TWI290174B - Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells - Google Patents

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1290174 玫、發明說明： 本申請案請求美國臨時專利申請案60/423,536號之優 先權，其案名為「具有超越心肌細胞中自然產生之調節序 列的活性之合成性肌肉啟動子」，申請日為2〇〇2年^月 4曰’其全部内容以參考資料合併於本文。 [發明所屬之技術領域] 本發明係藉由產生隨機組合之合成性啟動子重組表現 構築體資料庫之方法製造心肌_特異性之合成性啟動子。本 發明另一方面係關於一種利用心肌_特異性之合成性表現 構築體於心肌細胞中表現所欲基因之方法。 [先前技術] 於體外及體内，在心肌細胞中進行重組基因表現之能力 握有治療許多先天及後天心血管疾病之希望（Un等人， 1990)。心肌與骨骼肌對經調節基因增補之質體來說為引人 注目之標的物，這是因為其壽命長，且對蛋白質合成及區 域性或一般作用之分泌有較大接受力（DraghiaAkH等人， 1999 ; Vale等人，1999)。再者，心肌及㈣肌組織係高度 血管化以及具有高血流率，㈣，使重新纟成之蛋白質輕 易地在局部作用或進入全身性循環。重要地，直接將質體 DNA投予至心臟或肌肉會造成重組蛋白f於肌肉細胞中表 現（Mazda，2002 ; Prentice 等人，1996)。質體 dna 可呈游 離型狀態進行重組蛋白質之表現達數個月至數年（Acsadi 1290174 等人，1991 ; Wolff等人，1992)。然而，於利用經調節基 因增補之質體來矯正或防止心臟疾病之限制性問題為：以 肌肉特異性載體會達到相當低之表現程度。雖然低表現程 度之重組蛋白質已足以對經表現之蛋白質產生免疫反應， 但是目前尚未使用肌肉特異性啟動子/加強子產生治療程 度之重組蛋白質（Montgomery等人，1997)。本發明係說明 一種構築及特徵化心臟及肌肉組織之合成性啟動子之方 法。於最終已分化之肌肉中，此等合成性啟動子之轉譯作 用效力遠超過自然的肌生骨骼心肌動蛋白基因啟動子以及 病毒的啟動子之轉譯作用效力。 當遞送治療性基因時，極需要使用組織特異性之啟動 子。已採用多種策略來創造或使用以治療為目的之組織特 異性啟動子，其於心肌及骨骼肌中可支持轉譯作用，且不 會作用於其他類型之細胞中（Keogh等人，1999 ; R0eii等 人’ 2002，Rothermel等人’ 2001)。此方法確保轉殖基因 僅作用於局部區域，而於非-標的組織或器官中不會出現不 適當的表現等潛在複雜之副作用。例如，由於安全之爭議， 目前無法將β-腎上腺素之構成要素，Akt或半胱天冬酵素 (caSpase)訊息傳遞途徑視為人類基因治療上之有用的標的 物。然而’亦有證據支持該等策略可將基因產物專一且直 接地標的於心臟調節，以及支持可設計出可專一且有條件 地調整其活性之分子技術（Condorelli等人，20〇1 ; Ding等 人，2002 ; Webster 及 Bishopric，2002)。本發明係說明一 種構築及特徵化心臟及肌肉組織之合成性啟動子之方法。 1290174 於最終已分化之肌肉中，此等合成性啟動子之轉譯作用效 力遠超過自然的肌生骨骼α-肌動蛋白基因啟動子以及病毒 的啟動子之轉譯作用效力，以及本發明在基因治療上可I 有重要之應用性。 分析數種強肌肉啟動子及加強子之編制（該分析係關於 順式作用調節元件之編組及其與肌生調節因子之交互作用 時，促使發明人設計出一套策略以構築合成性肌肉啟動 子。固有之肌生性啟動子（例如α•肌動蛋白類）呈現出複雜 的編制。其活化作用經常需要各種肌生性的反式_因子與特 定順式-元件對間之交互作用。這些元件在演化上係經保留 的且於成人之骨骼肌中主要負責組織特異性之表現，以及 這些元件於產生合成性啟動子上顯示為合理的選擇。藉由 將這些肌生性元件隨機組合至合成性啟動子（81>)重組資^料 庫中，然後藉由篩選數百個所得之純系之轉錄作用活性， 可創造出轉錄作用效力超過任何自然產生之啟動子之人造 啟動子’如美國專利第Μ1Μ28號（簡稱為’228專利）所述 者’該專利於2002年6月25曰獲准，其案名為「鏗別合 成性細胞-或組織特異性轉錄作用調節區之方法」，及發明 人為Schwartz等人，其全部内容合併於本文以兹參考' ，關於控制心臟-特異性基因轉錄作用之分子機制，需要 詳細研究掌管這些基因於時間間複合上表現之順式_元 件。脊椎動物的心臟係於胚胎發生中所形成，接著於一連 串複雜而肖ϋ官形成有關之事件中需要不同蛋白質存在及 作用’並藉由數種轉錄因子及其辅因子之結合交互作用而 1290174 緊密地調節（Nemer 及 Nemer，2001 ; Wang 等人，2001) 〇 首先，合併近端骨絡肌α-肌動蛋白之血清反應元件 (SRE)(5’-CC[A/T]6GG_3，）。於心肌、骨骼肌與平滑肌之（X-肌動蛋白啟動子中發現多重SRE (Chang等人，2001)，以 及於肌凝蛋白輕鏈與肌縮蛋白（dystrophin)中亦發現多重 SRE (Bergsma 等人，1986 ; Carroll 等人，1986)。此順式-元件係藉由反式-作用血清反應因子（SRF)，以及藉由競爭 抑制劑 YY1 (Chow 及 Schwartz，1990 ; Lee 等人，1992 ; Minty及Kedes，1986)所識別。血清反應因子（SRF)係許多 細胞外訊息-調節基因之重要調節子，對細胞生長及分化極 為重要（Zhang等人，2001)。當近端SRE中發生突變時， 會阻斷SRF之結合而破壞骨骼肌α-肌動蛋白啟動子（SK)之 活性，該活性係代表此啟動子元件之基本作用。第二，選 出 MEF-2 位置（5，-[C/T]TAAAAATAAC[C/T]3-3，），該 MEF-2 位置已於肌凝蛋白輕鏈3基因之啟動子/加強子區域中發 現。單一的MEF-2位置缺乏增強作用之活性，但具有多重 重複數（copies)者則顯示出強烈的增強活性（Gossett等人， 1989)。胚胎中，MEF-2位置突變時，會嚴重地降低啟動子 的活性，顯示出MEF-2於所有肌肉相關族群中在控制分化 方面的重要性（Kelly等人，2002)。第三，包含MEF-1位置 (5’-CANNTG-3’）或E-boxe，其發現於大部分（非所有）肌肉-特異性基因之上游調節區（Olson等人，1991 ; Weintraub等 人，1990)。MEF-1位置係由鹼性螺旋·環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH)家族之蛋白質所辨識。位於基本非 1290174 -肌肉啟動子上游之多重MEF-1位置足以指導肌肉·特異性 之表現作用，以及於短暫分析（transientassay)中My〇D所 調節之反式活化作用（Lassar等人，1991 ; Weintraub等人， 1990)。最後’選出高度保留之肌肉-CAT結構域，或teF-1 結合位置（5’_CATTCCT-3，）。TEF-1可調節肌肉-特異性 (SK、心肌肌弼蛋白T (cardiac troponin T)、心臟之α_及β- 肌凝蛋白重鏈）與非-肌肉特異性之轉錄作用（類人猿病毒第 40 型（simian virus 4〇)啟動子）（Larkin 等人，1996 ; 等人，1994)。 於M-C AT依賴型啟動子中，由於細胞之特異性及整體 轉譯作用的強度，特異性序列立即連接至核心結構域 (O’Connell等人，2〇〇1)。儘管先前吾人已說明創造合成性 啟動子及其肌肉特異性之方法（Li等人，1999)，但未說明 或證實該等啟動子之心臟特異性。例如，吾等實驗室未公 開之為料證明該骨骼肌α—肌動蛋白488 (SK488)獨佔性地 表現於基因轉殖之動物的骨骼肌中，然而以相同啟動子但 較長遠的觀點論，骨骼肌α-肌動蛋白622 (SK622)可表現於 骨骼肌及心肌兩者中。再者，由基因轉殖之動物（人造模型） 取得之資料並不能推斷直接注射後之轉染作用於活體内之 活性。例如，於直接注射後或體外細胞轉染後，該骨骼肌 α-肌動蛋白448 (SK448)表現於心肌細胞。 藉由自然產生之心肌啟動子所驅動之轉殖基因具有相 當低之心肌轉殖基因表現程度，因此使心肌作為調節基因 增補之質體之標的物的用途受到限制。然而，可由任意地 1290174 組合E-box、MEF_2、TEF-1及SRE元件之結構域，產生具 有心肌-特異性之合成性啟動子重組資料庫。藉由_選數百 個所得之純系於體内或體外之轉譯作用活性，發現少數具 有心肌-特異性之合成性啟動子，該啟動子具有進行轉譯作 用的潛力，而使其轉譯作用程度遠超過由原本肌細胞及病 毒基因所具有之轉譯作用的程度。這些啟動子係直接用於 表現核酸表現構築體中所欲之基因，特別係心肌細胞。因 此，這些心肌-特異性之合成性啟動子可為調節危及健康病 症之基因增補之質體所使用，此等病症例如缺血性疾病、 心肌梗塞或心臟衰竭。因此，本發明一方面係藉由產生任 意合成性啟動子重組表現構築體資料庫之方法製造心肌_ 特異性之合成性啟動子。本發明另一方面係關於一種利用 。肌特異性之合成性表現構築體於心肌細胞中表現所欲 基因之方法。 [發明内容] 本發明第一方面包括一種心肌特異性之合成性啟動 子。此啟動子係藉由下述方法製造，該方法之步驟包括： 將隨機組合之合成性·啟動子-重組表現構築體之資料庫引 入第一-細胞族群，形成第一_試驗_細胞族群；自第一_試驗 -細胞族群篩選出具有第一 _轉錄活性之第一心肌_特異性_ 純系，該第一-轉錄活性高於對照_轉錄活性；以及自第一 心肌-特異性純纟中利用心肌特異性-合成性啟動子作為心 肌-特異性-合成性表現構築體之心肌特異性-合成性啟動 11 1290174 於此技藝之人士應可明瞭，核酸序列中之元件或結構並不 需要以前後相接或相鄰之順序而操作性連接。 本文中所使用之「質體」，一般係指一種含有外來染色 體遺傳物質之構築體，通常為環狀雙股DNA，該DNA可 獨立於染色體DNA自行複製。可將質體或其片段作為載 體。質體係雙股DNA分子，其係發生於或衍生自細菌與其 他微生物（極少數）。不過，一般係排除粒線體與葉綠體 DNA、殺手酵母（yeast killer)與其他實例。 本文中所使用之「經調節基因增補之質體」係指一種於 體内藉由利用核酸表現構築體，使受者長時間暴露於治療 性蛋白質之治療範圍下。 本文中所使用之「啟動子」係指一種與基因之轉錄作用 相關之DNA序列。啟動子可指導原核或真核基因之轉錄作 甩。啟動子可為「誘發性」，亦即，使用誘發劑起始轉錄 作用’或者’相反地’啟動子可為「本質性」，亦即，誘 發劑無法調節轉錄作用之速率。啟動子可以「組織·特異性 或:組織·較佳性」之方法加以調節，使其僅於料組織類 型或典型中具有活性以轉譯經操作性連結之編碼區。此 =，啟動子可包括「病毒的啟動子」、「對照.啟動子」、 「自然產生的」、4「合成的」經組合之核酸序列。 本文中所使用之「報導子其闵.插 讯守于I因」係一種可編蝎出易於八 之蛋白質的核酸序列。i 4 具係用於取代其他難以分析之蛋 本文中所使用之「經隨機組合之合成性_啟動子-重組 物」係經隨機組合之順式·作用調節元件之組合物。 析 15 1290174 白質產物的編碼區。其中，常見的報導子基因為下列蛋白 質之基因··氯黴素乙醯基轉換酵素（“CAT”）、半乳糖苷酶 (“GAL”）、β-尿苷酸酶（“GUS，，）、螢光素酶（‘‘Luc，，）、以及綠 色螢光蛋白質（“GFP，，）。熟於此技藝者應明瞭，本發明亦可 使用其他報導子基因。而熟於此技藝者亦應明瞭，其他編 碼區（例如治療性基因）係易於經報導子基因取代。 本文中所使用之「轉錄活性」係指將編碼於Dna中之 貝訛轉錄為RNA分子，或將編碼於RNA分子核苷酸中之 資訊轉譯為所設定之蛋白質胺基酸序列。 、 中所使用之載體」係指任何可將核酸遞送至細胞 ^有機體内之媒介。其實例包含質體載體、病毒載體、微 月曰粒、或帶陽離子的脂質。本文中所使用之「載體」具體 地係指-包括基因物質之構築體，該構築體係經設計，並 藉由將核酉夂序列遞送至標的細胞中’使該細胞進行轉形作 用。載體可含有多個基因元件，該等元件在位置上及順序 上係與其他必須元件排列，使得所包含之核酸盒（nueieie % acid Cassette)可經轉錄且當需要時可於該經轉染之細胞中 進订轉#作用。攻些兀件係操作性連結的。「表現載體」 係& DNA質體’該質體包含所有於異種細胞中產生重組 蛋白質所需之資訊。 本發明第一方面包枯_、、Hr? 4士田 匕枯心肌特異性_合成性啟動子。此 啟動子係藉由下述方沐制^ 去氣每，該方法之步驟包括··將隨機 組合之合成性啟動子-重也表 至、、丑衣現樽築體之資料庫引入第一- 細胞族群，形成第一-試驗 武驗-細胞族群；自第一 _試驗-細胞族 16 1290174 元件與自然的骨骼肌α_肌動蛋 吾人發現多聚化之單一 啟動子（SK448)相比時，具有較低的活性，而約2·5% 之純系（該純系係由組合啟動子資料庫中之調節元件所驅 動·示出…〇倍之高活性。於雞之初級肌管(my〇tubes) 的轉染分析中指出：相較於CMV啟動子 啟動子中之-者，亦即spe5_12,其活性增加了 6倍，以及 相較於對照之SK448,其活性增加了至少10倍。 於小鼠之初級心肌細胞的轉染分析中指出：相較於

CMV啟動子’ SPc5_12其活性增加了之倍，以及相較於 SK448’其活性增加了至少13倍。於正常肌肉中直接將 質體注射至肌肉内2至4星期後，進行分析，結果顯示， 相較於SK448啟動子’ SPc5_12其活性增加了 3至4倍， 以及相較於CMV啟動子’其活性增加了 6至8倍。心肌與 肌肉之特異性係經由非-肌肉細胞株以及於基因轉殖動物 中加以證實。 然而，不欲受限於理論，已提出許多並未進行相關轉錄^ 因子之選殖之轉錄調節區。因此，這些「可能的轉錄因子 調節元件」仍需要藉由相關轉錄因子之鑑別，證實其對轉 錄調節作用之功能。故，本發明之合成性啟動子係利用順 式-元件之組合加以構築，其反式-因子為已知或未知。亦 利用合成性啟動子之資料庫，提供所欲之功能性組織特異 性的基本資料。由於PCR突變法可任意修飾調節區，因此 缔選分析係將此PCR方法用於篩選大量的調節區。 21 1290174 然而，不欲受限於理論，相較於先前技術所產生之質體 DNA 表現載體（Buvoli 等人，2002; Phillips 等人，2002; Xu等人，2002)，運用各個調節元件而非利用整個啟動子 來設計合成性啟動子/加強子之新穎系統代表顯著的改 善。例如，與自然產生之序列相較下，可展現持續且增加 表現之器官-特異性啟動子/加強子即是利用此新穎之策略 所獲得。雖然，體外分析可提供良好的啟動子效力指標， 仍需要進行體内研究，俾決定最適合之合成性啟動子，如 本發明之特定具體實施例所示。然而，不欲受限於理論， 用於調節心肌與肌肉之經調節基因增補之質體的質體DNA 的最適化作用可增加其在遞送治療性蛋白質上之利用，該 治療性蛋白質包含抗-凝集因子、超氧化物歧化酶 (“SOD”）、原血紅素氧化酶（hemoxygenase)或其他治療性分 子。 合成性啟動子與報導子質體之構築。自質體 p612a AC A TMLC (Chow 及 Schwartz，1990)中移除雞之骨絡 肌α·肌動蛋白啟動子（Chow等人，1991 ; Lee等人，1994) 之EcoRI/EagI片段，該片段之長度為144 bp，且於柱頭位 置（cap site)之上游 _25 bp 處含有 TATA box、於-35 至-65 bp 間含有Spl pair、以及於-65 bp處含有TEF-1位置。將該 片段選殖至pBluescript KS +之EcoRI/EagI位置，產生 PBS-SK144。然後以 Sacl/Hindlll 酵素切割 pBS-SK144，然 後將具有適當選殖位置之SK144片段移至pGL-2基本載體 (Promega，Madison，WI，USA)之 Sacl/Hindlll 位置，產生 22 1290174 用有意義與反義股之寡核苷酸（各20μΜ，總共為 600pmole)、ImM ΑΤΡ、以及 0.5U/ml 之 Τ4 ?灵核苷酸激酶（Τ4 polynucleotide kinase)進行，加熱至70°C維持15分鐘，然 後冷卻至室溫超過30分鐘。 然後，於總體積為1〇〇μ1下，使用不同莫耳比（第1圖）， 將SRE、MEF-1、MEF-2、及TEF-1之不同組合進行接合， 維持寡核苷酸之總量為200pmole。各調節元件之核心結構 域（劃有底線者）的兩邊皆有相鄰之序列，使得調節元件經 組裝後，調節元件之結合位置可面向DNA雙股螺旋的同一 邊。該接合反應係以T4接合酶，於反應體積為150μ1中完 成。接合後，經組合之元件於6%丙烯醯胺凝膠中進行電 泳。將75至3 00bp之區域切下，以2倍體積之擴散緩衝液 於 37°C 下洗提一整夜。使用 Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen Inc_，Chatsworth，CA，USA)萃取 DNA，以及將該 DNA於含有經磷酸化且煉合之Spl元件（2.5 nmoles)與10U 之Τ4接合酶之150μ1反應溶液中在16°C下培養一整夜。由 於各Spl元件（j-CCGTCCGCCCTCGGd，）的雨端含有一丰 的EagI，因此，當兩個Spl元件接合在一起後，可產生完 整的EagI限制酶切割位置。將反應純化（Qiaquick Nucleotide Removal Kit)、以EagI限制酶進行切割、然後 選殖至SK144GL-2螢光素酶報導子構築體之EagI位置， 產生隨機組合之合成性-啟動子-重組物之資料庫，其係操 作性連結至報導子基因。將於轉染實驗中得到最佳結果之 純系進行自動定序。 24 1290174 你冑組合之合成性-啟動子_重組物純系進行增幅及 币、肖。將整個隨機組合之合成性_啟動子_重組物之資 料庫進行轉形作用，然後於培養在瓊脂生長培養基上之艮 Η5α細胞中增幅，以及將各純系轉染至肌肉細胞中筛 選出特定的、純纟。將於轉染實驗中得到最佳結果之純系進 行自動定序。 ^本文中所長1出之核酸序列係正確的，但可能出現 少數錯誤。熟於此技藝之人士可藉由鑑別該特定元件及丨 於所提供之序列中之位置，而輕易地獲得正確之合成性調 節區，且由該等元件於相同位置及方向構築該調節區。 _選出具有高轉錄活性之合成性啟動子。於開始篩選合 成性啟動子期間，使用小量製備（miniprep) DNA進行轉染 作用。於96孔盤中使每孔含有4000個細胞，利用脂質體 轉染劑（lipofectamine)以每孔15ng質體之量進行轉染，於 轉染後72小時收集細胞，採用下段所述之條件。 細胞培養。自Gibco BRL (Grand Island，NY)購得基本 成分培養基（MEM)、加熱失活之馬血清（heat inactivated horse serum，HIHS)、僅大黴素（gentamycin)、漢克斯平衡 鹽溶液（hanks balanced salt solution，HBSS)、月旨質體轉染 劑。以66巧3111&等人所述之方法（661^8111&等人，1986)得到 雞之初級肌胚細胞以及小鼠之心肌培養。於轉染前24小 時，將細胞以1·5百萬個/100mm孔盤之密度培養，於MEM 中補充10% HIHS、5%雞胚萃取物（CEE)、以及僅大黴素。 將細胞培養於37°C、5% C〇2、95%大氣潮濕之環境下。根 25 1290174 據操作手冊，使用脂質體轉染劑，以4μ§質體/100mm孔盤 之量進行細胞轉染。轉染後，將培養基換成含有2% HIHS、 2% CEE之MEM，培養至少24小時，俾使細胞進行分化。 於分化後24、48、72、及96小時收集培養基與細胞。進 行兩次不同回合的轉染作用，並將該樣品與對照物各分析 四-人。由對照組之β-半乳糖苷酶組織化學達1 Q%以評估轉 染之效率。於Promega報導子分解缓衝液中將細胞均質 化’以進行螢光素酶、β_半乳糖苷酶及蛋白質分析。 北方點墨分析。以DNase I (Gibco BRL)處理1〇至20pg 之總RNA ’於1.5%之瓊脂精-甲醛凝膠中進行電泳，並依 大小進行分離’且將經分離之RNA轉移至Gene Screen尼 龍膜（DuPont Research Products，Boston，ΜΑ)上。藉由隨機 引物法（random priming) (Ready_t〇-Go DNA iabeling kit， Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，使膜與經 32P 標記之 cDNA探針進行雜合作用。於45它下，含有5〇%曱醯胺、 5xSSPE、5xDenhardtS、1% SDS、2〇〇μ§/ιη1 經修剪之鮭魚 精子DNA之溶液中進行雜合作用。於室溫下，該膜以 2xSSPE/l% SDS、10分鐘之時間洗滌兩次，以及於68。〇下， 以0.2xSSPE/l% SDS、30分鐘之時間洗滌兩次。接著於_8〇 °C，將墨點暴露於X-光薄膜下，並加上一層訊號增強板。 基因轉殖動物之研究。藉由標準卵母細胞注射法，產生 於SPC5-12啟動子之控制下帶有五α/ζ•卜半乳糠苷酶 (“β-gal”）與：NLS之基因轉殖鼠。將三種不同系之5週齡大 的SPc5-12-P-gal小鼠與同窩出生之對照組小鼠殺死，採集 26 1290174 不同器官與骨骼肌之樣品，貯存於_80。(：。為了進行p_半乳 糖苷酶組織化學，將組織切成i0μπ1厚之薄片，將其固定 並染色。 於成年小鼠體内利用肌内注射將質體DNA注入。將 SPc_5_12與SK448之質體製備物於PBS ρΗ=7.4中稀釋成 lmg/ml。ICR 小鼠（Harlem Laboratories，Houston，ΤΧ)以 κ 他命（42.8 mg/m 卜 ketamine)、如若夢（8.2 mg/m 卜 xyiazine)、 與乙醯丙嗪（0.7 mg/ml，acepromazine)之組合進行麻醉，劑 量為0.5 ml/kg。將50微克溶於25μ1無菌PBS之質體直接 注射至小鼠之前脛肌。注射後1、2、及4星期，迅速將經 庄射之肌肉取下，冷珠於液態氮中。於PBS中將肌肉均質 化’該PBS之pH值為7.4，且含有〇·2% Tritonx_l〇〇與蛋 白酶抑制劑（包含亮抑蛋白酵肽（leupeptin) 〇·7μ§/ί^、派斯 坦（pepstain) lOpg/m卜以及抑肽酵素（aprotinin)2pg/ml (Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN))。於 4°C 下以 1 〇，00Oxg將肌肉萃取物離心3 〇分鐘，回收上清液。利用 Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 進行蛋白質分析，測量螢光素酶與β_半乳糖苷酶之活性。 各時間點上，各個構築體係使用6至1 5隻動物進行實驗。 實驗重複兩次。 小鼠生長素RIA。以異種大氣分析系統（Amersham，

Arlington Heights，IL)測量血漿中之小鼠gH。此試驗之敏 感度為0.1 6ng/管。内變異係數與間變異係數分別為6.5及 6 · 8 % 〇 27 1290174 統計數值。採用微軟Excel統計分批卷 ,^ 土 y 卞析套組分析數據。圖 中』不之數值係平均土s.e.m，以發揮所欲之作用。 參考下列實施例可有助於了解本發明，該實施例係本發 明之某些具體實施例之示例性說明，不應以該等實施例限 制本發明之範疇。 實施例1 合成性啟動子資料庫之構築。不欲受限於理論，骨骼肌 A-肌動蛋白之内源性啟動子係非常強之啟動子。例如，當 聚·Α(Ρ〇1γΑ)ηιΚΝΑ自成年鳥類之肌肉中單離出來時，約 9%之經單離之總聚_AmRNA内包括骨骼肌心肌動蛋白 mRNA，其於心肌或骨骼肌中係表現程度最高之聚_A⑽财 (Schwartz及Rothblum，1981)。故將雞骨骼肌^肌動蛋白 之核心片段（亦即SK144)作為插入合成性調節元件之最短 序列（Lee等人，1994)，（Chow等人，1991)。各調節元件 之核心結構域的兩側皆具有相鄰之序列，該相鄰序列係保 留於自然之基因中，以使調節元件可與DNA雙股螺旋之同 一側煉合。例如，相當於近端SK SRE1，與MEF_1相鄰之 GCTGC結構域之血清調節元件（“sre”）係保留於肌肉肌酸 激酶基因以及大鼠之肌凝蛋白輕鏈基因中。將SRE、

MEF-1、MEF-2、與TEF-1寡核普酸之不同組合煉合（第1 圖），由於已證實Spl與SRE及E-box具有協同作用，故將 上述經煉合之序列藉由與Sp 1元件接合而加上柱頭。亦已 證實，Spl結合位置為CpG區塊（CpG island)與非區塊DNA 28 1290174 區域之重新曱基化保護作用所必須（Mach〇n等人，i998)。 自包含約5至20個調節元件之DNA片段中產生合成性啟 動子，以及將其與可表現螢光素酶報導子基因之最小肌動 蛋白-報導子質體接合。 篩選具有高轉錄活性之合成性啟動子。螢光素酶之體外 活性係於96孔盤内，以超過1〇〇〇個不同之純系進行測量， 包含瞬間轉染雞之初級肌胚細胞，以決定新構築之合成性 啟動子之強度。將鳥類骨骼肌心肌動蛋白基因中長度為 448bp之啟動子片段（(_424/+24)(“似伙，)）作為心肌與骨 路肌之特異性表現對照物（第2圖）。已證實該似48啟動 子（對照物）於經分化之骨路肌肉細胞中具有活性，但是於 肌胚細胞中則否（Bergsma等人，！ 986 ; Ck與^福z , 199〇; ^等人，1994)。亦使用以細胞巨大病毒（“CMV”） 為主之啟動子作為普遍之啟動子對照物。將新產生之合成 性啟動子、CMV啟動子、以及SK448啟動子插入報導子構 築體之請’且轉染至細胞，然後置於分化作用培養基中 達時’使其開始停止細胞週期’且誘發融合後之分化 作用以及肌肉·特異性啟動子 初卞古化作用。於末期時，收集 細胞，並分析報導子基因之活性。 僅由多聚化之單—开杜Μ丨L 〇 牛（例如 SRE、E-box ' MEF-2、或 TEF 1)構成之啟動子’复典 、14低於月骼肌α_肌動蛋白啟動 子448數倍（未顯示數據） 爆）σ人發現某些含有組合元件之 啟動子與SK448相比時，顯干屮2 s ^ ^ ^ m ;不出2至10倍之高螢光素酶報 導子基因活性（第3圖）。對 ；对顯不出其轉錄活性係SK448之 29 1290174 活性的2倍以上之純系進行進一步試驗。來自第一及第五 組合群中之某些純系（例如cl-28、C5-12、c5_l、c5-5，其 中 SRE、MEF-2、MEF 小 TEF-1 分別係以 1:1:1:1 與 1:1:1:4 之比例混合）於體外及/或體内皆具有最高活性（參見第1 圖）。 由於已經顯示某些於體外具有高表現程度之肌肉特異 性調節元件，其於體内卻具有較低之活性，因此，細胞培 養试驗系統無法輕易地取代體内試驗，來篩選骨骼肌之新 的質體構築體（Barnhart等人，1998)。將50微克最具功效 之合成性啟動子（SPC1_28與SPc5-12)、SK448以及CMV質 體注射至成年ICR小鼠（n=6/組）之前脛肌。一星期後（第4 圖），CMV與SPc5_12之活性相似（分別為16 77土7 43與 14.59土9·39 X 1〇6 RU/pg 蛋白質），而 SK448 與 spcl 28 之 活性低了約10倍（分別為1.44 士 0.76以及1.58 土 0·65 X i〇6RU/ng蛋白質）。故選擇SPcS-12進行進一步研究。 於鳥類之初級肌細胞再生培養期間，對spc5_12進行 96小時之試驗，其中將複製之肌胚細胞自細胞週期内移 除，融合及形成多核之最終分化的肌管（第5圖）。CMv啟 動子於肌胚細胞與肌管内皆具有相似程度之活性（於24小 時時為1.05 士 〇.〇6χ 106RU (相對單位 小時時為咖0.22X心⑽蛋白質）。_8之表現6僅 於48小時後增加（於48小時時為〇 17±〇 〇ΐ6χ 1〇6奶心 蛋白質，於72小時時為〇·37±〇 〇9 χ 1〇0RU/^蛋白質， 於96小時時為〇.41±〇.〇6Xl〇6RU/^蛋白質），sk4m之 30 1290174 表現係與sk啟動子之活化作用的模式相關，其可於肌管中 活化但是不會於複製中之肌胚細胞活化

Schwartz，1986)。SPc5_12 之活化模式與 sk448 相仿。但 疋，於96小時時，SPc5-12之活性係SK448的1〇倍以上， 且係CMV的2至6倍（於48小時時為2·27±〇.23χ 1〇6κυ/μ§ 蛋白質，於72小時時為3·62±0.91 X l〇6RU/pg蛋白質，以 及於96小時時為7·25±〇·48 X l〇6Ru/pg蛋白質）。 於初級心肌細胞中對SPc5_12進行96小時之試驗（第6 圖），並且與普遍存在之啟動子CMV、s V4〇以及與肌肉特 異性啟動子SK448進行比較。如第6圖所示，於心肌細胞 中CMV啟動子具有最高之起始活性，該活性隨著時間遞 減。SK448與SPc5-12之活性於相同時段中呈增加趨勢， SK448與SPc5-12具有長時間之活化作用且該活性高於基 線。該骨絡肌細胞亦具有相似的情形，當心肌細胞於轉染 後96小時，該SPc5-12啟動子之表現係自然產生之SK448 的13倍，以及係CMV的2倍（第7圖）。 實施例2 SPC5-12啟動子於體外及體内之特異性。sPc5-12啟動 子之特異性係於數種非·肌肉細胞株中由瞬間轉染進行評 估。與大量表現之CMV啟動子相比，SPc5-12及SK448構 築體之β-gal活性於CV1細胞株（猴腎纖維組織母細胞）、 HeLa細胞（人類子宮頸上皮癌）、293細胞株（人類經轉形胚 31 1290174 胎腎細胞）、以及1GT1/2細胞株（小鼠胚胎 _相當低（第8圖）。 纖維組織母細 胞） 接者產生帶有五β_半乳糖苦酶（卜gai)以及由

析法顯示β-gal僅於肌肉及心臟樣品中進行轉錄作用；於非 肌生性器官中未偵測到表現作用。組織學上，P-gal呈陽性 SPC5_12啟動子控制之核定位訊號(nls)的基因轉殖小鼠4 決定其於體内之特異性。於5週結束時，將數個不同之 π 2基因轉殖p_gal小鼠殺死’且將不同器官（肺、肝 、白脾臟腸、月、腎、睪丸）以及心臟及骨路肌之樣品冷 束於液態氮中。β-gal之組織特異表現係藉由總麵之北 H墨分析法以及_化學技術（未顯示數據）進行評估（第 9圖）。於所有抓12基因轉殖陽性小鼠中，驗點墨分 之細胞核係存在於肌肉纖維，其具有原始的SK448啟動 子，但不存在於對照組之同寫出生者。於其他兩種基因轉 殖系中，具有相似之表現作用。

實施例3 SPC5-12啟動子之體内活性。利用肌内注射，將各構築 體直接注射至成年之具有免疫能力的小鼠中，之後比較 SPc5-12啟動子與常見之啟動子CMV與SV40、以及肌肉 特異性SK448啟動子之體内表現作用（第10圖）。於注射後 2及4星期，由SPc5-12所驅動之構築體的活性係sK44 8 啟動子之 3 至 5 倍（SPc5-12·· 2 週為 4_97±2.〇7X l〇6RU/pg 蛋白質，4週為3.78土 1·71 X 106RU/pg蛋白質；相對於 32 1290174 SK448 : 2 週為 1.37±0.43 X 1〇6RU/pg 蛋白質，4 週為 1.25±〇.〇4X 106RU~g蛋白質）以及其活性係cmv啟動子 週為 0.94土0.4 X 1〇6RU/pg 蛋白質，4 週為 〇 65±〇 ΐ6 χ 1 〇6則蛋白質）之6至8倍。於各測量時間點，sv4〇構 築體之活性（2週為0.05±0.02 χ 1〇δκυ/μ§蛋白質，4週為 〇·〇4±0.〇〇8 X l〇6RU/pg 蛋白質）比 SPc5_12 低 1〇〇 倍。這些 結果顯示，相較於習知啟動子，冑spc5_l2轉染至骨骼肌 細胞可顯著地提高表現作用。 本發明證實本發明之啟動子具有可確保所產生之經分 泌之蛋白質具有治療程度之能力。將人類生長素釋素 (human growth hormone releasing hormone，hGHRH)之 cDNA選殖至SPc5_12啟動子之下游。另外，製造一相同之 構築體作為陽性對照組，但是具有CMV啟動子。由肌肉細 胞所分泌之具有生物活性的hGHRH可刺激經注射之小鼠 的腦下垂體前葉分泌内生性生長素（“mGH”）。於將3〇微克 之SPC5-12-GHRH質體直接由肌内注射至成年小鼠體内七 天後’利用特定的RIA測量小鼠血清中之gh (“mGH”）。 與對照組相比’經注射SPc5-12-GHRH與CMV-GHRH之小 鼠’其血清中之mGH含量皆增加（SPc5_12_GHRH與 CMV-GHRH 分別為 24.84±13.15ng/ml 與 21.19±ll.〇5ng/m卜對照組為1β7土0.lng/ml)。使用這些合成 性啟動子（使用30pg之質體）所得到之數據為本實驗室先前 使用 lOOpgpSK-GHRH 所得之數據的 1.5 倍（Draghia_Akli 33 1290174 等人，1997)，而將質體之量標準化時，則顯示本發明之啟 動子的活性增加5倍。 於哺乳動物宿主中，可將上述合成性啟動子用於各種治 療性基因之器官特定表現。熟於此技藝之人士應明瞭，本 文所述之啟動子可指導各種不同用於經調節基因增補之質 體之基因的表現。根據本發明構築啟動子之方法及組成（其 可有效使表現載體基因轉移至宿主細胞），可於宿主細胞中 監測其治療效果（例如，減輕欲治療之特定疾病的相關症 狀），或者，進一步證實宿主中存在該經轉移之基因或基因 之高表現作用（例如，使用定序之聚合酶連鎖反應、北方或 南方雜合反應、或者轉錄作用試驗，以偵測宿主細胞中之 核酸，或使用免疫轉潰分析法（immun〇M〇t anaiysis广藉由 抗體之偵測作用、mRNA或蛋白質半生期研究、或特定之 試驗以偵測由經轉移之核酸所編碼之蛋白質或多肽，或藉 由此轉移增加表現程度或功能）。 曰 上述組織特異性合成性啟動子可用於不同的載體構築 體’然後投予至哺乳動物宿主’以進行各種治療作用。熟 於此技藝之人士應明瞭，可採用冬插 用夕種不同之方法將組織特 異性合成性表現載體投予至細胞。例如：⑴採用物 之方法，例如電穿孔法（電流）、基因搶（物理外力）或使用 大董體積之液體（壓力）；以及（2)將該組織特異性合成性表 現載體與另一實體複合在一起之方 成丨生表 分子。 &之方去，例如微脂粒或轉運 34 1290174 此外，本發明提供一種將組繡牲 ^ 、 罈特異性治療基因轉移至宿 之方法，該方法包括使用任何前十 17則返之投予途徑，或此技 食之人士所知悉之其他且適用的途你机 ’投予本發明之載 體，該載體較佳為組成之一部份。# 1仍根據本發明，有效地將 組織特異性表現載體之基因轉 夕王佰主細胞，可監測宿主 細胞之治療效果（例如，減輕欲 人/口蜃之特定疾病的相關症 狀），或者，進一步證實宿主中左产#, 中存在該經轉移之基因或基因

之表現（例如，使用定序之聚合酶 jL ^ ^ ^ 嗎逆鎖反應、北方或南方雜 a反應、或者轉錄作用試驗， 、 ^ M俏測佰主細胞中之核酸， 或使用免疫轉潰分析法、藉由抗靜 符田机體之偵測作用、mRNA或 蛋白質半生期研究、或特^之試驗以偵測由經轉移之核酸 所編碼之蛋白質或多肽，或藉由此轉移增加表現程 能）〇 法 應 作 本文中所述之組成及方法並不包括所有之組成及方 ’熟於此技藝之人士應了解亦可使用其他適用於該特殊

用之方法。此外，额成之有效量可進—步由具有所需 用之已知的類似化合物加以推知。 參考資料清單 美國專利文件 美國專利案第6,41〇,228號，申請日為1998年7月14 日以及其案名為「鑑別合成性細胞-或組織-特異性轉錄 作用調節區域之方法」，發明人為_霞㈣人。、' 其他公開之參考資料之清單·· 35 1290174

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[圖式簡單說明] 第1圖顯示於不同合成性啟動子之組合中，具有部份調 節元件之肌肉合成性啟動子的實驗策略及設計，其中各組 合至少含有一種肌肉特異性調節元件； 42 1290174 第2圖顯不於構築體中’肌肉合成性啟動子元件的設 計，該構築體與骨骼肌α-肌動蛋白488啟動子（SK488)相較 下，其於體外具有最高的報導基因活性； 第3圖顯示螢光素酶之轉錄表現，其係以超過sK448 表現量之倍數計算，該螢光素酶報導基因係藉由各種合成 性啟動子所驅動，且其活性係於分化後48小時測量； 第4圖顯不於成年ICR +鼠之前脛肌中，帛光素酶之 轉錄表現，該轉錄表現係由合成性啟動子spel_28、 SPc5-12、巨細胞病毒（“CMV，，）、以及SK448所驅動，該螢 光素酶之活性係於直接注射至前脛肌7天後測得； 第5圖顯示於雞之初級肌肉培養中，卜半乳糖苷酶 (P-gal)之轉錄表現，該轉錄表現係由合成性啟動子巨細胞 病毒（“CMV”）、SK448、SPc5_上2、以*對照組所驅動，該㈣ 之活性係於24' 48、72、以及96小時進行測量； 第6圖顯示於小鼠之初級心肌培養中，费光素酶之轉錦 表現，該轉錄表現係由合成性啟動子巨細胞病毒

(“CMV”）、SPc5_12、SK448、SV4〇、卜㈣、以及未轉染 細胞所驅動’該螢光素酶之活性係於24、48、72、以及I 小時進行測量； 第7圖顯示於心肌細胞中，於訂定時間下測量卜半乳 糖普酶之活性的結果，其中該p_gal之活性係於m、 72、以及96小時進行測量； 第8圖顯示p_gal之體外肌肉特異表現，該表現係由合 成性啟動子SPc5-12所驅動，其中於顯示細胞類型特異性° 43 1290174 表現中，由SPc5-12啟動子所驅動之β-gal表現程度與由 SK448啟動子所驅動之p_gal表現程度可相互比擬，以及於 數種非_肌肉細胞株（CVl，293，HeLa與10T1/2)中，由 SPc5-12啟動子所驅動之p_gai表現程度係小於由cmv啟 動子所驅動之β — gal表現程度至少一級之程度； 第9圖顯示於體内之肌肉及心肌細胞中，由合成性啟動 子c5-12所驅動之p_gai表現程度，使用不同系之基因轉殖 鼠（其基因係與β-gal cDNA探針雜合再與鼠之18S探針雜 合）之各組織（例如，睪丸（“T”）、腦（“B”）、腸（“p)、肺（“Lg”）、 胃（“st”）、腎臟（“κ”）、肝臟（“Lv”）、腓腸肌、心臟 (H”）、脾臟（“sp”））的總RNA北方點墨結果，顯示由spc5_12 所驅動之報導基因的肌肉與心肌特異性表現； 第10圖顯示由合成性啟動子巨細胞病毒（“CMV”）、 SPc5-12、SK448，、SV40、以及對照組所驅動之螢光素酶報 導基因之體内表現程度，其中該螢光素酶於體内之活性係 於直接注射於肌肉内後2及4星期進行分析； 第11圖顯示小鼠之鼠生長素的濃度，該生長素 係與由SPc5-12啟動子所驅動之GHRH表現構築體一起注 射至小鼠體内，與對照組啟動子相比，該GH的濃度係於 注射後第7天進行測定； 第12圖顯示具有經標記之調節元件以及限制酶位置圖 之合成性啟動子el_26的序列； 第13圖顯不具有經標記之調節元件以及限制酶位置圖 之合成性啟動子c2_26的序列； 44 1290174 第14圖顯示具有經舞 $& 5己之調郎元件以及限制酶位置圖 之合成性啟動子c2_27的序列·， 第1 5圖顯示具有缚辦 、、、& s己之調節元件以及限制酶位置圖 之合成性啟動子c5_5的序列； 第16圖顯示具有經择 、、w 5之調節元件以及限制酶位置圖 之合成性啟動子C5-12的序列； 第17圖顯示具有經標記一 之合成性啟動子心的序列广即7°件以及限制酶位置圖 第1 8圖顯示具有經標記 之合成性啟動子c6_16的序列调節元件以及限制酶位置圖 第19圖顯示具有經標記之 之合成性啟動子c6_39的序列即7°件以及限制酶位置圖

45 1290174 序列表 <110> Advisys 貝勒醫學院 <120〉具有超越心肌細胞中自然產生之調節序列的活性之合成性肌細胞啟動子 <130> 108328.00161 - AVSI-0027 <140> TW092130336 <141〉 2003-10-31 <150〉 US 60/423,536 <151> 2002-11-04 <160> 22 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213〉 人造序列 <220〉 <223〉啟動子中所使用之SRE控制元件 <400〉 1 gacacccaaa tatggcgacg g <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉啟動子中所使用之MEF-1控制元件 <400> 2 ccaacacctg ctgcctgcc <210〉 3 <211> 19 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉啟動子中所使用之MEF-2控制元件 <400> 3 cgctctaaaa ataactccc <210> 4 <211> 13 1290174 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉 啟動子中所使用之TEF-1控制元件 <400> 4 caccattcct cac 13 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 5 335 DNA 人造序列 真核啟動子C5-12之核酸序列 <400> 5 cggccgtccg ccttcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg 60 gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta 120 aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga 180 cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg 240 ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga 300 gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctaga 335 0 12 3 1111 2 2 2 2 < V < < 6 40 PRT 人造序列 <220> <223> 此為GHRH (1-40)〇H之人造序列 <220> <221> <222> <223> MISC—FEATURE(1).:(1) 位置1之Xaa可為酪胺酸 或組胺酸 <220> <221> <222> <223> MISC—FEATURE (2).7(2) 位置2之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 <220> <221> <222> <223> MISC—FEATURE (15)7.(15) 位置15之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 2 1290174 <220> < 2 21 > MI S C_FEATURE <222> (27)7.(27) <223〉位置27之Xaa可為甲硫安酸、或白胺酸 <220>

<221> MIS C—FEAT URE <222> (28)7.(28) <223> 位置28之Xaa可為絲胺酸天門冬醯胺酸 <400> 6 .Xaa Xaa Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Xaa Xaa Arg Gin Gin Gly 20 25 30

Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> 7 <211> 3534 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉HV-GHRH質體之核酸序列 <400> 7 gttgtaaaac gacggccagt gaatt^taat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc ccctttgacc ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 3 1290174 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc I860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520

4 1290174 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060 cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534 <210〉 8 <211> 3534 <212> DNA <213> 人造序列 <220〉 <223〉TI-GHRH質體之核酸序列 <400> 8 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc 60

accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 120 gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 180 tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 240 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa 420 480 ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct 5 1290174 ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc 540 ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa 600 ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg 660 agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg 720 ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag 780 tgcccaccag ccttgtccta gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct 840 tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa 900 cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc 960 tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt 1020 tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg 1080 gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt 1140 ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga 1200 ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg 1260 cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca 1320 ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct 1380 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1440 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcetaaagt 1500 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 1560 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 1620 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280

6 1290174 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 9 <211> 3534 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉TV-GHRH質體之核酸序列 <400> 9 gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3534 60 120 180 240 1290174 aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 300 cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 360 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10 1290174 accgtaa.aaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga 2460 actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 2520 gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 2580 acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 2640 agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 2700 cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 2760 gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 2820 gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 2880 gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 2940 ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 3000 cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 3060 cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 3120 cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 3180 catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 3240 caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 3300 agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 3360 agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca 3420 actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 3480 gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac 3534 <210〉 11 11 1290174 <211> 2710 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉 具有經GHRH類似序列最佳化之小鼠之密碼子的載體 <400> 11 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct 60 cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt .120 ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg 180 gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg 240 tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct 300 cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag 360 cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac 420 agctcaccta gctgccatgg tgctctgggt gctctttgtg atcctcatcc tcaccagcgg 480 cagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcaggatg cagaggcacg tggacgccat 540 cttcaccacc aactacagga agctgctgag ccagctgtac gccaggaagg tgatccagga 600 catcatgaac aagcagggcg agaggatcca ggagcagagg gccaggctga gctgataagc 660 ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 720 actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 780 gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg 840 aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc ttttgttccc tttagtgagg 900 gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 960 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1020 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1080 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1140 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1200 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1260 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 1320 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 1380 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 1440 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 1500 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 1560

12 1290174 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggctagc gcttagaaga actcatccag cagacggtag aatgcaatac gttgagagtc tggagctgca ataccataca gaaccaggaa acggtcagcc cattcaccac ccagttcctc tgcaatgtca cgggtagcca gtgcaatgtc ctggtaacgg tctgcaacac ccagacgacc acagtcaatg aaaccagaga aacgaccatt ctcaaccatg atgttcggca ggcatgcatc accatgagta actaccaggt cctcaccatc cggcatacga gctttcagac gtgcaaacag ttcagccggt gccagaccct gatgttcctc atccaggtca tcctggtcaa ccagacctgc ttccatacgg gtacgagcac gttcaatacg atgttttgcc tggtggtcaa acggacaggt agctgggtcc agggtgtgca gacgacgcat tgcatcagcc atgatagaaa ctttctctgc cggagccagg tgagaagaca gcaggtcctg acccggaact tcacccagca gcagccagtc acgaccagct tcagtaacta catccagaac tgcagcacac ggaacaccag tggttgccag ccaagacaga cgagctgctt catcctgcag ttcattcaga gcaccagaca ggtcagtttt aacaaacaga actggacgac cctgtgcaga cagacggaaa acagctgcat cagagcaacc aatggtctgc tgtgcccagt cataaccaaa cagacgttca acccaggctg ccggagaacc tgcatgcaga ccatcctgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga agggcgatcg <210> 12 <211> 2713 <212〉 DNA <213〉 人造序列 <220> <223> 具有經GHRH類似序列最佳化之大鼠之密碼子的載體 <400〉 12 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2710 60 120 180 240 300 1290174 cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag 360 cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac 420 agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttcttcgtg ctgctgaccc tgaccagcgg 480 aagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcagggtg cgccggcacg ccgacgccat 540 cttcaccagc agctacagga ggatcctggg ccagctgtac gctaggaagc tcctgcacga 600 gatcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag aggagcaggt tcaactgata 660 agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 720 gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 780 taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 840 gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg 900 agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 960 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 1020 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 1080 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 1140 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 1200 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 1260 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 1320 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 1380 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 1440 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 1500 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 1560 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 1620 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 1680 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc 1740 cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag 1800 gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat 1860 gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc 1920 attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc 1980 atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc 2040 ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat 2100

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atttggtatc tgcgctctgc 1560 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 1620 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 1680 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggc tagcgcttag aagaactcat ccagcagacg 1740 gtagaatgca atacgttgag agtctggagc tgcaatacca tacagaacca ggaaacggtc 1800 agcccattca ccacccagtt cctctgcaat gtcacgggta gccagtgcaa tgtcctggta 1860 acggtctgca acacccagac gaccacagtc aatgaaacca gagaaacgac cattctcaac 1920 catgatgttc ggcaggcatg catcaccatg agtaactacc aggtcctcac catccggcat 1980 acgagctttc agacgtgcaa acagttcagc cggtgccaga ccctgatgtt cctcatccag 2040 gtcatcctgg tcaaccagac ctgcttccat acgggtacga gcacgttcaa tacgatgttt 2100 tgcctggtgg tcaaacggac aggtagctgg gtccagggtg tgcagacgac gcattgcatc 2160 agccatgata gaaactttct ctgccggagc caggtgagaa gacagcaggt cctgacccgg 2220 aacttcaccc agcagcagcc agtcacgacc agcttcagta actacatcca gaactgcagc 2280 acacggaaca ccagtggttg ccagccaaga cagacgagct gcttcatcct gcagttcatt 2340 cagagcacca gacaggtcag ttttaacaaa cagaactgga cgaccctgtg cagacagacg 2400 gaaaacagct gcatcagagc aaccaatggt ctgctgtgcc cagtcataac caaacagacg 2460 ttcaacccag gctgccggag aacctgcatg cagaccatcc tgttcaatca tgcgaaacga 2520 tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa 2580 gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg 2640 caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agcaactgtt gggaagggcg 2700 atcg 2704 <210> 15 <211> 2713 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉具有經GHRH類似序列最佳化之雞之密碼子的載體 <400> 15 tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct 60 120 cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt 1290174 ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg 180 gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg 240 tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct 300 cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag 360 cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac 420 agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttctttgtg ctgctgaccc tgacctccgg 480 aagccactgc agcctgccac ccagcccacc cttccgcgtc aggcgccacg ccgacggcat 540 cttcagcaag gcctaccgca agctcctggg ccagctgagc gcacgcaact acctgcacag 600 cctgatggcc aagcgcgtgg gcagcggact gggagacgag gccgagcccc tgagctgata 660 agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 720 gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 780 taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 840 gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg 900 agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 960 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 1020 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 1080 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag qatcacaaaa 1140 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 1200 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 1260 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 1320 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 1380 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 1440 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 1500 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 1560 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 1620 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 1680 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc 1740 cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag 1800 gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat 1860 gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc 1920

19 1290174 attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc 1980 atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc 2040 ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat 2100 acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg 2160 cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc 2220 ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag 2280 aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agaegagetg cttcatcctg 2340 cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc 2400 agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc 2460 aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat 2520 gcgaaacgat cctcatcctg tetettgate agatettgat cccctgcgcc atcagatcct 2580 tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc 2640 cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg 2700 ggaagggcga teg 2713 <210> 16 <211〉 382 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223> 此為合成的啟動子cl-26之序列 <400> 16 ggcggccgag ggcggcgggg caggcagcag gtgttggcac cattcctcac cgctctaaaa 60 ataactcccg tgaggaatgg tgccgtcgcc atatttgggt gtcgacaccc aaatatggcg 120 acgggtgagg aatggtgggc aggeageagg tgttgggaca cccaaatatg gcgacggcca 180 acacctgctg cctgccggga gttattttta gagcggggag ttatttttag agcggtgagg 240 aatggtggac acccaaatat ggcgacggcc ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc 300 tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg ccggcggcgg cccacgagct acccggagga 360 gcgggaggcg ccaagctcta ga 382 <210〉 17 <211> 218 <212> DNA <213〉 人造序列 20 <220> 1290174 <223〉 此為合成的啟動子c2-26之序列 <400> 17 cggccgtcgc catatttggg tgtccgctct aaaaataact cccgacaccc aaatatggcg 60 acggggcagg cagcaggtgt tgggacaccc aaatatggcg acggccgggg ccgcattcct 120 gggggccggg cggtgctccc gcccgcctcg ataaaaggct ccggggccgg cggcggccca 180 cgagctaccc ggaggagcgg gaggcgccaa gctctaga 218 <210〉 18 <211> 230 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223> 此為合成的啟動子c2-27之序列 <400> 18 cggccgtcgc catatttggg tgtcggcagg cagcaggtgt tggcaccatt cctcacccgt 60 cgccatattt gggtgtcggc aggcagcagt gttgggacac ccaaatatgg cgacggccgg 120 ggccgcattc ctgggggccg ggcggtgctc ccgcccgcct cgataaaagg ctccggggcc 180 ggcggcggcc cacgagctac ccggaggagc gggaggcgcc aagctctaga 230 <210> 19 <211> 231 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉 此為合成的啟動子c5-5之序列 <400> 19 cggccgtccg ccctcgggac acccaaatat ggcgacgggt gaggaatggt gcaccattcc 60 tcacgggagt tatttttaga gcggtgagga atggtggaca cccaaatatg gcgacggccg 120 gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc 180 cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag cgggaggcgc caagctctag a 231 <210> 20 <211> 255 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉 此為合成的啟動子c6-5之序列 <400> 20 cggccgtcgc catatttggg tgtcccaaca cctgctgcct gccccgtcgc catatttggt 60 1290174 gtcggcaggc agcaggtgtt ggccaacacc tgctgcctgc cgggagttat ttttagagcg 120 gacacccaaa tatggcgacg gccggggccg cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc 180 cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga gctacccgga ggagcgggag 240 gcgccaagct ctaga 255 <210> 21 <211> 283 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223〉 此為合成的啟動子C6-16之序列 <400> 21

cggccgtcgc catatttggg tgtccgctct aaaaataact cccccaacac ctgctgcctg 60 ccccgtcgcc atatttgggt gtcggcaggc agcaggtgtt ggccaacacc tgctgcctgc 120 cccaacacct gctgcctgcc ccgtcgccat atttggtgtc cgccctcggc cggggccgca 180 ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg 240 gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc gccaagctct aga 283 <210〉 22 <211〉 263 <212> DNA <213〉 人造序列 <220> <223〉 此為合成的啟動子c6-39之序列 <400> 22

cggccgtccg ccctcggggg agttattttt agagcgccaa cacctgctgc ctgccccgtc 60 gccatatttg ggtgtcggca ggcagcaggt gttgggggag ttatttttag agcgccgtcg 120 ccatatttgg gtgtcccgag ggcggacggc cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg 180 ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg 240 agcgggaggc gccaagctct aga 263 22

Claims (1)

1290174 (2007年6月修正) c6-39 (SeqlD No: [ ' 拾、申請專利範圍： 1· 一種心肌特異性_合成性啟動子，其包括 22) 〇 2·如申明專利範15第1項之錢特異性合成性啟動子，其 中該心肌特異性-合成性啟動子進-步包括順式-作用古周 節元件之第一-組合； 名順式-作用調節元件之第一 _組合係選自隨機組合 之0成丨生—啟動子-重組物資料庫；以及 虡〜肌-特異性合成性啟動子驅動細胞族群中可表 見基因的轉錄活性，該活性高於細胞族群藉由對照_啟 動子所驅動之可表現基因的轉錄活性。 3·如申明專利範圍第2項之心肌特異性·合成性啟動子，其 吞貝式作用口周節元件包括SRE (SeqID N〇:工）、乂奸」 (SeqlD No· 2)、MEF_2 …仰 N〇 3)、以及 tef i 一種用於心肌細腧φ主

也中表現基因之心肌特異性-合成性 現構築體，包括： 工操作性連結至可表現基因之心肌-特異性-合成性-啟 子”中心肌-特異性_合成性-啟動子包括Μ·” No： 22) 〇 如申睛專利範圍第4項之錢特異性·合成性表現構築 _、中該。肌.特異性合成性啟動子進—步包括順式_ 作用調節元件之第一 _組合； /順式作用調節元件之第一 _組合係選自隨機組合 46 1290174 之合成性-啟動子_重組物資料庫；以及⑽❹7年6月修正〕 該心肌·特異性合成性啟動子_ 現基因的轉錄活性，該活性高 、群中可表 動子所驅動η本# 族群藉由對照-啟 動子所駆動之可表現基因的轉錄活性。 6.^申明專利粑圍弟5項之心肌特異性-合成性表現構築 …其中該順式作用調節元件包括SRE(SeqIDN〇. υ、 MEF.1(SeqlDNo:2),MEF„2(SeqiDN〇：3) (SeqlD No: 4)。 7·如申請專利範圍第4項 田牙項之〜肌特異性_合成性表現構築 體’其中該可表現基因包括可總派山止E 士 口匕祜T編碼出生長素釋素（GHRH) 或其生物功能活性上之等同物之核酸。 8·如申請專利範圍第7項之心肌特異性一合成性表現構築 體，其中該經編碼之GHRH係具有生物活性之多肽，以 及該經編碼之GHRH的生物功能活性等同物係一種多 肽，該多肽係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較 下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序 列0 9.如申請專利範圍第7項之心肌特異性_合成性表現構築 體’其中该經編碼之GHRH或其生物功能活性上之等同 物具有下列序列（SEQID No: 6): -X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQ QGERNQEQGA-OH 其中該序列具有下述特徵： Χι為胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）之D-或L-異構 47 1290174 (2007年6月修正） 物； I為胺基酸丙胺酸（“A”）、織胺酸（“v”）、或異白胺酸（“r，） 之D-或L-異構物； 又3為胺基酸丙胺酸（“Α”）或甘跄缺1 ’wife酸（G”）之D-或L-異構 物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“Μ”）或白胺酸（“L”）之〇_或[_異 構物； I為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν”）2 〇_或卜 異構物； # 或其組合。 1〇_~如申請專利範圍第4項之心肌特異性—合成性表現構 築體，其中該心肌特異性_合成性表現構築體包括SeqiD No ·· 7、SeqlD No ·· 8、SeqlD No : 9、SeqlD No : 1〇、 SeqlD No : 1 卜 SeqlD No ·· 12、SeqlD No : 13、SeqlD No ·· 14、或 SeqlD No ·· 15 o 11· 一種合成心肌特異性合成性表現構築體之方法，包括： 春 〇)識別一心肌-特異性啟動子，其中心肌_特異性-合成 性-啟動子包括C6-3 9 (SeqlD No·· 22);以及 (b)將該心肌·特異性啟動子操作性地連結至一可表現 基因，俾形成心肌特異性合成性表現構築體； 其中’ d亥心肌-特異性-合成性啟動子包括順式·作 用調節元件之第一組合；以及 該可表現基因包括具有或不具有經操作性連結之 啟動子的核酸表現構築體。 48 1290174 (2007年6月修正) #如申請專利範圍第1 1項之方法，#中該順式_作用調 μ —牛之第-組合係選自隨機組合之合成性-啟動子-重 組物資料庫；以及 “ “肌-特異性合成性啟動子驅動細胞族群中可表現 基口的轉錄活性，該活性高於細胞族群藉由對照-啟動子 所驅動之可表現基因的轉錄活性。 13·^如申請專利範圍第12項之方法，其中該順式_作用調 即兀件包括 SRE (SeqlD No·· 1)、MEF-1 (SeqlD No: 2)、 MEF-2 (SeqlD No·· 3)、以及 TEF-1 (SeqlD No: 4)。 14·如申請專利範圍第丨丨項之方法，其中該可表現基因包 括可編碼出生長素釋素（GHRH)或其生物功能活性上之 等同物之核酸。 15·如申請專利範圍第14項之方法，其中該經編碼之 GHRH係具有生物活性之多肽，以及該經編碼之ghrh 的生物功能活性等同物係一種多肽，該多肽係經生物工 転製作而含有與GHRH多肽相較下同時具有相似或經改 善生物活性之不同的胺基酸序列。 16.如申請專利範圍第14項之方法，其中該經編碼之 GHRH或其生物功能活性上之等同物具有下列序列 (SEQID No: 6): -Xi-X2-DAIFTNSYRKVL-X3.QLSARKLLQDI.X4.x5.Rq QGERNQEQGA - OH 其中該序列具有下述特徵： Χι為胺基酸酪胺酸（ςΥ”）或組胺酸（“H”）之D -或L -異構 49 1290174 (2007年6月修正） 物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“I”) 之D -或L -異構物， X3為胺基酸丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“g”）之D_或L-異構 物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“L”）之D-或L-異 構物； X5為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“n”）之D-或L_ 異構物； 或其組合。 1 7·如申請專利範圍第11項之方法，其中該心肌特異性-合成性表現構築體包括SeqlD No: 7、SeqlD No: 8、SeqlD No : 9、SeqlD No : 10、SeqlD No : 1 1、SeqlD No : 12、 SeqlD No : 13、SeqlD No : 14、或 SeqlD No : 15。 1 8 · —種用於肌細胞中表現基因之心肌特異性_合成性表現 構築體，包括： 經操作性連結至可表現基因之心肌_特異性-合成性-啟 動子’其中心肌-特異性-合成性—啟動子包括c6_39 (SeqID No: 22) 〇 19.如申請專利範圍第18項之心肌特異性·合成性表現構築 體，其中該可表現基因包括可編碼出生長素釋素（GHRH) 或其生物功能活性上之等同物之核酸。 20·如申請專利範圍第19項之心肌特異性_合成性表現構築 體，其中該經編碼之GHRH係具有生物活性之多肽，以 50 Ί290174 (雇年6月修疋) 及該經編碼之GHRH的生物功能活性等同物係一種多 肽，該多肽係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較 下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序 列。 21·如申請專利範圍第19項之心肌特異性—合成性表現構築 體，其中該經編碼之GHRH或其生物功能活性上之等同 物具有下列序列（SEQID No: 6): -XrXrDAIFTNSYRKVL-XpQLSARKLLQm-HRQ QGERNQEQGA-OH 其中該序列具有下述特徵： Χι為胺基酸酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“『）之〇_或L_異構 物； X2為胺基酸丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“Γ，) 之D-或L-異構物； X3為胺基酸丙胺酸（“Α”）或甘胺酸（“G”）之〇_或L•異構 物； X4為胺基酸甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“l”）之〇-或l —異 構物； X5為胺基酸絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“N，，）i 〇_或L_ 異構物； 或其組合。 22.如申请專利範圍第1 8項之心肌特異性-合成性表現構 築體，其中該心肌特異性_合成性表現構築體包括 SeqlD No : 7、SeqlD No : 8、Seqm no : 9、SeqlD No : 51 Ί290174 (2007年6月修正) 10、SeqlD No ： 11、SeqlD No : 12、SeqlD No : 13、 SeqlD No : 14、或 SeqlD No : 15。

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