TWI236344B - Process for the enzymatic lactose cleavage - Google Patents

Description

1236344 年 曰 案號 89103549 修正 五、發明說明（1) 一、 【發明所屬之技術領域】 本發明關於酶分裂乳糖之方法， 擴散反應器以實施酶分裂乳糖之方法j 疋有 膜 β將=之方法，*先是將乳糖溶液處理，其次 7將礼液及乳製品如脫脂乳或乳凊加工成為減乳糖 (reduced-1actose)製品 ° 二、 【先前技術】 =世界成人人口之約百分之七十為對乳糖過敏而盈 ί f 二故對減乳糖製品之需求量很大。此夕卜，發現ΐ 乳乳糖也常常為動物所難容忍，為 _ 。制。^ μ , ▲ 1此理由，使用低乳糖牛 乳“於耕作動物會達《有關動物之成長及營養方面之顯 著利益。最後，必須注意到牛乳之固體成分如增加到3〇% 以上時，I白質相會發生不穩定性。同樣之缺點我們也發 現到’例如在冰琪淋工業因不可能使用具有高固體分之牛 乳於乳糖在低溫時會結晶’造成蛋白f的再懸浮困難 所致。再者，乳糖結晶時會導致冰淇淋「砂砂」的口感。 乳糖為一種雙糖，可由酶卢〜糖苷酶^…^石〜 -glyco^idase)，諸如 3 -配糖酶（点—gluc〇sidase)及石一 半乳糖替酶（/3 -galactosidase)分裂成葡萄糖（gluc〇se) 及半乳糖（galactose)成分、。許多消費者拒絕直接添加這 些酶’因為它們會f來口感上之缺點，所以有人尋求其他 酶分裂乳糖之可能性。 κ 德國專利DE 2 1 5 1 5 34 A1揭露使在滲濾系統中用以支 持或處理具有這些固體分之乳製品之酶不變動。然而，此 1236344 —-—缝 89103549__年 J| 五、發明說明（2) 0_ 修正

f ^，由於乳成分而有結塊之傾向；此外，甚難防止乳 礼清受到微生物之傳染；再者，此系統的殺菌 =5 4± Jill » η 双雜 5 叮〜=任加熱處理過程中所使用之酶遭到損壞之事實。 人a歐洲專利ΕΡ 0 0 2 0 78 1號揭示經由透析膜以製備酶分裂 a乳糖水解物之溶液之方法，唯其酶反應係在〇。〜 乂 之溫度範圍内進行。 美國專利US 4 0 0 7283號揭示使用嗜熱性真菌衍生而得 之具穩定形態之乳糖酶（L a c t 〇 s e )，適用於催化乳製品中 的乳糖水解成為葡萄糖及半乳糖，該乳糖酶具有高酶催化 活性’在溫度5 5。〜6 (TC及P Η值不超過5之下維持一段時 間。 L· HUFFMAN揭示在中空纖維透膜反應器中批次水解乳 糖之方法，其操作處理度大約在5°c。 此方面之改良似乎呈現在使用透膜擴散反應器與嗜溫 (即中溫）的酶。在此種反應器中，牛乳由透膜從酶溶液中 分離出來，此透膜具有允許乳糖穿透擴散進入酶溶液中及 不允許分裂產物再擴散進入低乳糖乳中之透膜微細孔大 小，有關此請參照P. Czermak之“ Bi〇 Engineer ing 8”第 4 7頁至5 2頁，此種形態之方法可在溫度最高達4 5°c下處 理〇 透膜擴散反應器之構造，通常構成中空纖維反應器， 欲加工處理之產品在由滲透性溶液包圍之纖維管内部流 動，在此場合，酶係出現在滲透性溶液中。在此種情形下 之透膜擴散方法係將含乳糖基液從酶溶液分離出來，加之

第6頁 1236344 _ 案號 j9103549 五、發明說明（3) 月 曰 修正 許多其他優點如可防止酶由乳之成分，亦即蛋白質及殘餘 脂肪可能造成之情性化，更重要者為藉酶溶液之分離處理 而可增加酶之長期穩定性及簡化處理過程，因為無需要後 續之從產物流中分離酶之過程。 在这些系統中’顯然也有微生物感染之風險，為避免 此風險，提案使用蒸汽殺菌透膜擴散反應器，有關此反應 器’請參照 P· Czermak 之 “ DECHEMA_Biotechn〇1 ” Conf. 2，第133至145頁，（載於1991年之倫敦“ Elsevier

Appl ied Science”之中）。然而，這些反應器是如此之複 雜及昂貴，以目前情況而言，以目前情況而言，實不適於 工業處理方法。 三、【發明内容】 因此’本發明之第一目的在提供一種能避免習知方法 =具有之缺失之新穎方法。此目的係依本發明藉使用熱穩 。疋性酶或熱穩定性酶混合物來分裂乳糖，及控制溫度在5 〇 °C至8 5°C之間以實施此方法而達成。 在此溫度範圍内，相當於巴斯德殺菌（低溫殺菌）溫 度#因而可抑制大部份的微生物之成長。當在擴散反應器 中二施此操作時，由於更高之溫度，會增加乳糖之擴散量 ，而帶來更有效的透膜利用效果。 <所使用之酶，最好是熱穩定性点—糖笔：酶，例如：冷一 $乳糖替酶或卢—配糖酶，來自重組體微生物。此型石一糖 酶可自例如硫化裂片菌屬s 〇 1 f a t a r i c u s或焦性球菌屬 furi0sus製得。有關此種酶請參照1 9 95年由M. Moracci，

1236344 _案號89103549__年月曰 修正__ 五、發明說明（4) R. Nucci， F. Febbraio， C.Vaccaro, N. Vespa, F. La Car a及M.Rossi等人所發表之文獻“ Enzyme and Microbial Technology” 17 99 2〜9 9 7—文，及 1 9 9 5年 12 月由 W.G.B. Voorhorst’R.I.L. Eggen， E.J. Luesink及 W.M. de Vos等人所發表的 “Journal of Bacteriology” 1 7 0 5頁〜1 9 1 1頁。然而，為達此目的，其他熱穩定性乳糠 分裂用酶也可採用。 工作溫度5 0°C〜8 5°C意味非常嗜熱微生物仍會出現在 滲透物中’因此證明有利於至少部份殺菌過濾及/或紫外 線照射。 _ 本發明進一步涉及使用中溫酶在透膜擴散反應器中最 南溫度4 5°C下酶分裂乳糖之方法，依本發明之此方法，滲 透物至少一部份經殺菌過濾及/或紫外線照射。此點也具 有連續作業過程之優點。 上述兩種殺菌過程，即殺菌過濾及紫外線照射，如眾 戶f周知，本質上是為了得到滅除微生物之效，然而，以往 =些過程從未被使用在關聯透膜擴散反應器中分裂乳糠之 ί。’顯然是因為只有非常小心的作業過程才能導至 吏/、不活性化，同時消滅微生物。 之+ ΐ關ί膜擴散方法應了解所需要的透膜面積及酶溶液 处极4為嚴重影響此方法之經濟效益之因素的事實。每/ =^:酶溶液之穩定性之量度被認為就是實質上的節省。 二二t生物的代謝產物會使酶不活動化，滲透液之連續殺 囷非吊地有助於提昇酶溶液之穩定性。

1236344 _案號89103549_年月曰 修正_ 五、發明說明（5) 生產每單位時間某一定量之低乳糖乳所需要之透膜面 積主要端視乳糖擴散率而定。除此之外，加之許多物理化 學因素如：溫度、乳糖濃度等，模數比及透膜比特性也在 此扮演重要角色。這些特性包括例如：中空纖維管直徑， 透膜微孔大小及透膜材料。本發明之技術發展，適當透膜 模數之選擇是一重要之方向。加上某些上述之影響因素是 彼此相依之事實可做為參考。因此，例如，藉增加酶之濃 度在某種場合是可達成減少透膜面積之目的。為獲所需之 最終產品品質（水解程度），對選擇方法過程而言，只有經 濟效益是決定性的。 四、【實施方式】 茲依照附圖就本發明方法詳細說明如次： 第一圖表示由焦性球菌f u r i 〇 s u s製得之点-糖香酶重 組體之E. coli BL21(DE3)之醱酵過程圖。 第二圖表示利用透膜擴散法操作之工廠設備一例之示 意圖。 第三圖表示利用透膜擴散法操作之工廠設備另一例之 示意圖，其中滲透液係經過殺菌過濾及/或紫外線照射單 元。 第四圖表示紫外線照射對微生物數及酶活動性之效應 之圖表。 在本發明中，所使用之酶（酵素）最好是由E. col i重 組體製得者，例如，Θ -糖#酶是由Ε· coil BL21(DES)重 組體發酵之焦性球菌屬fur i o sus製得。從第一圖之線圖中

可看出典型之發酵過程。在最佳 屬S。—⑽製得之酶之半衰期：：：十=;片由隹菌 C =::製#之酶在相同條件之τ，其穩定性超 過十天。此兩種酶之最佳ΡΗ值在5. 〇至6 〇之 +佶斜於 乳:具有大約6·_)中之乳糖而言，事 貝疋取I佳的。同離子濃縮效應在使用酶運作的多種方 Ππ:造成：之活動性降低。平均…牛乳含有總量大 約MOmm之鉀、鈣、鎂及鈉，在本實施例中，來自硫化裂 片菌屬30^3七31^(：1^之万—糖菩酶之活動性減低至約85%; ，於$自焦性球菌屬f ur i 〇sus之万-糖苷酶之活動性則減 少三分之一以上。此等數值完全滿足本發明方法之實施。 ，於酶之製造係在容有3〇〇〇 u/l培養液或24,5 0 0 u/1搖動 k杯中進行。在1 5公升發酵槽中，由焦性球菌屬furi〇sus 產生之/5 -糖香酶量可增加四倍以上。 製程之條件在實驗型透膜擴散反應器系統試驗及最佳 化，此系統將配合第二圖詳細說明。 牛乳從放置於冷卻槽2中之儲槽丨中連續抽出並經由幫 浦3及熱交換器4後進入透膜擴散反應器Μ。在此之同時， 酶液從酶容器5流入透膜擴散反應器Μ。系統之壓力及溫度 非常重要，尤其是使用感溫器6及流體壓力計7加以監視。 酶溶液係經由外部儲槽循環抽送。 本作業之基本條件，首先選擇下列處理參數： 透膜微孔大小 相當於約50 〇〇道爾頓（dal tone) (截止孔徑）

第10頁 1236344 _案號89103549_年月日__ 五、發明說明（7) 内部纖維管 約2 0 0微米直徑 比水解率 每平方公尺透膜面積及每小時約 2公升乳出量（在約8 0 %程度之水 解作用下）

然而，我們發現供本發明處理用之透膜即使具有更大 之微孔（相當於約1 0，0 0 0道爾頓）亦可使用，唯微孔大小如 相當於約3 0，0 0 0道爾頓時，則酶之流失引人注目。内部纖 |維管之内徑也可為5 0 0微米。從實驗上獲知使用内徑5 0 0微 u米之纖維管可達成如同使用内徑2 0 0微米時之大約相等之 水解產量。 第三圖表示在第二圖之系統中加設將滲透液曝露在裝 置8以行殺菌過濾及裝置9以行紫外線照射之系統。 從第四圖之線圖中可看出，在紫外光照射下微生物數 在短時間内急劇下降，而酶之活動性仍保持穩定，此點對 於此處理過程而言是關鍵性的。 下列二實施例分別為使用熱穩定性酶於水解乳糖及使 用嗜溫（中溫）性酶於同樣之方法中者。 〔實施例一〕 使用熱穩定性酶之乳糖水解

. 在第二圖之處理系統中，使用熱交換器將脫脂牛乳加 溫至約6 5°C ( 3 3 8K)後用幫浦抽送至中空纖維管單元，中空 纖維管單元之内徑大約為0 . 0 0 0 5公尺，牛乳之流率設定為 每平方公尺透膜面積每小時約0 . 0 0 2立方公尺，在此情形 下可完成約8 0 %之水解度。如第二圖所示，酶液在循環回

第11頁 1236344 •1^1^9103549 #：___Ά 曰 修正 五、發明說明（8) 在此相ί'ΐΪ:理其溫度大釣維持在338Κ(即65。。)。 因此乳糖ΠΪΪ:度下生物之成長實質上被抑制， 自焦在較長之時間内連續進行，所使用之得 ^ 2 ^ uriosus之嗜熱性微生物重組體之半衰期大 ^ ^期，在此段期間，整個系統受到清洗及沖洗。 〔實施例二〕 imiiu性麗之乳耱水解_ A ·酶溶液之殺菌過渡_ 此方泽係在依第三圖所示系統中實驗性實施。此系統除 了附加之殺菌過濾裝置及UV(紫外線）照射裝置外基本上 與實施例一之系統相同。牛乳以熱交換器加溫至約3 Ot (3 0 3 K)後用幫浦送入中空纖維管單元内。中空纖維管之 内徑與實施例一之系統所用者相同，同時牛乳之流率也 設定為相同。因為在溫度30°C時，微生物在含糖酶溶液 中處於理想之成長條件，不加以殺菌事實上不可能實施 連續處理加工，所以將該酶溶液施以連續之殺菌過濾。 在本實施例中’使用微孔大小約〇 . m之交叉流微細過 濾單元，微生物被收集於所用之過濾網，而只有酶可暢 通無阻地通過此殺菌過濾裝置，此點是非常重要的。'B.鹽UV(紫外键^氧射 在本例中，酶溶液在商業上可購得之習知具有可控式照 射源之圓管型照射室内接受紫外線照射處理（ 2 54nm)， 照射燈具有2 5瓦特功率，此照射必須小心設定以免使酶 溶液顯著不活動。

第12頁 1236344 _案號89103549_年月日__ 五、發明說明（9) C .酶溶液之殺菌過濾及U V照射 本系統藉由實施使用殺菌過濾及/或UV照射酶溶液之過 程方法而可提高系統之處理效果。在幾小時内，微生物 總數可維持在非常低之水準，且酶之壽命為好幾天。 1236344 案號 89103549 年月曰 修正 圖式簡單說明 第一圖表示由焦性球菌f u r i 〇 s u s製得之点-糖替酶重 組體之E. coli BL21(DE3)之醱酵過程圖。 第二圖表示利用透膜擴散法操作之工廠設備一例之示 意圖。 第三圖表示利用透膜擴散法操作之工廠設備另一例之 示意圖，其中滲透液係經過殺菌過濾及/或紫外線照射單 元。 第四圖表示紫外線照射對微生物數及酶活動性之效應 之圖表。 符號說明：

1 儲 槽 2 冷 槽 3 幫 浦 4 熱 交 換 器 5 酶 液 容 器 6 感 溫 器 7 流 體 壓 力 計 8 殺 菌 過 濾 裝 置 9 紫 外 線 昭 射 裝 置 Μ 透 膜 擴 散 反 應 器 第14頁

Claims (1)

1236344 修正 曰 89103549 年 日 六、申請 u分裂乳糖之方法，其係在透膜擴散反應器内進行 用酶政反應器中所使用做為乳糖分裂 反=^度5〇。^85。：°下實施；或者，其中該透膜擴散 II Γ °°所使用做為乳糖分裂用酶係一種嗜溫（中溫）性 :六種嗜溫(中q性酶之混合物，且該方法係 取巧5 (TC下實施； 又

厂特徵為：該出現在滲透室中之滲透液至少一部份經 — 义過濾殺菌及/或紫外線照射。 2 ·，申凊專利範圍第丨項之方法，其中所使用之酶為熱穩 疋性万-糖苷酶’是得自重組體微生物之石—半乳糖噃酶 或冷-配醣酶。 3·依申請專利範圍第2項之方法，其中所使用之酶為熱穩 定性/3 -糖ί酶，是得自硫化裂片菌屬 solfataricus或焦性球菌屬 furiosus。 4 ·依申請專利範圍第2項之方法，其中所使用之酶為熱穩 定性点-糖替酶重組體，是得自E. col i BL21 (DES)、 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、樹幹畢赤酵母 (Pi chi a stipitis )或乳酸球菌乳（Lactococcus

• lactis)。 5 ·依申請專利範圍第1項之方法，其中該經過濾殺菌過程 係在微孔大小大約0 . 2// m之濾網下完成。 6 ·依申請專利範圍第5項之方法，其中該酶溶液係流經交 叉流微細過濾單元。

第15頁 1236344 案號89103549 年 月 曰 修正 六、申請專利範圍 7.依申請專利範圍第6項之方法，其中該滲透液係經由過 濾殺菌及/或紫外線照射導入一循環回路。 8 .依申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中為 該方法係以連續一貫作業實施。 9 · 一種低乳糖乳製品之製造方法，該方法係利用申請專 利範圍第1項至第8項中之一項之方法。 1 0.依申請專利範圍第9項之方法，其中該方法所用之起始 基質為任何脂肪含量之牛乳。

1 1.依申請專利範圍第9項之方法，其中該方法所用之起始 基質為乳清及乳清餾分。 1 2.依申請專利範圍第9項之製造方法，其中該起始基質為 乳糖溶液。 1 3.依申請專利範圍第9項之方法，其中該起始基質經預先 濃縮。 1 4.依申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中 該透膜係以乳蛋白或其他蛋白預先被覆以防止酶之流 失。

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