TWI276440B - An extract of Dioscorea sp. and the medical uses thereof - Google Patents
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Description
1276440 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域 本發明係有關於一種口服組成物，其包含一山藥 5 (D/oscorea sp.)的活性萃取物，本發明特別係有關於一種 可增進細胞增生及分化作用，以及減輕由化療所引發之副 作用的口服組成物。本發明係提供一種用於治療骨質疏鬆 症的方法以及一種用於減輕由化療所引發之副作用的方 法0 1〇 【先前技術】 發明背景 山藥（D/oscorea)，亦名“山藥(wild yam)”，係為單子葉 薯蕷科之一員，其係分佈於熱帶與亞熱帶區域。於世界上 約存在有650個種，其中於中國發現有93個種及9種變異 15 種，而於台灣發現有14個種與5種變異種。 山藥係為傳統中藥中一種非常重要的藥用植物，且其 醫藥效果係已被研究多年。於1936年，Tsukamoto等人係 自植物之Dioscoreacea科中分離出戴思均尼（diosgenin，其 為一種山藥的類脂醇植物皂質，而後並將之使用以作為醫 20 藥類脂醇之快速合成的原料。於1992年之Aradhana，Rao
Ar· Kale RK.的研究中，其指出戴思均尼(diosgenin)係可 促進大白鼠乳腺上皮細胞的生長。於Biochemical & Biophysical Research Communications 207(1 ):398-404,
Feb/1995中，丄L· Beneytout等人報導，當將戴思均尼 1276440 1 金 (diosgenin)添加至人類紅白血病（HEL)細胞培養液中時，其 具有誘導巨核細胞之形態及生化改變的特性，且因此，戴 思均尼（diosgenin)可使用以作為HEL細胞之巨核細胞分化 誘導劑。於Life Sciences 59(11):147-57, 1996 中，山藥 5 之類脂醇萃取物係被認為具有足以作為抗氧化劑之活性， 以改良血清脂質的含量。 脫氫異雄固國（DHEA)具有與戴思均尼（diosgenin)相 似的化學結構，且被認定具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病與 調節骨質的效果。血清中DHEA的含量會隨年齡增加而逐漸 10 下降，且與老化有關係。由多種研究可知，山藥之戴思均 尼（diosgenin)取萃物可在人體中被轉換成DHEA，而可補充 隨老化所減少之DHEA。然而，此等研究係僅於給老年人攝 取山藥中之戴思均尼（diosgenin)來進行，以研究戴思均尼 (diosgenin)是否可降低血清脂肪的過度氧化作用、減少血 15 清中的三酸甘油脂，以及增加HDL量，同時，降低LDL之過 度氧化傷害。 有關DHEA在骨質調控上的效果，於Life Sciences 62(1):59-68, 1998中 ’ Ben A.A. Scheven 等人提出下列報 導，DHEA及其硫酸鹽衍生物（DheA-S)本身無法在人類造 20 骨細胞上展現直接且獨立之顯著效果，但當與骨細胞調節 劑’ 1,25(〇H)2D3，一起處理細胞時，其可增進特定驗性填 酸酶(ALP)活性，此鹼性磷酸酶係為成熟造骨細胞的特定標 記。此研究顯示，DHEA/DHEA-S在造骨細胞生長及分化上 的效果可能係藉由1,25(OH)2D3所誘發之骨細胞改變的效 1276440 果而調控。 依據本發明，其發現山藥的甲醇萃取物及其進一步的 萃取區份係具有細胞再生的活性。詳言之，已發現，在沒 有任何骨細胞調節劑存在之下，山藥的曱醇萃取物及其進 5 一步的萃取區份本身可刺激造骨祖原細胞的增生與分化， 以補充骨中之造骨祖原細胞、促進造骨細胞的成熟與促進 造骨細胞的礦質化，藉此以達到骨骼修復、恢復與復原， 進而避免及治療骨質疏鬆症。再者，山藥的萃取物不僅可 在GM-CSF存在下刺激骨髓中之造血幹細胞的增生及分 10 化，且有助於該因接受抗癌藥劑治療所造成之白血球與紅 血球缺乏之病患的恢復，因此，山藥的萃取物可與抗癌藥 劑一起使用，以作為一化療助劑。 【發明内容】 發明概要 15 因此，本發明之一目的係在提供一種用於增進造骨祖 原細胞增生與分化之口服組成物，其包含一作為活性組分 之山藥萃取物。 本發明之又一目的係在提供一種用以作為抗癌藥劑之 助劑的口服組成物，其包令—作為活性組分之山藥萃取物。 20 本發明之再一目的係在提供一種用於預防與治療骨質 疏鬆症之口服組成物。 本發明之另一目的係在提供一種用於作為助劑之口服 組成物，以用以減輕由抗癌藥劑所造成之副作用。 本發明之再一目的係在提供一種用於治療骨質疏鬆症 1276440 的方法，其包含口服供給一有效量之山藥藥學活性萃取物 給一需要此治療之病患。 本發明之又一目的係在提供一種使用一化療助劑以用 於減輕由化療所造成之副作用的方法，其包含口服供給一 5 有效量之山藥藥學活性萃取物給一需要此治療之病患。 本發明之其他特徵及優點將由下列之較佳實施例的詳 細說明與所附隨之圖式而變得更清楚。 【實施方式】 本發明係有關於山藥萃取物之生物活性的發明，特別 10 是細胞再生活性的發明。由實驗證實，依本發明之方法所 製得之山藥的甲醇或乙醇萃取物及其進一步之萃取區份係 含有活性物質，其促進小鼠骨髓祖原細胞的增生與分化。 詳言之，山藥的甲醇或乙醇萃取物及其進一步之萃取區份 本身可增進功能性造骨袓原細胞的增生，且甚至大大地誘 15 導造骨祖原細胞分化為造骨細胞，並促進造骨細胞的礦質 化作用。再者，山藥的甲醇萃取物可減輕由抗癌藥劑所造 成之副作用。詳言之，曱醇萃取物可回復該以環磷醯胺(CY) 處理之小鼠之周邊血液中的白血球與紅血球量。因此，山 藥的甲醇萃取物可被使用以預防及治療骨質疏鬆症（該病 20 症係係老化過程中常見的疾病），且可用以與抗癌藥劑併 用，以作為一化療助劑。 幹細胞係指可自我更生與分化的細胞。幹細胞在肢胳 時期的數量最多，且會隨著老化而逐漸減少。因此，已推 測，幹細胞與老化間有其重要的的關聯性。成體中之幹細 1276440 肊曰對Μ%境改變所傳遞的特定訊息產生專一性的反應， 而=新的幹細胞或分化成特定細胞。當幹細胞接受分化 Α息^ ’幹細胞會快逮大量增生，最後進行分化。此等幹 、月匕係用以維持成體體内細胞的平衡，且補充因自然因素 5或傷害所死亡之細胞數目。 月知中的幹細胞分為兩類，一為造血幹細胞，一為基 質細胞，造血幹細胞會產生兩種較特定化的幹細胞種類， 即，淋巴袓原細胞(其轉變成丁與B淋巴球)以及脊髓祖原細 胞(其變成白血球、紅血球與巨核細胞），而基質細胞為骨趟 10巾構成支持結構之細胞來源。基f細胞於培養時，具有貼 附於培養盤底部的龍，且可分化成造骨細胞、軟骨細胞、 月曰肪、、’ I且甚至於分化成肌母細胞。基質細胞為造血幹 細胞生長與分化時所需。 由於老化發生時，幹細胞的產生與數量會大量減少， 15而導致多種與老化有關的問題，其中骨質疏鬆症尤其普 遍。骨質疏鬆症的發生包括骨骼生成作用與骨骼溶蝕作用 (resorption)間之平衡的喪失。造骨細胞係衍生自造骨祖原 細胞’且係負責骨縣的生成，而骨絡的生成作用係包括骨 質的形成與骨路的礦質化。造骨祖原細胞係源自於骨髓中 的基貝細胞。地塞米松（Dexamethasone)與抗壞血酸係可 促進造骨祖原細胞的增生與生長，且可使細胞分化為成熟 的造骨細胞。於分化的過程中，會表現不同的造骨細胞特 定標記·首先有膠原基質的沈積，於1〇至14天後，會表現 驗性酶(ALP)。驗性填酸酶係被廣泛作制以辨識造骨 1276440 細胞活性的生化標記，雖其實際功能仍未知，但目前相信 其參與骨骼的礦質化過程。於連續培養至第21天後，細胞 會分泌骨鈣（osteocalcein)，且最後礦質化以形成骨小節 (bone nodules) ° 5 於本發明中，發明人意外地發現，含有山藥之曱醇或 乙醇萃取物或其進一步之萃取區份的口服組成物可在沒有 任何骨細胞調節劑存在之下，增進造骨袓原細胞的增生與 分化，因此，該具有此活性萃取物之組成物可用以治療骨 質疏鬆症。 10 於本發明中，該用以增進細胞增生與分化之口服組成 物係包含一作為活性成分之山藥萃取物。該萃取物係由山 藥的塊莖部位所製備，且係使用以醇類為主之溶劑作為萃 取溶液而製得。製備方法係包括下列步驟：（a)在酸存在下， 較佳係在1 %醋酸存在下，使用一以醇類為主之溶劑萃取山 15 藥的塊莖，其中該以醇類為主之溶劑係為以曱醇、乙醇或 其等之混合物為主之溶劑。 此外，所得之萃取物可進一步基於其等之極性來進行 萃取，以獲得藥學上之活性區份。於本發明之一較佳實施 態樣中，甲醇萃取物係進一步進行分配層析法（partition 20 chromatography)，其包含下列步驟： (b) 使用乙酸乙酯與水之溶劑混合物萃取步驟(a)所得 之曱醇萃取物，以將乙酸乙酯萃取物與存在於水相中之水 萃取物分離； (c) 將η-丁醇溶劑加至水相中，以進行進一步的萃取， 10 1276440 並將丁醇萃取物與殘存於水相中之其餘水萃取物分離；以 及 (d)將75%〔醇溶劑加至由步驟⑹所得之水相中，以 萃取並進一步移除多糖，以獲得一純化的水萃取物。 為了確認山藥成份的生物活性，故於細胞上進行山藥 塊莖之甲醇萃取物與其進_步之萃取區份之生物活性分 析，其中細胞係取自於正常小鼠與患有由糖皮質激素所誘 發之骨質疏鬆症之病人。 參第1圖所示之實驗結果，發明人不預期地發現，山藥 ίο f醇萃取物與其進-步的萃取區份可在沒有任㈣細胞調 節劑的幫助下，增進造骨袓原細胞的增生。於相同的濃度 下，DHEA對於造骨祖原細胞增生並無任何增進效果。於第 2圖中，該結果顯示，山藥萃取物明顯增加正常細胞中所表 現之鹼性磷酸酶的量，換言之，由本發明所製備之萃取物 15 可刺激造骨祖原細胞分化為成熟的造骨細胞。 發明人進-步確認其對於由患有由糖皮質激素所誘發 之骨質疏鬆症之病人身上所取得之不正常骨髓細胞上的影 響。糖皮質激素係為多種發炎與自體免疫疾病的必要療 法。然而，長期之糖皮質激素的使用係為骨質疏鬆症之最 20 常見的醫源性原因之一。糖皮質激素會透過對於造骨細矽 的多種影響而增加骨骼的流失，即，造骨細皰譜系複製的 抑制、新造骨細胞之發生的降低、及引發造骨細胞的死亡 由第3圖的結果可知，發明人發現，本發明之活性萃取物係 增加此細胞中所表現之驗性碟酸酶的量，且因此、皮# ' ' 1276440 胞的功能可藉以該活性萃取物治療該患有由糖皮質激素所 誘發之骨質疏鬆症之病患而恢復。 再者，為了更進一步確認山藥萃取物在治療骨質疏鬆 症上之活體内的有效性，發明人於正常小鼠與被進行卵巢 5 切除以誘發骨質疏鬆症之小鼠上進行實驗，該等小鼠係以 口服方式供給本發明之萃取物。 於第4-5圖中，該結果說明，於活體内，山藥甲醇萃取 物係增加正常小鼠與被進行卵巢切除以誘發骨質疏鬆症之 小鼠中之造骨細胞之表現的鹼性磷酸酶的量與其礦質化作 10 用。因此，山藥萃取物不僅可調控造骨袓原細胞的增生與 分化，且可控制骨骼的生成與改造（remodeling)，且因此， 此活性萃取物可預防及治療骨質疏鬆症。 另一方面，已知骨髓細胞的增生與分化可藉某些因子 而控制’諸如，BMP-2 (骨形態發生蛋白-2)、TGF-yS H 15 EGF、GM-CSF等。當改變培養環境中之因子時，幹細胞 會依此因子的專一性而分化成不同的細胞。例如，Bmp-2、 TGF-/3、IL-4與EGF係與骨髓基質細胞增生與分化成造骨 細胞的譜系有正相關性。於此研究中，發明人進行實驗以 確認山藥甲醇萃取物在8|^户_2、TGF-点與丨L_4之基因表現 20 上的效果，並確認山藥曱醇萃取物及其進一步萃取區份在 EGF與GM-CSF存在下，對於骨髓幹細胞之增生與分化的 作用。 於第6圖中，數據顯示，山藥甲醇萃取物係增加 BMP-2、TGF-/3與IL-4的基因表現，特別是8|^||3_2與丁(3卜 12 1276440 /5。再者，由第7圖與第2表所示之實驗結果，發明人發現， 山藥曱醇萃取物在EGF存在下，係刺激小鼠骨髓細胞的增 生。曱醇萃取物之進一步萃取區份，Di〇MPw，係增進小鼠 骨髓細胞的增生。 5 1於GM_CSF，討作料該存在於造血祖原細胞上 之特定受體複合物上，以刺激骨髓系細胞生成，因而，可 促進骨髓中之造血袓原細胞增生與分化成單核球、中性白 血球、巨噬細胞等。因此，據信，GM_CSF對回復進行化 療之病人的巨噬細胞有其醫療上的潛力。於此研究中，發 10明人亦發現，在GM_CSF的存在T，山藥之甲醇萃取物及 其進一步的萃取區份可促進骨髓細胞的增生（見第3表）。此 外，結果顯示，山藥進一步的萃取區份可促進幹細胞的分 化。於相同的條件下，DHEA對於細胞分化有增進效果，但 無法增進細胞增生。因此，此研究暗示，由本發明所製得 15之山藥甲醇萃取物及其進一步的萃取區份可藉骨髓細胞的 增生與分化’而協助GM-CSF回復因化療所造成之巨嗟細 胞的降低，故，可使用以作為一化療助劑。 發明人進一步確認山藥萃取物在化療上作為化療助劑 之活體内的應用。環磷醯胺(CY)係為一種用以治療多數癌 2〇 症的藥物，然而，其破壞了骨髓的功能、降低血球細胞， 如，白血球、巨噬細胞與紅血球，並造成多種其他的副作 用。於本發明中，環磷醯胺係使用以造成小鼠的白血球減 少症，以建立一用以決定本發明之活性萃取物作為化療助 劑功能之動物相:型。所得結果顯不’本發明之活性萃取物 13 1276440 • . 可預防白血球數目的降低，並維持紅也球數量與血紅素含 量於-正常值，故，可加速以環碟酿胺治療之小鼠之白血 球減少症的回復。因此，本發明之活性萃取物可使用以作 為化療助劑，以減輕由抗癌藥劑所引發之副作用。 5 树明所進行之實驗明_明，山藥萃取物及其進- 步之萃取區份係可在不存在有任何骨細胞調節劑下，促進 造骨祖原細胞的增生與分化，故，本發明提供一種山藥在 治療骨質疏鬆症上的應用。再者，本發明所製得之萃取物 可增加並回復因化療所降低之巨喔細胞、白血球與紅錢 · 10 的數目，而可作為一化療助劑。 以下之實施例係用以說明本發明。該等實施例係不欲 用以限定本發明之範疇，且亦應以此方式解釋。 致隹實施例之諜細說明 15 羞山藥甲醇萃取物 購自於台灣陽明山之4 kg的去皮山藥塊莖係浸於含 有1%醋酸溶液中過夜。所得之固體部份係於_7〇艺下冷 鲁 凍並冷凍乾燥。所得之冷凍乾燥部份係浸於存在有1%醋 酸之甲醇溶液中。於擾拌及調整甲醇濃度至4〇體積％後， 20混合溶液係靜置過夜，而後離心分離。所得之溶解區份係 進行冷凍乾燥，且被稱為DioMs。
DioMs係進一步進行分配層析法，其包含下列步驟： 使用乙酸乙酯與水（1:1)之溶劑混合物萃取Di〇Ms，以將乙 酸乙S旨萃取物(稱為DiGMPe)與存在於水射之水萃取物分 14 1276440 離；於水相中加入η-丁醇溶劑，以進行進一步的萃取，以 將丁醇萃取物(稱為DiGMPb)與殘存於水相中之水萃取物分 離；以及，於水相中加入75%之乙醇溶劑，以萃取並進一 步移除多糖，而得一純化之水萃取物(稱為D丨〇MPw)。 5 鼠飼料的·诰方法
Purina Chow 5001(—種市售可得之小鼠飼料)係被磨 成粉末。將冷凍乾燥之山藥甲醇萃取物加入磨碎之飼料中 以形成一飼料混合物，其加入量係取代自磨碎飼料中所取 10 4之飼料量。飼料混合物係均句地與蒸顧水混合，藉擠出 成型模具重新賦形，在適當的功率下，於微波爐中烘烤2 分鐘，而後冷部至室溫並冷凍於孑〇〇c。於進行冷凍乾燥 後，飼料混合物係形成與purina Ch〇w飼料非常相似之丸 粒。所形成之丸粒係儲存於_2〇。〇冰箱中。於餵食當天，將 15丸粒回溫至室溫，且於無菌工作台臺上以UV燈殺菌。具有 不同濃度之甲醇萃取物的飼料混合物係被製得。 製備步驟3 .jj：後離與培養 於無菌條件下，犧牲SPF級C3H/HeN小鼠，並將 20 DMEM/F12之液態培養液注入大腿骨中，以沖出骨髓細 胞。以53號無菌尼龍網過濾細胞。將含有n2之DMEM/F12 培養液加至所彳于之單細胞懸浮液中，以調整至適當細胞濃 度0 15 1276440 製備步驟4 :自小鼠製備造骨袓原細胞的方法 於無菌條件下，取得SPF級C3H/HeN小鼠之大腿骨， 並注入DMEM/F12。沖出骨髓細胞並以53號無菌尼龍網過 濾、。將含有15% FCS之DMEM/F12培養液加至所得之單細 5 胞懸浮液中，以調整細胞濃度。 將細胞培養於含有DMEM/F12培養液之T-形容器中6 天，該培養液含有15% FCS、50 pg/ml抗壞血酸、1〇mM β-甘油構酸納與10nM地塞米松，培養液每3天更換一次。 細胞濃度為106細胞/cm2。於第6天，取出懸浮細胞及培養 10 液。以1XPBS(已被回溫至室溫）沖洗黏附之細胞層，而後 在37 C下’細胞以〇·〇1°/〇 EDTA處理5至10分鐘。移除 EDTA，並以含有FCS之培養液中止反應。接下來，於37 C下，以TEG處理5分鐘。同樣於含有FCS之培養液中停止 反應。收集所有細胞，並在1〇〇〇 rpm下離心5分鐘。 15 fAfeLL 蔓里藶萃取物及其進一舟茬敢1垃處理之 止鼠之造骨祖原細胞的增生反應 由製備步驟4所得之細胞係使用22G針頭打散，並懸浮 於含有15%FCS、50Pg/m|抗壞血酸、1〇_β•甘油填酸 2〇鈉與=ηΜ地塞米松之DMEM/M2培養液中，以形成 4_5χ104細胞/m丨濃度。將奶^丨之細胞懸浮液加至瓜 井微盤之各井中。於3個小時後，於各井之細胞懸浮液中加 入25μΙ甲醇萃取物、各進—步萃取區份與DHEA，並培養 72個小時。而後，進行ΜΤΤ分析。於各井中加人j m_ 16 1276440 MTT溶液，並反應4個小時。將15〇 μ|^2ΜΤΤ細胞溶解溶 液(20% SDS-50% DMF)加至各井中，並反應16個小時， 而後’在〇_D. 570 nm下量測各井中所得細胞懸浮液的吸光 值。 5 如第1圖所示，於山藥甲醇萃取物的刺激下，造骨祖原 細胞的增生能力係被增進，其中〇.〇1與〇1 μ9/ΓΤ1丨之濃度展 現顯著的增進效果。於相同的濃度下，DHEA對於造骨祖原 細胞的增生作用並無任何促進效果。萃取區份，〇丨〇|^^6與 DioMPb在10-400 μ9/ηη|下，係可促進細胞增生，其中 10 DioMPe展現絕佳效果。
活性(ALP)來決定 15 自製備步驟4所收集之造骨袓原細胞係培養於T-形容 器中6天。使用22G針頭打散細胞，並將細胞漢度調至5x1〇3 細胞/cm2。而後將細胞培養於6•井盤中，其中於各井中加 入4.5 ml的細胞培養液，且於隔天加入〇5m丨甲醇萃取物 及，、各萃取區伤培養14天後’進行鹼性鱗酸酶活性分析 20 (描述於後）。 吸出培養液，細胞層以PBS清洗Μ。將配製於PBS 中之0_5〇/〇 Triton X-100加至各井中。所得細胞懸浮液係於 -7(TC與371下進行冰;東及财製程。此處理係進行兩次， 以獲得-測試樣本。將50 μ丨之測試樣本由各井移至乱丨从 17 1276440 盤中。而後，將50 μ丨之AMP-受質緩衝液(配製於蒸餾水中 之2-胺基-2-甲基小丙醇(AMP，〇·5Μ)，pH 10 ; 2 mM氣化 鎮與9 mM P-磷酸硝基苯基酯）加至ELISA盤中，以在室溫 下，與測試樣本反應10-20分鐘。而後，隨即在410 nm波 5 長下’以eusa讀值機測得吸收值，並定量各井之蛋白質 濃度。所得之鹼性磷酸酶活性係以單位/μ9表示。 如第2圖所示，於培養骨髓前驅細胞14天後，可發現成 熟造骨細胞特定表現標記之鹼性磷酸酶的表現。山藥甲醇 卒取物及其各進一步萃取區份可明顯地增加鹼性磷酸酶的 10 表現量，其中0.1 Mg/m丨之曱醇萃取物、0_1 pg/ml之
DioMPb、0_〇1-〇 1 pg/m|之Dj〇MPe與0.1 pg/ml之DioMPw 係顯示有最強的增進效果。 复施例g: 4屋甲醇萃取物在骨髓細胞之鹼性磷酸醢(ALP) 15 适j：生上的作J二該骨髓細胞係源自於患有由糖皮質激音所 透發之f質菝鬆症之病東 得自台北榮民總醫院之病人骨髓細胞係被培養於含有 15% FCS、50 pg/ml抗壞血酸、10 mM β_甘油磷酸鈉與 10 ηΜ地塞米松之DMEM/F12培養中7天。而後進行鹼性 20 磷酸酶活性分析。 如第3圖所示，有發現驗性碟酸酶的表現。與對照組及 正對照組（1 ηΜ雌激素，其係為已知之骨質疏鬆症的治療 方法)相較，山藥甲醇萃取物係增加鹼性磷酸酶的表現量， 其中10 pg/ml之甲醇萃取物係顯示最強的增進效果。 18 1276440 f施例4:山藥甲醇萃取物在睑性磷酸酶(ALP)活性與H 胞之礦質化作用上的法體内效果 製備用於口服供給之不同濃度的甲醇萃取物（0、40、 5 200與1000 mg/ml)。於口服供給不同體積劑量之甲醇萃取 物5天後，犧牲小鼠，以取得骨髓細胞。 (1) 驗性踏酸酶活性分析 所得之骨髓細胞係以2x105細胞/井之濃度培養於96-1〇 井微盤中，於其中加入含有15% FCS、50 pg/m丨抗壞血 酸、10 mM β-甘油鱗酸鈉與1〇 nM地塞米松之250 μ丨的α -MEM培養液，並於37 °C之5% C〇2培養箱中培養2天。 吸出125 μΙ/井之培養液，並以125 μΙ/井之含有15% FCS、 50 pg/ml抗壞血酸、1〇1111\/16-甘油鱗酸鈉與1〇11|\/1地塞 15 米松之新鮮培養液取代。於培養4天後，進行鹼性磷酸酶活 性分析。 如第4(A)圖所示，係發現有鹼性磷酸酶的表現。於第 4(A)圖中，山藥甲醇萃取物會增加鹼性磷酸酶的表現量， 其中，與對照組相較，1000 mg/kg之甲醇萃取物係可達3 20 倍的增進效果。 (2) 骨小節形成分析 此測試係用以分析骨質的礦質化作用。自口服餵食不同 濃度之甲醇萃取物(〇，40，200，and 1000 mg/ml)的小鼠中 19 1276440 所得之骨髓細胞係被植種於24-井盤中，濃度為1X106細胞 /井’並培養於含有15% FCS、50 pg/m丨抗壞血酸、10 mM β-甘油磷酸鈉與10 nM地塞米松之α-ΜΕΜ培養液中，在 37°C之5% C〇2培養箱中培養24個小時。吸出500 μΙ/井之 5 培養液，並以含有15% FCS、50 pg/m丨抗壞血酸、1〇 mM β-甘油磷酸鈉與10 nM地塞米松之500 μΙ/井的新鮮培養液 取代。細胞係再培養15天’以分析骨質的礦質化，而培養液 係每4天更換一次。進行骨小節形成分析，如後所述。 吸出培養液，細胞係在37 °C之5% C〇2培養箱中，與 10 500 μ|/井之福馬林反應30分鐘而被固定。移除福馬林並以 無囷水清洗細胞3次，於各井中加入200 μ|之可與約反廉 之2%茜素紅(Alizarine Red) S溶液，細胞再於37 °c之 5% C〇2培養箱中培養10分鐘。而後，移出茜素溶液，細 胞以絕對酒精清洗三次。骨質之礦質化區域係藉Meta 15 Image而測得。 如第4(B)圖所示，當與對照組相較，山藥甲醇萃取物 係可促進骨質的礦質化，其中1000 mg/kg濃度之甲醇萃取物 係展現高達3_5倍之最強增進效果。
於無菌條件下，一組SPF級之C57BL/6j小氣係進行外 科手術，以去除卵巢而誘發骨質疏鬆症的發生，而 π另一組 20 1276440 則僅進行手術但不移除卵巢，以作為對照組(稱為經假手術 之小鼠）. 製備用於口服供給之不同濃度的甲醇萃取物（0、40、 200與1000 mg/ml)。於口服供給不同體積劑量之曱醇萃取 5 物42天後，犧牲小鼠，以取得骨髓細胞。 (1)鹼性鱗酸酶活性分析 得自口服供給不同濃度甲醇萃取物(〇、40、200與1〇〇〇 mg/ml)之小鼠的骨髓細胞與得自經假手術之小鼠的骨髓細 10 胞係以2x105細胞/井之濃度培養於96-井微盤中，於其中
加入250 μΙ之含有15。/。FCS、50 pg/m丨抗壞血酸、10 mM β-甘油磷酸鈉與10 nM地塞米松之α-ΜΕΜ培養液，並培 養於37 C之5% C〇2培養箱中2天。吸出125 μI/井之培養 液，並以125 μΙ/井之含有15% FCS、50 pg/m丨抗壞血酸、 15 1〇 mM β-甘油磷酸鈉與10 nM地塞米松之新鮮培養液取 代。於培養4天後，進行驗性磷酸酶活性分析。 如第5(A)圖所示，係發現有鹼性磷酸酶的表現。於第 5(A)圖中，其顯示山藥甲醇萃取物可增加鹼性磷酸酶的表 現量，其中，1000 mg/kg之甲醇萃取物係顯示最強的增進 20 效果。 (2)骨小節形成分析 得自口服供給不同濃度甲醇萃取物(0、40、200與1〇〇〇 mg/ml)之小鼠的骨髓細胞與得自經假手術之小鼠的骨髓細 21 1276440 胞係以1x1〇6細胞/井之濃度植種於24-井盤中，並以含有 15% FCS、50 pg/ml抗壞血酸、1〇 mM β-甘油麟酸鈉與
10 ηΜ地塞米松之α-ΜΕΜ培養液培養，且於37°c之5% C〇2培養箱中培養24個小時。吸出5〇〇 μ|/井之培養液，並 5 以500 Ml/井之含有15% FCS、50 pg/ml抗壞血酸、10 mM β-甘油磷酸鈉與10 nM地塞米松之新鮮培養液取代。細胞 係再培養15天’以分析骨質的礦質化，而培養液係每4天更換 一次。進行骨小節形成分析。 如第5(B)圖所示，當與對照組相較，山藥甲醇萃取物 10 可促進骨質的礦質化，其中1000 mg/kg濃度之甲醇萃取物係 展現最強的增進效果。 實施例6:山藥甲醇萃取物對骨髓細胞之某因表現的影響 使用 Ultraspec™ RNA 分離套組(Biotex laboratories INC， 15 U.S_A.)萃取由實施例4所得之骨髓細胞的完全RNA。5 pg完全 RNA與2·5 pg oligo dT係在70°C下加熱10分鐘、冷卻至室溫10分 鐘，而後加入4 μ110 mM dNTP、0.5 μΙ rRNasin、1 μΙ (10 單位) AMV (鳥類骨髓胚細胞過多病病毒)逆轉錄酶與其緩衝液，最後之 反應體積為26.5 μ卜前述反應溶液係於42°C下反應60分鐘，而後 20 在90°C下反應5分鐘，而得cDNA。於所得之2.5 μΙ cDNA中加入 0·5 μΙ 10mM dNTP、0·5 μΙ聚合酶(2單位)及其緩衝液、1 μΙ之 10 μΜ標地引子，反應混合物之終體積為25 μ卜進行合適循環 次數之PCR，各循環係由下列步驟所構成：94°C下45秒的變性作 用、於適當緩冷配對(annealing)溫度下之45秒的缓冷配對反 22 1276440 1 應、以及72°C之1分鐘的延長反應。反應產物係以2%續^、支膠 藉電泳而具像化。PCR引子之序列係顯示於第彳表。實卜社果 係顯示於第6圖。 如第6圖所示，BMP-2、TGF-/5與IL-4的基因表現係增加， 5 特別是BMP-2與TGF-/S。 尺寸大小（bp) 第1表·使用於RT-PCR中之引子的序列 細胞激素 序列（5,到3，） IL-4 10 15 20
表現 ATG GGT CTC AAC CCC CAG CTA GT 反表現 GCT CTT TAG GCT TTC CAG GAA GTC 399
TGF-/S 表現 TGG ACC GCA ACA ACG CCATCT ATG GCATCTATG AGAMAO： 反表現 TGGAGCTGAAGCMTAGTTGGTATCCAGGGCT 525 BMP-2
表現 CAT CCA GCC GAC CCT TG 反表現 CTC TCC CAC TGA CTT GTG 505 /5-肌動蛋白
表現 GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT 反表現 CCA CAT CTG CTG GAA GGT GG 510 實施例7:於上虔生县因手（EGF)存在下，山藥甲醇萃取泡· 皇_C3H小鼠之骨髓細胞形態蠻化上的影響 得自製備步驟3之1x104細胞/井之小鼠的骨髓細胞係 23 1276440 第2表 群組 農度 增生作用指標 a 形態^ 對照組 1.00 + DHEA 0.0001 pg/ml 0.99 + 0.001 Mg/ml 0.64 + 0.01 Mg/ml 0.65 + 0.1 pg/ml 0.67 ++ 1 pg/ml __ 0.70 DioMPw 10 ng/ml 1.09 100 ng/ml 1.13 詩 1 Mg/ml 1.17 顏 10 pg/ml 1.34* 100 Mg/ml >^1.90* ______ a.數據係以Student’s t_test來分析，“*，，係指p<〇 〇5 b_形態變化係以顯微鏡來觀察 5 實施例·_β:於GM-CSF存在下，』山藥甲醇萃取物及其 一步萃_奥-區份處理之小鼠之骨髓Jg胞的增生反應 得自製備步驟3之1x104細胞/井之細胞係植種於96-井 微盤之各井中，細胞以有N2與4 ng/ml mGM-CSF之 10 DMEM/F12培養液培養。具有不同濃度之山藥甲酵萃取物 係分別被加至各不同井之培養細胞中。於含有甲醇萃取物 之不同井中之培養細胞係在37°C之5% C〇2培養箱中培養 14天。以含有N2與20 ng/ml mGM_CSF之DMEM/F12培養 液培養之細胞係作為正對照組。進行MTT分析。於此分析 15 中，1 mg/ml MTT溶液係被加至各井中，以與其中之培養 細胞反應4個小時。加入150 μ|/井之MTT細胞溶解溶液 (20°/。SDS-50% DMF)。所得之混合物係反應16個小時。 25 1276440 於〇_D. 570nm下測定吸收值。. 如第3表所示，於〇·〇〇1 pg/ml至1000 pg/m丨濃度之山 藥甲醇萃取物的刺激下，骨髓細胞之增生速率係明顯增 加。必須注意的是，就增進增生的部份而言，最佳之甲醇 5 萃取物的濃度係在〇_〇1至1〇〇〇 pg/ml範圍間。由甲醇萃取 物進一步萃取所得之區份係皆發現具有增進細胞增生的能 力。於其中，DioMPb與DioMPe被發現，其對增生的增進 具有最佳效果。此外，已發現，在1-1〇 pg/m|濃度之山藥 甲醇萃取物的刺激下，20週大之成鼠的骨髓細胞係具有分 10 化能力。於甲醇萃取物之萃取區份（其係藉由水與乙酸乙酯 之溶劑混合物來萃取，或而後依序再使用丁醇及75。/〇乙醇 萃取水萃取物）中，乙酸乙酯萃取區份與75%乙醇萃取區份 (其係以75%乙醇進一步萃取水萃取物而得）被發現可加速 20週大成鼠骨髓細胞的分化作用。反之，在相同的條件下， 15 DHEA係僅在增進細胞分化上具有效果，而無法促進細胞增 生。因此，山藥萃取物在幹細胞之再生與分化上皆具有優 異之效果，而可輔助gM_csf回復因化療而減少之巨噬細 胞數目上的效果，且可作為化療助劑。 20 26 1276440 第3表 群組 濃度 增生作用指標 a 形態變化b 對照組 1.00 + DioMs 0.0001 pg/ml 1.08 + 0.001 Mg/ml 1.19* + 0.01 Mg/ml 1.68* + 0.1 Mg/ml 1.95* + 1.0 Mg/ml 1.78* ++ 10 Mg/ml 1.82* +++ 100 Mg/ml 1.49* + 1000 Mg/ml 1.39* + DioMPe 0.01 Mg/ml 0.98 + 0.1 pg/ml 1.11 ++ 1 Mg/ml 1.35* ++ 10 Mg/ml 2.64* +++ 100 Mg/ml 0.83 _c 300 Mg/ml 0.97 - DioMPb 0.01 pg/ml 1.07 + 0.1 Mg/ml 1.23 + 1 Mg/ml 1.34 + 10 pg/ml 1.41 + 100 Mg/ml 1.90* + 300 Mg/ml 2.02* + DioMPw 0.0001 pg/ml 1.06 + 0.001 Mg/ml 1.08 + 0.01 Mg/ml 1.12 ++ 0.1 Mg/ml 1.18 ++ 1 Mg/ml 1.31* +++ 10 Mg/ml 1.56* + DHEA 0.0001 Mg/ml 0.99 + 0.001 Mg/ml 1.15 + 0.01 Mg/ml 1.04 + 0.1 Mg/ml 1.13 + 1 Mg/ml 1.11 +++ 10 Mg/ml 1.19* + a.數據係以Student’st-test來分析，係指P<0_05 b. 形態變化係以顯微鏡來觀察 c. 於高濃度DioMPe下，發現骨髓細胞死亡 27 1276440 曱醇萃取物#由璦磷醯胺諉發之白 土直主·歷邊血液中之白血球與紅血球數目輿血包 的影響 5 製備用於口服供給之不同濃度的甲醇萃取物（0、20、 100與500 mg/ml)。在第〇及第5天，小鼠係以腹腔注射方式 注射200與1〇〇 mg/kg之環磷醯胺(CY)，以造成白血球減少 症’且定期採血，以造成貧血現象。於第1天至小鼠犧牲當 天，小鼠係口服供給不同劑量之曱醇萃取物。於第〇、4、8 10 與12天，自眼窩採樣周邊血液。 於第0、4、8與12天所得之血液（01 m|)中加入25 μ| EDTA溶液（72 mg/ml)，以避免血液凝集，血液#Turk，s溶 液（具有0.01%結晶紫之2。/。醋酸)稀釋1〇倍或2〇倍。以顯 微鏡計鼻白血球數目。 15 於第8天所得之血液(〇·1 ml)中加入25 μΙ EDTA溶液 (72 mg/ml) ’以避免血液凝集，血液並以生理食鹽水稀釋 2000倍。計算紅血球數目。血紅素(Hbg)含量係以 Worthington RE et al„ __tal _心丨_ 15:85-92, 1987所述之方法決定。 2〇 之縣可知，本發明之祕萃取物可 減少周邊血液之白血球數目的下降，並加速白血球的回 復，且維持紅血球及Hbg含量至正常值。 由前述可知’雖然已說明及描述各特定形式之發明實 施例，但可在不偏離本發明之精神與範轉下，進行各種改 28 1276440 前述實施例係不 良。因此，除了附隨之申請專利範圍外 欲用以限制本發明。 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示柱狀圖，其用以說明（A)山藥甲醇萃取物 與DHE纽及(B)各進—步之萃取區份在C3H小鼠之造骨祖 原細胞增生上的效果； 第2圖係包括柱狀圖，其顯示在、|㈣ # 仅活體外(A)山藥甲醇萃 取物與（B)各進一步之萃取區份對 ;小乳之造骨祖原細胞 10 15 20 分化為成熟造骨細胞上的效果，复 活性來蚊； ，、w^__(ALP) 第3圖係為柱狀圖，其顯示山 杀1f醇卒取物在骨髓細胞 之鹼性磷酸酶(ALP)活性上之活體 卜政果，該骨髓細胞係取 自於心有由糖皮質激素所誘發之骨^鬆症的病患； 為柱狀圖’其顯示山藥甲醇萃取物在㈧小鼠 之造齡化為絲料細•虹騎體内效果 (其係耩由鹼性磷酸酶(ALp)活性來決定 鼠之骨髓細胞中之骨質礦質化上 骨小節形絲枚）； &如絲（其係藉由 Γ4ΓΓ狀圖，其顯示山藥f醇萃取物在卵巢切除 小鼠中對㈧驗性碌，p)活性及⑹骨質礦 質化的活體内效果；
第6圖係顯示取自小鼠骨髓 斗τ α 此之細胞激素的RT-PCR 結果，削1係Π服供給本發明之山”醇萃取物； 29 j27644〇 第7圖係為相差照片，其顯示在上皮生長因子(EGF)存 在下，山樂甲醇萃取物在初代培養之小鼠骨趙細胞之形態 改變上的影響； 第8圖係顯示山藥甲醇萃取物對於白血球減少症小鼠 5 之肩邊血液中白血球含量上的活體内欵果，該白血球減少 疼係由環磷醯胺所引起； 第9圖係為一柱狀圖，其係顯示山藥甲醇萃取物對於由 環石粦醯胺所誘發之白血球減少症之小鼠的周邊血液中之紅 血球(RBC)含量上的活體内效果，該小鼠係患有嚴重貧血； 10 以及 第10圖係為一柱狀圖，其係顯示山藥曱醇萃取物對於 由環填醯胺所誘發之白血球減少症之小鼠的周邊血液中之 血紅素含量上的活體内效果，該小鼠係患有嚴重貧血。 15 【圖式之主要元件代表符號表】 (無） 30 1276440 序列列表 <110> 國立陽明大學 校長：吳李妍華
<120> 山藥萃取物及其醫藥用途 5 <130> PE-22228-AM <140> <141> <160> 8 10 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213>人工合成序列 15 <220> <223> IL-4之倍增作用弓|子 <400> 1 ATG GGT CTC AAC CCC CAG CTA GT 1 10 15 20 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213>人工合成序列 31 <220> 1276440 <223> IL-4之倍增作用引子 <400> 2 GCT CTT TAG GCT TTC CAG GAA GTC 5 1 10 15 20
<210> 3 <211> 41 <212> DNA 10 <213>人工合成序列 <220> <223> TGF-冷之倍增作用引子 <400> 3 TGG ACC GCA ACA ACG CCA TCT ATG CCA TCT ATG 15 1 10 15 20 25 30 AGA AAA CC 35 40 <210> 4 20 <211> 32 <212> DNA <213>人工合成序列 <220> <223> TGF-冷之倍增作用引子 32 1276440 <400> 4 TGG AGC TGA AGC AAT AGT TGG TAT CCA GGG CT 1 10 15 20 25 30 5 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213>人工合成序列 <220> 10 <223> BMP-2之倍增作用弓I子 <400> 5 CAT CCA GCC GAC CCT TG 1 10 15 15 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213>人工合成序列 <220> 20 <223> BMP-2之倍增作用引子 <400> 6 CTC TCC CAC TGA CTT GTG 1 10 15 33 1276440 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成序列 5 <220> <223>/S-肌動蛋白之倍增作用引子 <400> 7 GAC TAC CTC ATG AAG ATC CT 1 10 15 20 10 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成序列 15 <220> <223> /5-肌動蛋白之倍增作用引子 <400> 8 CCA CAT CTG CTG GAA GGT GG 1 10 15 20 20 34
Claims (1)
- Ι2-7644Θ-η ‘公告$ 專利範圍： 第092136872號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：95年12月 1· 一種山藥萃取物，其係藉由一包括下列步驟之方法而被 5 製得： 將去皮的山藥塊莖浸泡於一為1 %的醋酸溶液内； 冷凍該經醋酸處理的山藥塊莖； 冷凍乾燥該經冷凍的山藥塊莖； 在一酸之存在下，以一以醇為主之溶劑來萃取該經 10 冷凍乾燥的山藥塊莖； 令由該萃取步驟所得到的產物進行一分離處理，俾 以得到一溶解區份；以及 將溶劑自該分離步驟所得到的溶解區份中移除掉。 2. —種山藥萃取物，其係藉由一包括下列步驟之方法而被 15 製得： 將去皮的山藥塊莖浸泡於一為1%的醋酸溶液内； 冷凍該經醋酸處理的山藥塊莖； 冷凍乾燥該經冷凍的山藥塊莖； 在一酸之存在下，以一以醇為主之溶劑來萃取該經 20 冷凍乾燥的山藥塊莖； 令由該萃取步驟所得到的產物進行一分離處理，俾 以得到一溶解區份； 將溶劑自該分離步驟所得到的溶解區份中移除掉； 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 1276440 由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以 形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及 收集於該分配處理步驟所形成之乙酸乙酯層，繼而 移除乙酸乙酯，俾以得到一乙酸乙酯-萃取的產物。 5 3· —種山藥萃取物，其係藉由一包括下列步驟之方法而被 製得： 將去皮的山藥塊莖浸泡於一為1%的醋酸溶液内； 冷凍該經醋酸處理的山藥塊莖； 冷凍乾燥該經冷凍的山藥塊莖； 10 在一酸之存在下，以一以醇為主之溶劑來萃取該經 冷;東乾燥的山藥塊莖； 令由該萃取步驟所得到的產物進行一分離處理，俾 以得到一溶解區份； 將溶劑自該分離步驟所得到的溶解區份中移除掉； 15 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 由乙酸乙S旨與水所構成之溶劑混合物的第一分配處 理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層； 令由該第一分配處理所得到的第一水層進行一使 用η-丁醇的第二分配處理，俾以形成一η-丁醇層以及一 20 第二水層；以及 收集於該第二分配處理所形成之η-丁醇層，繼而移 除η-丁醇，俾以得到一η-丁醇-萃取的產物。 4· 一種山藥萃取物，其係藉由一包括下列步驟之方法而被 製得： 2 1276440 將去皮的山藥塊莖浸泡於一為1%的醋酸溶液内； 冷凍該經醋酸處理的山藥塊莖； 冷凍乾燥該經冷凍的山藥塊莖； 在一酸之存在下，以一以醇為主之溶劑來萃取該經 5 冷凍乾燥的山藥塊莖； 令由該萃取步驟所得到的產物進行一分離處理，俾 以得到一溶解區份； 將溶劑自該分離步驟所得到的溶解區份中移除掉； 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 10 由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的第一分配處 理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層； 令由該第一分配處理所得到的第一水層進行一使 用η-丁醇的第二分配處理，俾以形成一 η-丁醇層以及一 第二水層； 15 令於該第二分配處理所得到之第二水層混合以一 75%醇溶劑，俾以造成不溶於所形成的水醇溶液内的物 質之沉澱；以及 將不溶性物質自該混合步驟所形成的水醇溶液移 除掉，繼而移除水醇溶劑，俾以得到一水醇-萃取的產 20 物。 5·如申請專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物，其中 在該方法中，被使用於該萃取步驟中之該以醇為主的溶 劑是一以甲醇為主之溶劑、一以乙醇為主之溶劑，或是 它們的混合物。 3 1276440 6·如申w專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物，其中 在该方法中，被使用於該萃取步驟中的酸是1%醋酸。 7.如申印專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物，其中 在該方法中，一在1%醋酸之存在下的4〇%甲醇溶液被用 5 於該萃取步驟中。 8·如申晴專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物，其中 在該方法中，該分離處理是藉由離心來進行。 9· 一種用於治療骨質疏鬆症的藥學組成物，其包含有一如 申請專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物以作為 10 有效成分。 10. —種用於增進骨髓細胞的增生與分化的化療助劑組成 物，其包含有一如申請專利範圍第項中任一項之山 藥萃取物以作為有效成分。 11· 一種用於促進因接受抗癌藥劑治療所造成之白血球與 15 紅血球缺乏的病患之恢復的藥學組成物，其包含有一如 申請專利範圍第1至4項中任一項之山藥萃取物以作為 有效成分。 12· —種用以製備一山藥萃取物的方法，其包括下列步驟： 將去皮的山藥塊莖浸泡於一為1%的錯酸溶液内； 20 冷凍該經醋酸處理的山藥塊莖； 冷滚乾燥該經冷康的山藥塊莖； 在一酸之存在下，以一以醇為主之溶劑來萃取該經 冷凍乾燥的山藥塊莖； 令由該萃取步驟所得到的產物進行一分離處理，俾 4 1276440 以得到一溶解區份；以及 將溶劑自該分離步驟所得到的溶解區份中移除掉。 13.如申請專利範圍第12項之方法，其進一步包括下列步 驟： 5 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以 形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及 收集於該分配處理步驟所形成之乙酸乙酯層，繼而 移除乙酸乙酯，俾以得到一乙酸乙酯-萃取的產物。 10 14.如申請專利範圍第12項之方法，其進一步包括下列步 驟： 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的第一分配處 理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層； 15 令由該第一分配處理所得到的第一水層進行一使 用η-丁醇的第二分配處理，俾以形成一η-丁醇層以及一 第二水層；以及 收集於該第二分配處理所形成之η-丁醇層，繼而移 除η-丁醇，俾以得到一η-丁醇-萃取的產物。 20 15.如申請專利範圍第12項之方法，其進一步包括下列步 驟： 令由該溶劑移除步驟所得到的產物進行一使用一 由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的第一分配處 理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層； 5 1276440 令由該第一分配處理所得刻的第一水層進行一使 用η-丁醇的第二分配處理，俾以形成一n-丁醇層以及一 第二水層； 令於該第二分配處理所得刻之第二水層混合以一 5 75%醇溶劑，俾以造成不溶於所形成的水醇溶液内的物 質之沉澱；以及 將不溶性物質自該混合步驊所形成的水醇溶液移 除掉，繼而移除水醇溶劑，俾以得到一水醇—萃取的產 物。 10 M·如申請專利範圍第12至15項中任/項之方法，其中被使 用於該萃取步驟中之該以醇為主的溶劑是一以甲醇為 主之溶劑、一以乙醇為主之溶劑，或是它們的混合物。 17·如申請專利範圍第12至15項中任一項之方法，其中被使 用於該卒取步驟中的酸是1%醋酸。 15 18·如申請專利範圍第12至15項中任-項之方法，其中〆在 1%醋酸之存在下的娜甲醇溶液被祕該萃取步驟中。 19.如申請專利範圍第12至15項中任一項之方法，其^中該分 離處理是藉由離心來進行。 6
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