TWI262192B - Labeling peptide for nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells - Google Patents
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Description
1262192 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於—種鼻咽癌細胞的標記胜肽。該標 。己胜肽可被應用於做為治療癌症的化學治療藥劑引導 者，使該化學治療藥劑可準確被送至鼻咽癌細胞。 【先前技術】 對於住在南中國、台灣及新加坡的人來說，鼻咽癌 (Nasopharyngeai carcin〇ma，Npc)是一種極為常見的癌 症°其病因目W仍不甚清楚’除了遺傳及其他環境因素 :’其他如食用鹹魚與中草藥，以及長時間暴露於硫酸蒸 乱中，皆被懷疑與鼻咽癌的發生有關。此外，eb病毒亦 被認為與鼻咽癌的發生有密切的關係。 儘官放射線療法（radi〇therapy)、手術移除 removal)及化學療法㈣⑽化⑽州，已被應用於鼻咽癌治 療上有二十年以上的時間，且在一些大型醫院對局部性鼻 咽癌晚期病例治療中，五年存活率已改善至9〇%以上。然 而在-些比較病例上’其五年存活率仍低於5g%。因此， 為了有效的控制鼻咽癌，需找 來進行，例如高劑量的化學 (bone marrow stem cell)或 therapy) ° 尋並使用其他更有效的方法 療法加上注射骨髓幹細胞 疋4示的治療法（targeting 由於大部分的癌細胞通常與其原來的正常宿主細胞 具有許多共同的特徵，這使得癌細胞因缺乏其特有的分子 1262192 標的（m〇leeular urgets)，因此毒性較高的抗癌化學治療 劑^更常無法被應詩癌症的治療。大部分的抗癌化學治 療制，包含阿霉素（dt)x_biein)，被選用於對抗癌細胞時， 亦同時會導致正常組織’例如骨髓、胃腸道及毛囊㈣ follicles)的毒性增加。由於抗癌化學治療劑會對於正常电 織產生毒性的副㈣，致使其於施料必須㈣低於較適 ::的劑量，來避免正常器官的毒害反應，但這卻常會使 得最後的治療不@ ’甚i導致失敗。因&，即有人提出配 位標的（ligand-targeted)的治療法，將化學治療藥劑直接引 導至癌細胞處進行治療，以提供—種專—性的腫瘤治療方 式。如此可限制毒性治療劑對人體的影響範圍，而藉此可 供一種新的癌症治療方法。 另外，習知的化學療法常會受限於對於正常細胞的 毒性。因此若該藥劑可直接引導至腫瘤處，且遠離敏感的 正常組織時，此治療結果將會有大幅的改善。大部分的小 分子化學治療劑，一般來說皆具有大的散佈體積，但此一 現象部$使得在正常組織處因此而累積高的毒性劑量，而 使得治療效果不佳，甚至產生反效果。 為此’即有人提出，將小分子的藥物透過大分子載 體加以包裝[例如，微脂體（liposome)]，即可顯著的減少散 佈的體積’且可增加腫瘤處的藥物濃度。由此可使得藥物 的使用刮量降低，同時非專一性毒性的數量及種類亦會跟 著減少’且增加有效遞送至腫瘤的藥劑劑量。 此外’微脂體亦可保護藥物在血漿運送的過程中不 1262192 易被代謝及失活 且由於大分子傳輸或搬運穿越健康的内 f因其體積的限制而使得藥物在健康組織的累積 皮細胞 對兩性及南水溶 特徵對於保持微脂 減少。微脂體於生理溫度（37〇c)下具有 性77子相對上較不易通透的脂膜。此一 體藥物於血漿中或儲存時，藥物功效的穩定性來說是很重 要的。微脂體亦存在-内部的水性空間，其可被用於捕捉 多種的化學治療藥劑，如阿霉素(d〇x〇rubicin)或診斷染劑。 免疫微脂體（Immim〇liposomes)是一個好的載體，可 用於專一性部位的藥物遞送。早期微脂體由於會快速的被 網狀内皮系統（reticuloendothelial system)自血液循環中移 除，因此會阻止微脂體到達標的部位。為解決此一問題， 即有人提出將微脂體與多種聚乙二醇結合成包含多種聚 乙二醇（polyethylene glycol，PEG)脂質的衍生物，其可改 善循壞時間及腫瘤定位。 惟前述各種習知的改善化學治療藥劑遞送至腫瘤細 胞之方法中，雖或多或少有助於改善化學治療藥劑對=其 他正常器官的毒害，但實際臨床上的效果仍不佳。因此現 在於癌症標的治療上最重要的便是’鑑定出可用於腫瘤標 ㊁己及與腫瘤相關的配位體。其可提供腫瘤息 ^寻一性辨識並限 制毒性影響的範圍。 1262192 【發明内容】 本發明之目的係提供一種可與鼻咽癌細胞表面特異 性配位體結合的標記胜肽，藉由應用此標記胜肽’使其與 化學治療藥_結，可㈣化學治療_有效且準破的遞 送至癌細胞，以改善化學藥物治療的結果，並可降低化學 藥物治療的劑量。 本發明之另-㈣，即藉由根據本發明所指出之標 記胜肽，以供作為研製鼻咽癌早期篩檢的檢驗試劑。 為達成本發明之目的，本發明係藉由習知的噬菌體 顯現（phage-display)技術，以鼻咽癌細胞株來鑑 定並篩選出彳與其細胞表面專一性結合的嗟菌冑。經數次 的篩選（bioparming)後，可篩選分離出與鼻咽癌細胞株 Hne)具有高度專一性結合的噬菌體殖株。之後將此候選噬 菌體殖株藉由GCG軟體對插入之顯現胜肽定序並進行排 列为析’並自其中挑選出一具有與鼻咽癌、細胞專一性結合 能力的標的胜肽，在此稱為胜肽。 為證實所篩選出來之候選噬菌體殖株可與鼻咽癌細 胞專一性的結合係由於所插入之顯現胜肽來控制，因此使 用合成的L-胜肽（SEQ ID NO: 1)與^噬菌體來共同競爭 鼻咽癌細胞上相同的結合位置。結果顯示，胜肽可以抑 制L-噬菌體結合於鼻咽癌細胞的表面。此結果意味著， ㉖菌體係藉由顯現胜肽（SEq ID N〇: 1}與鼻咽癌細胞反 應，而非噬菌體本身或是此噬菌體的其他部位。 儘官L-噬菌體可專一性的與鼻咽癌細胞結合，但是 1262192 如要將其用於製備診斷試劑或其他的應用上，仍具有-些 限制口此纟a月人合成相同序列的胜肽，用以模仿噬菌 體結合的活性。並藉由；^ ^ 士 稭甶铋不有生物素的L —胜肽於活體外（以 W㈣以免疫組織化學法來確認其結合活性。結果顯示， L-胜肽可結合至鼻咽癌細胞株，且酵素連結免疫吸附分析 (EUSA)亦顯示標記生物素的L-胜肽可結合至鼻咽癌細 胞，且有劑量依存關係，而控制組胜肽則不會與鼻咽癌細 胞反應。这些結果皆支持了噬菌體顯現的L_胜肽是一種可 適用於鼻咽癌化學治療之標記導引。 此外，由於所有的化學治療劑對人體正常組織及細 胞皆具有極高的毒性，若直接注入體内將會危及正常的細 胞。因此，為避免此一情形，一般會將化學治療劑與微脂 體結合，藉由微脂體來包覆化學治療劑，以降低化學治療 劑對人體正常組織的傷害。此外，對於作為藥物遞送使用 來說，能否轉位（translocation)穿越細胞膜是报重要的，因 此胜肽可否被包入細胞内是本發明的重點。 為確認前述所指出之L-胜肽於結合微脂體後，依然 能專一性的與鼻咽癌細胞的配位體結合，因此本發明中藉 由習知的技術將L-胜肽與微脂體結合，來進行檢測其結合 活性。結果顯示，L-胜肽-微脂體（後面以L—peptide_u㈧ 簡稱）亦可專一性結合至鼻咽癌細胞表面，且可經由細胞 之胞飲作用進入腫瘤細胞的胞質中。 接著再於微脂體中填入化學治療藥物，例如阿霉素 (doxorubicin)，以製成L-胜肽-微脂體_阿霉素的複合體（後 1262192 面以L-peptide-Lipo」D〇X簡稱），同樣以上述實驗進行測 試。結果發現L-peptide-LiP〇-D〇x較微脂體-阿霉素複合體 (後面以Lip〇-Dox簡稱）對於鼻咽癌細胞有較高的毒性。此 結果意味著，L-peptide可引導Llpo_Dox至鼻咽癌細胞上。 另外’為測試 L-peptide-Lipo-Dox 於活體内（/" v,.v〇) 的反應，再藉由將鼻咽癌細胞注射至SCID小鼠體内，以
建立帶有鼻咽癌腫瘤模式的老鼠。藉由使用此一動物模式 可以測试出L-胜肽是否於活體内時仍可專一性的結合至 腫瘤。結果顯不異種移植（xen〇graft)組織較其他器官（如心 臟、肺及腦）含有較高的L噬菌體濃度，此意味著L噬菌 體具有較高的親和性與腫瘤組織結合能力，而其他正常器 官則不會肖L-噬菌體結合。此外，& L_噬菌體的免疫組 織化學法定位亦顯示L-噬菌體僅侷限於腫瘤中，而不存在 於腦、肺及心臟中。此結果亦支持菌體可專_性結合 至異種移植的腫瘤細胞上，而不會結合至正常組織及細胞 的結論。
*我們應用L-peptide_LipG_D()x作為治療實驗，結 發現其顯著的增強於鼻咽癌異種移植動物模式中的治 效果。當比較L-peptide_Llp〇_D〇x及Lip〇 D〇x對於腫: 長的影響時’結果發現經此二者處理後於腫瘤的大小及 瘤的重量上皆有明顯的不同，特別是在多次劑量處理组 48天（P < 0.001)後。於整個實驗過程中， L-PePtlde_LiP°-DGX進行處理的小鼠體重，比以Lipo—D< 處理者所產生之副作用較少，所有的小鼠均具有正常⑴ 10 1262192 重’且他們的器官皆未發生變異。 ^ 綜如上所述，本發明藉由使用噬菌體顯現胜肽庫來 師廷位於鼻咽癌細胞表面上的結合活性後，鑑定出一新穎 性的L-胜肽，其不論於活體外或活體内皆可專一性的結合 至鼻咽癌細胞表面。此外，將此胜肽被連結至包含有阿霉 素的微脂體上後，其亦可專一性的引導UP〇-Dox至鼻咽 癌腫瘤細胞的表φ，於活體内殺死鼻咽癌腫瘤、細胞而不致 產生其他的副作用。m L·胜肽是-個非常好的引導 者可用方、遞送樂物至鼻咽癌細胞，且藥物劑量可減少至 原來的五分之一。 本發明將藉由參考下列的實施方式做進一步的說 明，坆些貫施方式並不限制本發明前面所揭示之内容。熟 白本發明之技#者’可做些許之改良與修飾，但仍不脫離 本發明之範_。 【貫施方式】 本發明進行篩選之步驟，首先係將取自於噬菌體胜 肽庫（New England Biolabs，Inc Beverly，ΜA)之 12 個胺基 酸的胜肽接在噬菌體的基因m ±，以製備噬菌體顯現之 胜肽庫。經由五回的篩選（biGpanning)後，可蒒選分離出 專f生口率較最初南4〇倍的嗟菌體（參閱第一圖）。 刀別比李乂選自結合至鼻咽癌細胞及正常細胞的噬菌 體殖株，#由酵素連結免疫吸附分析法（ELISA)篩選出數 株可契鼻因癌細胞反應的嗟菌體殖株，之後並進一步將其 1262192 DNA定序。在這些篩選出的噬菌體殖株中插入的DNA片 段係包含36個核苷酸，可進一步轉譯成12個胺基酸。藉 由使用GCG軟體對前述經篩選得之噬菌體顯現胜肽序列 進行排列分析，其中有九個具有一致的脯胺酸（Pr〇)殘基， 這九個中有五個顯示有一致的胺基酸殘基，即白胺酸（Lw) 及脯胺酸，有兩個顯示具有相同的白胺酸_脯胺酸_酪胺酸 (Leu-Pr〇-Tyr)序列（SEq m NO : 2)，如表一所示。 接著使用免疫組織化學法驗證九個候選噬菌體殖株 分別對於鼻咽癌細胞株、其他癌細胞株、人類鼻黏膜細胞 及纖維母細胞的結合專—性。結果發現九個㈣體殖株的 細胞結合專一性差異非常的大’如表二所示。纟中，以編 號"9 (之後稱之L_噬菌體)的噬菌體殖株與所有受測的 鼻咽癌細胞株結合的專一性最佳，浐 于I取1土艳些叉測的鼻咽癌細胞 株包含NPC-TW 01細胞（來閱第—同Δ、 χ 阅弟—圖 A)、npc-cgbm-1 細胞（參閱第二圖B)及其他鼻咽癌％
ΤΓ 、、、、田胞株，例如Npc_TW 為進一步確認菌體不但可專-性的結合至鼻咽 癌的培養細胞株，亦可專一性的結 至"3癌的切片腫瘤 細胞，將L-噬菌體進一步與鼻咽癌 應。結果顯示，L-噬菌體確實 〜切片-起反 第二圖…不會結合至其他二胞至^ 胞株（參閱第二圖D)及子宮頸癌細胞 ^如口心癌細 與正常的鼻黏膜細胞結合(參閱第二目二閱弟二圖E)’或 嗟菌體並不會結合至NPC_TW ° 。但是控制組的 細胞株（參閱第二圖C) 12 1262192 及鼻咽癌檢體切片的細胞上(卜參閱第二圖Η)。 為進步確遇L-嗟菌體中顯現胜肽的序列（seq id NO : 1)的確是可與NP〇TW 04細胞表面反應。發明人利 用生物素標記的L-胜肽與人類癌細胞或正常細胞的專一 性結合情形進行檢驗。結果顯示，鼻咽癌細胞株，包含 NPC-TW 04、07及NPC-CGBM-1存在有專一性的反應產 物（芩閱第三圖A、B、C :箭頭處），顯示L-胜肽可與鼻咽 癌細胞專一性的結合。而口腔癌細胞株SAS (第三圖D)、 正常上皮細胞（第三圖E)，及纖維母細胞（第三圖J7)則不會 與生物素標記的L -胜肽反應。此外，生物素標記的控制組 胜肽亦不具結合活性。 另外，為檢測L-胜肽是否可被鼻咽癌細胞藉由胞飲 作用使L-胜肽進入鼻咽癌細胞内，以及是否具有結合至位 於細胞膜上標的蛋白抗原決定部位的能力，在此藉由免疫 螢光顯微鏡來分析L-胜肽-微脂體與鼻咽癌細胞結合情 形’以及是否能進入至鼻咽癌細胞。其係先將NPC-TW 04 細胞與封裝有螢光試劑（HPTS)的L_胜肽微脂體（在此簡稱 L-peptide-Lipo-HPTS)或封裝有螢光試劑（HPTS)的微脂體 (在此簡稱Lipo-HPTS)，於4°C或37°C下共同培養90分 鐘。結果顯示，於4°C下經處理90分鐘後，螢光標示位於 細胞表面（第四圖A)，但於37°C下處理90分鐘後，螢光 則會變得較亮且散佈於細胞質中並圍繞細胞核（第四圖 C)。但是在控制組Lipo-HPTS (第四圖B)則沒有出現螢 光，Lip0-HPTS於3 7°C會有非特異性進入細胞質，所以有 13 1262192 少量螢光出現（第四圖D)。這些數據強烈支持 L-peptide-Lipo-HPTS可被藉由胞飲作用進入細胞質並停 留於其中。 在細胞毒性分析方面，將NPC-TW 04細胞以 L-peptide-Lipo-Dox 處理 3、6、9、24、48 及 72 小時，並 以 MTT [3-(455-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]分析其細胞數量。結果顯示，當同樣 以500 ng/ml阿霉素處理48小時後，L peptide丄ip〇_D〇x (54 %)較Lipo-Dox (67 %)對於NPC-TW 04細胞有較強的 細胞毒性。 為確認活體中L-噬菌體的標記情形，在此係將1〇9
Pfu L-噬菌體經由尾巴靜脈注射注入小鼠體内，以產生由 NPC-TW 04細胞衍生的腫瘤。之後測定位於腫瘤塊及其他 為B的噬菌體濃度。結果顯示，L —噬菌體可特殊聚集於腫 瘤塊中，因其位於腫瘤塊的濃度較其他器官（包含腦、肺 及心臟）高約十倍（第五圖A)，而其他不相關的噬菌體 (R3 17)或控制組的噬菌體則顯示不具特殊聚集於腫瘤塊 ，犯力。另由結果中可知，肖L_噬菌體同時注入的合成游 離L-胜肽，會減少自腫瘤塊回收l_嗟菌體的數量，因此 I-重菌體對腫瘤導向亦會專_性的被L_胜肽所抑制。（第 五圖B) 為進一步確認鼻咽癌腫瘤引導胜肽（L_胜肽）可被用 =改善癌症化學治療的治療效果。在此亦將其與阿黴素結 合後注入如前所述步驟準備的8(：11)小鼠動物模式。 1262192 經過叶天後’小鼠會長出大小相當於由NPC-TW 04 細胞所形成的腫瘤（約50 mm3)，之後隨機安排至不同的處 理組（4〜9隻/組）。分別注入L_peptide_Lip〇_D〇x及 Lipo-Dox或磷酸鹽緩衝液（pbs)—次。 使用L-peptide-Lipo-Dox處理組，其腫瘤的大小會逐 漸變小，且顯著的較Lipo-Dox組及PBS組為小（p< 0.05)。 而L-peptide-Lipo-Dox處理組其腫瘤重量也有顯著的下 降。 另以多次給藥方式，將藥劑分成五次注入，使其最 後注入之總阿彳赦素劑量為5mg/kg。 結果顯示，L-peptide-Lipo-Dox處理組其腫瘤大小顯 著的較Lipo-Dox組及PBS組為小（ρ< 〇·〇〇ΐ)(第六圖a、 B)。且以L-peptide-Lipo-Dox處理組其腫瘤塊亦呈現較小 的體和及重置（弟六圖A及B)。這些結果支持， L-peptide-Lipo-Dox較Lipo-Dox可更有效的抑制腫瘤的成 長。 貫施例一 於活體外藉由㉟囷體顯現胜肽庫篩選（bi〇panning)可與鼻 咽癌細胞結合的喔菌體 於本發明中係採用12個胺基酸長度的隨機胜肽庫進 行篩選。其係將5x106鼻咽癌細胞株（NPC-TW 04)及正常 鼻黏膜細胞株（NNM-13)放置於直徑10公分的培養盤上。 於進行篩選前，先將培養液更換為含有p/q]BSa的5毫升 1262192 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)培養基，再將 培養盤置於4°C下30分鐘。接著於4°C下培養於含有 5 χΙΟ12 pfu經紫外線處理失活的控制組噬菌體於NNM-13 細胞及NPC-TW 04細胞。之後將5xl01() pfu的M13噬菌 體胜肽庫 PhD-12(New England BioLabs，MA)加入。經以 NNM-13細胞於4 °C下篩除三次每次 1小時後，再以 NPC-TW 04細胞進行篩選。噬菌體可藉由以冷的磷酸鹽緩 衝溶液（簡稱PBS)沖洗三次後再以2毫升的溶解緩衝液來 加以回收，在此去除可與NNM_ 1 3細胞結合的噬菌體。噬 菌體可進一步藉由 Escherichia coli ER2537 (New England BioLabs，MA)來增殖。將此回收的噬g體再與NPC-TW 04 的細胞反應進行篩選，以去除無法結合至NPC-TW 04細 胞的噬菌體，重複此一步驟進行五回。藉此即可篩選出可 與NPC-TW 04細胞專一性結合的候選噬菌體。 實施例二 篩選出可與鼻咽癌細胞反應的噬菌體殖株及DNA定序 將NPC-TW 04細胞塗佈於96孔的酵素連結免疫吸 附分析（ELISA)盤上過夜，以不含血清的DMEM清洗兩 次，再以阻隔緩衝液（blocking buffer，含有1 % BSA的不 含血清DMEM)於37°C下反應30分鐘。 取實施例一中筛選出的嗟菌體1 〇9 pfu加入上述培養 盤中，於4°C下培養2小時。之後再以冷的PBS及以阻隔 緩衝液稀釋成1 : 1 〇〇〇的結合辣椒根過氧化酶的抗噬菌體 16 1262192 M13 抗體溶液[horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-bacteriophage M13 antibody] (Pharmacia, Sweden)沖 洗三次，於4°C下培養1小時。 以冷的磷酸鹽緩衝溶液沖洗三次，再以過氧化酵素 基質鄰-苯二胺二鹽酸鹽（0_phenylenecJiamine dihydrochloride，Sigma, Germany)進行培養。最後加入 3N HC1中止反應，以酵素連結免疫吸附分析讀取儀測定 49〇nm的吸光率（absorbance)，自其中篩選出與鼻咽癌細胞 專一性結合較高者。 將前述所挑出之噬菌體殖株，經增殖後以1 /6體積比 的聚乙二醇/氯化鈉[20% (w/v) PEG-8000 and 2.5 M NaCl] 沉澱。將此沉澱之噬菌體顆粒（phage pellet)再懸浮於1〇〇μ1 峨化物緩衝液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0, 1 mM EDTA，4 Μ
Nal)中，加入25〇 μΐ乙醇，並於室溫下培養1〇分鐘。 之後以12,000xg離心1〇分鐘，以使噬菌體之dna 自嗤菌體顆粒中分離出來，以70%乙醇清洗後，經乾燥， 再溶解於50μ1的蒸餾水中。 此純化的噬菌體株，其DNA序列可使用自動dna 疋序儀（ABI PRISM 377, Perkin-Elmer，CA，USA)，以雙去 氧核醣核酸鏈停止法（dideoxynucle〇tide chain teminati⑽ method)來定序。噬菌體的顯現胜肽序列再藉由gcg程式 轉譯及排序。 在廷些篩選出的噬菌體殖株中插入的DNA片段係包 含36個核苷酸，其可轉譯成12個胺基酸。藉由使用gcg 1262192 軟體對噬菌體顯現胜肽序列進行排列比對後，發現其中有 九個顯現胜肽皆具有一樣的脯胺酸（pr〇)殘基。而這九個中 有五個存在有相同的胺基酸殘基序列，白胺酸（Lell)及脯胺 酸’有兩個顯示具有相同的白胺酸-脯胺酸-酪胺酸 (Leu-Pro-Tyr)序列（SEQ ID NO : 2)，如表一所示。 實施例三 專一性噬菌體及結合分析 將受測之癌症細胞株、正常鼻上皮細胞（nasal epithelia)及纖維母細胞（fibroblasts)塗佈在蓋玻片上，且培 養至80%細胞密度（confluence)。將此蓋玻片以DMEM(無 血清）培養基清洗兩次後，於4°C下培養於含有1〇" pfu經 紫外線處理失活的控制噬菌體之阻隔緩衝液中3〇分鐘。 之後再以PBS沖洗兩次，並以1%過氧化氫於4°c下處理 1 〇分鐘，再以冷的PBS潤洗。 取109〜101G pfu純化的噬菌體（包含L-噬菌體）加入每 個含有阻隔緩衝液的蓋玻片上，於4艺下培養1小時。再 以冷的填酸鹽緩衝溶液清洗三次，再加入具有HRP標記 以阻隔缓衝液稀釋成l/50(v/v)的老鼠抗M13單株抗體溶 液，於4°C下1小時。 蓋玻片再以冷的石粦酸鹽緩衝溶液清洗三次，以3 〇/0曱 醛（以磷酸鹽緩衝液配製）固定後，以冷的鱗酸鹽緩衝溶液 潤洗兩次。將蓋玻片放入〇·〇5%鹽酸二氨基聯苯胺 (3,3，-(11&111111〇561121(^116-4 11(111!>〇八8 5〇1111:1〇110117.4)溶液 1262192 (以0.2M Tris-HCl缓衝液配製）中5分鐘，再轉移至含有 0.01 %過氧化氫的鹽酸二氨基聯苯胺溶液中40秒，以磷酸 鹽緩衝溶液清洗，最後放置於含有50%甘油的磷酸鹽緩衝 溶液中。 經測試後，前述九個候選噬菌體殖株的細胞結合專 一性差異非常的大，如表二所示。其中，編號卜29 (L-噬 菌體）的噬菌體殖株有專一性，能與所有受測的鼻咽癌細 胞株結合，這些受測的鼻咽癌細胞株包含NpC>TW 01細 胞株（參閱第二圖A)、NPC-CGBM-1細胞株（參閱第二圖 B)及其他鼻咽癌細胞株，例如NPC_TW 03及04。而其他 的嗟菌體殖株專一性結合的情形較噬菌體差。 實施例四 標記生物素的L_胜肽對於鼻咽癌細胞株的專一性結合
先將鼻咽癌細胞培養於蓋玻片上，再將此蓋玻片以 不含血清的的DMEM培養基清洗兩次，之後培養於阻隔 緩衝液中，於37°C下30分鐘。再以冷的pBS清洗兩次， 並以1%過氧化氫於4t:下處理10分鐘，及冷的？63潤》: 分別取1〇μ1的預先標記生物素的L_胜肽（簡稱 Bi〇tin-L-peptide)及預先標記生物素的控制組胜肽（簡稱 biotin control-peptlde)加入前述的蓋玻片上，於4它下 持1小時’並以冷的PBS清洗兩次。 將此盍破片進一步加入以阻隔緩衝液稀釋成丨··50 的山羊抗生物素抗體（Vector，CA)溶液於4。口培養】小 19 1262192 時’再以冷的PBS清洗兩次。 加入以阻隔緩衝液稀釋成1 :丨00生物素標記的 (biotinylated)馬抗山羊抗體（Vector，CA)溶液，於4T：下培 養1小時，再以冷的PBS清洗兩次。 與卵白素-生物素-或氧化酵素（avidin-biotin -peroxidase)複合試劑（ABC kit· Vector，CA)反應 30 分鐘， 固定於含有3 %仲甲駿（paraformaidehyde)的PBS中1 0分 鐘，清洗並浸潰於二胺基聯苯胺（3.3，-Diamino benzidine， DAB)溶液中5分鐘，再移至含有o.oi%過氧化氫的二胺基 聯苯胺溶液中40秒，以PBS清洗並放置於含有50%甘油 的PBS中。 結果顯示，鼻咽癌細胞株（包含NPC-TW 04、07及 NPC-CGBM-l)^在專一性的反應產物（參閱第三圖A、b、 C :箭頭處），而口腔癌細胞株SAS (第三圖D)、正常上皮 細胞（第三圖E)，及纖維母細胞（第三圖F)則無。亦即鼻咽 癌細胞株可與有生物素標記的L-胜肽反應，而口腔癌細胞 株SAS、正常上皮細胞及纖維母細胞則不會與其反應。 實施例五 結合微脂體的L-胜肽之結合專一性 藉由逆相蒸發製備小的單層微脂體（Small unilamellar vesicles)。將 EPC、膽固醇及 PEG-DSPE (含有 20%NHS-PEG3400-DSPE或不含）依2: 1 : 0.2之比例反覆 的擠壓依序通過0·1 μηι及0 · 〇 5 μπι的聚碳酸醋過濾膜，再 20 1262192 將3 0 mM HPTS裝入微脂體中，再將L-胜肽結合至微脂體 上0 將鼻咽癌細胞分別於4°C或37°C與稀釋於每1 00ml 培養基含有53pg胜肽之生長培養基之包裹HPTS的L-胜 肽微脂體（L-peptide-Lipo-HPTS)或微脂體（Lipo-HPTS)培 養90分鐘。經處理後，將細胞以螢光染色劑（Hoechst 33258) 染色後計數。未結合之微脂體以冷的PBS清洗3次後會被 移除’再將其放置於安置溶液（mounting solution，Vector， CA)中。最後藉由免疫螢光顯微鏡（Leica um)來分析胜 肽-微脂體結合及吞噬至鼻咽癌細胞内。 結果顯示，於4°C下經處理90分鐘後，螢光係位於 細胞表面（第四圖A)。而於37°C下處理90分鐘後，則螢 光會變得較亮且散佈於細胞質中，並圍繞著細胞核（第四 圖C)。但是在Lipo-HPTS組（第四圖B，D)卻沒有螢光。這 些數據強烈支持L-peptide-Lipo-HPTS可被藉由胞飲作用 進入細胞質並停留於其中。 實施例六 取體重約18〜22公克，8〜10週齡的SCID小鼠（取自 國立台灣大學醫學院動物中心），注入1χ1〇?鼻咽癌細胞 (NPC-TW 01)。1〜2週後，老鼠會長出大小適中由鼻咽癌 細胞（NPC-TW01)所產生的腫瘤（直徑約〇乃〜丨公分），自尾 巴血管注人1〇9pfuL_嗤菌體或控制組嗤菌體。注入Η 分鐘後，以乙㈣dlethyl ether)使其麻醉。然後將老鼠灌注 21 1262192 5〇ml的PBS以洗去未結合的嗟菌體，並將其器官及腫瘤 移除，秤重，及以PBS_PI (蛋白酶抑制劑，Roche，Germany) (10 ml PBS/ one tablet)清洗。將此器官及組織樣本均質， 亚於37°C下培養於〇.5mi隔夜培養基RE2738細菌4〇分 4里以冲洗專一性反應嗟菌體顆粒。經沖洗後的嗟菌體顆 粒以LB培養基稀釋幻〇2〜1〇6 _，並放置於存在有 lmg/LIPTG/X_ge丨的洋菜培養盤上。經i2〜i6小時後計 异其菌洛數。在胜肽抑制實驗中，係同時注入丨〇9 的 囷體及1〇〇μ§的胜肽，控制組係使用無關的噬菌體 R3-17 (其顯現的胜肽序列為tlaTTASPDSAQ)。 結果顯不，L-噬菌體可引導至腫瘤塊，因其位於腫 瘤塊的濃度較其他器官（包含腦、肺及心臟）高十倍（第五圖 Α) ’而其他播關的嗟菌體（R3-1 7)或控制組的嗟菌體則顯示 不具導引至腫瘤塊的能力。由於與L_噬菌體同時注入的合 成游離L-胜肽’會抑制自腫瘤塊回收l —噬菌體量，因此 L-兔菌體的腫瘤導引亦會專一性的被配位體抑制。（第五 圖B) 實施例七 取lxlO7 NPC-TW 01鼻咽癌細胞注入老鼠中，1〇天 後老鼠會長出大小適中由鼻咽癌細胞（NPC-TW 01)所產生 的腫瘤，將這些老鼠隨機安排至不同實驗組中。之後分別 自老鼠尾巴一次注入（5 mg/kg)或分成五次注入（每次1 mg/kg)含有阿黴素的 L-peptide-Lipo-Dox 或 Lipo-Dox (4-5 22 1262192 又/每組）進行處理，使其注入之阿黴素總量為5 mg/kg。控 制組則注入相同體積不含有L-peptide-Lipo-Dox的磷酸鹽 緩衝/谷液（PBS)。每週測定兩次老鼠體重及腫瘤大小。腫 瘤體積的計算係藉由下列公式來計算： 腫瘤體積二長度χ(寬度）2χ0.52 48天後’將所有老鼠犧牲後，將其腫瘤移除並秤重 之。平均腫瘤體積及腫瘤重量的差異藉由Student，s t-test 進行計算。 於一次給藥實驗中，L-peptide-Lipo-Dox處理組的腫 瘤會逐漸變小，且顯著較Lipo-Dox組及PBS組為小（p < 〇·〇5)。而以L-peptide-Lipo-Dox處理組其腫瘤重量也有顯 著的下降。 在夕久給樂貫驗中’ L-peptide-Lipo-Dox處理組的腫 瘤大小，顯著較Lipo-Dox組及PBS組為小（p < 〇 〇〇ι)(第 /、圖A、B)。且L-peptide-Lipo-Dox處理組的腫瘤塊亦呈 現較小的體積及重量（表三）。這些結果顯示， L-peptide-Lipo-Dox較Lipo-Dox可更有效的抑制腫瘤的成 長。 23 1262192 表一對由NPC-TW04鼻咽癌細胞篩選出的噬菌體顯現胜肽 序列之排列分析
嗟菌體殖株 噬菌體顯現胜肽序列a 1-19 FPSKTGAFVPFS 卜35 NNSQKPAPVSPF 1-31 TKNMLSLPVGPG 1-8 RHLPTLFAPTPT 1-37 QLSPVLARHNIS 1-39 PRGVWTTMSLPH 1-18 LPLTSLMPLGLH 1-44 SVSLPYANLATH 1-29 (L-噬菌體） RLLDTNRPLLPY 噬菌體顯現相同的胺基酸以粗體字表示。
24 1262192 25 PND :>^M;( + + + )：^iis#ui^40〜60%;(++)：^iislui^30io%;( + + /+)：^its^礴鉍 20 〜3 0% ; (+) ：^r>s #Ui 鉍 一〇〜20% ;(之-)：％論 s 鱗Ut 鉍 5〜10% ; (-) ：^iisiut 贫琴 5%。 ΝΡΠ丨 TW01 +/. + + + Nipo-TW 03 ND 2D — Npn-TW 0仁 ++/+ ++、+±· Npn-nG-BM-1 ,^D +/ — ZD ++ § +++ ++ ++ + + + + /+ + +
+ + NfD ί 2D + + + MD 1丨8 一丨一一 1—18 ++ +++ +++ ++ ++ + + + /丨 + + + + + /- + /丨 1丨19 1-29 737 (L-成顾鎭) 一丨39 1丨41 1么4 ^»趨 1262192 【圖式簡單說明】 第一圖為藉由噬菌體顯現胜肽庫以NPC-TW04鼻咽癌細 胞進行五回的篩選，以找出可與其專一性結合的 噬菌體，每回回收之噬菌體數量分析圖。 第二圖為候選噬菌體於鼻咽癌細胞株及其組織切片樣本 上的免疫定位結果顯微照相圖。 A ··以L-噬菌體處理的NPC-TW01鼻咽癌細胞； B :以L-噬菌體處理的NPC-BM-1鼻咽癌細胞； C :以控制組噬菌體處理的NPC-TWO 1鼻咽癌細 胞； D :以L-噬菌體處理的Ca9-22 口腔癌細胞株； E :以L-噬菌體處理的CaSki子宮頸癌細胞株； F :以L-噬菌體處理的正常鼻黏膜細胞；
G :結合至鼻咽癌細胞組織切片的L-噬菌體；及 Η :結合至鼻咽癌細胞組織切片的控制組噬菌體； 第三圖為L-胜肽於不同癌症細胞株上的免疫定位顯微照 相圖。 A : NPC-TW04鼻咽癌細胞株； B : NPC-TW07鼻咽癌細胞株； C : NPC-CGBM-1鼻咽癌細胞株； D : 口腔癌細胞株（SAS); E ··正常鼻黏膜細胞株（NNM);及 F :纖維母細胞株。 第四圖為L-胜肽-微脂體-HPTS複合體於鼻咽癌細胞上 26 1262192 之免疫螢光染色顯微照相圖。 A ••於4°C下處理90分鐘； B .控制組（微脂體-HPTS複合體）於4°C下處理9〇 分鐘； C :於37°C下處理90分鐘； D ·控制組於3 7 C下處理9 0分鐘。 為自SCID小鼠所生成之鼻咽癌異種移植腫瘤上 及正常為'官中’回收的L-嗟菌體數量比較圖。 為SCID小机所生成之异咽癌異種移植腫瘤以 第五圖 弟六圖 胜肽-微脂體-阿黴素複合體（L-peptide-Lipo-Dox) 處理後之結果統計圖。 A :腫瘤大小；B :腫瘤重量。
27 1262192 序列表 <丨丨（) > 吳漢忠 < 1 2 0 > —種鼻咽癌細胞的標記胜肽 <16 0 > 2 <210> 1 <2 1 1 > 1 2 <2 12>PRT <2 1 3>人工序列 <220> <223 >可與鼻咽癌細胞表面專一性結合之標記 胜肽 <400> 1 Arg Leu Leu Asp Thr Asn Arg Pro Leu Leu
Pro Tyr 12 <210>2 <211>3 <2 1 2> PRT <2 1 3>人工序列 <220> <223>可與鼻咽癌細胞表面專一性結合之標記 胜肽 <400>2 Leu Pro Tyr 36
Claims (1)
1262192 ^ ί ' iLj\JL 4 r'\〇 . i 拾、申請專利範圍： ί—一—1 : 1· -種鼻咽癌細胞的標記胜肽’其具有一如seqidn〇: 1所示之胺基酸序列，該胺基酸序列能與鼻咽癌細胞表 面之配位體專-性結合，而不會與正常組織細胞反應。 2.如申請專利範圍第丨項所述之標記胜肽，其中該標記胜 肽與化學治療藥物連結後’具有料該化學治療藥物至 腫瘤細胞的能力。 3.如:請專利範圍第2項所述之標記胜肽，其中該化學治 療藥物包含阿黴素（doxorubicin)。 4·如申請專利範圍第i項所述之標記胜肽，其中該標記胜 肽與微脂體連結後，可引導該微脂體至該鼻咽癌細胞 處。 5.如申請專利範圍第4項所述之標記胜肽，其中該微脂體- 中含有該化學治療藥物。 _ 6· ^申請專利範圍第4項所述之標記胜肽，其中該微脂體 旎經由該鼻咽癌細胞的胞飲作用進入該鼻咽癌細胞中。 7.如申請專利範圍第丨項所述之標記胜肽，其中該標記胜參 肽可應用於作為偵檢試劑的開發。 8· —種用以殺死鼻咽癌細胞的化學治療藥物複合體，其包 含一導引者，可引導該化學治療藥物至該鼻咽癌細胞表 面，其中该導引者具有一胜肽，且該胜肽具有如SEQ ID N〇 : 1所示之胺基酸序列。 9·如申請專利範圍第8項所述之化學治療藥物複合體，其 中孩化學治療藥物複合體進一步包含一微脂體。 28 1262192 1 〇·如申請專利範圍第8或9項所述之化學治療藥物複合 體’其中邊化學治療藥物複合體能經由該鼻咽癌細胞的 胞飲作用進入該鼻咽癌細胞中。 U•一種核苷酸序列，其可轉譯成一具有如SEQ ID N〇 : 所示之胺基酸序列。 申叫專利範圍第11項所述之核苷酸序列，其中該胺 基酸序列可專—性的與鼻咽癌細胞表面結合。
29
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