JP2004196816A - 細胞の分化を誘導する血清由来因子およびその医薬的使用 - Google Patents

Abstract

【課題】低分子量を有し、酸性のｐＨで電気的に荷電し、２８０ｎｍに吸収をもつ生物学的に活性な血清由来の物質組成物（ＳＤＦ）に関する。このＳＤＦは電子スプレー質量スペクトルによって測定して分子量３１６Ｄａを有する。
【解決手段】本ＳＤＦまたはそのセルロプラスミン（ＣＰ）との複合体は数種の治療的に有用な性質を有する。ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は白血病細胞に最終的な細胞分化を誘導し、それらの増殖能およびそれらの自己細胞再生能を喪失させ、初期の正常前駆細胞の増殖の刺激および血管新生の亢進を阻害すると共に、正常幹細胞および前駆細胞をエキソビボ増殖させる。活性成分としてＳＤＦまたはその複合体を含有する医薬組成物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、低分子量を有し、酸性のｐＨで電気的に荷電し、２８０ｎｍに吸収をもつ生物学的に活性な血清由来の物質組成物（ＳＤＦ）、その単離方法、およびそれからなる医薬組成物に関する。

正常な造血は糖蛋白質成長因子（サイトカイン）たとえばコロニー刺激因子、ならびに非蛋白質小分子物質たとえばレチノイドを包含する多様な調節物質により統合的に行われている。それらは、生存（アポトーシス）、前駆細胞の増殖および分化ならびに成熟細胞の活性化状態を調節する。増殖および分化の両過程は、正および負の刺激によって調節される。急性白血病においては細胞分化の遮断により大量の増殖性、未分化、非機能性細胞の蓄積を招く。最近はこれらの調節物質が広範な一連の臨床的および実験室的適用に使用されている。たとえば、サイトカインは、貧血状態たとえば骨髄（ＢＭ）移植後、放射線−化学療法等の患者の処置に、ならびに細胞療法（移植、免疫−または遺伝子−療法）に価値がある特定のサブセットの細胞のエキソビボ（ex vivo）増殖に用いられる。低分子量化合物たとえばレチノイドは、白血病細胞の分化の誘導に治療的モダリティー（modality）として使用されている。

白血病の処置に対する現在のアプローチは悪性細胞を化学または放射線療法で死滅させることを基盤とする。このような処置は悪性細胞に特異的ではなく分裂中の正常細胞にも傷害を与える。したがって、未分化白血病細胞が分化を受けるように誘導することに基づく別のアプローチが開発されている。造血細胞の最終的分化により白血病の誘発性が喪失することは明らかである。

ある種の未分化骨髄性白血病細胞が、サイトカイン（たとえばＩＬ−６）に反応し、成熟した機能性の非分裂性顆粒球またはマクロファージへの分化を受け、それによって白血病誘発性は失われることが示されている（Fibach,E.ら, Nature,New Biology 237: 276, 1972; Shabo, Y.ら, Blood 78: 2070, 1988; Fibach,E.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 70: 343-346, 1973; Inbar, M.ら, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 70: 2577-2581, 1973; Fibach,E. & Sachs,L.J., Cell Physiol.83: 177-185, 1974; Hayashi,M.ら, Int.J.Cancer 14: 40-48, 1974; Fibach,E.& Sachs,L.J., Cell Physiol. 86: 221-230, 1975; Fibach, E. & Sachs, L.J.,Cell Physiol. 89: 259-266, 1975）。

他の分化誘導物質には、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチレンビスアセトアミド、酪酸（Collins,S.J.ら,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75: 2458,1978）、ビタミンＡおよびＤ３の誘導体（Breitman,T.T.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77: 2936, 1980）ならびに低用量の細胞毒性薬物、たとえばアクチノマイシンＤおよびシトシンアラビノシド（Breitman,T.T.ら, 同誌）が包含される。レチノイン酸は急性前骨髄球性白血病の処置に使用されている（Chomienne, C., FASEB 10:1025, 1996）。

一部の細胞系を誘導できることはあっても、これらの誘導物質は、白血病患者から新たに単離された細胞に最終的な分化を誘導することは稀にしか認められない（Breitman,T.T.ら, 1980, 同誌）。

悪性および貧血状態における高分子量の銅結合蛋白質であるセルロプラスミン（ＣＰ）のある種の活性が数報、報告されている。

たとえば、ＪＰ ５６１２０６２２およびＪＰ ５６０９００１５には、ＣＰが白血病に対する抗腫瘍製剤の活性成分として記載されている。ＪＰ ５６１２０６２２にはＣＰが癌の増悪に対するその阻止作用により、数種の哺乳動物の腫瘍に対して治療活性を有する旨記載されている。さらに、ＣＰは強力な酸化性スーパーオキサイドアニオンラジカルを不活性化して酸素分子に変換できることが記載されている。ＣＰには肝臓カタラーゼの生合成の促進作用があるとも言われている。

ＪＰ ５６０９００１５には、主要な成分としてヒトＣＰを含有する、抗悪性腫瘍剤の副作用の予防および治療薬が記載されている。
ＪＰ ５６００２９１６にはまた、ＣＰが抗腫瘍剤として記載されている。この公報は活性成分としてＣＰを含有する、放射線傷害の予防および処置のための組成物に関するものである。ＣＰからなる組成物でプレインキュベーションしたのちγ線を照射された動物は高い生存率を示した。この公報に記載された予防活性は特異的にＣＰに帰因するものであった。

ＪＰ ６０１４９５２９は哺乳動物にＣＰを投与した結果としての分化誘導因子の産生に関する。さらに、活性成分が動物をＣＰで処置したのちに産生された分化誘導因子である白血病の薬剤が記載されている。この公報に指摘されているように、分化誘導因子により得られる白血病細胞の分化はＣＰ刺激を介して誘導される。繰り返しＣＰを投与したウサギから得られる血清はＭ１細胞のマクロファージへの分化を誘導することができた。しかしながら、ＣＰ単独では分化を誘導することはできなかった。分化の誘導を引き起こしたＣＰ刺激によって得られる物質の同定または性質に関しては何ら指摘がない。

ＣＰの使用については他の医薬組成物の調製に関しても報告されている。たとえばＧＢ１，３０４，６９７にはとくに炎症に対して使用するための、ＣＰからなる医薬組成物が記載されている。
さらに、臨床試験によりＣＰが再生不良性貧血の治療に有用であることも明らかにされている（Shimizu,M.,Transfusion 19(6):742-8,1979;Arimori,S.,Jap.J.Clin.Exper.Med.43: 1897,1966）。

初期の報告とは異なり、本発明においては、従来ＣＰに帰せられていた活性が低分子量の物質組成物（ＳＤＦ）に起因するものであることが明らかにされた。この物質は血清中ではＣＰと優先的に会合する（ＳＤＦ−ＣＰ複合体）。ＳＤＦとＣＰの間の会合の性質とは無関係に、成人血清に由来するＣＰは、この因子に富んだ原料であることが明らかである。ＳＤＦの他の原料には尿および胎児血清がある。その高い分子量により無傷のＣＰは尿中には存在できない。したがって尿中に存在するこの因子はＣＰ分子とは会合していないか、少なくともその無傷の分子とは会合していないものと推察される。
以下に示すように、本発明の主題であるＳＤＦならびにそのＣＰとの複合体は多くの治療的用途を有する。

本発明は、低分子量を有し、酸性のｐＨで電気的に荷電し、２８０ｎｍに吸収をもつ生物学的に活性な血清由来の物質組成物（ＳＤＦ）に関する。ＳＤＦの分子量は電子スプレーで測定して３１６である。

第二の態様においては、本発明は低分子量物質組成物の血漿からの単離および精製方法であって、（ａ）血漿を親和性カラムに通して輸送し、ＳＤＦ−ＣＰ複合体である電気泳動的に均一な（homogeneous）分画を得、所望により陰イオン交換カラムを通過させて濃縮し、（ｂ）（ｉ）工程（ａ）で得られた分画をＲＰ−ＨＰＬＣ“Ｒｅｓｏｕｒｃｅ”（登録商標）カラムに通して、水（ｐＨ２．５）中０．０５〜０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる溶出緩衝液Ａ、アセトニトリルからなる緩衝液Ｂを用いてアセトニトリル濃度０〜２％および１３〜１７％で溶出する分画を集めて合わせるか、または（ii）工程（ａ）で得られた分画を酸性溶媒で抽出し、有機相から活性分画を回収して、ＳＤＦ−ＣＰ複合体からＳＤＦを単離し、（ｃ）工程（ｂ）において得られた分画を、Ｃ−１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより、最初の任意の分離工程では水（ｐＨ２．５）中０．１％ＴＦＡからなる溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡからなる溶出緩衝液Ｂを用いてアセトニトリル濃度０〜２％で溶出する分画を集め、次の分離工程では水中０．１％のトリエチルアミンからなり、ｐＨを７．０に調整した溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリルからなる溶出緩衝液Ｂを用いてアセトニトリル濃度９〜１１％で溶出する分画を集める工程からなる方法に関する。

本発明の範囲内にはまた、セルロプラスミンおよび上述の生物学的に活性な物質組成物（ＳＤＦ）からなる生物学的に活性な複合体も包含される。

第二の態様においては、本発明は、活性成分として本発明のＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体、および所望によりさらに医薬的に許容される添加物からなる医薬組成物に関する。

このような医薬組成物は、骨髄形成不全の患者の処置、腫瘍の寛解の誘導または維持、骨髄移植に際しての造血正常幹細胞および前駆細胞の増殖、または血管新生の阻害に使用することができる。

本発明は、低分子量を有し、酸性のｐＨで電気的に荷電し、２８０ｎｍに吸収をもつ生物学的に活性な血清由来の物質組成物（ＳＤＦ）に関する。ＳＤＦの分子量は電子スプレー質量スペクトルで測定して３１６である。
さらに詳しくは、ＳＤＦは、その断片化により電子スプレー質量スペクトル上に指示されるように、芳香族残基からなり、二重電荷を有する。

本発明はまた低分子量物質組成物の血漿からの単離および精製方法において、（ａ）血漿を親和性カラムに通して輸送し、ＳＤＦ−ＣＰ複合体である電気泳動的に均一な分画を得て、所望により陰イオン交換カラムを通過させて濃縮して２８０ｎｍに吸収を有する結合分画を収集し、（ｂ）（ｉ）工程（ａ）で得られた分画をＲＰ−ＨＰＬＣ“Ｒｅｓｏｕｒｃｅ”（登録商標）カラムに通し、水（ｐＨ２．５）中０．０５〜０．１％ＴＦＡからなる溶出緩衝液Ａ、アセトニトリルからなる溶出緩衝液Ｂを用いてアセトニトリル濃度０〜２％および１３〜１７％で溶出する活性分画を集めて合わせ、この場合、上記ＣＰの分画はアセトニトリル濃度約４０％で溶出して活性を欠き、または（ｉｉ）工程（ａ）で得られた分画を酸性溶媒で抽出し、有機相から活性分画を回収し、一方、ＣＰは水相から不活性型で回収される工程によって高ＭＷ ＣＰ蛋白質との複合体からＳＤＦを単離することからなる方法に関する。以下に示すように、工程（ｂ）において得られた２つの分画が活性であった。保持時間の差は分子のイオン化の状態および／またはある種の不純物、多分小さいペプチドとの会合によるものと考えられる（図２）。工程（ａ）に使用される親和性クロマトグラフィーカラムはＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６ＢまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂとクロロエチルアミンの反応を用いて誘導されるテンタクル−アガロースゲルとすることが好ましい（Calabrese,L.,Biochem.Int.16:199-208,1988）。

ＳＤＦをその不純物から単離するためには他の精製工程が要求される。すなわち本発明の方法はさらに、（ｃ）工程（ｂ）において得られた活性分画を、Ｃ−１８カラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分離により、最初の任意の分離工程では水（ｐＨ２．５）中０．１％ＴＦＡからなる溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡからなる溶出緩衝液Ｂを用いてアセトニトリル濃度０〜２％で溶出する分画（空隙（ｖｏｉｄ））を集めて精製することからなる。酸性ｐＨ（２．５）におけるこの精製工程では上記不純物からのＳＤＦの部分的解離が起こる。活性分画は空隙容量に相当する位置に溶出され、一方、大部分の不純物は勾配で溶出される。半精製ＳＤＦ（酸性ｐＨにおける任意精製を行った場合）は、ついでそれを同じカラムに通し、水中０．１％のトリエチルアミンからなり、ｐＨを７．０に調整した溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリルからなる溶出緩衝液Ｂを用いる次の分離工程に付す。単一の対称なピークとして出現する分画はアセトニトリル濃度９〜１１％で溶出し、この分画を収集する。所望により、工程（ｂ）で得られた分画を直接（ｃ）の第二の分離工程で分離してもよい。

工程（ａ）の別法として５工程の精製操作を用いることもできる。この５工程操作は硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE）、陽イオン交換クロマトグラフィー（S-Sepharose）、染料−リガンドクロマトグラフィー（Affigel blue）および疎水性クロマトグラフィー（TSK-Phenil）の工程からなる。最後の精製工程後に、精製分画はさらにＳＤＳ−ゲル上で分離することができる。

本発明によれば、ＳＤＦが得られる血漿はヒト血漿である。しかしながら、本発明者らは活性分画が非ヒト血漿、ヒト尿およびウシ胎児血清にも存在することを見出している。完全なＣＰ蛋白質は尿中に存在するには大きすぎるので、尿中に存在する活性分画はＳＤＦ自体、またはＣＰ蛋白質の部分もしくは他の小さいペプチドに会合しているものと推測される。以上から考えて、ＳＤＦはヒトまたは非ヒト成人または胎児の血清または尿から任意の適当な方法によって単離および精製できるものと思われる。

本発明はまたＣＰおよびＳＤＦからなる生物学的に活性な複合体に関する。

本発明の方法によって得られる生化学的に純粋なＳＤＦもまたすべて本発明の範囲に包含されることは自明の通りである。ＳＤＦとＣＰの複合体は、本発明のたとえば５工程精製の工程（ｖ）の操作から（実施例１Ｂ）または本発明の１工程親和性精製操作ののちに得ることができる。

以下の説明に示すように、本発明者らは、培養液中における細胞の成長および生存能を維持する正常血清が、造血細胞に二重の活性を発揮する低分子量の天然物質を含有することを見出した。すなわち、一方ではそれは様々な正常血液細胞の発生をきわめて強力に刺激し、他方では最終的な分化を誘導することにより白血病細胞の増殖を阻害する。この天然物質は血清から精製されたことから「血清由来因子」（ＳＤＦ）と命名された。

正常の造血に対するＳＤＦの作用
移植における造血細胞成長因子の使用
元は自己由来または同種起源から得られた造血細胞の移植は遺伝性または悪性の多様な疾患に対する第一選択的な処置となっている。最近では、多能性の造血幹細胞（ＣＤ３４^＋細胞）に富むさらに特定された集団がこのような処置に使用されている（Van Epps,D.E.ら, Blood Cells 20: 411, 1994）。骨髄のほかに、幹細胞も他の原料たとえば末梢血および新生児臍帯血から誘導できた（Emerson,S.G., Blood 87: 3082, 1996）。自家骨髄移植に比べて、末梢血細胞の移植は、汎血球減少症の期間を短縮して、感染および出血の危険を低下させる（Brugger,W.ら, N.Eng.J.Med. 333: 283, 1995; Williams,S.F.ら, Blood 87: 1687, 1996; Zimmerman,R.M.ら, J.Haematotherapy 5: 247, 1996）。移植に末梢血を用いる他の利点はその入手の容易さである。しかしながら、末梢血移植の制限因子は、循環ＣＤ３４^＋細胞の数が少ないことである。したがって移植に十分な細胞を得るためにはコロニー刺激因子および化学療法による処置後、骨髄から循環への動員ののち、末梢血由来の幹細胞は反復白血球泳動により「収穫」される（Bruggerら、1995、同誌;Williamら, 1996、同誌）。

予備的試みでは成長因子混合物を含む組織培養液中でのエキソビボ増殖によりＣＤ３４^＋集団を濃縮した（Koller,M.R.ら, Blood 82: 378, 1993; Lebkowski,J.S.ら, Blood Cells 20: 404, 1994）。少数のＣＤ３４^＋細胞からの機能性幹細胞のこのような増殖には以下のような利点がある。
−それは成人造血系の再構築に要求される血液の容量を減少させ、動員および白血球泳動の必要性が除去される（Bruggerら, 1995, 同誌）。
−エキソビボ増殖集団の将来の使用の可能性のための末梢血、骨髄または臍帯血ＣＤ３４^＋細胞の少数の保存を可能にする。
−悪性腫瘍患者の自己移植の場合に、使用される血液総容量を減少させ、最終的な移植体中における腫瘍細胞の負荷を、ＣＤ３４^＋細胞の選択により低下させることができる。自己輸血中のこのような夾雑腫瘍細胞は疾患の再発を引き起こす可能性がある（Bruggerら, 1995, 同誌）。
−培養はＴ−リンパ球の重要な欠失を与え、これは移植片対宿主病を減少させる同種移植のセッティングに有用である。

臨床試験により、少数の末梢血ＣＤ３４^＋細胞に由来するエキソビボ増殖細胞の移植は、高用量の化学療法剤で処置された患者の造血系を回復できることが指示されている。しかしながら、今日までの結果からは、このような培養細胞の長期にわたるインビボ造血能力について確立した結論が容認されるには至っていない（Bruggerら, 1995、同誌;Williamら, 1996、同誌）。

移植の成功には血球減少症の期間の短縮ならびに長期間の着床が重要である。移植体中に中期および後期前駆細胞を包含するとドナー由来の成熟細胞の産生が加速され、血球減少相を短縮できた。エキソビボ増殖細胞には幹細胞に加えて、さらに分化が進んだ前駆細胞を包含することが、造血系の短期間での回復および長期にわたる復元を至適化するために重要である。この目的では、幹細胞の増殖とともに、中期および後期前駆細胞、とくに好中球および巨核球系列を担当する細胞の増殖が要求される（Sandstrom,C.E.ら, Blood 6: 958, 1995）。

悪性腫瘍患者における自己移植に関しては様々な成長因子たとえばＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦがＢＭ移植に現在用いられていることに留意すべきである。それらは、移植（および化学療法）後の好中球の回復時間を骨髄性前駆細胞の刺激により短縮することが示されている。しかしながら骨髄性白血病細胞はこれらの因子の受容体を有するので、残った悪性細胞の増殖も刺激される。ＳＤＦそれ自体またはそのＣＰとの複合体は単独でまたはＧＭ−ＣＳＦとの組合せで正常前駆細胞の増殖を増強するが、骨髄性白血病細胞の「自発性」およびＧＭ−ＣＳＦ刺激増殖を阻害し（実施例２〜６）、それは、二重作用すなわち白血病細胞撲滅作用と同時に正常細胞刺激作用を有する可能性がある。

以下に例示するように、ＳＤＦによって処置された白血病細胞はそれらの増殖能を失い、これは細胞がそれらの白血病誘発能を失ったことを指示する。したがって、ＳＤＦは大きな治療的価値を有すると考えられる。

さらに、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は、初期の正常前駆細胞の増殖を刺激することができる。したがって、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は正常造血細胞たとえば幹細胞（ＣＤ３４^＋）、および骨髄性および赤血球担当の前駆細胞、ならびにＢＭ移植処置のための抗原提示樹状突起細胞のエキソビボ増殖、または細胞療法（移植、および免疫または遺伝子療法）に価値がある特異的サブ集団のエキソビボ増殖に使用できる可能性がある。加えて、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体はインビボに適用することも可能で、この場合それらは形成不全状態たとえば再生不良性貧血または放射線／化学療法後の造血組織の回復を支持する。

さらに、白血病細胞の分化の誘導および増殖の阻害に有効ではあるが、ＳＤＦもまたそのＣＰとの複合体も正常な骨髄性および赤血球系細胞の発生を阻害しないことが本発明者らによって見出された。しかも、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は単独でまたは他の成長もしくは増殖因子と組合せると正常な初期前駆細胞の増殖を刺激することが発見された。たとえば：
（ａ）初期造血幹細胞および担当前駆細胞のインビトロ刺激。ＳＤＦはＰＢまたはＢＭに由来する初期幹細胞（ＣＤ３４^＋）の増幅を刺激することが見出され、したがって多能性幹細胞ならびに系統（顆粒球、赤血球および巨核球）担当前駆細胞のエキソビボ増殖に適用できる可能性がある。後期成長因子との組合せにおいては（相２で添加、実施例中で以下に説明）、ＳＤＦは骨髄系および赤血球系コロニー形成細胞の数を上昇させる。このような培養は（固定化）ＰＢおよび新生児臍帯血に由来するＣＤ３４^＋濃縮集団の移植および遺伝子療法に重要である。
（ｂ）初期幹細胞および担当前駆細胞のインビボ刺激。ＳＤＦは、ＰＢおよび赤芽球ろう患者に由来する前駆細胞のインビトロ増殖を刺激することが見出された。これらの結果は、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体が形成不全状態、たとえば再生不良性貧血、ファンコニ貧血、脊髄異形成症候群または骨髄破壊放射線／化学療法およびＢＭ移植後の正常な造血系の回復のために投与可能であることを示唆する。
（ｃ）治療的可能性のあるリンパ造血細胞の特異的サブセット集団、たとえば抗原提示樹状突起のエキソビボ増殖。樹状突起は「専門的な」、免疫刺激、抗原提示細胞である。様々な研究から、免疫療法における樹状突起細胞の使用の可能性が示唆されてきた。このモダリティーには、インビトロでパルスされた樹状突起細胞の治療用ワクチンとしての腫瘍抗原との移入、ならびに養子（adoptive）Ｔ細胞療法に使用するため腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のプライミングにおける樹状突起細胞の使用が包含される（Bernhard,H.ら, Cancer Res. 55: 1099, 1995; Protti,M.P.ら, Cancer Res. 56: 1210, 1996）。文献によれば、このような細胞の増殖に最良の「カクテル」は、サイトカインの混合物（ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦα）である。ＢＭ細胞をこのようなカクテルの存在下にクローン化すると発生したコロニーの総数の４０％が樹状突起細胞を含んでいた（Moore,M.A.ら, J.Exp.Med.182: 1111, 1995）。ＰＢ前駆細胞からこのようなコロニーを得るためには、培養集団がＣＤ３４^＋細胞に富んでいなければならない。ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体はＰＢ−ＣＦＵ−樹状突起細胞の委任／増殖を誘導する。ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体を用いて（ＴＮＦまたはＳＣＦなしで）非濃縮ＰＢ単核球から８０％までの樹状突起コロニーが得られた。

実施例５に示すように、ＳＤＦはウシ大動脈からの内皮細胞の増殖に強力な阻害活性を有する。

上述のような、ＢＭ移植に加えて、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体を用いる造血幹細胞のエキソビボ増殖は遺伝子療法に使用できる可能性がある。

白血病の造血機能に対するＳＤＦの作用
さらに、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は本発明の方法もしくは任意の他の適当な方法で得られてもまた任意の適当な操作で合成されても、ヒトおよびマウス両者の確立された白血病細胞系ならびに急性および慢性のヒト骨髄性白血病から新たに体外培養された細胞の分化の誘導および増殖の阻害のような数種の治療的活性を有する。さらに、ＳＤＦそれ自体またはそのＣＰとの複合体は白血病細胞の最終的細胞分化を誘導することができる。幼若細胞はその白血病性の表現型を失い、機能性の非分裂マクロファージに変化する。さらに、上記最終的細胞分化の結果またはそれとは独立に、上記白血病細胞はＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体の存在下にそれらの増殖能力およびそれらの自己細胞再生能力を失う。白血病細胞に対するＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体の作用は、３つの臨床的セッティングにおいて、骨髄球性白血病の処置に有用である可能性がある。すなわち、（ａ）主要なモダリティーとして「分化誘導療法」を用いる、所望により他の造血因子または低用量化学療法と組合せた寛解の誘導；（ｂ）腫瘍の寛解状態の維持、および（ｃ）残留する白血病細胞のインビトロまたはインビボ排除のための自己移植である。

別の態様においては、ＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体は核転写因子の修飾による造血細胞の増殖および分化の調節に利用できる。

特異的な遺伝子の発現レベルの修飾には、細胞の増殖および分化の制御が前提条件である。遺伝子の発現は、場合により細胞表面受容体からのシグナル伝達の標的である配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質（転写因子）によって制御される。増殖の制御におけるこの過程の重要性は数種の癌原遺伝子たとえばｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ等が、配列特異的な転写因子をコードすることの発見によって強調される（Xanthoudakis,S., EMBO J. 11:3323, 1992; Ammendola,R., Eur.J. Biochem. 225: 483, 1994）。これらの因子の活性はリン酸化によって修飾することができるが、還元−酸化（レドックス）状態の変化により仲介されるＤＮＡ結合活性の付加的な形態の調節の証拠が最近出現した。レドックス状態は、リン酸化と同様の様式での転写因子の翻訳後制御の一般的な機構を提供する可能性が示唆されている（Xanthoudakis,S., 1992, 同誌;Ammendola, 1994, 同誌）。たとえば、Ｆｏｓ−ＪｕｎヘテロダイマーおよびＪｕｎ−ＪｕｎホモダイマーのＤＮＡへの結合にはこれらの蛋白質が還元状態にあることが要求される。このレドックス調節型は、数種の他の転写因子たとえばＭｙｂ，Ｒｅｌ，およびＮＫ−ｋＢのＤＮＡ結合活性が同様な様式でそれらの酸化状態の変化に鋭敏であることから、広く使用されている可能性がある。

最近の開示では、小さなレドックス電位分子たとえばグルタチオン、または大きな蛋白質たとえばチオレドキシン（Walker,L.J., Mol.Cell.Biol. 13: 5370, 1993）のＳｐ−１のような数種の核転写因子のＤＮＡ結合能の調節に寄与することが示唆されている。ヒト線維芽細胞の培養では、ピロキノリンキノン（ＰＱＱ）のようなレドックス電位を有する小分子が、増殖を刺激することが示されている（Naito,Y., Life Sciences 52: 1909, 1993）。ＰＱＱの強度は上皮成長因子の場合に匹敵し、線維芽細胞成長因子またはインスリン成長因子に比べてはるかに高い。ジチオカルバメートのピロリジン誘導体はＡＰ−１調節を介して骨髄系細胞の分化を誘発する（Aragones,J., J.Biol.Chem. 271: 10924, 1996）。したがって、レドックス電位活性を有する小分子は転写因子の活性の調節を介して細胞の増殖および分化を修飾することができると結論される。

本発明者らによればＰＱＱは高濃度で白血病細胞の分化を誘導し、正常細胞の増殖を刺激できる（実施例６）ことが見出された。しかしながら、高濃度を必要とすることから、ＳＤＦに比較してＰＱＱの効果は低い。ＳＤＦは低分子量物質組成を有し、二重の陰性電荷をもつと考えられ、しかも分化の誘導におけるその強度からＳＤＦはＰＱＱと同様にレドックス電位活性を有し、したがって転写因子活性の調節を介して細胞の増殖および分化を修飾する可能性も予測される。

血管新生に対するＳＤＦの作用
別の態様においては、ＳＤＦは内皮細胞の増殖に強力な阻害活性を有することが見出され、したがって、血管新生の阻害に適用できる可能性がある。ある種の病的状態においては、血管新生は劇的に増大し、もはや自己制御を受けない。病的な血管新生は多くの疾患、たとえば慢性関節リウマチ、乾癬、水晶体後線維増殖症、糖尿病性網膜症および血管腫の発症時、臓器移植の拒絶反応時、ならびにとくに重要なものは悪性の固形腫瘍において認められる。血管がよく発達した腫瘍は局部的および転移の両者によって増殖し、一方血管の少ない腫瘍は直径１〜２ｍｍを越えて増殖することはない。これは血管新生の刺激物質と阻害物質の間のバランスの欠如の結果であると示唆されている（Folkman,J., New Engl.J. Med. 285: 1182-1186, 1971; Folkman,J., J.Natl.Cancer Inst. 82: 4-6, 1989）。

他の態様においては、活性成分としてＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体を含有し、所望によりさらに医薬的に許容される添加物からなる医薬組成物が本発明の範囲内に包含される。このような医薬組成物は、病的な表出として制御されない血管新生を伴う疾患における血管新生の増進を阻害するために使用できる。

本発明の他の医薬組成物は、活性成分として本発明のＳＤＦからなり、所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含有する腫瘍の寛解を誘導する医薬組成物である。

別の態様では本発明の医薬組成物は活性成分として本発明のＳＤＦからなり、所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含有する、腫瘍の寛解を維持する医薬組成物である。

さらに、活性成分として本発明のＳＤＦからなり、所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含有する、造血正常幹細胞および前駆細胞の骨髄移植体を増殖させるための医薬組成物もまた、本発明の範囲に包含される。

本発明のＳＤＦの治療用量はもちろん、患者群（年齢、性別等）、処置される状態の性質、投与経路によって変動し、担当医師によって決定される。

本発明の医薬組成物は投与量単位剤形に調製することができる。剤形にはまた持続放出性デバイスも包含される。これらの組成物は製薬技術分野で周知の任意の方法によって調製することができる。

医薬組成物中の医薬的に許容される添加物は、医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤、および所望により他の治療成分とすることができる。医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤は、本質的に、使用される投与量および濃度においてレシピエントに非毒性である。

最後に、本発明の範囲内には、様々な医薬組成物の製造におけるＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体の使用が包含される。

実施例１−ＳＤＦの分離および精製
Ａ：ＳＤＦ−高ＭＷ複合体の１工程親和性（affinity）精製
血漿からＣＰを分離するためには、ヒト血漿を親和性カラムに通過させる。親和性クロマトグラフィー操作はＣＰ蛋白質が優先的に結合するテンタクル−アガロースゲル操作を基盤とする（Robert,V.S., Biochemistry International 27:281-289, 1992）。このゲルはＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６ＢまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂをクロロエチルアミンと反応させることにより誘導された（Robert, 1992, 同誌）。

血漿を親和性カラムに通す前に所望により、血漿を１０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、伝導度５ｍｓに平衡化した硫酸アンモニウムにより、カットオフ３０〜６０％で沈殿させ、ついで上述のようにテンタクル−アガロースゲル上で分離してもよい。溶出は段階的にｔｒｉｓ緩衝液中０．１，０．２，０．３，０．５，１．０Ｍ ＮａＣｌによって実施した（図１）。

親和性クロマトグラフィーによって得られた電気泳動的に均一な（homogeneous）ＣＰ分画を濃縮するためには、分画を陰イオン交換カラム（DEAE、QAE Sephadex カラム）に通した。カラムおよび分画はｔｒｉｓ緩衝液中３００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。結合した分画はｔｒｉｓ緩衝液中３００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。

Ｂ：ＳＤＦ−高ＭＷ複合体の５工程精製
（ｉ）硫酸アンモニウム沈殿−ヒト血漿３０ｌｉｔｅｒを遠心分離した。澄明な上清に固体の硫酸アンモニウムを終濃度６０％になるように加え、ついで室温で４時間攪拌した。得られたスラリー混合物を遠心分離し、沈殿は捨てた。上清にさらに固体の硫酸アンモニウムを８５％飽和まで添加した。２４時間攪拌したのち、スラリー混合物を遠心分離し、沈殿を６Ｌのｔｒｉｓ緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、３Ｋカットオフ膜を用いて同じ緩衝液に対して透析ろ過した。伝導度が５ｍｓに達し、溶液の容量が４Ｌに減少した時点で透析ろ過は完了した。得られた溶液は澄明で、ペレットは認められなかった。１４０００×ｇで１０分間遠心分離すると２．４×１０ｍｇの蛋白質が回収された。

（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー：工程（ｉ）で得られた分画をｔｒｉｓ緩衝液２０ｍＭ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ（伝導度１２０ｍｓ）に平衡化し、同じ緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥカラム（Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, 床容量 1 liter (11.2×10h)）に流速２．５Ｌ／時でポンプを用いて送った。カラムを負荷緩衝液で溶出液の２８０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が基底値に戻るまで洗浄した。使用した溶出緩衝液はｔｒｉｓ緩衝液中１２０ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線塩勾配とした。活性は３００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
ＤＥＡＥで得られた分画をｔｒｉｓ緩衝液２５ｍＭ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌでｖ／ｖ希釈した。攪拌しながら、ｎ−ブタノールをブタノール相が得られるまで滴下して加えた。遠心分離して、２相（水相およびブタノール相）を別個に集めた。ブタノール相を蒸発させ、エタノールまたはｔｒｉｓ緩衝液に再溶解し、活性をアッセイした。水相はＤＥＡＥカラム上でさらに分離した。結合した蛋白質はｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出した。活性は結合分画から回収された。

（ｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー：ブタノール抽出およびＤＥＡＥ段階溶出から得られた水性分画を、さらにＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Pharmacia, 床容量800 ml）上で分離した。溶出緩衝液Ａは、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）、４０ｍＭ ＮａＣｌ（伝導度４ｍｓ）、緩衝液Ｂは、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６ｍＭ ＮａＣｌから構成された。緩衝液Ａで平衡化したカラムに分画を負荷し、緩衝液Ａの条件に調整した。溶出勾配には１００％緩衝液Ａから出発し１００％緩衝液Ｂまでの直線塩勾配を使用した。活性は３００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。

（ｉｖ）染料−リガンド（Affigel blue）クロマトグラフィー：Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーから得られた活性分画をプールして、親和性Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ カラム（５０〜１００ メッシュ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５３−７３０１，カラム床容量４０ｍｌ）上で分離した。溶出緩衝液Ａは、５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、２４ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ ＺｎＣｌ（伝導度５．５ｍｓ）、溶出緩衝液Ｂは、５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、２４ｍＭ ＫＣｌ、緩衝液Ｃは５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＫＣｌを使用した。予め溶出緩衝液Ａで平衡化したカラムに活性分画を負荷し、緩衝液Ａの条件に調整し、ポンプにより流速３ｍｌ／分で流した。蛋白質は１００％緩衝液を用いる段階的溶出により溶出した。

（ｖ）疎水性クロマトグラフィー：Ａｆｆｉｇｅｌ ｂｌｕｅから得られたプールした活性分画を、さらにＴＳＫ−フェニルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，床容量１５ｍｌ）上で分離した。溶出緩衝液Ａは５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、２０％硫酸アンモニウムから構成され、緩衝液Ｂは５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）から構成され、緩衝液Ｃは５０ｍＭ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中２０％エタノールとした。予め緩衝液Ａで平衡化したカラムに活性分画を負荷し、緩衝液Ａの条件に調整した。１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂの負の塩勾配（硫酸アンモニウム）を使用し、ついで緩衝液Ｃにより連続的に段階溶出を行った。活性は５〜１０％硫酸アンモニウムで溶出した。

５工程操作を表１にまとめる。
いずれの操作（ＡまたはＢ）においても電気泳動的に均一なＳＤＦの分画がそのＣＰとの複合体（９７ＫＤ ＭＷ）として得られた（データは示していない）。ＳＤＦ活性の７０％が９７ＫＤバンドから回収されたが、ゲルの前方に相当する位置における分画からは３０％の活性が回収された。

最後の精製工程ののち、精製分画をＳＤＳ−ゲル上で分離することができる：
活性の７０％が９７ＫＤのＭＷに相当する蛋白質バンドから回収され、一方、活性の３０％はゲルの前方における低ＭＷ分画から回収された。９７ＫＤバンドを配列決定して、銅結合蛋白質−セルロプラスミンに相当することが見出された。低ＭＷ分画も配列を決定し、質量スペクトルによって分析し、１〜２ＫＤ ＭＷの数種のペプチドを含有することが認められた。工程（ｖ）で得られた高ＭＷ複合体からＳＤＦ分子を分離するためには、複合体を上述の工程（ｂ）および（ｃ）による精製に付した。

ＣＰとの高ＭＷ複合体からのＳＤＦの単離
ＳＤＦ分画は複合体から２つの異なる操作で単離することができる。
Ａ：ＲＰ−ＨＰＬＣ“Ｒｅｓｏｕｒｃｅ”（登録商標）クロマトグラフィー：活性分画は９ｍｇの精製複合体より、ポリスチレン／ジビニルベンゼンビーズからなるＲＰ−ＨＰＬＣカラム（３ml,Pharmacia）上で分離した（図２）。緩衝液ＡはＨ_２Ｏ中０．１〜０．０５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂはアセトニトリルから構成され、流速は３ｍｌとし、Ａ_２２０の吸収を測定した。０〜２％および１３〜１７％アセトニトリルにおける２つのＳＤＦピークが検出され、収集された。

Ｂ：溶媒抽出：活性分画はそのＣＰとの複合体から酸性溶媒による溶媒抽出によって分離した。ＳＤＦ−ＣＰ、１Ｍ ＨＣｌおよびブタノール（１：４：１０）の混合物を振盪し、ついで５分間遠心分離した（約２０００×ｒｐｍ）。水相および有機相を別個に収集した。ＳＤＦ活性は有機相から回収され、一方、ＣＰ分画は水相中に存在した。メタノール、アセトニトリルまたはクロロホルムも溶媒として使用できる。

ＳＤＦの精製
ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー：Ｃ−１８カラム（Vydac 2.1×280mm）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ分離操作によるＳＤＦの精製
最初の精製工程においては、ｐＨ２．５の溶出緩衝液を採用した。緩衝液Ａ−Ｈ_２Ｏ中 ０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。ＳＤＦ分画は約０〜２％アセトニトリルにより５〜６分後に溶出し（図３）、これは空隙容量に相当した。

第二の精製工程では、ｐＨ７．０に調整した水中１％トリエチルアミンから構成される緩衝液Ａおよびアセトニトリルからなる緩衝液Ｂを使用した。ＳＤＦ分画は１１〜１２分後に約９〜１１％アセトニトリルで溶出した（図４）。

第二のＲＰ−ＨＰＬＣ分離工程から１１．２６分に溶出した分画（図４）をプールし、最初のＲＰ−ＨＰＬＣ分離工程と同じ条件で再クロマトグラフィーに付すと単一の対称的なピークのみが５〜６分後に得られた。この再クロマトグラフィー工程の目的は第二の分離後に得られた分画が単一の均一なピークであることを示すことである（図５）。

実施例２−ＳＤＦの特性
ＵＶスペクトル
Ｃ−１８カラムから溶出した活性ピークの紫外線吸収スペクトル（図４〜５）は２８０ｎｍにおける吸収によって指示されるように（図６）、芳香族化合物の存在が有力であることを示唆している。この分画をさらにアミノ酸分析および配列決定に付したが、その結果はいずれも否定的であった。したがってＳＤＦは、この工程までペプチドとの関連で精製されたが、活性な化合物はペプチドではないと考えられる。

質量スペクトル
活性分画の質量スペクトル（電子スプレー）分析（図７）からは、分子量３１６（３１７−１）を有する単一化合物の存在が指示される。コーン電圧３０Ｖ、４５Ｖおよび６０Ｖにおける分子の断片化を図８（ａ〜ｃ）に示す。１５９分子量の質量フラグメントはその化合物の半分の質量を表すものと思われる。このような半質量フラグメントは二重荷電分子（Ｍ／２ｅ）の特徴である。さらに、二重荷電イオンは高度に不飽和な化合物（たとえば芳香族またはＮ−含有芳香族化合物）のスペクトルに主として認められる。

質量およびＵＶスペクトル、ならびに様々なｐＨでのＲＰ−ＨＰＬＣにおけるＳＤＦの挙動は、活性物質が、芳香族の荷電した物質組成物であることを示唆するものである。

実施例３−生物学的実験操作
連続細胞系
細胞系にはヒト骨髄単球細胞ＨＬ−６０、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性ヒト骨髄単球細胞ＬＫ（本発明者らの実験室で樹立）、ならびにマウス単球細胞系ＷＥＨＩが包含された。細胞系は、１０〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Bio Labs Jerusalem, Israel）補充α最小必須培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地（GIBCO,Grand Island, NY）中３〜４日毎に２．５×１０^５細胞／ｍｌで継代培養することによって維持された。培養液は空気中５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下３７℃でインキュベートした。生存細胞の濃度はトリパンブルー排除法によって決定した。総細胞数はＣｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて計数した。

細胞増殖アッセイ
ＨＬ−６０または他の細胞は、培地中に０．５％熱不活性化ＦＣＳならびに様々な希釈度の試験分画を含有する２４−ウエルディッシュにおいて、１．３×１０^５／ｍｌで培養した。ＤＮＡ合成は日４の収穫の１２時間前に添加した^３［Ｈ］−チミジン（１ｍｃｉ／１５０μｌ）（5mCi/mmol,ICN Radiochemicals,Irvine,CA）の取り込みによって測定した。１単位のＳＤＦは^３［Ｈ］−チミジンの取り込みの５０％低下に要求される１ｍｌあたりの量と定義した。

細胞分化アッセイ
形態学：Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（Shandon,Cheshire,UK）調製スライドを、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａで染色した。少なくとも１００個の細胞について計数してマクロファージ様細胞の百分率を決定した。

貪食能試験
ポリスチレンラテックス粒子（直径３．２μ）（Sigma,St.Louis,MO）をアッセイの日３に次のように添加された。ヒト血清を食塩水で１：１に希釈し、０．４５μのフィルターを通してろ過した（不溶性の粒子の除去のため）。ついで希釈血清１ｍｌあたり５×１０^７個のビーズを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。この懸濁液を０．１ｍｌ／ｍｌ培養液で添加した。２４時間インキュベートしたのち、細胞を収集し、培地で２回洗浄し（遊離ラテックス粒子を除去するため）、倒立顕微鏡下に少なくとも２００個の細胞を評価することによって、貪食細胞の百分率を決定した。自動的貪食能試験は記述したような培養液に蛍光２μラテックス粒子（Polyscience,Warrington, PA）を添加して実施した。２４時間インキュベートしたのちに、サンプルを直接、Fluorescence Activated Cell Sorter（FACSTARPlus, Becton-Dickinson）中で分析した。

一次白血病細胞
細胞は、 The Hadassah Medical Center,Ein Karem,IsraeruのHematology Department に入院中の患者から得られた。末梢血（ＰＢ）および骨髄（ＢＭ）細胞を、防腐剤を含まないヘパリン中に収集した。単核球に富む分画をＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（Pharmacia, Milan, Italy）密度勾配遠心分離により調製し、洗浄し、液体窒素中で凍結させた。各実験の前に細胞を解凍し、２０％ＦＣＳおよび膀胱癌細胞培養液からの１０％条件培地を補充したα培地（５６３７−ＣＭ）中１×１０^６細胞／ｍｌで培養した。

白血病細胞のクローニング
１０％ＦＣＳ補充α培地中に、０．８３％のメチルセルロース（Fisher Scientific Company, Fair Lawn, NJ）または０．３％Ｂａｃｔｏアガール（Difco Laboratories, Detroit, MI）を添加した半固体培地に３００〜１０００細胞／ｍｌを接種した。日８に倒立顕微鏡でコロニー数を評価した。細胞の成熟を決定するためには、単一のコロニーを微細毛細管で採取し、ガラススライドに塗沫標本として染色した。

正常前駆細胞のクローニング
直接クローニング：正常ボランティアから得られた末梢骨単核球細胞もしくはＢＭ細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの勾配上における遠心分離によって単離し、メチルセルロース含有α培地中でクローン化した。骨髄系コロニーについては、５６３７−ＣＭの形態での３０％ＦＣＳおよびＣＳＦもしくは１００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３（Genetic Institute,Cambridge,MA）、１％脱イオンＢＳＡ、１×１０^−５Ｍ ２−メルカプトエタノールおよび１．５ｍＭグルタミンを添加した。赤血球系コロニーについては、培養液に３０％ＦＣＳ、１％脱イオンＢＳＡ、１．５ｍＭグルタミン、２−メルカプトエタノール、および０．５〜２Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（r-HuEPO、Cilag AG International,Zug Switzerland）を加えた。２×１０^５ＢＭまたは５×１０^５ＰＢ細胞を含む混合物１ｍｌを３５ｍｍの非組織培養皿（Falcon,Oxnared,CA）中に分散した。すべての半固体培養液を密閉インキュベーター中６％Ｏ_２、７％ＣＯ_２および８７％Ｎ_２の加湿雰囲気において、３７℃で３０分間インキュベートした。コロニーを倒立顕微鏡を用いて評価した。コロニーの細胞組成は、個々のコロニーを採取し、ガラススライド上塗沫標本に調製し、最初にベンチジン、ついでＧｉｅｍｓａで染色した。

間接クローニング：細胞を、直接クローニングについて上述したように調製して、最初は指示した成長因子または試験分画を補充したまたは補充していない液体培養液中で数日間インキュベートし、ついで洗浄し、上述のように半固体培養液中でクローン化した。

実施例４−様々な細胞培養液に対するＳＤＦまたはそのＣＰとの複合体の作用
正常造血細胞に対する作用
正常造血前駆細胞の増殖−初期および後期正常造血前駆細胞に対するＳＤＦの作用を試験するために、２相培養操作を採用した。
相１（増殖相）−低密度ＢＭまたはＰＢ細胞を、ＳＤＦを補充した液体培地中で数日間インキュベートした。
相２（クローニング相）−相１の終了の時点で細胞を収穫し、洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、またはＧＭ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１および他のサイトカインを含むがＥｐｏを含まない５６３７−ＣＭのような組換えヒト後期増殖／分化因子を補充した半固体培地もしくは液体培地中で再培養した。ＢＭまたはＰＢ細胞を相１で数日間、単独の因子としてのＳＤＦとともにインキュベートし、ついで、ＳＤＦを含まない半固体培地中でクローン化した場合（相２）には、ＣＦＵ−Ｃ数の有意な増大が得られた（図９ＡおよびＢ）。相２におけるコロニーの系統特異的分化は存在する後期因子、たとえばＣＦＵ−ＥについてはＥｐｏ、ＣＦＵ−ＧＭについてはＧＭ−ＣＳＦに依存した。相１（増殖相）を省略し、細胞を半固体培地中で直接クローン化した場合には、ＳＤＦのみではコロニーの発生を支持しなかった。相２に後期因子を添加した場合には、ＳＤＦはわずかな刺激作用しか、または全く刺激作用は示さなかった（データは示していない）。

他の初期因子たとえばＳＣＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６と同様に、ＳＤＦは主としてプレＣＦＵ−Ｃの増殖相に活性であり、それ単独ではＣＦＵ−Ｃの増殖および分化を支持することはできない。それは多分、ＣＤ３４^＋細胞の増殖の直接刺激または補細胞の活性化によってプレＣＦＵ−Ｃの増殖を刺激するものと思われる。さらにＣＦＵ−Ｃの増殖および分化は後期増殖／分化因子の存在に依存する。

正常ＣＤ３４^＋細胞の増殖−末梢血単核球細胞を、ＳＤＦの存在下サイトカインは添加しないで、血清含有液体培地中で培養した。培養の開始時およびその後の様々な日にＣＤ３４^＋細胞をフローサイトメトリーによって計数した。結果は、培養１週後にＣＤ３４^＋の平均１０倍の増加を示している（図１０）。

正常樹状突起細胞の増殖−図１１から明らかなように、ＳＤＦはＰＢ ＣＦＵ−樹状突起細胞の委任／増殖を誘導する。相１にＳＤＦを用いると、相２で８０％までの樹状突起細胞のコロニーが非濃縮ＰＢ単核球細胞から得られた（図１１）。

赤血球形成不全患者からの造血前駆細胞の刺激−赤血球形成不全患者からの赤血球系前駆細胞はインビボおよびインビトロのいずれでも発生しない。しかしながら相１においてＳＤＦで処置した場合には、冒された小児からのＰＢサンプルは相２において多数の赤い（ヘモグロビン含有）コロニーを発生した（図１２）。

白血病細胞に対する作用
急性骨髄系白血病−ＳＤＦはきわめて低濃度で、様々な骨髄系白血病の樹立された細胞系、たとえばＨＬ−６０プロ骨髄系白血病細胞（表２）、ＷＥＨＩ単芽球様細胞（表３）、ＬＫ、本発明者らの実験室で樹立されたＧＭ−ＣＳＦ依存性骨髄系白血病細胞系（表４）、ならびに様々な形態の骨髄系白血病を有する患者から新たに外植された細胞（表５および６）に活性を示すことが見出された。これらのＳＤＦ補充培養においては、白血病細胞集団は完全に成熟したマクロファージへの分化を受けた。細胞はそれらの形状を典型的なマクロファージの形態に変え（表２）、たとえば半固体アガール培地中における移動性（「堅固」から「分散」へのコロニーの形態の変化によりアッセイ；表３）、異種粒子の貪食能（表２および６）および「非特異的」エラスターゼ（ＮＳＥ）活性の産生能（表６）のようなマクロファージの機能を獲得した。

^＊ＨＬ−６０は０．５％熱不活性化ＦＣＳを補充した培地中１．３×１０^５細胞／ｍｌで培養した。貪食、細胞の形態およびＤＮＡ合成を日４に決定した。結果の形態の評点は、以下のように指示する：（＋＋＋＋）はマクロファージ様細胞８０〜１００％、（＋＋＋）は６０〜８０％、（＋＋）は４０〜６０％、（＋）は１５〜４０％、（±）は５〜１５％マクロファージ様細胞を表す。コロニーについてはα−ＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび ０．３％Ｂａｃｔｏアガールならびに数種の希釈度のＳＤＦ中１ｍｌあたり６００個のコロニーをクローン化した。

比較のために、同じ細胞系に対する他の成長および増殖因子の作用を調べた。以下の表に示すように、ＳＤＦはコロニーの形成を顕著に阻害した。

^＊ＨＬ−６０（６００細胞／ｍｌ）およびＷＥＨＩ（６００細胞／ｍｌ）は表２に記載したのと同様にしてクローン化した。１０％ＦＣＳおよび０．３％ Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏアガールを様々な希釈度のＳＤＦ、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦおよびレチノイン酸とともにプレーティングした。コロニーはそれらの形態により、堅固（未分化）、部分分散（部分的に分化）および分散（完全に分化）に分類した。コロニー数は８日後に測定し、２回の独立した実験における結果の平均として示す。

^＊ＬＫ細胞（ＧＭ−ＣＳＦ依存性骨髄系白血病細胞系は、α−ＭＥＭおよび１０％ＦＣＳ中５×１０^４細胞／ｍｌにて培養した。培養液には、ＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）を補充しまたは補充せず、様々な濃度のＳＤＦを加えた。ＤＮＡ合成は日４に、^３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定した。結果はＣＰＭ／ｍｌ培養液および増殖阻害％で表す。
以上から、ＳＤＦはＧＭ−ＣＳＦの不存在下にも骨髄系白血病細胞の増殖を阻害できることが明らかである。

一次混合ＡＭＬ−ＡＬＬ細胞は、指示したように１×１０^６細胞／ｍｌにおいて培養した。細胞は培養６日に分析した。
４種の実験（Ａ）〜（Ｄ）において、非特異的エステラーゼおよび貪食細胞は６日目に測定した。

ＳＤＦに暴露されると、最終的な細胞分化の結果として、白血病細胞は、チミジンの取り込みおよび半固体培地中でのクローニングによって測定し、それらの増殖および自己再生能力を失った（表２および図１３）。

３〜４日後に完全な成熟が起こったが、ＳＤＦへの暴露は自己再生能の喪失を含め最終的な細胞分化の不可逆的委任の誘導に１日で十分であった（表６）。

^＊ＨＬ−６０胞をＳＤＦ（１：２００希釈）とインキュベートした。１，２または３日後、細胞を洗浄し、１×１０^３の生存細胞を半固体培養液にプレーティングした。残った細胞は懸濁液中に再外植した。コロニー数は日７に測定した。貪食能は６日目に測定した。

ＨＬ−６０のような白血病細胞は正常なＢＭ細胞の発生を阻害する。しかしながら、ＨＬ−６０細胞をＳＤＦで２４時間処置すると、それらが正常な造血系の発生を阻害する能力は失なわれた。

^＊生存ＨＬ−６０細胞（１×１０^５）をＳＤＦ（１：２００希釈）とともにまたはＳＤＦをくわえないで２４時間インキュベートし、ついで基底の正常ＢＭ細胞としてアガール中でプレーティングした。ＢＭコロニーの数は日１２に測定した。

慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
慢性骨髄性白血病患者（ＣＭＬ）に由来する細胞の増殖能力に対するＳＤＦの作用も本発明者らによって検討された（表７）。ＳＤＦは、本明細書に前述したように、半固体培養液を用いた直接クローニング操作および間接クローニング操作においてＣＭＬコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｃ）とともに培養した。これらの細胞はそれらの分化能を維持していたが、異常な増殖パターンを示した。したがって、ＳＤＦはこれらの前駆細胞が増殖しコロニーを発生する潜在能力を阻害できると結論された。ＣＭＬ細胞を液体培養液中で生育させた場合には、ＳＤＦは明らかな毒性を示さなかった。これらの培養液は主として成熟の様々な段階における骨髄系前駆細胞を含有した。

これらの結果は、ＳＤＦが、初期（プレＣＦＵ−Ｃ）ＣＭＬ前駆細胞を阻害する（それらの増殖の直接阻害によりまたは迅速な分化の誘導により間接的に）がさらに成熟した細胞には有害な作用は示さないことが示唆される。

^＊対照に比べて小さいコロニー。コロニー数は日１４に測定し、結果は対照と比較した阻害の％によって表す。

上述のように、ＣＭＬコロニー形成細胞に対するＳＤＦの作用は直接および間接コロニーアッセイにより測定した。直接クローニングでは、０．５×１０^６細胞／ｍｌを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥｐｏを補充した半固体培地中、指示した希釈度のＳＤＦの存在下または不存在下に培養した。間接クローニングでは、０．５×１０^６細胞／ｍｌを最初に指示した希釈度のＳＤＦを含有する半固体培地中で培養した。３日後、非接着細胞を回収し、洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥｐｏのみを補充した半固体培地中でＣＦＵ−Ｃについてアッセイした。

正常造血前駆細胞に対するＳＤＦの作用
様々な成長因子、たとえばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦは最近、骨髄移植に使用されている。それらは、骨髄系前駆細胞の刺激により移植（および化学療法）後の好中球の回復を短縮することが示されている。しかしながら、骨髄系白血病細胞はこれらの因子に対する受容体をもっているので、残りの悪性細胞の増殖も刺激される。以下の事実、すなわち、ＳＤＦはそれ自体でまたはＧＭ−ＣＳＦとの組合せで正常前駆細胞の増殖を強化するが、骨髄系白血病細胞の「自発性」およびＧＭ−ＣＳＦ刺激増殖を阻害すること、したがって二重の作用：白血病細胞の撲滅作用と同時に正常細胞の刺激作用をもつことが明らかにされている。

実施例５
血管新生に対するＳＤＦの作用
本発明者らはまた、高度に純粋な血漿由来のＳＤＦがインビトロにおいて内皮細胞の増殖に対して強力な阻害活性を含むことも見出した（表８）。

^＊ウシ大動脈由来の内皮細胞を２４−ウエルクラスター皿中、ウエルあたり１ｍｌのアリコート（５０００細胞／ｍｌ）で接種した。培養培地には１０％熱不活性化ウマ血清を補充した。５時間後、４０μｌの緩衝液または様々な濃度のＳＤＦ含有分画を補充した緩衝液を各ウエルに添加した。４日間インキュベートしたのち、培養液を２０時間^３Ｈ−チミジンでパルス標識したのち収穫した。結果は１分間のカウント数（ＣＰＭ）で表す。

実施例６
造血前駆細胞に対するＰＱＱの作用
本発明者らは、ＰＱＱおよび関連化合物が骨髄性白血病細胞において分化を誘導し、初期造血前駆細胞の成長を刺激することを見出した。上述の結果は表１０に例示する。

さらに正常造血前駆細胞に対するＰＱＱの作用を間接クローニング系で調べた（表１１）。

血漿からのＳＤＦ−ＣＰ複合体の親和性精製 血漿を３０〜６０％の硫酸アンモニウムで沈殿させたのちに得られた分画を１０ｍＭｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、伝導率−５ｍｓ中に平衡化し、テンタクル−アガロースゲル（同一の緩衝液で平衡化した床容量２００ｍｌ）上で分離した。ｔｒｉｓ緩衝液中０．１，０．２，０．３，０．５，１．０Ｍ ＮａＣｌによって段階的な溶出を行い、溶出液をその活性について分析した。ＳＤＦ活性は０．５Ｍ ＮａＣｌにより溶出することが見出された（ピーク６）。 ＳＤＦのそのＣＰとの高ＭＷ複合体からの、ＲＰ−ＨＰＬＣ“Ｒｅｓｏｕｒｃｅ”カラム上における分離 分画をその複合体から分離し時間（Ｔ（分））の関数としての２２０ｎｍにおける吸収（Ａ_２２０）により記述する。緩衝液Ａ−Ｈ_２Ｏ（ｐＨ２．５）中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。勾配は溶出緩衝液中のアセトニトリル百分率（ＡＣＮ（％））として指示する。流速−１４０ｍｌ／分。ＳＤＦ分画は空隙に相当する位置に５〜６分後に溶出する（ａ）。 ｐＨ２．５における共溶出夾雑物からのＳＤＦのＲＰ−ＨＰＬＣ分離 図１のｒｅｓｏｕｒｃｅ分離に由来する活性分画を、さらにＣ１８（Vydac 2.1×280）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで分離し時間（Ｔ（分））の関数としての２２０ｎｍにおける吸収（Ａ_２２０）により記述する。緩衝液Ａ−Ｈ_２Ｏ（ｐＨ２．５）中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。勾配は溶出緩衝液中のアセトニトリルの百分率（ＡＣＮ（％））の関数として表す。流速−１４０ｍｌ／分。ＳＤＦ活性は５〜６分後に溶出した。 ｐＨ７における共溶出夾雑物からのＳＤＦのＲＰ−ＨＰＬＣ分離 ５〜６分時の‘Ｒｅｓｏｕｒｃｅ’由来分画を、さらに、Ｃ１８（Vydac 2.1×280）ＲＰ−ＨＰＬＣによりｐＨ７で分離し時間（Ｔ（分））の関数としての吸収（Ａ_２２０）により記述する。緩衝液Ａ−Ｈ_２Ｏ中０．１％トリエチルアミンをＴＦＡでｐＨ７．０に調整、緩衝液Ｂ−アセトニトリル。流速−１４０ｍｌ／分。勾配は溶出緩衝液中におけるアセトニトリルの百分率（ＡＣＮ（％））として例示する。活性は１１．２６分に単一の対称ピークに相当する位置に回収された。 ＲＰ−ＨＰＬＣ上でのＳＤＦの精製 ＲＰ−ＨＰＬＣ上ｐＨ７での分離からプールした活性分画を、Ｃ１８上ｐＨ２．５で再クロマトグラフィーに付し、時間（Ｔ（分））の関数としての吸収（Ａ_２２０）によって図中に記述する。勾配は溶出緩衝液中におけるアセトニトリルの百分率（ＡＣＮ（％））として指示する。活性は６．７３分に溶出した単一のピークから回収された。 精製されたＳＤＦのＵＶスペクトル 以下の実施例に記載するようにして得られた精製ＳＤＦをＵＶスペクトルによって分析した。図には波長（Ｗ）ｎｍの関数として吸収（Ａ）を例示する。 ＳＤＦの質量スペクトル 以下の実施例に記載するようにして得られた精製ＳＤＦを質量スペクトル（電子スプレー）によって分析した。 ３１６ＭＷ分画の質量スペクトルによる断片化および分析 コーン（ｃｏｎｅ）電圧−３０Ｖにおける断片化 ３１６ＭＷ分画の質量スペクトルによる断片化および分析 コーン電圧−４５Ｖにおける断片化 ３１６ＭＷ分画の質量スペクトルによる断片化および分析 コーン電圧−６０Ｖにおける断片化 骨髄系および赤血球系コロニーの成長に対するＳＤＦの作用 低密度末梢血（ＰＢ）細胞を、補填物なし（Ｃ、対照）、５６３７ＣＭ（１０％ｖ／ｖ，（ＣＭ））、ＳＤＦおよびＳＤＦ−ＣＰ複合体（ＳＤＦ−ＣＰ）を様々な希釈度で補充した液体培養液中で培養した（実施例に記載の相Ｉ）。５日後に細胞を収穫し、洗浄し、Ｅｐｏを補充した半固体培地中でクローン化した。コロニーをプレートあたりの赤血球系コロニーの数（ｅ．ｃ／ｐ数）により図中に例示されたように日１４に評価した。 骨髄系および赤血球系コロニーの成長に対するＳＤＦの作用 低密度ＰＢ細胞を、５６３７ＣＭ（１０％ｖ／ｖ，（ＣＭ））、またはＳＤＦ（１：２００、（ＳＤＦ））を補充した液体培養液中で培養した（相Ｉ）。５日後に、細胞を収穫し、洗浄し、骨髄系コロニーについては５６３７ＣＭ、赤血球系コロニーについてはＥｐｏを補充した半固体培地中でクローン化した。コロニーを赤血球系（ｅ）および骨髄系（ｍ）細胞の両者について、日１４に評価し、プレートあたりのコロニーの数（Ｃ／Ｐ数）により図中に例示する。 ＣＤ３４^＋細胞に対するＳＤＦの作用 低密度ＰＢ細胞を、５６３７ＣＭ（１０％ｖ／ｖ，（ＣＭ））、幹細胞因子（ＳＣＦ）またはＳＤＦ（ＳＤＦ）を補充した液体培養液中で培養した（相Ｉ）。ＣＤ３４^＋細胞はフローサイトメトリーにより計数した（ＣＤ３４^＋（％））。培養の開始時におけるＣＤ３４^＋細胞の百分率（ＣＤ３４^＋（％））は０．１〜０．５％の範囲であった。３回の独立した実験を示す（実験１〜実験３）。ＣＤ３４^＋細胞の百分率は実験（１）では日６に、実験（２）では日３に、実験（３）では日７に測定した。 樹状突起コロニーの成長に対するＳＤＦの作用 低密度ＰＢ細胞を、５６３７ＣＭ（１０％ｖ／ｖ，（ＣＭ））、ＳＤＦまたはＳＤＦ＋５６３７ＣＭ（ＳＤＦ＋ＣＭ）を補充した液体培養液中で培養した（相Ｉ）。３〜４日後に細胞を収穫して、洗浄し、半固体培地中でクローン化した。樹状突起コロニー（Ｄ．Ｃ％）を日１４に評価した。 赤芽球形成不全に由来する赤血球系前駆細胞に対するＳＤＦの作用 赤芽球形成不全患者に由来する低密度ＰＢ細胞を、５６３７ＣＭ（１０％ｖ／ｖ，（ＣＭ））または表中に指示した様々なＳＤＦの希釈度のＳＤＦ＋５６３７ＣＭ（ＳＤＦ＋ＣＭ）を補充した液体培養液中で培養した（相Ｉ）。４日後に細胞を収穫し、洗浄し、Ｅｐｏを補充した半固体培地中でクローン化した。コロニーを日１４に評価し、プレートあたりの赤血球系コロニーの数（ｅ．ｃ／ｐ数）を表中に記述する。 白血病および正常前駆細胞によるコロニー形成に対するＳＤＦの作用 白血病ＨＬ−６０細胞（ＨＬ−６０）および正常ＢＭ（ＮＢＭ）前駆細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）および数種の希釈度のＳＤＦ（ＳＤＦ（Ｄｉｌ．））によって刺激したアガロース培養液中でクローン化した。コロニーは日１０に評価した。結果はＨＬ−６０細胞について実施した２セットの実験（実験１および実験２）についてＳＤＦ希釈度の関数としてのコロニー数により例示する。

Claims (22)

1. 電子スプレー質量スペクトルによって測定して分子量３１６を有する生物学的に活性な血清由来因子を血漿から分離および精製する方法であって、
   （ａ） 血漿から血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンを含む分画を分離し、
   （ｂ） 当該血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンから血清由来因子を分離し、および
   （ｃ） 工程（ｂ）で得られた血清由来因子を精製し、それによって、電子スプレー質量スペクトルによって測定して分子量３１６を有する精製された生物学的に活性な血清由来因子を取得する、
   ことを含む上記方法。
2. 血漿はヒト血漿である請求項１記載の方法。
3. 工程（ｂ）の血清由来の分画の分離が、
   ｉ） 血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンを酸性溶媒で処理して有機相を回収し、または
   ｉｉ） 血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンをＲＰ−ＨＰＬＣリソース（resource）カラムに通して、アセトニトリルで分画を溶出し、
   それによって血清由来因子を有機相中に分離する、
   ことによって達成される請求項１記載の方法。
4. 工程（ｂ）ｉｉ）の分画の溶出が、水中０．０５〜０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリルを含む溶出緩衝液Ｂにより、アセトニトリル濃度０〜２％で溶出される第一の分画およびアセトニトリル濃度１３〜１７％で溶出される第二の分画である２つの分画を収集して１つに合せることによって達成される請求項１記載の方法。
5. 工程（ａ）の血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンを分離する工程が、
   ｉ） 血漿を親和性（affinity）カラムに通して、血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンを含む電気泳動的に均一な（homogeneous）分画を回収する、または
   ｉｉ） 血漿蛋白質を硫酸アンモニウムで沈殿させ、当該血漿蛋白質を溶解し、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムに通して生物学的に活性な分画を回収し、当該生物学的に活性な分画を有機溶媒で処理して第二の生物学的に活性な分画を回収し、当該第二の生物学的に活性な分画を染料（dye）−リガンドカラムに通して第三の生物学的に活性な分画を回収し、当該第三の生物学的に活性な分画を疎水性カラムに通して、硫酸アンモニウムで第四の生物学的に活性な分画を溶出して血清由来因子と複合体を形成したセルロプラスミンを与える、
   ことによって達成される請求項１記載の方法。
6. 親和性カラムは、アガロースゲルとクロロエチルアミンとの反応を用いて誘導したテンタクル−アガロースゲルである請求項５記載の方法。
7. 陰イオン交換クロマトグラフィーによって工程ｉ）の生物学的に活性な分画を濃縮する工程をさらに含む請求項５記載の方法。
8. 陰イオン交換クロマトグラフィーが、電気泳動的に均一な分画をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランゲルカラムまたは四級アミノエチル（ＱＡＥ）−デキストランゲルカラムに通して、セルロプラスミンと複合体を形成した血清由来因子の生物学的に活性な分画を有する分画を選択することによって達成される請求項７記載の方法。
9. 酸性化した溶媒が、酸性化ブタノール、酸性化メタノール、酸性化アセトニトリルおよび酸性化クロロホルムからなる群から選択され、溶媒相中の複合体非形成の生物学的に活性な血清由来の分画を確認する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
10. 工程（ｃ）のクロマトグラフィーが、Ｃ−１８カラムを用いて、この場合、
    第一の分離工程では、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２．５）を含む溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡを含む溶出緩衝液Ｂを用いて、アセトニトリル濃度０〜２％で溶出される分画を収集し、および
    第二の分離工程では、ｐＨ７に調整した水中０．１％トリエチルアミンを含む溶出緩衝液Ａおよびアセトニトリルを含む溶出緩衝液Ｂを用いて、アセトニトリル濃度９〜１１％で溶出される分画を収集する、
    ことによって達成される請求項１記載の方法。
11. 請求項１記載の方法によって取得される生物学的に活性な血清由来因子であって、電子スプレー質量スペクトルによって測定して分子量３１６を有し、酸性のｐＨで電気的に荷電し、２８０ｎｍに吸収をもつ上記血清由来因子。
12. 白血病細胞の最終的な細胞分化を誘導できる請求項１１記載の血清由来因子。
13. 白血病細胞はそれらの増殖能およびそれらの自己再生能を失う請求項１２記載の血清由来因子。
14. 白血病細胞の増殖能および自己再生能の喪失を誘導できる請求項１１記載の血清由来因子。
15. 初期正常前駆細胞の増殖を刺激できる請求項１１記載の血清由来因子。
16. 亢進した血管新生を阻害できる請求項１１記載の血清由来因子。
17. 正常幹細胞および前駆細胞をエキソビボ（ex vivo）増殖させることができる請求項１１記載の血清由来因子。
18. 活性成分として請求項１１記載の血清由来因子および所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含む、亢進した血管新生を阻害するための医薬組成物。
19. 活性成分として請求項１１記載の血清由来因子および所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含む、腫瘍の寛解を誘導するための医薬組成物。
20. 活性成分として請求項１１記載の血清由来因子および所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含む、腫瘍の寛解状態を維持するための医薬組成物。
21. 活性成分として請求項１１記載の血清由来因子および所望によりさらに医薬的に許容される添加物を含む、造血正常幹細胞および前駆細胞骨髄移植体を増殖するための医薬組成物。
22. 造血正常幹細胞および前駆細胞骨髄移植体を増殖するための医薬組成物の製造における請求項１２記載の血清由来因子の使用。
    

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