TWI243901B - Analysis method of macromolecule using laser ablation and system of the same - Google Patents

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1243901 九、發明說明： L發明戶斤屬之技術領域3 發明領域 本發明係有關於一種使用雷射燒灼之高分子之分析方 5 法及其系統，更詳而言之，乃有關於一種可較習知更顯著 提升分析效率之使用雷射燒灼之高分子之分析方法及其系 統，舉例言之，即有關於一種適用於DNA、蛋白質、RNA、 PNA、脂質、糖等各種高分子之質譜分析的使用雷射燒灼 之高分子之分析方法及其系統。 10 【先前技術】 發明背景 【習知技術】 近年，質譜法之應用範圍由物理或化學之領域急速擴 張至醫學或生化學等生命科學之領域。特別是，蛋白質分 15 子量之判斷分析或胺基酸排列之判斷分析等發展更令人驚 異。 該質譜法之原理，係以各種方法將試料離子化後，再 將經離子化而得之離子依質量/電荷而分離，並測定分離後 之各離子之強度。 20 而，習知之高分子之質譜分析，係於高分子本身附加 電子而加以離子化，並解析其質量，或將高分子量之分子 碎化為低分子量之分子離子後再進行質譜分析，以對構成 分子加以比較。 於此，習知之高分子之質譜分析中之離子生成方法， 1243901 舉例言之，已知有令高能量原子離子碰撞高分子而將其離 子化之2次離子質譜法（SIMS)，或藉電子撞擊而碎化為低 分子量之分子離子後再進行質譜分析之電子撞擊游離法 (EI)、基質輔助雷射脫附游離質譜法（MALDI)等。 5 然而，上述任一方法中皆有問題點產生，例如為對高 分子離子進行質譜分析而需設置一具高解析能力之質譜分 析裝置，或中途分解生成之碎體離子之存在造成質譜之解 析困難等。 此外，以往於化學分析時以同位素標記之高分子試料 10 之質譜分析方法，已知有藉奈秒(nano-second ; 10_9秒）雷射 而進行原子化及離子化之雷射原子化共振離子化法 (LARIMP )。 然而，若依據該LARIMP法，則雷射需一用以使標記元 素原子化之原子化雷射與一用以使原子化後之標記元素之 15 原子行離子化之共振離子雷射等2台雷射，因此有系統構造 複雜之問題點。 進而，LARIMP法中，需如前述般令標記原子加以共振 游離。因此，則產生需對各標記原子照射固有波長之雷射 光，並於混有多種標記同位素之狀態下極難進行高效率之 20 分析之問題點。 【發明内容】 發明概要 【本發明欲解決之課題】 本發明乃有鑑於前述習知技術中之各種問題點而產生 1243901 者，其目的即在於提供一種使用雷射燒灼之高分子之分析 方法及其系統，係可使構成高分子之構成原子生成原子離 子，並對生成之原子離子加以分析者，即一種不需具高解 析能力之分析裝置之使用雷射燒灼之高分子之質譜分析方 5 法及其系統。更詳而言之，即提供一種於進行質譜分析時， 無質譜解析困難之虞，且質譜分析裝置不需具備高解析能 力之使用雷射燒灼之高分子之質譜分析方法及其系統。 又，本發明之目的並在於提供一種使用雷射燒灼之高 分子之分析方法及其系統，係可以1台雷射同時完成構成 10 高分子之構成原子之原子化與離子化，而可使系統構造大 幅簡化者。 進而，本發明之目的並在於提供一種縱使於混有多種 標記同位素之狀態下仍可進行有效率之分析之使用雷射燒 灼之1¾分子之分析方法及其糸統。 15 【用以解決課題之方法】 為達成上述目的，本發明之使用雷射燒灼之高分子之 分析方法及其系統，係藉由以超短脈衝雷射光燒灼如 DNA、蛋白質、RNA、PNA、脂質、糖等各種高分子，而 使該等高分子經原子電離後生成原子離子，並對生成之原 20 子離子加以分析者。藉此，即可進行各種高分子之化學分 析。 即，依據本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析方法 及其系統，則可藉由以超短脈衝雷射光燒灼高分子，而將 高分子分散分解並使構成該高分子之各原子一一原子化， 1243901 同時將業經原子化之原子電離成1價之離子，並可籍由分 析該經電離生成之原子離子而進行定量分析。 因此，本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析方法及 其系統，於進行質譜分析時可對低質量之原子離子進行質 5 譜分析，而不僅無質譜解析困難之虞，且質譜分析裝置不 需具備高解析能力。 又，依據前述本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法及其系統，則可藉由以超短脈衝雷射光燒灼高分子， 而有效率地進行高分子之原子化，同時並使業經原子化之 10 原子電離成一價之離子。因此，將可使系統構造簡化，並 由於化學分析時可同時使用多種標記元素，而可使解析效 率顯著提升。 即，由於本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析方法 及其系統，係可以1台超短脈衝雷射同時進行標記元素之 15 原子化與離子化，故可使系統構造大幅簡化。 進而，由於前述離子化乃依超短脈衝雷射光之最大強 度而隨非共振過程進行之游離作用（非共振游離），因此於 混有多種標記同位素之狀態下仍可使各標記原子分別離子 化，且容易應用於多標記類，並可進行高準確度且高效率 20 之高分子分析。 因此，本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析方法及 其系統，極適用於今後重要性將與日倶增之基因表現量之 定量分析等領域上。 即，本發明中第1形態之發明乃一種使用雷射燒灼之 1243901 高分子之分析方法，係藉由對分析對象之高分子照射雷射 光而燒灼該高分子，以使高分子原子化成構成元素，並將 業經原子化之構成元素離子化，再加以分析業經離子化之 構成元素者；而，用以照射分析對象之高分子，並燒灼該 5 高分子之雷射光係超短脈衝雷射光；且，藉由以該超短脈 衝雷射光照射分析對象之高分子而燒灼該高分子，而於使 該高分子原子化成構成元素之同時並使之離子化，且分析 業經離子化之構成元素。 於此，前述分析係可舉質譜分析為例，而質譜分析以 10 外之分析，具體而言，可舉化學性分析（通常謂之化學分 析）或光學性分析（螢光法等）為例。 又，本發明中第2形態之發明乃如本發明第1形態所 載之發明，其中該分析對象之高分子係業經固相化者。 又，本發明中第3形態之發明乃如本發明第2形態所 15 載之發明，其中該高分子之固相化方法，係包含有一藉由 在基板上滴下分析對象之高分子溶液並加以乾燥，而使之 固相化之過程者。 又，本發明中第4形態之發明乃如本發明第3形態所 載之發明，其中該基板係固體，且該固體之導熱率在 20 0.1W · m_1 · K_1 以上。 又，本發明中第5形態之發明乃如本發明第1形態所 載之發明，其中該分析對象之高分子係附有元素標記者。 又，本發明中第6形態之發明乃如本發明第5形態所 載之發明，其中該元素標記係週期表中之IA族元素。 1243901 又，本發明中第7形態之發明乃如本發明第5形態所 載之發明，其中該元素標記係週期表中之VIA族元素。 又，本發明中第8形態之發明乃如本發明第5形態所 載之發明，其中該元素標記係週期表中之WA族元素。 5 又，本發明中第9形態之發明乃如本發明第5形態所 載之發明，其中該元素標記係週期表中之過渡金屬元素。 又，本發明中第10形態之發明乃如本發明第5形態所 載之發明，其中該元素標記係穩定同位素標記。 又，本發明中第11形態之發明乃如本發明第1形態所 10 載之發明，其中該用以照射分析對象之高分子並燒灼該高 分子之超短脈衝雷射光，係脈衝時間寬度在10微微秒 (picosecond ; 1(Γ12秒）以下，且最大輸出功率在10兆瓦以 上者。 又，本發明中第12形態之發明乃如本發明第11形態 15 所載之發明，其中該用以照射分析對象之高分子並燒灼該 高分子之超短脈衝雷射光，係脈衝時間寬度在1飛秒(fs ; 1(Γ]5秒）以上且在1微微秒以下，而最大輸出功率在1千兆 瓦以上且在10千兆瓦以下者。 又，本發明中第13形態之發明乃如本發明第1至12 20 形態中任一項所載之發明，其中該業經離子化之構成元素 之分析係質譜分析。 又，本發明中第14形態之發明乃如本發明第13形態 所載之發明，其中該質量分析係飛行時間法之質譜分析。 又，本發明中第15形態之發明乃如本發明第1形態所 10 1243901 載之發明，其係同時分析業經離子化之多數構成元素。 又，本發明中第16形態之發明乃如本發明第1至15 形態中任一項所載之發明，其中該分析對象之高分子係固 定於DNA微陣列中之核酸或核酸之類似物。 5 另，關於核酸或核酸之類似物，具體而言，可舉DNA、 RNA、PNA 為例。 又，本發明中第17形態之發明乃如本發明第16形態 所載之發明，其中該DNA微陣列係業經多通道化之DNA 微陣列。 10 又，本發明中第18形態之發明乃如本發明第1至15 形態中任一項所載之發明，其係藉由至少使用以燒灼高分 子之短脈衝雷射光與分析對象之高分子中任一方移動，而 以用以燒灼該高分子之短脈衝雷射光無遺漏及重複地燒灼 該分析對象之高分子，以進行分析者。 15 又，本發明中第19形態之發明乃一種使用雷射燒灼之 高分子之分析系統，係藉由對分析對象之高分子照射雷射 光而燒灼該高分子，以使高分子原子化成構成元素，並將 業經原子化之構成元素離子化，再加以分析業經離子化之 構成元素者；而，該分析系統則具有：真空槽，係可於内 20 部配置標的物者；分析器，係配置於前述真空槽内者；及， 超短脈衝雷射，係用以射出超短脈衝雷射光並朝配置於前 述真空槽内之標的物照射者。 又，本發明中第20形態之發明乃如本發明第19形態 所載之發明，其進而具有一用以於前述真空槽内移動標的 1243901 物之移動機構。 又，本發明中第21形態之發明乃如本發明第20形態 所載之發明，其中該用以移動標的物之移動機構係一用以 旋轉標的物之旋轉機構。 5 又，本發明中第22形態之發明乃如本發明第19形態 所載之發明，其進而具有一用以移動超短脈衝雷射光對標 的物之照射位置之移動機構。 又，本發明中第23形態之發明乃如本發明第19形態 所載之發明，其中該分析器係質讀儀。 10 又，本發明中第24形態之發明乃如本發明第23形態 所載之發明，其中該質譜儀係四極質譜儀。 又，本發明中第25形態之發明乃如本發明第23形態 所載之發明，其中該質譜儀係飛行時間質譜儀。 又，本發明中第26形態之發明乃如本發明第23形態 15 所載之發明，其中該質譜儀係離子迴旋型傅立葉轉換質譜 儀。 又，本發明中第27形態之發明乃如本發明第19形態 所載之發明，其中該超短脈衝雷射係用以照射依脈衝時間 寬度在10微微秒以下，且最大輸出功率在10兆瓦以上之 20 短脈衝雷射光者。 又，本發明中第28形態之發明乃如本發明第26形態 所載之發明，其中該超短脈衝雷射係用以照射依脈衝時間 寬度在1飛秒以上且在1微微秒以下，而最大輸出功率在1 千兆瓦以上且在10千兆瓦以下之短脈衝雷射光者。 12 1243901 於此，本發明中藉由超短脈衝雷射光燒灼高分子時， 對高分子照射i束(shot) (!脈衝）超短脈衝雷射^刀即足=’。 但，亦可對高分子照射多束（多數脈衝）之超短脈衝雷射 光’且只需對用以照射高分子之超短脈衝雷射光之發射數 5 (脈衝數）加以適當選擇即可。 又，該超短脈衝雷射宜使用脈衝時間寬度在1〇微微秒 以下者，又特別以使用在】飛秒以上且在i微微秒以下: 通常稱做飛秒雷射之雷射更為適當。其最大輸出功率宜在 兆瓦以上，而又以在丨千兆瓦以上且在1〇千兆瓦以下者 10 特別理想。 若超過該範圍將大量生成多價離子，而使質譜之解析 產生困難，若低於此則使原子化及離子化之效率下降，以 致無法觀測原子離子信號。 另，依據後述發明人之實驗，於脈衝時間寬度為110 15飛秒，且最大輸出功率為2千兆瓦時，將可致極為良好之 結果 〇 又，依據本發明，則使可有效率地同時進行原子化與 尚隹子化之飛秒雷射光等超短脈衝雷射光，照射於以同位素 軚5己之高分子試料上。因此，無須對標記元素選擇性地進 20仃離子化，並可使用各種標記元素。且，由於可將雷射照 射之重複率提升至數kHz，故適於高速解析之用。 又，本發明中，係藉由至少使用以燒灼高分孑之短脈 ”吳射光與分析對象之南分子中任一方移動，而以用以燒 灼°亥鬲分子之短脈衝雷射光無遺漏及重複地燒灼該分析對 13 !2439〇i 象之高分子，以進行分析。即，本發明中，藉由短脈衝雷 射光之照射點與塗布有分析對象之高分子以作為試料之基 板的移動，即可對廣大面積上所塗布之多數試料無遺漏及 重複地進行燒灼。此項於應用在DNA微陣列上則特別有 效。 丰發明經由該等特徵，則不但解析速度較以往大為增 並可在表現置極少之基因表現上進行同時解析。

^ 本發明之具體應用實例，舉例言之，有使用DNA 10 15 20 μ陣列之基因表現分析，並可使其解析高速化。即，依據 可使用㈣同位素作為標記，且⑽標記者若使 〜疋同位素’標記之種類將可增至多種穩定同位素之數 性：？。此與習知之標記法之螢光法(2〜6種)或放射 f (約1G種）相較之下，則可使資訊量遽増。 酸標ί;: Γ+广’DNA微陣列實驗所用之標記’係以核苔 4針(Probe)而使用，該料酸乃包含有如週 矢之穩定同位素、，等，週期表中 ， =:、、等，週期表中_〜同位素= 素^表他歡穩植素'、、♦同位 衝針與DNA料壯之標的_雜合後，㈣短脈 譜^加以燒灼，並進行分子之原子電離其後若以質 量加以^測’财將業雜合之探針⑽含之同位素之 於此，習知之嶋微陣列技術中係以營光染料標記探 14 1243901 針。該習知之方法於雜合後之檢測時，以專用檢測裝置將 需花費ίο分鐘左右之時間。然而，若藉助本發明則可達到 高速化之效果。 又，現在所用之螢光染料僅只2種（Cy-3、Cy-5)，急 5 速之增加將無法估算在内。相對於此，若使用穩定同位素， 則標記之種類可達270種。 又，DNA微陣列之基因表現資料，係作成與參照用試 樣之相對值而得者。換言之，於僅能利用2種螢光標記之 習知之DNA微陣列實驗中，難以於實驗間比較多數試料之 10 資料。 然而，若混合以個別之元素加以標記之3種以上之多 數探針，同時使之與標的物雜合，並使用藉本發明之使用 雷射燒灼之高分子之分析方法測量之業經多通道化之DNA 微陣列，則可比較多數試料間之資料。 15 如此一來，藉由本發明即可確立以多種穩定同位素標 記進行之高靈敏度與高速之質譜法，因此，本發明將可應 用於以螢光染料或放射性同位素進行標記之全數研究領域 上。 又，依據本發明，則於標記元素上可使用穩定同位素 20 而不用放射性同位素，由於此時不受使用設施之限制，故 亦可設置於醫療設施或民間企業，其影響效果不可估量。 圖式簡單說明 第1圖係用以實施本發明之使用雷射燒灼之高分子之 分析方法之高分子分析系統之一例，乃質譜分析系統之構 15 1243901 造之一例之概念構造說明圖。 第2圖所示者係實驗所用之2種試樣（試樣1及試樣2) 之規格之圖表。 第3(a)、（b)、（c)圖係經四極質譜儀測定後之試樣1之質 5 譜；（a)所示者係短脈衝雷射光之輸出功率為230μ〗時，（b) 所示者係短脈衝雷射光之輸出功率為53μ】時，（c)所示者係 短脈衝雷射光之輸出功率為480μ】時；另，關於(c)之測定， 係使四極質譜儀之靈敏度較（a)及(b)之測定時再下降兩位 而測定。 10 第4圖所示者係經超短脈衝雷射光之照射而剝下之標 的物之狀態之顯微鏡照片。 第5圖所示者係測定標的物上形成之傷口之深度與面 積後之結果說明圖。 第6圖係經四極質譜儀測定後之試樣2之質譜。 15 第7圖係經四極質譜儀測定後之試樣3之質譜。 第8圖係經四極質譜儀測定後之試樣4之質譜。 I：實施方式】 較佳實施例之詳細說明 【發明之實施型態】 20 以下，參照附圖並詳細說明本發明之使用雷射燒灼之 高分子之分析方法及其系統之實施型態之一例。 第1圖所示者係質譜分析系統之構造之一例之概念構 造說明圖，以作為用以實施本發明之使用雷射燒灼之高分 子之分析方法之高分子分析系統之一例。 16 1243901 該質譜分析系統10係具有：一可設定成l〇_8Torr〜 1(Γ6Τοιτ之真空度之真空槽12; —配置於該真空槽12内之 標的物14 ; 一配置於真空槽12内之四極質譜儀16 ; —用 以旋轉標的物14之旋轉導入端子18;—用以射出超短脈衝 5 雷射光而朝標的物14照射之超短脈衝雷射20 ;及，一用以 將由超短脈衝雷射20照射之超短脈衝雷射光聚光至標的物 14上之聚焦透鏡22。 於此，前述超短脈衝雷射20係由鈦藍寶石雷射構成， 並具有以下所示之參數。即： 10 峰寬（脈衝時間寬度）：〜ll〇fs (飛秒） 輸出 ：50〜480μΙ (微焦耳） (最大輸出功率：0.5〜4GW(千兆瓦）） 波長 ：〜800nm (奈米） 重複率 ：1kHz (千赫）。 15 另，前述四極質譜儀16係設置於與由超短脈衝雷射 20射出而照射於標的物14上之超短脈衝雷射光之照射方 向相對呈90度之垂直方向上。 又，用以將由超短脈衝雷射20射出之超短脈衝雷射光 聚光之聚焦透鏡22之焦距，係設定成25 cm。 20 再針對以上構造中，以前述質譜分析系統10實際進行 質譜分析之實驗結果加以說明。 首先，使用第2圖所示規格之2種試樣（試樣1及試 樣2)作為實驗之試料。且，利用此2種試樣以旋轉塗敷法 作成標的物14。 17 1243901 即，首先準備一片一邊約2 cm之約略四角形之矽基 板，並以滴液吸移管於其上滴下試樣1或試樣2之濃溶液。 其後，以1000旋轉/秒旋轉該矽基板90秒。如此一來，則 使滴於矽基板上之試樣1或試樣2之溶液蔓延廣佈並使溶 5 媒蒸發而固相化，且一面保持表面平坦一面使之固化。然 後，再將表面有試樣1或試樣2固化其上之矽基板送入約 120度之恆溫槽中，放置30分至1小時。 藉由該方法，則可均勻地，且以由超短脈衝雷射20射 出之超短脈衝雷射光每1束之照射點約1013之濃度，製作 10 一形成有覆蓋達1 αηφ以上面積之試樣1或試樣2的標的物 14 〇 於此，基板之材質亦可為金屬或絕緣體，而不需用半 導體。藉由該使用超短脈衝雷射光之雷射燒灼，則導熱度 高之基板將賦予更高之離子檢測效率。另，基板係使用固 15 體，而該基板所用之固體之導熱率宜於0.1W · m—1 · Κ—1以 上。 將以上述方式作成之標的物14裝設於真空槽12内， 並將真空槽12内抽成真空，而使真空槽12内之真空度設 定在10—6Torr以下。 20 其次，將由超短脈衝雷射20射出之超短脈衝雷射光， 以聚焦透鏡22聚光於標的物14上，並燒灼形成於該標的 物14上之試樣1或試樣2。 另，由超短脈衝雷射20射出之超短脈衝雷射光之脈衝 寬度為110飛秒，輸出功率則於53μΙ、230μ】、480μ】間變 18 1243901 化。 並，藉由前述四極質譜儀16測定經超短脈衝雷射光對 標的物14之照射而產生之一價離子之質量。 第3(a)、（b)、（c)圖中所示者係以前述手法並藉由四極 5 質譜儀16測定後之試樣1之質譜。 藉由將短脈衝雷射光之輸出功率由53μΤ (參照第3(b) 圖）升至230μ】（參照第3(a)圖），則能以與構成比大致對 應之量測出形成一價離子之12C、160、19F。 由此即證實，試樣1之高分子業經飛秒雷射等超短脈 10 衝雷射之燒灼而原子化，同時並經離子化。 於此，若進而將短脈衝雷射光之輸出功率提升至 480μΙ，則C之比例增加，且被視為二價之矽離子之峰值逐 漸明顯（參照第3(c)圖）。另，關於第3(c)圖之測定，係將 四極質譜儀16之靈敏度較第3(a)圖及第3(b)圖之測定時再 15 下降二位而進行測定。 其次，第4圖所示者係一顯微鏡照片，乃顯示經超短 脈衝雷射光之照射而使試樣1剝下之標的物14之狀態。由 第4圖中可辨識出呈同心圓狀形成之雙重圓圈，一為内側 之白圓，一為其外周之黑圓。該1照射點即對應於快門之 20 開放時間8ms之照射。換言之，可說是藉由超短脈衝雷射 光約8束左右之脈衝而剝下。 第5圖所示者係測定標的物14上形成之傷口之深度與 面積後之結果。於此，深度等級B (Lv.B)係定為矽基板 之表面，而於深8μηι、寬224μπι之圓筒内之試樣1與於深 19 1243901 6μηι、寬48m之圓錐内之矽，則視為經8束左右脈衝剝下 者。隨後，估算以超短脈衝雷射光1束剝下之試樣之量與 矽之量，並將結果顯示於下。 即， 5 以超短脈衝雷射光1束剝下之試樣之量： ( 224/2 ) 2πχ8χ1(Γ12[αη 3]xl[g/cm 3]χ {(6.02xl023 ) /1193 } + 8 = 2·〇χ1013 以超短脈衝雷射光1束剝下之矽之量： (48/2) 2πχ6χ10- 12χ (1/3) [cm 3]x2.33[g/cm 3]χ 10 {(6·02χ1023 ) /28 } + 8 = 2·3χ1013 如前述所載，則由試樣1之相關實驗結果證實，藉由 超短脈衝雷射光（具體而言即脈衝時間寬度為110飛秒之 飛秒雷射光）之燒灼，將可使高分子行原子化並離子化。 其次，為進行關於標記之DNA試樣之實驗，則使用市 15 售之dATP作為試樣2，進行與試樣1相同之實驗。 第6圖所示者係經該實驗而得之質譜，並可觀測構成 元素 12C、14N、160、23Na、31P 之峰值。 由此結果亦可證實，藉由超短脈衝雷射光（具體而言 即脈衝時間寬度為110飛秒之飛秒雷射光）之燒灼，亦可 20 使高分子（分子量約500)行原子化並離子化。進而，亦可 將P之同位素作為標記而使用。 由以上可證，藉由將高分子以高密度塗布於矽基板 上，則可以超短脈衝雷射光之燒灼將有機分子内之構成要 素C、N、〇、Na、F、P等行原子化與離子化，並進行檢 20 1243901 測。藉由測出dATP内之P，則可利用P之同位素作為標記。 其次，說明於使用以下所示之試料（具VIA族元素之 DNA試樣乃S取代DNA試樣）作為試樣3，並設定超短脈 衝雷射20之脈衝時間寬度為110飛秒，最大輸出功率為 5 2GW時之實驗結果。 試樣 3 : 2’-Deoxyadenosine5’-0—( 1—Thiotriphosphate) 化學式·· QoHnNsOnPJNas · 3H20 該試樣3亦與試樣1及試樣2之相關實驗時相同，於 藉質譜分析系統10進行高分子之質譜分析前，首先，準備 10 一將業已使作為質譜分析對象之試料之高分子（即前述S 取代DNA試樣）溶於溶媒中之溶液塗布於矽基板上，並將 該矽基板置於攝氏50度之恆溫槽内約30分鐘，使塗布於 石夕基板上之溶媒蒸發者，以作為標的物14。 將前述表面有試樣3固化其上之標的物14裝設於真空 15 槽12内，再將真空槽12内抽成真空，而使真空槽12内之 真空度設定在l(T6Torr以下。 其次，將由超短脈衝雷射20射出且具有前述參數之超 短脈衝雷射光，以聚焦透鏡22聚光於標的物14上，並對 標的物14進行燒灼。 20 藉由使用前述旋轉導入端子18旋轉標的物14，以呈 點狀對標的物14無遺漏及重複地燒灼。又，此時藉由一面 移動聚焦透鏡22並一面啟閉快門，則可呈點狀對標的物14 無遺漏及重複地進行燒灼。 並，藉由前述四極質譜儀16而測定經超短脈衝雷射光 21 1243901 對標的物14之照射所產生之一價離子之質量。 第7圖所示者係以前述方式並藉四極質譜儀16測定後 之試料之質譜之一例。 其次，說明於使用以下所示之試料（具VDA族元素之 5 DNA試樣乃C1取代DNA試樣）作為試樣4，並設定超短 脈衝雷射20之脈衝時間寬度為no飛秒，最大輸出功率為 2GW時之實驗結果。 试樣 4 · 5-Chloro-2’-Deoxyuridine 化學式：C^HuClNWs 10 該試樣4亦與試樣1及試樣2之相關實驗時相同，於 藉質譜分析系統10進行高分子之質譜分析前，首先，準備 一將業已使作為質譜分析對象之試料之高分子（即前述C1 取代DNA試樣）溶於溶媒中之溶液塗布於矽基板上，並將 忒石夕基板置於攝氏5〇度之恒潘槽内約3〇分鐘，使塗布於 15石夕基板上之溶媒蒸發者，以作為標的物14。 將前述表面有試樣4固化其上之標的物14裝設於真空 槽12内，再將真空槽12内抽成真空，而使真空槽12内之 真空度設定在i〇-6Torr以下。 其次’將由超短脈衝雷射20射出且具有前述參數之超 20短脈衝雷射光’以聚焦透鏡22聚光於標的物14上，並對 標的物14進行燒灼。 藉由一面移動聚焦透鏡22並一面啟閉快門，以呈點狀 對標的物14無遺漏及重複地進行燒灼。 並，藉由前述四極質譜儀16而測定經超短脈衝雷射光 22 1243901 對標的物14之照射所產生之一價離子之質量。 第8圖所示者係以前述方式並藉四極質譜儀16測定後 之試料之質譜之一例。 另，本發明之使用雷射燒灼之高分子之分析方法，係 5 可運用於如DNA、蛋白質、RNA、PNA、脂質、糖等各種 高分子之質譜分析上。 又，關於該等各種高分子並可解析附有元素標記者乃 自不待言。 即，藉由超短脈衝雷射燒灼以單數或多數同位素元素 10 標記之蛋白、白蛋白、DNA等高分子，則可經由對業已使 高分子構成元素完全原子電離並離子化之標記元素加以質 譜分析，而進行高分子之定量測定。藉此，即可使用多種 同位素元素作為標記。因此，乃可大加擴展可行質譜分析 之高分子之對象範圍。 15 即，藉由本發明，將可使以同位素元素標記之高分子 試料本體以原子等級進行離子化並測出標記元素，故可大 加擴展可行質譜分析之對象範圍。舉例言之，可使用同位 素元素作為DNA之標記，且標記之種類亦可增至如穩定同 位素元素之數270。此與習知之標記法之螢光法（2種）或 20 放射性同位素（約10種）相較，則可使資訊量遽增。 另，前述實施型態中，係使用四極質譜儀作為質譜儀， 但當然並非以此為限，於使用藉由測定原子之飛行時間而 進行質譜分析之飛行時間質譜儀時，將可以一次之雷射照 射同時進行多數原子之質譜分析。又，於使用離子迴旋型 23 1243901 傅立葉轉換質譜儀作為質譜儀時，亦可同時進行多數原子 之質譜分析。 又，前述實施型態中，係以質譜分析作為高分子之分 析方法而加以說明，但當然並非以此為限，除質譜分析外 5 之分析亦可使用本發明。 又，前述實施型態中，用以移動標的物14之移動機 構，係使用可旋轉標的物14之旋轉導入端子18,但當然並 非以此為限，其亦可使用可載置標的物14且移動自如之檯 部等適當之移動機構。 10 此外，前述實施型態中，係藉由使用旋轉導入端子18 旋轉標的物14，而對標的物14無遺漏及重複地進行燒灼， 但當然並非以此為限，其亦可設置一用以移動超短脈衝雷 射光對標的物14之照射位置之移動機構，以對標的物14 無遺漏及重複地進行燒灼。 15 【發明之效果】 本發明即如以上說明般構成，乃一種使用雷射燒灼之 高分子之分析方法及其系統，係用以生成構成高分子之構 成原子之原子離子，並分析生成之原子離子者，且達到可 提供一種使用雷射燒灼之高分子之質譜分析方法及其系 20 統，而不需具高解析能力之分析裝置之優良效果。於此， 更詳而言之，例如於進行質譜分析時，可無質譜解析困難 之虞，並可達到不需裝設一具備高解析能力之質譜分析裝 置之優良效果。 又，本發明係如以上說明般構成者，故能達到可使系 24 1243901 統構造大幅簡化之優異效果。 進而，由於本發明係如以上說明般構成者，故縱使於 混有多種標記同位素之狀態下，仍能達到可進行有效率之 分析之優異效果。 5 【圖式簡單說明】 第1圖係用以實施本發明之使用雷射燒灼之高分子之 分析方法之高分子分析系統之一例，乃質譜分析系統之構 造之一例之概念構造說明圖。 第2圖所示者係實驗所用之2種試樣（試樣1及試樣2) 10 之規格之圖表。 第3(a)、（b)、（c)圖係經四極質譜儀測定後之試樣1之質 譜；（a)所示者係短脈衝雷射光之輸出功率為230μ〗時，（b) 所示者係短脈衝雷射光之輸出功率為53μ〗時，（c)所示者係 短脈衝雷射光之輸出功率為480μ】時；另，關於(c)之測定， 15 係使四極質譜儀之靈敏度較⑻及(b)之測定時再下降兩位 而測定。 第4圖所示者係經超短脈衝雷射光之照射而剝下之標 的物之狀態之顯微鏡照片。 第5圖所示者係測定標的物上形成之傷口之深度與面 20 積後之結果說明圖。 第6圖係經四極質譜儀測定後之試樣2之質譜。 第7圖係經四極質譜儀測定後之試樣3之質譜。 第8圖係經四極質譜儀測定後之試樣4之質譜。 25 1243901 【主要元件符號說明】 ίο...質譜分析系統 12.. .真空槽 14.. .標的物 16.. .四極質譜儀 18.. .旋轉導入端子 20.. .超短脈衝雷射 22.. .聚焦透鏡 26

Claims (1)

1. 十、申請專利範圍： 第91103449號專利申請案申請專利範圍修正本94.04.01 1. 一種使用雷射燒灼之高分子之分析方法，係藉由對分析 對象之高分子照射雷射光而燒灼該高分子，以使高分子 5 原子化成構成元素，並將業經原子化之構成元素離子 化，再加以分析業經離子化之構成元素者； 而，用以照射分析對象之高分子，並燒灼該高分子之雷 射光係超短脈衝雷射光； 且，藉由以該超短脈衝雷射光照射分析對象之高分子而 10 燒灼該高分子，而於使該高分子原子化成構成元素 之同時並使之離子化，且分析業經離子化之構成元 素。 2. 如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該分析對象之高分子係業經固相化者。 15 3.如申請專利範圍第2項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該高分子之固相化方法，係包含有一藉由在 基板上滴下分析對象之高分子溶液並加以乾燥，而使之 固相化之過程者。 4. 如申請專利範圍第3項之使用雷射燒灼之高分子之分析 20 方法，其中該基板係固體，且該固體之導熱率在0.1W · m—1 · ΚΓ1以上。 5. 如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該分析對象之高分子係附有元素標記者。 6. 如申請專利範圍第5項之使用雷射燒灼之高分子之分析 27 1243901 方法，其中該元素標記係週期表中之ΙΑ族元素。 7. 如申請專利範圍第5項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該元素標記係週期表中之VIA族元素。 8. 如申請專利範圍第5項之使用雷射燒灼之高分子之分析 5 方法，其中該元素標記係週期表中之WA族元素。 9. 如申請專利範圍第5項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該元素標記係週期表中之過渡金屬元素。 10. 如申請專利範圍第5項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該元素標記係穩定同位素標記。 10 11.如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 方法，其中該用以照射分析對象之高分子並燒灼該高分 子之超短脈衝雷射光，係脈衝時間寬度在10微微秒以 下，且最大輸出功率在10兆瓦以上者。 12. 如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 15 方法，其中該用以照射分析對象之高分子並燒灼該高分 子之超短脈衝雷射光，係脈衝時間寬度在1飛秒(fs; 10_15 秒）以上且在1微微秒(pico-second ; 10·12秒）以下，而最 大輸出功率在1千兆瓦以上且在10千兆瓦以下者。 13. 如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 20 方法，其中該業經離子化之構成元素之分析係質譜分 析。 14. 如申請專利範圍第13項之使用雷射燒灼之高分子之分 析方法’其中該質譜分析係飛行時間法之質譜分析。 15. 如申請專利範圍第1項之使用雷射燒灼之高分子之分析 28 1243901 方法，其係同時分析業經離子化之多數構成元素。 16.如申請專利範圍第1至15項中任一項之使用雷射燒灼之 南分子之分析方法’其中該分析對象之南分子係固定於 DNA微陣列中之核酸或核酸之類似物。 5 17.如申請專利範圍第16項之使用雷射燒灼之高分子之分 析方法，其中該DNA微陣列係業經多通道化之DNA微陣 列。 18. 如申請專利範圍第1至15項中任一項之使用雷射燒灼之 高分子之分析方法，其係藉由至少使用以燒灼高分子之 10 短脈衝雷射光與分析對象之高分子中任一方移動，而以 用以燒灼該高分子之短脈衝雷射光無遺漏及重複地燒 灼該分析對象之高分子，以進行分析者。 19. 一種使用雷射燒灼之高分子之分析系統，係具有： 真空槽，係可於内部配置標的物者； 15 分析器，係配置於前述真空槽内者；及 超短脈衝雷射，係用以射出超短脈衝雷射光並朝配置於 前述真空槽内之標的物照射者。 20. 如申請專利範圍第19項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其進而具有一用以於前述真空槽内移動標的物 20 之移動機構。 21. 如申請專利範圍第20項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該用以移動標的物之移動機構係一用以旋 轉標的物之旋轉機構。 22. 如申請專利範圍第19項之使用雷射燒灼之高分子之分 29 1243901 析系統，其進而具有一用以移動超短脈衝雷射光對標的 物之照射位置之移動機構。 23.如申請專利範圍第19項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該分析器係質譜儀。 5 24.如申請專利範圍第23項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該質譜儀係四極質譜儀。 25. 如申請專利範圍第23項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該質譜儀係飛行時間質譜儀。 26. 如申請專利範圍第23項之使用雷射燒灼之高分子之分 10 析系統，其中該質譜儀係離子迴旋型傅立葉轉換質譜 儀。 27. 如申請專利範圍第19項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該超短脈衝雷射係用以照射一脈衝時間寬 度在10微微秒以下，且最大輸出功率在10兆瓦以上之短 15 脈衝雷射光者。 28. 如申請專利範圍第27項之使用雷射燒灼之高分子之分 析系統，其中該超短脈衝雷射係用以照射一脈衝時間寬 度在1飛秒以上且在1微微秒以下，而最大輸出功率在1 千兆瓦以上且在10千兆瓦以下之短脈衝雷射光者。 20 30