（C) EV71之VP1如能與受檢驗 的scFv抗體庫的抗體交互作用，則AD/scFv會被攜近UAS，並恢復GAL1的 功能，造成報導基因的表現。 圖2測量EV71 VP1的陽性克隆的抗原關連特異度（antigen-association specificity)，上：G338、G235 及 G234 的親本克隆；中：G333、G2334 及 G335的親本克隆；下：G621、G622、G623、G624及G625的親本克隆。 圖3純化有潛力的scFv。箭頭標示純化的scFv。 24 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 年私獨:(更成.替換 圖4以Ni親和力純化的EV71 VP1蛋白的SDS-PAGE圖。箭頭標示溶出的EV71 VH-Hise。 圖5以ELISA檢驗scFvs的相連專一性。 圖6以BIAcore 2000親和力檢驗測量scfv與重組VP1的連接。 圖7scFv的中和反應。（A)選擇抗EV71-B型的scFv克隆。（B)選擇抗EV71—C 型的scFv克隆。 圖 8以溶菌斑減少試驗（plaque reduction assay)檢驗 scFv 對（A) EV71-B， 與（B) EV71-C的抗體中和反應。 圖9建構全G625抗體重組桿狀病毒（baculovirus)°(A) G625重鍵構築 pCEF/DB625-huCgl，（B) G625 輕鏈構築 pCEF/DB625-huCk，與（C)桿狀病毒 轉移載體 pAcDB3-G625CglCk。 圖10以溶菌班檢少試驗測量全G625抗體重組桿狀病毒的中和反應。（A) G625 抗 EV71-B，與（B) G625 抗 EV71-C。 25 1296930 申請案號：094Π5151 專利補充、修正未劃線版 序列表 <110〉 財團法人生物技術開發中心 <120〉 抗腸病毒71型重組中和性抗體及其應用 <130〉 無 <160> 29 <170> Patent In version 3.1 <210〉 1 <211> 759 <212〉 DNA <213〉 人工 <220> <221 > V_region <222〉 (1)..(759) <223〉 scFv-G625 <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 .................... ...................................................................................... ................-...............................................................................................................................................................................— .........................................................—.__—.................... tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtgt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt 300 gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcaggcg gtggcggatc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420 ggcagtaatt ttacgccgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc 480 accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540 cagcagcttc caggatcagc ccccaatgtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca 600 ggggtccctg accgattctc tggccccaag tctggcaccc cagcctcccc ggccatcact 660 gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag oagcctgagt 720 ggtgaggtct tcggcggggg cacccagctg accgtcctc 759 <210> 2 <211> 789 <212> DNA <213>人工 <220> <221> V_region <222> (1)..(789) <223> scFv-G624 <400> 2 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180 1 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac _ tcctcaggcg 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cggcggtgga 420 tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc 480 atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540 ctcacctatg gtaacagcaa tcggccctca 600 tctggcaccc cagcctcccc ggccatcact 660 tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720 accgtcctcc egaattegag cacccagctg 780 789 ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60 acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct 120 ataggccaag atggaagcca gcaatactat 180 tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 acggctgttt attactgtgc gagagetett 300 ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga 420 tctgtgtcgg aggccccggg gaggacggtc 480 atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540 ctcacctatg gtaacagcaa tcggccctca 600 tctggcacct cagcctcccc ggccatcact 660 tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720 accgtcctc 759 2 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <400〉 4 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagcca gcaatactat » gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt ^ gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc . tcctcaggcg gtggcggato aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggcggtgga ggcagtaatt ttacgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaggacggtc accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 一 gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt ggtgaggtct tcggcggggg cacccagctg accgtcctc <210> 5 <211> 759 <212> DNA <>人工 <220> <221> V-region <222> (1)..(759) <223> scFv-G621 <400> 5 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtggag cctctggatt cacctttagt acctcttgga tggcctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataggccaag atggaagtca gcaatactat gcggactctg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagctctt gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc cgggaaccct ggtcaccgtc tcctcaggcg gtggtggacc aggcggcgga ggatctggcg gaggtggcag cggtggtgga ggcagcgat t ttatgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac . cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacagcaa tcggccctca ggggtccctg accgattctc tggctccaag tctggcacct cagcctcccc ggccatcact gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt ggtgtggtct tcggcggagg cacccagctg accgtcctc <210> 6 <211> 768 <212〉 DNA <213>人工 <220> 3 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <221〉 V-region <222> (1)..(768) <223> scFv-G338 <400> 6 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggagg ccccctcagc gactatggct tcagctgggt gcgactggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg ggtgggaggg atcatcccta tgtttggaac accaaactac 180 gcacagaagt ttcagggcgg agtctcgatt accgcggacg agtccacgac cactgcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acgggcgtgt attattgtgc 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gagagetett 300 gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcaggcg gtggtggatc aggeggegga ggatctggcg gaggtggcag cggtggtgga 420 ggcagtaatt ttatgctgac tcagccccac tctgtgtcgg aggctccggg gaagacggtc 480 accatctcct gcactgggag cagctccaac atcggggcag gttatgatgt acactggtac 540 cagcagcttc caggatcagc ccccaaagtc ctcatctatg gtaacaacaa tcggccctca 600 ggggtccctg accgattctc tgactccaag tctggcacct cagcctccct ggccatcact 660 gcattccagg ctgaggatga ggctgattat tactgccagt cgtatgacag cagcctgagt 720 QQtgtggtct teggeggagg cacccagctg accgtcctc 759 <210> 8 <211> 759 4 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <212〉 DNA <213>人工 <220> <221> V-region . <222> (1)..(759) <223> scFv-G335 ， <400〉 8 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc tcctgtggag cctctggatt cacctttagt ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc gtggactctg tgaagggccg attcaccgtc ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac » gacgacagtg ctggctggtt tgaatttgac tcctcaggcg gtggtggatc aggcggcgga ggcagtaatt ttatgctgac tcaaccccac accatctcct gcactgggag cagctccaac cagcagcttc 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Ser Ala Ser Val Gly Gly Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 165 170 175 ► Gly Ile Gly Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 180 185 190 . Pro Lys Pro Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Leu Gin Ser Gly Val Pro 195 200 205
Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie 210 215 220
Thr Gly Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 225 230 235 240
Asn Tyr Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 245 250 255 15 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <210> 22 <211> 253 <212> PRT <213>人工 <220> <221> domain <222> (1)..(253) <223> scFv-G621 <400> 22
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Phe 130 135 140
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Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp 165 170 175
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Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Pro Ala lie Thr Ala Phe Gin Ala 210 215 220
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Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu 245 250 16 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <210> 23 <211〉 253 <212〉 PRT <213>人工 <220〉 <221> domain <222〉 （1)..(253) <223〉 scFv-G622 <400> 23
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
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Gly Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu 245 250 <210> 24 17 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <211〉 253 <212> PRT <213>人工 . <220〉 <221> domain . <222> (1)..(253) <223> scFv-G623 <400> 24
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe 130 135 140
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Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp 165 170 175
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Gly Glu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu 245 250 <210> 25 <211> 263 18 1296930 申請案號：0941 15151 專利補充、修正未劃線版 <212〉 PRT <213>人工 <220> <221> domain <222〉 （1)..(263) <223〉 scFv-G624 <400> 25
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser 20 25 30
Trp Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr lie Gly Gin Asp Gly Ser Gin Gin Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Leu Asp Asp Ser Ala Gly Trp Phe Glu Phe Asp Phe Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe 130 135 140
Thr Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly Arg Thr Val 145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 165 170 175
Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ser Ala Pro Lys Val Leu Thr 180 185 190
Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 195 200 205
Ser Lys Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ile Thr Ala Phe Gin Ala 210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser 225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu Pro Asn Ser 245 250 255
Ser Thr Gin Leu Thr Val Leu 260 <210> 26 19 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <211> 253 <212> PRT <213>人工 . <220> <221> domain _ <222〉 （1)..(253) <223> scFv_G625 <400> 26
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser 20 25 30
Trp Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr Ile Gly Gin Asp Gly Ser Gin Gin Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Cys 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Leu Asp Asp Ser Ala Gly Trp Phe Glu Phe Asp Phe Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe 130 135 140
Thr Pro Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly Arg Thr Val 145 150 155 160
Thr Me Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Me Gly Ala Gly Tyr Asp 165 170 175
Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ser Ala Pro Asn Val Leu lie 180 185 190
Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 195 200 205
Pro Lys Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ile Thr Ala Phe Gin Ala 210 215 220
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser 225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gin Leu Thr Val Leu 245 250 <210> 27 <211> 297 .〆 ^ 乂 20 1296930
申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 <212> PRT <213> Enterovirus 71 strain TW/1743/98 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(297) <223> enterovirus 71 strain TW/1743/98 VP1 subunit <400> 27
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val 15 10 15
Ser Lys Ala Leu Thr Pro Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Pro Asp Thr 20 25 30
Gin Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gin 35 40 45
Ala Ala Glu lie Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Me 50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu lie Asp Leu Pro 85 90 95
Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp lie Asp 100 105 110 I le Thr Gly Tyr Ala Gin Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr 115 120 125
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly 130 135 140
Arg Val Val Pro Gin Leu Leu Gin Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala 145 150 155 160
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Asp Ser Leu Ala Trp Pro Thr Ala Thr Asn 165 170 175
Pro Ser Val Phe Val Lys Ser Ser Asp Pro Pro Ala Gin Val Ser Val 180 185 190
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gin Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr 195 200 205
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gin Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala 210 215 220
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser 225 230 235 240
Ser Lys Ser Glu Tyr Ser Leu Val lie Arg lie Tyr Met Arg Met Lys 245 250 255
His Val Arg Ala Trp lie Pro Arg Pro Met Arg Asn Gin Asn Tyr Leu 260 265 270
Phe Lys Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asp Ser Ile Lys Pro Thr Gly 275 280 285 21 1296930 申請案號：094115151 ' 專利補充、修正未劃線版 Thr Ser Arg Thr Ala lie Thr Thr Leu 290 295
<210> 28 <211> 891 <212> DNA <213> Enterovirus 71 strain TW/1743/98 <220〉 <221> CDS <222> (1)..(891) <223> enterovirus 71 strain TW/1743/98 capsid protein VP1 <400> 28 gga gat agg gtg gca gat gtg att gag.agt tct ata ggg gac age gtg 48 age aga gcc etc acc ega got eta ccg gca cct acc ggc caa gac aca 96 cag gta age age cat ega tta gat act ggt aaa gtt cca gca etc caa 144 gcc get gaa att gga gca tea tea aat get agt gat gag agt atg att 192 gag aca egg tgt gtt ett aat tea cat age aca get gag acc act ett 240 gat age ttc ttc age aga gca gga tta gtt gga gag ata gac etc cct 288 ett gaa ggc aca acc aac ccg aat ggg tac gca aac tgg gac ata gac 336 ata aca ggt tac geg caa atg cgt aga aag gtg gag ctg ttc acc tac 384 atg cgt ttt gac gca gag ttc acc ttt gtt gca tgc acc cct acc ggg 432 gaa gtt gtc ccg caa ttg etc caa tat atg ttt gta cca ccc gga gcc 480 ccc aag cca gac tee aga gaa tct etc gca tgg caa act gcc act aat 528 ccc teg gtt ttt gtg aag ctg tea gac ccc cca gca cag gtt tct gtt 576 cca ttc atg tea cct geg age gcc tat caa tgg ttt tat gac ggg tat 624 ccc aca ttc ggt gaa cac aaa cag gag aaa gac ett gaa tac ggg gca 672 tgc cca aac aac atg atg ggt aeg ttc tea gtg egg act gta ggc acc 720 teg aag tee aag tac cca ttg gtg ate agg att tac atg agg atg aag 768 cac gtc agg geg tgg ata cct ege cca atg cgt aac cag aac tat eta 816 ttc aaa gcc aac cca aat tat get ggt aat tct att aaa cca act ggt 864 gcc agt ege aca gca ate acc act etc ^91 <210> 29 <211> 22 <212〉 DNA <213>人工 <220> <221〉 primer <222> (1)..(22) <223> Primer for VP1 eDNA <400> 29 tcctcctgcg aagctgctga ct 22
22

Claims (1)

1296930 申請案號:妒4^?^尽 專利補充、盡 申請專利範圍：
2. 3. -種抗腸病毒EV71型之抗體，其係包含SEQ ID n〇 i4、15、i6、 17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的胺基酸序列。 如申請範圍第1項所述之抗體’其胺基酸序列係為卿ID N〇. 26。 如申請範圍第1項所述之抗體，其胺基酸序列係由—包含序列SEQID Ν〇·:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或13 的多聚核酸編 碼所譯出（encode)。 4.如申請範圍第1項所述之抗體’其為—人類單株抗體。 5·如申請範圍第1項所述之抗體，其為一單股Fv抗體（single chain Fv，scFv)。 6· 如申叫範圍第1項所述之抗體，其胺基酸序列可用於製造雙重專 性抗體。 7.如申請範圍第6項所述之抗體，其中雙重專一性抗體係包含兩個變 異區域且其中一變異區域為申請範圍1所述之胺基酸序列。 8·如申請範圍第i項所述之抗體，其連接至一抗病毒藥品或是可债測 的標記。 9.如申請範圍第8項所述之抗體，其中抗病毒藥品或是可偵測的標記 係選自下列群組，包括：化療製劑、放射性製劑、放射性同位素、 酵素、前軀藥物或細胞介素。 10·如申請範圍第8項所述之抗體，其中可偵測的標記可應用於檢測或 定量腸病毒。 11·如申明範圍第10項所述之抗體，其中檢測或定量的樣本係為生物體 1296930 申請案號：094115151 專利補充、修正未劃線版 外檢測。 12·-種獲得如巾請範圍第4項之抗體的方法，包括： ⑷自酵母抗斷帽定含有該抗縣因之酵母細胞， ⑹细自酵母抗體庫選定之抗體基因，以重組桿狀病毒表現系統 生產完整人類單株抗體； 其中酵母抗體庫是由以下步驟製作·· ⑴自周邊血液細胞以RT-PCR準備VH與Vl的DNA區段， (ii)將Vh與VL的編碼區段以連接物（linker)接起，與 (^丨）將含有連接好的Vh與Vl的載體轉形酵母菌。 13· 一種製造如申請範圍第1項之抗體的方法，其包括； (a) 宿主細胞經過轉形或轉染後可表現SEQ ID N〇 : 14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25 或 26 之胺基酸序列；與 (b) 自宿主細胞中純化抗體。 14·如申請範圍第13項所述之方法，其中宿主細胞可為細菌、酵母菌、 哺乳類或昆蟲細胞。 15· 一種用於治療腸病毒71型之醫藥組合物，其包含申請範圍第’丨項之 抗體及醫藥上適用的載體或溶劑，其中該抗體連結於抗病毒之藥品 或可偵測的標記。 2
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