TWI231299B - Antibody for the detection of microorganism - Google Patents

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 ' Λ7 _____Β7 五、發明說明（1 ) 〔技術的分野〕 本發明係關於種種的微生物、特別爲對細菌檢測有用 的抗體、使用其之微生物檢測法、微生物檢測用試藥組合 以及微生物檢測用的特異抗體之製造方法。 本發明可有效地利用於醫藥品工業、特別以細菌爲主 的微生物感染症之診斷藥劑的製造。 〔過去技術〕 微生物感染症的診斷爲一般對感染部位等的病原菌作 檢測，以檢測出對於血淸、體液中的病原菌之抗體的檢測 而確定。特別此診斷係由病原菌的檢測故能迅速對病患進 行治療而意義非凡。 感染症病原菌的檢測可分爲，經過病原菌的分離培養 ，其生化學的性狀爲基準而進行菌鑑定之培養鑑定法，與 以病原菌特異基因爲基準的P C R法等放大檢測之基因診 斷法，以及利用與病原菌表面抗原標誌的抗體特異反應而 進行之免疫方法。然而要取得培養鑑定法、基因診斷法的 檢測結果必須花費許多時間。一般使用能短時間且高感度 地檢測出病原菌，迅速且適宜地對病人進行治療的免疫法 作爲診斷。 例如衣原體(Chlamydia )屬的情況，已知有作爲屬特 異抗體脂多醣（LPS )之抗原決定基的存在（Stephens, R. 們：J. Immunol.，128: 1083-89，1982. Caldwell. Μ· D·: Inf. Immun.，44:306- 1 4, 1 984 )，對種種診斷用藥組合中特別使 -----------€------- — 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -4- 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3 ) L P S使用單株抗體的檢測法。 然而，這些抗體以及檢測法中，對於微生物的種特異 性質並不明顯，又因存在同種的複數表面抗原之所有血淸 型會被覆蓋，造成檢測上困難等問題。 又，使用這些過去的技術之標識抗原，對於各種微生 物細胞裡普遍存在的同一機能分子（例如，同一機能的蛋 白質、L P S或表面多醣成分）於微生物的進化過程中， 菌種經變化過程的分子並非有統一性可作爲標誌而能檢測 。以1個分子作爲基準欲檢測出菌種間抗原性的差異，此 想法爲基礎的免疫診斷法至今並未被提出。 〔發明的揭示〕 本發明提供一種理想的微生物檢測•免疫診斷方法， 其作爲統一標識抗原可覆蓋對種種微生物的同一分子之抗 體，特別對欲檢測之所有微生物裡使用細胞內的同一機能 成分分子，對微生物進化過程所產生變化部分的抗體、使 用該抗體的特異性且幾乎所有血淸型之微生物檢測方法、 微生物檢測用試藥組以及微生物檢測用特異抗體的製作方 法。 本發明者們，發現對於所有微生物而言被保存的同一 機能蛋白質可作爲有用的抗原蛋白質。一般預知此蛋白質 的構造變化極少，但驚人地，該蛋白質的抗原決定基對於 微生物的種或屬具有特異性，對該蛋白質的抗體、可使用 於微生物的種或屬特異性的識別而具有多樣性，同時對於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ .- -----------———訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 __JB7_ 五、發明說明（4 ) 作爲特定微生物可檢測出所有的血淸型。 本發明者著眼於，存在於所有微生物細胞，且其胺基 酸構造於微生物間有著某程度相異點之細胞內分子，特別 爲核糖體蛋白質的其中一種之Ribosomal Protein L7/L12 ( 核糖體蛋白 L 7 / L 1 2 ) 。Ribosomal Protein L7/L12 係 作爲蛋白質合成所必須的核糖體蛋白質爲已知，其已知爲 分子量約1 3 κ D a的蛋白質，特別以大腸菌、枯草菌等 幾樣微生物的全胺基酸序列解析正被進行著，而微生物間 有5 0 %〜6 5 %程度的相同胺基酸序列被確認。 本發明者們發現不管此分子於微生物間具類似性，而 著眼於其一部份具有各微生物固有的胺基酸序列等構造部 分，利用該蛋白質的抗體可對種種微生物的特異性以及同 一菌種內的所有血淸型作檢測。具體的例子有對流感嗜血 桿菌(Haemophilus influenzae ) ' 肺炎鏈球菌(

Streptococcus pneumoniae )以及淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae )使用其特異抗體的微生物種免疫法診斷技術 開發，其結杲，對於各個微生物可取得該蛋白質特異性的 抗體，使用該抗體發現可對於所有菌檢測其特異性，而完 成本發明。 因此，本發明爲有關如以下的微生物檢測用抗體，被 使用於微生物檢測方法以及微生物檢測用試藥組合以及微 生物檢測用特異抗體的製作方法。 1) 一種對微生物的核糖體蛋白質之抗體，其特徵爲與 該微生物具特異性反應之抗體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -7 - -----------— — — —— — — ^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 2) 如1 )所記載的抗體，其中微生物的核糖體蛋白質爲 Ribosomal Protein L7/L12 。 3) 如1 )或2 )所記載的抗體’其中微生物爲性行爲 感染症（STD，Sexually transmitted disease )的病原 微生物。 4 )如1 )或2 )所記載的抗體，其中微生物爲呼吸系 統感染症之病原微生物。 5)如4 )所記載的抗體，其中呼吸系統感染症之病原 微生物爲流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae ) ο - 6 )如4 )所記載的抗體，其中呼吸系統感染症之病原 微生物爲肺炎鍵球囷(Streptococcus pneumoniae ) ο 7 )如3 )所記載的抗體，其中性行爲感染症（STD，

Sexuallly transmitted disease )微生物爲淋病奈氏球 菌(Neisseria gonorrhoeae ) 0 8 )如7 )所記載的抗體，其爲對淋病奈氏球菌(

Neisseria gonorrhoeae )的 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質的抗體，且爲可辨認序列表序列號碼：2 2 的胺基酸序列中第1 1 5號含丙胺酸5至3 0胺基 酸長度的連續部分之胺基酸序列的抗體。 9 ) 一種微生物檢測方法，其特徵爲對各種微生物而言 爲使用同一機能的細胞內分子之抗體。 10) —種微生物檢測方法，其特徵爲對於各種爲微生物 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 B7 五、發明說明（6 ) 而言使用1 )至8 )任一項的抗體。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11 ) 一種微生物檢測用試藥組合，其特徵爲使用對各種 微生物而言爲同一機能的細胞內分子之抗體。 1 2 ) —種微生物檢測甩試藥組合，其特徵爲使用如1 ) 至8 )任一項所記載的抗體。 13 ) —種如1 )至8 )任一項的抗體之製造方法，其特 徵爲以基因操作方法或自微生物單離純化所得的微 生物之Ribosomal Protein L7/L12蛋白質，其部分肽 ，或與此部分肽相當之合成肽作爲免疫源。 以下爲本發明的詳細說明 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列表中序列號碼1以及2爲流感嗜血桿菌的 Ribosomal Protein L7/L12基因之DNA序列以及所對應的胺 基酸序列。序列號碼3以及4爲幽門螺桿菌(Helicobacter pylori )的 Ribosomal Protein L7/L12 基因之 D N A 序列以及 所對應的胺基酸序列。序列號碼5以及6爲肺炎鏈球菌的 Ribosomal Piotein L7/L12基因之D N A序列以及所對應的 胺基酸序列。序列號碼7以及8爲淋病奈氏球菌的 Ribosomal Protein L7/L12基因之D N A序列以及所對應的 胺基酸序列。序列號碼9以及1 0爲腦膜炎球_菌的

Ribosomal Protein L7/L12基因之D N A序列以及所g應的 胺基酸序列。序列表中序列號碼1 1以及1 2爲取得來自 流感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7./L 12基因所使用的 PCR之引發物DNA ( PrimerDNA)。序列號碼13以 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 及1 4爲取得來自肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12 基因所使用的P C R之引發物DNA ( Primer DNA )。序列 號碼1 5以及1 6爲取得來自淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12基因所使用的P C R之引發物D N A ( Primer DNA )。序列號碼1 7以及1 8爲取得來自流感嗜 血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因的D N A序列以及 所對應的胺基酸序列。序列號碼1 9以及2 0爲取得來自 肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12基因的D N A序列 以及所對應的胺基酸序列。序列號碼2 1以及2 2爲取得 來自淋病奈氏球菌的 Ribosomal Protein L7/L12基因的 D N A序列以及所對應的胺基酸序列。 且，如序列表中所記載的胺基酸序列的左端以及右端 分別爲胺基酸基（以下稱N端）以及羧基末端（以下稱C 端），又鹼基序列的左端以及右端分別爲5 /末端以及 3 /末端。 又，本發明所述的基因操作的一連串分子生物學實驗 可由一般的實驗書籍中所記載的方法進行。前述的一般實 驗書籍爲，例如可舉出 Molecular Cloning, A labolatory manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Sambrook, J. 等（1989 )。 對於本發明的微生物係指，細菌、酵母、黴菌、放線 菌、立克次體類等全體微生物類，大多指特別於微生物感 染症的診斷中有問題的細菌。 對於本發明的「對微生物有特異性反應的抗體」係指 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 1〇 - -----I-----· I---I--訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（10 ) affinity column ) ’以純化表現蛋白（expression protein ) 爲目的’取得蛋白抗原。此時因Ribosomal Protein L7/L12 之全長蛋白質成爲抗原，而取得對應於微生物間被保存的 胺基酸部分之抗體，但不爲本發明的目的。因此本法所取 得的抗原以公知的方法使用單株抗體而產生的融合瘤，因 選擇生產僅能與該微生物反應的抗體之純系，因此可取得 目標抗體。 b ) Ribosomal Protein L7/L12的胺基酸序列對於未知微生 物，與其此Ribosomal Protein L7/L12的胺基酸序列於 菌種間有5 0〜6 0 %相同，不如使用此胺基酸序列 相同部分序列爲準，以P C R法進行特定序列部分的 基因增量或相同部分序列作爲模型探測體進行雜交法 等，一般基因操作方法較易取得該蛋白質基因。 此後與其他蛋白質基因構成融合基因（fuS1〇n gene ) ，以大腸菌等爲寄主，使用公知的基因導入方法於寄主內 插入該融合基因，使其有大量表現作用（expression )後， 對應作爲融合蛋白質的蛋白質之抗體親和力柱子法（ affinity column )，以純化表現蛋白（expression protein ) 爲目的，取得蛋白抗原。此時因Rib os omal Protein L7/L12 之全長蛋白質成爲抗原，而取得對應於微生物間被保存的 胺基酸部分之抗體，但不爲本發明的目的。因此本法所取 得的抗原以公知的方法使用單株抗體而產生的融合瘤，因 選擇生產僅能與該微生物反應的抗體之純系，因此可取得 目的的抗體。 ϋ ϋ ί ϋ ϋ ϋ ϋ n ·1 ϋ 1 I 一口， n 1 ϋ n ϋ I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -13- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ____ B7 五、發明說明（12 ) 粒子上吸著該抗體進行凝集反應，於E L I S A板中進行 公知技術的E L I S A法，既知的免疫色譜法、以著色粒 子或具發色能的粒子，或酵素或螢光體標識該抗體同時， 使用以捕捉（capture )抗體覆蓋的磁性微粒子等之夾心試 驗法（間接螢光抗體法）等既知的所有免疫測定方法。 又，特別利用抗體於有用的微生物檢測方法的特表平 7 - 5 0 9 5 6 5號公報中記載有關氧化矽、氮化矽等所 形成光學薄膜上不進行抗體反應之光干涉原理等的檢測， 即所謂的光免疫測定（〇IA，Optical Immunoassay )等高感 度之檢測方法可利用。 又對於該檢測方法，萃取來自必要微生物的細胞內標識抗 原方法，有首先使用Triton X-100、Tween-20等種種界面 活性劑以萃取試藥處理的方法、使用適當的蛋白酶等酵素 之酵素處理法、物理方法中有將微生物細胞破碎的使用既 知細胞構造之破碎方法，其中對界面活性劑等組合的微生 物之試藥而言，設定最適的萃取條件爲佳。 又，對於本發明，使用抗體的微生物檢測用試藥組合 相當於，與該檢測方法所使用的檢測試藥組合。 例如，取得對於肺炎、支氣管炎、髓膜炎等病原菌具 有高度診斷意義的流感嗜血桿菌之特異抗體時，本菌的 Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之胺基酸序列以及D N A 序列已爲表等之記載中爲公知。流感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12胺基酸序列以及D N A序列以序列表序列號 碼：1以及2表示。 -11 11 -1-----—訂- -------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -15- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ____B7__ 五、發明說明（15 ) 〇 使用公知的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之D N A 序列的部分序列，檢索類似序列D N A片段的有無時，相 當Ribosomal Protein L7/L12基因的D N A序列存在著，而 取得全D N A序列的情報。此淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/Li2基因的全鹼基序列以及所對應的氨基酸序列 於序列號碼：7以及8所示 因此，與流感嗜血桿菌與肺炎鏈球菌情況相同，淋病 奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之D N A序列 的N末端、C末端的序列爲準之P C R前導體，例如設計 序列表序列號碼：1 5以及1 6所示的P C R前導體，以 後使用完全相同的方法可取得，以淋病奈氏球菌的 Ribosomal Protein L7/L12蛋白質全部或一部份作爲抗原的 淋病奈氏球菌特異目的之抗體。 特別與淋病奈氏球菌爲相同的奈瑟氏菌屬（Neisseria. )之腦膜炎球菌(Nesseria meningitidis )的 Ribosomal Protein L7/L12蛋白質基因中，該基因序列於電腦網路上已 公開且可容易獲得。此腦膜炎球菌的Ribosomal Protein L7/L 1 2基因全鹼基序列以及對應的胺基酸序列以序列表序 列號碼：9以及1 0表示。此淋病奈氏球菌與腦膜炎球菌 的Ribosomal Protein L7/L12基因全鹼基序列作比較下胺基 酸序列的相異部分爲自N末端第1 1 5號的胺基酸於淋病 奈氏球菌爲丙胺酸，對於此腦膜炎球菌爲谷胺酸僅一個胺 基酸不同而已。因此可以種特異性而檢測出淋病奈氏球菌 ----------- I------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（16 ) 之氏球茼Ribosomal Protein L7/L 1 2蛋白質抗體爲該 當Ribosomal. Protein L7/L12蛋白質由N末端第1 1 5號的 丙胺酸以及含有此之胺基酸領域作爲表位（epitope )而辨 識的抗體。 以本發明爲基礎所製作的抗體，可利用公知的測定方 法，將聚苯乙烯乳膠粒子上吸著該抗體進行凝集反應，於 E L I S A板中進行公知技術的E L I S A法，既知的免 疫色譜法、以著色粒子或具發色能的粒子，或酵素或螢光 體標識該抗體同時，使用以捕捉（capture )抗體覆蓋的磁 性微粒子等之夾心試驗法（間接螢光抗體法）等既知的所 有免疫測定方法。 又，對本發明爲基礎所製作的抗體對於全部免疫測定 方法而言，其功用爲可作爲該抗原蛋白質於固相或液相中 所捕捉的capture抗體，同時用過氧化酶或鹼基磷酸酯酶等 酵素以公知的方法修飾，即所謂的酵素標識抗體之功能。 〔爲實施發明時的最佳狀態〕 以下面的例子具體說明本發明，但對於本發明並無任 何範圍的限定。 〔實施例1〕 自流感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因的純 系化過程（cloning ) 流感嗜血桿菌A TCC9334 (I ID984)株 本^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19 : -------------------^------1— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7

五、發明說明（17 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (自東京大學醫科學硏究所所分配、購入）於巧克力洋菜 培養基上適當地植菌，C〇2培養箱中3 7 Ό、C〇2 〇 · 5 %條件下2 4小時培養。所長出的菌落最終成大約 5 χ 1 〇 9 C F U / 左右，於τ Ε緩衝劑（和光純藥工 業公司製）中懸濁。此時移入約1 · 5 的微量離心試管 中以1 Ο Ο Ο Ο r p m離心2分鐘，捨棄上淸液，沈澱部 分以5 6 7 // 1的T E緩衝液再懸濁。再加上3 0 // 1的 1 〇 %月桂硫酸鈉（S D S )與3 // 1的2 0 m g / J Proteinase K溶液充分混合，培養3 7 °C 1小時。再添加 1 〇 %溴化十六烷基三甲基銨/ 〇 · 7 Μ N a C 1溶液 8 0 // 1 ，死分混合後6 5 °C下培養1 0分鐘。再加入體 積比2 4 / 1的氯仿一異戊醇混合物7 0 Q // 1充分攪拌 。此溶液以微量離心機1 2 0 〇 〇 r p m，5分鐘（控制 於4 °C下）離心處理後，水層部分移至新的微量離心管。 於此加入0 · 6倍量的異丙醇充分搖動試管使D N A形成 沈澱，白色D N A沈澱以玻璃棒勾取移入放有1 i的7 0 %乙醇（冷卻至一 2 0 t者）之另一微量離心管。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 再以1 0 0 0 0 r p m，5分種離心處理，靜靜地將 上淸液除去後再加上1 的7 0 %乙醇再離心5分鐘。再 將上淸液除去後沈澱物以1 0 0 // 1的T E緩衝液溶解得 到D N A溶液。此基因組D A N溶液的濃度依照Molecular Cloning, A laboratory manual, 1 989, Eds. Sambrook, J” Fritsch, E. F., and Maniatis, T·, Cold Spring harbor Laboratory Press 的 E5, Spectrophntometric Determination of 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -20- 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（18 ) the Amount of DNA或RNA之方法定量。 使用此基因組D N A中1 〇 n g進行P C R ( Polymerase chain reaction ) °PCR 爲使用 Taq 聚合酶 (寶酒造公司製，標號R 〇 〇 1 . A )。附加於酵素的緩衝 液5 // 1 ，附加於酵素的dNTPmixture 4 // 1與序列表序 列號碼：1 i所示的合成寡核苷酸A以及序列表序列號碼 :1 2所示的寡核苷酸B分別加入2 0 0 p m ο 1 ，使最 終容量爲5 0 // 1 。 此混合物使用 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 ， 9 5 °C 1分鐘，5 0 °C 2分鐘，7 2 °C 3分鐘進行 5次循環後，再進行9 5 °C 1分鐘，6 0 °C 2分鐘， 7 2 °C 3分鐘2 5次循環。此P C R產物的一部份以 1 · 5 %瓊脂糖凝膠（agarose )中進行電泳，經溴化乙錠 (曰本gene公司製）染色後，以紫外線觀察，確認有 4 0 〇 b p的c D N A被增大。且以限制酶B a m Η I以 及X h ο I切斷處理後，以1 · 5 %瓊脂糖凝膠中進行電 泳經溴化乙錠染色後切出約3 7 0 b p —帶的膠片再以 SuprecOl (寶酒造公司製）純化後，倂入市販的載體（ vector ) p G E X — 4 T — 1 ( Pharmacia 公司製）。此載 體因倂入於適當的目的基因片段之限制酶位置，而能表現 (expression)與G S T蛋白質的融合蛋白質，具目的分子 的表現載體（expression vector )之功能。 具體而言，載體p GEX — 4T— 1與先前的DNA 其莫耳比成1 : 3混合之，以T 4 D N A連接酶（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） -21 - -----------ills — ^-1111111 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（19 ) ligase，Invhrogen公司製）將DNA倂入載體中。DNA所 倂入的載體 p G E X — 4 丁 — 1 以〇ne Shot Competent Cells (Invitrogen公司製）導入基因大腸菌內，植菌於含安匹 西林（Sigma公司製）5 〇 // g / m 1的乙一培養液（1^ Broth ，寶酒造公司製）半固體培養基培養皿中，放置於 3 7 °C 1 2小時，長出的菌落以逢機選擇植入同濃度的 含安匹西林的L 一培養液2 中，3 7 °C振盪培養8小時 ’回收囷體’使用Witherdominiprep (Promega公司製）並依 照所添加的說明書分離質體，此質體以限制酶B a m Η I / X h ◦ I分解，切出約3 7 0 b ρ的D Ν Α而確認該 P C R產物已被倂入，對於已確認的群株而言進行所倂入 的D Ν A之鹼基序列分析。對於所插入的D Ν A片段之鹼 基序列分析，使用Applied Biosystems公司製的螢光序列分 析裝置實施。序列樣品的調製方法使用PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit( Applied Biosystems公司製）進行。0 . 52容量的微量試管中加入 9 · 5 // 1的反應保存液、4 . 0 // 1的Q · 8 P m ο 1 / A 1 的 T 7 起動引發物（promoter primer ， GIBCO BRL 公司製）以及6 · 5// 1的Q · 1的序列用 模型D Ν A混合，1 0 0 // 1的礦物油添加於上層後’ 9 6 °C 3 0秒、5 5 °C 1 5秒以及6 0 °C 4分鐘爲 一次循環，進行P c R增大反應2 5次循環，於4 °C 5 分鐘保溫。反應後加上8 0 μ 1的滅菌精製水攪拌’離心 分離後’此水層進行3次的苯酚•氯仿萃取。1 〇 〇 β 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 22 - I I ---------訂-----I--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ____B7___ 五、發明說明（2〇 ) 的水層中加入1 〇 // 1的3 Μ醋酸鈉（P Η 5 · 2 )以及 3 0 〇 // 1的乙醇攪拌後，室溫下進行離心1 4，0 0 0 r P m，1 5分鐘後回收沈澱。沈澱物以7 5 %乙醇沖洗 後，真空下靜置2分鐘使其乾燥，作爲序列用樣品。序列 樣品溶解於4 // 1含1 0 m Μ的E D T A之甲醯胺9 0 °C ，2分鐘變性後於冰中冷卻提供於進行序列步驟。 所得的5個純系中1個序列與使用於P C R的探測體 (probe)的序列有相同性，且其他微生物，例如發現與淋病 奈瑟氏菌的Ribosomal Protein L7/L12基因序列非常類似的 D A N序列。此構成基因部分的全鹼基序列以及對應的胺 基酸序列係如序列表序列號碼：1 7以及1 8的序列。此 基因片段明顯地爲流感嗜血桿菌流感的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的基因密碼（code)。 〔實施例2〕 來自流感嗜血桿菌中的Ribosomal Protein L7/L12基因 於大腸桿菌裡的大量表現與純化° 倂入表現載體的大腸菌於L B培養基中5 0 mC， 3 7 °C下1晚培養。2倍量的T Y培養基5 0 0 2於 3 7 °C下1小時保溫。1晚培養後的大腸菌液5 0 ^放入 前述的5 0 0 培養基中’ 1小時後放入1 〇 〇 m Μ IPTG (異丙基一 Θ - D (-）硫代半乳糖甙）550 // 1經 4小時培養後回收’分別以2 5 0 2放入離心s式 管中進行7 0 0 0 r pm，1 0分鐘離心。捨棄上淸液溶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -23 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--------- # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 B7___ 五、發明說明（21 ) 解於含 5〇mM T r i s - H C 1 ρΗ7·4，25 %蔗糖之溶解（L y s i s )緩衝液2 5 中。 添力口 1 Ο °/〇 Ν Ρ - 4 Ο 1 · 2 5 ， 1 Μ Μ g C 1 2 125//1再移入塑膠試管中。1分鐘Χ5次 冰冷中實施音波處理（sonication )，再1 2 0 0 0 r pm ，1 5分鐘離心後回收上淸液。 再以磷酸緩衝生理食鹽水（P B S )作處理的谷胱甘 肽瓊脂糖凝膠柱吸著前述上淸液。 以含 2〇mM Tr i s 緩衝液 ρΗ7 · 4，4 · 2 m M MgCl2，lmM DTT( dithiothreitol )洗淨 液將柱子以2倍體積洗淨。然後以含5 m M的谷胱甘肽之 5 0 m Μ T r i s緩衝液ρ Η 9 · 6溶出，析出的部 分中的蛋白質含有量以色素結合法（布雷德福特法； Biorad公司）檢測，取得主要部分。所得的純化G S Τ融 合Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的純度以電泳法確認其 爲約7 5 %之免疫源而確保其高純度。 〔實施例3〕 對應流感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質 之單株抗體的製作 首先對於老鼠的免疫流感嗜血桿菌之G S T融合 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質抗原 lOOeg 溶於 2 0 0 # 1的Ρ B S後加入福樂因特助劑（Freund’s adjuvant ) 2 0 0 # 1 ’乳化後注射2 0 0 # 1於腹腔內。 ______—— — — — · I___— II ^ — — — — — — I— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -24 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（22 ) 且於2週後、4週後、6週後同樣的乳化抗原注射於 腹腔內，且於1 0週後、1 4週後以2倍濃度的抗原乳化 液注射於腹腔內進行最後的免疫，3天後取出脾臟’提供 於細胞融合的步驟。 相對無菌方式取出的老鼠脾細胞1 〇 8個而言取出骨 髓瘤細胞2 X 1 0 7個於玻璃試管充分混合後以 1 5 0 0 r p m，5分鐘離心，捨棄上淸液之後充分混合 細胞。 細胞融合時所使用的骨髓腫瘤細胞爲使用’ N S - 1 系的細胞株於含1 0 %牛胎兒血淸（F C S )之 R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基中培養，自細胞融合的2週前於 含 〇 · 13mM 的氮烏嘌呤，0 · - 210，10% FCS之RPMI 1640培養基中培 養1週後，於含1 0 % F C S之R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基 中培養1週者。混合的細胞樣品中添加5 0 保溫於 3 7 °C的R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基3 0 ，經離心 1 5 0 Q r P m除去上淸液後加上保溫3 7 °C的5 0 %聚 乙基乙二醇1 J 2分鐘激烈攪拌處理後，添加保溫 3 7 °C的1 0 J R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基，液體以吸液 管（P1pet )進行吸進，擠出約5分鐘的激烈攪拌混合。 於1 0 0 0 r p m離心5分鐘，除去上淸液後加上 3 0 4的H A T培養基調整成細胞濃度成5 X 1 0 6個/ ，攪拌均勻後，於9 6洞培養皿型培養皿中分別注入 〇 . 1 ，以7 % C〇2條件下，3 7 &C培養，第1天、第 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -25- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I I —Bi 1 ϋ· i^i ϋ II ϋ— ·ϋ ι_ϋ ϋ ϋ I . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ________B7__ 五、發明說明（23 ) 1週、第2週分別添加HAT培養基〇 · lm£。 爲篩選產生目標抗體之細胞，實施以E L I S A法進 ί了評價。溶解於含〇 · 〇 5 %迭氮化鹼P B S中的 血 G S T 融合 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質以及 G S T蛋白質分別稀釋至1 〇 μ g/j濃度之液體，分別 以1 0 0 // 1注入9 6洞培養皿，4乞下吸著1晚。除去 上淸液後，添加1 %牛血淸白蛋白溶液（P B S中） 2 0 〇 # 1於室溫下反應1小時後遮蓋（blocking )。除 去上淸液後以洗淨液（Tween20 0.02 % ，P B S )洗淨， 其i：加入融合細胞培養液1 〇 〇 // 1於室溫下反應2小時 後除去上淸液且以洗淨液洗淨。將此加入5 0 n g /W的 過氧化酶標識羊抗老鼠I g G抗體液1 0 〇 // 1 ，於室溫 下反應1小時，除去上淸液以洗淨液洗淨後加入 100// 1 TMB溶液（KPL公司）於室溫下反應 2 0分鐘，發色後添加1 N的硫酸1 〇 〇 // 1停止反應， 以4 5 0 n m測定其吸光。 此結果中發現僅與G S T融合Ribosomal Protein L7/L 12蛋白質反應而不與G S T蛋白質反應的陽性凹穴， 其判斷爲含有對應於Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之抗 體。 於是分別回收陽性凹穴中的細胞於2 4洞塑膠培養皿 中，以H A T培養基培養。所培養的融合培養基爲之細胞 數能成2 0個而以HT培養基稀釋，將此5 0 // 1與 於Η T培養基中懸濁於6週齡的老鼠胸線細胞1 〇 6個於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -26 - ϋ I ϋ ϋ ϋ I 1-· I I^L I 1 l I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ------— B7 __ 五、發明說明（24 ) 9 6涧培養皿中混合後，以7 % C〇2條件下，3 7 t：培 養培養2週培養液上淸液中的抗體活性以上述的 E L I S A法以问樣方法檢測，回收與Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反應之陽性細胞。 而且，反覆進行同樣的稀釋檢測，純系化過程操作， 得到融合瘤Η I R B — 1〜5的5種純系。 〔實施例4〕 與流感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反 應的單株抗體之淋病奈瑟氏菌以及與其他微生物的反應試 驗。 使用如前述取得之陽性融合瘤細胞的一定方法，進行 單株抗體生產的回收。 具體而言，使用P R Μ I 1 6 4 0陪地（含1〇％ F C S )進行繼代培養的細胞，於2週前於腹腔內注射 0 · 5 4扎日斯烷（pnstan )的B a 1 b / C老鼠腹腔內 注射5 X 1 0 6個（P B S中），3週後回收腹水，離心後 取得上淸液。 取得的含抗體液吸著於Protein A柱（5 m£容積， Pharmacia公司），以3倍容積的P B S量洗淨，以p Η 3 的檸檬酸緩衝液溶出，回收抗體部分，得到生產各個融合 瘤的單株抗體。 使用來自此5株融合瘤的單株抗體以E L I S Α法進 行評價。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -27 - ----------I -------—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 --------B7 五、發明說明（26 ) 或其他的微生物即使有1 〇 8個/ 2的高濃度亦無顯示反應 性’因此確疋使用對應Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的 單株抗體，可取得具流感嗜血桿茼特異反應性的抗體。 --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -29 - 1231299 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（27 ) [表1] 106個/2檢測結果 流感嗜血桿菌（Haemophilus influezae) ATCC9327 + 流感嗜血桿菌（HaemophHus influezae) ATCC9334 + 流感曙血桿菌（Haemophilus induezae) ATCC9007 + 流感嗜血桿菌（Haemophilus influezae) ATCC9332 + 流感嘻血桿菌(Haemophilus influezae) ATCC8142 + 流感嗜血桿菌（Haemophilus infNuezae) ATCC9833 十 1〇8個/nve檢測結果 腦膜炎球菌（Neisseria meninaitides) ATCC13090 - 嗜乳糖奈瑟氏菌（Neisseria lactamica) ATCC30011 - 黏膜奈瑟氏菌（Neisseria mucosa) ATCC35611 - 乾燥奈瑟氏菌（Neisseria sicca) ATCC9913 - 卡他布蘭漢氏球菌（Branhamella catarrharis) ATCC25240 - 淋病奈瑟氏菌（Neisseria aonorrhoese) ATCC9793 - 大腸桿菌（Escherichia coli) ATCC25922 - 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae) ATCC13883 — (+;陽性反應、 陰性反應) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -30- 1231299 A7 _____B7 五、發明說明（％ ) 〔實施例5〕 自肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12基因的純系 化過程，同蛋白質於大腸桿菌中的大量表現與純化，以及 對應同蛋白質的單株抗體製作。 肺炎鏈球菌I I D5 5 5株（東京大學醫科學硏究所 所分配、購入）於血液洋菜培養基適當地植菌後，於培養 箱中進行3 7 °C 4 8小時培養。所長出的菌落最終成大約 5 X 1 〇 9 C F U /2左右，於T E緩衝劑（和光純藥工業 公司製）中懸濁。此時移入約1 · 5 m£的微量離心試管中 以1 0 0 0 r p m離心2分鐘，捨棄上淸液，沈澱部分以 5 6 7 // 1的T E緩衝液再懸濁。再加上3 0 // 1的1 〇 %月桂硫酸鈉（S D S )與3 μ 1的2 0 m g / J Proteinase K溶液充分混合，培養3 7 °C 1小時。再添加 1 0 %溴化十六烷基三曱基銨/ 0 · 7 Μ N a C 1溶液 80// 1 ，充分混合後65 °C下培養10分鐘。再加入體 積比2 4 / 1的氯仿一異戊醇混合物7 0 0 // 1充分攪拌 。此溶液以微量離心機1 2 0 0 0 r p m，5分鐘（控制 於4 °C下）離心處理後，水層部分移至新的微量離心管。 於此加入0 · 6倍量的異丙醇充分搖動試管使D N A形成 沈澱，白色D N A沈澱以玻璃棒勾取移入放有1 的7 0 %乙醇（冷卻至一 2 0 °C者）之另一微量離心管。 再以1 0 0 0 0 r p m，5分種離心處理，靜靜地將 上淸液除去後再加上1 的7 0 %乙醇再離心5分鐘再將 上淸液除去後沈澱物以1 0 0 # 1的τ E緩衝液溶解得到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - ^1 1- ϋ I ϋ )·0, ϋ ϋ ϋ ϋ ^1 ϋ I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 _____ B7 五、發明說明（29 ) D Μ A溶液。此基因組D N A溶液的濃度依照Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch，E. F·， and Maniatis, T·，Cold Spring harbor Laboratory Press 的 E5，Spectrophntometric Determination of the Amount of DNA或RNA之方法定量。 使用此基因組DNA中l〇ng進行PCR ( polymerase chain reaction ) 。P C R 爲使用 T a q 聚合酶 (寶酒造公司製，標號R 〇 〇 1 A )。附加於酵素的緩衝 液5 // 1 ，附加於酵素的dNTPmixture 4 // 1與序列表序列 號碼：1 3所示的合成寡核苷酸C以及序列表序列號碼： 1 4所示的寡核苷酸D各別加入2 0 0 p m ο 1 ，使最 終容量爲5 ϋ # 1 。 此混合物使用 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 ， 9 5 °C 1分鐘，50 12分鐘，72 °C 3分鐘進行5次 循環後，再進行9 5 °c 1分鐘，6 〇 °c 2分鐘，7 2 °C 3分鐘2 5次循環。此P C R產物的一部份以1 · 5 %瓊 脂糖凝膠（agarose )中進行電泳，經溴化乙錠（日本gene 公司製）染色後，以紫外線觀察，確認有4 0 0 b p的 c D N A被增大。且經限制酶B a m Η I以及X h ο I切 斷處理後，以1 · 5 %瓊脂糖凝膠中進行電泳經溴化乙錠 染色後切出約3 7 0 b p —帶的膠片再以SuprecOl (寶酒 造公司製）純化後，倂入市販的載體（vector ) p G E X —6 P — 1 (Pharmacia公司製）。此載體因倂入於適當的目 的基因片段之限制酶位置，而能表現（expression )與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I e MM am MB I 一一0, «ϋ I ϋ ϋ ϋ I I . 1231299 A7 ___ B7___ 五、發明說明（3〇 ) G S T蛋白質的融合蛋白質，作爲目的分子的表現載體 (expression vector)之功能。 具體而言，載體PGEX — 6P — 1與先前的 DNA其莫耳比成1 : 5混合之，以T4 DNA連接酶（ ligase，Invitrogen公司製）中將DNA倂入載體中。DNA 所倂入的載體pGEX — 6P— 1於大腸菌以OneShot Competent Cells (Invitrogen公司製）導入基因，植菌於含安 匹西林（Sigma公司製）50//g/m〇tJL —培養液（L-Bi:oth ，寶酒造公司製）半固體培養基培養皿中，放置於 3 7 °C 1 2小時，長出的菌落以逢機選擇植入同濃度的 含安匹西林的L 一培養液2 m£中，3 7 °C振盪培養8小時 ，回收菌體，使用Witherdominiprep (Promega公司製）並依 照所添加的說明書分離質體，此質體以限制酶B a m Η I / X h ο I分解，切出約3 7 0 b ρ的D Ν Α而確認該 P C R產物已被倂入，對於已確認的群株而言進行所倂入 的D Ν A之鹼基序列分析。對於所插入的D Ν A片段之鹼 基序列分析，使用Applied Biosystems公司製的螢光序列分 析裝置實施。序列樣品的調製方法使用PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司製）進行。0 · 5 容量的微量g式管中加入 9 · 5// 1的反應保存液、4 · Οβ 1的〇 · 8pm〇1 /// 1 的 T 7 起動引發物（promoter primer ’ GIBCO BRL 公司製）以及6 · 5// 1的〇 · 1的序列用 模型D Ν A混合，1 0 0 // 1的礦物油添加於上層後進行 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -33 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ϋ in I ϋ I ϋ ϋ ϋ ϋ I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（31 ) 9 6 °C 3 0秒、5 5 °C 1 5秒以及6 0 °C 4分鐘爲一次循 環，進行P C R增大反應2 5次循環，於4 °C 5分鐘保溫 。反應後加上8 0 // 1的滅菌精製水攪拌，離心分離後， 此水層進行3次的苯酚•氯仿萃取。1 〇 0 # 1的水層中 加入1 0 // 1的3 Μ醋酸鈉（p Η 5 · 2 )以及 3 0 〇 // 1的乙醇攪拌後，室溫下進行離心1 4，〇 〇 〇 r P m，1 5分鐘後回收沈澱物。沈澱物以7 5 %乙醇沖 洗後，真空下靜置2分鐘使其乾燥，作爲序列用樣品。序 列樣品溶解於4 // 1含1 0 m Μ的E D T A之甲醯胺 9 0 t，2分鐘變性後於冰中冷卻提供於序列步驟。 所得的7個純系中的1個序列與使用於P C R的探測 體（probe)的序列有相同性，且其他微生物，例如發現與淋 病奈瑟氏菌的Ribosomal Protein L7/L12基因序列非常類似 的D N A序列。此構造基因部分的全鹼基序列以及對應的 胺基酸序列係如序列表序列號碼：1 9以及2 0的序列。 此基因片段明顯地爲流感嗜血桿菌流感的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的基因密碼（c〇de)。 倂入表現載體的大腸菌於2倍濃度的Y T培養基中 5 0 ，3 7 1晚培養。2倍濃度的T Y培養基 4 5 0 2於3 7 t下1小時保溫。1晚培養後的大腸菌液 5 0 放入前述的4 5 0 4培養基中，3 7 °C 1小時培 養後放入 500mM IPTG 100//1，25°C 4小時培養後回收，分別以2 5 0 m 1放入離心試管中進 行5 0 0 0 r p m，2 0分鐘離心。捨棄上淸液溶解於含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -34 - ------------------訂---------AWI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 Α7 Β7 五、發明說明（32 ) 5 0 m M T r i s - H C 1 pH7.4，含 25% 蔗 糖之（Lysis )緩衝液2 5 m 1中。

添加 10% NP — 40 1.25m£，lM mSC12 125//1再移入塑膠試管。1分鐘x 5次 冰冷中實施音波（sonication )處理，再12000rpm ’ 1 5分鐘離心後回收上淸液。 再以P B S作處理的谷腕甘肽瓊脂糖凝膠（Pharmacia 公司製）柱吸著前述上淸液。 再以P B S洗淨液將柱子以3倍體積洗淨。然後以含 10mM的谷胱甘肽之50mM T r i s - H C 1 8 · 〇溶出，其析出的部分的蛋白質含有量以色素結合法 (布雷德福特法；Biorad公司）檢測，取的主要部分。主 要部分以3L PBS進行3次透析。 所得的 G S T 融合 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質 1 溶液 1〇2 加上含 500mM T r i s - HC1 ρΗ7·0，1·5Μ NaCl，l〇mM EDTA，lQmM DTT 之斷裂緩衝液（Cleavage buffer ) 1 m£，且再添加 2 u / // 1 的 PreScission Protease (Pharmacia公司製）100// 1於4 °C下反應。GST部 分由Ribosomal Protein L7/L12蛋白質部分切離。 再以P 3 S作處理的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱通過反應 液，回收通過液，且P B S以1倍容積流入，亦將此回收 。所取得的純化R i b 〇 s 〇 m a 1 P r 〇 t e i n L 7 / L 1 2蛋白質之純度以 電泳法進行確認，確保作爲免疫源時約有9 0 %的高純度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -35 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

i—！丨—訂·！—I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 B7 五、發明說明（33 ) 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先對於老鼠的免疫，肺炎鏈球菌之Ribosomal Proteln L7/L12 蛋白質抗原 100//g 溶於 2 00// 1 的 P B S後加入福樂因特助劑（Freund’s adjuvant )200 # 1 ，乳化後2 0 0 // 1注射於腹腔內。 且於2週後、4週後、6週後同樣的乳化抗原注射於 腹腔內，且於1 〇週後、1 4週後以2倍濃度的抗原乳化 液注射於腹腔內，最後的免疫起3天後取出脾臟，提供於 細胞融合的步驟。 相對無菌方式取出的老鼠脾細胞1 〇 8個而言取出骨 髓瘤細胞2 X 1 0 7個於玻璃試管內充分混合後以1 5 0 0 r p m，5分鐘離心捨棄上淸液，之後充分混合細胞。 細胞融合時所使用的骨髓瘤細胞於使用於N S - 1系 的細胞株，於含1 0 %牛胎兒血淸（F C S )之 R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基中培養，自細胞融合的2週前於 含 〇 · 13mM 的氮烏嘌呤，0 · — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 210，10% FCS之RPMI 1640培養基中培養 1週後，使用含10% FCS之RPMI 1640培養基 中培養1週者。混合的細胞樣品3 0 加入保溫於3 7 °C 下的RPMi丄640培養基50m£，150〇rpm離 心除去上淸液後加入保溫3 7 °C，5 0 %的聚乙基乙二醇 1 2激烈攪拌，2分鐘處理後，添加保溫3 7 °C的1 0 r Ρ Μ I 1 6 4 0培養基，此液體以吸液管（pipet )進行 口及進，擠出約5分鐘的激烈攪拌混合。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -36 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（34 ) 於1 0 0 0 r p m離心5分鐘，除去上淸液後加上 3 0 4的H A T培養基調整細胞濃度成5 X 1 〇 6個/J， 攪拌均勻後，於9 6洞培養皿型培養皿中分別注入〇 .丄 J，以7 % C 0 2條件下，3 7 °C培養，第1天、第1週、 第2週分別添加HAT培養基〇 · 14。 爲篩選產生目標抗體之細胞，實施以E L I S A法進 行評價。溶解於含0 · 0 5 %迭氮化鹼P B S中的肺炎鏈 球菌之 Ribosomal Protein L7/L12蛋白質，其稀釋至 1 0 // g / mU農度之液體，分別以1 〇 〇 // 1注入9 6洞 培養皿，4 °C下吸著1晚。除去上淸液後，添加1 %牛血 淸白蛋白溶液（P B S中）2 0 0 // 1於室溫下反應1小 時後遮蓋。除去上淸液後以洗淨液（Tween20 0.02 % ， P B S )洗淨 > 其上加入融合細胞培養液1 Q 〇 #丨於室 溫下反應2小時後除去上淸液以洗淨液洗淨。將此加入 5 0 n g/m£的過氧化酶標識羊抗老鼠I g G抗體液 1 0 0 // 1 ，於室溫反應實施1小時，除去上淸液以洗淨 液洗淨後加入1 0 0 μ 1 Τ Μ Β溶液（K P L公司）於 室溫下反應2 0分鐘，發色後添加1 Ν的硫酸1 〇 〇 // 1 停止反應，以4 5 0 n m測定其吸光。 此結果中發現有與Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反 應的陽性凹穴，其判斷爲含有相對於Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之抗體。 於是分別回收陽性凹穴中的細胞於2 4洞塑膠培養皿 中，以H A T培養基培養。所培養的融合培養基爲使細胞 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -37 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------^ 1111111 · 1231299 A7 B7 五、發明說明（35 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 數能成2 0個/ m£而以Η T培養基稀釋，將此5 0 // 1於 Η Τ培養基中懸濁的6週齡的老鼠胸線細胞1 〇 6個於9 6 洞培養皿中混合後，以7 % C 0 2條件下，3 7 °C培養培養 2週培養液上淸液中的抗體活性以上述的E L I S A法同 樣方法檢測，回收與Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反應 之陽性細胞。 而且，反覆進行同樣的稀釋檢測，純系化過程操作， 得到融合瘤A M S P - 1〜4合計4種純系。 〔實施例6〕 與肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反應 的單株抗體之肺炎鏈球菌以及與其他微生物的反應試驗。 依照使用如前述取得之陽性融合瘤細胞的一定方法， 進行單株抗體生產的回收。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具體而言，使用RPMI 1 640培養基（含10% F C S )進行繼代培養的細胞於2 5 c m 2培養椎形瓶中以 無血淸培養基稀釋至2X105個/ 2，3 · 3xl05個 /m£以及5 X 1 0 5個/m£程度的全容量爲5m 1的菌液。 於7 % C〇2，3 7 t下進行3〜5天的增値，可見到細胞 增値的錐形瓶中選擇原來細胞數較少的者，使其最終稀釋 至2 X 1 05個者能於3〜4天內增値至2 X 1 06個 / ，重複以同樣操作進行無血淸培養基培養。再進行細 菌培養用9 6洞培養皿中的純系化過程，選擇增値較快且 抗體價値較高的細胞，所選擇的細胞於2 4洞培養皿中增 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明說明（36 ) 値的以無血淸培養基稀釋至2 5 c m 2培養椎形瓶中2 X 1 0 5個/ 的程度的全體積爲1 〇 2菌液，將此於7 % C〇2，3 7°C下培養3〜5天增値至1 x 1 〇6個/ 2後 ，以7 5 c m 2培養椎形瓶中同樣地進行增値至1 X 1 06個，再移至1 0 02大量培養用的瓶子中。此瓶 中加上1 0 0 m«的無血淸培養基，邊攪拌邊以3 7 °C下培 養2天後，再加上無血淸培養基2 0 02再培養2天。此 培養液分爲4支而加1 0 0 2的無血淸培養液’ 2天培養 後分別添加4 0 0 2的無血淸培養液再培養約6天後，回 收培養液以1 0 0 0 r p m，1 5分鐘離心取得含作爲目 的抗體的培養上淸液，此培養上淸液添加0 · 1%迭氮化 鹼後4 °C保存。所取得的含有抗體的液體1 0 0 以 P B S稀釋5倍後以ProteinG柱子（5 容積，Pharmacia 公司）吸著，以3倍容積的P B S洗淨，以p Η 3的檸檬 酸緩衝液溶出，回收抗體部分得到可生產各融合瘤的單株 抗體。來自此4株的融合瘤的單株抗體以特表平7 -5 0 9 5 6 5號公報所記載的〇I Α法進行評價。 即，0 I A法爲具有氮化矽的薄膜層之矽晶圓上進行 capture用抗體的反應所製成的反應用器材，於此抗原物質 即微生物萃取液於一定時間進行反應後，被捕捉的抗原與 作酵素標識的抗體（增幅試藥）進一步地反應，最後加上 基質溶液所生成的薄膜沈澱引起的光干涉之色澤濃度，進 而可以視覺判斷抗原抗體反應的方法。 所製得的單株抗體作爲〇 I A法中具有氮化砂的薄膜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 39 - MB MM aa IBM MB 一-0, n —.1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 X 消 費 合 社 印 製 五、發明説明（39[表2] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) 肺炎鏈球蘭(Streptococcus pneumoniae) 肺炎鏈球菌（StreDtococcus pneumoniae) 肺炎鏈球菌（StreDtococcus pneumoniae) .肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) 大腸桿菌(Escherichia coli) 排泄物腸球菌（Enterococcus faecalis) 流感嗜血桿菌(Haemcmhiliis influenzae) 肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) 嗜乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica) 腦膜炎球菌(Neisseria meningitidis) 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa) 鏈球菌 B 群(GrouoB streptococcus) 金黃色葡萄球菌(Staphvlococcus auresu) 釀膿鏈球菌(Streptococci pyogenes) 1〇6個/2檢測辱里 ATCC27336 IID554 IID555 IID556 IID557 IID5588 IID559 IID1603 + + + + + + + + 103個/mg檢測結果 ATCC25922 ATCC19433 ATCC10211 ATCC13883 IID821 ATCC23970 ATCC13090 ATCC27853 ATCC12386 ATCC25923 ATCC19615 (+;陽性反應、陰性反應） — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） -42- 1231299 A7 B7 五、發明說明（40 ) 〔實施例7〕 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 自淋病__奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L1 2基因的純 系化過程中，同蛋白質於大腸桿菌中的大量表現與純化， 以及對應同蛋白質的單株抗體之製作。 淋病奈氏球菌I ID8 21株（自東京大學醫科學硏 究所所分配、購入）於巧克力洋菜培養基上適當地植菌， C〇2培養相中3 7 C、C〇2 〇 · 5 %條件下2 4小時 培養。所長出的菌落最終成大約5x 1 〇9CFU/m£左右 ，於T E緩衝劑（和光純藥工業公司製）中懸濁。此時移 入約1 · 5 m£的微量離心試管中以1 〇 〇 〇 〇 r p m離心 2分鐘，捨棄上淸液，沈澱部分以5 6 7 // 1的T E緩衝 液再懸濁。再加上3 0 // 1的1 0 %月桂硫酸鈉（S D S )與3//1的20mg/m£ Proteinase K溶液充分混合， 培養3 7 °C 1小時。再添加1 Q %溴化十六烷基三甲基銨 / 0 · 7 M . N a C 1溶液8 0 // 1 ，充分混合後6 5 °C 下培養1 0分鐘。再加入體積比2 4/1的氯仿一異戊醇 混合物7 0 0 // 1充分攪拌。此溶液以微量離心機 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 2 0 0 0 r p m，5分鐘（控制於4 °C下）離心處理後 ，水層部分移至新的微量離心管。於此加入0 · 6倍量的 異丙醇充分搖動試管使D N A形成沈澱白色D N A沈澱以 玻璃棒勾取移入放有1 2的7 0 %乙醇（冷卻至一 2 0 t 者）之另一微量離心管。 再以1 0 0 0 0 r p m，5分種離心處理，靜靜地將 上淸液除去後再加上1 2的7 0 %乙醇再離心5分鐘再將 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -43 - 1231299 A7 B7 五、發明說明（41 ) 上淸液除去後沈澱物以1 〇 〇 // 1的T E緩衝液溶解得到 D N A溶液。此基因組D A N溶液的濃度依照M〇iecular Cloning, A laboratory manual, 1 989, Eds. Sambrook, J., Fritsch， E. F·， and Maniatis， T·， Cold Spring harbor Laboratory Press 的 E5，Spectrophntometric Determination of the Amount of DNA或RNA之方法定量。 使用此基因組DNA中1 〇 n g進行p CR ( polymerase chain reaction ) 。？〇尺爲使用丁8(1聚合酶 (寶酒造公司製，標號R 0 0 1 A )。附加於酵素的緩衝 液5 # 1 ，附加於酵素的dNTPmixture 4 // 1與流感嗜血 桿菌等菌的Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列的類似性可 由電腦網路情報（奧克來荷馬大學，肺炎鏈球菌某因設計 公開 基因d N A情報）取得肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列以原先設計的序列表序列號碼： 1 5所示合成核苷酸E以及序列表序列號碼：1 6所示的 核苷酸F作爲探測體，分別加入2 0 0 p m ο 1 ，使最終 容量爲5 0 // 1。 此混合物使用 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 ， 9 5 °C 1分鐘，5 0 °C 2分鐘，7 2 t： 3分鐘進行5次 循環後，再進行9 5 t： 1分鐙，6 0 t： 2分鐘， 7 2 °C 3分鐘2 5次循環。此P C R產物的一部份以 1 · 5 %瓊脂糖凝膠（agarose )中進行電泳，經溴化乙錠 (日本gene公司製）染色後，以紫外線觀察，確認有 4 0 0 b p的c D N A被增大。且經限制酶b a m Η I以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公餐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ___B7__ 五、發明說明（42 ) 及X h ο I切斷處理後，以1 · 5 %瓊脂糖凝膠中進行電 泳經溴化乙錠染色後切出約3 7 0 b p —帶的膠片再以 SuprecOl (寶酒造公司製）純化後，倂入市販的載體（ vector ) p G E X — 4 T — 1 ( Pharmacia 公司製）。具體 而言，載體p GEX - 4T 一 1與先前的DNA其莫耳比 成1 : 3混合之，以T 4 D N A連接酶（llgase，

Invitrogen公司製）於載體中倂入D N A。D N A所倂入的 載體p G E X — 4 T — 1於大腸菌以〇ne Shot Competent Cells ( InWtrogen公司製）導入基因，植菌於含安匹西林 (Sigma 公司製）5 0 // g / 的 L -培養液（L-Bi*oth， 寶酒造公司製）半固體培養基培養皿中，放置於3 7 t 1 2小時，長出的菌落以逢機選擇植入同濃度的含安匹西 林的L —培養液2 m£中，3 7 °C振盪培養8小時，回收菌 體，使用Witherdominiprep ( Promega公司製）並依照所添 加的說明書分離質體，此質體以限制酶B a m Η I / X h ο I分解，切出約3 7 0 b ρ的D Ν Α而確認該 P C R產物已被倂入，對於已確認的群株而言進行所倂入 的D Ν A之鹼基序列分析。 對於所插入的D Ν A片段之鹼基序列分析，使用 Applied Biosystems公司製的螢光序列分析裝置實施。序列 樣品的調製方法使用 PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 公司製）進行。 0 . 5 容量的微量試管中加入9 · 5 // 1的反應保存液 、4 · 0# 1的0 · 8pmo 1/// 1的T7起動引發物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -45 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) aH·! MB -，， ϋ .1 I ϋ I . 1231299 A7 _________Β7________ 五、發明說明（43 ) (Promoter primer，GIBC〇 BRL 公司製）以及 6.5//1 的 0 · 1 6 /z g / # 1的序列用模型D N A混合， 1 〇 0 // 1的礦物油添加於上層後，進行9 6 °C 3 0秒、 5 5 °C 1 5秒以及6 0 °C 4分鐘爲一次循環，進行P C R 增大反應2 5次循環，於4 °C 5分鐘保溫。反應後加上 8 〇 # 1的滅菌精製水攪拌，離心分離後，此水層進行3 次的苯酚•氯仿萃取。1 0 0 // 1的水層中加入1 0 # 1 的3 Μ醋酸鈉（p Η 5 · 2 )以及3 0 0 // 1的乙醇攪拌 後’室溫下進行離心1 4，0 0 0 r p m，1 5分鐘後回 收沈澱。沈澱物以7 5 %乙醇沖洗後，真空下靜置2分鐘 使其乾燥，作爲序列用樣品。序列樣品溶解於4 // 1含 1 0 m Μ的E D T A之甲醯胺經9 0 t：，2分鐘變性後於 冰中冷卻提供於序列步驟。 所得的5個純系中1個序列與使用於P C R的探測體 (probe )的序列有相同性，且其他微生物，例如發現與1 感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因序列非常類似 的D A N序列。此構造基因部分的全鹼基序列以及對應的 胺基酸序列係如序列表序列號碼：2 1以及2 2的序列。 此基因片段明顯地爲淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的基因密碼（code )。 使用如此所構成的淋病奈氏球菌的G S T融合 Ribosomal Protein L7/L12蛋白質表現載體與實施例2所記 載的相同方法取得純化淋病奈氏球菌的G S T融合 Ribiosomal Protein L7/L12 蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）-46 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -I I I I ϋ^OJa ϋ ϋ ϋ I . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 --- —___B7___ 五、發明說明（44 ) 而且依照實施例3所記載的方法取得可產生對應淋病 查的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之單株抗體的 融合瘤G C R B - 3株。 〔實施例8〕 與淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反 應的單株抗體之淋病奈氏球菌以及與其他微生物的反應試 驗。 依照使用如前述取得之陽性融合瘤細胞G C R B - 3 的一定方法，回收生產的單株抗體。 具體而言爲使用PRMI 1640陪地（含1〇°/〇 F C S )進行繼代培養的細胞，於2週前於腹腔內注射 0 · 5 2扎日斯烷（pnstan )的B a 1 b / C老鼠腹腔內 注射5 X 1 0 6個（P B S中），3週後回收腹水，離心後 取得上淸液。 取得的含抗體液體吸著於Protein A柱（5 容積， Pharmacia公司），以3倍容積的P B S洗淨，以p Η 3的 檸檬酸緩衝液溶出，回收抗體部分，得到生產各個融合瘤 的單株抗體。 使用來自此G C R Β - 3融合瘤的單株抗體以 E L I S Α法進行評價。 抗體的評價使用夾心試驗法，所製得的單株抗體與過 氧化物酶以化學結合作爲酵素標識抗體使用。 即，酵素標識爲使用Hosradeishu過氧化物酶（Sigma grade VI )，結合使用試藥S —乙醯基硫代醋酸N -羥基琥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -47 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 A7 B7 五、發明説明（46 )[表3] 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 __ 1〇6個/以檢測結果 淋病奎，.氏j求菌(Neisseria gonorrhoeae) ATCC9793 + 淋病奢氏j求康[(Neisseria gonorrhoeae) ATCC19424 + 淋病查氏j求菌(Neisseria gonorrhoeae) ATCC27628 + 进^病奈氏球 Iff (Neisseria gonorrhoeae) ATCC27629 + 淋病-轰氏球菌(Neisseria gonorrhoeae') ATCC27630 + 琳病奈氏球蘭fNTehfirh gonorrhoeae) ATCC27631 + 淋病奈氏球两ΓΝΑςπΗΑ gonorrhoeae) ATCC27632 + 淋病奈氏球两iNe上seria PonorrhoeafO ATCC27633 + 淋病奈氏球两(NeiaeHa gonorrhoeae) ATCC35541 + 淋病奈氏球两(NeiMeria gonorrhoeae) ATCC35542 + 淋病奈_氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) ATCC43069 + 淋病奈氏球葆f(Neisseria gonorrhoeae) ATCC43070 + 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) ATCC49226 + 1〇8個/2檢測結果 腦膜炎球菌 Weisseria meningitidis) ATCC13090 - 嗜乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamical ATCC30011 - 黏膜奈瑟氏菌（Neisseria mucosa) ATCC35611 - 乾燥奈瑟氏菌（Neisseria sicca) ATCC9913 - 卡他布蘭漢氏球窗f(BranhameMa catarrharis) ATCC25240 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) ATCC10211 - 大腸桿菌(Escherichia coin ATCC25922 - 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae) ATCC13883 - (+;陽性反應、 陰性反應） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 49 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7

五、發明說明（47 ) 〔實施例9〕 取得特異抗 Rlb〇s〇mal Pr〇tein L7/L12 蛋白 質單株抗體 I氏I ID8 2 1株（自東京大學醫科學硏 究所所配合、購入）於巧克力洋菜培養基上適當地植菌， c 〇 2培養箱中3 7 °C、C〇2 0 · 5 %濃度條件下2 4 小時培養。所長出的菌落最終成大約5 x 1 〇 9 C F U / 左右’於T E緩衝劑（和光純藥工業公司製）中懸濁。此 時移入約1 · 5 m 1的微量離心試管中以 1 0 0 0 0 r p m離心2分鐘，捨棄上淸液，沈澱部分以 5 6 7 // 1的T E緩衝液再懸濁。再加上3 0 // 1的1 〇 %月桂硫酸納（SDS)與3// 1的2〇mg/Tn£ Proteinase K溶液充分混合，培養3 7 °C 1小時。再添加 1 0 %溴化十六烷基三甲基銨/ 〇 · 7 Μ N a C 1溶液 8 0 // 1 ，充分混合後6 5 t：下培養1 0分鐘。再加入體 積比2 4/1的氯仿一異戊醇混合物7 0 0 // 1充分攪拌 。此溶液以微量離心機1 2 0 0 0 r p m，5分鐘（控制 於4 °C下）離心處理後，水層部分移至新的微量離心管。 於此加入0 · 6倍量的異丙醇充分搖動試管使D N A形成 沈澱白色的D N A沈澱以玻璃棒勾取移入放有1 m 1的 70%乙醇（冷卻至—20 °C者）之另一微量離心管。 再以1 0 0 0 0 r p m，5分種離心處理，靜靜地將 上淸液除去後再加上1 4的7 0 %乙醇再離心5分鐘再將 上淸液除去後沈澱物以1 0 0 V 1的T E緩衝液溶解得到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -50 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（48 ) D N A溶液◦此基因組D A N溶液的濃度依照Molecular Cloning, A laboratory manual, 1 9 8 9, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T·， Cold Spring harbor Laboratory Press 的 E5，Spectrophntometric Determination of the Amount of DNA或RNA之方法定量。 使用此基因組DNA中lOng進行PCR ( polymerase chain reaction ) 。P C R 爲使用丁 a q 聚合酶 (寶酒造公司製，標號R 〇 〇 1 A )。附加於酵素的緩衝 液5 // 1 ，附加於酵素的dNTPmixture 4 // 1與其他菌的

Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列的類似性可由電腦網路 情報（奧克來荷馬大學，肺炎鏈球菌基因設計公開 基因 D N A情報）取得肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列以原先設計的序列表序列號碼：1 5所示合成核 苷酸E以及序列表序列號碼：1 6所示的合成核苷酸F作 爲探測體，分別加入2 0 0 p m ο 1 ，使最終容量爲5〇 β 1 〇 此混合物使用 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 ， 9 5 °C 1分鐘，5 0 °C 2分鐘，7 2 °C 3分鐘進行 5次循環後，再進行9 5 t： 1分鐘，6 0 °C 2分鐘， 7 2 °C 3分鐘2 5次循環。此P C R產物的一部份以 1 · 5 %瓊脂糖凝膠（agarose )中進行電泳，經溴化乙錠 (曰本gene公司製）染色後，以紫外線觀察，確認有 4 0 〇 b p的c D N A被增大。且限制酶B a m Η I以及 X h ο I切斷處理後，以1 · 5 %瓊脂糖凝膠中進行電泳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -51 - -----------MW--------1T--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 B7 五、發明說明（49 ) 經溴化乙錠染色後切出約3 7 0 b p —帶的膠片以 SuprecOi (寶酒造公司製）純化後，倂入市販的載體（ vector ) pGEX— 6P— 1 ( Pharmacia 公司製）。同載 體因倂入目標基因片段而表現與.G S T蛋白質的融合蛋白 質’作爲目標分子的表現載體之機能。具體而言，載體 PGEX — 6P— 1與先前的DNA其莫耳比成1 : 5混 合之，以T 4 D N A連接酶（ligase，Invitrogen公司製） 中將DNA倂入載體中。DNA所倂入的載體p GEX — 6 P — 1 於大腸菌以 One Shot Competent Cells ( Invitrogen 公司製）導入基因，植菌於含安匹西林（Sigma公司製） —培養液（L 一 B r 〇 t h，寶酒造公 司製）半固體培養基培養皿中，放置於3 7 °C 1 2小時， 長出的菌落以逢機選擇植入同濃度的含安匹西林的L -培 養液2 中，3 7 °C振盪培養8小時，回收菌體，使用 Witherdominiprep ( Promega公司製）並依照所添加的說明 書分離質體，此質體以限制酶B amH I/Xh ο I分解 ，切出約3 7 0 b p的D N A而確認該P C R產物已被倂 入，對於已確認的群株而言進行所倂入的D N A之鹼基序 列分析。對於所插入的D N A片段之鹼基序列分析，使用 Applied Biosystems公司製的螢光序列分析裝置實施。序列 樣品的調製方法使用 PRISM，Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 公司製）進行。 0 · 5 容量的微量試管中加入9 . 5 μ 1的反應保存液 、4 · 0 # 1的0 · 8 pmo 1/// 1的Τ7起動引發物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .f--------J---------$. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -52- 1231299 A7 B7 五、發明說明（50 ) (promoter primer，GIBC〇 BRL 公司製）以及 6.5//1 的 〇 · 1 6 // g / # 1的序列用模型D N A混合’ 1 0 0 // 1的礦物油添加於上層後，9 6 °C 3 0秒、 5 5 °C 1 5秒以及6 0 °C 4分鐘爲一次循環’進行 p c R增大反應2 5次循環，於4 °C 5分鐘保溫。反應 後加上8 0 // 1的滅菌精製水攪拌，離心分離後’此水層 進行3次的苯酚•氯仿萃取。1 0 〇 A 1的水層中加入 10#1的3M醋酸鈉（pH5 · 2)以及300//1的 乙醇攪拌後，室溫下進行離心1 4，0 0 0 r p m，1 5 分鐘後回收沈澱。沈澱物以7 5 %乙醇沖洗後’真空下靜 置2分鐘使其乾燥，作爲序列用樣品。序列樣品溶解於 4// 1含1 OmM的EDTA之甲醯胺9 0°C，2分鐘變 性後於冰中冷卻提供於序列步驟。 所得的4個純系中1個序列與使用於P C R的探測體 (probe )的序列有相同件，且其他微生物，例如發現與流感 嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因序列非常類似的 D A N序列。此構成基因部分的全鹼基序列以及對應的胺 基酸序列係如序列表序列號碼：2 1以及2 2的序列。此 基因片段明顯地爲淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的基因密碼（code)。 倂入表現載體的大腸菌於2倍濃度的Y T培養基中 5〇m£，37°C1晚培養。2倍量的YT培養基450J 於3 7 °C下1小時保溫。1晚培養後的大腸菌液5 0 放 入前述的4 5 0 培養基中，3 7 t： 1小時培養後放入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · 53 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) H — — — — — — 一so, a — — — — — — — — . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ________^B7___ 五、發明說明（51 ) 5 0 〇 m M IPTG 100//1 ，25 °C 4 小時培養 後回收，分別以2 5 0，-£放入離心試管中進行5 0 〇 〇 r P m，2 0分鐘離心。捨棄上淸液溶解於含5 0 m Μ 1>1'13—卜1(：1?117.4，含25%蔗糖之（1^以） 緩衝液2 5 中。

添加 10 % NP — 40 1 .25m£，1M M g c 1 2 1 25// 1再移入塑膠試管。1分鐘X5次 冰冷中實施音波處理，再1 2 0 0 0 r p m，1 5分鐘離 心後回收上淸液。 再以P B S作處理的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（Pharmacia 公司製）柱吸著前述上淸液。 以P B S洗淨液將柱子以3倍體積洗淨。然後以含 10mM的谷胱甘肽之5〇mM T r i s - H C 1 8 · 0溶出，析出的部分中之蛋白質含有量以色素結合法 (布雷德福特法；Biorad公司）檢測，取得主要部分。主 要部分以3 L P B S進行3次透析。 所得的 G S T 融合 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質 lmg/m£ 溶液 l〇m£ 加上含 500mM T r i s — HC1 ρΗ7·〇，1·5Μ NaCl，l〇mM EDTA，l〇mM DTT 斷裂緩衝液（Cleavage buffer )，且再添加 2u///l 的 PreScission Protease ( Pharmacia公司製）1 0 0 // 1於4 °C下反應。G S T部分 由Ribosomal Protein L7/L12蛋白質部分切離。 再以P B S作處理的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱通過反應 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ MB MB^OJ ϋ ϋ 1 ϋ ϋ I _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -54- 1231299 A7 __B7__ 五、發明說明户2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 液，回收通過液，且P B S以1倍容積流入，亦將此回收 。所取得的純化Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之純度以 電泳法進行確認，確保作爲免疫源時約9 0 %的高純度。 首先對於老鼠的免疫，淋病奈氏球菌之Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質抗原 l〇〇/zg 溶於 2 00// 1 的 P B S後加入福樂因特助劑（Freund’s adjuvant ) 2 0 0 // 1 ，乳化後2 0 0 // 1注射於腹腔內。 且於2週後、4週後、6週後同樣的乳化抗原注射於 腹腔內，且於1 0週後、1 4週後以2倍濃度的抗原乳化 液注射於腹腔內進行最後的免疫起3天後取出脾臟，提供 於細胞融合的步驟。 相對無菌方式取出的老鼠脾細胞1 〇 8個而言取出骨 髓瘤細胞2 X 1 0 7個於玻璃試管充分混合後以 1 5 0 0 r p m，5分鐘離心捨棄上淸液，之後充分混合 細胞。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 細胞融合時所使用的骨髓瘤細胞使用N S - 1系的細 胞株於含1 0 %牛胎兒血淸（F C S )之 R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基中培養，自細胞融合的2週前於 含 0 · 1 3 πι Μ 的氮烏曝 D令，〇 · 5 // g / 的 M C — 210，10% FCS之RPMI1640培養基中培養 1週後，使用含10% FCS之RPMI 1640培養基 中培養1週者。混合的細胞樣品添加保溫於3 7 °C下的 5 0 RPMI 1640培養基30m£，進行離心 1 5 0 0 r p m除去上淸液後加上保溫3 7 °C的5 0 %的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -55 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 -------Β7___ 五、發明說明（53 ) % S基乙二醇1 2激烈攪拌2分鐘處理後，添加保溫 3 7 °c的1 〇 ^ R Ρ Μ I 1 6 4 0培養基，液體以吸液 胃（Pipet )進行吸進，擠出約5分鐘的激烈攪拌混合。 於1 0 0 0 r p m離心5分鐘，除去上淸液後加上 3 的HAT培養基調整成細胞濃度成5 X 1 06個/ m£ ’攪拌均勻後，於9 6洞培養皿型培養皿中分別注入 〇 · 1 4，以7 % C〇2條件下，3 7 °C培養，第1天、第 1週、第2週分別添加HAT培養基〇 · 12。 爲篩選產生目標抗體之細胞，實施E L I S A法進行 評價。溶解於含〇 · 〇 5 %迭氮化鹼P B S中的淋病奈氏 見之 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質稀釋至 1 〇 // g / J濃度之液體，分別以1 0 0 // 1注入9 6洞培養皿， 4 t下吸著1晚。除去上淸液後，添加1 %牛血淸白蛋白 溶液（P B S中）2 0 0 // 1於室溫下反應1小時後遮蓋 。除去上淸液後以洗淨液（Tween20 0.02 % ，P B S )洗 淨，其上加入融合細胞培養液1 0 0 // 1於室溫下反應2 小時後除去上淸液以洗淨液洗淨。將此加入5 0 n g / 的過氧化酶標識羊抗老鼠I gG抗體液100// 1 ，於室 溫反應實施1小時，除去上淸液以洗淨液洗淨後加入 100// 1 TMB溶液（KPL公司）於室溫下反應 2 0分鐘，發色後添加1 N的硫酸1 0 0 // 1停止反應’ 以4 5 0 n m測定其吸光。 此結果中發現與Rib〇soma 1 Protein L7/L12蛋白質反應 的陽性凹穴，其判斷爲含有相對於Ribosomal Protein L7/L12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -56 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 A7 _____B7___ 五、發明說明（54 ) 蛋白質之抗體。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於是分別回收陽性凹穴中的細胞於2 4洞塑膠培養皿 中’以H A T培養基培養。所培養的融合培養基爲使細胞 數能成2 0個/ 2以Η T培養基稀釋，將此5 0 // 1與 Η Τ培養基中懸濁的6週齡的老鼠胸線細胞1 0 6個於9 6 洞培養皿中混合後，以7 % C 0 2條件下，3 7 t培養培 養2週培養液上淸液中的抗體活性以上述的E L I S A法 同樣方法檢測，回收與Ribosomal Protein L7/L12蛋白質反 應之陽性細胞。 而且，反覆進行同樣的稀釋檢測，純系化過程操作， 得到融合瘤Η I R B - 5〜8合計4種純系。 依照使用如前述取得之陽性融合瘤細胞的定性方法， 進行單株抗體生產的回收。 具體而言，使用RPMI 1640培養基（含10 % F C S )進行繼代培養的細胞於2 5 c m 2培養椎形瓶中於 無血淸培養基稀釋至2X105個/4，3 . 3X105個 / m£以及5 X 1 0 5個/ 程度的全容量5 。7 % C〇2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，3 7 t下3〜5天進行增値，於可見到細胞增値的錐形 瓶中選擇原來細胞數較少的者，使最終稀釋至2 X 1 0 5個 / 2者能於3〜4天內增値至2 X 1 0 6個/ ，重複以同 樣操作於無血淸培養基培養。再進行細菌培養用9 6洞培 養皿中的純系化過程，選擇增値較快且抗體價値較高的細 胞所選擇的細胞於2 4洞培養皿中增値的以無血淸培養基 稀釋至2 5 cm2培養椎形瓶中2x 1 05個/ 2的程度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -57 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（55 ) 而全體積爲10m«，將此於7% C〇2，37 °C下培養3〜 5天增値至1 X 1 0 6個/ 後，以7 5 c m 2培養椎形 瓶中同樣地進行增値至1 X 1 06個/ 2，再移至1 0 〇m£ 大量培養用的瓶子中。此瓶中加上1 0 0 的無血淸培養 基，邊攪拌邊以3 7 °C下培養2天後，再加上無血淸培養 基2 0 〇m£再培養2天。此培養液分爲4支而加1 0 02 的無血淸培養液，2天培養後分別添加4 0 0 2的無血淸 培養液再培養約6天後，回收培養液以1 0 0 0 r p m， 1 5分鐘離心取得含作爲目標抗體的培養上淸液，此培養 上淸液添加0 . 1 %迭氮化鹼後4 °C保存。所取得的含有 抗體的液體1 0 0 m£以P B S稀釋5倍後以ProteinG柱子 (5 m£容積，Pharmacia公司）吸著，以3倍容積的P B S 洗淨，以p Η 3的檸檬酸緩衝液溶出，回收抗體部分得到 可生產各融合瘤的單株抗體。來自此4株的融合瘤單株抗 體以特表平7 - 5 0 9 5 6 5號公報所記載的〇I Α法進 行評價。 即，0 I A法爲具有氮化矽的薄膜層之矽晶圓上進行 capture用抗體的反應所製成的反應用器材，於此抗原物質 即微生物萃取液於一定時間進行反應後，被捕捉的抗原與 作酵素標識的抗體（增幅試藥）進一*步地反應，最後加上 基質溶液所生成的薄膜沈澱引起的光干涉之濃度，可以視 覺可判斷抗原抗體反應的方法。 所製得的單株抗體作爲〇 I A法中具有氮化砂的薄膜 層之矽晶圓上進行固定化的capture抗體使用。又作爲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -58- -------------------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 經濟部智慈財產局员工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（58 ) [表4] 1〇8個/2檢測結果 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) IID821 + 嗜乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica) ATCC23970 + 腦膜炎球菌(Neisseria menindtidis) ATCC13090 + 大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC25922 - 排泄物腸球菌(Enterococcus faecalis) ATCC19433 - 流感嘻血桿菌（Haemophilus influenzae) ATCC10211 - 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae) ATCC13883 - 綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa) ATCC27853 - 鏈球菌 B 群(GroupB streptococcus) ATCC12386 - 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus auresu) ATCC25923 - 肺炎鏈球菌（Streptococcus Dneumoniae) ATCC27336 - 釀膿鏈球菌（Streptococcs pyogenes) ATCC19615 - (+;陽性反應、 陰性反應） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •罐衣. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -61 - 1231299 A7 B7 五、發明説明（63 )[表5] 1〇8個檢測結果 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) ATCC10211 + 大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC25922 - 排泄物腸球菌(Enterococcus faecalis) ATCC19433 - 肺炎桿菌（Klebsiella Dneumoniae) ATCC13883 - 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) IID821 - 嗜乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica) ATCC23970 - 腦膜炎球菌(Neisseria meningitidis) ATCC13090 - 綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa) ATCC27853 - 鏈球菌 B 群（GroupB streptococcus) ATCC12386 - 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus auresu) ATCC25923 - 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) ATCC27336 - 釀膿鏈球菌(Streptococcs pyogenes) ATCC19615 - (+;陽性反應、 陰性反應） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） -66 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7_ 五、發明說明（64 ) 〔參考例1〕. 取得與各種微生物的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質 特異反應的單株抗體。 以〇I A或E L I S A進行微生物檢測時，通常以 capture抗體與detect用標識抗體夾住抗原進行檢測，即所 謂的夾心試驗法其特別對檢測感度具有利用性，然而此時 與來自特定微生物的抗原物質與特異性反應之抗體爲必要 的同時，多一種可辨識與特異性抗體相異的抗原表位的抗 體亦爲必要的。 與來自種種微生物的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質 進行非特異性反應的抗體和，與Ribosomal Protein L7/L12蛋 白質進行特異性反應的抗體所構成夾心試驗的抗體極爲有 用。 幸運地因Ribosomal Protein L7/L12蛋白質爲種種微生 物中具有相同胺基酸序列領域，因此試取得與由流感嗜血 桿菌的種種微生物之Ribosomal Protein L7/L12蛋白質交差 反應的多細胞抗抗體，由發現由一種微生物所取得的不具 特異性之抗Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗體中於種種 微生物的夾心試驗法可共通利用。 首先由淋病奈氏桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因 進行純系化過程’同蛋白質於大腸囷的大量表現、純化以 及製得對應同蛋白質地單株抗體。 淋病奈氏球菌I ID8 21株（自東京大學醫科學硏 究所所分配、購入）於巧克力洋菜培養基上適當地植菌， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -67 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 --------- B7_ _ 五、發明說明（65 ) c 0 2培養箱中3 7 °C、C〇2 0 · 5 %條件下2 4小時 培養。所長出的菌落最終成大約5 X 1 〇 9 c F U /2左 右’於T E緩衝劑（和光純藥工業公司製）中懸濁。此時 移入約1 · 5 的微量離心試管中以1 〇 〇 〇 〇 r p ^離 心2分鐘，捨棄上淸液，沈澱部分以5 6 7 // 1的T E緩 衝液再懸濁。再加上3 0 // 1的1 〇 %月桂硫酸鈉（ SDS)與 3// 1 的 20mg/m£ Proteinase K 溶液充分 混合’培養3 7 °C 1小時。再添加1 〇 %溴化十六烷基三 甲基銨/ 〇 · 7 Μ N a C 1溶液8 0 // 1 ，充分混合後 6 5 °C下培養1 〇分鐘。再加入體積比2 4/1的氯仿一 異戊醇混合物7 0 0 // 1充分攪拌。此溶液以微量離心機 1 2 0 〇 〇 r p m，5分鐘（控制於4 °C下）離心處理後 ’水層部分移至新的微量離心管。於此加入〇 . 6倍量的 異丙醇充分搖動試管使DNA形成沈澱。白色DNA沈澱 以玻璃棒勾取移入放有1 的7 0 %乙醇（冷卻至 一 2 0°C者）之另一微量離心管。 再以1 0 0 0 0 r p m，5分種離心處理，靜靜地將 上淸液除去後再加上1 m£的7 0 %乙醇再離心5分鐘。再 將上淸液除去後沈澱物以1 0 0 // 1的T E緩衝液溶解得 到D N A溶液。此基因組D A N溶液的濃度依照Molecular Cloning, A laboratory manual, 1 989， Eds. Sambrook, J·， Fritsch， E. F·， and Maniatis, T·， Cold Spring harbor Laboratory Press 的 E5, Spectrophntometric Determination of the Amount of DNA或RNA之方法定量。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） -68 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 A7 _______B7__ 五、發明說明（66 ) 使用此基因組DNA中1 Q n g進行P CR ( polymerase chain reaction ) °PCR 爲使用 Taq 聚合酶 (寶酒造公司製，標號R 〇 〇 1 A )。附加於酵素的緩衝 液5 # 1 ’附加於酵素的dNTPmixture4 // 1與流感嗜血菌 等菌的Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列的類似性可由網 路情報（奧克來荷馬大學，肺炎鏈球菌基因設計公開 基 因D N A情報）取得肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12 DNA序列以原先設計的序列表序列號碼：1 5所示 合成核苷酸E以及序列表序列號碼：1 6所示的核苷酸F 作爲探測體，分別加入2 0 0 p m ο 1 ，使最終容量爲 5 0 // 1。 此混合物使用 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 ， 9 5 °C 1分鐘，5 0 2分鐘，7 2 °C 3分鐘進行 5次循環後，再進行9 5 °C 1分鐘，6 0 °C 2分鐘， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7 2 °C 3分鐘2 5次循環。此P C R產物的一部份以 1 · 5 %瓊脂糖凝膠（agarose )中進行電泳，經溴化乙錠 (曰本gene公司製）染色後，以紫外線觀察，確認有 40 Ob p的c DNA被增大。且限制酶B amH I以及 X h ο I切斷處理後，以1 · 5 %瓊脂糖凝膠中進行電泳 經溴化乙錠染色後切出約3 7 0 b p —帶的膠片再以 SuprecOl (寶酒造公司製）純化後，倂入市販的載體（ vector ) p G E X — 4 T — 1 ( Pharmacia 公司製）。具體 而言，載體p GEX— 4T— 1與先前的DNA其莫耳比 成 1 : 3 混合之，T 4 D N A 連接酶（ligase，Invitrogen -69- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 _______B7_ 五、發明說明（67 ) 公司製）中於將D N A倂入於載體中。D N A所倂入的載 體 P G E X — 4 T — 1 於大腸菌以 One Shot Competent Cells ( invitr〇gen公司製）導入基因，植菌於含安匹西林 (Sigma公司製）5 0 #忌/』的乙一培養液（L-Broth， 寶酒造公司製）半固體培養基培養皿中，放置於3 7 °C 1 2小時，長出的菌落以逢機選擇植入同濃度的含安匹西 林的L —培養液2 中，3 7 °C振盪培養8小時，回收菌 體’使用Witherdominiprep ( Promega公司製）並依照所添 加的說明書分離質體，此質體以限制酶B a m Η I / X h ο I分解，切出約3 7 0 b ρ的D Ν Α而確認該 P C R產物已被倂入，對於已確認的群株而言進行所倂入 的D Ν A之鹼基序列分析。對於所插入的D Ν A片段之鹼 基序列分析，使用Applied Biosystems公司製的螢光序列分 析裝置實施。序列樣品的調製方法使用PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit( Applied Biosystems公司製）進行。0 · 52容量的微量試管中加入 9 · 5// 1的反應保存液、4 · 0# 1的0 · 8pmo 1 / # 1 的 T 7 起動引發物（promoter pnmer，GIBC〇 BRL 公 司製）以及6 · 5 // 1的0 · 1 6 // g / // 1的序列用模 型D Ν A混合，1 0 0 “ 1的礦物油添加於上層後， 9 6 t： 3〇秒、5 5 °C 1 5秒以及6 0 °C 4分鐘爲一 次循環，進行P C R增大反應2 5次循環，於4 °C 5分鐘 保溫。反應後加上8 0 // 1的滅菌精製水攪拌，離心分離 後，此水層進行3次的苯酚•氯仿萃取。1 0 0 # 1的水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · 70 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 ϋ emt ·-_，· ϋ ϋ 1 temm iBi I i 1231299 A7 ___B7___ 五、發明說明（68 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 層中加入10//1的3M醋酸鈉（PH5 · 2)以及 3 0 0 // 1的乙醇攪拌後，室溫下進行離心1 4，0 0 0 r p m，1 5分鐘後回收沈澱。沈澱物以7 5 %乙醇沖洗 後，真空下靜置2分鐘使其乾燥.，作爲序列用樣品。序列 樣品溶解於4 // 1含1 0 m Μ的E D T A之甲醯胺中經 9 0 °C，2分鐘變性後於冰中冷卻提供於進行序列步驟。 所得的5個純系中1個序列與使用於P C R的探測體 (probe )的序列有相同性，且其他微生物，例如發現與遮_ 感嗜血桿菌的Ribosomal Protein L7/L12基因序列非常類似 的D N A序列。此構成基因部分的全鹼基序列以及對應的 胺基酸序列係如序列表序列號碼：2 1以及2 2的序列。 此基因片段明顯地爲淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質的基因密碼（code )。 使用如此所構成的淋病奈氏球菌的Ribosomal Protein 17/L12蛋白質表現載體與實施例2所記載的相同方法取得 純化淋病奈氏球菌的G S T融合Ribiosomal Protein L7/L12 蛋白質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 而且依照實施例3所記載的方法取得可產生對應淋病 奈氏球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質之單株抗體的 融合瘤A M G C 1株。依照前述所取得的陽性融合瘤細胞 A M G C 1株的方法，回收單株抗體。 具體而言，使用RPMI 1640培養基（含10 % F C S )進行繼代培養的細胞於2 5 c m 2培養椎形瓶中於 無血淸培養基稀釋至2X105個/2’ 3 · 3X105個 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -71 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 ___ B7__ 五、發明說明（69 ) / 2以及5 X 1 0 5個/ m£程度的全容量5 m£。7 % C〇2 ，3 7 °C下3〜5天進行增値，於可見到細胞增値的錐形 瓶中選擇原來細胞數較少的者，最終稀釋至2 X 1 0 5個/ 2者能於3〜4天內增値至2 X 1 〇6個/ m£，重複以同樣 操作於無血淸培養基培養。再進行細菌培養用9 6洞培養 皿中的純系化過程，選擇增値較快且抗體價値較高的細胞 所選擇的細胞於2 4洞培養皿中增値的以無血淸培養基稀 釋至2 5 c m 2培養椎形瓶中2 X 1 0 5個/ 2的程度而 全體積爲1 〇m£，將此於7% C〇2，3 7°C下培養3〜5 天增値至1 X 1 0 6個/ 後，以7 5 c m 2培養椎形瓶 中同樣地進行增値至1 X 1 0 6個/ m«，再移至1 0 0 大 量培養用的瓶子中。此此瓶中加上1 〇 〇 m£的無血淸培養 基，邊攪拌邊以3 7 °C下培養2天後，再加上無血淸培養 基2 0 〇m£再培養2天。此培養液分爲4支而加1 0 〇m£ 的無血淸培養液，2天培養後分別添加4 0 0 的無血淸 培養液再培養約6天後，回收培養液以1 0 〇 〇 r p m， 1 5分鐘離心取得含作爲目標抗體的培養上淸液，此培養 上淸液添加0 · 1 %迭氮化鹼後4 °C保存所取得的含有抗 體的液體1 0 0 m£以P B S稀釋5倍後以ProtemA柱子（ 5m£容積，Pharmacia公司）吸著，以3倍容積的P B S洗 淨，以p Η 3的檸檬酸緩衝液溶出，回收抗體部分得到可 生產各融合瘤的單株抗體。來自此4株的融合瘤單株抗體 以使用E L I S Α法進行評價。 對於抗體的評價，使用以來自於各種微生物的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I I ϋ ϋ ϋ I I · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -72 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 · ______B7__ 五、發明說明（70 )

Kiboscmai Protein L7/L12蛋白質作爲抗原作用的9 6洞培 »1 ’所製成的單株抗體使其反應後與，作爲2次抗體的 抗老鼠I g G之hosradeishu過氧化物酶標識（Μ B L公司 製’ Code 3 30 )進行反應，最後以酵素反應發色試藥檢測 。對於EL I SA反應，含〇 · 05%氮迭化鹼的PBS 中溶解贩病奈氏球茼、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌的重組 Ribosomal Protein L7/L12 蛋白質，將其稀釋至 1 // g/m£ 濃度的液體1 0 〇 // 1分別注入9 6洞培養皿中以4 °C吸 著1晚。除去上淸液後，添加1 %牛血淸白蛋白溶液（ P B S中）2 0 〇 // 1於室溫下反應1小時後遮蓋。除去 上淸液後以洗淨液（0.02 % Tween20 ，P B S )洗淨，其 上添加自0 · 1至的AMGC1抗體溶液 1 0 0 // 1於室溫下進行2小時反應後，除去上淸液且以 洗淨液洗淨後，加上5 // g / m«的抗老鼠I g G之 hosradeishu過氧化物酶標識（MB L公司製，Code 330)抗 體液1 0 0 // 1於室溫，實施1小時反應，除去上淸液且 洗淨液洗淨後，分別加上1 0 0 // 1的Τ Μ B溶液（KPL 公司）於室溫下進行反應2 0分鐘，發色後添加1 Ν的硫 酸1 0 0 // 1反應停止，以4 5 0 n m的吸光進行測定。 其結果如表6所示，使用來自融合瘤A M G C 1的單 株抗體時’確認此抗體能與淋病奈氏球菌、流感嗜血桿菌 、肺炎鏈球菌的Ribosomal Protein L7/L12蛋白質進行反應 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1231299 A7 _B7_ 五、發明說明（71 ) [表 6]_ (AMGC1抗體與各微生物的Ribosomal Protem L7/L12蛋白質檢測結果） 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) + 流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) + 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)_+_ (+;陽性反應) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -74 - 1231299 A7 B7 五、發明說明（72 ) 於此所取得的A M G C 1抗體對於〇I A或 E L I S A法中的微生物檢測等即所謂的夾心試驗法的微 生物檢測，作爲與各微生物特異性抗Ribosomal Protein L7/L12蛋白質抗體組合而使用的抗體係極爲有用的。 〔產業上可利用性〕 本發明使用對於各種微生物爲同一機能之細胞內分子 之抗體於微生物檢測中，而微生物之特異性或/且爲同一 種中所有血淸型的微生物可精確地檢測出。 作爲如此的抗體使用對應微生物之核糖體蛋白質、 Ribosomal Previn L7/L12抗體，可精確地檢測出流感嗜血 桿菌、肺炎鏈球菌以及淋病奈氏球菌。 又，使用此抗體構成要素的微生物檢測用試藥組合， 使得微生物檢測更能夠廣泛地且高度精確地進行。 又，對於各種微生物同一機能的細胞內分子可作爲抗 原使用，故可製得使用於各種微生物檢測的特異性抗體。 〔關於寄存微生物〕 所寄存的寄存機構 名稱：通商產業省工業技術院生命工學工業技術硏究 所 地址：日本國茨城縣筑波市東1 丁目1 一 3 寄存微生物於此寄存機構之日期：平成1 1年（ 1999) 7 月 28 曰 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -75 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

— I imme ϋ i-i i^i ϋ Βϋ a^i emmi I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 __B7 五、發明說明（73 ) 碼 號 存 寄 之 構 機 存 寄 此 於 存 寄

P B Μ R Ε F 7 ο 8 6 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--------訂---------AW9I. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -76- 1231299 . A7 、 _B7' 五、發明說明（5 )[序列表] SEQUENCE LISTING <11〇>微生物檢測之抗體 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <120> Antibodies for Detecting Microorganisms <130> ASAHI-2 <150〉 JP 10/230204 , <151〉 1998-7-31 <160> 22

<210〉 1 <211〉 369 <212> DNA <213> 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae) <400> 1 atg tea tta act aac gaa caa ate att gaa geg att get tea aaa act 48

Met Ser Leu Thr Asn Glu Gin lie lie Glu Ala lie Ala Ser Lys Thr

------------f------- -訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -77 - 1231299 A7 B7 五、發明說明（ Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala35 40 45 gcg gca gca gaa gaa aaa act gaa ttc gac gtt gta ctt aaa tct gca Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Yal Val Leu Lys Ser.Ala 50 55 60 192 ggt gcg aac aaa gta gca gta att aaa gca gta cgt ggt gca act ggt Gly Ala Asn Lys Val Ala Val lie Lys Ala Y^l Arg Gly Ala Thr Gly 65 70 75 80 240 tta ggc tta aaa gaa get aaa gat tta gtt gaa tct get cca get aac Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn 85 90 95 288

tta aaa gaa ggc gtt tct aaa gaa gaa get gaa gca ctt aag aaa gaa Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu 100 105 HO 336 -----------1------- — 訂---------(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 tta gaa gaa gcg ggt gca gaa gta gaa gtt aaa Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys 115 120

<210〉 2 <211〉 123 <212〉 PRT <213〉 流感嗜血桿菌（Haemophilus influezae) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 369 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7() <400> 2

Met Ser Leu Thr Asn Glu Gin lie He Glu Ala lie Ala Ser Lys Thr 15 10 15

Yal Thr Glu lie Val Glu Leu lie Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30

Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala 50 55 60

Gly Ala Asn Lys Val Ala Val lie Lys Ala Yal Arg Gly Ala Thr Gly 65 70 75 80

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn 85 90 95

Leu Lys Glu Gly Yal Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu 100 105 110

Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Yal Glu Val Lys 115 120

<210> 3 〈211〉 375 <212> DNA <213〉幽門螺桿菌（Helicobacter pylori) ‘ <400> 3 atg gca att tea aaa gaa gaa gtg tta gag tat att ggt tea ttg age 48

Met Ala lie Ser Lys Glu Glu Val Leu Glu Tyr lie Gly Ser Leu Ser 15 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------11 -----—訂———— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 B7 五、發明說明（叫） gtt tta gag ctt tct gaa ttg gtt aaa atg ttt gag gaa aaa ttt ggc Val Leu Glu Leu Ser Glu Leu Val Lys Met Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30 96 gtg age geg act cca aeg gtc gta geg ggt geg get gta get ggcggt Val Ser Ala Thr Pro Thr Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly 35 40 45 144 gca geg get gag age gaa gaa aaa acc gaa ttt aat gtg att ttg gee Ala Ala Ala Glu Ser Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asn Val lie Leu Ala 50 55 60 192 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) gat age ggt get gaa aaa att aag gtg att aaa gtg gtt cgt gaa ate Asp Ser Gly Ala Glu Lys lie Lys Val lie Lys Val Val Arg Glu lie 65 70 75 80 240 act gga ctt ggc ctg aaa gaa get aaa gac get acc gaa aaa acc cct Thr Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ala Thr Glu Lys Thr Pro 85 90 95 288 -----1---訂-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cat gtg ctt aaa gag ggc gtg aat aaa gaa gaa get gaa acc ate aag His Val Leu Lys Glu Gly Val Asn Lys Glu Glu Ala Glu Thr lie Lys 100 105 no aag aaa ctt gaa gaa gta ggc get aag gtt gaa gtc aag Lys Lys Leu Glu Glu Val Gly Ala Lys Val Glu Vaf Lys 115 120 125 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 336 375 1231299 A7B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（Μ ) <210〉 4 <211〉 125 <212> PRT <213〉幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) <400> 4 Met Ala lie Ser Lys Glu Glu Val Leu Glu Tyr lie Gly Ser Leu Ser 15 10 15 Yal Leu Glu Leu Ser Glu Leu Yal Lys Met Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30 Val Ser Ala Thr Pro Thr Val Yal Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Glu Ser Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asn Val lie Leu Ala 50 55 60 Asp Ser Gly Ala Glu Lys lie Lys Yal lie Lys Yal Val Arg Glu lie 65 70 75 80 Thr Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ala Thr Glu Lys Thr Pro 85 90 95 His Val Leu Lys Glu Gly Val Asn Lys Glu Glu Ala Glu Thr lie Lys 100 105 110 Lys Lys Leu Glu Glu Val Gly Ala Lys Val Glu Val Lys 115 120 125 <210> 5 <211> 366 <212> DNA * <213〉肺炎鏈球菌（strepf〇coccus pneum0niae) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i 訂---------隹 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1231299 A7 B7 五、發明說明（八） <400〉 5 atg gca ttg aac att gaa aac att att get gaa att aaa gaa get tea Met Ala Leu Asn lie Glu Asn lie lie Ala Glu lie Lys Glu Ala Ser 1 5 10 15 48 ate ett gaa ttg aac gac ett gta aaa get ate gaa gaa gaa ttt ggt lie Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala lie Glu Glu Glu Phe Gly 20 25 30 96 gta act gca get get cct gta get gtt get gca get gat gca get gat Val Thr Ala Ala Ala Pro Yal Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp 35 40 45 144 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -i get ggt get get aaa gat tea ttc gac gtt gaa ttg aca tet gca ggc Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly 50 55 60 192 gac aaa aaa gtt ggc gtt ate aaa gtt gta cgt gaa ate act ggt ett Asp Lys Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Glu He Thr Gly Leu 65 70 75 80 240 訂---------MW. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggt ett aaa gaa get aaa gaa ett gtt gac ggt gca cca gca ett gtt Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Yal 85 90 95 aaa gaa ggc gtt gca act gca gaa get gaa gaa ate aaa get aaa ttg Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu lie Lys Ala Lys Leu !〇〇 105 110 ^ 336 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（) gaa gaa get gga get tea gtt act ett aaa 366

Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys 115 120

<210〉 6 <211〉 122 <212> PRT <213〉肺炎鏈球菌(Streptococcus pneupioniae) <400〉 6

Met Ala Leu Asn lie Glu Asn lie lie Ala Glu lie Lys Glu Ala Ser 15 10 15 lie Leu Glu Leu Asn Asp Leu Yal Lys Ala lie Glu Glu Glu Phe Gly 20 25 30

Yal Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Yal Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp 35 40 45

Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly 50 55 60

Asp Lys Lys Yal Gly Val lie Lys Yal Val Arg Glu lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Fro Ala Leu Val 85 90 95.

Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu He Lys Ala Lys Leu 100 105 110

Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys 115 120 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-ϋ ϋ ϋ I 一SJ ϋ ϋ ϋ I ϋ n I 1231299 A7 B7 五、發明說明（w) <210> 7 <211〉 369 <212> DNA<213> 淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) <4〇〇> 7 atg get att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tet ttg acc Met Ala lie Thr Lys Glu Asp lie Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 1 5 10 15 48 gta atg gaa ttg aat gac ctg gtt aaa get ttt gaa gaa aaa ttc ggt Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30 96 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i gtt tet get get get gtt gca gtt gca ggt cct get ggt gee ggt get Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45 144 gee gat get gaa gaa aaa acc gaa ttt gat gtc gtt ttg get tet gee Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala 50 55 60 192 訂---------MW, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggc gat caa aaa gtc ggc gtg att aaa gtt gtc cgt gca att act ggt Gly Asp Gin Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Ala lie Thr Gly 65 7〇 75 80 ttg ggt ctg aaa gaa get aaa gac ate gtt gac ggc gca cct aaa acc Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Prolys Thr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 240 1231299 A7 B7 五、發明說明（w) 85 90 95 att aaa gag ggt gtt tct aaa get gaa gcc gaa gac ate caa aaa caa 336 lie Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp lie Gin Lys Gin 100 105 no ctg gaa gca gca ggc get aaa gtc gaa ate aaa 369

Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120

<210〉 8 <211> 123 <212〉 PRT /O 1 0\ 淋病奈氏球菌（Neisseria gonorrhoeae) <400> 8

Met Ala lie Thr Lys Glu Asp lie Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 15 l〇 15

Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30

Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45

Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala 50 55 60

Gly Asp Gin Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Ala lie Thr Gly 65 70 75 80

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp lie Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i 訂---------MW. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 A7 B7 五、發明說明（Η ) lie Lys Glu Gly Yal Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp lie Gin Lys Gin 100 105 110 Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120 <210〉 9 <211〉 369 <212> DNA<213> 腦膜炎球菌（Neisseria meningitidis) <400〉 9 atg get att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tct ttg acc Met Ala lie Thr Lys Glu Asp lie Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 1 5 10 15 48 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) gta atg gaa ttg aac gac ttg gtt aaa get ttt gaa gaa aaa ttc ggt Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Yal Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30 96 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gtt tet get get get gtt gca gtt gca ggt cct get ggt gcc ggt get Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45 gcc gat get gaa gaa aaa acc gaa ttt gat gtc gtt ttg get tet gcc Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala 50 55 60 ^ ggt gat caa aaa gtc ggc gtg att aaa gtt gtc cgt gca att acc ggt 144 192 240 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） 1231299 65 A7 B7 五、發明說明（％ )

Gly Asp Gin Lys Yal Gly Val Ile Lys Val Yal Arg Ala Ile Thr Gly 70 75 80 ttg ggt ctg aaa gaa get aaa gac ate gtt gac ggt gca cct aaa acc Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Ile Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr 85 ΟΛ 95 att aaa gag ggt gtt tet aaa get gaa gee gaa gac ate caa aaa caa Ile Lys Glu Gly Yal Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp Ile Gin Lys Gin 100 105 no 336 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ctg gaa gaa gee ggc get aaa gtc gaa ate aaa Leu Glu Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120 369 <210〉 10 <211〉 123 <212〉 PRT<213> 腦膜炎球菌（Neisseria meningitidis) * · «ϋ tmmf ^^1 ammumm «Bn w «ϋ ϋ ·ϋ i^i I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 10

Met Ala Ile Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 1 5 10 15

Yal Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30

Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45

Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Yal Val Leu Ala ^Ser Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 1231299 A7 :B7 五、發明説明（κ) 50 55 60

Gly Asp Gin Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Ala lie Thr Gly 65 70 75 80 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp He Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr 85 90 95

lie Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp lie Gin Lys Gin 100 105 HO

Leu Glu Glu Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120

<210〉 11 <211> 31 <212> DNA <213〉合成序列(artificial sequence) <220〉 〈223〉來自流感嗜血桿菌（Haemophi山s influezae)的 Ribosomal Protein L7/L12 κ基因之取得所使用的PCR的引發物DNA。 <400> 11 gtaaggatcc atgtcattaa ctaacgaaca a 31 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

<210〉 12 <211〉 34 <212〉 DNA <213〉合成序列（artificial sequence) 〈220〉 ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1231299 A7 B7 五、發明説明（W ) <223〉來自流感嗜血桿菌（Haem〇Phi丨us 丨uezae)的 Rlb〇somal Protein L7/L12 .基因之取得所使用的PCR的引發物DNA。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <400> 12 agcatctcga gatttaactt ctacttctgc accc 34

<210〉 13 <211〉 33 <212> DNA <213〉合成序列(artificial sequence) <220〉 <223〉來自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的 Ribosomal Protein L7/L12 基 因之取得所使用的PCR的引發物DNA。 <400> 13 ggaaggatcc atggcattga acattgaaaa cat 33

<210> 14 <211〉 33 <212> DNA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <213> artificial sequence <220> <223〉來自肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)的 Ribosomal Protein L7/L12 基 因之取得所使用的PCR的引發物DNA。 <400> 14 ► 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1231299 A7 .B7 五、發明説明（巧） tactctcgag tttaagagta actgaagctc cag 33 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

<210> 15 <211> 31 <212> DNA 〈213> 合成序列(artificial sequence) <220> <223〉來自淋病奈氏桿菌(Nisseriagonorrhoeae)的 Ribosomal Protein L7/L12 基因 之取得所使用的PCR的引發物DNA。 <400> 15 gtaaggatcc atggctatta ctaaagaaga c 31

<210> 16 <211> 34 <212> DNA <213〉合成序列(artificial sequence) <220> <223> 來自淋病奈氏桿菌(Nisseriagonorrhoeae)的 Ribosomal Protein L7/L12 基因 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 f 之取得所使用的PCR的引發物DNA。 <400> 16 agcatctcga gatttgattt cgactttagc gcct 34 <210〉 17 * <211〉 369 <212〉 DNA _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1231299 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（w)<213> 流感嗜血桿菌(HaemophHus influenzae)<400> 17 atg tea tta act aac gaa caa ate att gaa geg att get tea aaa act Met Ser Leu Thr Asn Glu Gin lie lie Glu Ala lie Ala Ser Lys Thr 1 5 10 15 gta act gaa ate gtt gaa tta ate gca geg atg gaa gaa aaa ttc ggt Yal Thr Glu lie Yal Glu Leu lie Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 3〇 gtt tea gca geg gca gca gta gca gca get cca gca gca ggc ggt gca Yal Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala 35 4〇 45 geg gca gca gaa gaa aaa act gaa ttc gac gtt gta ett aaa tet gca Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Yal Val Leu Lys Ser Ala 50 55 6〇 ggt geg aac aaa gta gca gta att aaa gca gta cgt ggt gca act ggt Gly Ala Asn Lys Val Ala Yal He Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly 65 70 75 . «π tta ggc tta aaa gaa gct aaa gat tta gtt gaa tet get cca get Leu G1y Leu LyS Glu Ala Lys Asp Uu Val Giu w m … 85 90 · 95 aac

Asn

Ua aaa gaa ggC gtt tct磁卿卿似咖咖cu咐•咖卿 本紙張尺度細+ S @家標準(CNS)A4規格(210 χ 297公釐) 48 96 144 192 240 336 ------------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·-------- -91 - 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（外）

Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu 100 105 110 tta gaa gaa gcg ggt gca gaa gta gaa gtt aaa 369

Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys 115 120

<210> 18 <211> 123 <212> PRT 〈213> 流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae) <400> 18

Met Ser Leu Thr Asn Glu Gin lie lie Glu Ala lie Ala Ser Lys Thr 1 5 10 15

Val Thr Glu lie Val Glu Leu lie Ala Ala Met Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30

Val Ser Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala 35 40 45

Ala Ala Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Lys Ser Ala 50 55 60

Gly Ala Asn Lys Val Ala Val lie Lys Ala Val Arg Gly Ala Thr Gly 65 70 75 80

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Val Glu Ser Ala Pro Ala Asn 85 90 95

Leu Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Glu Ala Glu Ala Leu Lys Lys Glu 100 105 110

Leu Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Glu Val Lys _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-I 訂---------ΜΜΨ. 1231299 A7 • ’ B7 五、發明說明（） 115 120 <210> 19 <211〉 366 <212〉 DNA<213〉肺炎鏈球菌（strept〇coccus pneunl〇niae) <400> 19 atg gca ttg aac att gaa aac att att get gaa att aaa gaa get tea Met Ala Leu Asn lie Glu Asn lie lie Ala Glu lie Lys Glu Ala Ser 15 10 15 48 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-I ate ett gaa ttg aac gac ett gta aaa get ate gaa gaa gaa ttt ggt lie Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala lie Glu Glu Glu Phe Gly 20 25 30 96 gta act gca get get cct gta get gtt get gca get gat gca get gat Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp 35 40 45 144 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 get ggt get get aaa gat tea ttc gac gtt gaa ttg aca tet gca Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala 5〇 55 6〇 邮刪咖gtt ggc gtt ate aaa gu…邮卿…μ邮 Asp Lys Lys Val Gly Yal ne Lys Val Val Arg Glu'lie Thr Gly 65 70 75 ggc

Gly ett

Leu

192 240 1231299 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（w) ggt ctt aaa gaa get aaa gaa ett gtt gac ggt gca cca gca ett gtt 288

Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Val Asp Gly Ala Pro Ala Leu Val 85 90 95 aaa gaa ggc gtt gca act gca gaa get gaa gaa ate aaa get aaa.ttg 336

Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu lie Lys Ala Lys Leu 100 105 110 gaa gaa get gga get tea gtt act ett aaa 366

Glu Glu Ala Gly Ala Ser Val Thr Leu Lys 115 120

<210〉 20 <211〉 122 <212> PRT <213〉肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) <400〉 20

Met Ala Leu Asn lie Glu Asn lie lie Ala Glu lie Lys Glu Ala Ser 15 10 15 lie Leu Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala lie Glu Glu Glu Phe Gly 20 25 . 30

Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp 35 40 45

Ala Gly Ala Ala Lys Asp Ser Phe Asp Val Glu Leu Thr Ser Ala Gly 50 55 60

Asp Lys Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Glu lie Thr Gly Leu 65 70 75 ^ 80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------1------- — 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1231299 A7 B7 五、發明說明㈠2 )

Gly Leu Lys Glu Ala Lys Glu Leu Yal Asp Gly Ala Pro Ala Leu Val 85 90 95

Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Glu Ala Glu Glu lie Lys Ala Lys Leu 100 105 no

Glu Glu Ala Gly Ala Ser Yal Thr Leu Lys 115 120

<210> 21 <211> 369 <212> DNA <213> 淋病奈氏球菌（Neisseria gonorrhoeae) <400> 21 atg get att act aaa gaa gac att ttg gaa gca gtt ggt tet ttg acc 48

Met Ala lie Thr Lys Glu Asp lie Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 1 5 10 15 gte atg gaa ttg aat gac ctg gtt asa get ttt gaa gaa asa ttc ggt 96

Val Met Glu Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30 gtt tet get get get gtt gca gtt gca ggt cct get ggt gcc ggt get 144

Val Ser Ala Ala Ala Val Ala Yal Ala Gly Pro Ala Gly Ala Gly Ala 35 40 45 gcc gat get gaa gaa aaa acc gaa ttt gat gtc gtt ttg get tet gcc 192

Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Yal Val Leu Ala Ser Ala 5〇 55 60 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1231299 A7 B7 五、發明說明⑼） ggc gat caa aaa gtc ggc gtg att aaa gtt gtc cgt gca att act ggt 240

Gly Asp Gin Lys Val Gly Val lie Lys Yal Val Arg Ala lie Thr Gly 65 70 75 80 ttg ggt ctg aaa gaa get aaa gac ate gtt gac ggc gca cct aaa acc 288

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp lie Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr 85 90 95 att aaa gag ggt gtt tet aaa get gaa gcc gaa gac ate caa aaa caa 336 lie Lys Glu Gly Yal Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp lie Gin Lys Gin 100 105 no ctg gaa gca gca ggc get aaa gtc gaa ate aaa 369

Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120

<210〉 22 <211> 123 <212> PRT 〈213> 淋病奈氏球菌（Neisseria gonorrhoeae) <400> 22

Met Ala lie Thr Lys Glu Asp lie Leu Glu Ala Val Gly Ser Leu Thr 1 5 l〇 15

Yal Met Glu Leu Asn Asp Leu Yal Lys Ala Phe Glu Glu Lys Phe Gly 20 25 30

Yal Ser Ala Ala Ala Val Ala Val Ala Gly Pro Ala Gly Ala TJly Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - I ϋ ϋ I I i-i JM1 a I ϋ I t] 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Φ1299 A7 B7 五、發明說明（#) 35 40 45

Ala Asp Ala Glu Glu Lys Thr Glu Phe Asp Val Val Leu Ala Ser Ala 50 55 60

Gly Asp Gin Lys Val Gly Val lie Lys Val Val Arg Ala lie Thr Gly 65 70 75 80

Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp lie Val Asp Gly Ala Pro Lys Thr 85 90 95 lie Lys Glu Gly Val Ser Lys Ala Glu Ala Glu Asp lie Gin Lys Gin 100 105 110

Leu Glu Ala Ala Gly Ala Lys Val Glu lie Lys 115 120 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）

Claims (1)

12312_ 93. 9. 22 補充 公告本 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 第88 1 1 5075號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國93年9月22日修正 1 .一種可特異性地檢測出流感嗜血桿菌( 丹)之抗體，其爲具有下述特徵者； (a )來自流感嗜血稈菌的對於具序列號碼2所示胺基酸之 核糖體蛋白質L7/L12可進行特異性反應； (b)至少不會與來自腦膜炎球菌(Neisseria mentingitide s )、嗜乳糖奈瑟氏菌（lactamica ) 、占膜奈瑟菌 (Neisseria mucosa )、乾燥球菌(Neisseria sicca )、 Branhame lla catarrharis 、淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae )、大腸桿菌(Escheria coli )、肺炎桿菌( 的核糖體蛋白質L7/L12進行反應 ;及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C)可辨識作爲表位（epitope)之序列號碼2所示胺基酸 序列中胺基酸數爲5至30的部分胺基酸序列，該部分胺基 酸序列至少與來自腦膜炎球菌(Neisseria mentingitides ) 、嗜孚L糖奈瑟氏菌 (Neisseria lactamica )、粘膜奈瑟菌 ( Neisseria mucosa ) 、乾燥球菌(Neisseria sicca ) 、 Branham ell a catarrharis 、淋病奈氏球菌（Neisseria gonorrhoeae ) 、fi§ M ( Escherichia coli ) 肺炎桿菌 (火的核糖體蛋白質 L7/L12之胺基 酸序列所對應部分作比較時，至少1個胺基酸殘基對於各 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1231299 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 菌而言爲相異者。 2 •一種可特異性地檢測出肺炎鏈球菡Γ )之抗體，其爲具有下述特徵者 y (a )來自肺炎鏈球菌的對於具序列號碼6所示胺基酸之核 糖體蛋白質L7/L12可進行特異性反應； (b) 至少不會與來自大腸桿菌(Escherichia coli ) >排泄 Μ Μ Μ ( Enterococcus faecalis )、流感嗜血桿蘭( Haemophilus influenzae )、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae )、淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae )、 嗜乳糖奈瑟氏菌（lactamica )、腦膜炎球菌（ Neisseria mentingitides )、綠騰桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、鏈球菌 B 群（Group B streptococcus)、金 黃色葡萄球菌(Staphylococcus auresu )、釀膿鏈球菌(. Streptococcus pyogenes);及 (c) 可辨識作爲表位（epitope)之序列號碼6所示胺基酸 序列中胺基酸數爲5至3 0的部分胺基酸序列，該部分胺基 酸序列至少與來自大腸桿菌(Escherichia coli )、排泄物 腸球菌 (Enterococcus faecalis )、流感噴血桿菌 ( Haemophilus influenzae ) 、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae )、淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae )、 嗜乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica )、腦膜炎球菌( Neisseria mentingitides )、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )、鏈球菌 B 群(Group B streptococcus)、金 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 、tT —άψ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1231299 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 黃色葡萄球菌(Staphylococcus auresu ) 釀膿鏈球菌( 夕少)的核糖體蛋白質L7/L12之胺基酸 序列所對應部分作比較時，至少1個胺基酸殘基對於各菌 而言爲相異者。 3 · —種可特異性地檢測淋病奈氏球菌(Neisseria 的抗體，其爲具有下述特徵者； (a )來自淋病奈氏球菌的對於具序列號碼8所示胺基酸之 核糖體蛋白質L7/L1 2可進行特異性反應； (b) 至少不會與來自腦膜炎球菌(Neisseria mentingiti de s )、晴乳糖奈瑟氏菌（JVg/wgr/a lactam ica )、粘膜奈瑟菌 (Neisseria mucosa )、乾燥球菌(Neisseria sicca )、卡 他布蘭漢氏球菌（catarrharis )、流感嗜血桿 菌(Haemophilus influenzae )、大腸桿菌(Escherichia co li )、炎桿菌（ΛΓ leb si ella pneumoniae^) •，及 (c) 可辨識作爲表位（epitope)之序列號碼8所示胺基酸 序列中胺基酸數爲5至30的部分胺基酸序列，該部分胺基 酸序列至少與來自腦膜炎球菌(Neisseria mentingitide s ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、嗜孚L糖奈瑟氏菌 （Neisseria lactami ca ) 、粘膜奈瑟菌 ( Neisseria mucosa )、乾燥球菌（Neisseria sicca )、卡他 布蘭漢氏球菌（万catarrharis )、流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae )、大腸桿菌(Escherichia coli )、炎桿菌（”⑽7·以）的核糖體蛋白質 L7/L12之胺基酸序列所對應部分作比較時，至少1個胺基 酸殘基對於各菌而言爲相異者。 本纸張尺度適用中國國家操準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -3- 1231299 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 ·如申請專利範圍第3項之抗體，其中該（C )的部 分胺基酸序列爲含有序列號碼8的胺基酸序列中第1 1 5號 之丙胺酸者。 5 · —種可特異性地檢測出流感嗜血桿菌之方法’其特 徵爲使用如申請專利範圍第1項的抗體。 6 . —種可特異性地檢測出肺炎鏈球_菌之方法，其特 徵爲使用如申請專利範圍第2項的抗體。 7 · —種可特異性地檢測出淋病奈氏球菌之方法，其 特徵爲使用如申請專利範圍第3或4項的抗體。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4-