KR20010102547A - 유전자 치료제 - Google Patents

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우에노미츠히로
하시노기미카주
요시오카히로푸미
다나카게이지
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오미야 히사시
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Abstract

활성 성분으로서 유전자 치료에 사용가능한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자 도입을 필요로하는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 또다른 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질, 또는 상기 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 상기 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 함유함을 특징으로 하는 유전자 치료에 민감성을 나타내는 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료법.

Description

유전자 치료제{Gene therapeutics}
현재까지 세계적으로 약 3000 경우의 유전자 치료가 수행되었다. 유전자 치료에 관한 가장 큰 기술적 문제는 표적 세포, 특히 조혈 간세포에 치료 유전자를 도입하는 효율이 매우 낮다는 것이었다. 최근에 유전자 도입 효율이 피브로넥틴 단편의 재조합 단백질, CH-296 (Takara Shuzo; RetroNectin)의 사용에 의해 놀라웁게 개선되었고, 따라서, 유전자 치료는 실용성을 얻어가고 있다 (Nature Medicine, 2:876-882 (1996)). 재조합 레트로넥틴(RetroNectin) 분자는 혼입된 치료 유전자를 갖는 레트로바이러스 및 표적 세포와 결합할 수 있어, 그들이 서로 인접하게 하여, 유전자 도입 효율을 크게 증가시킨다. 유전자를 인간 조혈 간세포에 도입하는 것이 가장 어려웁다고 말해지고 있다. 그러나, 약 90%의 효율로 치료 유전자를 도입하는 것이 인간 조혈 간세포 경우에도 레트로넥틴을 사용하여 달성되었다. 레트로넥틴은 조혈 간세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드가 혼입된 치료 유전자를 갖는 레트로바이러스 벡터에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 연결된 단일 폴리펩타이드이다. 본 발명자들은 레트로넥틴중의 두 부분을 서로 분리하고, 칵테일로서 혼합한다해도 원래의 레트로넥틴 분자의 것과 동일한 활성을 나타낸다는 것을 입증하고, 이 방법을 칵테일 유전자 도입 방법이라고 명명하였다(참조, WO 97/18318).
레트로넥틴을 사용하여 조혈 간세포에 유전자를 도입하는 방법은 조혈 간세포에 유전자를 도입하는 효율을 증가시킨다는 점에서 획기적인 방법이다. 이 방법은 시험관내에서 조혈 간세포에 유전자 도입을 수행하고 도입된 유전자를 갖는 조혈 간세포를 생체에 되돌리는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 단계를 포함하는 방법은 너무 복잡하여 일부경우의 유전자 치료에 적용할 수 없다.
현재, 유전자 치료에 사용될 표적 세포의 다양화를 다룰 수 있는 표적 세포-특이적 유전자 도입 방법을 제공하는 것이 요구되고 있다.
세포에 특이적인 친화성을 갖는 리간드를 첨가하여 표적 세포에의 지향성을 비-바이러스 벡터(예를들어, 핵산을 보유하기 위한 담체로서 폴리라이신 등을 사용하는 벡터)에 부여하는 시도가 있어왔다. 그러나, 이 방법에 의해 도입된 유전자는 세포내에서 안정하게 유지될 수 없다. 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 리간드와 바이러스 인벨롭(envelope)의 융합 단백질을 각각 발현하는 바이러스 벡터가 알려져 있다. 그러나, 의도된 표적화는, 인벨롭에 고유한 감염기능 및 리간드에 고유한 결합기능의 한쪽 또는 모두가 융합 발현에 기인하여 손상되기 때문에, 많은 경우에 달성되지 않았다. 또한, 융합된 인벨롭을 발현하기 위하여, 표적 세포의 매종류에 대해 패키징 세포의 복잡한 구축을 수행하는 것이 필요하였다. 또한, 복제능을 획득한 레트로바이러스(replication competent retrovirus, RCR)가 나타나지 않는 것을 확인하기 위하여 고역가(high-titer) 바이러스 벡터 현탁액등을 제공할 수 있는 패키징 세포주를 수립하기 위하여 많은 실험 준비 시간이 요구되어 왔다.
상기 기술된 바와 같이, 표적 세포에 특이적으로 관심의 대상이 되는 유전자를 효율적으로 도입하기 위하여 현재 기술이 여전히 안고 있는 다양한 문제점을 해결하는 것이 요망되어 왔다.
본 발명은 치료를 위해 유전자 치료를 요하는 질병의 치료에 유용하고, 생체내에서 표적 세포에의 유전자의 선택적 도입에 유용한 미사일 유전자 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 비히클로서 HL-60 세포를 사용하는 유전자 도입의 효율을 예시한다.
본 발명을 하기에 상세히 기술한다.
본 발명의 치료 조성물을 사용한 미사일 유전자 치료에서 사용되는 바이러스 벡터는 특정하게 제한되지 않는다. 유전자 도입에 보통 사용되는 공지된 바이러스 벡터, 예를들어 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-수반 바이러스 벡터 또는 백시니아 바이러스 벡터가 사용된다. 바람직하게는 재조합 레트로바이러스 벡터가 본 발명에서 사용된다. 특히, 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터의 복제 능력은 벡터가 감염된 세포에서 자동적으로 복제할 수 없도록 제거되어, 따라서, 벡터는 비병원성이다. 벡터는 척추동물 세포(특히, 포유동물 세포)와 같은 숙주 세포에 침입할 수 있고, 벡터내에 삽입된 유전자 치료에 유용한 외부 유전자를 안정하게 크로모좀 DNA에 통합할 수 있다.
본 발명에서, 생체내 표적 세포에 도입되는 유전자는 적절한 프로모터, 예를들어 바이러스에 존재하는 프로모터 또는 외래 프로모터의 조절하에 발현되도록 재조합 레트로바이러스 벡터에 삽입되어 사용될 수 있다. 또한, 프로모터 및/또는 전사 개시 부위와 협력하는 또다른 조절 요소(예를들어, 인핸서 서열 또는 종결 서열)가 유전자의 효율적인 전사를 달성하기 위하여 벡터내에 존재할 수있다. 또한,프로모터, 전사 개시 부위 및 부위-특이적 방법(기관에서, 종양 주위에서등)으로 발현을 조절하는 이들과 협력하는 또다른 조절 요소가 벡터에 혼입되어 표적 부위에서의 유전자 발현의 특이성을 추가로 증가시킬 수 있다. 도입되는 유전자는 천연 유전자 또는 인공적으로 제조된 유전자일 수 있다. 다르게는, 유전자는 상이한 기원의 DNA 분자가 결찰 또는 본 분야에 알려진 다른 수단에 의해 함께 결합된 것일 수 있다.
바이러스 벡터에 삽입하려는 유전자로서 생체내에서 표적 세포에로의 도입이 요망되는 유전자를 선택할 수 있다. 예를들어, 치료하려는 질병과 관련된 효소 또는 단백질, 세포내 항체(예를들어, WO 94/02610), 증식인자, 안티센스 핵산, 리보자임, 폴스(false) 프라이머(예를들어, WO 90/13641) 등을 코딩하는 유전자가 상기 유전자로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유 아세포 성장 인자, V 형 콜라겐 및 폴리라이신을 포함한다. 또한, 헤파린-결합 도메인을 갖는 기능성 물질과 같은 이들 기능성 물질에 기능적으로 동등한 물질이 사용될 수 있다. 이들은 이러한 기능성 물질로부터 유래될 수 있다. 이와 관련하여, "기능성 물질로부터 유래된"이란 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질의 기능성 부위가 사용되는 기능성 물질의 분자내에 포함되어 있다는 것을 의미한다. 친화성은 바이러스에 대해 결합하는 능력 및 세포에 부착하는 능력을 포함하는 개념이다. 본 발명에서 사용된 기능성 물질의 바이러스에 대한 친화성은 바이러스가 특정 세포, 또는 그를 함유하는 기관 또는 조직에로의 표적화, 및 생체내의 유전자를 특정 세포에 도입하는 것을 포함하는 유전자 치료를 수행하는 것을 가능하게 한다.
바이러스에 특이적인 친화성을 갖는 항체는 특히 유전자를 특정 세포에 특이적으로 및 효율적으로 도입하는데에 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 특정한 것으로 제한되지 않는다. 유전자 도입용 바이러스의 표면상의 항원을 인식하는 항체가 사용경우에 적절하게 선택될 수 있다. 이러한 항체는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 다르게는, 많은 현재 시판되는 항체가 또한 사용될 수 있다. 항체는 사용되는 바이러스에 결합하는 능력과 같은 원하는 성질을 갖는 한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 공지된 기술을 사용하여 개질된 항체, 또는 항체의 유도체, 예를들어 인간화된 항체, Fab 단편 또는 단일쇄 항체가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 세포에 대해 각각 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 세포 표면 항원에 대한 항체, 폴리사카라이드, 당단백질, 당지질, 당단백질 또는 당지질로부터 유래된 당쇄, 표적 세포의 대사물 및 세포를 포함한다. 이들은 이러한 기능성 물질로부터 유래된 세포-결합 부위일 수 있다. 이와 관련하여, "기능성 물질로부터 유래된"이란 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질의 기능성 부위가 사용되는 기능성 물질의 분자내에 포함된다는 것을 의미한다. 표적 세포에 대한 친화성은 표적 세포에 결합하는 능력 및 세포에 접착하는 능력을 포함하는 개념이다. 본 발명에서 사용되는 기능성 물질의 표적 세포에 대한 친화성은 바이러스의 특정 세포, 또는 그 세포를 함유하는 기관 또는 조직에의 표적화 및 생체내 유전자를 특정 세포에 도입하는 것을 포함하는 유전자 치료를 수행하는 것을 가능하게 한다.
표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체가 특히 특정 표적 세포에 유전자를 효율적으로 도입하는데에 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항-표적 세포 항체는 특정한 것으로 제한되지 않는다. 유전자가 도입되는 표적 세포상에서 발현되는 항원에 대한 항체를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이러한 항체는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 다르게는, 많은 현재 시판되는 항체가 또한 사용될 수 있다. 항체는 표적 세포에 대해 특이성과 같은 원하는 성질을 갖는 한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한, 공지된 기술을 사용하여 개질된 항체 또는 항체의 유도체, 예를들어 인간화된 항체, Fab 단편 또는 단일 쇄 항체가 또한 사용될 수 있다.
다양한 세포상의 각각의 백혈구 항원(CD 항원이라고 알려짐)의 발현을 상세히 연구하였다. 따라서, 유전자는 관심의 대상이 되는 표적 세포상에서 발현되는 CD 항원을 인식하는 항원을 선택하고, 이를 본 발명의 유전자 도입 방법에서 사용하여 고도의 특이성으로 표적 세포에 도입될 수 있다. 예를들어, 유전자 도입은 항-CD4 항체를 사용하여 헬퍼 T 세포로 또는 항-CD34 항체를 사용하여 조혈 간세포로 지향될 수 있다.
또한, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 또는 비트로넥틴과 같은 세포에 접착하는활성을 갖는 단백질은 표적 세포에 대한 친화성을 갖는 기능성 물질로서 사용될 수 있다. 기능성 물질은 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 한 그의 단편일 수 있다.
당단백질인, 라미닌이 혈액 세포와 같은 다양한 표적 세포에 유전자를 효율적으로 도입하는데에 유용하다. 라미닌의 당쇄는 라미닌을 사용한 유전자 도입에 서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 공지된 방법에 따라 라미닌으로부터 방출된 당쇄는 또한 기능성 물질로서 사용될 수 있다. 또한, 라미닌과 같은 고 만노즈형 N-결합된 당쇄, 또는 그로부터 방출되거나 화학적으로 합성된 당쇄를 갖는 당단백질이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 상기-언급된 당쇄가 부착된 단백질과 같은 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는 예를들어, 레트로바이러스에 친화성을 갖고 당쇄가 부착된 기능성 물질이 유전자 도입에 사용될 수 있다.
상기 기술된 기능성 물질은 천연기원 물질로 부터 수득하거나, 인위적으로 제조하거나 (예를들어, 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성 기술을 사용하여), 천연기원 물질과 인위적으로 제조된 물질을 조합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 피브로넥틴 또는 그의 단편은 예를들어 J. Biol. Chem., 256:7277 (1981); J. Cell. Biol., 102:449 (1986); 또는 J. Cell. Biol., 105:489 (1987)에 기술된 방법에 따라 천연기원 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 피브로넥틴 또는 그의 단편은 미국 특허 제 5,198,423 호에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 특별하게는, 레트로바이러스-결합 부위인 헤파린-II 도메인을 함유하는 피브로넥틴 단편, 예를들어 CH-296 (RetroNectin), H-271, H-296 및 CH-271을 포함하는 재조합체 폴리펩타이드및 그를 함유하는 방법이 특허의 공보에 상세히 기술되어 있다. 이들 단편은 공보에 기술된 바와 같이 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan에 소재하는 the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry에 수탁번호 FERM P-10721 (H-296)(원기탁일: 1989년 5월 12일), FERM BP-2799 (CH-271)(원기탁일: 1989년 5월 12일), FERM BP-2800 (CH-296) (원기탁일: 1989년 5월 12일) 및 FERM BP-2264 (H-271) (원기탁일: 1989년 1월 30일)로 기탁된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주를 배양하여 수득할 수 있다. 또한, 전형적으로 이들 단편들로부터 유래될 수 있는 단편은 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 에스케리키아 콜라이에 있는 플라스미드를 변형하여 제조할 수 있다.
상기-언급된 피브로넥틴 단편중에서, CH-296 및 CH-271이 VLA-5 에 대해 리간드를 갖고, CH-296 및 H-296이 VLA-4에 대해 리간드를 갖는다. 따라서, 이들은 VLA-5 또는 VLA-4를 발현하는 세포를 표적화하는데에 유용하다. 예를들어, VLA-4에 대한 리간드를 갖는 기능성 물질이 조혈 간세포에 유전자를 도입하는데에 유용하다.
세포가 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질로서 사용될 수 있다. 특정 세포는 기관, 조직 또는 세포에 특이적인 친화성을 갖는다. 따라서, 세포가 생체내에서 바이러스 벡터로 표적 세포를 감염하는데에 비히클로서 유용하다. 세포를 비히클로서 사용하여 표적 세포에 유전자를 표적화시키는 것을 하기에 예시한다.
1. 비히클로서 혈관 내피 세포를 사용한 유전자 도입
혈관내피세포는 혈관이 새로이 형성되는 부위에서 특이적으로 축적되는 성질을 갖는다. 비히클로서 혈관 내피 세포를 사용한 유전자의 표적화(targeting)는 이 성질을 사용하여 수행될 수 있다.
암세포는 그들의 증식을 위하여 그들 주위에 혈관신생(vascularization)을 유도하고, 형성된 혈관을 통해 영양분을 취하며, 노폐물을 분비한다. 암은 상기 기술된 바와 같이 혈관 내피 세포의 성질을 이용하여 암 세포 주위의 혈관 신생 부위에 바이러스 벡터를 수송하여 치료할 수 있다. 예를들어, HSV-TK와 같은 자살 유전자를 암 조직을 직접적으로 공격하는 치료 유전자로서 도입할 수 있다. 다르게는, 혈관신생을 억제하는 유전자를 암 세포에 의한 영양분의 섭취를 저해하고, 암을 퇴보시키기 위하여 도입할 수 있다. 암에 대한 이러한 치료 경우 관찰되는 부작용은 통상적인 화학요법 또는 방사선 요법 경우 관찰되는 것보다 적다. 수술에 의한 환자에 대한 물리적 부담은 본 발명의 유전자 치료용 조성물로 접종하는 것을 포함하는 간단한 치료를 사용하여 극적으로 감소된다.
뇌경색 또는 심근경색에 대한 혈관 바이패스 수술후 관찰되는 허혈성 상태를 극복하기 위하여 측부혈행로의 발달을 촉진하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 허혈성 상태는 수술 부위 주변의 혈관 신생부위에 비히클로서 혈관 내피 세포를 사용하여 혈관신생을 촉진하는데에 포함된 유전자를 도입하여 개선된다.
2. 비히클로서 염증 세포를 사용하는 염증 조직에의 유전자 도입
알레르기성 염증, 예를들어 기관지 천식의 경우에, 혈관 루멘으로부터의 염증 세포가 혈관벽에 접착하고, 혈관 내피 세포를 통해 이동하며, 스트로마(stroma)내로 이동하여 기도 점막에 염증을 일으킨다. 치료는 염증세포가 염증 부위에 축적되는 성질을 이용하여 수행될 수 있다. 비히클로서 사용될 수 있는 염증세포는 호산구, 비만세포 및 림프구를 포함한다. 예를들어, 축적의 제 1 단계인 혈관벽에 염증세포의 접착시, 접촉의 저해에 포함되는 유전자가 혈관 내피세포에 도입된다면, 염증세포의 접착은 저해되고, 그후 축적이 일어나지 않는다.
3. 비히클로서 조혈 간세포를 사용하는 골수 미소환경에의 유전자 도입
조혈 간세포는 골수 미소환경에 호밍(homing)하는 성질을 갖는다. 유전자의 표적화는 이 성질을 이용하여 수행될 수 있다. 조혈 간세포가 바이러스 벡터와 함께 골수 미소환경에 호밍할 때, 인접한 다른 조혈 간세포 및 스트로마(stroma) 세포와 같은 골수 미소환경을 구성하는 세포를 포함하는 골수 미소환경에 유용한 유전자가 도입될 수 있다.
4. 비히클로서 뇌 내피 세포를 사용한 뇌종양에의 유전자 도입
뇌 종양 부위에의 표적화를 바이러스 벡터를 뇌로부터 유도된 내피세포에 결합시켜 수행할 수 있다. 특히, 레트로바이러스 벡터는 분열하는 세포를 고효율로 감염하는 성질을 갖는다. 따라서, 이 벡터는 종양 주위의 비-분열 정상 세포를 감염함이 없이 치유 유전자를 뇌 종양에 특이적으로 수송할 수 있다.
5. 비히클로서 조직을 재생할 수 있는 세포를 사용하는 유전자 도입
최근에, 골수 세포를 사용한 혈관의 재생이 보고되었고, 이 관찰을 이용한 심근경색 치료가 수행되어 왔다. 심근에 골수 세포를 주입하여 경색 상태에 있는심근에서의 혈류가 개선되었다. 이성질을 이용하여 골수 세포가 유용한 유전자(예를들어, 혈관신생-촉진 유전자)를 갖는 바이러스 벡터를 수송하도록 하였을 때, 혈관을 재생하는 골수 세포의 능력이 도입된 유전자와의 상승 효과에 기인하여 극적으로 증가되었다. 또한, 골수 세포는 간말성 간세포(mesenchymal stem cells)와 같이 골, 연골, 건(tendon), 지방 세포, 골격근 및 스트로마 세포로 분화하고 재생할 수 있다. 따라서, 골수 세포는 목적하는 것에 적절한 치료 유전자를 수송하기 위해 골수 세포를 사용하여 조직 또는 세포의 재생 촉진, 부위-특이적 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 기능적 물질은 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능적 물질 및 표적 세포에 친화성을 갖는 기능적 물질로 구성된 것을 포함한다. 예를들어, 기능적 물질은 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 항-표적 세포 항체 및 바이러스에 대해 특이적인 친화성을 갖는 항-바이러스 항체로 구성된 기능적 물질, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 당쇄 및 바이러스에 대해 특이적인 친화성을 갖는 항-바이러스 항체로 구성된 기능성 물질, 및 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 세포 및 바이러스에 대해 특이적인 친화성을 갖는 폴리펩타이드로 구성된 기능성 물질에 의해 예시된다. 유전자는 이러한 기능적 물질을 사용하여 다양한 유형의 세포가 공존하는 생체내에서 특이적 세포에 도입될 수 있다. 특히, 당쇄는 세포의 다양한 성질을 결정하기 때문에 세포의 얼굴이라고 말해지며, 세포는 다양한 당쇄를 통하여 서로 인식하고 상호반응한다. 따라서, 이 당쇄의 특이성을 이용한 유전자 도입의 표적화는 특이적 결합 능력을 갖는 항체와 함께 사용될 때생체내에서 가장 정밀한 미사일 유전자 치료를 가능하게 한다.
비히클로서 세포를 사용하는 본 발명의 유전자 치료용 조성물은 바이러스 벡터에 친화성을 갖는 기능적 물질이 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포에 결합되는 것에 의해 예시된다. 세포에 기능적 물질을 결합시키는데에 사용되는 방법은 기능적 물질이 세포에 화학적으로 결합하는 방법 및 바이러스 벡터에 대한 친화성 및 비히클로서 사용되는 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 사용되는 방법을 포함한다.
또한, 바이러스 벡터에 대해 특이적인 친화성 및 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포가 비히클로서 이용될 수 있다. 상기-언급된 두 성질을 고유적으로 갖는 선천적(native) 세포가 이러한 세포로 사용될 수있다. 다르게는, 세포는 인위적으로 부여되는 두 개 친화성의 하나 또는 두 개를 가질 수 있다. 표적 세포에 대해 특이적인 친화성은 세포가 세포의 표면에 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질(예를들어, 표적 세포상에서 발현되는 수용체에 대한 리간드 또는 표적 세포상의 표면 항원에 대한 항체)을 발현하도록 하여 부여될 수 있다. 또한, 바이러스 벡터에 대한 친화성은 비히클 세포의 표면상에 바이러스 벡터에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질을 발현시켜 유사하게 부여될 수 있다.
본 발명의 유전자 치료용 조성물을 투여받는 환자로부터 제조된 비히클 세포는 면역성등에 의해 제거되지 않는다. 따라서, 이들이 치료 목적으로 특히 바람직하다. 환자로부터 비히클 세포를 제조하는 것이 불가능하면, 또다른 개인 또는 동물종으로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 이 경우에, 세포를 사전에 방사선 또는 약제로 처리하면, 세포는 생체에 투여후 특정기간이 지난후 세포가 분열하기 시작할때, 세포는 증식하지 않고 소멸된다. 이러한 세포는 바이러스 벡터를 수송할 목적에 있어서는 충분히 기능성이다.
또한, 비히클 세포와 표적 세포 사이의 상호작용(예를들어 시그날 전달)을 이용하여 표적 세포가 바이러스 벡터에 의한 감염에 감수성인 상태를 만들어, 예를들어 세포 사이클을 진행시켜 추가로 유전자 도입 효율이 증가될 수 있다.
유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대한 친화성을 갖는 기능과 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화력을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 활성 성분으로서 유효량의 상기-언급된 기능성 물질을 사용하고, 이를 공지된 약제학적 담체와 제형화하여 제조할 수 있다. 조성물은 주사제, 점적용제등으로 투여될 수 있다.
치료 조성물의 투여량은 특별한 투여 형태, 투여 경로 및 목적 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 적절하게 결정되고 변한다. 일반적으로, 성인 경우 1일 투여량은 제제안에 함유된 활성 성분의 양으로 100 ㎍ 내지 200 mg/kg이다. 물론, 투여량은 다양한 인자에 따라 변할 수 있다. 그러므로, 일부 경우에, 상기 투여량보다 적은 투여량이 충분할 수 있고, 다른 경우, 상기 보다 많은 투여량이 요구될 수 있다.
본 발명은 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 치료 방법에서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질은 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스에 결합되어 투여될 수 있다. 다르게는, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질을 그의 친화성에 기인하여 생체내에서 바이러스와 결합하도록 투여될 수 있다. 어느 경우나, 투여 방식은 유전자가 생체내에서 표적 세포에 도입되도록 결정된다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 유전자 치료용 조성물이 표적 세포에 도달하기에 적절한 투여 방법을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유전자 도입용 표적으로 사용되는 세포의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 간세포(stem cell), 조혈세포, 비접착성저밀도단핵세포, 접착성 세포, 골수 세포, 조혈 간세포, 말초 혈 간세포, 제대혈액세포, 태아성 조혈 간세포, 배형성 간세포, 배세포, 프리모디알 점 세포(primordial germ cells), 난모 세포, 난원 세포, 난자, 정모세포, 정자, CD34+ 세포, c-키트+ 세포, 다능성조혈전구세포, 단능성조혈전구세포, 적혈구계전구세포, 림프구모세포, 성숙혈구, 혈액세포, 백혈구, 림프구, B 세포, T 세포, 종양 침윤 림프구, 섬유아세포, 신경아세포, 신경세포, 내피세포, 혈관 내피세포, 간세포(hepatocytes), 근아세포, 골격근세포, 평활근세포, 암 세포, 골수종 세포 및 백혈병세포를 포함한다.
표적 세포로서 조혈 간세포를 사용하는 유전자 치료의 일부는 환자에 있어서 결손이거나 비정상적인 유전자를 보완한다. 이의 예는 아데노신 디아미나제(ADA) 결핍증(미국 특허 제 5399346 호 참조) 및 고세병(Gaucher's diease)용 유전자 치료를 포함한다. 또한, 약제 내성 유전자가 예를들어 암 또는 백혈병의 치료에 사용되는 화학 요법제에 의해 기인한 조혈 세포의 장해를 완화시키기 위해 조혈 간세포에 도입될 수 있다.
또한, 티미딘 키나제 유전자와 같은 자살 유전자가 암 세포에 도입되고, 약제가 그 세포를 죽이기 위하여 투여되는 치료 방법이 암용 유전자 치료로서 연구되어 왔다(Science, 256:1550-1552 (1992)). 또한, 유전자 치료를 사용하여 AIDS를 치료하는 시도가 있다. 이 경우에, 하기 과정이 고려된다. 이 과정에서, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 복제 또는 유전자 발현을 방해하는 핵산 분자(예를들어, 안티센스 핵산 또는 리보자임)를 코딩하는 유전자를 AIDS의 원인제인 HIV로 감염될 수 있는 T세포에 도입한다[예를들어, J. Virol., 69:4045-4052 (1995)]. 본 발명에 따른 표적 세포-특이적 유전자 도입은 상기 기술된 바와 같이 유전자 치료의 효율성을 증가시킨다.
상기에서 상술된와 같이, 치료를 위하여 유전자 치료를 요하는 질병을 본 발명의 치료 조성물 및 치료 방법을 사용하여 생체내에서 표적 세포에 유전자를 특이적으로 도입하여 치료될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물을 생리학적으로 유효한농도로 생체에 투여하였을 때, 급성 독성이 관찰되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예 1
(1) 벡터 PGK-hADA(Nature Medicine, 2:876-882(1996), EPHA-5-생산 세포에 의해 생산된 인간 ADA 유전자(hADA)를 함유하는 PGK 벡터(Nature Medicine, 2:876-882(1996)), 및 실시예 2에서 하기 기술된 바의 레트로넥틴의 주사제를 C3H/HeJ 마우스(8주령, Japan SLC로부터 구입)의 꼬리 정맥에 주사하였다. 조혈 간세포의 형질도입을 유전자 도입된 마우스에서 형질도입된 인간 ADA cDNA의 발현을 조사하여 Nature Medicine, 2:876-882(1996)에 기술된 바와 같이 분석하였다. 특히, 마우스로부터 말초 혈 세포중의 인간 ADA 단백질의 존재를 검출용 셀룰로즈 아세테이트 전기영동을 사용한 ADA 이소자임 분석에 의해 확인하였다. 조사를 이식후 4개월 째의 시작에서 수행하고, 매달 반복하였다.
(2) 9개월후 이소자임 분석을 이용한 이식된 마우스로부터의 형질도입된 골수의 분석은 레트로넥틴 및 벡터 PGK-hADA가 투여된 마우스 경우 인간 ADA cDNA의 발현을 확인하였다. 인간 ADA는 대조 마우스에서는 검출되지 않았다.
실시예 2
레트로넥틴 (CH-296, Takara Shuzo)을 2 mg/ml의 농도로 주사 용수에 용해시켰다. 용액을 염수와 평형화시켜 주사 제제를 제조하였다.
실시예 3 비히클로서 HL-60 세포를 사용한 유전자 도입
폴리펩타이드 CH-271을 다음과 같이 제조하였다. 간략하게, 에스케리키아 콜라이 HB101/pCH101(FERM BP-2799)를 미국 특허 제 5,198,423에 기술된 방법에 따라 배양하였다. CH-271을 배양물로부터 수득하였다.
인간 백혈병 HL-60 세포(Dainippon Pharmaceutical로 부터 구입)를 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 D-MEM 배지(Bio Whittaker)에 2 x 106세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 레트로넥틴(RetroNectinTM)(Takara Shuzo) 또는 CH-271을 최종 농도 100 ㎍/ml의 농도로 세포 현탁액 1 ml에 첨가하였다. 이러한 기능성 물질을 첨가하지 않은 대조군 그룹도 준비하였다.
인핸스드(enhanced) 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자(pLEIN (Clontech), GP+E-86 세포(ATCC CRL-9642)를 사용하여 제조됨)를 갖는 에코트로픽(ecotropic) 레트로바이러스 6.23 x 106cfu/ml를 함유하는 100 ㎕ 용액을 세포에 첨가하였다. 혼합물을 5% CO2인큐베이터에서 37℃에서 30분간 인큐베이션했다. 인큐베이션후, 세포를 세포에 흡착하지않은 바이러스 벡터를 제거하기 위하여 10% FCS를 함유하는 D-MEM 배지중에서 원심분리에 의해 2회 세척하였다. 원심분리에 의해 세척후, 세포를 10% FCS를 함유하는 D-MEM 배지 1 ml에 현탁시켰다.
2 x 106개의 이렇게 수득된 HL-60 세포를 2 x 105개의 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)가 배양된 6-웰 세포 배양 플레이트(Falcon)에 첨가하였다. 세포를 5%CO2인큐베이터에서 37℃에서 2일동안 인큐베이션했다. 인큐베이션후, 플레이트에 부착된 NIH/3T3 세포를 수집하였다. EGFP-발현 세포를 488 nm의 여기 파장 및 515-545 nm의 방출 파장에서 FACSVantage(Becton Dickinson)를 사용한 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 분석하였다. 이어서 유전자 도입 효율( 전세포에 대한 EGFP-발현 세포의 비)을 계산하였다. 실험 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에서 나타난 바와 같이, GP+E-86/EGFP 레트로바이러스 벡터로부터 유래된 EGFP 유전자의 유의적인 발현이 레트로넥틴(CH-296)이 HL-60 세포에 첨가된 그룹에서만 관찰되어 유전자 도입이 일어났다는 것을 나타냈다. 특별히는, 레트로바이러스 벡터가 레트로넥틴을 통해 HL-60 세포에 흡착될 수 있고, HL-60 세포와 함께 표적 세포로서의 NIH/3T3 세포에 접근하고, 이어서 표적 세포를 감염한다는 것이 입증되었다. 레트로넥틴을 통해 세포에 흡착된 바이러스 벡터는 원심분리나 세정후에도 떨어지지 않고, 흡착시 그의 감염성을 잃지 않았다. 상기한 바와 같이, 바이러스에 흡착할 수 있는 비히클 세포는 단지 레트로넥틴을 세포 현탁액에 첨가하여서 편리하게 제조할 수 있었다.
레트로넥틴은 VLA-5에 대한 리간드외에, HL-60 세포에서 발현되는 VLA-4에 대한 리간드(CS-1)을 갖는다. 다른한편, CH-271은 HL-60에서의 발현 수준이 낮은 VLA-5 에 대한 리간드를 갖는다. 이 차이는 유전자 도입 효율에서의 차이를 반영한다고 생각되어진다. 이들 결과는 복수 종류의 세포가 공존하는 상태에서도 세포와 조합하여 사용되는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질(예를들어, 피브로넥틴 단편)을 적절하게 선택하여 관심의 대상이 되는 비히클 세포에 바이러스에대한 친화성을 특이적으로 부여하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 비히클로서 혈관 내피 세포를 사용한 유전자 도입
레트로넥틴을 5 x 105개의 혈관 내피 세포(HUVECs, Bio Whittaker로부터 구입)를 함유하는 200 ㎕의 D-MEM 배지(Bio Whittaker, 10% FBS가 보충됨)에 100 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 레트로넥틴이 첨가되지 않은 대조군 그룹도 준비하였다.
7.75 x 106cfu/ml의 농도로 GP+E-86/EGFP 레트로바이러스를 함유하는 용액 200 ㎕를 세포에 첨가하였다. 혼합물을 5% CO2인큐베이터에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, 세포에 흡착되지 않은 바이러스 벡터를 제거하기 위하여 세포를 10% FCS를 함유하는 D-MEM 배지에서 원심분리에 의해 2회 세정하였다. 원심분리 세정후, 세포를 10% FCS를 함유하는 100 ㎕의 D-MEM 배지에 현탁시켰다. 상기된 바와 같이 준비된 5 x 105개의 HUVEC 세포를 500 ㎕의 RPMI 1640 배지(Bio Whittaker, 10% FBS로 보충됨)중에서 1 x 105개의 L1210 세포(Dainippon Pharmaceutical로 부터 구입)와 혼합하고, 24-웰 플레이트(Facon)에 옮겼다. 세포를 5% CO2인큐베이터에서 37℃에서 4일동안 인큐베이션했다.
세포를 배양후 형광 현미경하에서 조사하여, L1210 세포에 의해 둘러싸인 HUVEC의 덩어리를 관찰하고, HUVEC가 L1210 세포에 친화성을 갖는다는 것을 입증했다. 또한, EGFP로부터의 형광을 HUVEC를 둘러싸고 있는 L1210 세포에 대해 관찰하여 이들 세포에서 유전자 도입이 일어났다는 것을 입증했다. 레트로넥틴의 참가없이 상기 언급된 과정을 거친 세포 경우, L1210 세포에 의해 HUVEC가 둘러싸인 것은 관찰되었으나, 형광은 관찰되지 않았다.
상기로부터, HUVEC 및 레트로넥틴과 같은 기능성 물질을 조합하여 사용하여 표적 세포에로 유전자를 표적화시킬(target) 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 5: 아데노바이러스 발현 벡터 키트(Takara Shuzo)를 사용한 혈관 내피 세포의 호밍
키트에 부착된 lacZ 유전자를 갖는 대조군 플라스미드, pAxCAiLacZ를 함유하는 아데노바이러스 벡터 AxCAiLacZ를 제조하였다. 거의 콘플루엔스(confluence)로 10-cm 플레이트(Falcon)에서 배양된 HUVEC를 m.o.i.=10으로 아데노바이러스 AxCAiLacZ으로 감염시키고, 배양을 계속하였다. 감염하고 3일후 수집된 세포를 LacZ-HUVEC로 명명하였다.
마우스 섬유육종 세포주 Meth-A(Physical and Chemical Research (RIKEN)에 의해 분양, RCB)의 1 x 106개의 세포를 SCID 마우스(Clea Japan으로 부터 입수)에 피하 이식하였다. 2 x 106개의 LacZ-HUVEC를 이식하고 5일후 꼬리 정맥을 통해 접종하였다. 종양, 종양에 인접한 부위에서 혈관신생이 관찰되는 복막(복벽과 함께), 및 다양한 기관(간, 췌장, 심장, 신장 및 폐)을 접종 7일후 마우스로부터 적출하였다. 상기 각각을 X-gal(Takara Shuzo)를 사용하여 염색하고, LacZ-HUVEC가 있는 곳을 조사하였다. 또한, LacZ-HUVEC의 일부분을 LacZ-HUVEC가 lacZ 유전자를 갖는지를 확인하기 위하여 마우스에 접종시에 플레이트안에서 배양시키고, 종양, 복막 및 기관과 동시에 X-gal로 염색했다.
플레이트에서 배양된 LacZ-HUVEC은 X-gal로 푸르게 염색되어 이들이 lacZ 유전자를 갖고 있음을 확인하였다. 적출된 종양 및 복막의 일부분들이 X-gal로 푸르게 염색되었다. 특히, 선 모양의 염색이 복막에서 혈관신생 부위를 따라 관찰되어, LacZ-HUVEC이 혈관신생 부위에 위치함을 확인하였다. 또한, 푸른 염색이 종양의 일부분에서 또한 관찰되었다. 따라서, 투여된 HUVEC가 혈관신생 부위에서 선택적으로 축적됨을 나타냈다.
상기 기술된 바와 같이, HUVEC는 종양형성부위 및 혈관신생부위에 유전자를 도입하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다는 것이 입증되었다.
본 발명의 주 목적은 생체내에서 유전자를 도입하는 것을 포함하는 유전자 치료에 유용한 치료 조성물, 및 상기 조성물을 사용하여 생체내에서 표적 세포에 특이적으로 유전자를 도입하는 것을 포함하는 편리한 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 다음과 같이 요약된다. 본 발명의 제 1 면은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자 도입이 요구되는 표적세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질을 함유하는, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
제 1 면의 조성물은 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유할 수 있다. 예를들어, 바이러스는 기능성 물질과 혼합되어 함유될 수 있다. 다르게는, 바이러스는 기능성 물질과 혼합될 수 있도록 함유될 수 있다.
제 1 면의 조성물 경우, 기능성 물질의 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능은 특정적으로 제한되지 않고, 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성된 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 것에 의해 예시된다.
제 1 면의 조성물 경우, 기능성 물질의 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능은 특정적으로 제한되지 않고, 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 것에 의해 예시된다.
본 발명의 제 2 면은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 함유하는 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
제 2 면의 조성물은 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유할 수 있다. 예를들어, 바이러스는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질과 혼합되어 함유될 수 있다. 디르게는, 바이러스는 사용할 때 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질과 혼합될 수 있도록 함유될 수 있다.
제 2 면의 조성물 경우, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질은 특정하게 제한되지 않고, 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 및 폴리라이신, 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질에 의해 예시된다.
제 2 면의 조성물 경우, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질은 특정하게 제한되지 않고, 표적 세포에 대해 각각 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 기능성 물질에 의해 예시된다.
본 발명의 제 3 면은 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료 방법에 관한 것으로, 그 방법은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질을 투여하는 것을 포함한다.
제 3 면의 유전자 치료 방법에서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 본 발명의 조성물과 동시에 또는 별개 시간에 투여할 수있다.
제 3 면의 유전자 치료 방법에서, 기능성 물질의 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능은 특정하게 제한되지 않고, 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것에 의해 예시된다.
제 3 면의 유전자 치료 방법 경우, 기능성 물질의 표적 세포에 대한 특이적인 친화성을 갖는 기능은 특정하게 제한되지 않고, 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 것에 의해 예시된다.
본 발명의 제 4 면은 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자치료 방법에 관한 것으로, 방법은 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 투여하는 것을 포함한다.
제 4 면의 유전자 치료 방법에서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 본 발명의 조성물과 동시에 또는 별개의 시간에 투여될 수 있다.
제 4 면의 유전자 치료 방법 경우, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질은 특정한 것으로 제한되지 않고, 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질에 의해 예시된다.
제 4 면의 유전자 치료 방법 경우, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질은 특정하게 제한되지 않고, 표적 세포에 대해 각각 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 대사물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질에 의해 예시된다.
본 발명의 제 5 면은 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질의 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료용 조성물의 제조에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 면은 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질의 유전자 치료에 감수성인 질병 치료하기 위한 유전자 치료용 조성물의 제조에서의 용도에 관한 것이다.
제 1 또는 제 2 면의 조성물, 제 3 또는 제 4 면의 유전자 치료 방법, 또는 제 5 또는 제 6 면의 용도 경우, 유전자 도입을 위한 표적 세포는 특정하게 한정되지 않고, 조혈 간세포, 혈액세포, 백혈구, 림프구, T 세포, 종양-침윤 림프구, B세포 또는 암세포에 의해 예시된다.
제 1 또는 제 2 면의 조성물, 제 3 또는 제 4 면의 유전자 치료 방법, 또는 제 5 또는 제 6 면의 용도 경우, 표적 세포에 도입되려는 유전자는 유전자 치료 목적으로 사용될 수 있는 한 특정하게 제한되지 않는다. 도입된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포내에서 유전자의 발현시 치료에 충분한 양으로 발현되는 치료 단백질이다. 단백질은 생체내 효소 또는 사이토킨에 의해 예시된다.
제 1 또는 제 2 면의 조성물, 제 3 또는 제 4 면의 유전자 치료 방법, 또는 제 5 또는 제 6 면의 용도 경우, 사용되는 바이러스는 치료 수단으로서 임상적으로 사용될 수 있는 한 특정하게 제한되지 않는다. 안전이 확인된 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-수반 바이러스 벡터 또는 백시니아 바이러스 벡터이다. 이는 표적 세포에의 감염성 또는 유전자 도입 효율을 기초로 선택될 수 있다.
본 발명자들은 표적 세포에의 친화성을 갖는 기능 및 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능의 유용성이 생체내 유전자 도입을 위해 사용될 표적 세포의 임의의선택을 가능하게 하고, 바이러스를 이용하여 표적 세포에 효율절인 유전자 도입을 가능하게 하며, 이전에는 어려웠던 유전자 도입의 생체내 표적화 또는 미사일 유전자 치료를 가능하게 한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.
본 발명은 생체내에서 표적 세포에의 유전자 도입을 표적화할 수 있고, 관심의 대상이 되는 표적 세포에 특이적으로 유전자를 도입하며, 결과적으로, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 유용한 치료 및 치료 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명은 상기 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법 및 생체내에서 표적 세포에 유전자를 도입하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.

Claims (45)

  1. 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자 도입이 요구되는 표적세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질을 함유하는, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유하는 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성된 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능이 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래된 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질인 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 기능성 물질이 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 조성물.
  8. 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 함유하는 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하는데에 사용되는 유전자 치료용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유하는 조성물.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 및 폴리라이신, 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 조성물.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 표적 세포에 대해 각각 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포인 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 조성물.
  14. 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질을 투여하는 것을 포함하는, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 유전자 치료방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능이 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 유전자 치료방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래된 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질인 유전자 치료방법.
  19. 제 14 항에 있어서, 기능성 물질이 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 세포인 유전자 치료방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 유전자 치료방법.
  21. 활성 성분으로서 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질을 투여하는 것을 포함하는, 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 유전자 치료방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 유전자 치료방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포인 유전자 치료방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 유전자 치료방법.
  27. 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능을 갖는 유효량의 기능성 물질의 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료용 조성물의 제조에 있어서의 용도.
  28. 제 27 항에 있어서, 조성물이 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유하는 용도.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 용도.
  30. 제 27 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능이 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질로부터 유래된 용도.
  31. 제 27 항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포로부터 유래된 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질인 용도.
  32. 제 27 항에 있어서, 기능성 물질이 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포인 용도.
  33. 제 32 항에 있어서, 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 용도.
  34. 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 바이러스에 대해 친화성을 갖는 유효량의 기능성 물질 및 유전자의 도입이 요구되는 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 유효량의 또다른 기능성 물질의 유전자 치료에 감수성인 질병을 치료하기 위한 유전자 치료용 조성물의 제조를 위한 용도.
  35. 제 34 항에 있어서, 조성물이 유전자 치료에 유용한 유전자를 함유하는 유효량의 바이러스를 함유하는 용도.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 바이러스에 대해 친화성을 갖는 기능성 물질이 항-바이러스 항체, 피브로넥틴의 헤파린-II-결합 도메인, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 및 폴리라이신 및 그의 기능적 동등물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 용도.
  37. 제 34 항 내지 제 36 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 각각 표적 세포에 대해 친화성을 갖는 단백질, 호르몬, 사이토킨, 항-표적세포 항체, 당쇄, 탄수화물 및 세포로 구성되는 그룹으로부터 선택된 기능성 물질인 용도.
  38. 제 34 항에 있어서, 표적 세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 표적세포에 대해 특이적인 친화성을 갖는 세포인 용도.
  39. 제 38 항에 있어서, 표적 세포에 특이적인 친화성을 갖는 기능성 물질이 혈관 내피 세포, 염증 세포, 조혈 간세포, 뇌 내피 세포 및 골수 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 용도.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 조혈 간세포, 혈액세포, 백혈구, 림프구, T 세포, 종양-침윤 림프구, B 세포 및 암 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포가 조혈 간세포, 혈액세포, 백혈구, 림프구, T 세포, 종양-침윤 림프구, B 세포 및 암 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항중 어느 한 항에 있어서, 도입된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 표적 세포에서 유전자의 발현시 치료를 위해 충분한 양으로 발현되는 치료 단백질인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
  43. 제 42 항에 있어서, 단백질이 효소 또는 사이토카인인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 바이러스 벡터인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-수반 바이러스 벡터 또는 백시니아 바이러스 벡터인 조성물, 유전자 치료방법 또는 용도.
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