JP6216786B2 - 質量スペクトルの再現性向上方法およびこれを用いた定量分析方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、質量スペクトルの再現性向上方法およびこれを用いた定量分析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化学物質の質量スペクトルにおいて、イオン生成反応の温度を互いに同一に調整し、或いはイオン生成反応温度が同じであるスペクトルを選択することにより、前記化学物質の質量スペクトルの再現性を向上させる方法に関する。また、本発明は、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法、定量分析用検定線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を求める方法、および質量スペクトルを用いた試料定量分析方法に関する。
［背景技術］
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）方法は、化学物質をイオン化させる方法であって、主に、飛行時間型（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ、ＴＯＦ）質量分析管と共に使用され、化学物質の質量分析に活用されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析方法は、分析可能な試料の選択範囲が広く、分析にかかる時間が短いため、様々な固体物質、特に生物の分子構造解析に広く用いられる。

ところが、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルパターンの再現性が非常に悪いため、ＭＡＬＤＩ質量分析法を試料の定量分析に使用することは難しい。このような点から、ＭＡＬＤＩ質量分析法の産業的または科学的応用範囲が非常に制限されている。

それにも拘わらず、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを用いて試料の定量分析を行うために、例えば、内部標準物質を使用しない相対的定量法、内部標準物質を使用する相対的定量法、内部標準物質を使用する絶対的定量法、分析物質の添加による絶対的定量法など、様々なＭＡＬＤＩ質量スペクトルを活用した方法が開発された。

内部標準物質を使用しない相対的定量法（またはプロファイル解析法（ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ））は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル内で各成分の相対的な信号強度が一定であるという事実に基づいて、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを再現性よく分析するために分類アルゴリズム（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いるＭＡＬＤＩ質量分析法である。ところが、プロファイル解析法は実験の設計および遂行が難しいという欠点がある。

また、内部標準物質を使用する相対的定量法は、一定量の内部標準物質を添加した試片に対するＭＡＬＤＩ質量スペクトルにおいて、各試料のピーク高さまたは面積を前記内部標準物質のピーク高さまたは面積に対する相対的な値をもって測定することにより、試料を定量するＭＡＬＤＩ質量分析法である。ところが、内部標準物質を使用する相対的定量法によっては試料の絶対的な量を測定することができない。

また、内部標準物質を使用する絶対的定量法は、測定しようとする試料の量を変化させながら一定量の内部標準物質を混ぜた多数個の試片から検定線を求めた後、前記内部標準物質を使用する相対的定量法を用いて未知の試片に対して得た前記試料の相対的な測定値を前記検定線に代入して前記試料の絶対的な量を求めるＭＡＬＤＩ質量分析法である。ところが、内部標準物質を使用する絶対的定量法を用いて、多数の成分が含有された試片を分析するには、各成分ごとに検定線を求めなければならないという欠点がある。

また、分析物質の添加による絶対的定量法は、測定しようとする試料を含有したサンプルを２つ以上に分割し、分割されたサンプルに前記試料の量を変化させながら添加した各サンプルに対して得たＭＡＬＤＩ質量スペクトルから検定点（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔｓ）を求めた後、前記検定点から、本来測定しようとした試料の絶対的な量を求めるＭＡＬＤＩ質量分析法である。ところが、分析物質の添加による絶対的定量法を用いて試料を定量分析するには、分析しようとする試料をさらに準備しなければならず、１種の試料を分析するために多数個の試片を準備しなければならないという欠点がある。

今まで公知となった方法をもって、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを用いて定量分析を行うためには、内部標準物質、特に試料と同一の化合物として、同位元素で置換された物質を使用している。ところが、タンパク質や核酸など分子量の大きい物質だけでなく、ペプチドのように分子量が大きくない物質に対しても、同位元素で置換されたものとそうでないものを質量スペクトルで区分するために、同位元素置換程度を高めると、試料の価格が非常に高くなる。しかも、試料の前処理が簡単でないことも、内部標準物質を使用するＭＡＬＤＩ質量分析法によって定量分析する方法の欠点の一つである。

ＭＡＬＤＩ質量分析の試片は、通常、試料とマトリックスとの混合物であるので、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルには、分析すべき試料イオン（ａｎａｌｙｔｅ ｉｏｎ、ＡＨ^＋）およびその分解生成物と、マトリックスイオン（ｍａｔｒｉｘ ｉｏｎ、ＭＨ^＋）およびその分解生成物が現れる。よって、ＭＡＬＤＩスペクトルのパターンはＡＨ^＋とＭＨ^＋の分解パターン、およびＡＨ^＋とＭＨ^＋の強度比によって決定される。

ＭＡＬＤＩによって形成されたイオンは、イオン源の内部（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ、ＩＳＤ）または外部（ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅ ｄｅｃａｙ、ＰＳＤ）で壊れる可能性がある。ＩＳＤは反応速度が速く、早く終結するが、これに対し、ＰＳＤは反応速度が遅い。このような分析試料イオンの分解反応速度および収率は反応速度定数およびイオンの内部エネルギーによって決定される。よって、ＭＡＬＤＩにおいてレーザーパルスにより生成されるプルーム(plume)の有効温度が分かれば内部のエネルギーが分かるようになり、これを用いて反応速度を求めることができる。

ＭＡＬＤＩ質量分析において試片にレーザーを照射するときに生成されるイオンと中性分子を含んでいる気体たるプルームの温度を調べるための多くの科学的研究が行われたことがある（Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．１９９４， ９８， １９０４−１９０９；Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００７， １８， ６０７−６１６；Ｊ Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．Ａ ２００４， １０８， ２４０５−２４１０）。

ところが、プルームの温度を測定する最も体系的な方法は、本発明者らの研究によって最初に提示された（Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ ２００９， １１３． ２０７１−２０７６）。本発明者らは、時間分別光分解スペクトルとＰＳＤスペクトルを反応速度論的に分析することにより、イオンの分解反応速度と有効温度を得ることに成功した。また、こうして得た温度は末期プルーム温度（Ｔ_ｌａｔｅ）であることを認知した。本発明者らは、こうして得た反応速度関数を用いてＩＳＤ収率を分析することにより、初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）も決定することができた。

本発明者らは、まずＭＡＬＤＩスペクトルから、ペプチドイオンのＩＳＤ、ＰＳＤなどによって作られる分解イオン生成物の強度を測定した。この資料からイオン源の出口におけるペプチドイオンの生存確率（Ｓ_ｉｎ）を計算した。実験条件を考慮して、ペプチドイオンがイオン源の出口で生存することが可能な最高速度定数を求め、ペプチドイオンの分解速度定数からそれに該当する最高の内部エネルギーを決定した。温度を変えながらペプチドイオンの内部エネルギー分布を求め、最高の内部エネルギーより小さい領域の確率がＳ_ｉｎと同一になる温度を取ることにより、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を決定した。

本発明者らが考案した方法によって決定されたイオン含有気体（プルーム）の初期および末期の温度は、先行研究者らが報告した結果と殆ど一致した。しかし、他の研究者らによって考案された方法に比べて方法論的に一層さらに体系的であり、任意性がなくて普遍的適用が可能であるという利点がある（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、２０１１年、ｖｏｌ． ２２， ｐｐ１０７０−１０７８）。この論文の内容をすべて本明細書の内容として引用する。

このような研究により、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ実験条件を変化させると初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）が変わるが、様々な実験条件の下で得たスペクトルのうち、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じである質量スペクトルのみを選択して考察すると、各質量スペクトルのパターンが互いに同一であるという驚くべきことを見出した。

また、本発明者らは、ＭＡＬＤＩにおいてイオン生成反応の様々な条件を変化させると、イオンが生成される当時の温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）が変わるが、様々な実験条件の下で得たスペクトルのうち、イオン生成反応温度が同じである質量スペクトルのみを選択して考察すると、各スペクトルにおける全イオン数（total ion count、ＴＩＣ）が互いに同一であるとういう驚くべきことを見出すことにより、本発明を着想するに至った。

しかも、本発明者らは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同一の場合、質量スペクトルパターンだけでなく、ＴＩＣ(total ion count)が同一であるということから、試片に照射されるレーザーパルスのエネルギー強度を調節してＴ_{ｅａｒｌｙ}を一定に維持すると、同じＴ_{ｅａｒｌｙ}での質量スペクトルを得ることができるということもさらに見出した。

よって、本発明者らは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を測定することが可能な因子、例えば、質量スペクトルに現れたイオンの分解パターンやＴＩＣなどを活用して、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が一定である質量スペクトルを選別し或いは求めることができれば、質量分析器を用いて定量分析が可能であるということを発明するに至った。

さらに、本発明者らは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じであるスペクトルからプルームのプロトン交換反応の反応商（Ｑ＝［Ｍ］［ＡＨ^＋］／（［ＭＨ^＋］［Ａ］）を求めると、前記反応商が固体試片における試料の濃度の変化とは関係なく変化せず一定であるということも見出した。

すなわち、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析において、初期プルームはほぼ熱的平衡状態にあり、前記反応商（Ｑ）はマトリックス物質と試料物質間のプロトン交換反応の平衡定数（Ｋ）に該当するということを確認することができた。よって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルにおいて、一定の温度条件で生成された試料とマトリックスのイオン強度の比は固体試片における試料とマトリックスのモル比に正比例し、これにより定量分析が可能であるということに着目した。

本発明者らは、ＭＡＬＤＩ実験条件を変えながらＭＬＡＤＩ質量スペクトルを数回測定し、各スペクトルから、ＭＡＬＤＩ質量分析試片に含有されたマトリックスイオンまたは試料イオンまたは添加された物質イオンそれぞれの分解パターンを互いに比較し、これらの物質のイオン分解パターンが同じであるスペクトルのみを選別した後、選択されたＭＡＬＤＩスペクトルからマトリックスイオンの信号強度と試料イオンの信号強度との比を測定することにより、マトリックスと試料のイオン化反応の平衡定数を測定する方法を発明するに至った。

しかも、本発明者らは、前記測定したマトリックスと各試料間の平衡定数を活用して一定の温度でマトリックスと各試料間の各濃度比の変化による検定線を求める方法を発明した。

また、本発明者らは、一定量のマトリックスに未知量の試料を混合して製作した試片のＭＡＬＤＩ質量スペクトルから測定した試料イオンの信号強度とマトリックスイオンの信号強度との比およびマトリックスの濃度を前記検定線に代入して前記未知量の試料のモル数を算出することにより、試片に含有された試料の量を測定する定量分析方法を発明した。

また、本発明者らは、試片内に試料が高い濃度で存在すると、マトリックスのイオン信号および試片内の他の試片のイオン信号を減少させて精度のよい定量分析を難しくする誤差原因となることを解決するために、マトリックス信号減衰効果が７０％を超過する場合に試料を数倍〜数百倍またはそれ以上に希釈することにより、前記マトリックス信号減衰効果を抑制して質量スペクトルを活用した定量分析の正確度を向上させる方法を発明した。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
よって、本発明の第１の目的は、化学物質の質量スペクトルにおいて、イオン生成反応の温度を互いに同一に調整し、或いはイオン生成反応の温度が同じであるスペクトルを選択することにより、前記化学物質の質量スペクトルの再現性を向上させる方法を提供することにある。

本発明の第２の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片、または一定量のマトリックスと一定量の試料と第３物質とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオン、マトリックスイオンまたは第３物質イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）段階で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階とを含むことを特徴とし、前記イオン信号比を、前記試料の濃度を前記マトリックスの濃度で割った値である濃度比で割って、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法を提供することにある。

本発明の第３の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片、または一定量のマトリックスと一定量の試料と第３物質とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオン、マトリックスイオンまたは第３物質イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）段階で選別された質量スペクトルに現れた試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）段階のイオン信号比を、前記試片の試料濃度をマトリックスの濃度で割った値である濃度比の変化に従って図示して定量分析用検定線を求める方法を提供することにある。

本発明の第４の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片、または一定量のマトリックスと一定量の試料と第３物質とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオン、マトリックスイオンまたは第３物質イオンの分解パターンが互いに同一である質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）段階で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記マトリックスのモル濃度と前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を下記数式（９）の定量分析用検定線に代入して前記試料のモル濃度を計算する段階とを含んでなる、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法を提供することにある。
［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ …（９）
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の目的は、化学物質の質量スペクトルにおいて、イオン生成反応の温度を互いに同一に調整し、或いはイオン生成反応の温度が同じであるスペクトルを選択することにより、前記化学物質の質量スペクトルの再現性を向上させる方法を提供することによって達成できる。

本発明の化学物質の質量スペクトルの再現性を向上させる方法は、マトリックス、試料または第３物質から選ばれるいずれか一つの化学物質の前記質量スペクトルにおけるイオン化分解パターンが互いに同じである質量スペクトルを選別する段階を含むことができる。

また、本発明の化学物質の質量スペクトルの再現性を向上させる方法は、前記質量スペクトルにおいて、ＴＩＣ（ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｏｕｎｔ）が同じである質量スペクトルを選択する段階を含むことができる。

本発明の第２の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階とを含むことを特徴とし、前記イオン信号比を、前記試料の濃度を前記マトリックスの濃度で割った値である濃度比で割って、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法を提供することによって達成できる。

また、本発明の第２の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ） 前記マトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階とを含むことを特徴とし、前記イオン信号比を、前記試料の濃度を前記マトリックスの濃度で割った値である濃度比で割って、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法を提供することによって達成できる。

また、本発明の第２の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料と第３物質とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記第３物質イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階とを含むことを特徴とし、前記イオン信号比を、前記試料の濃度を前記マトリックスの濃度で割った値である濃度比で割って、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法を提供することによって達成できる。

本発明の一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法において、前記試片にエネルギーを加える手段が、レーザー、または粒子線、その他の放射線などを含む様々な種類の電磁気波であってもよい。また、前記レーザーは窒素レーザーまたはＮｄ：ＹＡＧレーザーであってもよい。また、前記レーザーを試片に照射する際に、前記試片の一地点に多数回照射して多数の試料イオンスペクトルを得ることができる。

本明細書において、「マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）」とは、レーザーなどのエネルギー源からエネルギーを吸収し、そのエネルギーを分析試料に伝達することにより、分析試料を加熱しイオン化させる物質である。ＭＡＬＤＩ質量分析で使用されるマトリックスとして、ＣＨＣＡ（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＨＢ（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ））、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ピコリン酸（ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の他に、様々な物質が知られている。

本発明の方法で試片にエネルギーを加える手段は、一般にレーザー光線であるが、粒子線や放射線などを含む様々な種類の電磁気波が使用できる。
典型的なＭＡＬＤＩ質量分析では、マトリックス（Ｍ）と微量の分析試料（Ａ）とからなる固体試片にレーザーパルスを照射する。マトリックスは、前記レーザーを吸収して前記分析試料（Ａ）を加熱し、分析試料（Ａ）のイオン化を助ける。ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、マトリックスと試料からなる混合物に対する質量スペクトルである。

本明細書において、「全イオン数（ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｏｕｎｔ、ＴＩＣ）」とは、質量分析器内の検出器で検出される総粒子数（ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を意味する。質量分析器の内部でＭＡＬＤＩにより生成されたイオンの一部が分解されて失われるため、ＭＡＬＤＩにより生成されるイオンの総数を容易に測定することが難しい。よって、ＭＡＬＤＩにより生成されるイオンの総数に相当する値として検出器で検出される総粒子数（ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を全イオン数（ＴＩＣ）として定義したものである。

本明細書において、「プルーム（ｐｌｕｍｅ）」とは、試片に照射されたレーザーパルスのエネルギーによって前記試片から生成された蒸気である。プルームは、気相マトリックス分子、試料分子、マトリックスイオンおよび試料イオンを含み、これらの物質の中でも気相マトリックス分子がプルームの大部分を形成する。

本明細書において、「反応商（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｑｕｏｔｉｅｎｔ）」とは、

反応において、Ｑ＝（［Ｃ］^ｃ［Ｄ］^ｄ）／（［Ａ］^ａ［Ｂ］^ｂ）と定義される。化学反応が平衡状態である場合、反応商は平衡定数と同じである。

本明細書において、「検定線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）」または「検定式（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）」とは、ある成分の濃度と前記成分の特定の性質（例えば、電気的性質や発色など）間の関係を予め実験的に求めた曲線である。検定線は、濃度が分からない成分を定量分析するために使用される。

本明細書において、「イオン信号比」とは、試料イオンの信号強度（Ｉ_ＡＨ＋）値をマトリックスイオンの信号強度（Ｉ_ＭＨ＋）値で割った値（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）と定義する。また、本明細書において、「濃度比」とは、試片に含有された試料のモル数を試片に含有されたマトリックスのモル数で割った値（［Ａ］／［Ｍ］）と定義する。

ＭＡＬＤＩ質量スペクトルに現れるイオンは、プロトン化した分析試料（ＡＨ^＋）、プロトン化したマトリックス（ＭＨ^＋）、およびイオン源の内部で生成されたこれらの断片化生成物（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）である。よって、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのパターンはＡＨ^＋とＭＨ^＋の断片化パターン（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）および試料とマトリックスイオンの比によって決定される。

本発明者らは、ＭＡＬＤＩによって生成される初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）を決定する方法を発明して、論文として発表したことがある（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１， ２２， １０７０−１０７８；Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１０， ２１， １８７６−１８８３）。また、本発明者らは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が特定されると、前記３つの要因が共に決定されるという事実を解明した。このような先行論文の内容を全て本明細書に引用する。

さらに、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ質量分析において実験条件を変化させると初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）は変わるが、様々な実験条件の下で得たスペクトルのうち、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じである質量スペクトルのみを選別して考察すると、各質量スペクトルのパターンがそれぞれ互いに同じであるということも見出した。このような現象は、分析試料だけでなく、マトリックスと第３物質を含む場合にも同様に現れる。

したがって、実験条件を変えながらＭＡＬＤＩ質量スペクトルを数回測定し、各スペクトルから、ＭＡＬＤＩ質量分析試片に含有されたマトリックスイオンまたは試料イオンまたは添加された第３物質イオンそれぞれの分解パターンを互いに比較して、これらの物質イオンそれぞれの分解パターンが同じである、つまり初期プルーム温度が一定である質量スペクトルのみを選別することにより、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルにおけるイオン分解パターンの再現性を確保した。

また、ＭＡＬＤＩにおいてイオン生成反応の様々な条件を変化させると、イオンが生成される当時の温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）が変わるが、様々な実験条件の下で得たスペクトルのうち、イオン生成反応温度が同じである質量スペクトルのみを選択して考察すると、各スペクトルにおける全イオン数（ＴＩＣ）が互いに同じであるということも見出した。このような現象は、分析試料だけでなく、マトリックスと第３物質を含む場合にも同様に現れる。

つまり、ＭＡＬＤＩスペクトルは、試料イオン、マトリックスイオン、およびこれらの分解生成物から構成され、特定のＴ_{ｅａｒｌｙ}を持つＭＡＬＤＩスペクトルを選択すると、実験条件を問わず、各イオンの相対強度だけではなく絶対強度も同じである、再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得ることができる。また、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じであれば、試片に含有されている試料の種類、濃度および個数を問わず、生成されるイオンの総数は同一であるということを見出したのである。

したがって、本発明者らは、ＭＡＬＤＩイオン化反応条件を変えながら、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを数回測定し、各スペクトルにおける全イオン数（ＴＩＣ）が同じであるＭＡＬＤＩ質量スペクトルを選別することにより、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルの再現性を確保した。

すべての実験条件を固定し、試片にレーザーパルスを照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルのＴ_{ｅａｒｌｙ}は、益々減少する。これは、試料の厚さが薄くなるにつれて、試片を載せた板への熱伝導がさらに効率よく起こるためである（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２０１２， ８４， ７１０７−７１１１）。このようなＴ_{ｅａｒｌｙ}の減少は、ＭＡＬＤＩスペクトルの照射対照射(shot-to-shot)の再現性が低下する原因の一つである。

本発明の好適な実施態様によって、ＴＩＣ、すなわちＴ_{ｅａｒｌｙ}が一定であるＭＡＬＤＩ スペクトルを得るためには、試料の厚さが薄くなるにつれてＴ_{ｅａｒｌｙ}が減少するときにレーザーのパルスエネルギーを増加させることにより、常に一定なＴ_{ｅａｒｌｙ}を有するＭＡＬＤＩスペクトルを得るのである。詳しくは、レーザーパルスエネルギーを調節するために、例えば、円形の中性密度フィルター（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｎｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）を使用する。前記円形の中性密度フィルターをステップモーター（ｓｔｅｐ ｍｏｔｏｒ）に装着して所望の角度だけ前記フィルターを回転させることにより、レーザーパルスエネルギーを調節する。

前記レーザーパルスエネルギーのフィードバックコントロールは、次のとおり実行することができる。まず、閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）エネルギーの２倍に相当するレーザーパルスエネルギーを使用するとき、ＴＩＣを基準値として設定することができる。レーザーパルスを照射してＭＡＬＤＩスペクトルを得ると、前記スペクトルに該当するＴＩＣを求め、この値が基準ＴＩＣからどれほど外れた値であるかを計算し、前記円形の中性密度フィルターを回転させる方向および角度を決定する。このようなフィードバックコントロールは、レーザーパルスエネルギーが閾値エネルギーの３倍に相当する値を超過すると終了する。各照射地点でこのような過程を繰り返し行い、ＭＡＬＤＩスペクトルを得る。

ＭＡＬＤＩプルームでは、マトリックスと試料との間に下記反応式（１）のプロトン交換反応が起こる：
ＭＨ^＋＋Ａ→Ｍ＋ＡＨ^＋ …（１）
前記反応式（１）の反応商は、下記数式（２）のとおり定義される。

Ｑ＝［Ｍ］［ＡＨ^＋］／（［ＭＨ^＋］［Ａ］）＝（［Ｍ］／［Ａ］）／（［ＭＨ^＋］／［ＡＨ^＋］…（２）
前記数式（２）において、［Ｍ］／［Ａ］値は、試片製作の際に使用したマトリックスと試料の濃度から直ちに求めることができる。

また、前記数式（２）において、［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］は、前記試料由来イオンの濃度を前記マトリックス由来イオンの濃度で割った値であり、本発明のプロトン交換反応の反応商を測定する方法の （ｉｉ）段階で求めた、前記試料由来イオンの信号強度を前記マトリックス由来イオンの信号強度で割った値（イオン信号比）、すなわちＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋と同じである。よって、前記数式（２）は、次のとおり表すことができる。

Ｑ＝（［Ｍ］／［Ａ］）（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋） …（３）
つまり、前記数式（３）の［Ｍ］／［Ａ］値とＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋値を共に求めることができるので、マトリックスと試料間のプロトン交換反応に対する反応商を求めることができ、この反応は平衡状態にあるので、反応商は平衡定数と同じである。

大部分の生物学的試料（Ａ）に対するＭＡＬＤＩにおいて、試料イオン（［Ａ＋Ｈ］^＋）は、マトリックスイオン（［Ｍ＋Ｈ］^＋）からのプロトン転移によって生成される（反応式（１））。したがって、ペプチドなどの試片内に試料が非常に高濃度で存在すると、マトリックスのイオン信号を減少させ、試片内の他の試料のイオン信号も減少させる。

本明細書において、「マトリックス信号減衰効果（ｍａｔｒｉｘ ｓｉｇｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）」とは、試片内に試料が非常に高い濃度で存在するときにマトリックスイオン信号が減少する現象を意味する。また、本明細書において、「試料信号減衰効果（ａｎａｌｙｔｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）」とは、試片内に試料が非常に高い濃度で存在するときに試片内の他の試料のイオン信号が減少する現象を意味する。

反応商に関する数式（３）によれば、試料イオンの数が増加するにつれてマトリックスイオンの数が減少するが、このような現象を、本明細書では「正常信号減衰（ｎｏｒｍａｌ ｓｉｇｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という。また、試料の濃度が非常に大きいとき、すなわちマトリックス信号減衰効果が非常に大きいとき、（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）対［Ａ］の曲線が線形性から外れるが、このような現象を本明細書では「非正常信号減衰（ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｉｇｎａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」と指し示す。

ＭＨ^＋の一部は、イオン源の内部崩壊を経てＭＨ−Ｈ_２Ｏ^＋、ＭＨ−ＣＯ_２ ^＋などになる。したがって、ＭＡＬＤＩにより生成されたマトリックス由来イオンの総数はこれらの和になる。そして、ＭＡＬＤＩにより生成されたマトリックスイオンの数はＭＡＬＤＩスペクトルに現れるＭＨ^＋の数に比例する。よって、本発明では、マトリックス由来イオンの総数の代わりに、ＭＡＬＤＩスペクトルに現れるＭＨ^＋の数を使用する。

Ｉ_０を純粋なマトリックスのＭＡＬＤＩスペクトルにおけるＭＨ^＋のイオン信号強度と定義し、Ｉをマトリックス−試料の混合物におけるＭＨ^＋のイオン信号強度と定義すると、前記混合物のマトリックス信号減衰効果（Ｓ）は下記数式（４）のとおり定義される：
Ｓ＝１−Ｉ／Ｉ_０ …（４）
多くの試料に対する測定の結果、マトリックス信号減衰効果が７０％よりさらに大きい場合に線形性からの偏差が発生した。このような事実を試片の定量分析でガイドラインとして使用することができる。すなわち、本発明者らは、試片のＭＡＬＤＩスペクトルを得てマトリックス信号減衰効果を計算した。前記マトリックス信号減衰効果が７０％以下であるとき、前記質量スペクトルを試料の定量分析に使用することができる。

マトリックス信号減衰効果が７０％よりさらに大きい試片は、下記数式（５）を用いて希釈させることにより、マトリックス信号減衰を減らすことができる。
ｃ_２／ｃ_１＝（Ｓ_１ ^−１−１）／（Ｓ_２ ^−１−１） …（５）
式中、Ｓ_１およびＳ_２はそれぞれ試料１および試料２の濃度がｃ_１およびｃ_２であるときのマトリックス信号減衰効果を示す。

したがって、前記試片の試料の量が適正の範囲を超過してマトリックス信号減衰効果が７０％を超える場合、前記試片の試料を２倍以上、好ましくは数倍〜数百倍に希釈して使用することができる。

本発明の第３の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ） 前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）段階のイオン信号比を、前記試片の試料濃度をマトリックスの濃度で割った値である濃度比の変化に従って図示し、定量分析用検定線を求める方法を提供することによって達成できる。

また、本発明の第３の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ） 前記マトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記 （ｉｉ）段階のイオン信号比を、前記試片の試料濃度をマトリックスの濃度で割った値である濃度比の変化に従って図示し、定量分析用検定線を求める方法を提供することによって達成できる。

また、本発明の第３の目的は、一定量のマトリックスと一定量の試料と第３物質とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記第３物質イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階、および（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を、前記試片の試料濃度をマトリックスの濃度で割った値である濃度比の変化に従って図示し、定量分析用検定線を求める方法を提供することによって達成できる。

本発明のＭＡＬＤＩ定量分析用検定線を求める方法において、前記試片にエネルギーを加える手段は、レーザーだけでなく、任意の粒子線や各種放射線でありうる。また、前記レーザーは窒素レーザーまたはＮｄ：ＹＡＧレーザーでありうる。また、前記レーザーを試片に照射する際に、前記試片の一地点に多数回照射して多数個の試料イオンスペクトルを得ることができる。

また、本発明のＭＡＬＤＩ定量分析用検定線を求める方法において、前記マトリックスの濃度を一定にしたままで前記試料の濃度を変化させながら前記（ｉ）段階〜前記（ｉｉｉ）段階を多数回繰り返し行って得た前記イオン信号比の変化を前記濃度比の変化に従って図示して線形回帰分析することにより、ＭＡＬＤＩ定量分析用検定線を求めることができる。

前述したように、試料とマトリックスのイオン信号比が温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）によって決定されるという事実は、プロトン交換反応が熱平衡にあることを意味する。前記反応式（１）の反応が熱的平衡状態にあるか否かは、試料の濃度が異なる試片に対して、同じＴ_{ｅａｒｌｙ}における反応商（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｑｕｏｔｉｅｎｔ、Ｑ）が前記試料の濃度に応じて変わるか否かによって確認することができる。

本発明者らは、試料の濃度が異なる多数の試片にレーザーパルスを繰り返し照射してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得た後、特定のＴ_{ｅａｒｌｙ}を有するスペクトルのみを選別することにより、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}は同一であるが試片の組成は異なるスペクトルを得た。また、本発明者らは、こうして得たスペクトルに対して、マトリックスと試料に由来するイオンの強度を測定した。

前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値（イオン信号比）と試片のマトリックス濃度と試料の濃度を前記数式（３）に代入して反応商を求めた結果、本発明者らは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同一であれば、試片に含有された試料の濃度が異なっても前記反応商が一定であるということを見出した。このような結果は、前記反応式（１）が熱平衡状態にあるということを意味する。

マトリックスと試料間のプロトン交換反応が平衡状態にあるため、前記数式（２）および（３）の反応商（Ｑ）を平衡定数（Ｋ）で代替することができる。この場合、前記数式（２）および（３）は、下記数式（６）となる。

Ｋ＝［Ｍ］［ＡＨ^＋］／（［ＭＨ^＋］［Ａ］）＝（［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］）／（［Ａ］／［Ｍ］） ＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）／（［Ａ］／［Ｍ］） …（６）
ＭＡＬＤＩプルームにおけるイオンの量は、中性分子の量より遥かに少ないため、固体試片における［Ａ］／［Ｍ］をＭＡＬＤＩプルームで相応する比率に設定した。前記数式（６）を変形させると、下記数式（７）および（８）の検定線を得る。

［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］＝Ｋ（［Ａ］／［Ｍ］） …（７）
すなわち、Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋＝Ｋ（［Ａ］／［Ｍ］） …（８）
１つのＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋測定値と１つの［Ａ］／［Ｍ］値のみをもっても、前記数式（８）から検定線の傾き、すなわち平衡定数を求めることができる。

また、多数個のＩ_{ＡＨ ＋}／Ｉ_ＭＨ＋測定値と多数個の［Ａ］／［Ｍ］値を統計処理、すなわち回帰分析することにより、前記数式（８）の傾きである平衡定数を求めることもできる。この場合、一つのＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋測定値と一つの［Ａ］／［Ｍ］値のみを用いるときよりさらに正確な平衡定数を求めることができる。

本発明の一つの実施態様において、Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋（すなわち、［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］）を縦軸とし、［Ａ］／［Ｍ］を横軸とすると、傾きがＫである直線を得ることができ、この直線がＭＡＬＤＩ定量分析用検定線（または検定式）である。

前記試片の試料の量が適正の範囲を超過してマトリックス信号減衰効果が７０％を超える場合、前記試片の試料を２倍以上、好ましくは数倍〜数百倍に希釈して、定量分析用検定線を求めることに使用することができる。

本発明の第４の目的は、一定量のマトリックスと未知量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記試料イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記マトリックスのモル濃度と前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を下記数式（９）の定量分析用検定線に代入して前記試料のモル濃度を計算する段階とを含む、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法を提供することによって達成できる。

［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ …（９）
また、本発明の第４の目的は、一定量のマトリックスと未知量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記マトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記マトリックスのモル濃度と前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を下記数式（９）の定量分析用検定線に代入して前記試料のモル濃度を計算する段階とを含む、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法を提供することによって達成できる。

［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ …（９）
また、本発明の第４の目的は、一定量のマトリックスおよび第３物質に未知量の試料が混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、（ｉ）前記第３物質イオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、（ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値 (イオン信号比) を測定する段階と、（ｉｉｉ）前記マトリックスのモル濃度と前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を下記数式（９）の定量分析用検定線に代入して前記試料のモル濃度を計算する段階とを含む、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法を提供することによって達成できる。

［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ …（９）
本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法を用いた試料定量分析方法において、前記試片にエネルギーを加える手段がレーザー、または粒子線、その他の放射線などを含む様々な種類の電磁気波でありうる。また、前記レーザーは窒素レーザーまたはＮｄ：ＹＡＧレーザーでありうる。しかも、前記レーザーを試片に照射する際に、前記試片の一地点に多数回照射して多数個の試料イオンスペクトルを得ることができる。

前述したように、前記数式（８）によれば、Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋は［Ａ］／［Ｍ］に比例するが、これは、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルからＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋を測定することにより、固体試片内の試料の量を測定することができるということを意味する。前記数式（８）を変形させると、下記数式（９）を得る。

［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｑ …（９）
すなわち、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いた定量分析において、前記数式（９）を、試料の絶対的な量を求めるための検定線（または検定式) として用いることができる。

より詳しくは、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法を用いた試料定量分析方法の（ｉｉｉ）段階で得た試料イオンの信号強度とマトリックスイオンの信号強度との比、すなわちＩ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋値と既に知っているマトリックスの濃度［Ｍ］値を、本発明のＭＡＬＤＩ定量分析用検定線を求める方法によって求めた検定線（数式（９））を用いて、試料の濃度［Ａ］値を計算することができる。

化学反応に対する平衡状態は、他の化学反応が同時に平衡である場合にも維持されるので、前記数式（９）は、前記マトリックスプルーム内の各成分に対しても成立する。つまり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを利用する本発明の方法によっては、試料または試片が酷く汚染している場合でも特定の試料の定量分析が可能である。したがって、本発明の方法によって、様々な物質が混ぜられている混合物内の様々な成分それぞれに対する定量分析が同時に可能である。

前記試片の試料の量が適正の範囲を超過してマトリックス信号減衰効果が７０％を超える場合、前記試片の試料を２倍以上、好ましくは数倍〜数百倍またはそれ以上に希釈して、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法に使用することができる。
［発明の効果］
本発明の方法によれば、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルから試料とマトリックスのイオン比を求め、これから定量分析検定線を作成することにより、低コストで正確かつ迅速に極微量の試料をＭＡＬＤＩ質量スペクトルを用いて精度よく定量分析することができる。

また、本発明の方法によれば、分析すべき試料が混合物の一成分であるか或いは試料が酷く汚染しているとしても、迅速かつ簡単にＭＡＬＤＩ質量スペクトルを用いて精度かつ再現性よく定量分析することができる。

本発明の実施例１のペプチドイオン［Ｙ_６＋Ｈ］^＋の初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）を求める方法に対する概念図である。 本発明の実施例２において、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡ（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）に３ｐｍｏｌのＹ_５Ｒが含有されている固体試片上の一地点に３３７ｎｍのレーザーパルスを繰り返し照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例２において、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに３ｐｍｏｌのＹ_５Ｋが含有された固体試片上の一地点に３３７ｎｍのレーザーパルスを繰り返し照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例２において、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに３ｐｍｏｌのアンギオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）が含有されている固体試片上の一地点に３３７ｎｍのレーザーパルスを繰り返し照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例３において、試片の厚さによる初期プルーム温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）の変化を示すグラフである。 本発明の実施例４の［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋のＰＳＤスペクトルである。 本発明の実施例５のＹ_５Ｒ：ＣＨＣＡ＝１：８３００の試片から得たＭＡＬＤＩスペクトルの中でも、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋ付近のスペクトルである。 本発明の実施例５のＹ_５Ｋ：ＣＨＣＡ＝１：８３００の試片から得たＭＡＬＤＩスペクトルの中でも、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋ付近のスペクトルである。 本発明の実施例５のアンギオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）：ＣＨＣＡ＝１：８３００の試片から得たＭＡＬＤＩスペクトルの中でも、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋ付近のスペクトルである。 本発明の実施例６で求めたＹ_５ＲとＹ_５Ｋのマトリックスとのプロトン交換反応商を示す。 本発明の実施例７で求めたＹ_５ＲとＹ_５Ｋに対するＭＡＬＤＩ定量分析用検定線である。 本発明の実施例８で９種のペプチド、タモキシフェンおよびマトリックスの混合試片に対して得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１０において、ａ）３１〜４０回目の照射、（ｂ）８１〜９０回目の照射および（ｃ）２９１〜３００回目の照射の範囲にわたって平均して得た、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する試片上の一地点で得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１０において、レーザーパルスエネルギー閾値の（ａ）２倍、（ｂ）３倍および（ｃ）４倍で得た、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する真空乾燥試片に対してＴＩＣを用いて選択されたＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１０でＴＩＣによる選択（９００±１８０ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅ）によって得たＹ_５ＫのＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩにおける検定線である。 本発明の実施例１１で９００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅに予め設定されたＴＩＣを用いて、（ａ）３１〜４０回目の照射、（ｂ）８１〜９０回目の照射、（ｃ）１３１〜１４０回目の照射および（ｄ）２９１〜３００回目の照射の範囲にわたって平均して得た、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する試片上の一地点でＴＩＣ制御によって得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１１で２５００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅに予め設定されたＴＩＣを用いて、（ａ）３１〜４０回目の照射および（ｂ）６１〜７０回目の照射の範囲にわたって平均して得た、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する試片上の一地点でＴＩＣ制御によって得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１１で（ａ）真空乾燥および（ｂ）空気乾燥によって製造された、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する試片、そして（ｃ）１００ｎｍｏｌのＤＨＢに２０ｐｍｏｌのＹ_６を含有する試片に対する写真である（スケールバー＝３００μｍ）。 （ａ）および（ｂ）は本発明の実施例１１で２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する空気乾燥試片に対して、ＴＩＣ制御をしていないままで得たＭＡＬＤＩスペクトルであり、（ｃ）および（ｄ）は同一の試片に対して９００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅの予め設定された値を用いたＴＩＣ制御によって得たＭＡＬＤＩスペクトルである。 本発明の実施例１２で求めたペプチドＤＬＧＥＥＨＦＫに対する検定線を示す。マトリックス信号減衰は中空の円で表示されている。

以下、下記の実施例または図面を挙げて本発明をより具体的に説明する。なお、下記の実施例または図面に対する説明は、本発明の具体的な実施態様を特定して説明しようとするものに過ぎず、本発明の権利範囲をこれらに記載されている内容に限定し、或いは制限解釈しようと意図するものではない。

実験
本発明者らが自体製作したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器を使用した（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｓｈｉｎ， Ｙ． Ｓ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ．Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．２０１０， ３１， ９２−９９；Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｃｈｏｉ， Ｋ． Ｍ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００６， ２０， ２２０１−２２０８）。前記機器の重要な側面の１つは、内部電圧に一次および二次成分があるリフレクトロン （ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）を装着しているということである（Ｏｈ， Ｊ． Ｙ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００４， １５， １２４８−１２５９；Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．２０１０， ３１， ９２−９９）。したがって、プロンプトイオン（ｐｒｏｍｐｔ ｉｏｎ）とこれらのＩＳＤおよびＰＳＤ生成物を同時に検出することができる（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１， ２２， １０７０−１０７８）。

特に言及がない限り、窒素レーザー（ＭＮＬ１００、Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の３３７ｎｍ出力を、焦点距離１００ｍｍのレンズで集めてＭＡＬＤＩに使用した。また、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（ＳＬＩＩＩ−１０、Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）の３５５ｎｍ出力も同じレンズで集めて使用した。

信号対雑音比を改善するために、２０回のレーザー照射で得たスペクトルを合わせた。そして、２０個の異なる地点で得たスペクトルのうち、照射数が同じものを合わせた。よって、最終スペクトルの各地点は、４００回のレーザー照射で得た結果を合わせたものである。各ピークをなすイオンの数を計算する方法は、文献に報告されたところに従う（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｓｈｉｎ， Ｙ． Ｓ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ．Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｓｈｉｎ， Ｙ． Ｓ．；Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２， ２３， １６２−１７０）。

３３７ｎｍを使用したペプチドＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩにおいて、閾値レーザーパルスのエネルギー、すなわち閾値は０．５０μＪ／ｐｕｌｓｅであった。レーザービームの様子が改善されたため、この値は、従来の文献に報告された値である０．７５μＪ／ｐｕｌｓe（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｓｈｉｎ， Ｙ． Ｓ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ．Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｓｈｉｎ， Ｙ． Ｓ．；Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２， ２３， １６２−１７０）より小さかった。３５５ｎｍにおける閾値は０．４０μＪ／ｐｕｌｓｅであった。

試料として、ペプチドＹ_５Ｘ（Ｙ＝チロシン、Ｘ＝Ｋ（リジン）またはＲ（アルギニン）；Ｐｅｐｔｒｏｎ、大田、大韓民国）、アンギオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）およびＣＨＣＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用した。各ペプチドの貯蔵水溶液を希釈して必要な濃度を作った後、水とアセトニトリルを溶媒として用いて作ったＣＨＣＡ溶液と混合した。各混合物１μＬをターゲットにのせた後、真空乾燥させた。試片は２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡと１または３ｐｍｏｌのペプチドから構成された。

実施例１．Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を求める方法
本発明者らの初期プルーム（ｅａｒｌｙ ｐｌｕｍｅ）温度を求めるための反応速度論的方法に従う（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１， ｖｏｌ ２２， １０７０−１０７８；Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１０， ｖｏｌ ２１， １８７６−１８８３）。

まず、ＩＳＤ、ＰＳＤ、およびＩＳＤのＰＳＤによって作られる生成物の相対強度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから測定した。この資料からイオン源の出口におけるペプチドイオンの生存確率（Ｓ_ｉｎ）と検出器における生存確率（Ｓ_ｐｏｓｔ）を計算した。［Ｙ_６＋ Ｈ］^＋の分解の場合、前記イオンの総分解速度定数は、ｋ（Ｅ）、時間分別光分解に関する研究（Ｙｏｏｎ， Ｓ． Ｈ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９、 ２０、１５２２−１５２９）で既に決定した。反応速度論的分析において５０ｎｓをＩＳＤの閾値寿命（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｉｆｅｔｉｍｅ）とした。これは、反応速度定数としては１．４×１０^７ｓ^−１に該当し、内部エネルギーとしては１３．１５７ｅＶに該当する。その次、内部エネルギー分布関数で１３．１５７ｅＶより小さい部分がＳ_ｉｎとなるようにすることより、初期プルームの有効温度（Ｔ_{ｅａｒｌｙ}）を決定した。末期プルーム（ｌａｔｅ ｐｌｕｍｅ）の温度も同様の方法で決定したが、この際は５．４×１０^４ｓ^−１を速度定数の閾値として使用した。使用したレーザーフルエンス（ｆｌｕｅｎｃｅ）が文献１での場合より大きかったので、今回決定したＴ_{ｅａｒｌｙ}値は、本発明者らが従来報告した８８１Ｋ（Ｂａｅ， Ｙ． Ｊ．；Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｈ．；Ｋｉｍ， Ｍ． Ｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１， ｖｏｌ ２２， １０７０−１０７８）より多少高かった。

前述した方法では、反応速度論的方法によってペプチドの温度を求めるためにはそれの分解反応速度定数ｋ（Ｅ）を知らなければならない。本発明者らの方法を逆に使用することによりｋ（Ｅ）を求めることができることを明らかにしたうえ、［Ｙ_５Ｒ＋Ｈ］^＋の分解反応についてパラメーターＥ_０＝０．６６０ｅＶと

を報告し、［Ｙ_５Ｋ＋Ｈ］^＋の分解反応についてはパラメーターＥ_０＝０．６３０ｅＶと

を報告した。このパラメーターを用いて各ペプチドイオンのＲＲＫＭ（Ｒｉｃｅ−Ｒａｍｓｐｅｒｇｅｒ−Ｋａｓｓｅｌ−Ｍａｒｃｕｓ）の速度関数（ｋ（Ｅ））を計算した。その計算結果を用いて、様々な実験条件下でのＴ_{ｅａｒｌｙ}を求めることができる。

ペプチドイオン［Ｙ_６＋Ｈ］^＋について図１を参照すると、ＭＡＬＤＩスペクトルに現れるペプチド関連イオンの強度を測定し、これからイオン源内でのペプチドイオンの生存確率を求める。ＭＡＬＤＩ測定条件を考慮し、ペプチドイオンが生存することが可能な最高速度定数を求める。その後、温度を変化させながらペプチドイオンの内部エネルギー分布を求め、最高速度定数より小さい領域の確率が生存確率と同一になる温度を取る。

実施例２．照射数(shot number)による全体スペクトルパターンの変化
試片上の一地点(spot)を３３７ｎｍの窒素レーザーパルスで繰り返し照射しながらデータを収集することにより、１セットのＭＡＬＤＩスペクトルを得た。２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに３ｐｍｏｌのＹ_５Ｒが含有された試片を閾値の６倍のパルスエネルギーで２００回照射して得たスペクトルの一部が図２に示されている。図２の各スペクトルは、（ａ）１回〜２０回、（ｂ）４１回〜６０回、（ｃ）８１回〜１００回、（ｄ）１４１回〜１６０回および（ｅ）１８１回〜２００回の照射数（ｓｈｏｔ ｎｕｍｂｅｒ）にわたってのスペクトルを合わせたものである。ペプチド（［Ｙ_５Ｒ＋Ｈ］^＋）とマトリックス（［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋）イオンだけでなく、これらのＩＳＤ生成物、例えば、ペプチドイオンから作られるインモニウムイオンＹとマトリックスイオンから作られる［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋と［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋だけでなく、マトリックス二量体イオン（［２ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋）も前記スペクトルに示されている（ＰＳＤピークは＊で表示した）。前記スペクトルには、ペプチドイオンの分解生成物であるｂ、ｙ、およびこれらの分解生成物も示されているが、その強度はインモニウムＹよりも非常に小さい。ペプチドイオンのＰＳＤ生成物のピークも非常に小さく示されている。小さいけれども明らかに現れるピークの大部分は、マトリックスから作られたものである。図２に示されるイオンの種類は照射数を問わずに同一であるが、照射数が変わるにつれてそれらの相対強度が変わることを確認することができる。驚くべきことに、照射数によるスペクトルパターンの変化様相が再現性あることを観測したとともに、その誤差は１０〜２０回の照射(shot)に過ぎなかった。

前述のように、ＭＡＬＤＩスペクトルの全体パターンを特徴付ける３つの要素は、ペプチドイオンの相対強度、マトリックスイオンの相対強度、並びにペプチドイオンおよびマトリックスイオンの分解パターンである。図２から分かるように、照射（ｓｈｏｔ）が続けられるにつれて、この３つの要素がいずれも変化した。第一に、ペプチドイオンに対するインモニウムイオンＹの相対強度は徐々に減少した（他のＩＳＤ生成物もやはり減少した）。第二に、マトリックスの質量スペクトルパターンも徐々に変化したが、特に［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋イオンが弱くなった。第三に、ペプチド由来イオンがＣＨＣＡ由来イオンに比べて相対的にさらに多くなった。

Ｙ_５Ｋ（図３）とアンギオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）ＩＩ（図４）に対しても、同様の傾向が観察された。図３には、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに３ｐｍｏｌのＹ_５Ｋが含有された固体試料上の一地点に３３７ｎｍのレーザーパルスを繰り返し照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルが示されているが、使用されたレーザーパルスのエネルギーは閾値の６倍であり、各スペクトルは（ａ）１回〜２０回、（ｂ）４１回〜６０回、（ｃ）８１回〜１００回、（ｄ）１４１回〜１６０回、および（ｅ）１８１回〜２００回の照射数にわたってのスペクトルを合わせたものである。インモニウム（Ｙ）イオンが［Ｙ_５Ｋ＋Ｈ］^＋の主なＩＳＤ生成物であり、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋と［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋が［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋のＩＳＤ生成物である（ＰＳＤピークは＊で表示した）。図４には、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに３ｐｍｏｌのアンギオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）が含有された固体試料上の一地点に３３７ｎｍのレーザーパルスを繰り返し照射して得たＭＡＬＤＩスペクトルが示されているが、使用されたレーザーパルスエネルギーは閾値の６倍であり、各スペクトルは（ａ）１回〜２０回、（ｂ）４１回〜６０回、（ｃ）８１回〜１００回、（ｄ）１４１回〜１６０回、および（ｅ）１８１回〜２００回の照射数にわたってのスペクトルを合わせたものである。インモニウムイオン、Ｐ、Ｖ、Ｈ、Ｙが［ＤＲＶＹＩＨＰＦ＋Ｈ］^＋の主なＩＳＤ生成物であり、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋と［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋が［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋のＩＳＤ生成物である（ＰＳＤピークは＊で表示した）。

実施例３．照射数による有効温度の変化
照射が続けられるにつれて生成物の相対強度が減少するというのは、ペプチドの平均内部エネルギーが減少することを意味する。初期プルームで熱平衡が成り立つと仮定すると、これはＴ_{ｅａｒｌｙ}が益々低くなることを意味する。レーザーを照射し続けるときに起こることの一つは、レーザーを照射した地点の厚さが益々薄くなることである。よって、試片が薄くなるにつれてＴ_{ｅａｒｌｙ}が益々低くなる。試片が薄くなるほどＴ_{ｅａｒｌｙ}が減少することは熱伝導効率が良くなるためであるかを確認するために、組成が同じで（Ｙ_５Ｒ：ＣＨＣＡ＝１：２５０００）厚さが異なる（０．９〜２．１μｍ）試片を準備した。また、厚さ５０ｎｍのフルオロカーボン（ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ）層をコートしたアンカーチッププレート（ａｎｃｈｏｒ ｃｈｉｐ ｐｌａｔｅ）の疎水性部分の上に試片を準備した。レーザーパルスエネルギーは閾値の６倍を使用し、初期２０回の照射で得たスペクトルを加えた。各スペクトルで測定したＳ_ｉｎからＴ_{ｅａｒｌｙ}を計算した。試片の厚さによるＴ_{ｅａｒｌｙ}の変化が図５（ステンレス鋼の表面：●、フルオロカーボン層：○）に示されており、これは、試片が薄いほど熱伝導が効率的であることを意味する。フルオロカーボン層上の試片に対して求めたＴ_{ｅａｒｌｙ}は、露出した金属板上の試片から得た値よりも高かった。これは、フルオロカーボン層が熱流れに対して不導体として作用していることを意味する。結論的に、ペプチドイオンの分解収率からＴ_{ｅａｒｌｙ}を決定することができ、照射が続けられるにつれて温度が下がる。

実施例４．照射数による［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋分解パターンの変化
ＰＳＤが起こる時間領域（約１０μｓ）は、ＩＳＤが起こる時間領域（数十ナノセカンド（ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ））よりも遥かに長いので、すなわちＰＳＤの反応速度が遥かに遅いので、低エネルギー反応はＩＳＤよりはＰＳＤでさらに有利である。［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋のＰＳＤスペクトル（図６）において、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋イオンが最も大きい生成物であり、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋イオンは［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋の１０％に過ぎなかった。これは水の損失反応が二酸化炭素の損失反応よりもさらに低エネルギー反応であることを意味する。図２にあるＭＡＬＤＩスペクトルにおいて、照射が続けられるにつれて、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋に比べて、ＩＳＤによって生成された［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋イオンが減少した。これは、照射が続けられるにつれてＴ_{ｅａｒｌｙ}が低くなるという意味である。すなわち、ＣＨＣＡ質量スペクトルのパターンも温度によって決定される。

実施例５．ペプチドとマトリックスのイオン信号比
Ｙ_５Ｒ：ＣＨＣＡ（ペプチドとマトリックスの比）が１：８３００である試片に対し、４つの条件の下で実験を行った。実験条件を（Ｙ_５Ｒのｐｍｏｌ、ＣＨＣＡのｎｍｏｌ、閾値を単位とするレーザーパルスエネルギー、レーザー波長）で表示するとき、使用した実験条件は、（ａ）（３、２５、×６、３３７）（照射数７１〜９０の範囲）、（ｂ）（３、２５、×４、３３７）（照射数５１〜７０の範囲）、（ｃ）（４．２、３５、×６、３３７）（照射数１０１〜１２０の範囲）、（ｄ）（３、２５、×６、３５５）（照射数３１〜５０の範囲）であった。各セットからＴ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋであるスペクトルを一つずつ選び出し、４つのスペクトルを図７（ａ）〜（ｄ）に示した。前記４つのスペクトルは実質的に同じである。他の温度でもこのような類似性が観測された。

また、Ｙ_５Ｋ（図８）とアンギオテンシンＩＩＩ（図９）でもこのような類似性が観測された。図８には、Ｙ_５Ｋ：ＣＨＣＡ（ペプチドとマトリックスの比）が１：８３００である試片に対して４つの条件、すなわち、（ａ）（３、２５、×６、３３７）（照射数６１〜８０の範囲）、（ｂ）（３、２５、×４、３３７）（照射数４１〜６０の範囲）、（ｃ）（４．２、３５、×６、３３７）（照射数７１〜９０の範囲）、（ｄ）（３、２５、×６、３５５）（照射数２１〜４０の範囲）で得たＭＡＬＤＩスペクトルセットのうち、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋ付近であるスペクトルが示されている。図９には、アンギオテンシンＩＩの（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）：ＣＨＣＡ（ペプチドとマトリックスの比）が１：８３００である試片に対して４つの条件、すなわち、（ａ）（３、２５、×６、３３７）（照射数７１〜９０の範囲）、（ｂ）（３、２５、×４、３３７）（照射数３１〜５０の範囲）、（ｃ）（４．２、３５、×６、３３７）（照射数８１〜１００の範囲）、（ｄ）（３、２５、×６、３５５）（照射数２１〜４０の範囲）で得たＭＡＬＤＩスペクトルセットのうち、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が９６８Ｋ付近であるスペクトルが示されている。

すなわち、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じスペクトルのみを比較すると、ペプチドのＭＡＬＤＩスペクトルは再現できる。ペプチドとマトリックスの比が異なる試片の場合、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同じスペクトルを選択すると、ペプチドイオンとマトリックスイオンの分解パターンはそれぞれ同一に現れた。但し、ペプチドとマトリックスのイオン信号比のみが異なった。

実施例６．プロトン交換反応の平衡
ＭＡＬＤＩ質量分析法において、マトリックス（Ｍ）からペプチド（Ｐ）にプロトンが移動する反応、すなわち、ＭＨ^＋＋Ｐ→Ｍ＋ＰＨ^＋が起こる。前記ＭＨ^＋はプロトン提供者であって、本実施例の場合には［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋、または［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋である。ペプチドとマトリックスのイオン信号比が温度によって決定されるというのは、プロトン交換反応がほぼ熱平衡にあることを意味する。これを確認するために、一つは濃度が異なる試片に対して同じＴ_{ｅａｒｌｙ}で反応商（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｑｕｏｔｉｅｎｔ）、Ｑ＝（［Ｍ］／［Ｐ］）（［ＰＨ^＋］／［ＭＨ^＋］）を求め、これが濃度に応じて変わるかを調べた。ＣＨＣＡ２５ｎｍｏｌにＹ_５ＲまたはＹ_５Ｋが０．３ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌ含有された試片にレーザーを繰り返し照射してＭＡＬＤＩスペクトルセットを得た後、各スペクトルに対してＴ_{ｅａｒｌｙ}を計算した。そして、定められたＴ_{ｅａｒｌｙ}を有するスペクトルのみを選別することにより、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}は同じが試片の組成は異なるスペクトルセットを得た。前記セットにあるスペクトルに対して、マトリックスとペプチドに由来するイオンの強度を測定した。Ｑを計算するためには、ＭＨ^＋が何であるかを知らなければならないが、Ｑが一定であるかどうかを知ることだけが目的であれば、プロトン提供者になれるどんなイオンの強度を使用しても問題になることはない。なぜならＴ_{ｅａｒｌｙ}が決まったら、マトリックスに由来するすべてのイオンの相対強度は決まるからである。マトリックスイオンの分解パターンが濃度に関係ないというのは、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋のような断片イオンが主なプロトン提供者でないことを意味する。もし断片イオンの一つが主なプロトン提供者であれば、ペプチドの量が増加するにつれて［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋よりもその断片イオンがより速く減少するからである。したがって、主なプロトン提供者は［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋イオンである可能性が高い。プロトンを失っていないマトリックスイオンの一部は分解するだろうという仮定の下に、マトリックスに由来するすべてのイオンの強度の和、すなわちΣ［ｍａｔｒｉｘ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｏｎ］をＱの計算において［ＭＨ^＋］とした。同様に、Σ［ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｏｎ］を［ＰＨ^＋］とした。気相中性分子の比、すなわち（［Ｍ］／［Ｐ］）の計算のために、固体試片におけるマトリックスとペプチドの比を使用した。図１０には９５０ＫのＴ_{ｅａｒｌｙ}で得たＱ値を固体試片に含有されたペプチド（●：Ｙ_５Ｒ、○：Ｙ_５Ｋ）の量に対する関数で示した。図１０より、Ｑ値がペプチド量に関係ないことを明らかに確認することができる。これはプロトン交換反応がほぼ熱平衡にあることを意味する。つまり、図１０のＱ値は実質的に平衡定数Ｋに該当する。マトリックスからペプチドへプロトンが移動する反応の平衡定数Ｋは、Ｙ_５Ｒの場合がＹ_５Ｋの場合よりも大きい。これは、アルギニン（Ｒ）がリジン（Ｋ）よりも強い塩基であるという事実に符合する。

実施例７．検定線
２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｆｍｏｌ〜３０ｐｍｏｌのＹ_５ＲまたはＹ_５Ｋが含有された試片の一地点にレーザーパルスを照射した。イオン信号が消えるまで、前記地点にレーザーパルスを照射してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得た。各スペクトルに対して、ペプチドイオンの断片化パターンを分析してＴ_{ｅａｒｌｙ}を決定した。その後、各スペクトルセットから同じＴ_{ｅａｒｌｙ}を有するスペクトル、すなわちＴ_{ｅａｒｌｙ}が８７０Ｋ〜９００Ｋのスペクトルを選択した。前記マトリックスイオンの断片化パターンがＴ_{ｅａｒｌｙ}に応じて変わるので、前記断片化パターンをＴ_{ｅａｒｌｙ}の測定手段として使用した。［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋／［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋の強度比が３〜４．５であるスペクトルを選択した。図１１の検定線から分かるように、Ｙ_５Ｒ（図１１（ａ）および図１１（ｂ））とＹ_５Ｋ（図１１（ｃ）および図１１（ｄ））で［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］と［Ａ］／［Ｍ］ との間に明確に正比例関係が成り立つ。

実施例８．定量分析−検定線の使用
２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに９種のペプチド（それぞれ０．３ｐｍｏｌ）および１．０ｐｍｏｌのタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）を含有している試片を準備した。前記試片のＭＡＬＤＩスペクトルが図１２に示されている。図１２において、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋／［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋が３〜４．５、すなわちＴ_{ｅａｒｌｙ}が８７０Ｋ〜９００Ｋに該当するように温度を選択した。前記試料に含有されたペプチドのうちＹ_５ＲおよびＹ_５Ｋを、図１１の検定線を用いて定量分析した結果が表１に示されている。

図１１から分かるように、［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］は［Ａ］／［Ｍ］にほぼ正比例する。よって、１つの濃度で得たデータのみでも、正比例関係を用いて未知の試料の量を決定することができる。前記試片の各成分に対するワンポイント検定(one-point calibration)結果が表２に示されている。

表２のタモキシフェンに対する結果から分かるように、ＭＡＬＤＩによってイオン化されるすべての試料に対して本発明の方法が適用できる。

実施例 ９．スペクトル温度（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の尺度−全イオン数（ＴＩＣ）
試料として、ペプチドＹ_６、Ｙ_５ＫおよびアンギオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ））をペプトロン社（大田、韓国）から購入した。マトリックスＣＨＣＡおよびＤＨＢをＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ＣＨＣＡまたはＤＨＢの１：１水とアセトニトリル溶液と試料水溶液を混合した。ＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩにおいて、０ｐｍｏｌ〜２５０ｐｍｏｌの試料と２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡを含有する溶液１μＬをターゲットに載せた後、真空乾燥または空気乾燥させた。Ｙ_６のＤＨＢ−ＭＡＬＤＩ試片を２つの段階で製作した。各段階で、０．５ｐｍｏｌ〜３２０ｐｍｏｌのＹ_６および５０ｎｍｏｌのＤＨＢを含有する溶液１μＬをターゲットに載せた後、真空乾燥させた。

ＭＡＬＤＩスペクトルのＴ_{ｅａｒｌｙ}を測定するために、試料イオンの分解に対する反応速度論的分析が必要なわけではない。マトリックスイオンの分解パターンまたは生成されるイオンの総数もＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として用いることができる。ところが、これらの方法では、試料の種類、濃度および個数が変わるとき、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を容易に計算することが難しい。したがって、実質的な定量分析のために、試料の種類、濃度および個数を問わず、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を容易かつ迅速に計算することが可能な良いＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度が必要である。良いＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度としては次の条件が要求される。

第一に、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の尺度はＴ_{ｅａｒｌｙ}に対して敏感な関数でなければならない。第二に、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の尺度は試料の種類、固体試片内での試料の濃度およびこれらの個数とは関係がないべきである。第三に、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の尺度はスペクトルから前記特性を迅速かつ容易に計算することができなければならない。

試料イオン分解を用いたＴ_{ｅａｒｌｙ}の測定は第２、第３の条件を満たしていない。マトリックスイオン分解パターンを用いる場合でも、マトリックスイオン信号が異なるものによって汚染すると、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の測定が難しい。ＭＡＬＤＩで生成されるイオンの総数をＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度として用いると、第１、第２の条件を満たすことができる。

ところが、リフレクトロンの内部で発生するイオンの分解生成物の損失により、ＭＡＬＤＩによって生成されるイオンの総数を簡単に測定することが難しいため、本発明者らは、これに準じる値として検出器で検出される総粒子数（ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を全イオン数（ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｏｕｎｔ、ＴＩＣ）とし、これをＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度として用いた。ＴＩＣが Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の関数であることを確認するために、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合、試料の種類、濃度および個数を変化させながら、レーザーパルス当たり生成される総粒子数とＴＩＣを表３に示した。

表３に示すように、全イオン数（ＴＩＣ）は、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}の変化（８７５Ｋ→９００Ｋ）に非常に敏感であり、試料の種類、濃度および個数を問わずＴ_{ｅａｒｌｙ}によって決定される値であるので、前述した３つの条件をすべて満たすＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度として使用することができることが分かる。

また、ＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩと同様に、ＤＨＢ−ＭＡＬＤＩにおいてレーザーパルスによって生成されたイオンの総数も、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同一であれば、固体試片内での試料の種類、濃度および個数を問わず実質的に同じであった。前記同じスペクトルから計算したＴＩＣデータが表４に示されており、表４の内容から、ＤＨＢ−ＭＡＬＤＩにおいてもＴＩＣが尺度として使用できることが分かる。

実施例１０．ＴＩＣ によって選択されたスペクトルの定量的再現性
まず、反復的なレーザーパルス照射によるスペクトルの変化を考察してみた。２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを添加した試片を真空乾燥させた後、閾値パルスエネルギー（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｐｕｌｓｅ ｅｎｅｒｇｙ）の２倍であるレーザーパルスを用いて、前記試片の一地点(spot)からＭＡＬＤＩスペクトルセットを得た。

前記スペクトルセットから３１〜４０回目の照射、８１〜９０回目の照射および２９１〜３００回目の照射範囲で得たスペクトルをそれぞれ平均して得たスペクトルが図１３に示されている。初期３０個のスペクトルを使用しなかったが、これはアルカリ添加生成イオン（ａｌｋａｌｉ ａｄｄｕｃｔ ｉｏｎｓ）による汚染が激しかったからである。前記照射範囲で得たスペクトルに対して総和を求めたＴＩＣは、それぞれ１２０００（１２０００）、７３００（５８０００）および１１０（１０６０００）であった（括弧内の数は、それぞれ３１〜４０回目の照射、８１〜９０回目の照射および２９１〜３００回目の照射の間で蓄積されたＴＩＣを意味する）。温度選択をしなかったため、レーザー照射が進行するにつれて、スペクトルパターンおよび各イオンの数が変わった。２９１〜３００回目の照射範囲で、［Ｙ_５Ｋ ＋Ｈ］^＋は他のものよりさらに目立った。しかし、２９１〜３００回目の照射範囲における絶対数値は３１〜４０回目の照射および８１〜９０回目の照射における絶対数値よりも遥かに小さい。実際に、イオン生成は３００回目の照射後にほぼ停止した。このような事実が、３００回目の照射後にレーザーパルスが照射される地点で試片が枯渇したことを意味するものではない。これはレーザーパルスエネルギーを増加させたときにイオン生成がさらに始まったからである。このような現象が起こる理由は、レーザーパルスが照射される地点が益々薄くなるほど前記地点の温度が益々低くなるから、３００回目の照射における融除（ａｂｌａｔｉｏｎ）に対する閾値よりさらに低くなったためである。その後、レーザーパルスエネルギーを増加させることにより、温度を前記融除閾値以上に上昇させたとともにイオン生成が再開した。

本発明者らの以前研究によれば、同じＴ_{ｅａｒｌｙ}でのスペクトルを選択した場合には、与えられた組成の試片から得たＭＡＬＤＩスペクトルが実験条件を問わず定量的に再現可能である。前記研究では、Ｉ（［Ｍ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］^＋）／Ｉ（［Ｍ＋Ｈ］^＋）の比がＴ_{ｅａｒｌｙ}の尺度として使用された。

本発明において、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有した真空乾燥試片に対して類似の測定を行ったとともに、ＴＩＣが１１００±２００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅであるスペクトルを選択した。図１４に示すように、こうして得たスペクトルは実質的に同じであった。また、ＣＨＣＡにアンギオテンシンＩＩが含有された試片に対しても類似の結果を得た。前記結果によれば、ＴＩＣはＴ_{ｅａｒｌｙ}に対する優れた尺度である。また、地点対地点（ｓｐｏｔ−ｔｏ−ｓｐｏｔ）および試片対試片（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ｓａｍｐｌｅ）の再現性を確認した結果、ＴＩＣを用いたスペクトル獲得温度選択（ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）に対する前記戦略が適切であることを発見した。

２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに０．０１ｐｍｏｌ〜２５０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する真空乾燥試片に対するＭＡＬＤＩスペクトルを得た後、ＴＩＣが９００±１８０ｉｏｎｓ／ ｐｕｌｓｅであるスペクトルを選択した。前記選択されたスペクトルから［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］対［Ａ］／［Ｍ］のデータを計算した。前記計算結果が図１５の（ａ）に示されている。前記検定線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）の優れた線形性（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）は温度選択のためのＴＩＣの有用性を立証する。

実施例１１．ＴＩＣ制御による再現性のあるスペクトルの獲得
ＭＡＬＤＩスペクトルにおいて、ＴＩＣを制御するためにレーザーパルスエネルギーを変化させた。レーザーの後端に設置された円形の可変中性密度フィルター（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ）（Ｍｏｄｅｌ ＣＮＤＱ−４−１００．ＯＭ、ＣＶＩ Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ、ＵＳＡ）を回転させてレーザーパルスエネルギーを手動で調節した。前記円形の可変中性密度フィルターをステップモーターの上に設置し、データシステムからの命令によって前記フィルターを回転させることにより、前記レーザーパルスエネルギーをシステム的に調整した。

前記レーザーパルスエネルギーを制御するために、ネガティブフィードバック （ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ）方式を採用した。照射地点からデータを得始める時点で、前記レーザーパルスエネルギーを閾値の２倍に設定し、１０個の単一照射スペクトル（ｔｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ｓｈｏｔ ｓｐｅｃｔｒａ）を得てそれらを平均した。こうして得たスペクトルから、ＴＩＣを計算し、前記計算されたＴＩＣ値を予め設定された値と比較して、次のレーザーパルスエネルギーに必要な調整値を計算した。前記計算された調整値を用いて、前記フィルターの回転方向および角度を決定した。前記フィルターの角度調整が終わった後、スペクトルをさらに得た。反復的なレーザー照射によって前記地点で試片が枯渇したとき、スペクトルの獲得を終了した。ＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩに対して、前記レーザーパルスエネルギーが閾値の３倍になったときに終了した。

２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する真空乾燥試片に対する実験を繰り返し行った。予め設定された値として９００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅのＴＩＣを用いてレーザーパルスエネルギーをフィードバック調整した。３１〜４０回目の照射、８１〜９０回目の照射、１３１〜１４０回目の照射および２４１〜２５０回目の照射範囲で平均したスペクトルが図１６に示されている。前記照射範囲における総ＴＩＣはそれぞれ９０００（９０００）、８６００（５３０００）、９０００（１０３０００）、および８１００（１８８０００）であり、括弧内の数は３１〜４０回目の照射、８１〜９０回目の照射、１３１〜１４０回目の照射および２４１〜２５０回目の照射の間で蓄積されたＴＩＣを示す。前記レーザーパルスエネルギーが閾値の３倍になった２５０回目の照射でスペクトルの獲得を終了した。図１６に示すように、スペクトルパターンおよびイオン数がいずれも前記地点での測定中に類似に現れた。これは、ＴＩＣ制御によって再現性のあるスペクトルを成功的に得たことを立証する。

ＴＩＣを制御していないままで得たスペクトルセット（図１３）から、ＴＩＣが９００±１８０ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅであるスペクトルを選別した。前記選択されたスペクトルに対するＴＩＣの和は１９０００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅであった。すなわち、ＴＩＣ制御スペクトルで蓄積されたＴＩＣたる１８８０００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅは、ＴＩＣによって選別されたスペクトルで蓄積されたＴＩＣよりも遥かに大きかった。これは、定量的に再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得るためにはＴＩＣを制御してスペクトルを得ることがＴＩＣによってスペクトルを選別することよりもさらに効率的であることを示唆する。前記方法で窒素レーザーの出力を固定した後、前記フィルターの透過率を変化させることにより、試片でのパルスエネルギーを調節した。

前述した方法を代替することが可能な方法として、レーザーの出力自体を直接調節する方法の適否を調査するために、窒素レーザーの代わりに波長３５５ｎｍのＮｄ：ＹＡＧ（ＳｕｒｅｌｉｔｅＩＩＩ−１０、Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）レーザーを使用した。前記波長におけるパルスエネルギーの閾値は０．２５μＪ／ｐｕｌｓｅであった。２５００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅをＴＩＣの基準値として使用した。パルスエネルギー閾値の２倍に相当するレーザー出力を用いてスペクトルを得始めた。１０個のスペクトルを得た後、ＴＩＣを計算して基準値と比較した。ＴＩＣが基準値を回復するようにするために、パルスエネルギーを調節した。この際、レーザーのＱスイッチング（Ｑ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）の遅延時間を調節してパルスエネルギーを調節したが、レーザーの出力を変える方法はレーザー別に異なり得る。図１７の（ａ）のスペクトルは、パルスエネルギーを閾値の２倍に固定して得た（３１〜４０回目の照射）。その後、ＴＩＣ制御によってレーザー出力を調節した。こうして得た６１〜７０回目の照射の結果が図１７の（ｂ）のスペクトルである。前記２つのスペクトルは非常に類似し、レーザーの出力調節を用いたＴＩＣ制御により成功的にスペクトルを再現したことを示す。比較のために、レーザーの出力を閾値の２倍に固定して得た６１〜７０回目の照射のスペクトルが図１７の（ｃ）に示されている。レーザーの出力を固定した後、フィルターを用いて試片でのパルスエネルギーを調節した場合と同様に、レーザーの出力を直接調節した場合にも成功的に再現性のあるスペクトルを得ることができることが分かる。

ペプチド／ＣＨＣＡ溶液を真空乾燥させて得た試片は比較的均質である。真空乾燥した試片に対する写真が図１８の（ａ）に示されている。試片の地点対地点の再現性を確認するために、真空乾燥したペプチド／ＣＨＣＡ試片上の多くの地点からＴＩＣ制御によるスペクトルを得た。こうして得たスペクトルはレーザー照射地点を問わずに類似している。ＴＩＣ制御をしない場合には、同じ地点で得たスペクトルすらも再現性がないため、地点対地点の変化を確認することが無意味である。

与えられた組成の溶液をターゲットに載せた後で乾燥させると、固体試片の初期厚さは溶液の体積および試片の直径に影響を受ける。これは、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}に影響を与えるとともに、ＭＡＬＤＩスペクトルにおける試片対試片（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ｓａｍｐｌｅ）の非再現性をもたらすであろう。Ｔ_{ｅａｒｌｙ}を予め設定された値の近くに維持することが主要戦略であるので、前記問題点が容易に克服されるであろう。これを確認するために、図１６のスペクトルを得るために使用したものと同一の溶液を用いて試片を製造したが、１．０μＬを使用した図１６の場合とは異なり２．０μＬの溶液を用いた。前記溶液の体積を２倍に増加させた場合、試片の厚さが約４０％増加したと測定された。ＴＩＣ制御のために同一に予め設定された値、すなわち９００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅを用いて前記試片からＴＩＣ制御によるスペクトルを得た。前記スペクトルのパターンは図１６のスペクトルと類似している。これは、ＴＩＣ制御によって、試片をターゲットに載せるときに発生した誤差を減らすことができることを意味する。

ペプチド／ＣＨＣＡ溶液を空気乾燥させて製造した試片は均質ではなかった。空気乾燥した試片に対する写真が図１８の（ｂ）に示されている。真空乾燥した試片は比較的連続的なフィルムを形成したが（図１８の（ａ））、空気乾燥した試片ではマトリックス微小結晶（ｍａｔｒｉｘ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｔｅｓ）が島のように存在する（図１８の（ｂ））。試片の不均質性によるスペクトルの再現性に対する制限を確認するために、図１６のスペクトルを得るために使用したものと同一の溶液を用いて空気乾燥させることにより、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに１０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する試片を製造した。ＴＩＣ制御をしていないままで前記空気乾燥した試片から得た、各地点に対して平均したＭＡＬＤＩスペクトルは、図１９の（ａ）および（ｂ）に示された２つの典型的なスペクトルに現われているように、顕著な地点対地点の偏差を見せた。このような現象は、部分的には前記空気乾燥した試片のレーザー焦点の微小結晶の数が３〜５個と偏差を示すからであると予想される。

次に、ＴＩＣ制御によって類似の実験を行った。図１９の（ｃ）および（ｄ）に示された２つの典型的なスペクトルに現れているように、ＴＩＣ制御によって、他の地点から得たＭＡＬＤＩスペクトルが定量的に、すなわちパターンおよび各イオンの絶対的な量がすべて類似になった。また、図１９の（ｃ）および（ｄ）において、空気乾燥した試片に対するＴＩＣ制御による地点−平均スペクトル（ＴＩＣ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｐｏｔ−ａｖｅｒａｇｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ）が、図１６の真空乾燥した試片に対するＴＩＣ制御によるスペクトルと比較的類似していることは注目すべきである。詳しくは、前記２つの場合においてＴＩＣに対して同一に予め設定された値を使用した場合にも、前記空気乾燥試片から得たスペクトルと関連付けられているＴ_{ｅａｒｌｙ}が、前記真空乾燥試片から得たスペクトルと関連付けられているＴ_{ｅａｒｌｙ}よりもやや高い傾向がある。例えば、［ＣＨＣＡ＋Ｈ−ＣＯ_２］^＋対［ＣＨＣＡ＋Ｈ］^＋の比率が前記真空乾燥した試片よりも前記空気乾燥試片でやや少し大きい。このような現象は次のとおり説明できる。二つの異なる試片から同じ個数のイオンを生成するために、前記空気乾燥した試片に対するＴ_{ｅａｒｌｙ}は前記真空乾燥した試片に対するＴ_{ｅａｒｌｙ}よりややさらに高くなければならないが、これはレーザー照射に晒された試片の面積が空気乾燥試片でさらに小さいためである。著しく異なる形態(morphology)を持つ前記２つの試片から得たスペクトルがＴＩＣ制御によって類似になったという事実を注目すべきである。

２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに０．０１ｐｍｏｌ〜２５０ｐｍｏｌのＹ_５Ｋを含有する真空乾燥試片に対して、予め設定された値として９００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅのＴＩＣを用いるＴＩＣ制御によって得たスペクトルを用いて、［ＡＨ^＋］／［ＭＨ^＋］対［Ａ］／［Ｍ］のプロットを求めた。こうして得た検定線も図１５の（ｂ）に示されている。図１５の（ｂ）に示された検定線は優れた線形性を示す。

また、ＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩと同様に、ＤＨＢ−ＭＡＬＤＩでレーザーパルスによって生成されたイオンの総数も、Ｔ_{ｅａｒｌｙ}が同一であれば、固体試片内での試料の種類、濃度および個数を問わず実質的に同じであった。前記同じスペクトルから計算したＴＩＣデータが表４に示されており、表４の内容から、ＤＨＢ−ＭＡＬＤＩにおいてもＴＩＣが尺度として使用できるということが分かる。

予め設定された値として１３００ｉｏｎｓ／ｐｕｌｓｅのＴＩＣを用いて、１００ｎｍｏｌのＤＨＢに２０ｐｍｏｌのＹ_６を含有する試片上の一地点に対して繰り返し照射してＴＩＣ制御によるＭＡＬＤＩスペクトルセットを求めた。前記試片のレーザー照射地点での測定全体に対してスペクトルのパターンおよびイオン数がいずれもＣＨＣＡ−ＭＡＬＤＩの場合と類似している。また、１００ｎｍｏｌのＤＨＢに１．０ｐｍｏｌ〜６４０ｐｍｏｌのＹ_６を含有する試片に対する検定線を求めた。図１５の（ｃ）に示されている検定線の線形性は、ＤＨＢ−ＭＡＬＤＩを用いる定量分析においてもＴＩＣ制御の有用性を示す。

実施例１２．マトリックス信号減衰効果
５０ｐｍｏｌのＤＬＧＥＥＨＦＫと、２５ｎｍｏｌのＣＨＣＡに含まれた６．５ｐｍｏｌのシトクロムＣのトリプシン消化液を含有する試片を準備した。実施例１１に記載されたＴＩＣ制御方法に従って、１回のレーザー照射あたりＴＩＣを３０００個に設定して質量スペクトルを得た。こうして得た質量スペクトルから求めた、前記試料ＤＬＧＥＥＨＦＫに対する検定線が図２０に示されている。前記試片に対するマトリックス信号減衰効果は９４％であった。質量スペクトルを用いてＤＬＧＥＥＨＦＫを定量分析した結果は９．７ｐｍｏｌであり、正確な値は５０ｐｍｏｌであった。

前記試片の試料を２．０倍に希釈したとき、マトリックス信号減衰効果は７８±７％であった。この値は前記数式（４）から予測された８４％とよく一致した。ところが、前記試料に対する定量分析結果は１９±４ｐｍｏｌであり、前記試料の正確な値５０ｐｍｏｌに比べて定量分析結果が依然として良くなかった。

前記試片の試料を１０倍に希釈したとき、マトリックス信号減衰効果は５５±４％であった。この値は前記数式（４）から予測された５９％とよく一致した。前記試料に対する定量分析結果は５１±６ｐｍｏｌであり、前記試料の正確な値５０ｐｍｏｌに比べて定量分析結果がよく一致した。

Claims (4)

1. 一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、
   （ｉ）前記試料イオンまたはマトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、
   （ｉｉ）前記（ｉ）で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階を含むことを特徴とし、
   前記イオン信号比を、前記試料の濃度を前記マトリックスの濃度で割った値である濃度比で割って、一定の温度で前記マトリックスと前記試料間のプロトン交換反応の平衡定数を測定する方法。
2. 一定量のマトリックスと一定量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、
   （ｉ）前記試料イオンまたはマトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、
   （ｉｉ）前記（ｉ）段階で選別された質量スペクトルに現れた試料イオンの信号強度をマトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、
   （ｉｉｉ）前記（ｉｉ）段階のイオン信号比を、前記試片の試料濃度をマトリックスの濃度で割った値である濃度比の変化に従って図示し、定量分析用検定線を求める方法。
3. 前記マトリックスの濃度を一定にしたままで前記試料の濃度を変化させながら前記（ｉ）段階〜前記（ｉｉｉ）段階を多数回繰り返し行って得た前記イオン信号比の変化を前記濃度比の変化に従って図示して線形回帰分析することにより、定量分析用検定線を求めることを特徴とする、請求項２に記載の定量分析用検定線を求める方法。
4. 一定量のマトリックスと未知量の試料とが混合された試片にエネルギーを加えて形成されるイオンから得られる多数の質量スペクトルの中で、
   （ｉ）前記試料イオンまたはマトリックスイオンの分解パターンが互いに同じである質量スペクトルのみを選別する段階と、
   （ｉｉ）前記（ｉ）段階で選別された質量スペクトルに現れた前記試料イオンの信号強度を前記マトリックスイオンの信号強度で割った値であるイオン信号比を測定する段階と、
   （ｉｉｉ）前記マトリックスのモル濃度と前記（ｉｉ）段階で測定したイオン信号比を下記数式（９）の定量分析用検定線に代入して前記試料のモル濃度を計算する段階とを含んでなる、質量スペクトルを用いた試料定量分析方法。
   ［Ａ］＝（Ｉ_ＡＨ＋／Ｉ_ＭＨ＋）［Ｍ］／Ｋ …（９）
   （前記式（９）において、［Ａ］は、試料のモル濃度、Ｉ _ＡＨ＋ は、試料イオンの信号強度、Ｉ _ＭＨ＋ は、マトリックスイオンの信号強度、［Ｍ］は、マトリックスのモル濃度、Ｋは、平衡定数である）