TWI272107B - A composition for gene therapy by gene transfer in vivo - Google Patents

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k 1272107 A7 B7 五、發明説明（2 ) 及將轉形有基因之造血幹細胞送回活體之方法，則在基因 治療的面上，相對地操作上極為繁雜。 又，最近為配合轉形細胞之多樣化，有關標的細胞專一 性地轉形方法之需求，亦日益增加。 非病毒載體，例如使用有聚離胺酸等作為保持核酸之載 體，係嘗試將具有細胞專一親和性之配位體附加於標的細 胞上，以增加其方向性，但此方法並無法安定地將轉形之 基因保持於細胞中。又，在病毒載體，習知係將病毒外膜 與對於標的細胞具親和性之配位體，作為融合蛋白並使其 表現。然而，這許多的嘗試由於外膜本來的感染功能，或 者配位體本來的結合功能，單獨地或同時地在融合表現上 有損害之故，使得目的之尋標（targeting)未能達成。又， 為使上述融合蛋白表現之故，就必須要構築極繁雜之封裝 細胞，而且也需要針對各種標的細胞來進行。進一步，可 獲得高滴定病毒載體液之封裝細胞株的建立、確認獲得複 製能力之逆轉錄病毒（Replication Competent Retrovirus， RCR)沒有出現之作業過程，亦須費時龐大之實驗準備時 間。 如上所述，為使標的基因以高效率、且專一轉形標的細 胞中，現在之技術仍存在有種種之問題，亟待吾人解決。 發明之目的 本發明之主要目的係提供一種用於活體内轉形之基因治 療上極為有用之治療劑，並藉由使用該治療劑，於活體内 標的細胞上以專一轉形所提供之簡單的基因治療方法。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 五 發明説明（3 發明之概要 :概略敘述本發明，本發明之第!個發明係一種 古基^台療具有敏感性疾病的基因治療劑，其特徵為含 係Si〈功此性物質作為有效成分，其中，該功能性物質 梨：有基因治療上有用基因的病毒具有親和性、以及 、、必肩基因導入之標的細胞上為專一親和性之功能性。 本發明之第1個發明的治療劑，其只要含有在基因治療 么上有用基因之有效量的病毒即可，例如該病毒與上述的功 月匕性物質混合之狀態、或者使用時再混合之狀態即可。 本發明之第1個發明的治療劑中，其關於對於功能性物 質 < 病毒具有親和性之功能性並無特別限制，例如抗病毒 杬體、纖維連結蛋白的肝素結合領域、纖維芽細胞增 殖因子、膠原蛋白、聚離胺酸或與其功能上相同物質中所 選擇之功能性物質所衍生的功能性。 又，本發明之第1個發明的治療劑中，其關於功能性物 質之具有在標的細胞上為專一親和性之功能性並無特別限 制，例如標的細胞的親和性蛋白質、激素、細胞.活素、抗 才ΪΚ的細胞抗體、糖鏈、碳水化合物以及細胞中所選擇之功 能性物質所衍生的功能性。 本發明之弟2個發明之治療劑係一種用於治療對於基因 治療具有敏感性疾病的基因治療劑，其特徵為含有有效量 之對於基因治療上有用基因的病毒為親和性之功能性物 質’以及含有有效量之對於必須基因導入之標的細胞具有 專一親和性之他種功能性物質作為有效成分。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1272107 、發明説明（ 本發明之第2個發明之治療劑，可以包括有效量之含有 對於基因治療上有用基因的病毒，例如，將該病毒與對於 病毒具有親和性之功能性物質混合之狀態，或者是包含使 用時再混合之狀態亦可。 本發明之第2個發明之治療劑中，其關於對於病毒具有 親和性之功能性物質並無特別限制，例如抗病毒抗體、纖 維連結蛋白的肝素_Π結合領域、纖維芽細胞增殖因子、 '7原a白名離胺酸或與其功能上相同物質中所選擇之功 能性物質。 又本發明〈第2個發明的治療劑中，其關於具有在標 二細胞上為專一親和性之功能性物質並無特別限制，例如 = 細胞的親和性蛋白質、激素、細胞活素、抗標的細胞 = '糖鏈、碳水化合物以及細胞中所選擇之功能性物 I。 本發明之第3個發明’係一種基因治療方法，立特徵為 ^於基因治療具敏感性之疾病的治療方法中，投盘有效 Π =物質作為有效成分，其中，該功能性物質係具 於必^ I因治療上有用基因的病毒為親和性、以及對 ;本:1因導入之標的細胞上具有專—親和性之功能性。 其投與方法， 或稍後再行投 量個發明之基因治療方法中，只要投與有效 !《5有基目治療上有用基㈣病毒即可 可將該病毒與本發明之治療劑同時投與 與。 、 其關於對於功 本發明之第3個發明之基因治療方法中

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有在標的細胞上為專一親和性之功能性物質並無特別限 制，例如樣的細胞的親和性蛋白質、激素、細胞活素、抗 標的細胞抗體、糖鏈、碳水化合物以及細胞中所選擇之功 能性物質。 本發明之第5個發明，係一種有效量功能性物質之使 用，其在對於基因治療具敏感性之疾病的治療用基因治療 劑的製造中，該功能性物質係具有對於含有基因治療上有 用基因的病毒為親和性、以及對於必須基因導入之標的細 胞上為專一親和性之功能性。 本發明之第6個發明，係在對於基因治療具敏感性之疾 病的治療用基因治療劑的製造巾，一種具有對於含有基因 治療上有用基因的病毒為親和性之有效量功能性物質之使 用，以及對於必須基因導入之標的細胞具有專一親和性之 他種有效量功能性物質之使用。 在本發明之第1或第2個發明的治療劑，第3或第4個發 明的基因治療方法，或第5或第6個發明的使用中，對於 基因導入之標的細胞並無特別之限制，該標的細胞例如有 造血幹細胞、血液細胞、白血球、淋巴球、τ細胞、癌浸 潤淋巴球、B細胞或癌細胞等。 …反 在本發明 < 第1或第2個發明的治療劑，第3或第*個發 明的基因治療方法，或第5或第6個發明的使用中，對於 基因導入標的細胞之基因，只要是符合基因治療之目的所 使用之基因即可並無特別之限制，由導人之基因所編碼之 蛋白質，只要是該基因於細胞中表現時以治療上充足量 -9-

1272107 A7 B7 五、發明説明（7 ) 所表現之治療用蛋白質即可，該蛋白質例如有活體内酵素 或細胞活素。 在本發明之第1或第2個發明的治療劑，第3或第4個發 明的基因治療方法，或第5或第6個發明的使用中，所使 用之病毒，只要是臨床上治療方法所使用之病毒即可並無 特別之限制，可使用經安全性確認之病毒載體。該病毒載 體例如有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺隨伴病毒載體 或瓦克西尼爾病毒載體等。只要由對於標的細胞之感染 性，以及轉形效率來選擇即可。 本發明質者們，藉由利用對於標的細胞具有親和性之功 能性，以及對於病毒具有親和性之功能性，可自由地選擇 在活體内進行基因導入之標的細胞，可有效率地進行利用 病毒將基因導入該標的細胞，過去以來之活體内基因導入 之尋標、亦即導彈型基因療法成為可能，從而完成了本發 明。 圖示之簡單說明 圖1 :將HL 60細胞作為搬運體使用之基因導入效率圖 發明之詳細說明 以下，玆詳細說明本發明。 在使用本發明之治療劑的導彈型基因療法中，該病毒載 體並無特別之限制，一般而言，在基因導入操作上習知的 病毒載體，例如逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺隨伴病 毒載體或瓦克西尼爾病毒載體等均可使用。本發明中，理 想者有重組逆轉錄病毒載體可以使用，特別是複製能力缺 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（8 ) 陷之重組逆轉錄病毒載體最為理想。該載體係於所感染之 細胞中無法自行複製，並因而複製能力有所欠缺，為非病 原性。這些載體可以侵入脊椎動物特別是哺乳動物之宿主 細胞，使被插入之基因治療上有用的外來基因可以安定地 重組於該染色體DNA中。 本發明中，基因導入於活體内之標的細胞中的基因，可 於適當的啟動子，例如存在於病毒載體中之啟動子以及外 來啟動子的控制下而被表現，從而使其可以插入重組逆轉 錄病毒載體内而被使用。又，為使效率較佳之基因轉錄可 達成之故，啟動子與轉錄開始部位所共同之其他調節因 子，例如加強予序列以及終端子序列亦可存在於載體之 中。進一步，藉由將載體與控制器官、腫瘤附近等部位專 一表現之啟動子、轉錄開始部位所共同之其他調節因子進 行重組，可進一步將標的細胞上基因表現之專一性提高。 所轉形之基因即使是天然地或人工地被製作的，或者起源 相異之DNA分子，都可以利用接合（ligation)等習知方式加 以結合。 插入於病毒載體中之基因，可以選擇欲導入活體内標的 細胞之任意的基因。這種基因例如有編碼成為治療對象、 且與疾病有關之酵素及蛋白質的基因以外，尚有編碼細胞 内抗體（例如，可參照W0 94/02610)、增殖因子、反意義 (antisense)核酸、核酸代酶（ribozyme)、佛爾斯引子（例 如，可參照WO 90/ 13641)等之基因。 本發明所使用之對於病毒具有親和性之功能性物質並無 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（9 ) 特別之限制，例如抗病毒抗體、纖維連結蛋白之肝素-II 結合領域、纖維芽細胞增殖因子、V型膠原蛋白、聚離胺 酸或與其功能上相同物質例如具有肝素結合性部位之功能 性物質皆可使用。或者這些功能性物質所衍生者亦可。 又，本發明中所謂之「功能性物質衍生」係指在功能性分 子中，該功能性物質亦包含有具有對於病毒為親和性之功 能性部位。又，所謂之親和性（affinity)係包含與病毒之結 合性、以及與細胞之接合性等概念。藉由本發明使用之物 質對於功能性物質之親和性，就可使病毒對於特定之細 胞、或包含該細胞之器官、組織之尋標成為可能，再藉由 於活體内對特定之細胞進行轉形，而使得基因治療成為可 能。 對於病毒具有專一親和性之抗體，其對於特定之標的細 胞專一、同時高效率地轉形則特別有用。本發明所可以使 用之抗體並無特別之限制，可以適當地選擇認識基因導入 用之病毒表面抗原的抗體而使用。這種抗體可以習知之方 法製作，但現在市面上販售之抗體頗多，其亦可以使用。 這些抗體，其若為具有對於所使用之病毒有結合能力者即 可，不論為單株抗體、或者多株抗體皆可。進一步，以習 知技術所修飾之抗體及抗體之衍生物，例如人類化抗體、 Fab片段、單鏈抗體等皆可。 又，本發明所使用之對於標的細胞具有親和性之功能性 物質亦無特別之限制，例如細胞親和性之蛋白質、荷爾蒙 及細胞活素、細胞表面抗原之抗體、多糖類、糖蛋白質、 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（10 ) 糖脂質、糖蛋白質以及糖脂質衍生之糖鏈、標的細胞之代 謝物、或者細胞等。又，即使是這些功能性物質衍生之細 胞結合部位亦可。該所謂之「功能性物質衍生」係指在功 能性分子中，該功能性物質亦包含有具有對於標的細胞為 親和性之功能性部位。又，所謂對於標的細胞之親和性係 包含與標的細胞之結合性、以及與細胞之接合性等概念。 藉由本發明使用之對於功能性物質之標的細胞的親和性， 就可使病毒對於特定之細胞、或包含該細胞之器官、組織 之尋標成為可能，再藉由於活體内對特定之細胞進行轉 形，而使得基因治療成為可能。 專一結合於標的細胞之抗體，其對於特定之標的細胞以 高效率地基因導入則特別有用。本發明所可以使用之抗標 的細胞抗體並無特別之限制，可以適當地選擇對於欲導入 基因之標的細胞所表現之抗體的抗原而使用。這種抗體可 以習知之方法製作，但現在市面上販售之抗體頗多，其亦 可以使用。這些抗體，其若為具有對於標的細胞的專一性 等性質者即可，不論為單株抗體、或者多株抗體皆可。進 一步，以習知技術所修飾之抗體及抗體之衍生物，例如人 類化抗體、Fab片段、單鏈抗體等皆可。 以CD抗原所被週知之白血球抗原，其關於各抗原在各 種細胞上之表現目前正被詳細地調查中。因此，藉由選擇 在目的之標的細胞上表現之CD抗原的認識抗體，並使用 於本發明之基因導入方法中，就可以以高度專一性將基因 導入於標的細胞中。例如，若使用抗CD 4抗體時可對幫 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐) 1272107 A7 B7

五、發明説明（b 助者T細胞，或者於使用抗CD 34抗體時則可對造血幹 胞’各自地賦予一個基因導入之方向 又’具有標的細胞親和性之功能性物質，其可使用具有 細胞接著活性之蛋白質，例如纖維連結蛋白、昆布胺酸 膠原蛋白、羥基連結蛋白等。這些功能性物質 只要對於標的細胞為具有結合活性時，則亦可為其片段。 糖蛋白質之昆布胺酸，在各種標的細胞，例如血液系之 ’、田胞上’其對於有效率地導入基因係十分有用。又，^使 用糖蛋白質之基因導入中，該糖鏈係扮演重要之角色。因 此，以習知之方法由昆布胺酸所切下來之糖鏈亦可以作為 上述功能性物質而使用。又，與昆布胺酸具有相同之高甘 露糖型之N_結合性糖鏈的糖蛋白質，以及由其所切下來 之糖鏈’甚至化學合成之該糖鏈亦可使用於本發明中。進 一步，將上述之糖鏈結合於蛋白質等物質上亦可使用，例 如，結合於對逆轉錄病毒具有親和性之功能性物質，其則 相當適於用在基因導入上。 上述之功能性物質可由天然來源之物質獲得，又，亦可 為人工製作者（例如利用重組DNA技術以及化學合成技術 所製作者），進一步，亦可藉由天然來源之物質以及人工 製作之物質組合而得者。 在本發明的方法中所使用之纖維連結蛋白以及其片段， 可參閱例如 Journal of Biochemistry 第 256 卷、第 7277 頁 (1981年）、Journal of Cell Biology 第 102卷、第 449 頁（1986 年）、Journal of Cell Biology 第 1〇5 卷、第 489 頁（1987 年）上 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（12 ) 之方法，而由天然來源之材料以實質地純粹形態進行製 作。又，根據美國專利第5，198,423號之方法，亦可利用重 組DNA技術來進行製造。特別是，含有逆轉錄病毒之結合 部位之肝素-I I領域的纖維連結蛋白片段，例如前出之CH-296(逆連結蛋白）、以及H-271、H-296、CH-271等的重組 聚胜肽、以及獲取其之方法，皆詳細記載於此專利中。這 些片段如上述公報所記載者，可由日本國茨城縣筑波市市 東1丁目1番3號之通商產業省工業技術院生命工學工業技 術研究所，以寄存編號FERM P-10721 (H_296)(原寄存曰： 平成 1年（1989年）5 月 12 曰）、FERM BP-2799 (CH-271)(原寄 存曰：平成 1 年（1989 年）5 月 12 曰）、FERM BP-2800 (CH-296)(原寄存曰：平成1年（1989年）5月12曰）以及FERM BP-2264 (CH-271)(原寄存曰：平成1年（1989年）1月30曰），由 培養獲得所寄存之大腸菌而得到。又，由這些片段所定型 地衍生之片段，其亦可將保持於上述大腸菌之質體以習知 之基因重組方法進行改變，並可以製得。 舉例來說，上述之纖維連結蛋白片段中，CH-296、CH-271係具有對於VLA5之配位體，又，CH-296、CH-296係具 有對於VLA4之配位體，其各自對於表現VLA5、VLA4之細 胞尋標皆為有用。例如，具有對於VLA4之配位體的功能 性物質則對於造血幹細胞的基因導入有用。 對於標的細胞具有親和性之功能:性物質亦可以使用細 胞。細胞中的某物質對於器官、組織或細胞係具有專一親 和性，而作為在活體内使病毒載體感染標的細胞之搬運體 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 _—___ B7 五、發明説明（13 ) 亦十分有用。在標的細胞中將細胞作為搬運體使用之基因 哥標則舉例如下。 1·將血管内皮細胞作為搬運體使用之基因導入 血管内皮細胞具有在新血管形成的部位上專一聚積之性 質。利用此性質，便可以將血管内皮細胞作為搬運體而進 行基因尋標。 癌細胞為進行複製之故，會在其附近謗導血管新生，並 籍由*亥血管攝取養分排出廢物。利用上述血管内皮細胞之 性質，將病毒載體運輸至細胞周圍之血管新生部位，便可 進行癌細胞之治療。例如，將當作治療基因的自殺基因 (HSV-TK等）導入便可以直接攻擊癌組織，此外，藉由基 因導入可以阻礙血管新生之基因，就可以阻止癌細胞的營 養攝取並使癌細胞退縮。此種癌細胞之治療，比起過去進 行之化學療法以及放射線療法而言並無副作用。又，由手 術所施加給病患之物理上負擔亦由於本發明之基因治療劑 的接種之簡單處理，亦大幅度地減輕。 又，為克服腦阻塞、心肌梗塞之血管繞道手術後、虛血 狀態，則以可促進侧副血管路徑之發達者為理想。此種情 形時，將血管内皮細胞作為搬運體，而於手術部位附近之 血管新生部位上’進行有關促進血管新生的基因導入，便 可以改善虛血狀態。 2.將發炎細胞作為搬運體使用之發炎組織之上的基因導入 過敏性發炎病症，例如氣喘病症上’發炎細胞可由血管 内腔附著於血管壁，再進一步經血管内皮細胞之間移動之 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇 x 297公爱) 1272107

後，可移至間質内並於氣管黏膜上引起發炎。這種發炎的 凊況可以利用發炎細胞聚集之性質而治療。可以作為搬 運體而使用之發炎細胞有嗜酸性球、巨噬細胞、淋巴球 等。例如，在聚集之最初步驟，即發炎細胞的血管壁接著 上’右將阻礙接著於血管内皮細胞之相關基因導入時，其 後發炎細胞之接著便被阻礙、聚集便不會發生了。 3·將造血幹細胞作為搬運體使用之骨髓微小環境中的基因 導入 造血幹細胞在骨髓微小環境中具有自動尋的（homing)性 質，利用該性質便可以進行基因尋標。當造血幹細胞與病 母載體共同在骨髓:微小環境中自動尋的時，即可在相鄰之 造血幹細胞與間質細胞等構成骨髓微小環境之細胞，及骨 髓微小環境上基因導入有用的基因。 4·將腦内皮細胞作為搬運體使用之腦腫瘤中的基因導入 在腦衍生的内皮細胞上可使病毒載體結合，而進行腦腫 瘤部位之尋標。特別是逆轉錄病毒載體在分裂中的細胞上 具有高效率感染之性質，其在未分裂之腫瘤附近的正常細 胞上並未感染’故可以專一性地將治癒基因搬運至腦腫瘤 上。 5.將具有組織再生能力之細胞作為搬運體使用之基因導入 最近已有報告指出骨髓細胞會導致血管再生，從而使利 用該事實而進行之心肌梗塞治療成為可能。藉由將骨髓細 胞注入心肌中可改善梗塞狀態之心肌血流。利用該性質， 而將重組有有用基因、例如血管新生促進基因之病毒載體 -17-

1272107 A7 B7 五、發明説明（15 ) 搬運至骨髓細胞時，由於與被導入之基因產生相乘效果的 緣故，血管再生能力就可以大幅度地提昇。又，將例如間 末性幹細胞（mesenchymal stem cells)等，具有分化為骨、 軟骨、肌腱、脂肪細胞、間質細胞等分化再生能力之骨髓 細胞中，搬運一配合目的之治療基因，即可於上述之組 織、細胞的再生促進以及部位專一性地治療上都加以利 用。 本發明所使用之功能性物質，其例如有具有對於上述病 毒為親和性之功能性物質，以及對於標的細胞為親和性之 功能性物質所構成者。舉例來說有，由對於標的細胞具有 親和性之抗標的細胞抗體，與對於病毒具有專一親和性之 抗病毒抗體所構成之功能性物質；由對於標的細胞具有專 一親和性之糖鏈，與對於病毒具有專一親和性之抗病毒抗 體所構成之功能性物質；以及由對於標的細胞具有專一親 和性之細胞，與對於病毒具有專一親和性之聚胜肽所構成 之功能性物質等。透過使用這些功能性物質，在各種細胞 所混雜之活體中，就使得針對特定之細胞的轉形成為可 能。特別是，糖鏈常被稱為細胞的櫥窗，其決定細胞的多 種性質，而細胞則透過彼此相互地多種的糖鏈，從而認識 並相互作用。因此，利用此種糖鏈之專一性，轉形之尋 標，其配合抗體之專一性結合力，就可能使活體内最高精 密度之導彈型基因療法為可能。 又，將細胞作為搬運體使用之本發明的基因治療劑，舉 例來說，將對於上述病毒載體為親和性之功能性物質，結 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（16 ) 合於對於標的細胞為專一親和性之細胞者是。將該功能性 物質結合於細胞之方法，則例如有將該功能性物質化學性 地結合於細胞之方法；以及使用對於病毒載體為親和性 與，同時對於作為搬運體使用之細胞為專一親和性之功能 性物質之方法等。 進一步，亦可將具有對於病毒載體為專一親和性與，對 於標的細胞為專一親和性之細胞作為搬運體而利用。此種 細胞，本來可以使用同時具有上述性質之原始（native)細 胞，但即便是賦予上述2種類之親和性的任一者，或是將 二者皆以人工方式賦予者的細胞亦可。有關標的細胞專一 親和性之賦予，其可藉由將針對具有標的細胞之受體的配 位體以及針對標的細胞表面抗原之抗體等，對於上述標的 細胞為專一親和性之功能性物質，於細胞表面上強制地表 現而達成。又，藉由使對於上述病毒載體為專一親和性之 功能性物質於搬運體細胞上表現，亦同樣地可赋予對於病 毒載體之親和性。 由欲接受本發明之基因治療劑投與之病患本身所製造之 搬運體細胞，由於不會因為免疫等因素而被排除，所以以 治療之目的而言極為適合。又，若病患本身無法製造時， 亦可使用他人或其他動物所衍生之細胞。在此種情形，若 事先以放射線照射以及藥劑等處理細胞的話，則在投與至 活體經過一定的時間後，細胞就會開始分裂，而該細胞並 不會增殖便被消滅。這種細胞以搬運病毒載體的目的而 言，實具有相當的功能。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) !272l〇7 、發明説明（17 ) 進一步’利用搬運體細胞與標的細胞間之相互作用，例 如訊息傳達等，可以製造出一個標的細胞很容易接受病毒 載體感染之狀怨（例如細胞週期逆轉等），從而可以提高基 因導入之效率。 將有效量之功能性物質作為有效成分，其含有對於基因 /口療有用基因的病毒具有親和性之功能性，以及對於必須 基因導入之標的細胞為專一親和性之功能性，從而在對於 基因治療有敏感性之疾病的治療上，可用於製造基因治療 劑而為使用。又，將有效量之他種功能性物質作為有效成 分，其具有含有對於基因治療有用基因的病毒為親和性之 功能性，以及對於必須基因導入之標的細胞為專一親和性 之功能性，亦可用於製造基因治療劑而為使用。 本發明之治療劑，只要是將上述之各種有效量的功能性 物質作為有效成分，而將其與習知之醫藥用載體組合作成 製劑即可。該治療劑可以以注射劑型、點滴用劑型投與。 治療劑之投與量，可根據該製劑形態、投與方法、使用 目的以及適用其之病患的年齡、體重、症狀而為適當之設 定並無一定，但一般而言，製劑中所含有之有效成分的量 為成人一天1〇#g〜200 mg/kg。當然該投與量會依各種條件 而有變動，較上述之投與量少有可能，或者超過該範圍亦 有可能。 、本發明所提供之基因治療方法，其特徵係將本發明之有 效量之治療劑作為有效成分而為投與。 在本發明之基因治療方法中，可以將含有對於基因治療 20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（18 ) 有用基因的有效量病毒，與具有病毒親和性之功能性物質 結合之狀態，進行投與；或者在活體内，使該病毒對於具 有該病毒親和性之功能性物質成為親和性而投與亦可。不 論是哪一種，只要設定為可在活體内以良好效率進行，使 基因導入於標的細胞中即可。 又，本發明並無特別之限制，在投與時，只要選擇適當 之方法，其適於本發明之基因治療劑到達標的細胞者即 可° 根據本發明，作為基因導入之標的細胞並無特別之限 制，舉例來說，幹細胞（stem cells)、造血細胞、非接著性 低密度單核細胞、接著性細胞、骨髓細胞、造血幹細胞、 末梢血幹細胞、臍帶血液細胞、胎兒性造血幹細胞、胚形 成幹細胞、胚細胞、原始生殖細胞（primordial germ cell)卵 母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、CD 34 +細 胞、C-kit +細胞、多功能性造血前驅細胞、單功能性造 血前驅細胞、紅血球系前驅細胞、淋巴球母細胞、成熟血 球、血液細胞、白血球、淋巴球、B細胞、T細胞、癌浸 潤淋巴球、纖維芽細胞、神經芽細胞、神經細胞、内皮細 胞、血管内皮細胞、肝細胞、肌芽細胞、骨路肌細胞、平 滑肌細胞、癌細胞、骨髓腫瘤細胞以及白血病細胞等。 以造血幹細胞為標的之基因治療，其係補充病患之欠 缺、或者異常之基因者，舉例來說，ADA (adenosine deaminase)缺乏症（參照美國專利號碼5：399346號公報），以 及戈雪病之基因治療即是。其他則例如有，在治療癌症以 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1272107 A7 B7 五、發明説明（19 ) 及白血病之化學療法劑中，用於緩和其所導致產生之障 礙，而將藥劑抗性基因導入於造血幹細胞中。 又，癌症之基因療法，例如有在癌細胞中轉形胸#激酶 基因等自殺基因之後，而投與藥劑使細胞死亡之制療法。 [Science、第 256卷、第 1550 〜1552 頁（1992 年）]。進一步， 有關AIDS亦正在嘗試以基因療法來進行治療。在此種情 況下，則係考慮在由造成AIDS的HIV(人類免疫不全病毒） 所感染之T細胞上，導入編碼妨礙HIV之複製以及基因表 現的核酸分子（反意義核酸以及核酸代酶等）之基因的方 法。[舉例來說，有Journal of Viology、第69卷、第 4(M5〜4052頁（1"5年）]。本發明之標的細胞專一性的基因 導入，則可提高上述基因治療之效率。 如上所詳細說明者，由本發明之治療劑、治療方法所進 行之對於活體内標的細胞之專一性基因導入，可以治療需 要基因治療之疾病。又，本發明之治療劑即使投與至活體 之内，只要在其生理有效濃度之範圍之内，並無急性毒性 被發現。 實施例 以下以實施例，進一步詳細說明本發明，然本發明並不 限定於以下之實施例之範圍。 實施例1 (1)在8週大的C 3H/HeJ老鼠（日本SLC公司購得）上，利用 EPHA-5 產生細胞（nature medicine、第 2 卷、第 876〜882 頁 (1996))，將含有所產生之人類ADA基因（hADA)之PGK載體 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（20 ) 的 PGK- hADA 載體（nature medicine、第 2卷、第 876〜882 頁 (1996))，以及實施例2所記載之逆轉錄連結蛋白注射劑， 注射至尾端靜脈中。造血幹細胞之轉形，係根據nature medicine、第2卷、第876〜882頁（1996)，利用檢測基因導 入老鼠中被轉形之人類ADA cDNA的表現，來進行分析。 亦即，藉由醋酸纖維素電泳，將老鼠末梢血細胞中的人類 ADA蛋白質檢測其存在，並以ADA同功酶分析以進行確 認。試驗係於移植後4個月後立即實施，並且每個月重 複。 (2)在同功酶分折9個月後，進行轉形骨髓妁被移植體分 析，在逆轉錄連結蛋白以及投與有PGK- hADA載體之老鼠 中，確認人類ADA cDNA的表現。又，對照組之老鼠則無 該人類ADA被檢測出來。 實施例2 將逆轉錄連結蛋白（CH-296、寶酒造公司製）溶解於注射 用水中，使成為2毫克/毫升之後，以生理食鹽水進行平 衡，而作成注射劑。 實施例3 將HL 60細胞作為搬運體之基因導入 將聚胜肽CH-271以下列之方法進行製備。亦即，使用大 腸菌 Escherichia coli HB 101/pCH 101 (FERM BP-2799)，並 將其以美國專利第5,198,423號公報所記載之方法進行培 養，由該培養物得到CH-271。 將人類白血病細胞HL 60(由大日本製藥公司購得）於含有 10%仔牛胎兒血清（FCS :生物維他克公司購得）之D-MEM培 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1272107 A7 B7 五、發明説明（21 ) 養基（生物維他克公司製）中，配製為2X106細胞/毫升。並於 每1毫升細胞懸浮液中，添加最終濃度為100 /z g/ml之逆轉 錄連結蛋白或者上述之CH-271。進一步，再準備未添加 這些功能性物質之對照組。 在上述之細胞中，添加1〇〇 A 1之溶液，該溶液係含有6.23 X 106 cfti/ml之具有「促進性綠勞光蛋白」（Enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的愛克托豬反轉錄病毒載體 [pLEIN (選殖技術公司製）··使用GPE-86細胞（ATCC CRL-9642)而製備]，並於5%二氧化碳孵育器中，以37°C孵育3〇 分鐘。孵育之後，將細胞於含有10% FCS之D-MEM培養 液中離心2次加以洗淨，去除未吸附細胞之病毒載體。離 心之後，懸浮於含有10% FCS之D-MEM培養液1毫升中。 將如此所獲得之HL 60細胞（相當於2X 106細胞），添加於 培養有相當於2X105細胞的NIH/3 T 3細胞（ATCC CRL-1658) 之6孔細胞培養用之培養盤中（亞爾康公司製）。將該細胞 於5%二氧化碳孵育器中，以37°C孵育2天。培養之後，回 收接著於培養盤之NIH/3 T 3細胞，並藉由使用FACS Vantage (貝克呑狄更生公司製）之流動侧位儀（激態波長488 nm、勞光波長515〜545 nm)進行EGFP表現細胞之解析， 從而計算出基因導入效率（相對於全細胞之EGFP表現細胞 之比率）。該實驗結果則示於圖1。 如圖1所示，只有在HL 60細胞上添加有逆轉錄連結蛋白 (CH-296)的群組中，確認有統計上有意義之GPE + 86/EGFP 逆轉錄病毒載體衍生之EGFP基因的表現，顯示有基因導 -24- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（22 ) 入發生。亦即，顯示逆轉錄病毒載體係媒介逆轉錄連結蛋 白而吸附於HL 60細胞，並與該細胞同時接近標的細胞之 NIH/3 T 3細胞，然後再感染標的細胞。透過逆轉錄連結 蛋白而被吸附於細胞之病毒載體，其係藉由離心處理、洗 淨處理也不會有所脫離，而且也不會因為吸附而失去感染 能力。如此，只要將逆轉錄連結蛋白添加於細胞懸浮液 中，即可簡單地製成具有病毒吸附能力之搬運體細胞。 逆轉錄連結蛋白係，VLA 5配位體之外，還具有可於HL 60細胞表現之VLA 4配位體（CS-1)，然而VLA 5配位體在具 有CH-271之配位體在HL 60細胞其表現量甚低，相對於 此，一般咸認係基因導入效率之差別所致。此現象顯示， 適當地選擇欲與使用細胞所配合之具有病毒親和性的功能 性物質，例如纖維連結蛋白的片段等，即使在多種細胞混 合之狀態下，亦可能可赋予所希望之搬運體細胞一專一病 毒親和性。 .實施例4 將血管内皮細胞作為搬運體之基因導入 將含有5 X 105細胞的血管内皮細胞（HUVEC :生物維他 克公司購得）之200 // 1之D-MEM培養基（生物維他克公司 製、添加10%FBS後使用）上，添加最終濃度為100/zg/ml 之逆轉錄連結蛋白。又，同時準備沒有添加逆轉錄連結蛋 白之對照組。 在上述之細胞上，添加含有7. 75 X 106 cfu/ml之GPE + 86/EGFP逆轉錄病毒溶液200 /z 1，並於5%二氧化碳孵育器 中，以37 °C孵育30分鐘。孵育之後，將細胞於含有10% -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1272107 A7 B7 五、發明説明（23 ) FCS之D-MEM培養液中離心2次加以洗淨’去除未吸附細胞 之病毒載體。離心之後’懸浮於含有FCS之D-MEM 培養液100//1中。將上述方法所製備之HUVEC(相當於5X 105細胞），於500 /z 1之RPMI 1640培養基（生物維他克公司 製、添加10% FBS後使用）中，與L1210細胞（相當於1 X 1〇5 細胞）（由大日本製藥公司購得）混合，再移至24孔培養盤中 (亞爾康公司製）。將該細胞於5%二氧化碳孵育器中，以37 °C孵育4天。 培養結束之後，以螢光顯微鏡觀察該細胞，可觀察到 HUVEC之周圍都被L1210細胞所圍繞。由此可明白顯示 HUVEC係對於L1210細胞具有親和性。在HUVEC之周圍的 L1210細胞上，可見有EGFP產生之螢光，由此可明白顯示 這些細胞發生了基因導入。又，在沒有添加逆轉錄連結蛋 白而進行上述之操作的組別中，沒有觀察到L1210細胞圍 繞HUVEC，以及螢光之現象。 由以上事實，顯示將HUVEC與逆轉錄連結蛋白等功能性 物質加以組合，可使標的細胞之基因尋標成為可能。 實施例5 血管内皮細胞之自動尋的 使用腺病毒表現載體套組（寶酒造公司製），製備重組有 該套組所附之具有LacZ基因之控制組質體pAxCAiLacZ之 腺病毒載體AxCAiLacZ。其次，在直徑10公分之培養盤（亞 爾康公司製）中，幾乎匯流地培養的HUVEC上，將上述之 腺病毒載體AxCAiLacZ以m.o.i. = 10感染並繼續培養。感染 培養3天後回收細胞並作成LacZ-HUVEC。 -26- 本紙張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1272107 A7 B7 五、發明説明（24 ) 事先將1 X 106個老鼠纖維肉腫瘤細胞株Meth-A(由理化學 研究所分讓，RCB 0464)，移植至scid老鼠（日本克雷爾公 司購得）之皮下。移植後第5天，由尾部靜脈接種相當2X 106個LacZ-HUVEC。接種7天後，由上述老鼠摘取腫瘤、 鄰近於腫瘤且可看見血管新生之腹膜以及各種器官（肝 臟、脾臟、心臟、腎臟、肺臟），並使用X-gal(寶酒造公司 製）將其各自染色，並調查LacZ-HUVEC之分布狀態。又， 為確認所使用之LacZ-HUVEC具有LacZ基因，茲將該細胞 之一部份在接種於老鼠時同時於培養基上培養，並與上述 之腫瘤、腹膜、器官等於相同時期以X-gal進行染色。 培養基上所培養之LacZ-HUVEC因為X-gal而呈現藍色， 確認有LacZ基因之存在。在被摘取之腫瘤及腹膜上，由於 X-gal染色之故可見到有藍色之染色。在新生血管部位上 確認有LacZ-HUVEC分布。進一步，腫瘤的一部份亦見到 有藍色染色之部分。亦即，被投與之HUVEC明顯地會選 擇性地聚集於新生血管部位。 如上所述，顯示HUVEC在腫瘤形成部位、血管新生部位 之基因導入可以作為搬運體使用。 產業上利用性 由於本發明，可以在活體中對於標的細胞進行基因導入 之尋標，而在目標之標的細胞上進行專一基因導入，其結 果，可提供一對於基因治療敏感性之疾病的治療上有用之 治療及該治療劑。又，本發明亦提供一藉由投與此種治療 劑之基因治療方法，以及在活體内對於標的細胞基因導入 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1272107 A7 B7 五、發明説明（25 ) 之基因治療方法。 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims (1)

1272说石刚822號專利申請案 韶 中文申凊專利範圍替換本(95年11月）名雪 申請專利範圍 年月日修正

1 · 一種活體投與用組合物，其係投與於對基因治療具有 敏感性之疾病患者，其特徵為含有： (1)含有對於基因治療上有用之基因的有效量逆轉錄 病毒； (2 )對於（1 )之逆轉錄病毒具有親和性以及對於標的細 胞具親和性之有效量功能性物質，其中該對於（丄） 逆轉錄病毒具有之親和性係來自由抗病毒抗體、 纖維連結蛋白之肝素_π結合區域、纖維芽細胞增 殖因子、膠原蛋白、聚離胺酸所選擇之功能性物 質，而該對於標的細胞具有之親和性係來自由蛋 白質、激素、細胞活素、抗標的細胞抗體、糖 鏈、碳水化合物以及細胞所選擇之功能性物質； 及 (3 )醫藥用載體。 2.如申請專利範圍第1項之活體投與用組合物，其中所使 用之對於標的細胞具有親和性之功能性物質係得自由 血管内皮細胞、發炎細胞、造血幹細胞、腦内皮細 胞、骨髓細胞中所選出之細胞。 3·如申請專利範圍第1項之活體投與用組合物，其中，該 作為功能性物質所使用之細胞係由血管内皮細胞、發 炎細胞、造血幹細胞、腦内皮細胞、骨髓細胞中所選 出者。 4. 一種活體投與用組合物’其係投與於對基因治療具有 敏感性之疾病患者，其特徵為含有： 63265-951124.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1272107 六、申請專利範圍 A B CD

含有對於基因治療上有用之基因的有效量逆轉綠 病毒； (2 )對於（1 )之逆轉錄病毒具有親和性之有效量功能性 物質，其係來自由抗病毒抗體、纖維連結蛋白之 肝素-II結合區域、纖維芽細胞增殖因子、膠原蛋 白、聚離胺酸所選擇之功能性物質， (3 )對於標的細胞具有親和性之有效量其他功能性物 質’其係纟自由標的細胞之蛋白f、激素、細胞 活素、抗標的細胞抗體、糖鏈、碳水化合物以及 細胞所選擇之功能性物質； (4 )醫藥用載體。 5·如申請專利範圍第4項之活體投與用組合物，其中，該 作為功能性物質所使用之細胞係由血管内皮細胞、發 炎細胞、造血幹細胞、腦内皮細胞、骨髓細胞中所遂 出者。 63265-951124.DOC - 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐）