TW589320B - Apoptosis inducer - Google Patents
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（，） 發明所屬之技術領域 本發明偽關於可利用作為醫藥品之細胞自滅誘發劑、 制癌劑及致癌預防劑〇又，本發明為提供於細胞自滅機 構之解明、細胞自滅誘發阻礙劑舖選當中有用的細胞自 滅誘發方法。更且提供依據本發明所純化之含岩藻糖硫 酸多S唐及其分解物，並提供含岩藻糖硫酸之多_分解物 之製造，和構造研究中有用的含岩藻糖硫酸多醏分解酵 素。 先前之技術 近年，關於細胞組織之死亡，僳注目於所謂的細胞自 滅（apoptosis，亦稱為脱噬作用；自我暴死或細胞自滅）。 此細胞自滅，與病理性的細胞死亡不同，乃被認為係 由細胞本身之基因於最初所被重組入的死亡。即任何的 外部或内部的主要原因乃成為板機使策劃（program)細胞 自滅之基因被活化，且使用此基因將策劃死基因之蛋白 質被生物合成，並經由生成之策割死蛋白質將細胞本身 分解，而死亡。 此種細胞自滅若可令在所欲的組織、細胞中表現，則 可使不要的或病原的細胞以自然型態由生物中排除，為 極具深遠意義。 發明所欲解決之課題 本發明之目的為開發具有誘發細胞自滅作用之安全性 高之化合物，且提供含有該化合物之細胞自滅誘發劑、 制癌劑、致癌預防劑、及使用該化合物作為有效成分之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 A7 B7 五、發明説明（> ) 細胞自滅誘發方法。又提供在本發明化合物之分解物製 造上之有用的該化合物分解酵素。 解決課題之手段 若概述本發明，則本發明之第1發明為關於細胞自滅 誘發劑，其特徴為含有含岩藻糖硫酸多賭和/或其分解物。 本發明之第2發明為關於細胞自滅誘發方法，其待激 為使用含岩藻糖硫酸多醏和/或其分解物作為有效成分。 本發明之第3發明為關於制癌劑，其待擞為含有本發 明第5或第6發明之含岩藻糖硫酸多醏和/或其分解物。 本發明之第4發明為關於致癌預防劑，其特激為含有 含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物。~ 本發明之第5發明僳關於具有下逑理化性質之含岩藻 糖硫酸多醣。 (1) 構成糖；含有糖醛酸。 (2) 經由産黃菌屬（FlavobacteriuB)sp.SA-fl082(CCRC 910069)生産之岩藻依聚糖（fucoidan)分解酵素而低分 子化，且生成至少由下逑式（I)、（II)、（III)所示化合 物所選出之一種以上之化合物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 準 標 家 國 一國 中 用 適 度 一尺 I張 紙 一本 ¾ 一釐 公 589320 A7 B7 五、發明説明（
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ... 1T· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
'5—, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（4
o=s=o I OH 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 言 f 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 本發明之第6發明傺關於具有下述理化性質之含岩藻 糖硫酸多醣。 (1) 構成糖：實質上不含有糖醛酸。 (2) 實質上無法經由産黃菌颶（Flavobacterium)sp. SA-Q〇82(CCRC 910069)生産之岩藻依聚糖分解酵素低分 子化。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 糖混處 糖混處 糖明 _ 糖混之集 糖 藻醏劑 藻醣脂 藻發多。藻醏力採 藻 岩多藥 岩多樹 岩 5 用程岩多能並 岩 含酸之 含酸換 含第使工含酸糖理 含 之硫力 之硫交 之明質之之硫多處 之 明糖能 明糖子 明發物去明糖酸物 明 發藻集 發藻離 發本性除發藻硫生 發 5 岩凝 5 岩陰 5 造色以 6 岩糖微 6 第含酷 第含以 第製著予第含藻之 第 明將多 明將， 明在之質明將岩素 明 發含性 發含下 發含存物發含含酵 發 本包酸 本包在 本包共之本包之解 本· 於為有 C 於為存。於為將基於為酸分 於 7 關激具程關徴合程關徴，換關徴醛該 關-為特以工為特混工為特時交為特糖有 為 明其，之明其之之明其糖子明其含具 明 發，下物發，子糖發，多離發，解以 7 法在澱 8 法離多 9 法酸陰10法分者程11 第製存沈第製陽的第製硫有第製有或工第 之之類去之之價目之之糖具之之具，之之 明糖鹽除明醣 2 集明 _ 藻或明醣以素醣明 發多於並發多於採發多岩質發多，酵多發 本酸物，本酸物並本酸含物本酸物解的本 硫合理 硫合理 硫之性 硫合分目 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（& ) 硫酸多醣之製法，其特徴為包含將含岩藻糖硫酸多醏混 合物於鹽類存在下，以具有酸性多醣凝集能力之藥劑使 目的多糖沈澱之工程。 .本發明之第1 2發明為關於本發明第6發明之含岩藻糖 硫酸多醏之製法，其持徴為包含將含岩藻糖硫酸多釀混 合物於2價陽離子之混合存在下，以陰離子交換樹脂處 理並採集目的多醏之工程。 本發明之第13發明為關於本發明第6發明之含岩藻糖 硫酸多醏之製法，其特激為包含在製造本發明第6發明 之含岩藻糖硫酸多醏時，將共存之¥色物質使用多醣性 物質或具有陰離子交換基之物質予以除去、之工程。 本發明之第14發明為關於含岩藻糖硫酸多醏混合物之 製法，其特徽為由海藻萃取本發明第7、8、10、11或12 發明中所使用之含岩藻糖硫酸多醏混合物時，使醋酸離 子與鈣離子共存。 本發明之第15發明為關於具有下述理化性質為其特徴 之末端（end)型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素。 (i)作用：對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣 作用，且令該含岩藻糖硫酸多醏低分子化，。 (a) 構成糖：實質上不含有糖醛酸。 (b) 實質上無法經由産黃菌颶（Flavobacteriuia)sp. SA-0Q82(CCRC 910069)生産之岩藻依聚糖分解酵素低 分子化。 對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醏無作用。 本紙張尺度適用中圏國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589320 A7 B7 五、發明説.明（？） (c )構成糖\含有糖醛酸。 # (d)經由産黃菌颶（Flav*〇bacteriuia)sp.SA-0082(CCRC 910069)生産之岩藻依聚糖分解酵素低分子化，且生 成至少由下述式（I)、 （II)、 （III)所示化合物所選出 之一種以上之化合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ·
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£01 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（$ ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
-10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（9 ) (ii) 最適PH:本酵素之最適pH為在7〜8附近。 (iii) 最適溫度：本酵素之最適溫度為在30-35 °C附近。 本發明之第16發明為關於含有鈣源與本發明第15發明 之末端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素之酵素組成的。 本發明之第1 7發明為關於本發明第15發明之末端型含 岩藻糖硫酸多醣分解酵素之製法，其待歡為將具有本發 明第15發明末端型含岩藻糖硫酸多_分解酵素生産能力 之互生單胞菌屬細胞予以培養，並由其培養物採集該酵 素。 本發明之第18發明為關於含岩藻糖硫酸多醏之低分子 化物，其特徴為令本發明第15發明之末端型含岩藻糖硫 酸多醏分解酵素作用於本發明第6發明之含岩藻糖硫酸 多醣所取得者。 本發明者等人成功地取得各種經純化之含岩藻糖硫酸 多醣和其分解物，且其次撿討其生物活性，並發現此等 物質令癌細胞誘發細胞自滅且顯示出強的制癌作用。又 發現含岩藻糖硫酸多醏和/或其分解物顯示出強的致癌 抑制作用。更且將本發明分解物諝製上有用之含岩藻糖 硫酸多醏分解酵素成功地單離，因而完成本發明。 圖面之簡單說明 第1圖示出含岩藻糖硫酸多醣之沈澱形成率。 第2圖示出依使用Sephacryl S- 5 0 0之凝膠過濾法測 定之含岩藻糖硫酸多糖-U之分子量分布。 第3圖示出含岩藻糖硫酸多糖-U之IR光譜。 -11- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 A7 B7 五、發明説明（β ) 第4圖示出含岩藻糖硫酸多_ -ϋ之1 Η-N MR光譜。 第5圖示出糖化合物（a)之吡啶基- (2)-胺基化糖化合 物（PA-a)以L-柱分離時之溶出圖式。 第6圖示出糖化合物（b)之吡啶基- (2)-胺基化耱化合 物（卩4-13)以1^柱分離時之溶出圖式。 第7圖示出糖化合物（c )之吡啶基-(2 )-胺基化糖化β合 物（PA-c)以L-柱分離時之溶出圖式。 第8圖示出糖化合物（a )之依質量分析（負測定）所得 之結果。 f 第9圖示出糖化合物（b)之依質量>分析（負測定）所得 之結果。 、 第10圖示出糖化合物（C)之依質量分析（負測定）所得 之結果。 第11圖示出糖化合物（a>之依質量-質量分析（負測定） ► 所得之結果。 第12圖示出糖化合物（b)之依質量-質量分析（負测定） 所得之結果。 第13圖示出糖化合物（c)之依質量-質量分析（負測定） 所得之結果。 ， 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第14圖示出糖化合物（a)之1 H-NMR光譜。 第15圖示出糖化合物（b)之1 H-NMR光譜。 第16圖示出糖化合物（c)之1 H-NMR光譜。 第17圖示出依使用Sephacryl S-500之凝膠過濾法測 定之含岩藻糖硫酸多醣-F之分子量分布。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ο X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（"） 第18圖示出含岩藻糖硫酸多酷-F之IR光譜。 第19圖示出含岩藻糖硫酸多醣-F之1 H-HMR光譜。 第20圖示出依本發明所得之末端型含岩藻糖硫酸 多_分解酵素之PH與相對活性之關偽圖。 第21圖示出依本發明所得之末端型含岩藻糖硫酸多醏 分解酵素之溫度與相對活性之關俗圖。 第22圖示出依使用Cellulofine GCL-300之凝膠過濾 法所測定之含岩藻糖硫酸多醣-F，於經本發明所得之末 端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素分解前後之分子量分布。 第2 3圖示出依本發明所得之末端型含岩藻糖硫酸分解 酵素之反應液中之鈣離子濃度與相對活性之關僳圖。 第24圖示出依實施例19-(6)中使用Cellulofine GCL-3QG之凝膠過濾法所測定之含岩藻糖硫酸多酷-F，於經 本發明所得之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素予以分 解之物質之分子量分布。 第25圖示出含岩藻糖硫酸多醏-F,於經本發明所得之 末端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素予以分解之物質之IR 光譜。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第2 6圖示出含岩藻糖硫酸多_ -F,於經本發明所得之 末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素予以分解之物質之 1 H-NMR光譜。 。 第27圖示出於HL-60細胞培養液中令實施例1、15及18 所得之含岩藻糖硫酸多醣以lfflg/inl添加時之培養時間與 培養液中之生細胞數之關偽。 -1 3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（-) 第2 8圖示出於MOLT-3細胞培養液中添加實施例1所得 之含岩藻糖硫酸多醏、實施例12所得之含岩藻糖硫酸多 醏-F,實施例15及17所得之含岩藻糖硫酸多醸、及葡聚 糖硫酸時之培養時間與培養液中之生細胞數之關係。 第29圖示出於HCT 116細胞培養液中添加實施例1所 得之含岩藻糖硫酸多醏樣品、實施例1所得之含岩藻糖 硫酸多醣混合物、實施例12所得之含岩藻糖硫酸多醏-U 及含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3及F-Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫酸多醏、及肝素及葡 聚糖硫酸時之培養時間與培養液中之> 生細胞數之關僳。 第30圖示出於HCT 116細胞培養液中'將實、施例1所得 之含岩藻糖硫酸多醏樣品以各種濃度添加時之培養時間 與培養液中之生細胞數之關傺。 第3 1示出於AGS細胞培養液中將實施例1所得之含岩 藻糖硫酸多醸樣品以各種濃度添加時之培養時間與培養 液中之生細胞數之關僳。 第32圖示出於SW 480細胞培養液中將實施例1所得之 含岩藻糖硫酸多醏樣品以各種濃度添加時之培養時間與 培養液中之生細胞數之關像。 ， 第33圖示出於WiDr細胞培養液中將實施例1所得之含 岩藻糖硫酸多醏混合物、實施例12所得之含岩藻糖硫酸 多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4及實施例15所得之含岩藻糖硫 酸多醏添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關俗。 第3 4圖示出於W i D r細胞培養液中將實施例1所得之 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（〇 ) 含岩藻糖硫酸多糖樣品以予以各種濃度添加時之培養時 間與培養液中之生細胞數之關僳。 發明之實施形態 以下，具體說明本發明。 本發明中所使用之含岩藻糖硫酸多醏並無特別限定， 例如可使用來自檜華叉之物質、來自高果美（GAG0ME)海 帶之物質、來自真海帶之物質、來自裙帶菜之物質以外 ，其他全部來自褐藻植物之物質亦可使用。又，已知於 海參體壁亦具有含岩藻糖硫酸多醣，故於本發明中亦使 用來自海參之含岩藻糖硫酸多醏。又於本發明中亦可使 用含岩藻糖硫酸多醣之分解物。含岩藻糖硫酸多醏之分 解方法可列舉以酸處理等之化學性分解方法、超音波處 理等之物理性分解方法、或酵素分解方法等。 本發明者等人發現將如上述各種含岩藻糖硫酸多醣和/ 或其分解物添加至癌細胞之培養液時，於添加後1日至 數日中引起細胞自滅。又，亦確認對正常細胞不顯示出 毒性。 於本發明中，所謂之含岩藻糖硫酸多醣，為分子中含 岩藻糖硫酸之多糖，並無特別限定，例如為褐藻植物、 海參等中所含有者〔左右田德郎監修、江上不二夫编集、 共立出販股份有限公司、昭和30年12月15日發刊、多醏 類化學、第319頁、第321頁〕。尚來自褐藻植物之含岩 藻糖硫酸多糖通稱為岩藻依聚糖、岩藻多醏、藻聚糖， 且已知數個分子種類但其多總稱地稱為岩藻依犖糖。例 -1 5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（K ) 如，已報導市售SIGMA公司製之岩藻依聚糖可分成13種 物質之分子種類〔Carbohydrate research、第255卷、 第213〜2 2 4頁（ 1 9 9 4 )〕，其中有以岩藻糖作為主成分 之一群，與含數％糖醛酸之構成糖中多含有岩藻糖和甘 露糖之一群之分子種類。對於其生物活性中之巨噬細胞 活性增強、癌轉移抑制、抗凝血等之各種情況已被報導 ，但由於在含岩藻糖硫酸多醣中具有分子種類故為了調 査活性本身為在何種分子種類，乃必霈將含岩藻糖硫酸 多醣予以分離精製並調査。於含岩藻糖硫酸多醣中，有 實質上不含糖醛酸之構成糖之主成芬為岩藻糖者，及含 數％糖醛酸之構成糖中含有岩藻糖和甘露糖等者〇以下
V ，於本説明書中實質上不含糖醛酸者記為含岩藻糖硫酸 多糖-F，含有糖醛酸之含岩藻糖硫酸多醏者記為含岩藻 糖硫酸多酷-U,而兩者之混合物記載為含岩藻糖硫酸多 ► 醏混合物。 迄今已知之分離含岩藻糖硫酸多_ -F和含岩藻糖硫酸 多醏-ϋ之方法為依分子量分级和陰離子交換樹脂予以分 離，由於其分離不夠充分故難以大量調製，以作為藥品 和機能性食品。 _ 又，已知由含岩藻糖硫酸多醣將著色性物質完全除去 乃為困難，於市售之岩藻依聚糖等中亦含有著色性物質 。通常此著色性物質為聚苯酚聚合而成之物質，以極強 之反應性阻礙各種酵素反應並阻礙細胞生長，又，例如 • \ 對接觸之樹脂和樹脂性容器等不可逆地吸附。因此為了 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 589320 A7 ____ B7 五、發明説明（β ) 正確調査含岩藻糖硫酸多醣之生物活性，又，為了防止 容器和樹脂等之污染，乃必霈由含岩藻糖硫酸多_除去 反應性強的箸色性物質。 又，已知由褐藻類或褐藻類之乙醇洗淨殘渣等中萃取 含岩藻糖硫酸多_混合物時，因使用可溶性醋酸鋇和氯 化鋇和氯化鈣可抑制藻酸的混入，有利於其後的精製， 但可溶性鋇鹽於廢液處理等並非容易，又由於氛化0若 與海藻混合則PH變動，而在取得非分解性之含岩藻糖硫 酸多醣中PH調整乃為必要。於pH調整時由於海藻粉末為 帶有黏性而凝集，故其後之萃取效率降低且分取回液分 離之過濾變得困難〇 即，僅管現在期待含岩藻糖硫酸多醏之産業上的有用 性，但不僅無分子種類充分分级之含岩藻糖硫酸多醏-F 和含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之市售品，且亦無有關其效率性 製法之報告。更且於市售之含岩藻糖硫酸多醣中含有如 上述反應性的箸色性物質。 雖然含岩藻糖硫酸多醏有各種活性，但如前述由於其 之分级調製困難，故仍未取得實質上經純化之含岩藻糖 硫酸多醣-F和含岩藻糖硫酸多 然而依據本發明，可提供實質上經純化之含岩藻糖硫 酸多醏其簡便的萃取方向及含岩藻糖硫酸多醣-U之 製法。又依據本發明，提供通常由含岩藻糖硫酸多醣難 以除去並造成酵素反應阻礙和樹脂污染等之反應性強之 著色性物質被予以除去之含岩藻糖硫酸多賭-11。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明U ) 更且依據本發明，提供實質上經純化之含岩藻糖硫酸 多酷-P、其簡便的萃取方法及含岩藻糖硫酸多醏-F之製 法。 又依據本發明，提供通常由含岩藻糖硫酸多醸難以除 去並造成酵素反應阻礙和樹脂污染等之反應性強之著色 性物質被予以除去之含岩藻糖硫酸多醣-F。 本發明中所使用之含岩藻糖硫酸多糖，可為褐藻植物 、海參等含岩藻糖硫酸多醏含有物，例如就以此予以乾 燥、粉碎供使用亦可，或使用來自含岩藻糖硫酸多醣含 有物之含岩藻糖硫酸多醏萃取液、由> 該萃取液之精製物 亦可。含岩藻糖硫酸多醣萃取液之調褽方痪，由萃取液' 之精製方法可依公知方法進行即可，並無特別限定。 又，本發明中使用之所謂的含岩藻糖硫酸多醏分解物 ，為含岩藻糖硫酸多_以酵素化學性方法、化學性方法 、物理學方法分解所取得之物質，可使用公知之酵素化 學性方法、化學性方法、物理學方法。 又，本發明中使用之含岩藻糖硫酸多_、含岩藻糖硫 酸多_分解物包含其藥理容許鹽。 含有含岩藻糖硫酸多醏之褐藻植物，例洳為山回幸雄 序、瀨川宗吉著、保育社、昭和5 2年發刊之原色曰本海 藻圖鑑、第22〜5 2頁中記載之褐藻植物，例如使用檜葉 尖（Fucus evanescens)、高果美海帶（Kjellnaniella crassifolia)、真海帶（Laminaria japonica)、裙帶菜 (Undaria pinnatifida)等，可調製含岩藻糖硫酸多糖。 _ 1 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589320 A7 B7 五、發明説明（) 含有含岩藻糖硫酸多醏之海參，例如為日本特開平4-91027號公報記載之海參，例如可使用，真海參（Stichopus japonicus)、假黑海參（Holothuria leucospilota)等， 並依該公報記載之方法，可調製含岩藻糖硫酸多釀。 含岩藻糖硫酸多醣為在分子中具有硫酸基，該基為與 各種,鹼形成反應鹽。此些含岩藻糖硫酸多醣、其分解物 為呈鹽之狀態而為安定，通常以鈉和/或鉀等鹽之型態 被單離。此等物質之鹽經Dowex 5QW等陽離子交換樹脂 處理而游離含岩藻糖硫酸多醣，並可能導至游離其分解 物。又，其更且視需要可進行公知慣用之鹽交換，與所 欲之各種鹽進行交換。含岩藻糖硫酸多_、其分解物之 鹽，可使用製藥容許鹽，可列舉例如鉀、鈉等之鹼金屬 鹽、鈣、鎂、鋇等之鹼土金屬鹽與吡啶等之有機鹼之鹽 、及銨鹽。 含有含岩藻糖硫酸多糖之褐藻植物、海參等經進行乾 燥後，粉碎處理，可調製含岩藻糖硫酸多醣粉末體。 由含岩藻糖硫酸多醣粉末體經進行熱水萃取。稀酸萃 取而可調製含岩藻糖硫酸多酷萃取液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 含岩藻糖硫酸多醣之含有物的萃取溫度、時間可在〇〜 200 °C、1〜360分鐘之範圍中依目的選擇即可，通常為 10〜150 °C、5〜240分鐘，較佳為選擇50〜13(TC、10〜 180分鐘之範圍而進行為較佳。 為了提高含岩藻糖硫酸多酷含有率之萃取物之精製手 段有，使用氯化鈣、醋酸鋇等之含岩藻糖硫酸多醣之分 一 1 9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320
7 B 明説 明 發五 岩醣 含多 之性 劑酸 1II1ICHU 凝使 糖下 多在 性存 酸類 等鹽 啶於 毗 ， 基法 蟠方 鯨级 化.分 氯之 用醣 使多 ，酸 法硫 方糖 级藻 離 / 濾-ο 過製 0 0 凝行 、進 法 ， 方合 级組 分其 之將 醣可 多要 酸霈 硫視 糖且 藻， 岩等 含析 之層 劑換 «3V 凝子 硫音 糖超 0 行 岩進 含 ， 用法 使方 為之 可解 ，分 法酸 方行 解進 分 ， 之法 醣方 多之 酸素 硫酵 糖解 藻分 岩醣 含多 酸 方 告 公 之 法 方 解 分 Q 醏行 多進 酸法 硫方 糖述 藻上 岩以 含可 之製 等精 法之 方物 之解 理分 處 ， 波法 但使 ，可 醣如 多例 酸 ， 硫定 糖限 藻別 岩丨恃 含無 種並 多類 有種 在的 存類 中藻. 類褐 藻之 褐用 於使 ，所 常明 通發 本 者 帶 海 真 自， 來 〇 : 者 者類 帶藻 海褐 美部 果全 高 自 自來 來他 /其 者 、 尖者 葉菜 檜帶 自裙 來自 用來 条 水 之 類 藻 褐 以 先 首 上 造 . 製 的 醏 多 酸 0 硫液 糖取 藻萃 岩得 含取 於劑 溶 液0% 取10 萃 ~ 得60 取以 於 、 ，末 可粉 亦燥 藻乾 海成 生作 是邊 使一 卽 、 藻燥 海乾 之藻 取褐 萃將 供邊 ,1 又若 前 、含 醛入 二混 戊質 、物 醛性 乙色 、著 0 少 甲減 有幅 含大 於可 浸於 並由 , 則 淨中 洗液 等溶 酮水 丙之 和等 醇水 乙氨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 利 有 岩氯 含或 取 、 萃鋇 等化 渣氯 殘 、 0 0 洗酸 醇醋 乙性 之溶 類可 藻用 褐使 為或若 而類 ， 糖藻時 多褐醣 酸由多 硫於酸 糖，硫 藻又糖 岩 藻 而 人： 混 Μ 的11η 酸以 藻 , 制時 抑取 可萃 於於 由由 則理 鈣述 化上 依 而 0 Λ5 精 的 後 其 利 有 於 液 溶 0 酸 醋 之 右 左 佳 較 為 取 萃 下 °c 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS.) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（β ) 於海藻較厚且粉末（粒子）大之情形中，因由最初使用 0.2M以上之醋酸鈣乃使萃取效率變差，故首先以水萃取 ,再加入醋酸鈣，除去所生成之藻酸沈澱即可。 然而於欲將含岩藻糖硫酸多醏與藻酸同時萃取之情形 ，和欲取得萃取時具某程度分解之情形等中則對溶劑及 萃取條件並無特別限定，可使用水或者食鹽，氛化鎂等 各種濃度之中性鹽類水溶液、檸檬酸、磷酸、鹽酸等各 種濃度之酸性水溶液、檸樣酸、磷酸、鹽酸等各種濃度 之酸性水溶液、氫氣化鈉、氫氣化鉀等各種濃度之鹼性 水溶液，且亦可加入緩衝劑和防腐劑。萃取液之pH和萃 取溫度、萃取時間等亦無特別限定，一般由於含岩藻糖 硫酸多醣對酸和鹼為弱，故使用酸性溶液和鹼性溶液時 則易進行低分子化。藉由調整加熱溫度、時間、pH等， 而可調製任意的分解物，例如藉由凝膠過濾處理，分子 量分级膜處理等，而可調整分解物之平均分子量、分子 量分布等。 即本發明之含岩藻糖硫酸多糖-ϋ及含岩藻糖硫酸多醏 - F之分子量及糖組成為依含岩藻糖硫酸多醣原料之收獲 期，該原料之乾燥方法、該原料之保存方法而異，又依 含岩藻糖硫酸多醸萃取時之加熱條件、ΡΗ條件等而異。 例如以酸令含岩藻糖硫酸多醣水解，並於鹼性條件下由 糖醛酸之/?-脱離，而進行低分子化。因此本說明書中 記載之含岩藻糖硫酸多醏-11，含岩藻糖硫酸多醣-F之分 子量，分子量分布不過僅為其一例，可依含岩藻糖硫酸 -21- 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（p ) 多醣之處理條件，而輕易地變化其分子量、分子量分布 。例如，於弱鹼性10 〇 °c、加熱1小時脫鹽時，若使用孔 徑大小300之分子篩膜，則可調製分子量分布由1000至1 萬左右之含岩藻糖硫酸多醏-1)、含岩藻糖硫酸多_-趴 且依使用條件可調製任意分子量分子量分布之本發明之 含岩藻糖硫酸多醏-U及含岩藻糖硫酸多醸-F。 為由前述之褐藻類萃取液除去藻酸及中性糖等，例如 可在0.2〜0.6 Μ濃度食鹽等之鹽類存在下，加入不會令其 再産生沈澱之氯化鯨蠟基毗啶等之酸性多醏凝集劑，並 以集沈澱即可。 > 視需要此沈澱以0.2〜0.6 Μ濃度之食'鹽等鹽類溶液洗 淨後，將沈澱中之氯化鯨蠘基吡啶以食鹽飽和乙醇洗掉 ，取得含岩藻糖硫酸多醣混合物。為由經此處理所得之 含岩藻糖硫酸多醣混合物中除去色素，可將此沈澱溶解 ► 後以陰離子交換樹脂和多醏性樹脂處理進行超過濾即可 。又若於脫鹽、後冷凍乾燥亦可取得乾燥樣品。 本發明者等人發現於0.6〜3Μ之1 種或2種以上鹽類 存在下，本發明之含岩藻糖硫酸多釀-F與本發明之含岩 藻糖硫酸多醸-U為對酸性多醏凝集劑顯示诎完全不同的 舉動。 例如使用本發明之方法，可由含岩藻糖硫酸多醏混合 物之水溶液分離出本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U。 首先於含岩藻糖硫酸多醣混合物之水溶液中添加1種 或2種以上之鹽類並使其總濃度為0.6〜2Μ。添加之鹽 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（Η ) 類例如為氯化鈉、氣化鈣等並無特別限定。 通常於分離本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F與本發明之 含岩藻糖硫酸多醣-U時，以1.5M左右鹽濃度可達成目的 (參照後述第1圖之説明）。例如上述鹽類之鹽濃度調整 至1. 5M後若將氯化鯨蠟基吡啶等酸性多醣凝集劑令以不 會再産生沈澱為止地添加，則因含岩藻糖硫酸多_ -F形 成沈澱，故若除去沈毅則取得本發明之含岩藻糖硫酸多 醏-U之溶液。視需要將此溶液濃縮後，以4倍量之乙醇 等令溶液中之含岩藻糖硫酸多酷-U沈澱，並將沈澱中之 氛化鯨蠘基吡啶以食鹽飽和乙醇洗掉，取得本發明之含 岩藻糖硫酸多醏-U。為由經此處理所得之含岩藻糖硫酸 多_-11中除去色素，亦可將此沈澱溶解後進行超過濾等 〇又若於脱鹽後冷凍乾燥亦可得取得乾燥樣品。又，亦 可於工程中添加防腐劑等。 其次於僅欲效率地製造本發明之含岩藻糖硫酸多糖-F 之倩形中，於以氛化鯨蠟基毗啶等令以凝集時，不以0.2 〜0.6N之鹽濃度，而若例如以2 Μ之鹽濃度則可僅含有本 發明之含岩藻糖硫酸多釀-F。 本發明.者等人亦發現含岩藻糖硫酸多賭以陰離子交換 樹脂精製時若有2價陽離子共存則每單位樹脂量吸附之 含岩藻糖硫酸多醏量增加，且含岩藻糖硫酸多醏之分離變 佳〇卽，使用本發明之方法製造本發明之含岩藻糖硫酸 多醣-U時，首先於含岩藻糖硫酸多醏混合物中作為2價 陽離子來源之藥品較佳添加以lmM以上。其次，陰離子 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 許 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（〇 ) 交換樹脂以含有較佳lffiM以上2價陽離子之液體平衡化 ，並令上逑含岩藻糖硫酸多_混合物吸附。此陰離子交 換樹脂以平衡化之液充分洗淨後，例如1以氣化納梯度令 含岩藻糖硫酸多_溶出。使用本方法時，添加之2價陽 離子濃度若為I"以上01可，但，令本發明之含岩藻糖 硫酸多趿附於柱上為目的時則期望為未滿〇·5Μβ又 本方法使用作為2價陽離子來源之藥品待別以鈣鹽和鋇 鹽之效果優異，但並非特別限定，硫酸鎂、氯化錳等亦 可使用。 1 又，若由褐藻類以通常之方法製^含岩藻糖硫酸多酷 混合物，則如上述混入反應性強的箸色性物質，其不僅 污染接觸之樹脂和樹脂性容器，且亦阻礙酵素反應和細 胞生長〇發現此箸色性物質若令以結合或吸附至多_性 物質或具有陰離子交換基之g質則可輕易地除去。即， 於含有含岩藻糖硫酸多釀之溶液中例如添MCellulofine 、GCL-2000(生化學工業公司製）和Sephacryl S-500、 Sephadex G-200、Sepharose CL-2B(同為 PHARMAICA 公 司製）等之多醣性樹脂、或DEAE-Cellulofine A- 8 0 0 (生 化學工業公司製）、DEAE-Sepharose FF、J)EAE-Sephadex A-50、 QAE-Sephadex A-50、 DEAE-Sephacel(同為 PHARMA CIA公司製）、TSK-凝膠 DEAE-Toyopearl 650、TSK-凝膠 D E A E T o y o p e a r 1 5 5 0 ( T 0 S 0 公司製）、A m b e r 1 i t e 条之陰 離子交換樹脂（0RGAN0公司販售Uitopearl条之陰離子 交換樹脂（富士紡績公司製）等之具有陰離子交換基之物 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（4 ) 質攪拌後除去，或者於充填其之柱中令含有含岩藻糖硫 _多_之溶液通過則可輕易地除去此反應性強的箸色性 物質。但，於陰離子交換樹脂之情形中因亦可結合含岩 藻糖硫酸多醏，故在令著色性物質吸附時其鹽濃度以2M 左右為較佳。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏-ϋ例如可如實施例6記載 般諝製。以下，示出此含岩藻糖硫酸多醏-ϋ之理化性質 ，但本發明之含岩藻糖硫酸多醣-U並不被此例所限定。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏-U、及實施例8所得之本 發明之含岩藻糖硫酸多醏-F之在各氣化鈉濃度中，過量 之氯化鯨蠘吡啶存在下的沈澱形成性示於第1圖。 第1圖之縱軸表示沈澱形成率（％),横軸表示氯化鈉 濃度（Μ)。圖中，實線及白圈表示本發明之含岩藻糖硫 酸多醣-11於各氯化鈉濃度下之沈澱形成率，且圖中，點 線及白三角為表示本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F於各氯 化鈉濃度（Μ)下之沈澱形成率。 沈澱形成率之測定為，在溶劑溫度3 7 °C下，如下進行ρ 將本發明之含岩藻糖硫酸多賭-U及含岩藻糖硫酸多糖 -F分別以2%之濃度溶解於水及4M氯化鈉中，其經由以 各種比例混合而調製溶解於各種濃度氯化鈉中之含岩藻 糖硫酸多醣-U及含岩藻糖硫酸多醏-F溶液各125微升。 其次，將氯化鯨蠟基吡啶以2.5 %之濃度溶解於水及4Μ 之氯化鈉中，並經由混合而諝製溶解於各種濃度氯化鈉 中之1 . 2 5 %氛化鯨蠟基毗啶溶液。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公漦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^τ- 589320 A7 B7 五、發明説明（) 令溶解於水中之2%本發明之含岩藻糖硫酸多醏-U及 含岩藻糖硫酸多醣-F於1.25 %之氯化鯨蠘基毗啶中完全 沈澱需要3. 2倍容量。於是，相對於溶解於各濃度氣化 鈉之2%含岩藻糖硫酸多醏-U及含岩藻糖硫酸多醏-F之 各125徹升，將溶解於各濃度氯化鈉之氯化鯨蠟基毗啶 溶液添加4 0 0微升後，充分攪拌，放置30分鐘後，離心 分離並將上清液之糖含量依苯酚-硫酸法〔Analytical Chemistry、第28卷、第3 5 0頁（ 1 9 5 6 )〕測定，可算出在 各氯化鈉濃度下之各含岩藻糖硫酸多醣的沈澱形成率。 所得之本發明之含岩藻糖硫酸多i -U之分子量於使用 Sephacryl S-500之凝膠過濾法計算時'考出以約19萬 為中心之分子量分布（參照第2圖）。尚，於第2圖中， 縱軸為依苯酚-硫酸法測定試料中之糖含量以4 8 0 ιιβϊ吸光 度表示，横軸為表示溶離份编號。 ► 尚，凝膠過濾之條件示於下。 柱尺寸：3.08X162.5公分 溶劑：含有0.2M氛化鈉與含10%乙醇之lDmM磷酸納緩 衝液（PH6 · 0) 流速：1 . 5毫升/分鐘 _ 樣品濃度：0. 25% 樣品液量：20毫升 分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82(昭和電工 公司製） 其次，分析所得之本發明含岩藻糖硫酸多醏-U之成分 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（/) 首先，依 Journal of Biological Chemistry，第 卷、第595頁（1948)之記載定量岩藻糖量。 其次，將所得之含岩藻糖硫酸多賭-U之乾燥樣品於1 當量之鹽酸中以0.5%濃度溶解，並於litre下處理2小 時，將構成單糖予以水解。其次，將使用Glyco TAG及 Glyco TAG試藥套組（同為寶酒造公司製）水解所得之單 糖的還原性末端予以吡啶基-U)-胺基化（PA化），以iiPLC 調査構成糖的比率。尚，HPLC之條件為如下述。 裝置：L-6200型（日立製作所製） 柱：PERPACK類型Α (4·6βιβιΧ 150roa:寶酒造公司製） 洗提液：7〇〇®M硼酸緩衝液（ΡΗ9·0):乙腈=9: 1 檢測：以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製）於激發波 長3 10ΠΒ1、螢光波長3 8 0ηΐη下檢测 流速：〇 . 3毫升/分鐘
柱溫：6 5 °C 其次：依 Analytical Biochemistry、第4 卷、第 330 頁（1962)之記載定量糖醛酸量。 其次，依 Biochemical Jouornal、第 84卷、第 106頁 (1962)之記載定量硫酸含量。 以上之結果，所得之含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之構成糖為 岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、糖 醛酸。其他之中性糖為實質上不含有。又，主要成分 之岩藻糖：甘露糖：半乳糖：糖醛酸：硫酸基的莫耳比 ^ 10 ： 7: 4: 5: 20〇 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 格（210Χ 297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（a ) 其次，含岩藻糖硫酸多醣-ϋ鈣鹽之IR光譜以傅里葉 (Fourier)變換红外線分光光度計JIR*"DIAM0ND 20(日本 電子公司製）測定時取得第3圖所示之光譜。尚，第3 圖中縱軸表示透過率（％)，橫軸表示波數（c®-1)。 其次，本發明之含岩藻糖硫酸多教鹽之ΝΜβ光譜 以500MHz之核磁共振裝置JNM-ct 500型核磁共振裝置（曰 本電子公司製）測定時取得第4圖所示之光譜。 第4圖中，縱軸表示訊號強度、橫軸表示化學位移值 (PPffi)o尚，於1 H-NMR中之化學位移值為以H0D之化學 位移值視為4 . 6 5 p p ffl表示。 1 H-NMR (D 2 〇) 、 占5.27(甘露糖1位之Η)、5·〇7(岩藻糖1位之H)、 4.49(岩藻糖3位之Η)、4·37(葡糖醛酸1位H)、4·04 (岩藻糖4位之H)、3.82(岩藻耱2位之H)、3.54(葡糖 ► 醛酸3位之H)、3.28(葡糖醛酸2位之Η)、1·〇9(岩溪糖 5位之C Η 3之Η ) 本發明之含岩藻糖硫酸多醸-U之冷凍乾燥物的比旋光 度以高度-高感度旋光計SEPA-30M堀場製作所製）測定 時為-53 · 6度。 ^ 本發明者等人如以下所逑決定所取得之本發明含岩藻 糖硫酸多醣-ϋ之構造。 經由具有分解含岩藻糖硫酸多醏-U能力之分解 含岩藻糖硫酸多醣-ϋ分解及分解物之精製。 令精製之含岩藻糖硫酸多醣-ϋ以下述末端型岩溪依$ -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公嫠） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
iT 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 589320 A7 _B7 ‘ _ 五、發明説明（β ) 糖分解酵素作用，進行分解物之精製。 即，將1%之含岩藻糖硫酸多糖-U溶液16毫升，與50ιβΜ 之碟酸緩衝液（ρΗ8·〇)12毫升與4M之氣化鈉4毫升與32 ιηϋ/ιηΐ之末端型岩藻依聚糖分解酵素溶液8毫升混合， 並於25°C下反應48小時。可確認隨反應進行於23Giiib之 吸光度增加，可判定經由本酵素乃令含岩藻糖硫酸多_ -U分解。此反應液以MICR0ACILIZER-G3(旭化成公司製） 脱鹽後，以DEAE-Sepharose FF可分離精製3個溶離份 (a)、 （b)、及（c)〇 尚，上述之末端型岩藻依據糖分解酵素為經以下之方 法調製。 該末端型岩藻依聚糖分解酵素之生産上所用的菌株， 若為具有該末端型岩藻依聚糖分解酵素生産能力之薗株 則為任何菌株均可，具體例可列舉例如産黃菌屬 (Flavobacterium)sp· SA-0082株（CCRC 910069)。 本菌株為由青森縣之海水中由本發明者等人所新檢索 取得之菌株，其菌學性質如下。 1 ·産黃菌屬sp . S A- 0 0 8 2株 a .型態性質 (1) 本菌為短桿菌 寬 0 · 8〜1 · 0 # m 長度 1.0 〜1.2/u in (2) 孢子之有無 · 無 (3 )革蘭氏染色 陰性 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本覓)
589320 A 7 B7 五、發明説明（4 ) b.生理性質 (1)生長之溫度範圍 於37°C以上可生長。適當的生長溫度為15〜28°C。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ⑴對 氣 之 態度 好 氣 性 ⑴過 氧 化 氫酶 陽 性 ⑷氧 化 酶 陽 性 ⑴脲 酶 弱 陽 性 (6)酸 的 生 成 D- Μ 萄 糖 陽 性 乳 糖 RgL m 性 麥 芽 糖 陽 性 D - 甘 露 糖醇 陽 性 簾 糖 陰 性 海 藻 糖 陰 > 性 (7)水 解 澱 粉 陰 性 明 膠 陽 性 酪 蛋 白 陰 性 t 窠 樹 甘 陽 性 (8)硝 酸 鹽 的還原 陰 性 (9 )吲 的 生成 陰 性 (1 〇 )硫化氫的生成 陰 性 (1 1 )牛奶的凝固 陰 性 (12)納的要求性 陽 性 -30- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公嫠） 589320 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明（β ) (13)鹽類要求性 於 0%食鹽培養基中的生長 陰 性 於 1%食鹽培養基中的生長 陰 性 於 海水培 養基 中的 生長 陽 性 - (1 4)画条 甲 基萦 m 6 (1 5) 薗體内 DNA之GC含量 32 % (1 6) 0F-試驗 0 (1 7) 菌落的 色調 黃 色 条 (1 8) 蓮動性 f 無 (1 9)滑走性 無 本 菌 株 被考慮 為B e rgey's Man u a 1 of S y s t e 扭a tic Ba c t e r i 〇 logy. 第1 卷（1 9 8 4 ). 及Be r g ey • s Μ a η u al of S y s t e m a t i c B a c t e r i 〇 logy、 第9 卷 (1 9 9 4 ) 中 記載 之 水 生 産 黃 Μ (Fla v o b a c t e r i u m a q > u a t i le )、 及腦膜脈毒 産 黃 m (F 1 a v o b a c t e r i u m m e n i n g ；〇 s e p t i c u m)之 類 緣細 薗 但 其 與 前者在 不形 成利 用蔗糖 之酸 之 方 面， 無 法分 解 酪 蛋 白 之 方面， 可分 解匕 葉樹甘 之方 面 s 可液 化 明膠 之 方 面 S 脲 酶為呈 陽性 之方 面為相 異、 而 與 後者 在 無法 分 解 酪 蛋 白 之方面 、於 3 7°C 下之生 長慢 之 方湎為 相 異。 因 此 將 本 菌株鑑定 為屬 於産 黃菌颶 之細 菌 9 並命 名 為産 黃 菌 屬 SP SA-0082〇 尚 上 述菌株 以産 黃菌 屬s p · S A- 0 08 2表示， 於通商 産 業 省 工 業技術 院生 命工 學工業 技術 研 究 院〔 曰 本莰 城 縣 筑 波 市 東1 丁 目1 番3 號（郵遞编號3 05 )〕中由平成 -31- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（w) 7年3月29開始以FERM P- 1 4 8 7 2寄存，並在前逑通商産 業省工業技術院生命工學工業技術研究所中以FERM BP-5402(於國際寄存之移管申請日：平成8年2月15日）寄 存，且在貴國食品工業發展研究所菌種保存及研究中心 中於1996年12月24日以CCRC第910069號寄存。 於本薗株培養基中所加入之營養源若為使用之菌株可 利用，且産生末端型岩藻依聚糖分解酵素者即可，碩源 例如可利用岩藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、岩藻糖、葡 萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳耱、澱粉等 、氤源以酵母萃取物、蛋白陳、酪蛋白胺基酸、玉米漿 、肉萃取物、脱脂大豆、硫酸銨、氣化銨等為適當。其 他將鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無機質、及金 屬鹽類添加亦可。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於培養本末端型岩藻依聚糖分解酵素之生産薗時，生 産量雖依培養條件而變動，但一般於培養溫度為15°C〜 3〇°C,培養基之pH為5〜9為佳，於5〜72小時之通氣攪拌 培養下，本末端型岩藻依聚糖分解酵素之生産量到達最 高。培養條件當然依使用之菌株、培養基組成等，將本 末端型岩藻依聚糖分解酵素之生産量設定成為最大。 本末端型岩藻依聚糖分解酵素在菌體中存在，亦在培 養物上清液中存在。 上述的産黃薗屬sp· SA- 0 0 8 2株若以適當的培養基培 養，並收集其菌體，以通常所用的細胞破壞手段，例如 以超音波處理等將菌體弄碎，則可取得無細胞萃取液。 -32-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 州320 A7 —_£Z__ 五、發明説明（〜） 其次，由此萃取液以通常所用之精製手段可取得精製 _素樣品。例如，以鹽析、離子交換柱層析、疏水鐽柱 廇析、凝顏過濾等進行精製，可取得不含其他岩藻依聚 糖分解酵素之經純化的本末端型岩藻依聚is分解酵素。 又，由上述培養液除去菌體之培養液上清液中因亦大 釐存在本酵素體外酵素），故可經由與薗體内酵素同 樣之精製手段將其精製。 示出末端型岩藻依聚糖分解酵素之精製例。 將産黃菌颶sp· SA-0082(C OR C 910069)接種至由分注 含有葡萄糖〇·25 %、蛋白諫1·〇% ^酵母萃取物〇·〇5% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之人工海水（Ger®a!ine Laboratoryif)p、H7.5 所組成之 培養基6D0毫升並殺菌（120°C、20分鐘）之2公升三角燒 瓶中，並於24 °C下培養24小時作成種培養液。將含有蕕 萄糖0.25%、蛋白腺1·〇%、酵母萃取物〇·〇5%、及消 泡劑（信越化學工業製ΚΜ70)0·01%之人工海水（Geriaalin Laboratory製）PH7.5所組成之培養基20公升置入30公升 容量之醱酵缸中並於120°C下殺菌20分鐘。冷卻後，接 種以上述之種培養液600毫升，並於24°C下24小時，每分鐘 10公升通氣量與每分鐘125轉之攪拌速度汶條件下培養。 培養終了後，將培養液離心分離可得菌體。 將此薗體懸浮於含2 0 0 iaM氯化鈉之20 *M醋酸-磷酸緩衝 液（PH 7.5),並以超音波弄碎後、離心分離可得薗體萃 取液。於測定此菌體萃取液中之本末端型岩藻依聚糖分 解酵素之活性時，於培養1毫升中檢測出5aU之活性。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 〇明2〇
五 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 發明説明（) 於本萃取液中，加入終濃度為90%飽和之硫酸銨，攪 伴溶解後離心分離，並將沈澱於上逑菌體萃取液相同之 鑲衝液中懸浮，以含有5DmM食鹽之2ϋ®Μ醋酸-磷酸緩衝 液（Ρ Η 7 . 5 )充分透析。由透析所産生之沈澱以離心分離 除去後，令以吸附至事先以含有50ιβΜ食鹽之2GffiM醋酸-磷酸緩衝液（PH7.5)平衡化之DEAE-Sepharose FF柱，並 將吸附物以相同緩衝液充分洗淨後，以5GmM至6Q()mM之 氣化納梯度令其溶出，並收集活性溶離份。其次，於此 活性溶離份中加入終濃度為4M之食鹽，令以吸附至事 先以含有4M食鹽之2DmM磷酸緩衝液（PH8.G)平衡化之苯 基-Sepharose CL-4B柱吸附，並將吸附物以相同緩衝液 充分洗淨後，以4M至1 Μ之食鹽梯度令其溶出，並收集活 溶離份。其次將此活性溶離份以超濾器濃縮後，以事 先以含有5〇11^食鹽之1〇“磷酸緩衝液平衡化之86?1^(^71 S-3G0進行凝膠過濾並收集活性溶離性。此酵素之分子 量由Sephacryl S-300滯留時間算出為約46萬。其次將 此活性溶離份以含有25ϋιηΜ食鹽之lOroM磷酸緩衝液（PH7) 透析。將此酵素液令以吸附至事先以含有2 5 0 η Μ食鹽之 lOffiM磷酸緩衝液（ρΗ7)平衡化之Mono Q HR 5/5柱，並將 吸附物以相同緩衝液充分洗淨後，以250βιΜ至4 5 0 mM之食 鹽梯度令其溶出，並收集活性溶離份，取得精製酵素。 以上之精製工程示於表1。 -34- 本紙張尺度適用中國國家標举（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 • A7 B7 五、發明説明（衫） 表 1 總 工程 蛋白量 (mg ) 總活性 (毫單位） 比活性 (毫單涖 /mg ) 收率 (% ) 菌體萃取液 61,900 101,000 1.63 10 0 硫酸銨鹽析 33,800 88,600 2.62 87.7 DEAE-Sepharose F F 2，1 9 0， 40,400 18.4 40.0 苯基-Sepharose CL-4B 48.2 29,000 60 1 28.7 Sephacryl S- 3 0 0 7.24 19 厂6 0 0、 2,710 19.4 Mono Q 0.824 15,000 18,200 . 14.9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本酵素之活性測定為如下逑進行。 ► 將2.5 %來自高果美海帶之岩藻依聚糖溶液50徹升、 與10微升之本酵素、與60撤升之含有667α»Μ氯化鈉之83ηιΜ 磷酸緩衝液P Η 7 . 5混合，並令於3 7 °C、反應3小時後， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將反應液105微升與水2毫升混合攪拌，並測定其在230nni 之吸光度（AT)。準備僅用於溶解本酵素之上述緩衝液代 替本酵素並令以同樣條件反應者，及僅使用水代替岩藻 依聚糖溶液並進行反應者作為對照組，並分別同樣地測 定吸光度（AB1及AB2)。 1單位之酵素，為在上述反應糸中於1分鐘將1/umol 之甘露糖與糖醛酸之間的糖甘鍵脱離性切斷之酵素量。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 除依 以藻 予岩 離帶 分海 心美 離果 以高 澱的 沈製 之精 生得 産可 時燥 此乾 且凍 ,冷 子液 分清 低上 去此 除將 〇 及。糖 鹽去聚 多 酸 _ 硫 藻 岩 含 將 素 酵 解 分 糖 析聚 解依 造藻 構岩 之型 物端 産末 應之 反述 素上 酵 以多糖 予酸寡 鍵硫之 I藻構 α 岩η 之含II 間之{ 酸得 0 所 糖於 葡用 D-作 與令 糖若 露 ， 甘素 D-酵 之之 在解 存分可 中性則 u U I 離 I 醣脱醣 式 下 有 具 成 生 及 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（4 )
OH o=s = o 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH
〇
-38- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（W )
〇 Io=s=o IOH 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-39 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（# 以下，詳細說明。 以上逑之DEAE-Sepharose FF分離精製之3储溶離份 、 （b)、及（c)分別僅一部分使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末端予以吡啶基- (2)_胺基化（pa 化），可得各 PA化糖（PA-a)、 （PA-b)、及（PA-c)。 （PA-a) 、（pPb)、及（PA-c)以HPLC進行分析。 尚，HPLC之條件為如下。 (1) 使用分子量分级柱之HPLC分析 裝置：L -6200型（日立製作所製）
柱：SHODEX SB-803(4.6X 250ffiin)(昭和電工公司製） 洗提液：0.2M氯化鈉：二甲基亞碘=9: 1 檢測：以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製）於激發波 長32 Onro、螢光波長40 Oram下檢測 流速：1毫升/分鐘 柱溫：5()°C (2) 使用逆相柱之HPLC分析 裝置：L- 6 2 0 0型（日立製作所製） 柱：L-柱（4.6X 2 5 Oram)〔（財）化學藥品檢査協會〕 洗提液：50mM醋酸-三乙胺（pH5 · 5) '
檢測：以螢光檢測器F - 1 1 5 G (日立製作所製）於激發波 長3 2 0 ηιπ、螢光波長4001»·下檢測 流速：1毫升/分鐘 柱溫：4 0 °C 於第5、6、及7圖中示出各吡啶基-(2)-胺基化之糖 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 _ 五、發明説明（外广 化合物（PA-a)、 （PA-b)、及（PA-c)之HPLC的溶出圖式， 且圖中縱軸表示相對螢光強度、横軸表示滞留時間（分 鐘）。 下述二出式（I)、式（II)、及式（III)所示化合物，卽 (a)、 （b)、及（c)之物性。 第8圖中示出（a)、第9圖中示出（b)、第（10)中示出 (c)之質量光譜，於第11圖中示出（a)、第12圖中示出（b) 、第13圖中示出（c)之質量-質量光譜，且各圖中縱軸表 示相對強度（％)、橫軸表示ιη/ζ值。 更且在第14圖中示出（a)、第15圖示出（b)、第16圖 中示出（c)之1 H-NHR光譜，各圖中縱ft表承訊號強度， 横軸表示化學位移值（PPH〇。 尚，於1 H_N HR中之化學位移值為以H0D之化學位移值 視為4.65ppffl表示。 ► (a)之物性 分子量 564 MS m/z 5 6 3 [ M-H+ ]- MS/MS ffl/z 97[HS04 ]-、157[不飽和 D-葡糖醛酸-H2 0-H+卜、175[不飽和D -蕕糖醛酸-H+ ]-、2J2 5[L -含岩藻 硫酸二H2 0-H+】-、243[L -岩藻糖硫酸-H+ ]-、319[不 飽和D -葡糖醛酸與D -甘露糖結合者之- Η20-Η+】-、405 [Μ -不飽和D-葡糖醛酸-H+ 卜、483[M-S03 -H+ ] - -4 1- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
A7 B7 五、發明説明（4-) 1H - NMR (D2 〇) <55· 78(1H, d, J=3· 7Hz, 4" - H)、5· 26(1H，d, J = 1 . 2 H z , l-H)、5. 12(1 H, d, J = 4. 0 H z , 1，一Π)、 5· 03 (1H, d，J = 6 . 1 H z , 1" 一 11)、4· 47 (111, d — d， J = 3 . 4, 10· 4Hz, 3，一 H)、4· 2 1 ( 1 H, br - s, 2 - H)、 4. 12(1H, m# 5' - H)、4· 10(1 H，d - d，J=3· 7，5·
8Hz, 3"-H)、4· 0 3 ( 1 H, d, J = 3 . 4 Hz, 4' -H)、3· 86(1H，m，3-H)、3. 83(1H, d - d, J=4. 0, 1,0· 4H z，2' -H)、3· 7 2 ( 1 H, m, 4 -H)、3· 7 2 ( 1 m, 5-Π) >3. 70(2H, m, 5-C H2 )>3. 65(1H, d-d,J=5.
8, 6. 1 H z, 2" -H)、1 . 08(3H, d, J =6. 7Hz, -C H3 之H3 ) 糖組成 L-岩藻糖：不飽和卜葡糖醛酸：D -甘露糖=1: 1 : 1 (各1分子） 硫酸鹽 1分子（L-岩藻糖之3位） 尚，於1 H-NMR中尖峰所歸屬之编號為如下述式（IV)。. (IV ) o=s=o
I
OH 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（4Ί ) (b)之物性 分子量 724 MS m/z 7 2 3 [M-H+ ]' 361 [ M-2H+ ] 2 ~ , MS/MS m/z 97[HS〇4 】-、175[不飽和 D-葡糖醛酸-H+ ]- 、2 4 3 [L-含岩藻硫酸-H+ ]-、321[M-S0 3 -2H+ ] 2 -、 ， 405[M -不飽和D-葡糖醛酸- 2S〇3 -IT ]7、417[M-L岩藻 糖-2S0 3 -H+ ]- 〇 1 H-NMR (D 2 〇 ) δ 5 . 6 6 ( 1 H, d, J = 3. 4Hz，f4~—H)、5. 27 (1H, d,
J = 7 . 3 H z , 1 " - H )、5 · 2 2 ( 1 H, d , J = 1 · 8 II z , ^ -H )、5 · 2 1 ( 1 H , d , J = 3 · 7 Π z , 1，一 ll )、、4 · 5 0 ( 1 H，d ·
J = 3 . 1 H z · 4 〃 一 H )、4. 3 2 ( 1 H · q , J = 6 · 7Hz, 5 · - H )、4· 2 7 ( 1 H, d-d, J =3. 7, 10· 4 Hz, 2' - H)、4· 2 1 (1H，d-d, J=3· 4, 6· 7 Hz，3" - H)、4· 1 8 ( 1 H, d - d, J = 1 . 8，11· Ο H z , 5」CH^H)、4. 15(1H, br - s, 2 - H )、4. 10 (1H, d-d, J=5. 8, 11· 0 H z、5 - C H 灿） 、3· 99(1H, d-d, J = 3. 1, 10· 4Hz, 3' - H)、3· 90 (1 H，m, 5 -H)、3· 8 2 ( 1 H, rm 3 - H)、3· 8 2 ( 1 H, m， 4 一 H)3· 54(1H，br—t，J=7· 3 Hz，2" - Π)、1· 11( 3H，d，J=6· 7Hz, 5〜CH3 之 H3) " 糖組成L-岩藻糖··不飽和D -葡糖醛酸：D -甘露糖=1: 1 : 1 (各1分子） 硫酸鹽 3分子（L-岩藻糖之2位和4位及D-甘露糖之6位） 尚，於1 Η - N M R中尖峰所歸颶之编號為如下迷式（V )。 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 訂 589320 Α7 Β7 五、發明説明（〇 )
ο
(C)之物性 分子量 1 1 28 MS b/z 1 1 27 [ H-H+ ]- MS/HS b/z 97[HS04 】-、175[不飽和 D-韶糖醛酸-11+】-、2 2 5 [ L -含岩藻硫酸-H 2 0 - H + 卜、2 4 3 [ L -岩藻糖硫酸 - H + 卜、3 7 1 [ Η -不飽和D -葡糖醛酸-L -岩藻糖- S 0 3 - 2 Η 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Η4 2 ' 4 0 5丨硫酸化L -岩藻糖與D -甘露糖結合者之 、7 2 1丨Μ - I)-甘露糖-L -岩藻糖-S 0 3 - Η 2 0 -丨丨—] -44- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（〇 ) 1H-NMR (D2 Ο) 55. 69 (1Η, d, J=3. 7 Hz, (4 广 -Η)、5·34 (1H， s, (1) - H)、5· 16 ( 1 H» s , 1 一 Η)、5· 10(1H，d，J = 4 · 0 H z , ( 1 ) — H )、5 · 5 0 ( 1 Π · d · J = 3 · 7 Π z_, 1，一 ll )、4· 93(1H, d，J=6· 4 Hz，(1)^-11)^4. 5 0 ( 1 H f d - d, J=3· 4, 10· 7 Hz· 3，一 H)、4· 47(1H, d-d, J 二 3· 4, 10. 4 H z, (3)' - H)、4· 39(1H，d, J=7· 9H z 9 1 ^ — H)、4.33(lH，br - s，（2) - H)、4· 14 ( 1 H > m, 2 - H)、4· 12 ( 1 H * m t (3)"-11)、4· 12 ( 1 H t fn * 5 '-H)、4· 1 2 ( 1 H, m, (5)'二 H)、4· 04(1H, m, 4，一 Η)、4· 0 3 ( 1 H, m, ( 4 ) ’ 一 Η ) , 3 · 8 5 ( 1 Η，m, 2 ’ 一 Η)、 3· 85(1Η, m，（2)' - Η)、3· 82(lH,、m, 3 - Η)、3· 8 2 ( 1 Η, m, (3>-Η)、3· 73 (1Η, m, 4 - Η)、3· 73 (1Η, m» 5 一 Η)> 3· 73 (1Η» γπ» (4) 一 Η)、3· 70 (2Η，m，5-C Η2 之 Η2 )、3·70(2Η, m· (5) - C Η2 之 Η2 )、3 · 6 7 ( 1 H，m, 5"-Η)、3· 62(1H, m, 4" - Η)、3· 62(1H，m， (2) Η)、3· 6 2 ( 1 H, m, (5) - H)、3· 5 1 (1H，t ,J = 8· 9Hz, 3"-H)、3. 28(1H, t , J = 7 · 9 H z , 2" ~ H )、1 · 0 9 ( 3 H , d , J = 6 · 7 H z，（ 5 )，- C H3 之 H3 )、[ · · 0 7 ( 1 H, d, J=6· 7Hz, 5' -CH3 之H3 ) 糖组成L -岩藻糖：不飽和U-ϋ糖醛酸糖醛酸： D_甘露糖=2 ·· 1 : 1 ·· 2(L-岩藻掂與D-甘銪，糖各 2分子及不飽和D -砀糖薛酸與ϋ - Μ糖薛酸各1 分子） 较酸鹽2分子（各L-岩藻糖之3位） 尚，於1 H-HMR中尖峰所歸屬之编號為如下述式（vl)。 -45- (7¾ 第 45a 頁） · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • - 訏· 589320 五、發明説明（40)
on
ο on 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -45a-(上接第45頁） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 "''' ~ -------- -- 五、發明説明（44 ) 所得之含岩藻糖硫酸多醏-U若令上述之末端型岩藻依 聚糖分解酵素作用則隨著反應進行由脱離反應所引起之 23〇n 趿光度增加，由於脱離反應産物之不飽和己糖醛 酸基成為主要反應産物之全部，故可稱在所得之含岩藻 糖硫酸多醣-U之分子内，存在己糖醛酸與甘露糖交互結 合之糖鏈。由於所得之含岩藻糖硫酸多醏-ϋ之構成糖多 為岩藻糖，故含含岩藻糖硫酸多醣-U較一般的多醣易被 分解成酸，另一方面，已知己糖醛酸和甘露糖之鍵為比 較強的酸〇本發明者等人為了明暸高果美海帶之含岩藻 糖硫酸多醏混合物分子内存在之己糖< 醛酸與甘露糖為以 交互結合之糖鏈中的己糖醛酸之種類，乃參考 Carbohydrate Research、第 125卷、第 283〜290頁（1984) 之方法，首先將含岩藻糖硫酸多醣混合物溶解於〇·3Μ之 草酸並於1〇〇 °C處理3小時者予以分子量分级、收集分子 量為3000以上之溶離份，再以陰離子交換樹脂收集趿附 部分。此物質於冷凍乾燥後以4N鹽酸予以酸水解，並調 整至pH 8後，PA化，以HPLC進行糖醛酸之分析。尚HPLC 之條件為如下述。 裝置：L - 6 2 0 0型（日立製作所製） ， ' 柱：PERPACK類型 N (4.6fflmX 250aiB)(寶酒造社製） 洗提液：200mM醋酸-三乙胺緩衝液（ρΗ7·3):乙腈= 25 : 75 檢測：以螢光檢_器1^115()(日立製作所製）於激發波 長3 2 0 11111、螢光波長4 0 0 ^111下檢測 -4 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 _____ 五、發明説明（4Γ ) 流速：〇 · 8毫升/分鐘
柱溫：4 0 °C 尚，PA化己糖醛酸之標準物質葡糖醛酸為SIGMA公司 製、半乳糖醛酸為和光純藥公司製、艾杜糖醛酸為SIGMA 公司製之4 -甲基傘形基- a -L-艾杜糖醛酸化物經水解者 、甘露糖薛酸及葡糖薛酸為依Acta Chenica Scandinavica 、第15卷、第1397〜1 3 98頁（1961)記載之方法，將和光 純藥公司製的藻酸水解後以陰離子交換樹脂分離者經PA 化而取得。 其結果，可判定上述含岩藻糖硫酸多釀混合物之糖鏈 中所含的己糖醛酸僅為葡糖醛酸。 更且上逑糖鏈水解物中之葡糖醛酸經由陰離子交換樹· 脂與D -甘露糖分離並冷凍乾燥後測定其比旋光度時，可 判定為右旋性葡萄醛酸之D-葡糖醛酸。 又，對於來自高果美之含岩藻糖硫酸多酷混合物事先 以上逑之末端型岩藻依聚糖分解酵素處理者即使與上逑 同樣地以草酸予以酸水解，亦未檢測出D-葡糖醛酸與D-甘露糖為交互結合之聚合物〇由此可判定，上逑之末端 型岩藻依聚糖分解酵素經脱離分離切斷之含岩藻糖硫酸 多醏之骨架構造為具有D-葡糖醛酸與D-甘露糖為交互結 合之構造。 更且，為了調査D-葡糖醛酸與D-甘露糖之各結合位置 與糖甘結合之異頭（anomeric)配置，將經由草酸分解所 得之聚合物進行NMR分析。 -4 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公楚1 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 聚合物之NMR測定結果示於下。但，於1 H-NMR中之化‘ 學位移值為以三乙胺之甲基之化學位移值定為1.13，且 於13 C-NMR中之三乙胺之甲基之化學位移值定為9.32ppm 而表不。 1H- NMR (D2 0) 55· 25(1H，br - s，1 - Η)、4· 32(111，d，J=7· 6H z , 1' -H)、4· 00 (1Π, br-s，2 - Π)、3· 71 (1Π，m· 5' - H)、3· 69 (1Π, m, 5 - CH <Π)、3·(58(1Π，Γη,3- Η)、3· 63 (1H, m, 5 - CH 之Η)、3· 63 (1H, m, 4, -H)、 3· 57(1H, m, 4 - H)、3· 54(lfi, m, 3, - H)、3· 53( 1 H, m, 5 - H)、3· 2 5 ( 1 H，t，J = 8 · 5 H z、2 ' - H ) ^C-NMR (D2 O) 5175· 3 (5' - COO H之C )、102· 5(1，-C)、99· 6( 1-C)、78· 5 (2 - C)、77· 9 (4，- C)、77· 0 (3' - C )、76· 7(5，- C)、73· 9、5-C)、73. 7(2' -C)、70· 6 (3 - C)、67· 4 (4 - C)、61· 0 (5 - CH2 OH 之C) 尚，尖峰所歸鼷之编號為如下述式（VII):
由於D -葡糖醛酸1位之立體配置其連位結合定數為7.6 Hz,故決定為-D-葡糖醛酸。 -4 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • 訂 320 A7 ——^___E___ 五、發明説明（47 ) 又，由於甘露糖1位之立體配置其化學位移值為由 5·25ρριη,故決定為《-1)-甘露糖。 構成糖之結合方式使用1 Η檢測異種核檢測法之HMBC 法進行。 於1 H-NMR之歸屬中使用DQF-C〇SY法及Η0ΗΑΗΑ法，於 13 C-fJMR之歸屬中使用HSQC法。 由HMBC光譜可確認在i-H與4’-C之間及4’-H與1-C之間 、：I ’-H與2-C之間及2-H與1 ’-C之間分別有交錯尖峰。由 此可得知D-葡糖醛酸為以办-鍵結合於卜甘露糖之2位 ，D-甘露糖為以X鍵結合於卜葡糖醛酸之4位。 若合併、考慮上述之結果，則可判定（a )俗在作為還原 末端殘基之D-甘露糖中具有不飽和D-葡糖醛酸與結合有 硫酸基之L-岩藻糖結合之構造、（b)傜在作為結合有硫 酸基之還原性末端殘基的D -甘露糖中具有不飽和D-葡糖 薛酸、與結合有2個硫酸基之L-岩藻糖之構造、（c)像 在作為有還原末端殘基之D-甘露糖中具有D-葡糖醛酸、 與結合有硫酸基之L-岩藻糖結合，且在其D-葡糖醛酸中 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 糖 0 D 〇 和造 飽構 不之 有合 具結 中糖 糖藻 露岩 甘L- D-之 其·鍵 在基 且酸 更硫 ，有 糖合 露結 甘與 - D / 合酸 結醛 酸甘 薛D-糖之 葡上 D"以 有個 具 1 為少 T至 糖在 多且 酸， 硫造 糖構 藻之 岩合 含結 之互 得交 所糖 ，露 上甘中 以0-糖 與露 造 構 之 鍵 糖 藻 岩 L 有 具
I V 但 η 又 造 ， 構化 分’酯 部酸 之硫 示被 所為m * [化 氧 式氫 般性 1 醇 述乙 下個 有 1 具少 ，至 又之 中 式 為 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210 X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（以） 以上之整數）
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明，為提供與本發明之含鲁藻轉硫酸多醣-F 分離，且純化之含岩藻糖硫酸多醏-U。本發明之含岩藻 糖硫酸多酷-ϋ為含有糖醛酸作為構成糖，且經由産黃菌 屬39.34-008 2 ((^1^ 91006 9 )生産之岩藻依聚糖分解酵 素而低分子化，且生成至少由上述式（I)、 （II)、 （III) 所示化合物所選出之1種以上之化合物。其分子量，分 子量分布、糖組成若為本發明之含岩藻糖硫酸多醣-11則 無任何限定，且可調製任意的分子量，分子量分布之含 岩藻糖硫酸多醣並可提供糖組成等理泚性質明確的 含岩藻糖硫酸多醣。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏-ϋ為不具有含岩藻糖硫酸 多糖-F所具有的強抗凝血活性，故可提供實質上不顯示 抗凝血活性之含岩藻糖硫酸多醏。本發明之含岩藻糖硫 酸多醸-U可以經純化之含岩藻糖硫酸多醏型式使用為制 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） tr 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（仍） 癌劑、抗轉移劑、致癌預防劑等，又亦可用於作為抗含 岩藻糖硫酸多醏抗體之抗原。更且由此含岩藻糖硫酸多 醃-U,可製造具有上述式（I)、（II)、（III)等構造之寡 糖，且於此些新穎化合物之製造中亦為有用。 警 其次，記載本發明之含岩藻糖硫酸多醏-F及其製法。 於使用本發明方法製造本發明之含岩藻糖硫酸多_-F 時，若不令具有分解含岩藻糖硫酸多醏-ϋ能力之分解酵 素作用於含岩藻糖硫酸多醣混合物亦可，且於酵素反應 終了後將低分子化之含岩藻糖硫酸多醣-U以超過濾等予 以除去即可。上逑之分解酵素若為可將含岩藻糖硫酸多 醏-ϋ選擇性地分解之酵素則為任何酵素均可，其具髏例 可列舉例如産黃菌屬（Flavobacteriuffl)sp. SA-0082株 (C C R C 9 1 0 Q 6 9 )生産之上述的末端型岩藻依聚糖分解酵 素。 令本酵素作用時可於有利酵素反應進行下設定受質濃 度和溫度、卩Η等即可，受質濃度通常由〇. 1至1G%左右 、溫度為由20至40 °C附近、pH為由6至9附近為令人所 望。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，將含岩藻糖硫酸多釀混合物添加至培養基，並將 具有分解含岩藻糖硫酸多醏-U能力之分解酵素生産能力 的撤生物於此培養基中培養，由培養後之培養基精製亦 可〇使用之微生物若為可生産具有分解含岩藻糖硫酸多 釀-U能力之分解酵素之微生物則為任何徹生物均可，具 體可列舉上述記載之産黃菌屬sp. SA-0082株（CCRC 91G06) -51- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 589320 A 7 B7 _ 五、發明説明（《 ) 或 F u c 〇 i d a η 〇 b a c t e r in a r i n u s S I - 0 0 9 8 株（F E R Μ B P - 5 4 0 3 ) 〇 培養基中添加之營養源若為使用·之菌株可利用，並生 産該分解酵素者卽可，磺源例如可利用岩藻依聚糖、海 藻粉末、藻酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗 糖、麥芽糖、乳糖、澱粉等，氮源以酵母萃取物、蛋白 賺、酪蛋白胺基酸、玉米漿、肉萃取物、脱脂大豆、硫 酸銨、氯化銨等適當。其他將鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、錄 鹽、鋅鹽等無機質、及金屬鹽類棒加亦可。 又，培養條件當然為依使用之菌株、培養基組成等， 將含岩藻糖硫酸多醣-ϋ之分解活性^定成為最大，一般 若於培養溫度為15〜30X：、培養基之ΡΗ為、5〜9，於5〜72 小時之通氣攪拌下進行培養即可。培養終了後，#分+ 化之含岩藻糖硫酸多_-ϋ和培養基中之含岩藻糖硫酸多 醸-F以外之成分以超過濾除去即可。 尚，上述之 Fucoidanobacter marinus SI-0098株為 由青森縣的海水中，由本發明者等人所新檢 株，其薗學性質為如下。 1 . Fucoidanobacter m a r i n u s SI- 0 0 9 8 a.型態性質 ， (1)本菌為短桿菌（短桿薗） 寬 0 · 5〜0 . 7 #隱 長度0 · 5〜0 · 7必m (2 )孢子之有無 無 (3)革蘭氏染色 陰性 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) 格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（η ) b .生理性質 (1) 生長之溫$範圍 於37 °C以上可生長。適當的生長溫度為15〜28 °C。 (2) 對氣之態度 好氧性 (3) 觸酶（catalase) 陽性 (4 )氣化酶 陰性 (5) 脲酶 陰性 (6) 水解 澱粉 陰性 明膠 陰性 酪蛋白 陰性 匕葉樹甘 陽性 (7)硝酸鹽的還原 陰性 (8 ) B引呤之生成 陰性 (9)硫化氣的生成 陽性 (10)牛奶的凝固 陰性 (11)鈉的要求性 陽性 (12>鹽類要求性 於0%食鹽培養基中的生長 陰性 於1%食鹽培養基中的生長 陰性 於海水培養基中的生長 陽性 (1 3 )酲条 甲基萘酲7 (14)菌體内DNA之GC含量 6 1 % (15)細胞壁之二胺基庚二 酸 陰性 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（& ) (16) 乙醇醯試驗 陰性 (17) 羥基脂肪酸的存在 陽性 (18) 0F-試驗 〇 (19) 菌落的色調 不生成待徴性地薗落色素 (20) 蓮動性 有 (21) 滑走性 無 (2 2 )鞭毛 極單毛 本菌株若依據 B e r g e y · s M a II u a 1 〇 f D e t e r m i n a t i v e Bacteriology、第9卷（1994)記載之基本分類則被分類 至第4群（革蘭氏陰性好氣性桿菌及 >球菌）。然而本菌株 於電子傳遞鐽中具有甲基萘酲7,且GC'含暈為61%之方面 與第4群所屬之菌大為不同。基本上革蘭氏陰性細鋪在 電子傳遞鏈中具有泛酲，而革蘭氏陽性細菌具有甲基萦 作為革蘭氏陰性細菌，産黃菌屬及噬纖維菌颶 (Cytophaga)例外地於電子傳遞鏈中具有甲基萦酲，但 屬於此些屬之細薗的GC含量，於土壤細菌Cytophaga arvensicola等 43 〜46% ,海洋細菌 Cytophaga diffluens 、Cytophaga fermentans、Cytophaga »a»rina及 Cytophaga uliginosa為42%,與本菌株之性質完全相異。更且， 將本®株與已鑑定株之16Sr DNA序列之相同性進行比較
時，卽使於相同性最高之已鑑定株VerrucofflicrobiuB spinosum中其相同性為76·6%。由於一般泛知l6Sr DNA 序列之相同性為90%以下時，兩細菌之颶乃為不同，故 -5 4 - 本紙張尺度適用中囷國家標準（CNS )八4*1格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
IT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（〇 )t 本發明者等人斷定本薗株為不颶於既存屬中之新屬細薗 ，依此將本菌株命名為Fucoidanobacter Barinus SI-00980 本發明者等人如前述亦發現在0.6〜3M之1種或2種 以上鹽類存在下，本發明之含岩藻糖硫酸多醏-F與含岩 藻耱硫酸多醣-ϋ對酸性多糖凝集劑顯示出完全不同的舉 動。 例如使用本發明之方法，可由含岩藻糖硫酸多醣混合 液之水溶液中分離本發明之含岩藻糖硫酸多糖-F。 首先在含岩藻糖硫酸多糖混合液之水溶液中添加1種 或2種以上之鹽類並使其總濃度為0.6〜3Μ。添加之鹽 類例如可為氯化鈉、氯化鈣等，並無特別限定。如此調 整鹽濃度後，若將氯化鯨蠘基吡啶等酸性多醏凝集劑以 不會令其再産生沈澱為止地添加，且收集沈澱則可取得 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F。 然而上述鹽濃度若超過2Μ,則因本發明之含岩藻糖硫 酸多釀-F難經由氯化鯨蠟基吡啶形成沈澱，故需要注意 。於分離本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F與含岩藻糖硫酸 多醣-U之目的下，通常以1.5Μ左右之鹽濃度即可達成目 的（參照第1圖之説明）。 其次視需要，將此沈澱洗淨後，沈澱中的氛化鯨蠟基 吡啶以經食鹽飽和之醇洗落，並取得本發明之含岩藻糖 硫酸多醏-F。為了由此所得之本發明之含岩藻糖硫酸多 中除去色素，可在此沈澱溶解後進行超過濾等即可 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 L--- · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（料） 。又若在脱_後冷凍乾燥亦可取得乾燥樣品〇又，於 工程中亦可添加防腐劑等。 本發明者等人如前所述亦發現含岩藻糖硫酸多醣以陰 離子交換樹脂精製時若有2價陽離子共存，則每簞位樹 脂量吸附之含岩藻糖硫酸多醏增加，且含岩藻糖硫酸多 醣之分離變佳。即，使用本發明之方法製造本發明之含 岩藻糖硫酸多_-F時，首先於含岩藻糖硫酸多_混合物 中較佳添加lffl Μ以上作為2價陽離子來源之藥品。其次， 陰離子交換樹脂以含有較佳laM似上2價陽離子之液體 平衡化，並令上述含岩藻糖硫酸多^混合物吸附。此陰 離子交換樹脂以平衡化之液充分洗淨挺，、例如以氯化鈉 梯度令含岩藻糖硫酸多醣-F溶出。使用本方法時，添加 之2價陽離·子濃度若為1®M以上即可。又本方法使用作 為2價陽離子來源之藥品待別以鈣鹽和鋇鹽之效果優異 ► ，但並非特別限定，硫酸鎂、氯化錳等亦可使用。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏-F例如可依實施例8之記 載而取得。以下，示出此含岩藻糖硫酸多醏之理化性質 ，但本發明之含岩藻糖硫酸多醏-F並非被限定於此例。 所得之本發明含岩藻糖硫酸多_ - F之分_子量於使用 Sephacryl S_5〇0之凝膠過濾法計算時，示出約I9萬為 中心之分子量分布（參照第17圖）。尚，於第17圖中，縱 軸為依苯酚-硫酸法測定試料中之糖含量以4 8 0 ηιη吸光度 表示，横軸為表示溶離份编號。 尚，凝膠過濾之條件示於下。 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4現格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（《 ) 柱尺寸：3.08乂162.5公分 溶劑：含有0.2M氯化鈉與含10%乙醇之ΙϋιηΜ磷酸鈉緩 衝液（ΡΗ6 · 0) 流速：1 . 5毫升/分鐘 樣品濃度：〇 . 2 5 % 樣品液量：20毫升 分子量標準物質：Shodex STANDARD Ρ-82(昭和電工 公司製） 其次，分析所得乏本發明含岩藻糖硫酸多糖-F之成分。 首先，依 Journal of Biological Chemistry,第 175 卷、第5 9 5頁（ 1 9 4 8 )之記載定量岩藻糖量。 其次，將所得之含岩藻糖硫酸多醏_ F之乾燥樣品淤1 當量之鹽酸中以0 . 5 %濃度溶解，並於1 1 0°C下處理2小 時，將構成單糖予以水解。其次，將使用Glyco TAG及 Glyco TAG試藥套組（同為寶酒造公司製）水解所得之單 糖的還原性末端予以吡啶基-(2卜胺基化（PA化），以HPLC 調査構成糖的比率。尚，HP LC之條件為如下述。 裝置：L-6200型（日立製作所製）
柱：PERPACK類型Α (4·6ιη»Χ15〇Μΐη:寶酒造公司製） 洗提液：700“硼酸緩衝液（？119.0):乙腈=9:1 檢測：以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製）於激發波 長310η«ι、螢光波長380 nm下檢測 流速：〇 . 3毫升/分鐘 柱溫：6 5 °C -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 _B7___ 五、發明説明（Μ ) 其次：依 A n a 1 y t i c a 1 B i 〇 c h e i s t r y、第 4 卷、第 3 3 0 頁（1962)之記載定量糖醛酸量。 其次，依 Biochemical Jouornal、第 84卷、第 106頁 (1962)之記載定量硫酸含量^ ^ 以上之結果，所得之含岩藻糖硫酸多醣-F之構成糖為 岩藻糖、半乳糖、其莫耳比為約1 0 ·· 1。”實質上不含糖 醛酸及其他之中性糖。又，岩藻糖與硫酸基之莫耳比為 約 1 : 2。 將1%之岩藻依聚糖-F溶液16毫升、與50ηιΜ之磷酸緩 衝液（pH8·0)12毫升與4M之氯化鈉4'毫升與3 2Inu/ml之 前述來自産黃菌屬sp· SA-0082(CCRC'910、fl69)之末端型 岩藻依聚糖分解酵素溶液8毫升混合，並令於2 5°C下反 應4 8小時。經反應無分解物之生成，且亦確認其無低分 子化。 其次，含岩藻糖硫酸多醣-F鈣鹽之IR光譜以傅里葉 (Fourier)變換紅外線分光光度計JIR-DIAMOND 20 (日本 電子公司製）測定時取得第18圖所示之光譜。尚，第18 圖中縱軸表示透過率（％),横軸表示波數（cnr1)。 其次，本發明之含岩藻糖硫酸多糖-F鈣潑之NMR光譜 以500MHZ之核磁共振裝置JNM-a 500型核磁共振裝置（曰 本電子公司製）測定時取得第19圖所示之光譜。 1 第19圖中，縱軸表示訊號強度、橫軸表示化學位移值 (PPra)。尚，於1 H-NMR中之化學位移值為以HOD之化學 位移值視為4 . 6 5ppm表示。 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
IT 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明（β ) 1 H-NHR (D 2 0) 5.30(岩藻糖1位之H)、1.19(岩藻糖5位之CH3之H) 其次，所得之含岩藻糖硫酸多醏-F之冷凍乾燥物的比 旋光度以高速高感度旋光計SEPA-3GG(堀場製作所製）測 定時為-135度。 依據本發明，為提供與本發明之含岩藻糖硫酸多醣-I) 分離，且純化之含岩藻糖硫酸多醣-F。本發明之含岩藻 糖硫酸多醏-F為實質上不含有糖醛酸作為構成糖，且不 經由産黃菌屬sp· SA-0082(CCRC 910069)生産之岩藻依 聚糖分解酵素而低分子化。其分子量、分子量分布、糖 組成若為本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F則無任何限定， 且可調製任意的分子量、分子量分布之含岩藻糖硫酸多 _-F,並可提供糖組成、還原末端等理化性質明確、硫 酸化度極高之含岩藻糖硫酸多W-F。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏-F,因與實質上不具有抗 凝血活性之含岩藻糖硫酸多醸-U分離，故具有強的抗凝 血活性，該含岩藻糖硫酸多醏-F和/或其分解物可以經 純化之含岩藻糖硫酸型式使用作為抗凝血劑，又亦可用 於作為抗含岩藻糖硫酸多醏抗體之抗原。 本發明之含岩藻糖硫酸多醏，其分解物若於癌細胞之 培養液中添加1徹克/毫升以上之濃度，則自添加後1 曰起至數曰使癌細胞引起細胞自滅。即，本發明之含岩 藻糖硫酸多醏、其分解物具有強的細胞自滅誘發作用。 尚，此些物質對於正常細胞不誘發細胞自滅，且亦無毒 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（J ) 性。特別以來自食用褐藻植物、海參之含岩藻糖硫酸多 酷、其分解物之安全性高。 於將本發明之細胞自滅誘發劑予以製劑化中，可將含 岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物作為有效成分，並與公 知之翳藥用載體組合卽可。一般，本發明之含岩藻糖硫酸 多醏和/或其分解物與藥學容許之液狀或固體狀載體配 合，且視需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安 定劑、賦形劑、結合劑、崩散劑、潤滑劑等，並作成錠 劑、穎粒劑、散劑、粉末劑、謬囊劑等之固型劑、通常 之液劑、懸浮劑、乳劑等液劑。又S可作成在使用前經 由添加適當載體而呈液狀之乾燥品。' 、 本發明之細胞自滅誘發劑可為經口劑，或者注射劑、 點滴用劑等之非經口劑之任一種投予均可。 醫藥用載體，可依上述投予型態及劑型而選擇，於經 ► 口劑之情形，可利用例如澱粉、乳糖、白糖、甘露糖醇 、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。又，於經口劑 之調製時，亦可再配合結合劑、崩散劑、界面活性劑、 潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。其 具體例可列舉以下所示物質。 _ <結合劑 > 澱粉、糊精、阿拉伯膠粉末、明膠、羥丙基 澱粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，羥丙基纖維素、 結晶纖維素、乙基纖維素、聚乙烯基毗咯烷酮、聚乙二 醇。 <崩散劑 > 澱粉、羥丙基澱粉、羧甲基纖維素鈉、羧甲 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 討 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（η ) 基纖維素鈣、羧甲基纖維素、低取代羥丙基纖維素。 <界面活性劑 > 月桂基硫酸鈉、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪 酸酯、聚山梨糖醇酯80。 <潤滑劑 > 滑石、蠟類、添加氫之植物油、蔗糖脂肪酸 酯、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋁、聚乙二醇。 <流動性促進劑 > 輕質無水矽酸、乾燥氫氧化鋁膠、合 成矽酸鋁、矽酸鎂。 # 又，經口用之液劑，可作成懸浮液、乳劑、糖漿劑、 s酏劑。於此各種劑型中亦可配合矯味、矯臭劑、著色劑。 另一方面，非經口劑之情形可依常法將本發明之有效 成分含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物溶解或懸浮於 作為稀釋劑之注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶 液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油 、丙二醇、聚乙二醇等，且視需要，可加入殺菌劑、安 定劑、等張化劑、無痛化劑等而調製。 本發明之細胞自滅誘發劑，可依製劑型態以適當的投 予途徑進行投予。投予方法亦無特別限定，可經由内用 、外用及注射。注射劑，例如可投予至靜脈内、肌肉内 、皮下、皮内等，且於外用劑中亦可包含浣腸劑等。 本發明之細胞自滅誘發劑之投予量可依其製劑型態、 投予方法、使用目的及其所適用之患者年齡、體重、症 狀而適當設定、並無一定、一般上為製劑中所含有之有 效成分之量為每成人1天以1〜1G00毫克，較佳為10〜 200毫克。當然投予量為依各種條件而變動，故亦有比 -6 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（h ) 上述投予量還少之量而為充分之情形，或者亦有必需超 過範圍之情形。 若將具有制癌作用之本發明之含岩藻糖硫酸多釀-1)、 含岩藻糖硫酸多醏-F和/或其分解物作為有效成分，並 與公知之醫藥用載體製劑化則可製造制癌劑。制癌劑之 製造可依上述方法為準而進行。一般，本發明之含岩藻 糖硫酸多醣和/或其分解物與藥學容許之液狀或固體狀 載體配合，且視霈要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝 劑、安定劑、賦形劑、結合劑d崩散劑、潤滑劑等，並 作成錠劑、顆粒劑、散劑、粉末劑/膠囊劑等之固型劑 、通常之液劑、懸浮劑、乳劑等液劑 又荠可作成在使 用前經由添加適當載體而呈液狀之乾燥品。 制癌劑可為經口劑，或者注射劑、點滴用劑等之非經 口劑之任一種投予均可。 醫藥用載體，可依上述投予型態及劑型而選擇，且若 以上述之細胞自滅誘發劑之準供使用即可。 制癌劑，可依製劑型態以適當的投予途徑進行投予。 投予方法亦無恃別限定，可經由内用、外用及注射。注 射劑，例如可投予至靜脈内、肌肉内、皮，下、皮内.等， 且於外用劑中亦可包含浣腸劑等。 制癌劑之投予量可依其製劑型態、投予方法、使用目 的及其所適用之患者年齡、體重、症狀而適當設定，雖 然並無一定但一般上為製劑中所含有之有效成分之量為 每成人1天1〜1000毫克，較佳為10〜200毫克。當然投 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 A7 B7 五、發明説明（P ) 予量為依各種條件而變動，故亦有比上述投予量還少之 量而為充分之情形，或者亦有必需超過範圍之情形。本 發明之藥劑除了可就此經口投予以外，亦可添加至任意 之飲食品中令以日常攝取。 若將具有致癌抑制作用之含岩藻糖硫酸多酷和/或其 分解物作為有效成分，並與公知之醫藥用載體製劑化則 可製造致癌預防劑。致癌預防劑之製造可依上述方法為 準而進行〇 —般，含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物與 藥學容許之液狀或固體狀載體配合，且視需要加入溶劑 、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、賦形劑、結合劑 、崩散劑、潤滑劑等，並作成錠劑、顆粒劑、散劑、粉 末劑、_囊劑等之固型劑、通常之液劑、懸浮劑、乳劑 等液劑。又其可作成在使用前經由添加適當載體而呈液 狀之乾燥品。 致癌預防劑可以經口劑，和注射劑、點滴用劑等之非 經口劑之任一種投予均可。 翳藥用載體，可依上逑投予型態及劑型而選擇，且若 以上述之細胞自滅誘發劑為準供使用即可。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 制癌預防劑，可依製劑型態以適當的投予途徑進行投 予。投予方法亦無待別限定，可經由内用、外用及注射 。注射劑，例如可投予至靜脈内、肌肉内、皮下、皮内 等，且於外用劑中亦可包含浣腸劑等。 制癌預防劑之投予量可依其製劑型態、投予方法、使 用目的及其所適用之患者年齡、體重、症狀而適當設定 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（θ 並無一定 成人1天 量為依各 而為充分 明之藥劑 飲食品中 明之含岩 使對鼠經 明之藥劑 疾病、病 健康。又 機構、免 、細胞自 藻植物、 其分解物 之含岩藻 ,雖然 量為每 然投予 少之量 。本發 任意之 本發 質，即 本發 或者癌 劑保持 體防禦 之研究 食用褐 多醣， 所調製 但一般上為製劑中所含有之有效成分之 1〜1 0 0 0毫克，較佳為1 0〜2 0 0毫克。當 種條件而變動，故亦有比上述投予量還 之情形，或者亦有必需超過範圍έ情形 除了可就此經口投予以外，亦可添加至 令以曰常攝取。 藻糖硫酸多醏，其分解物為來自天然物 口投予亦不認為有毒性。 被期待使用作為免疫機能降低或亢進、 毒性疾病等之治療可作為致癌預防 ，本發明之細胞自滅_發方法可用於生 疫機能或者與癌、病毒性疾病等之關傜 滅誘發阻礙劑之開發等。特別地，若由 食用海參，_製本發明之含岩藻糖硫酸 ，因其作為食品已有長的歴史，故由其 糖硫酸多醏、其分解物於經口投予之倩 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 項
頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 醣·原多糖得 多抗酸藻取 { 化善硫岩所 屬 酸改糖含用 菌 硫加藻將作 胞 之.Μ岩僅素單 大 Μ 含，供酵 生 極用將提該。，互 量使要為令物於 子供必，及化屬 分品乃明，子為 。之藥，發素分若 質糖醫等本酵低 ，4-物多為性據之之株-6 之酸作活依解-F® 高硫此血，分 _ 之 極糖就凝解性多用 性藻其抗分擇酸使 全岩將，度選硫所 安含比性程-F糖中 為 ，了 勻某醏藻明 ，次為均行多岩發 中其故，進酸含本 形 ，性.醣硫之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（W )
Alteroaonas)颶細菌，且具有本發明之末端型含岩藻糖 硫酸多醏分解酵素生産能力之薗株則為任何菌株均可。 又，該具有末端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素生産能力 之菌株之具體例可列舉例如互生單胞菌颶sp. SN-1009 株。若令來自該菌株之末端型含岩藻糖硫酸多酷分解酵 素作用於含岩藻糖硫酸多糖，則可取得本發明之含岩藻 糖硫酸多醣-F之低分子化物。 本菌株為由青森縣之海水中由本發明者等人所新檢索 取得之菌株，其菌學性質為如下。
a .型態性質 I
(1 )本菌為桿菌 寬約1 # BI 長度 約2 //粗 (2)孢子之有無 無 (3 )革蘭氏染色性 陰性 b.生理性質 (1)生長之溫度範圍 合適的生長溫度為15〜3G°C。於4°C或40°C下無法生 長〇 (2)對 氣 之態度 好 氣性 (3)觸 酶 陽 性 (4)氣 化 酶 陽 性 (5)脂 酶 陽 性 (6)資 化 性 葡 萄 糖 陽 性 甘 露 糖 陰 性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格Γ2Ϋ〇Ρχ_297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 589320 A7 B7五、發明説明（从） 蔗糖 乳糖 纖維二糖 蜜二糖 甘露糖醇 甘油 甲醇 DL-蘋果酸 琥珀酸 反丁烯二酸 檸檬酸 水楊甘 (7)水解 澱粉 明膠 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陽性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 哼性 陰性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -_ 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (8) 硝酸鹽之還原 陰性 (9) 脱氮反應 陰性 (10) 藻酸之分解 陽性 (11) /8-羥基丁酸之利用 陰性 (12) 聚羥基丁酸之蓄積 陰性 (13) 鈉的要求性 陽性 (14) 鹽類要求性 於0%食鹽培養基中的生長 陰性 於1 %食鹽培養基中的生長 陰性 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ 於海水培養基中之生長 (1 5 )醆条 泛酲8 (16)菌體内DNA之GC含量 陽性 36 % (1 7 ) 〇 F -試驗 (18) 菌Μ之色調 (19) 發光性 (20) 蓮動性 (21) 鞭毛 0 不生成特徴性地菌落色素 陰性 陽性 極單毛 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本薗株被鑑定為 Bergers Manual of Systematic Bacteriology、第 1 卷、第 343〜352H、&Bergey’s M a n u a 1 o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i ο 1 o g y、第 9 卷、第 75頁、第132〜133頁（1994)中所記載之互生單胞薗屬細 菌。然而，本細菌之生理性狀與所記載之任一菌種均無 一致，且GC含量亦為低值。於是，將本菌株命名為互生 單胞菌屬sp · SN- 1 0 0 9。 尚，上述菌株以互生單胞菌屬sp. SN- 1 0 0 9表示，於 通商産業省工業技術院生命工學工業技術研究院〔曰本 莰城縣筑波市東1 丁目1番3號（郵遞编號305)〕中由 平成8年2月13日開始以FERM P-15436寄存，並在前述 通商産業省工業技術院生命工學工業技術研究所中以 FERM BP-5747(於國際寄存之移管申請日：平成8年11 月15日）寄存，且在貴國食品工業發展研究所菌種保存 及研究中心，於1996年12月24日以CCRC第9 10070號寄存 -67 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '訂 589320 A7 B7 五、發明説明（W ) 於本菌株培養基中所加入之營養源若可為使用之菌株 利用，且可産生末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素者即 可，磺源例如可利用含岩藻糖硫酸多醣、海藻粉末、藻 酸、岩藻糖、蕕萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麥芽糖 等，氮源以酵母萃取物、蛋白諫、酪蛋白胺基酸、玉米 漿、肉萃取物、脱脂大豆、硫酸銨、氯化銨等為適當。 其他將鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無機質、及 金屬鹽類添加亦可。 又本菌株在含有上逑營養源之海水或人工海水中生長 地非常良好。 於培養本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之 生産«時，生産量雖依培養條件而變動，但一般於培養 溫度為15 °C〜30 °C，培養基之pH為6〜9為佳，於5〜72 小時之通氣攪拌培養下，本發明之末端型含岩藻糖硫酸 多_分解酵素之生産量到達最高。 培養條件當然依使用之菌株、培養基組成等，將本發 明之末端型含岩藻糖硫酸多賭分解酵素之生産量設定成 為最大。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多_分解酵素在菌體中 存在，亦在培養物上清液中存在。 上述的互生單胞_颶sp. S卜100 9若以適當的培養基 培養，並收集其菌體，以通常所用的細胞破壤手段，例 如以超音波處理等將菌體弄碎，刖可取得無細胞萃取液。 其次，由此萃取液以通常所用之精製手段可取得精製 - 6 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（θ ) 酵素樣品。例如，以鹽析、離子交換柱層析、疏水鍵柱 層析、凝膠過濾等進行精製，可取得不含其他岩藻依聚 糖分解酵素之經純化的本發明之末端型含岩藻糖硫酸多 醣分解酵素。 又，由上逑培養液除去菌體之培養液上清液中因亦大 量存在本酵素，故經由與_體内酵素同樣之精製手段可 將其精製。 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多贿分解酵素之化學及 理化性質為如下。 (i)作用：對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣 ，即含岩藻糖硫酸多醣-F作用，則令該含 岩藻糖硫酸多_ - F被低分子化。 (a )構成糖：實質上不含有糖醛酸。 (b)實質上不經由産黃菌屬（Flavobacteriuffl)sp·SA-0 0 8 2 ( C C R C ίΠ 0 0 6 9 )生産之岩藻依聚糖分解酵素 低分子化。 不對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多醣、即 含岩藻糖硫酸多酷-ϋ作用 (c )構成糖：含有糖醛酸。 (d)經由産黃 g 屬（Flavobacteriiim)sp.SA-0082(CCRC 910069)生産之岩藻依聚糖分解酵素而低分子化， 並生成至少由下述式（I )、 （ I I )、 （ I I I )選出至少 一種以上之化合物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^衣· 訂 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH C Η 2 Ο — S - Ο Μ
OH .70· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
OH 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 經濟部t央樣隼局員工消費合作社中製 五、發明説明（W )
0=3=0 IOH
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71· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T t 589320 A7 _________B7_ ____ 五、發明説明（> ) (ii) 最適PH:本酵素之最適pH為在7〜8附近（第20画）。 卽第20圖為示出本酵素之pH與相對活性之關僳圖，縱 軸表示相對活性（％ )、横軸表示p H。實線為，還原性末 端使用PA化之含岩藻糖硫酸多醣-F(pA-FF)作為受質之 曲線，點線為使用下述（V)-( 2)記載之含岩藻糖硫酸多 _-F作為受質時之曲線。 (iii) 最適溫度：本酵素之最適溫度為在30〜35 °C附 近（第21圖）。 即第21画為示出本酵素之溫度與相對活性之關偽圖， 縱軸表示相對活性（％ )、横軸表示溫度（°C )。實線為， 還原性末端使用使用PA化之含岩藻糖硫酸多醣-F (PA-FF) 作為受質時之曲線、點線為使用下逑（V)-(2)記載之含 岩藻糖硫酸多_-F作為受質時之曲線。 (iv) 分子童：本酵素之分子量，以使用3©?11&〇1：’/：18- 2 0 0 ( PHARMACIA公司製）之凝膠過濾法計算時，為約1〇萬。 (v )酵素活性之測定方法： 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素活性之测 定為如下進行。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 酵至解⑴ 分ί 醣 多 酸 硫 糖--F 0 Ρ 岩及 含 、 型-F 端 ,口 末多 之酸 明硫 發糖 本藻 為岩 作含 ，之 先質 首受 素 逑 下 由 為 製 程 Η 之 含 帶 海 Brc 高 I 身 高製 燥所 乾作 將製 槭 $ 製型 調？ 之彳 物 合 混 _ 多 酸 硫 糖 >·於 藻！！並 岩 帶 海 碎 弄 中 M-醇 機乙 碎 ％ 粉8 由之 自量 以倍 * 5 斤 · 41 公 機 2 良 、 奈°c 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） >89320 A7 —^______-—— 五、發明説明（V) 小時處理後，過濾。殘渣以上逑80%乙醇萃取、過據之 工程再重覆3次，取得乙醇洗淨殘渣1870克❶於殘渣中 加入36公升水，於1〇〇 T處理2小時，並過減可得萃取 液。萃取液之鹽濃度使與4 0 (3 in Μ氣化納溶液相同後，將 5%氱化鯨蠟基吡啶以不會令其再産生沈滕為止地添加 ，並離心分離。此沈澱以80%乙醇重覆洗淨，將氣化嫁 蠛基毗啶完全除去後，溶解於3公升之2 Μ氣化鈉中，將 不溶物以離心分離除去，並懸浮於以2 Μ氣化鈉平衡化之 1〇〇毫升DEAE-Cellulofine Α-800，攪拌後過濾，並除 去樹脂。將此濾液置入以2M氯化鈉平衡化之1〇ϋ-*DEAE-C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0粒中，通過之溶離份以超濂器（過濾 膜之排除分子量10萬）進行脱鹽及低分子除去，此時所 産生之沈澱以離心分離予以除去。將此上清液冷凍乾燥 可得精製高果美海帶含岩藻糖硫酸多醣混合物82.2克。 (2)含岩藻糖硫酸多醣-F之調製 將上逑來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物6 克於600毫升含有0.2M氯化鈣之20bM醋酸鈉（pH6.〇>中溶 解後，置入事先以含有〇·2Μ氣化鈣之20biM醋酸納（ρΗβ ()) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 平衡化之3600毫升DEAE-Sepharose FF柱中，以含有〇·2μ 氛化鈣之20mM醋酸納（PH6.D)充分將柱洗淨後，以〇〜2μ 之氱化鈉梯度令其溶出〇 收集氱化鈉濃度為0·75 Μ以上所溶出之含岩藻糖硫酸 多糖-F溶離份，並以裝有排除分子量10萬超濂膜之超，據 器濃縮脫鹽後冷凍乾燥，可得含岩藻耱硫酸多 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 —^_B7__ 五、發明説明（P ) 凍乾燥樣品3 . 3克。 (3) PA-FF之調製 將上述之含岩藻糖硫酸多_ - F之冷凍乾燥樣品12毫克 溶解於水4 8 0微升中，並以各12微升分注36份後，使用 冷凍乾燥之Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末 端PA化，取得PA-FF。所得之PA-FF，溶解於15毫升含有 1 0 %甲醇之1 0 ffl Μ醋酸銨溶液中，且以C e 1 1 u 1 〇 f i n e G C L-3 0 0柱（4GX 9 0 0 mm)進行凝膠過濾，並收集高分子溶離份 。所得之高分子溶離份以孔徑大小3 5 0 0之透析膜充分透 析並脱鹽，其次以蒸發器濃縮至5毫升可得本發明之末 端型含岩藻糖硫酸多_-F分解酵素之受質用PA-FF。 又，如此處理所得之PA-FF,經由與市售之吡啶基- (2)-胺基化岩藻糖（寶酒造公司製）之螢光強度（激發波長320 nm,螢光波長4Q0nm)|：b較定量為約40nmol。 使用由上述（1 )及（2 )工程所得之含岩藻耱硫酸多醏-F 測定本發明末端型含岩藻糖硫酸多酷分解酵素之活性時 ，以下述要領進行。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 即，將2 . 5 %含岩藻糖硫酸多醏-F溶液1 2微升、與6 微升之1 Μ氯化鈣溶液與1 2徹升之1 Μ氯化鈉溶液、與7 2徹 升50ibM含有醋酸和眯唑和Tris -鹽酸之緩衝液（PH7.5)、 與18徹升之本發明末端型含岩藻糖硫酸多_ _F分解酵素 混合，並於3 0 °C、反應3小時後，反應液以1 0 0 °C處理， 離心分離後，其1 G G微升以Η P L C進行分析，測定低分子 化之程度。 -7 4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) 準備用以溶解本發明末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵 素之緩衝液代替本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分解 酵素並令以同樣條件反應者，及使用水代替含岩藻糖硫 酸多釀-F溶液進行反應者作為對照組，並分別同樣地以 HPLC進行分析。 1單位之酵素，為在上逑反應条中於1分鐘將1# mol 之含岩藻糖硫酸多醏-F之岩藻糖基鍵切斷之酵素量。所 切斷之岩藻糖基鍵之定量為由下逑式算出。 { (12X 2.5)/(100X MF)} X {(MF/M)-1} X {0.12/(180X0.01} = ϋ/ffll
(12X2. 5)/100 •.反應条中添加之含岩藻糖硫酸多醏-F (毫克） MF:受質含岩藻糖硫酸多醣-F之平均分子量 Μ :反應産物之平均分子量 (MF/M)-1: 1分子之含岩藻糖硫酸多醣-F經酵素所切 斷之數目 1 8 〇 :反應時間（分鐘） 0·01:酵素液量（毫升） 〇 · 1 2 ··反應液總量（毫升） 尚，HPLC之條件為如下逑。 裝置：L-6200型（日立製作所製） 柱：OHpak KB-804(8nimX 300mm)(昭和電工公司製） 洗提液：含有51^叠氮化鈉、25“氣化鈣、及5〇1^氣 化鈉之25mM眯唑緩衝液（pH8) 一 75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) l·訂 589320 A7 __ B7 _ 五、發明説明（％ ) 撿測：視差折射率檢測器（S h 〇 d e X R卜7 1、昭和電工 公司製） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 流速：1毫升/分鐘
柱溫：2 5 °C 為了 _定反應産物之平均分子量，將市售已知分子量 之聚三蕕萄糖（STANDARD P-82、昭和電工公司製）以同 上逑之HPLC分析之條件下進行分析，並將聚三蕕萄糖分 子童與OHpak KB-804滯留時間之鼸僳以曲線表示，作為 用以测定上逑酵素反應産物分子量之檫準曲線。 使用由上逑（1)〜（3)工程所得之PA-FF測定本發明末 端型含岩藻糖硫酸多酷酵素之活性時，以下述之要領進 行。 卽，將8pmol/#l之PA-FF溶液2撤升、與5徹升之1M 氣化鈣溶液與10微升之1M氯化鈉溶液、與23微升水、與 50徹升之5DroM含有醋酸和眯唑和Tris -鹽酸之緩衝液（PH 8.2)、與10微升之本發明之末端型含岩藻糖硫酸多醣分 解酵素混合，並於3 0 °C、反應3小時後，反應液以1 〇 〇 °C 處理10分鐘，離心分離後，其80徹升以HPLC進行分析， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 0 1 酵解纟析mo 解分^分A 分 _Fi行 1 _多-F進將 多酸PALC鐘 酸硫替HP分 硫糖代以 1 糖藻水地於 藻岩用樣中 岩含使同条 含型及別應 型端。分反 端末者並述6-末之應 ，上-7 。 明明反組在 度發發件照為 程本本條對 ， 之解替樣為素 化溶代同作酵 子以液以者之 分用衝令應位 低備緩並反單 定準之素行 1 測 素酵進 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ 之含岩藻糖硫酸多醣之岩藻糖基鍵切斷之酵素量。所切 斷之岩藻糖基鍵之定量為由下述式算出。 16X10^ X {(MF/M) - 1} X {1/(180X0.01)) = U / m 1 16X 10·6 :反應条中添加之PA-FF(# mol) MF :受質PA-FF之平均分子量 Μ :反應産物之平均分子量 (MF/ Μ)-1 : 1分子之含岩藻糖硫酸多醣-F經酵素所切 斷之數目 1 8 0 :反應時間（分鐘） 0 · 0 1 ··酵素液量（毫升） 尚，HPLC之條件為如下述。 裝置：L- 6 2 0 0型（日立製作所製） 柱：OHpak SB-803(8fflfflX 300ioin)(昭和電工公司製） 洗提液：含有氮化鈉及10%二甲基亞硪之200«1>1 氣化鈉溶液 檢測：以螢光檢測器F - 1 1 5 0 (日立製作所製）於激發波 長3 2 0 nffi、螢光波長4 0 0 nm下檢測。
流速：1毫升/分鐘 柱溫：5 0 °C 為了测定反應産物之平均分子量，將市售已知分子量 之聚三葡萄糖（STANDARD P-82、昭和電工公司製）使用 Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末端予以PA化 ，取得各種分子量之P A化聚三蕕萄糖。將所得之各種分 子量之PA化聚三葡萄糖以同上述之HP LC分析條件下進行 -7 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
、1T 589320 A7 B7__ 五、發明説明（) 分析，並將聚三®萄糖分子量與〇Hpak SB- 8 0 3滯留時間 之關僳以曲線表示，作為用以測定上逑酵素反應産物分 子量之標準曲線。 蛋白質之定量，為經由測定酵素液之2 80 nm吸光度而 進行。此時1毫克/毫升之蛋白質溶液的吸光度以1·〇 計算。 本發明者等人，如下所述，決定本發明之末端型含岩 藻糖硫酸多醏分解酵素之作用機制。 (1)經由末端型含岩藻耱硫酸多_分解酵素之含岩藻 糖硫酸多醏-F之分解及分解物的諝製 令精製之來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣-F以本 發明之末端型含岩藻糖硫酸多醏分解酵素作用，進行分 解物的調製〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先，進行含岩藻糖硫酸分解酵素之生産。即，將互 生單胞舗羼sp· SN-1009(CCRC 910070)接種至由分注含 有葡萄糖0.25 %、蛋白諫1.0%、酵母萃取物（KD5%之 人工海水（Germaline Laboratory製）ρΗ8·2所組成之培 養基6 0 0毫升並殺菌（120°C、20分鐘）之2公升三角燒瓶 中，並於25 °C下培養26小時作成種培養液。將含有葡萄 糖0.25%、蛋白諫1.0 %、酵素萃取物0.02%、前述之 來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣0.2%、及消泡劑 (信越化學工業製KM70)0.01%之人工海水（Germalin Laboratory製）pH8.0所組成之培養基20公升置入30公升 容量之醱酵缸中並於121TC下殺菌20分鐘。冷卻後，接 -7 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（”） 種以上述之種培養6 G 0毫升，並於2 4 °C下2 4小時，每分 鐘10公升通氣量與每分鐘125轉之攪拌速度之條件下培 養。培養終了後，將培養液離心分離可得麵體及培養上 清液。將所得之培養上清液，以分级分子量1萬之超濾 器濃縮後以8 5 %飽和硫酸銨鹽析，所産生之沈澱以離心 分離收集，並對含有1/10濃度人工海水之20inM Tris -鹽酸緩衝液（P Η 8 . 2 )充分透析，可得6 0 0毫升之粗製酵素。 將如此處理所得之粗製酵素中之40毫升、與人工海水 44毫升、與前述之含岩藻糖硫酸多醣-F 510毫克與水36 毫升混合，並將pH調整至8,於25°C下反應48小時後， 以C e 1 1 u 1 〇 f i n e G C L _ 3 ϋ 0進行凝_過濾，分成4個部份 ，由分子量大量者之順序，定為F-Fd-1(分子量超過25000 )、F-Fd-2(分子量 25000 〜超過 12000)、F-Fd-3(分子量 12000〜超過6500)、及F-Fd-4(分子量65G0以下）。將此 4 4値溶離份脫鹽後冷凍乾燥，各取得乾燥品1 7 0毫克、 270毫克、300毫克、及340毫克。 含岩藻糖硫酸多醣-F之酵素分解物，即低分子化經由 C e 1 1 11 1 〇 f i n e G C L _ 3 0 0凝膠過濾之結果示於第2 2圖 於 圖22中縱軸表示480ηηι之吸光度（依苯酚-硫酸法之呈色 量）、橫軸表示溶離份編號，1溶離份為1 0毫升。柱體 積為1075毫升，洗提液為含有10%甲醇之0.2M醋酸銨溶 液。 第22画中，白圈標記為表示含岩藻糖硫酸多醣_F之酵 素分解物之凝膠過濾結果，黑三角標記為表示酵素分解 -7 9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
、1T 589320 A7 B7 五、發明説明（#) 前之含岩藻糖硫酸多醏-F之凝膠過濾結果。 由上逑之C e 1 1 u 1 〇 f i II e G C L - 3 0 0之結果，可判定本發 明之含岩藻糖硫酸多醏分解酵素之反應産物之分子量分 布為約1000〜3萬左右。 (2)酵素反應産物之還原末端糖及中性糖組成之分析 將上述之 F-Fd-1、 F-Fd-2、 F-Fd-3、及 F-Fd-4之一部 分使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將還原性末端予 以PA化，並將所得之各PA化糖（PA-F-Fd-1)、 （PA-F-Fd-2) 、（P A - F - F d - 3 )及（P A H d - 4 )以 4 當量之鹽酸、1 0 0 °C 處理3小時將其水解，並以HP LC調査還原末端糖。 尚，HPLC之條件為如下述。 裝置：L· - 6 2 0 G型（日立製作所製） 柱：Per Pack類型A (4·6ηιιηΧ 150mm)(寶酒造公司製） 洗提液：7 0 0 m Μ硼酸緩衝液（p Η 9 ):乙腈=9 : 1 檢測：以螢光檢潮器F - 1 1 5 Q (日立製作所製）於激發波 長3 1 0 n m、螢光波長3 8 G η ηι下檢測。
流速：0.3毫升/分鐘 柱溫：65DC 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果，（PA-F-Fd-1)、 （PA-F-Fd-2〉、 （PA~F-Fd-3)及 (P A - F - F d - 4 )之還原末端糖為岩藻糖。 又，F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3及 F-Fd-4之中性糖組成 以下述方法測定。尚，受質所用之含岩藻糖硫酸多醣-F 於硫酸水解後，使用Glyco TAG及Glyco TAG試藥套組將 搆成耱之還原性末端予以PA化，並在相同於上述分析酵 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（79 ) 素反應産物還原性末端時之Η P L C條件下分析時，僅檢測 出岩藻糖與半乳糖，且因其立體配位分別為L·及D，故 關於産物亦僅測定出L-岩藻糖及D-半乳糖。 卽，為了調查構成糖之一之D-半乳糖的含量，使用F-套組，乳糖/半乳糖（百靈佳山之内公司製），依據說明 書構築僅可測定D -半乳糖之反應条，將另外以4當量鹽 酸於 1 G D °C、水解 2 小時之 F - F d - 1、F - F d - 2、F - F d - 3、及 F - F d - 4於中和後，以此反應条測定。 更且，為了定量另一者構成糖之L-岩藻糖，依據 Clinical Chemistry、第 36卷、第 474-476頁（1990)記 載之方法，將另外以4當量鹽酸於1 0 G °C、水解2小時 之 F-Fd-1、F-Fd_2、F-Fd-3、及 F-Fd-4於中和後，以此 反應条測定。 以上結果，L _岩藻糖與D -半乳糖之比例為分別對F - F d - 1 、F-F d- 2、F-Fd-3N 及 F - F d - 4 以約 1 0 0 : 4 4，1 0 0 : 2 7、 10 0: 5¾ 100 : 1 〇 若歸納以上之結果，則可判定本發明之末端型含岩藻 糖硫酸多醴分解酵素，為對含岩藻糖硫酸多醏-F作用並 水解其岩藻糖基鍵，生成分子畺約1000〜3萬左右之低 分子化物，且此低分子化物於分子量大者為半乳糖含童 高〇尚，低分子化物之還原性末端全部為L -岩藻糖。 其次，為了調査本酵素之受質專一性，含岩藻糖硫酸 多_ - ϋ以本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素予以作用。 即，將2 . 5%之含岩藻糖硫酸多酷-1)溶液12微升、與6 一 8 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（和） 徹升之1M氯化鈣溶液與12微升之1M氯化鈉溶液、與72微 升之5Gi«M眯唑緩衝液（pH7 . 5)、與18徹升之本發明之末 端型含岩藻糖硫酸多_分解酵素（1.6mU/rol)混合，並於 3 0 °C反應3小時後，將反應液於1 0 0°C處理1 0分鐘，離 心分離後，其lflQ微升以HPLC進行分析，測定低分子化 之程度。 對照組為準備，以用於瀋解本發明末端型含岩藻糖硫 酸多醏分解酵素之緩衝液代替本發明之末端型含岩藻糖 硫酸多醣分解酵素且令以同樣條件反應者，並同樣地以 Η P L· C進行分析。 尚，HP LC之條件為如下逑。 裝置：L-6200型（日立製作所製） 柱：OHpak KB- 8 0 4(8iHmX 300niffl)(昭和電工公司製） 洗提液：含有5mM蠱氮化鈉、25βιΜ氯化鈣、及50mM氯 化納之2 5 m Μ咪唑緩衝液（p Η 8 ) 檢測：視差折射率檢測器（S h 〇 d e X R I - 7 1、昭和電工 公司製）
流速：1毫升/分鐘 柱溫：2 5 °C 其結果，本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素，完全 無法將含岩藻糖硫酸多醣-U予以低分子化。 如其所述，本發明為關於含有上述之本發明之含岩藻 糖硫酸多醏分解酵素，與鈣源之酵素組成物。 可使用之鈣源，於固型組成物中，可列舉例如氛化鈣 -8 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. -訂 589320 A 7 B7 五、發明説明（以） 、碳酸鈣、醋酸鈣之鈣鹽、氧化鈣、氫氣化鈣、或其水 合物等。另外，於水、乙醇等溶劑中令其溶解、懸浮、 乳化之液狀組成物中，鈣源可為如前述之單體，或者為 經溶解等而呈離子化狀態者亦可。 此些鈣源，因可將該酵素賦活或安定化而為有效。 因此，上述酵素組成物於不阻礙上述鈣源作用效果之 範圍下，亦可依用途含有常用的添加劑。 藉由令本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素作用於含 岩藻糖硫酸多_ - F含有物，則可調製含岩藻糖硫酸多醣 -F之低分子化物。含岩藻糖硫酸多_ -F含有物，例如可 為含岩藻糖硫酸多醣-F精製品、或可為前述之含岩藻糖 硫酸多醏混合物，更且可為褐藻類海藻之水性溶劑萃取 物。含岩藻糖硫酸多_ - F含有物之溶解可於通常之方法 下進行即可，且溶解液中之含岩藻糖硫酸多醣濃度雖以 其最高溶解濃度亦可，但通常以考慮其操作性，酵素力 價而選定為較佳。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 含岩藻糖硫酸多_ - F溶解液可由水、緩衝液等依目的 而選擇即可。溶解液之PH通常為中性，酵素反應通常於 30 °C附近進行。藉由調整酵素量、反應時間等，而可_ 整低分子化物之分子量。 其次將低分子化物進行分子量分級，則可調製更加均 勻之分子最分布之含岩藻糖硫酸多酷-F低分子化物。分 子量分级可應用通常所常使用之方法，例如可使用凝膠 過濾法和分子量分級膜。低分子化物，視需要亦可再進 -83-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（心） 行離子交換樹脂處理、活性碳處理等之精製操作，且可 視需要進行脱鹽處理、無_處理，並藉由冷凍乾燥，亦 可調製本發明之低分子化物之乾燥品。 實施例 以下，列舉實施例，更具體說明本發明，但本發明並 不被此些記載所限定。尚，實施例中之％意指重量％。 實施例1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將高果美海帶充分乾燥後，乾燥物2公斤以自由粉碎 機（奈良機槭製作所製）弄碎，將所得之乾燥粉末懸浮於 9公升之8 0 %乙醇中，並於8 0 °C處理2小時。處理後以 濾紙過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆 3次操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於4 G公升水後 ，於9 5 °C處理2小時，並過濾。殘渣以熱水洗淨，取得 高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醣之萃取液3 6公升。將所 得之萃取液1 . 8公升冷凍乾燥，可得含岩藻糖硫酸多醣 樣品15. 4克。其次於殘餘的萃取液中加入0.4 Μ食鹽，再 將5 %氯化鯨蟠基吡啶以不會令其再産生沈澱為止地添加 並以離心分離收集沈澱。此沈澱於3公升之0 . 4 Μ食鹽水 中懸浮後離心分離，並冼淨。此洗淨操作重覆3次後於 沈澱中加入1公升之4 Μ食鹽水，良好攪拌後將乙醇添加 成8 0 % ,攪拌後以離心分離取得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 % 乙醇中並離心分離之操作重覆至上清液中之2 6 0 ηπι吸光 度成為0為止。此沈澱溶解於2 Μ食鹽水3公升中，且不 溶物以離心分離除去後，添加2Μ食鹽水平衡化之100毫 -84 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 升DEAE-Cellulofine A_800(生化學工業公司製），攪拌 後，加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M食鹽水平衡 化之1)£4£-0611111〇:^1^纟-800柱中，非吸附部分以具備 排除分子量1 〇萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾，並 將著色性物質及食鹽完全除去後，以離心分離及過濾將 不溶性物質除去，並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫 酸多醣混合物之重量為76克。 實施例2 將真海帶充分乾燥後，乾燥物2公斤以自由粉碎機（奈 良機槭製作所製）弄碎，將所得之乾燥粉末懸浮於9公 升之8 0 %乙醇中，並於8 0 °C處理2小時。處理後以濾紙 過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次 操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於4 Q公升水後，於 9 5 °C處理2小時，並過濾。殘渣以熱水洗淨，取得真海 帶之含岩藻糖硫酸多醏之萃取液3 6公升。於所得之萃取 液中加入〇 . 4 Μ食鹽，再將5 %氯化鯨蠟基吡啶以不會令 其再産生沈澱為止地添加並以離心分離收集沈澱。此沈 澱於3公升之0 . 3 Μ食鹽水中懸浮後離心分離，並洗淨。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4 Μ食鹽水 ，良好攪拌後將乙醇添加成8 0 % ,攪拌後以離心分離取 得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇中並離心分離之操作重 覆至上清液中之26ί)ηιη吸光度成為0為止。此沈澱溶解 於2 Μ食鹽水3公升中，且不溶物以離心分離除去後，添 加2Μ食鹽水平衡化之100毫升DEAE-Cellulofine Α-800 - 85 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（私） (生化學工業公司製），攪拌後，加入之樹脂以過濾除去 。將濾液置人食鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A -8 0 0柱中，非吸附部分以具備排除分子量1 0萬以下空心 絲之超濾裝置予以超過濾，並將著色性物質及食鹽完全 除去後，以離心分離及過濾將不溶性物質除去，並冷凍 乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣混合物之重量為5 2 克。 實施例3 真海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物之萃取 將真海帶充分乾燥後，乾燥物2公斤以自由粉碎機（奈 良機械製作所製）弄碎，將所得之乾燥粉末懸浮於9公 升之8 0 %乙醇中，並於8 G °C處理2小時。處理後以濾紙 過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次 操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於36公升之0.2 Μ醋 酸鈣溶液後，於9 5 °C處理2小時，並過濾。殘渣以4公 升之0 . 2 Μ醋酸鈣溶液洗淨，可得真海帶之含岩藻糖硫酸 多醣之萃取液36公升。 實施例4 真海帶之含岩藻糖硫酸多醣混合物之調製 於實施例·所得之濾液中，將5 %氯化鯨蠘基吡啶以 不會令其再産生沈澱為止地添加並以離心分離收集沈澱 。此沈澱於3公升之0 . 3 Μ食鹽水中懸浮後離心分離，並 洗淨。此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之4 Μ 食鹽水，良好攪拌後將乙醇添加成8 0 %，攪拌後以離心 -8 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 589320 A7 B7 五、發明説明（K ) 分離取得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心分 離之操作至上清液中之2 6 0 n ro吸光度成為G為止。此沈 澱溶解於2 Μ食鹽水3公升中，且不溶物以離心分離除去 後，添加2 Μ食鹽水平衡化之1 0 0毫升D E A Ε - C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0 (生化學工業公司製），攪拌後，加入之樹脂以過 濾除去。將濾液置人2 Μ食鹽水平衡化之D E A E - C e 1 1 u 1 〇 f i e A - 8 0 0柱中，非吸附部分以具備排除分子量10萬以下空 心絲之超濾裝置予以超過濾，並將著色性物質及食鹽完 全除去後，以離心分離及過濾將不溶性物質除去，並冷 凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣混合物之重量為 5 2克。又，此含岩藻糖硫酸多_混合物為不含有吸附至 多醣性樹脂之著色性物質。 實施例5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將實施例4記載之含岩藻糖硫酸多醣混合物之冷凍乾 燥物秤量4份各1克，並分別溶解於水，0 . 2 Μ之氯化鈉 、0 . 2 Μ之氣化鈣、0 . 2 Μ之氣化鎂中。其次，準備4根5 0 0 毫升之D E A Ε - S e p h a r 〇 s e F F柱，並於其内2根以0 . 2 Μ之 氛化鈉、1根以〇 . 2 Μ之氣化鈣、1根以0 . 2 Μ之氯化鎂分 別予以平衡化。以0 . 2 Μ氯化鈉平衡化之柱之一者以柱10 倍量之水洗淨。將分別溶解於水、氯化鈉、氯化鈣、氯 化鎂之含岩藻糖硫酸多_混合物分別置入以水、氯化銷 、氣化鈣、氣化鎂分別平衡化之D E A Ε - S e p h a r 〇 s e F F柱 中，分別以平衡化所用之溶液充分洗淨，且其次，以〇 至4 Μ之氣化鈉梯度令其溶出。結果，僅在使用氣化鈣及 一 87 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 氣化鎂之条中吸附有含岩藻糖硫酸多_混合物之總量。 於水及食鹽水平衡化之柱中僅相當G . 4克之含岩藻糖硫 酸多_被吸附。 又，於任一種柱中，均將本發明之含岩藻糖硫酸多醣 - F與含岩藻糖硫酸多_ -U實質上分離。 實施例e 將高果美海帶充分乾燥後，其2公斤以自由粉碎機（奈 良機槭製作所製）弄碎，將所得之乾燥粉末懸浮於9公 升之8 ΰ %乙醇中，並於8 0 °C處理2小時。處理後以濾紙 過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次 操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於36公升之0 . 2 Μ醋 酸鈣溶液後，於9 5 °C處理2小時，並過濾。殘渣以4公 升之醋酸鈣溶液洗淨，可得高果美海帶之含岩藻糖 硫酸多醣之萃取液36公升。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將此濾液以裝有排除分子量1 〇萬超濾膜之超濾器濃縮 至2公升，其次，添加終濃度為1 . 5 Μ之食鹽並將5 %氯 化鯨蠘基吡啶以不會令其再産生沈澱為止地添加。所産 生之沈澱以離心分離予以除去。所得之上清液以超過濾 濃度至1公升，並添加4公升之乙醇，且産生之沈澱以 離心分離予以收集。於此沈澱中添加1 0 0毫升之4 Μ食鹽 水並良好攪拌後將乙醇添加成8 0 %，攪拌後以離心分離 取得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心分離之 操作，至上清液中之2 6 0 n m趿光度為0為[1：。將此沈澱 溶解於2 Μ之食鹽水2公升中，且不溶物以離心分離除去 -88-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 589320 、 A 7 B7 五、發明説明（Π ) 後，添加以2 Μ食鹽水平衡化之5 0毫升D E A E - C e 1 1 u 1 o f i n e A - 8 0 0 (生化學工業公司製），攪拌後，加入之樹脂以過 濾除去。將濾液置入2 Μ食鹽水平衡化之D E A E - C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0柱中，非吸附部分以具備排除分子量1 0萬以下空 心絲之超濾裝置予以超過濾，並將著色性物質及食鹽完 全除去後，以離心分離及過濾將不溶性物質除去，並冷 凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣-U之重量為15克 。又，本發明之此含岩藻糖硫酸多_ -U不含有吸附至多 _性樹脂之著色性物質。 又此含岩藻糖硫酸多醣-ϋ令與前述之末端型岩藻依聚 糖分解酵素作用，則生成上式（I )、 （ I I )、及（I I I )所示 之寡糖。 實施例7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將高果美海帶充分乾燥後，其2公斤以自由粉碎機（奈 良機槭製作所製）弄碎，將所得之乾燥粉末懸浮於9公 升之8 0 %乙醇中，並於8 0 °C處理2小時。處理後以濾紙 過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇洗淨。過濾重覆3次 操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸浮於36公升之0 . 2 Μ醋 酸鈣溶液後，於9 5°C處理2小時，並過濾。殘渣以4公 升之（K 2 Μ醋酸鈣溶液洗淨，取得高果美海帶之含岩藻糖 硫酸多_之萃取液3 6公升。於所得之過濾液中將5 %氯 化鯨蠟基毗啶以不會令其再産生沈澱為止地添加並以離 心分離收集沈澱。此沈澱於3公升之0 . 4 Μ食鹽水中懸浮 後離心分離，並洗淨〇此洗淨操作重覆3次後於沈澱中 -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（# ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 加入1公升之4 Μ食鹽水，良好攪拌後將乙醇添加成8 0 % ，攪拌後以離心分離取得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇 中並重覆離心分離之操作至上清液中之2 6 0 η ϊπ吸光度成 為0為止。此沈澱溶解於2 Μ食鹽水3公升中，且不溶物 以離心分離除去後，添加2Μ食鹽水平衡化之100毫升DEAE -C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0 (生化學工業公司製），攪拌後，加 入之樹脂以過濾除去。將濾液置入2M食鹽水平衡化之 DEAE-Cellulofine A-800柱中，非趿附部分以具備排除 分子量1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾，並將著 色性物質及食鹽完全除去後，以離心分離及過濾將不溶 性物質除去，並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多 _混合物之重量為90克。又，此含岩藻糖硫酸多醏混合 物為不含有吸附至多_性樹脂之著色性物質。稱量此含 岩藻糖硫酸多_混合物之冷凍乾燥物7克，並溶解於0.2 Μ之氯化鉀中。其次，將4 0 0 0毫升之DEAE-Sepharose FF 柱以G . 2 Μ之氯化鈣平衡化。將溶解於G . 2 Μ氯化鈣之含岩 藻糖硫酸多醣混合物置人DEAE-Sepharose FF柱，以0.2Μ 之氯化鈣充分洗淨，且其次，以0〜4 Μ之氯化鈉梯度令其 溶出。收集溶出份之内氯化鈉濃度為0 . 0 5〜0 . 8 Μ之溶離 份並以透析脫鹽後冷凍乾燥，取得實質上與含岩藻糖硫 酸多醣-F分離之含岩藻糖硫酸多_ -U 2 . 1克。 又，收集上述溶出份之内氯化鈉濃度為0 . 9〜1 . 5 Μ之 溶離份並以透析脫鹽後冷凍乾燥，取得實質上與含岩藻 糖硫酸多醣-I)分離之含岩_糖硫酸多醣-F 4.7克。 -90 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（朽） 實施例8 含岩藻糖硫酸多醣-F之製造 秤量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物1 . 2克 ，並於1 . 5 Μ之氯化鈉溶液中以終濃度為0 . 2 %溶解，並 將1 . 25%氱化鯨蠘基毗啶之1 . 5Μ氣化鈉溶液以不會令其 再産生沈澱為止地添加。生成之沈澱以離心分離收集， 且此沈澱於5 0 0毫升之1 . 5Μ食鹽水中懸浮後離心分離， 並洗爭。此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入1公升之 4Μ食鹽水，良好攪拌後將乙醇添加成80 %,攪拌後以離 心分離取得沈澱。此沈澱懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心 分離之操作至上清液中之2 6 0 nm吸光度成為0為止。此 沈澱溶解於2M食鹽水500毫升中，且不溶物以離心分離 除去後，添加2M食鹽水平衡化之1毫升DEAE-Cellulofine A-800(生化學工業公司製），攙拌後，加入之樹脂以過 濾除去。將濾液置入2M食鹽水平衡化之DEAE-Cellulofine A- 8 0 0柱中，非吸附部分以具備排除分子量10萬以下空 心絲之超濾裝置予以超過濾，並將著色性物質及食鹽完 全除去後，以離心分離及過濾將不溶性物質除去，並冷 凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醣-F之重量為710 克〇又，此含岩藻糖硫酸多醣-F為不含有吸附至多醏性 樹脂之著色性物質。又此含岩藻糖硫酸多醣-F為不含糖 醛酸巨以岩藻糖作為構成糖主成分之本發明含岩藻糖硫 酸多醣-F。 實施例9 一 91- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（％ ) 含岩藻糖硫酸多醏-F之酵素性精製方法 粹量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物1 〇克， 並於5 0 0毫升之人工海水中溶解後，添加前逑來自産黃 鐘屬s p . S A - 0 0 8 2 ( C C R C 9 1 0 0 6 9 )之末端型岩藻依聚糖分 解酵素並於°C反應5 G小時。反應液以製備排除分子量 1 0萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾，並將低分子性 物質完全除去後，以離心分離及過濾將不溶性物質除去 ,並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多醏-F之重量 為6克。又，此含岩藻糖硫酸多_ - F為不含有吸附至多 醣性樹脂之著色性物質。又判定此含岩藻糖硫酸多_ - F 為不含糖醛酸，且以岩藻糖作為構成糖主成分之本發明 之含岩藻糖硫酸多醣-F。 實施例1 〇 ' 含岩藻糖硫酸多_ - F之培養性精製方法 秤量實施例7所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物6 Q克， 並於2 0公升之人工海水中溶解後加入蛋白觫2 0 0克與酵 母萃取物4克，並置入3 0公升之發酵缸中並滅菌後，將 前述之産黃«屬sp. SA-0082株（CCRC 910069)植Μ並於 2 5 °C培養2 4小時。將塔養液離心分離除去菌體後，以具 備排除分子鼍1萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾， 將低分子性物質完全除去後，以離心分離及過濾除去不 溶性物質，並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多 _ - F之重景為3 6克。又此含岩藻糖硫酸多醏-F為不含有 吸附至多醏性樹脂之箸色性物質。又判定此含岩藻糖硫 _ 9 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（^ ) 酸多_ - F為不含糖醛酸並以岩藻糖作為構成糖主成分之 本發明之含岩藻糖硫酸多醣-F。 實施例1 1 將實施例7記載之含岩藻糖硫酸多醏混合物之冷凍乾 燥物稱量4份各1克，並分別溶解於水，G . 2 Μ之氯化鈉 、0 . 2 Μ之氯化鈣、0 . 2 Μ之氯化鎂中，其次，準備4根5 0 0 毫升之D E A Ε - S e p h a r 〇 s e F F柱，並於其内2根以0 . 2 Μ之 氯化鈉、1根以〇 . 2 Μ之氣化鈣、1根以G . 2 Μ之氣化纟美分 別予以平衡化。以G . 2 Μ氯化鈉平衡化之柱之一者以柱1 0 倍量之水洗淨〇將分別溶解於水、氣化鈉、氯化鈣、氣 化鎂之含岩藻糖硫酸多醣混合物分別置入以水、氯化鈉 、氯化鈴、氣化分別平衡化之D E A Ε - S e p h a r 〇 s e F F柱 中，分別以平衡化所用之溶液充分洗淨，且其次，以〇 至4 Μ之氯化鈉梯度令其溶出。結果，僅在使用氣化鈣及 氯化鎂之条中吸附置入柱之含岩藻糖硫酸多醣混合物之 總量。於水及食鹽水平衡化之柱中僅相當0 . 4克之含岩 藻糖硫酸多醏被吸附。 又，於任一種柱中，均將本發明之含岩藻糖硫酸多醣 - F與含岩藻糖硫酸多醣-ϋ實質上分離。 實施例〗2 秤最實施例〗記載之含岩藻糖硫酸多醣混合物7克， 並於8 0 ()毫升之（Κ 2 Μ氯化鈣中溶解。其次，4公升之 D E A Ε - S e p h a r> 〇 s e F F柱以0 . 2 Μ之氣化鈣平衡化，並將上 述含岩藻糖硫酸多_溶液全量置入柱中，以8公升之0 . 2 一 93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 、11 589320 A7 B7 五、發明説明（P ) Μ氯化鈣溶液洗淨後，以0至4 Μ之氯化鈉梯度令其溶 出。分別將溶出分内撿測出糖醛酸之溶離份（氯化鈉濃 度約0 . 9 Μ以下：含岩藻糖硫酸多_ - ϋ )、未檢測出耱醛 酸之溶離份（氯化鈉濃度約1 . 2Μ附近：含岩藻糖硫酸多 _ - F )脱鹽後冷凍乾燥，並分別取得1 . 4克及4 . 8克乾燥 品。 實施例1 3 於實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物中，令産 黃菌屬s ρ · S A - 0 0 8 2 ( C C R C 9 1 0 G 6 9 )生産之末端型岩藻依 聚糖分解酵素作用則生成具有下逑構造之寡糖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7
五、發明説明（W 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH 〇
11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^衣· -訂
OH •95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（料）
經濟部中央標準局員工消費合作社印製
on (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
96-
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（％ ) 本發明者等人為進行下述之酵素反應，取得上述寡糖。 即，將2 . 5 %之實施例1之含岩藻糖硫酸多醣混合物 溶液80毫升、和50mM之磷酸緩衝液（pH7 . 5) 6D毫升和4M 之氯化鈉20毫升和32roU/ml之末端型岩藻依聚糖分解酵 素溶液4 0毫升混合，並令於2 5 °C下反應4 8小時。 反應液經Cellulofine GCL-300(生化學工業公司製） 之柱予以分子量分級、並收集分子量2000以下之溶離份 〇 此溶離份以 MICROACILIZER G3 脱鹽後，以 DEAE-Sepharose F F分離出3個溶離份，並再度脱鹽後，冷凍乾燥。如此 處理取得各250毫克、310毫克、52毫克之上述各式（I)、 (II)、 （III)之寡糖。 實施例1 4 將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏混合物1 0克溶解 於0.2M之檸檬酸5 0 0毫升中，將pH調整至2.9後，於100°C 下處理3小時。於此水解物中加入1 5 0毫升1 H之醋酸鈣 溶液，所産生之沈澱以離心分離除去後以Cel lulof ine GCL-25進行凝_過濾予以分子量分級（分子量50()()以上 、5000〜超 3000、 3000〜超 2000、 2000〜超 1000、 1000 〜超5 0 0、5 0 0以下），由分子量大者之順序，命為G F (Ιο 1 i - 1 、 G F d - 01 i - 2 、 G F d - 0 1 i- 3 、 G F d - 0 1 i- 4 、 G F d - 0 1 i - 5 、 及G F d - 0 1 i - 6。將此6部份脱鹽後冷凍乾燥，可分別取 得2 · 3克、1 . 7克、G · 8 8克、1 . 8克、1 · 4克、及0 . 7 2克之 乾燥品。 實施例1 5 一 97 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
、1T 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（朴） 秤量實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣混合物6 0克， 並於2 0公升之人工海水中溶解後加入蛋白臃2 0 0克與酵 母萃取物4克，並置入30公升之發酵缸中並滅菌後，將 前述之産黃菌颶sp. SA-0082株（CCRC 910G69)植菌並於 2 5 °C培養2 4小時。將培養液離心分離除去Μ體後，以具 備排除分子量10萬以下空心絲之超濾裝置予以超過濾， 將低分子性物質完全除去後，以離心分離及過濾除去不 溶性物質，並冷凍乾燥。冷凍乾燥之含岩藻糖硫酸多 醏-F之重量為36克。 實施例1 6 將真海參5公斤解體，除去内贜，並收集體壁。體壁 濕重量每20G克加入500毫升之丙酮，以均質器處理後過 濾，且殘渣以丙酮洗淨至再無著色物質為止。將此殘渣 抽氣乾燥可得140克之乾燥物。於此乾燥物中加入0.4Μ 之食鹽水2 · 8公升，於1 0 Q °C下處理1小時後、過濾、並 將殘渣以0 . 4 Μ食鹽水充分洗淨，取得萃取液3 . 7公升。 於此萃取液中將5 %氯化鯨蠘基吡啶以不會令其再産生 沈澱為止地添加，且生成之沈澱以離心分離收集。此沈 澱於G . 4 Μ之食鹽水中懸浮後再度離心分離，並於所得沈 澱中加入1公升之4 Μ食鹽水，以均質器處理後，一邊攪 拌一邊添加4公升之乙醇，並攪拌]小時後，過濾，取 得沈澱。對此沈澱，將8 G %乙醇懸浮後過濾之工程重覆 至上清液之2 6 G n m吸光度成為0為止。將所得之沈澱懸 浮於2公升之2 Μ食鹽水中，且不溶物以離心分離予以除 -98 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _^^衣· 、11 589320 A7 B7 五、發明説明（W ) 去。上清液以具備排除分子量3萬膜之超濾裝置予以超 過濾，並完全脫鹽後，冷凍乾燥可得3 . 7克之含岩藻糖 硫酸多_。 實施例1 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將檜葉尖（Fucus Vesiculosus)充分乾燥後，乾燥物2 公斤以自由粉碎機（奈良機械製作所製）弄碎，將所得之 乾燥粉末懸浮於9公升之8 0 %乙醇中，並於8 0 °C處理2 小時。處理後以濾紙過濾取得殘渣。此殘渣以上述乙醇 洗淨。過濾重覆3次操作可得乙醇洗淨殘渣。此殘渣懸 浮於4 0公升水後，於1 0 0 °C處理2小時，並過濾。濾液 中加入0 . 5M氯化鈉，再將5 %氯化鯨鱲基吡啶以不會令 其再産生沈澱為止地添加並以離心分離收集沈澱。此沈 澱於3公升之0 . 4 Μ食鹽水中懸浮後離心分離，並洗淨。 此洗淨操作重覆3次後於沈澱中加入2 5 0克之氯化鈉， 並於3公升之乙醇中懸浮，以離心分離取得沈澱。此沈 澱懸浮於8 0 %乙醇中並重覆離心分離之操作至上清液中 之2 6Gn hi吸光度成為0為止。此沈澱溶解於2Μ食鹽水3 公升中，且不溶物以離心分離除去後，添加2 Μ食鹽水平 衡化之1 Q 0毫升D E A Ε - C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0 (生化學工業公 司製），攪拌後，加入之樹脂以過濾除去。將濾液置入 2^1食鹽水平衡化之0£4£-0611111〇£1116纟-800柱中，非吸 附部分以具備排除分子量1 〇萬以下空心絲之超濾裝置予 以超過濾，並將箸色性物質及氛化鈉完全除去後，以離 心分離及過濾將不溶性物質除去，並冷凍乾燥。冷凍乾 -99-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（料） 燥之含岩藻糖硫酸多醣之重量為92克。 實施例1 8 將裙帶菜（Undaria pinnatifida)充分乾燥後，其2公 斤以自由粉碎機（奈良機槭製作所製）弄碎，將所得之乾 燥粉末懸浮於9公升之乙醇中，並於7 5 Ό處理2小時。 處理後以濾紙過濾取得殘渣。對此殘渣添加9公升之8 0 % 乙醇，攪拌，並於8 (3 °C、1小時處理後，以濾紙過濾， 取得殘渣。對此殘渣，以上述之8 0 %乙醇洗淨、過濾之 操作重覆3次，可得乙醇洗淨殘渣190 8克。將此殘渣中 之6 8 4克於9公升之0 . 2 Μ醋酸鈣中懸浮後，於9 5 °C、處 理1小時，靜置2 4小時後取得其上清液。於除去上清液 之沈澱中添加9公升之（3 . 2 Μ醋酸鈣並攪拌，靜置1小時 後取得上清液，與上述之上清液合併。經處處理所得之 上清液以濾紙過濾後，以具備排除分子量1 G，0 G 0空心絲 之超濾裝置予以超過濾，並濃縮至3 5 0毫升。濃縮液以 離心分離，除去沈澱後，一邊添加2ιηΜ之氯化鈉一邊予 以超過濾，將醋酸鈣完全除去後，冷凍乾燥，可得冷凍 乾燥物3 . 2克。冷凍乾燥物中之含岩藻糖硫酸多醣重量 為3 . 1克。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例1 9 (1 )高果美海帶含岩藻糖硫酸多醣混合物之調製 將乾燥高果美海帶2公斤以自由粉碎機Μ _ 2型（奈良機 «製作所製）弄碎，並於4 . 5倍量之8 ϋ %乙醇中80°C，2小時 處理後，過濾。殘渣以上述8 0 %乙醇萃取、過濾之工程 一 1 0 0 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 再重覆3次，取得乙醇取代洗淨殘渣1 8 7 0克。於殘渣中 加入3 6公升水，於1 G G °C處理2小時，並過濾可得萃取 液。萃取液之鹽濃度使與4 0 0 in Μ氯化鈉溶液相同後，將 5 %氯化鯨蠘基吡啶以不會令其再産生沈澱為止地添加 ，並離心分離。此沈澱，以8 0 %乙醇重覆洗淨，將氣化 鯨鱲基吡啶完全除去後，溶解於3公升之2 Μ氯化鈉中， 將不溶物以離心分離除去，並懸浮於以2Μ氯化鈉平衡化 之】0 0毫升D E A Ε - C e 1 1 u 1 〇 f i n e A - 8 0 0，攪拌後過濾，並 除去樹脂。將此濾液置入以2 Μ氯化鈉平衡化之1 G 0毫升 DEAE-Cellulofine A- 8 0 0柱中，通過之溶離份以超濾器 (過濾膜之排除分子量1 G萬）進行脫鹽及低分子除去，此 時所産生之沈澱以離心分離予以除去。將此上清液冷凍 乾燥可得精製高果美海帶含岩藻糖硫酸多_混合物8 2 . 2 克。 (2)含岩藻糖硫酸多醣-F之調製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述來自高果美海帶之含岩藻糖硫酸多_混合物6 克於6 0 0毫升含有Q . 2 Μ氯化鈣之2 Q m Μ醋酸鈉（p Η 6 . 0 )中溶 解後，置入事先以含有〇 . 2 Μ氯化鈣之2 G ro Μ醋酸鈉（p H 6 . 0 ) 平衡化之3 0 0 0毫升I) E A Ε - S e p h a r 〇 s e F F柱中，以含有0 · 2 Μ 氯化鈉之2 G m M醋酸鈉（p Η 6 . G )充分將柱洗淨後，以0〜2 Μ 之氯化銷梯度令其溶出。收集氯化鈉濃度為0 . 7 5Μ以上所 溶出之含岩藻糖硫酸多醣-F溶離份，並以裝有排除分子 鼍1 〇萬超濾膜之超濾器濃縮脫鹽後冷凍乾燥，可得含岩 ?桌糖硫酸多_ - F之冷凍乾燥樣品3. 3克。 -1 0 1 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) (3 )末端型含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之調製 將産黃鋪屬s p . S N - 1 0 0 9 ( C C R C 9 1 0 0 7 0 )，於將含有葡 萄糖0 . 2 5 %、蛋白腺1 . 0 %、酵母萃取物0 . 0 5 %之人工 海水（Germalin Laboratory公司製）pH8.2所組成之培養 基600毫升分注並殺菌（120 °C、20分鐘）之2公升三角燒 瓶中接種，並於2 5 °C下培養2 5小時作成種培養液。將含 有蛋白腺2 G Q克、酵母萃取物4克、及消泡劑（信越化學 工業公司製K Μ 7 0 ) 4毫升之人工海水p Η 8』所組成之培養 基18公升置入3Q公升容量之醱酵缸中並於120 °C下殺_ 2 0分鐘。冷卻後，將另外於1 2 0°C、1 5分鐘殺_之2公 升人工海水中溶解之20克使用實施例8方法調製之來自 高果美海帶之含岩藻糖硫酸多醏-F及上述之種培養液600 毫升接種，並於2 4 °C下2 0小時，每分鐘1 0公升通氣量與 每分鐘2 5 0轉之攪拌速度之條件下培養。培養終了後， 將培養液離心分離可得®體及培養上清液。 培養上清液中之本發明含岩藻糖硫酸多醣分解酵素活 性於使用含岩藻糖硫酸多_ -F作為受質測定時，為 培養液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所得之培養上清液以分級分子量1萬之超濾器濃縮後 ，所産生之沈澱以離心分離予以除去，以8 5 %飽和硫酸 銨鹽析，且産生之沈澱以離心分離予以收集，對含有 1/】〇濃縮人工海水（Germalin 5)之20inM Tris-鹽酸緩衝 液（P Η 8 . 2 )充分透析，可得4 0 0毫升之粗製酵素。 令所得之粗製酵素液吸附至事先以含5 in Μ曼氮化鈉及 一 1 0 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 589320 A7 ______ B7 五、發明説明（^ ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i/lO濃度人工海水（Germalin S)之20mM Tris -鹽酸緩 衝液（？118.2)平衡化之1)£4£-(^11111〇“1^1800(生化學 工業公司製）柱，並將趿附物以相同緩衝液充分洗淨後 ，以相同緩衝液中含有lOOmM、 200mM、 300mM、 400mM、 及6 0 fl ffl M氯化納之溶液予以溶出，並收集活性溶離份。 所得之部分精製酵素之活性於使用含岩藻糖硫酸多醣 - F作為受質測定時，為1〇200ιηϋ(10·2ϋ)。尚，確認無其 他含岩藻耱硫酸多醏分解酵素之混入。 所得之部分精製酵素之一部分經由事先以含有1/10濃 度之人工海水（GeiMnalin S)及5ι»Μ||氮化鈉之10mM Tris - _酸緩衝液（PH8.0)平衡化之Sephacryl S-200進行凝膠 過濾，算出其分子量為約10萬。 (4) 以上逑實施例所得之部分精製酵素及pA-FF分別作為 酵素源及受質，進行影饗本酵素活性之鈣濃度之檢討。 酵素反應中所用之緩衝液為使用含有50“醋酸、眯脞 、及Tris-鹽酸之pH7緩衝液。又，反應液中為令以溶存有 終濃度400ιηΜ之氛化納。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 令反應液中之氣化鈣濃度變化以0〜ΙΟΟηιΜ為止，並測 定酵素活性，取得如第23圖所示之結果。尚，於第23圖 中，縱軸表示相對活性（％),橫軸表示反應液中之鈣濃 度（mM ) 〇 此結果，可判定本酵素於鈣鹽存在下活性顯著提高。 (5) 本發明之末端型含岩藻糖硫酸多_分解酵素一邊以下 述6種緩衝液透析並一邊於5 °C下保持2 0小時後，测定 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（…） 其殘存活性。 1 · 2 0 m Μ T r i s -鹽酸緩衝液（p Η 8 _ 2 ) 2 ·含5 m Μ曼氮化鈉之2 0 in Μ T r i s -鹽酸緩衝液（ρ Η 8 · 2 ) 3·含5niM疊氮化鈉及50ηιΜ氯化鈉之20ιβΜ Tris-鹽酸緩衝 液（PH8 · 2) 4 .含5 hi Μ蠱氮化鈉及5 0 0 ϊβ Μ氯化鈉之2 0 in Μ T r i s _鹽酸緩 衝液（P Η 8 · 2 ) 5 .含5 m Μ璺氮化納、5 0 πι Μ氯化鈉及1 0 ηι Μ氯化鈣之2 0 Bi Μ T r i s -鹽酸緩衝液（ρ Η 8 · 2 ) 6 .含5 m Μ叠氮化鈉及1 / 1 0濃度人工海水（G e r m a 1 i η S )之 2 fl ro Μ T r i s -鹽酸緩衝液（p H 8 2 ) 以上之結果，以1、2及3緩衝液透析之本發明之含岩 藻糖硫酸多醣分解酵素失活性，而以4、5及6緩衝液 透析之本發明之含岩藻糖硫酸多醣分解酵素保持活性。 由此可判定本酵素在5 0 0 Hi Μ氯化鈉存在下或1 G in Μ鈣離 子存在下被安定化。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (6)萍量上述實施例所調製之含岩藻糖硫酸多_ -F 5克 ，並混合47 1毫升之50m Μ眯唑緩衝液（ρΗ8)、12. 5毫升之 4 Μ氣化納、6 . 2 5毫升之4 Μ氯化鈣、及實施例1 9 - ( 3 )所得 之本發明含岩藻糖硫酸多醣分解酵素之部分精製品1 0毫 升（相當6 m U )，且令於2 5 °C下反應1 2 0分鐘取得含岩藻糖 硫酸多_ - F之低分子化物。 所得之低分子化物的Ιϋ及N MR的分析結果分別示於第 2 5圓及第2 6圖。又，以C e 1 1 u 1 〇 f i n e G C L - 3 0 0凝膠過濾 -10 4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（^ ) 時，於第2 4圖中示出所得之結果。即，本物質為以分子 量1000〜30 0 00分布。 又，本物質之硫酸含量以S 0 4 (分子量4 6 )為4 6 %。中 性糖組成為岩藻糖：半乳糖=1 0 0 : 4。 尚，第24圖〜第26圖中之縱軸及橫軸分別與第2圖〜 第4圖同義。 實施例2 0 於含1 Q %之5 6 °C下處理3 0分鐘之牛眙兒血清（J R Η BIOSCIENCE公司）之PRMI 1640培養基（GIBC0公司製）中 3 7 °C下培養之前骨髓性白血病細胞111，60(41(：(：01?1^ 1 9 6 4 )於A S F 1 0 4培養基（味之素公司製）中以5 X 1 0 5個 / 9毫升懸浮。此懸浮液準備9毫升4份，並分別對此 懸浮液，添加1毫升實施例1、1 2、及1 5所得之含岩藻 糖硫酸多醏生理食鹽水溶液（5毫克/毫升）之過濾處理 液〔以孔徑〇.20#m之纖維素醋酸酯膜（KONIC公司製）過 濾者（以下過濾處理為以此條件下進行）〕，並於3 7 °C、 5 %二氧化碳存在下培養4 0小時。培養之細胞經離心分 離而與上清液分離。所得之細胞於含有1 0 m Μ乙二胺四醋 酸鹽及0.5%月桂醯其肌胺酸鈉之50 ϊπΜ Tr> is-鹽酸緩衝液 (P Η 7 . 8 ) 2 0 > 1中懸浮，並添加1 /2 1之1 0毫克/毫升核糖 核酸酶A(SIGMA公司製）於5G°C、30分鐘處理後，添加1 # 1 之1 Q毫克/毫升蛋白酶K並於5 0 °C、處理1小時。將處 理後之細胞作為樣品，使用2 %瓊脂糖凝於1 G 0 V定電壓 下進行電泳此凝_於溴化乙錠溶液中浸漬3 0分鐽後， -1 0 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（μ) 使用超照明裝置確認凝膠中之DNA狀態時，細胞自滅特 有的D N A涕段為被確認。更且為了確認，使用已知作為 誘發細胞自滅試藥之放射舖素D之1 0撤克/毫升溶液代 替上述之含岩藻糖硫酸多醣進行同樣操作時，於培養20 小時下，可確認與含岩藻糖硫酸多醏情形相同之D N A梯 段。 因此結果，可得知H L - 6 0細胞為經實施例1、1 2、及1 5 所得之含岩藻糖硫酸多醣而誘發細胞自滅。 使用H L - 6 0 ( A T C C C C L - 2 4 0 )，實施例1、1 2及1 5所得之 各含岩藻糖硫酸多_溶液〔以5毫克/毫升溶解於含有 1 2 0 m Μ氯化鈉之3 0 nr Μ Η E P E S緩衝液（P Η 7 · 2 )中，並於1 2 1 °C 、壓熱滅M20分鐘處理者〕之細胞自滅誘發作用依上述 為準測定，取得同樣之結果。 實施例2 1 於含1 〇 %之5 6 °C下處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η Β I 0 S C I E N C Ε公司）之P R Μ I 1 6 4 0培養基（G I B C 0公司製）中 3 7 °C下培養之前骨髓性白血病細胞H L - 6 0 ( A T C C C C L - 2 4 0 )於A S F 1 0 4培養基（味之素公司製）中以5 X 1 0 5個 / 9毫升懸浮。對此懸浮液9毫升，添加1毫升實施 例〗5所得之含岩藻糖硫酸多醣生理食鹽水溶液（5毫克 /毫升）之過濾處理液，並於3 7 °C、5 %二氧化磺存在下 培養2 ϋ小時。培養之細胞經離心分離而與上清液分離。 所得之細胞依「細胞自滅實驗手則」（秀潤社、四沼靖 -監修、第93〜95頁、1 9 9 5年〕進行吉薩姆染色。即所 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂 589320
A7 B7____^___ 五、發明説明（ϊ<?> ) 得之細胞使用卡諾亞固定液（醋酸：甲醇=1 : 3 )固定於 切Η玻璃上，並使用吉薩姆色素（MERCK公司製）染色， 以光學顯微鏡觀察細胞自滅特有核之片斷化。由此結果 可判定HL-60細胞為經由實施例15所得之含岩藻糖硫酸 多_而引起細胞自滅。 實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣溶液〔以5毫克/ 毫升，溶解於含120ιηΜ氱化納之30diM HEPES緩衝液（PH 7. 2)中，並於121汜、壓熱滅菌處理20分鐘者〕之細胞 自滅誘發作用為依上述為準測定，取得同樣之結果。 實施例2 2 於含10%之56 °C下處理30分鐘之牛胎兒血清（JRH BIOSCIENCE公司）之PRMI 1640培養基（GIBC0公司製）中 37°C下培養之前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CCL~ 240)於ASF 104培養基（味之素公司製）中以5x105個 / 4 · 5毫升懸浮。此懸浮液準備4份4 · 5毫升，並分別對 此懸浮液，添加0 . 5毫升含有實施例1、1 5、及1 8所得之 含岩藻糖硫酸多醣溶液〔以1 0毫克/毫升溶解於含有1 2 0 mM氣化鈉之30mM HEPES緩衝液（ΡΗ7·2)中，並於121°C、 壓熱滅_處理20分鐘者〕及120mM氣化鈉之30biM HEPES (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} Φ 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 時 〇 、 小圖 C ο 7 °c4 2 37及第 於時於 並小示 4 释 ， 2 男 液後結 衝始其 緩開 中 養gfo液 培 Ϊ一« 於01® 細抱 ，测肪 養W細 培 fL-rfe法 Η 在¢3 Μ #_ 一不 WM表 矹盼為 台圖 以27 後第 例 施 實 將 氣 二 % 毫 ii 以 醏 多 酸 硫 糖 藻 岩 含 之 得 所 8 1X 及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（—） 克/毫升添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關 偽圖，橫軸表示培養時間（時間）、縱軸表示培養液中之 生細胞數（Χίο5個/ 5毫升第27圖中，培養基中添 加之含岩藻糖硫酸多醏種類為，口標記為表示無添加（ 對照）、十標記為實施例1、 •標記為實施例1 5、X標記 為實施例18所得之含岩藻糖硫酸多醣。 又，此時之死細胞顯示出細胞縮小及片斷化等細胞自 滅所特有之型態。即，由此些結果，可判定H L - 6 0細胞 經由實施例U I 5、及1 8所得之含岩藻糖硫酸多醏而誘 發細胞自滅且細胞増殖被顯箸抑制。 實施例1、1 5、及1 8所得之各含岩藻糖硫酸多醣溶液 〔以1 〇毫克/毫升溶解於含有1 2 0 in Μ氯化鈉之3 0 m Μ Η E P E S 緩衝液（ΡΗ7 . 2)中，並以過濾處理者〕之細胞自滅誘發 作用依上述為準測定，取得同樣之結果。 實施例2 3 於含1 0 %之5 6 °C下處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η Β I 0 S C I E N C Ε公司）之P R Μ I 1 6 4 0培養基（G I B C 0公司製）9 毫升中將急性淋巴芽球性白血病細胞_1^-3以1(：(：01^-1 5 5 2 )以5 X 1 0 s個/ 9毫升懸浮。此懸浮液9毫升5份 ，並分別添加1毫升實施例1、2、1 2、及1 6所得之含岩 藻糖硫酸多醣生理食鹽水溶液（5毫克/毫升）之過濾處 理液，並於3 7 °C、5 %二氧化碩存在下培養6 G小時。培 養之細胞經離心分離而與上清液分離。所得之細胞懸浮 於含有1 0 m Μ乙二胺四醋酸鹽及0 . 5 %月桂醯基肌胺酸鈉 -1 0 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7___ 五、發明説明（W ) 之50raM Tris -鹽酸緩衝液（ρΗ7·8)20#1中，並添加1卢1 之10毫克/毫升之核糖核酸酶A(SIGMA公司製），於50°c 處理30分鐘後，添加1#1之毫克/毫升之蛋白酶κ， 於5 0 °C處理1小時。將處理後之細胞作為樣品，使用2 % 瓊脂糖凝_於1 β 〇 v定電壓下進行電泳。此凝膠於溴化乙 錠溶液中浸漬30分鐘後，使用超照明裝置確認凝膠中之 DNA狀態時，細胞自滅特有的DNA梯段為被確認。更且為 了確認，使用已知作為誘發細胞自滅試藥之放射菌素D 之1 0毫克/毫升溶液代替上述之含岩藻糖硫酸多_進行 同樣操作時，於培養2 0小時下，可確認與含岩藻糖硫酸 多醣情形相同之DN A梯段。 由此結果可判定實施例1、2、1 2、及1 6所得之含岩藻 糖硫酸多醣對Μ 0 L T - 3細胞誘發細胞自滅。 實施例1、2、1 2及1 6所得之含岩藻糖硫酸多醣溶液〔 以5毫克/毫升溶解於P B S (將8克氣化鈉、〇 · 2克氯化評 、2. 9克磷酸氫二鈉12水合物、及〇·2克磷酸二氫鉀溶解 於1公升水中），並於1 2 1 °C '壓熱滅@處理2 〇分鐘者〕 之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取得同樣& @ ° 實施例2 4 於含1 〇 %之5 6 °C下處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J β Η BIOSCIENCE公司）之PRMI 1640培養基（GIBC0公司製）中 3 7 °C下培養之人類急性淋巴芽球性白血病細胞Μ I 3 (A T C C C R L - 1 5 5 2 )，於 R Ρ Μ I 1 6 4 0 培養基中以 5 X 1 3 個 /毫升懸浮，並在F A L C 0 N公司製之2 4孔口平板上之名^ # -1 09- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---^---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 口分注1 . 8毫升。對各懸浮液，各添加0 . 2毫升之以0 . 5 毫克/毫升溶解於P B S後過濾滅鋪之實施例1所得之含 岩藻糖硫酸多醣混合物、實施例1 2所得之含岩藻耱硫酸 多_ - F、實施例1 5及1 7所得之含岩藻糖硫酸多_，及葡 萄糖硫酸（分子量5 0萬，和光純藥公司製）之溶液，並於 3 7 °C、5 %二氧化磺存在下培養。尚，僅將P B S同量添加 者作為對照組，並同樣地培養。培養開始2日、4日、6曰 、8日後之生細胞數依台盼籃染色法計測。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果示於第2 8圖。即第2 8圖表示於Μ 0 L T - 3細胞培養 液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所 得之含岩藻糖硫酸多_ - F、實施例1 5及1 7所得之含岩藻 糖硫酸多醣、及葡聚糖硫酸以0.5毫克/毫升添加時之 培養時間與培養液中之生細胞數之關僳圖，橫軸表示培 養時間（日），縱軸表示培養液中之生細胞數（Χ104個 / 2毫升）。第2 8圖中，於培養基中添加之硫酸化多_種 類為，Ο標記為表示無添加（對照）、·標記為實施例1 2 所得之含岩藻糖硫酸多醏-F、口標記為實施例1所得之 含岩藻糖硫酸多醣、△標記為實施例1 7所得之含岩藻糖 硫酸多醏、標記為實施例15所得之含岩藻糖硫酸多_ 、葡聚糖硫酸為顯示出與實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸 多醣之情形為實質上相同曲線。 又，此時之死細胞顯示出細胞縮小及片斷化等細胞自 滅所特有之型態。即，由此些結果，可判定Μ 0 L Τ - 3細胞 經由實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所得 -1 1 0-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（^) 之含岩藻糖硫酸多醏-F、實施例1 5及1 7所得之含岩藻糖 硫酸多釀，及葡聚糖硫酸而誘發細胞自滅且細胞增殖被 顯箸抑制。 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣、實施例1 2所得之 含岩藻糖多醣-F、實施例1 5及1 7所得之含岩藻糖硫酸多 _、及葡聚糖硫酸（分子量50萬，和光純藥公司製）之各 溶液（以〇 . 5毫克/毫升溶解於P B S後，於1 2 1 °C、壓熱滅 _處理20分鐘者）之細胞自滅誘發作用依上述為準測定， 取得同樣之結果。 實施例2 5 於含1 0 %之5 6 °C下處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η BIO SCIENCE公司）之PRMI 1640培養基（GIBC0公司製）中 37°C下培養之前骨髓性白血病細胞HL-60 (ATCC CCL -2 4 0)於众3?104培養基（味之素公司製）中以5父104個 / 9毫升懸浮。此懸浮液準備9毫升4份，並對各懸 浮液，添加1 0 〇 # 1生理食鹽水、及實施例1所得之含岩 藻糖硫酸多醣樣品、F-Fd-Ι〜F-Fd-4、及實施例13所得 之3種含岩藻糖硫酸寡糖之各生理食鹽水溶液（10毫克 /毫升）之過濾處理液，並於3 7 °C、5 %二氣化磺存在下 培養4 G分鐘。培養之細胞以顯微鏡觀察，調査增殖程度 及細胞型態。 其結果，添加含岩藻糖硫酸多醣樣品、F-Fd-Ι〜F-Fd - 4 及3種含岩藻糖硫酸寡糖之HL-60細胞全部呈現出細胞 縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徽。又，添加生理食 -1 1 1 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（、〜） 鹽水之H L· - 6 Q細胞其細胞數為增加約4倍，但添加含岩 藻糖硫酸多醣樣品、F - F d - 1〜F H 4及3種含岩藻糖硫 酸寡糖之HL-6Q細胞其細胞數完全無增加至為1/1 Q以下 為止，可判定經由此些含岩藻糖硫酸多醣樣品、F - F d - 1 〜F - F d - 4及3種含岩藻糖硫酸寡糖之細胞自滅誘發作用 抑制H L - 6 G細胞之增殖。 更且為了確認，使用已知作為誘發細胞自滅試藥之放 射舖素D之1 0撤克/毫升溶液代替上述之含岩藻糖硫酸 寡糖進行同樣操作時，於培養2 G小時下，可看見如含岩 藻糖硫酸寡糖之情形相同的細胞縮小及細胞片斷化。由 此結果可得知H L - 6 0細胞經實施例1所得之含岩藻糖硫 酸多醣樣品、F - F d - 1〜F - F d - 4及實施例1 3所得之含岩藻 糖硫酸寡糖而誘發細胞自滅。 實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、F - F d - 1〜 F - F d - 4及實施例1 3所得之3種含岩藻糖硫酸寡糖之各溶 液〔以10毫克/毫升溶解於含有120m Μ氯化鈉之30m Μ Η E P E S緩衝液（ρ Η 7 )，於1 2 1 °C、壓熱滅菌處理2 0分鐘者〕 之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取得同樣之結果。 實施例2 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將肺癌細胞A - 5 4 9 ( A T C C C C L -】8 5 )、S V 4 0轉形之肺細 胞 W I - 3 8 V A 】3 U T C C C C 7 5 · 1 )、、及肝癌細胞 H e p G 2 ( A T C C Η B - 8 0 6 5 )以各1 0 4個/毫升，懸浮至含1 0 % 5 6 °C、處理 3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η B I 0 S C 1 E N C E )之P R Μ I 1 6 4 0培 養基中。將此懸浮液分注1 . 8毫升，並對各懸浮液，各 -112-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（’"） 癌細胞中添加2 0 G 1之生理食鹽水、及實施例1及1 5所 得之含岩藻糖硫酸多_，及實施例1 4所得之6種含岩藻 糖硫酸寡糖之各生理食鹽水溶液（1毫克/毫升）之過濾 處理液，並於3 7 °C，5 %二氧化磺存在下培養6天。培 養之細胞以顯徹鏡觀察，調査增殖程度及細胞型態。 其結果添加實施例1及1 5所得之含岩藻糖硫酸多_， 及實施例1 4所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖中分子量2 0 0 0 以上之3溶離份的肝癌細胞A - 5 4 9、S V 4 G轉形之肺細胞 W I - 3 8 V A 1 3，及肝癌細胞H e p G 2全部呈現細胞縮小及細胞 片斷化等之細胞自滅特徴。又，添加生理食鹽水之各癌 細胞其細胞數顯著增加，但添加實施例1及1 5所得之含 岩藻糖硫酸多醏、及實施例1 4所得之6種含岩藻糖硫酸 寡糖中分子量2 0 0 G以上3分劃之各種癌細胞細胞數減少 ，可判定經由此些含岩藻糖硫酸多醏及寡糖之細胞自滅 誘發作用可抑制各種癌細胞之增殖。 實施例1及15所得之含岩藻糖硫酸多酷，及實施例14 所得之6種含岩藻糖硫酸寡糖之各P B S溶液（1毫克/毫 升）之121 °C、20分鐘壓熱滅«處理物之細胞自滅誘發作 用依上述為準測定，取得同樣之結果。 寊施例2 7 將結腸癌細胞H C T 1 1 6 ( A T C C C C L - 2 4 7 )、及胃癌細胞 A G S ( A T C C C R L _ 1 7 3 9 )各以1 0 4個/ 1 . 8毫升，分別懸浮 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η Β I 0 S C I E N C Ε )之 M c C 〇 y ’ s 5 a 培養基（G I B C 0 公司製）、H a m ’ s -113- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) φ. 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（ F 12培養基（GIBC0公司製）。將此懸浮液分注1.8毫升， 並對各懸浮液，各癌細胞中添加2 0 G a 1之生理食鹽水、 及實施例1 、1 2、及1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣及F - F d - 1 〜F-Fd-4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之各生理食鹽水溶液 (1 〇毫克/毫升）之過濾處理液，並於3 7 °C , 5 %二氧化 磺存在下培養4 8小時。培養之細胞以顯微鏡觀察，調査 增殖程度及細胞型態。 其結果添加實施例1 、12及15所得之含岩藻糖硫酸多 _&F-Fd-1〜F-Fd-4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之結腸癌 細胞HCT 116及胄癌細胞AGS全部呈現細胞縮小及細胞Η 斷化等之細胞自滅特徵。又，添加生理食鹽水之各種癌 細胞其細胞數顯箸增加，但添加實施例1、12及15所得 之含岩藻糖硫酸多醏及 F-Fd-l〜F-Fd-4之4種含岩藻 糖硫酸寡糖之各種癌細胞細胞數減少，可判定經由此些 含岩藻糖硫酸多_及寡糖之細胞自滅誘發作用可控制各 種癌細胞之增殖。 實施例1、1 2、及1 5所得之各含岩藻糖硫酸多醣及 F - F d - 1〜F - F d - 4之4種含岩藻糖硫酸寡糖之各P B S溶液 (10毫克/毫升）之121 °C、20分鐘壓熱滅菌處理物之細 胞自滅誘發作用依上述為準，取得同樣之結果。 實施例2 8 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 G分鐘之牛胎兒血清（J R Η B10SCIENCE公司）之McCoy's 5a培養基（GIBC0公司製）中 3 7 °C下培養之人類結腸癌細胞H C T 1 1 6，於M c C 〇〆s 5 a -11 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） I!---„------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 培養基中以5 X 1 0 3痼/毫升懸浮，並在F A L C 0 N公司製 之2 4孔口平板上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液， 添加〇 . 2毫升溶解於P B S之1 0毫克/毫升實施例1所得之 含岩藻糖硫酸多醣樣品、含岩藻糖硫酸多醣混合物、實 施例12所得之含岩藻糖硫酸多醴-F、含岩藻糖硫酸多醣 -U、 F-Fd-1、 F-Fd-2、 F-Fd-3、及 F-Fd-4、賁施例 15所 得之含岩藻糖硫酸多釀之各溶液、及溶解於PBS之5毫克 /毫升肝素（和光純藥公司製）及葡聚糖硫酸（分子量50 萬、和光純藥公司製）於121 °C、20分鐘壓熱滅菌處理物 ，並於3 7 °C、5 %二氣化碳存在下培養。尚，僅將P B S同 量添加者作為對照組，並同樣地培養。培養開始1日、 2曰、3日、4日後之生細胞數依「組織培養之技術」 (第2販）（朝倉出版、日本組織培養學會編、1990年）） 記載之方法（第2 6〜2 8頁）計測。即，以血球計算板上之 台盼籃染色之方法計測。 所得之結果示於第29圖。即第29圖表示於HCT 116細胞 培養液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多_樣品、實 施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏混合物、實施例1 2所得 之含岩藻糖硫酸多醏-U及含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-l、 F - F d - 2、F - F d - 3、及F - F d - 4、及實施例1 5所得之含岩藻 糖硫酸多_以1毫克/毫升，及將肝素及葡聚糖硫酸以 〇 . 5毫克/毫升添加時之培養時間與培養液中之生細胞 數之關偽圖，橫軸表示培養時間（日）、縱軸表示培養液 中之生細胞數（X 1 0 4個/ 2毫升），第2 9圖中，於培養 -1 1 5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 589320 A7 B7 五、發明説明（，# ) 基中添加之含岩藻糖硫酸多_或寡糖之種類為，〇標記 為無添加（對照）、♦標記為實施例1所得之含岩藻糖硫 酸多醣樣品、標記為實施例1所得之含岩藻糖硫酸多 醣混合物。實施例12所得之含岩藻糖硫酸多賭-U及含岩 藻糖硫酸多醣-F、 F-Fd-1、 F-Fd-2、 F-Fd-3、及 F_Fd-4、 、及實施例15所得之含岩藻糖硫酸多_為與實施例1所 得之含岩藻糖硫酸多酷混合物之情形為實質上相同曲線。 其結果添加PBS之HCT 116細胞其細胞數為顯著增加， 但添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品、含岩藻 糖硫酸多_混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸多醣 - F、含岩藻糖硫酸多醣-U、F-Fd-1、F-Fd-2、F-Fd-3、 及卜Fd-4、實施例15所得之含岩藻糖硫酸多_，肝素、 及葡聚糖硫酸之HCT 11 6細胞其細胞數幾乎無增加，或 者減少。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多_樣品、含 岩藻糖硫酸多醏混合物、實施例1 2所得之含岩藻糖硫酸 多醣-F、含岩藻糖硫酸多醏-11、卜Fd-1、F-Fd-2、F-Fd -3、及F - F d - 4、實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多醣、肝 素、及葡聚糖硫酸之HCT 116細胞全部呈現細胞縮小及 細胞片斷化等之細胞自滅特擻。 PJ1，可判定經由此呰含岩藻糖硫酸多醣及寡糖、肝素 ，及葡聚糖硫酸之細胞自滅誘發作用可抑制HCT 116細胞 之增殖。 於P B S中溶解1 0毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻 糖硫酸多_樣品、含岩藻糖硫酸多醏混合物、實施例12 - 1 1 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) 所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、含岩藻糖硫酸多_ - u、 F - F d - 1、F - F d - 2、F - F d - 3、及 F - F d - 4、實施例 1 5 所得之 含岩藻糖硫酸多醏之各溶液之過濾處理液，及於P B S中 溶解5毫克/毫升之肝素、及葡聚糖硫酸之各過濾處理 液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取得同樣之結 果。 實施例2 9 於含1 G % 5 6 °C、處理3 G分鐘之牛胎兒血清（J R Η BIOSCIENCE公司）之McCoy's 5a培養基（GIBC0公司製）中 3 7 °C下培養之人類結腸癌細胞H C T 1 1 6，於M c C 〇 f s 5 a 培養基中以5 X 1 0 3個/毫升懸浮，並在F A L C 0 N公司製 之2 4孔口平板上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液， 添加0.2毫升溶解於PBS之2G毫克/毫升、30毫克/毫升 、及50毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣 樣品溶液於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅_處理物，並於3 7 °C ，5 %二氣化磺存在下培養。尚，僅將P B S同量添加者作 為對照組，並同樣地培養。培養開始後經時性之生細胞 數依「組織培養之技術」（第2販）（朝倉出販、日本組 織培養學會編、1 9 9 ϋ年）記載之方法（第2 6〜2 8頁）計測 。即，以血球計算板上之台盼藍染色之方法計測。 其結果示於第30圖。即第30圖表示於HCT 116細胞培 養液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種 濃度添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關偽圖 ，橫軸表示培養時間（時間）、縱軸表示培養液中之生細 -1 1 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 589320 A7 B7 五、發明説明（4 ) 胞數（X104個/毫升）。第30圖中，於培養基中之含岩 藻糖硫酸多醣樣品之添加量為，Ο標記為無添加（對照） 、參標記為2毫克/毫升、標記為3毫克/毫升、黑 三角標記為5毫克/毫升。 其結果添加PBS之HCT 116細胞其細胞數為顯著增加， 但添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏樣品之H C T 11 6 細胞其細胞數減少。 又，添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多酷樣品之H C Τ 1 1 6細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特 徽。 即，可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品至 少於2毫克/毫升之濃度下對H C Τ 1 1 6細胞具有細胞自 滅誘發作用，並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液之 過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取得 同樣之結果。 實施例3 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 0分鐘之牛眙兒血清（J R Η BIOSCIENCE公司）之HanTs F12培養基（GIBC0公司製）中 37°C下培養之人類胃癌細胞AGS ,於HaiTs F12培養基 中以5X103個/毫升懸浮，並在FALCON公司製之24孔 口平板上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液，添加0 . 2 毫升溶解於PBS之20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50 -1 18-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶 液於1 2 1 °C、2 0分鐘壓熱滅菌處理物，並於3 7°C、5 %二 氧化磺存在下培養。尚，僅將P B S同量添加者作為對照 組，並同樣地培養。培養開始後經時性之生細胞數依 「組織培養之技術」（第2販）（朝倉出販、日本組織培 養學會編、1 9 9 0年）記載之方法（第26〜28頁）計測 即 ，以血球計算板上之台盼籃染色之方法計測。 其結果示於第3 1圖。即第3 1圖表示於A G S細胞培養液 中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃度 添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關偽圖，橫 軸表示培養時間（時間）、縱軸表示培養液中之生細胞數 (X 1 0 4個/ 2毫升）。第3 1圖中，於培養基中之含岩藻 糖硫酸多醏樣品之添加量為，Ο檫記為無添加（對照）、 泰標記為2毫克/毫升、標記為3毫克/毫升、黑三 角標記為5毫克/毫升。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果添加PBS之AGS細胞其細胞數為顯著增加，但 將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以終濃度3毫 克/毫升以上添加之A G S細胞其細胞數減少，且添加2 毫克/毫升者亦顯箸抑制細胞增殖。 又，添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之A G S 細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徽。 即，可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品至 少於2毫克/毫升之濃度下對AGS細胞具有細胞自滅誘 發作用，並可抑制細胞增殖。 -1 1 9一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 於PBS中溶解20毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏樣品溶液 之過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取 得同樣之結果。 實施例3 1 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η BIOSCIENCE公司）之L-15培養基（GIBC0公司製）中37°C下 培養之人類結腸癌細胞SW 48MATCC CCL-228),於L-15 培養基中以5X103値/毫升懸浮，並在FALC0H公司製 之2 4孔口平板上之各孔口分注1 . 8毫升。對各懸浮液， 添加0.2毫升溶解於PBS之10毫克/毫升、30毫克/毫升 、及50毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣 樣品溶液於121°C、20分鐘壓熱滅菌處理物，並於37°C ，5 %二氣化磺存在下培養。尚，僅將P B S同量添加者作 為對照組，並同樣地培養。培養開始後經時性之生細胞 數依「組織培養之技術」（第2販）（朝倉出販、日本組 織培養學會編、1990年）記載之方法（第26〜28頁）計測 。即，以血球計算板上之台盼籃染色之方法計測。 其結果示於第32圖。即第32園表示於SW 480細胞培養 液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃 度添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關傺圖， 橫軸表示培養時間（時間）、縱軸表示培養液中之生細胞 數（X 1 0 4個/毫升）。第3 2圖中，於培養基中之含岩藻 糖硫酸多_樣品之添加量為，Ο標記為無添加（對照）、 -1 2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（"Μ •標記為1毫克/毫升、檫記為3毫克/毫升、黑三 角標記為5毫克/毫升。 其結果添加PBS之SW 4 8 0細胞其細胞數為顯著增加， 但將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多_樣品以終濃度3 毫克/毫升以上添加之SW 4 8 0細胞其細胞數減少，且添 加1毫克/毫升者亦顯著抑制細胞增殖。 又，添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品之S W 4 8 D細胞全部呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特 徵。 即，可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多_樣品至 少於1毫克/毫升之濃度下對SW 480細胞具有細胞自滅 誘發作用，並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解10毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液 之過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取 得同樣之結果。 實施例3 2 於含1 0 % 5 6 °C、處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η BI0SCIENCE公司）及ΝΕΑΑ(大日本製藥公司製）之DEME培 養基（大日本製藥公司製）中3 7 °C下培養之人類結腸癌細 胞W i D r ( A T C C C C L - 2 1 8 )，於上述培養基中以5 X 1 0 3個 /毫升懸浮，並在FALCON公司製之24孔口平板上之各孔 口分注1 . 8毫升。對各懸浮液，添加0 . 2毫升溶解於P B S 之1 0毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏混 -1 2 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589320 A7 B7五、發明説明 合物、實施例12所得之含岩藻糖硫酸多醏-F、F-Fd-3及 F - F d _ 4、及實施例1 5所得之含岩藻糖硫酸多_之各溶液 °c 氧 二 % 5 Ρ 7 3 於 並 物 mil 理 處 a 滅 熱 壓 鐘 分 尚 Ο 養 培 下 在 存 磺 化 組 照 對 為 作 者 加 添 量 同 養 培 〇 養 培 地 411κ 樣 同 並 依 數 胞 細 生 之 性 時 PB經 將後 僅始 ， 開 織 組 會血 學以 養 ， 培即 織 〇 組測 本計 X)/ 曰 頁 、 8 販2 出 6 倉ί 朝 )(法 販方 2 之 第載 /V 記 J ) 術年 技90 之19 養 、 培編 第 於 示 表 〇 為 測圖 計 3 法第 方即 之 Ο 色圖 染33 藍第 盼於 台一不 之果 上結 板之 算得 計所 球 胞 細 物Ξ 合F-混及 多Fd 酸 F 硫 、 F 糖 一 藻 _ 岩多 含酸 之硫 得糖 所藻 1 岩 例含 施之 實得 將所 中12 液例 養施 培實 得 所 5 1 例 施 實 及 間 時 養 培 之 時 加 添軸 畀橫 毫 ， \ 圖 克俗 毫關 1 之 以數 _ 胞 多細 酸生 硫之 糖中 藻液 岩養 含培 之與 間 時 /{V 間 時 養 塔 示 表
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*1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 曲 同 相 上 質 實 為 形 情 之 醣 多 酸 硫 糖 0 岩 含 之 得 所 5 1 例 C 施線 加例 添施 果實 結加 其添 但 之 之 得 ，施 加實 增 ， 著物 顯合 為混數，口 胞多 細酸 其硫 胞糖 細藻 6 1 岩 F 之 、醣 F ^ - 多 醣酸 多硫 酸糖 硫藻 糖岩 藻含 岩之 含得 之所 I 5 得 1 所例 12施 例實 及數 、 胞 T細 FC1其 F-胞 及細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（…） 為減少。 又，添加實施例1所得之含岩藻耱硫酸多醣混合物、 實施例12所得之含岩藻耱硫酸多醸-F、F-Fd-3及F-Fd - 4 、及實施例15所得之含岩藻糖硫酸多醣之WiDr細胞全部 呈現細胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅特徵。 卽，可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多«混合物 、實施例12所得之含岩藻糖硫酸多醣-F、F-Fd-3及F-Fd-4 、實施例15所得之含岩藻糖硫酸多醣對WiDr細胞具有細 胞自滅誘發作用，並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解10毫克/毫升之實施例1所得之含岩藻 糖硫酸多_混合物、實施例12所得之含岩藻糖硫酸多醏-F 、F-Fd-3及FH4、及實施例15所得之含岩藻糖硫酸多 _溶液之過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定 ，取得同樣之結果。 實施例3 3 於含10 % 56 °C、處理30分鐘之牛胎兒血清（JRH BI0SCIENCE公司）之NEAA(大日本製藥公司製）之DMEM培 養基（大日本製藥公司製）中37 °C下培養之人類結腸癌 細胞WiDr(ATCC CCL-218)，於上逑培養基中以5X103 個/毫升懸浮，並在FALCON公司製之24孔口平板上之各 孔口分注1 .8毫升。對各懸浮液，添加0.2毫升溶解於PBS 之1 〇毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫克/毫升之實 施例1所得之含岩藻耱硫酸多_樣品溶液於1 2 1 °C、2 0 分鐘壓熱滅蘭處理物，並於3 7 °C，5 %二氣化碩存在下 培養。尚，僅將P B S同量添加者作為對照組，並同樣地 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（^ ) 培養。培養開始後經時性之生細胞數依「組織培養之技 術」（第2販）（朝倉出販、日本組纈培養學會編、1 9 9 0 年）記載之方法（第26〜28頁）計测。即，以血球計算板 上之台盼籃染色之方法計測。 其結果示於第34圖。即第34圖表示於WiDr細胞培養 液中將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品以各種濃 度添加時之培養時間與培養液中之生細胞數之關像圖， 橫軸表示培養時間（時間）、縱軸表示培養液中之生細胞 數（X104個/ 2毫升）。第34圖中，於培養基中之含岩 藻糖硫酸多醣樣品之添加量為，〇標記為無添加（對照） 、•標記為〗毫克/毫升、標記為3毫克/毫升、黑 三角標記為5毫克/毫升。 其結果添加PBS之HCT 116細胞其細胞數為顯著增加， 但將實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醏樣品以終濃度3 毫克/毫升以上添加之WiDr>細胞其細胞數減少，且添加 1毫克/毫升者亦顯著抑制細胞增殖。 又，添加實施例1所得之含岩藻糖硫酸多_樣品之W i D r> 細胞全部呈現細胞縮小及細胞Η斷化等之細胞自滅特徽。 即，可判定實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品於 至少於1毫克/毫升之濃度下對H C Τ 11 6細胞具有細胞自 滅誘發作用，並可抑制細胞增殖。 於PBS中溶解10毫克/毫升、30毫克/毫升、及50毫 克/毫升之實施例1所得之含岩藻糖硫酸多醣樣品溶液 之過濾處理液之細胞自滅誘發作用依上述為準測定，取 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ;裝· 589320
五、發明説明（〜） 得同樣之結果。 實施例3 4 於含10% 56 °C、處理30分鐘之牛胎兒血清（JRH BIOSCIENCE公司）之培養基（GIBC0公司製）中 37°C下養之人類前骨髓性白血病細胞HL-60(ATCC CCL- 2 4 0 )，於ASF 104培養基（味之素公司製）中以5X104 個/900毫升懸浮，並在FALC〇n公司製之6孔口平板上 之各孔口分注4 . 5毫升。對各懸浮液，添加〇 · 5毫升實施 例1 9 ( 6 )記載之含岩藻糖硫酸多醣-F之低分子化物經冷 凍乾燥者以]0毫克/毫升溶解於含有1 2 0 m Μ氯化鈉之3 0 ® M HEPES緩衝液（pH7)中，並以濾器過濾處理者，並於37°C ，5 %二氧化磺存在下培養。尚，僅將上述緩衝液同量 添加者作為對照組，並同樣地培養。培養開始2 2小時後 與4 6小時後之生細胞數依組織培養技術（第2販）（朝倉 出販、曰本組織培養學會編）記載之方法（第2 6〜2 8頁） 計測。即，以血球計算板上之台盼籃染色之方法計測。 其結果可判定HL-60細胞為經由上述之含岩藻糖硫酸 多醣-F低分子化物之冷凍乾燥物而誘發細胞自滅，並抑 制細胞增殖速度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亨施例3 5 將人類前骨髓性白血病細胞H L - 6 0，於含1 0 %之5 6 °C 、處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η B I 0 S C I E N C E公司）之P R Μ I 1 6 4 0培養基（G I B C 0公司製）中以5 X 1 0 4個/ 9 0 0毫升懸浮 。此準備6份此懸浮液，並對各懸浮液，添加1 〇 U微升 一 1 2 5 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^) 之含有1 2 G m Μ氯化鈉之3 0 in Μ Η E P E S緩衝液（ρ Η 7 )及以1 0毫 克/毫升溶解於同緩衝中之實施例1 9 ( 2 )記載之含岩藻 耱硫酸多醣 _F、F-Fd-1、F-Fd-2、FH3、及 F-Fd-4 之 過濾處理液，並於3 7 °C、5 %二氧化碳存在下培養4 6小時。 測定培養開始後22小時及46小時培養液中之生細胞數。 又，將人類前骨髓性白血病細胞H L - 6 0，以5 X 1 0 4個 /900毫升懸浮於ASF1D4培養基（味之素公司製）。準備 6份此懸浮液，並對各懸浮液，分別添加1 0 0微升之含 有1 2 0 in Μ氯化鈉之3 0 m Μ Η E P E S緩衝液（ρ Η 7 )及以1 0毫克/ 毫升溶解於同緩衝中之含岩藻糖硫酸多醣-F、F - F d - 1、 F - F d - 2、F - F d - 3、及F - F d - 4之過濾處理液，並於3 7 °C、 5 %二氧化碩存在下培養4 0小時。 測定培養開始後16小時及40小時培養液中之生細胞數。 又，進行上述2種培養之細胞以顯徹鏡觀察，並調查 增殖程度及細胞型態。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果，於以A S F 1 (] 4培養基培養之細胞中，添加含 岩藻糖硫酸多 _ - F、F - F d - 1、F - F d - 2、F - F d - 3、及 F - F d -4之細胞為全部呈現細胞縮小及細胞Η斷化等之細胞自 滅持徵，且生細胞數為幾乎未見增加或者大約完全死滅 。於僅添加緩衝液之培養基中細胞數增加約3倍。另一 方面，於以P R Μ I 1 6 4 G培養基培養之細胞中，僅添加 F - F d - 1、F - F d - 2、F - F d - 3、及F - F d - 4之細胞全部呈現細 胞縮小及細胞片斷化等之細胞自滅待擻，且細胞幾乎死 滅。於僅添加緩衝液之培養基中細胞數為增加約3倍， -1 2 6 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（^) 而在添加含岩藻糖硫酸多贿-F之培養基中細胞數為增加 約2 . 5倍。 由以上之結果，可判定含岩藻糖硫酸多醣-F於無血清 培養基中對癌細胞具有強的細胞自滅誘發作用，但F - F d - 1 、F-Fd-2、F-Fd-3、及F-Fd-4不論於無血清培養基中或 於血清培養基中均具有非常強的細胞自滅誘發作用。 更且為了確認，將人類前骨髓性白血病細胞H L - 6 0， 於含1 0 %之5 6 °C、處理3 0分鐘之牛胎兒血清（J R Η BIOSCIENCE公司）之PRMI 1640培養基（GIBC0公司製）中 以5 X 1 0 4個/ 9 0 0毫升懸浮。準備此懸浮液9毫升2份 ，並分別添加1毫升之含有1 2 0 m Μ氯化鈉之3 0 hi Μ Η E P E S 緩衝液（Ρ Η 7 )及以1 0毫克/毫升溶解於同緩衝液之F - F d - 4 過濾處理液，並於3 7 °C、5 %二氣化磺存在下培養1 6小 時。培養之細胞經離心分離而與上清液分離。將所得之 細胞懸浮於2 0徹升含有1 0 in Μ乙二酸四醋酸鹽及0 . 5月桂 醯基肌胺酸鈉之5 0 m Μ T r i s _鹽酸緩衝液（ρ Η 7 . 8 )中，並 添加1 〇毫克/毫升核糖核酸酶A ( S I G Μ Α公司製）1徹升， 於50°C、處理30分鐘後，添加1徹升之10毫克/毫升蛋 白酶K，並於5 0 °C、處理3 0分鐘。將處理後之細胞作為 樣品，使用2 %瓊脂糖凝膠於1 G Q V電壓下進行電泳。此 凝膠於溴化乙錠溶液中浸漬3 0分鐘後，使用超照明裝置 確認凝_中之DMA狀態時，細胞自滅特有的DN A梯段為被 確認。更且為了確認，使用已知作為誘發細胞自滅試藥 之放射_素D 10微克/毫升溶液代替上述之F-Fd-4進行 -1 2 7 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^ ) 同樣操作時，於培養2 0小時下，可確認與F ~ F d - 4情形相 同之DN A梯段。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 即，可判定若經由本發明末端型含岩藻糖硫酸多醏~ F 分解酵素將含岩藻耱硫酸多酷-F分解，則對癌細胞之細 胞自滅誘發作用變强。 實施例3 6 對2 1歳女性及3 2歲男性之正常人採取靜脈血，並以每 1公升含有®萄糖100毫克、CaCl2 · 2Η2 0 0.74毫克 s MgC 1 2 19.92毫克，KC 1 40.26毫克、NaCl 7371 毫克 、T r i s -鹽酸1 7 5 6 · 5毫克之溶液稀釋2倍後，於淋巴球 分離溶液（大曰本製藥販售）事先以稀釋血液2倍容量置 入之離心分離管中靜置重簦層，並於1 8〜2 0 °C、4 0,0 g下 離心分離3 G分鐘。離心後，收集淋巴球分離溶液上層之 淋巴球部份。
經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 如此處理所得之正常淋巴球以每].9 X 1 {) 5個添加至 2 4孔口之平板中，加入1 . 8毫升之含1 f) %牛胎兒血清（5 6 °C ，處理3 0分鐘者）之R Ρ Μ I ~ 1 fi 4 0培養基中各添加1種0 . 2 毫升之5毫克/毫升上述各實施例所得之含岩藻糖硫酸 多_、及其分解物之培養基並於3 7 Ό下培養。以添加生 理食鹽水代替含岩藻糖硫酸多醣溶液者作為對照組。培 養開始後，以顯微鏡測定各孔口細胞之型態變化及生細 胞數。其結果，於加入各種含岩藻糖硫酸多醣、其分解 物之孔口亦與對照孔口於細胞型態上差異，又生細胞數 之差異亦幾乎無，且於第1 3天任一者之細胞均亦幾乎死 -1 2 8 - 本Λ張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（) 滅。由此結果，可判定在含岩藻糖硫酸多醏、其分解物 對癌細胞誘發強細胞自滅之濃度中亦對正常細胞不顯示 出毒性。 實施例3 7 含岩藻糖硫酸多醏-U對固型癌之制癌作用 鼠固型癌M e t h A ( 4 X 1 0 6細胞/鼠）皮下注射至8週 齡之BALB/ C公鼠（體重約2G克）腹部。其後，連鑛於相 同處皮下注射1 Q天實施例6記載之含岩藻糖硫酸-U ( 1 0 0 毫克/公斤/天）。另一方面對照群為將食鹽水同樣地 皮下注射。摘出2週後於鼠腹部所形成之癌組織，並測 定其重量。結果示於表2。卽，於對照群中平均癌重量 為1 . 25克，相對地含岩藻糖硫酸多贿-ϋ投予群為0 . 28克 ，顯示出有意義（相對於對照群Ρ < 〇 . 01 )的制癌作用。抑 制率為7 7 . 6 %。 表2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^衣· 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 鼠（η) 腫瘤重量（克） 抑制率 平均士 SD (% ) 對照組（8 ) 1 · 2 5 ± 0 · 1 0 - 含岩藻糖硫酸多醣-U投予 0 . 28 ± 0. 0 7 7 7.6 (8) -129- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（〇〇 實施例3 8 含岩藻糖硫酸多醣之致癌預防作用 (1)對6週齡之Spragure-Dawley鼠（公）19隻，背部皮 下投予7.4毫克/公斤之氣化偶氮基甲烷（NAKARI TESC 公司製），並於其後1週1次，至第10週為止背部皮下 投予。尚投予時，為將氣化偶氮基甲烷溶解於含有〇 . 9 % 氣化鈉之PH6.5之0.1M磷酸緩衝液中，並以每次100微升 調整溶液濃度。 對上逑19隻中之5隻，在最初氧化偶氮基甲烷投予之 同時連日地將依實施例1記載為準調製之高果美海帶熱 水萃取液7 〇毫升以飲用水型式經口投予至第3 0週為止。 此熱水萃取液為含有2毫克/公斤含岩藻糖硫酸，多醣 混合物，故其被連日經口投予以140毫克/公斤之含岩 藻糖硫酸多醣混合物。 尚對上述19隻中之14隻不投予含岩藻糖硫酸多醣，而 給予自來水作為飲用水，並視為對照群。 至第3 0週為止對照群之外耳巢癌發生者為在]4隻中見 到有1 4隻，相對地於含岩藻糖硫酸多醣混合物投予群為 5隻中有1隻，確認其顯箸的致癌抑制作用。 尚至第3 0週為止對照群為死亡3隻，但含岩藻糖硫酸 多酷混合物投予群為全部生存。又第3 0週之對照群之平 均體重為716克，相對地含岩藻糖硫酸多醣混合物投予 群之平均體重為817克。另一方面氣化偶氮基甲烷非投 予之鼠群（5隻）平均體重為788克，含岩藻糖硫酸多_ -130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589320 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 混合物投予群之體重增加為與氧化偶氮基甲烷非投予之 鼠群同等。 其次，選出對照群4隻，於第3 0週開始連日將上述高 果美海帶熱水萃取液40毫升（含岩藻糖硫酸多醏混合物 8 0毫克）以飲用水型式經口投予。於第36週，4隻中之 2隻的外耳巢癌顯箸退縮，確認含岩藻糖硫酸多醣之制 癌作用。 經由以上含岩藻糖硫酸多_之經口投予，確認對化學 致癌劑之致癌預防作用，化學致癌劑抑制體重增加的防 止作用，更且癌組織之退縮。 實施例3 9 注射劑 將實施例1製造之含岩藻糖硫酸多酷混合物溶解於注 射用蒸餾水作成5 %溶液。此溶液於冷凍乾燥用玻璃小 瓶之1瓶中，以含岩藻糖硫酸多醣為5 ()毫克充填，並進 行冷凍乾燥。另外添加生理食鹽水2毫升作為溶解液。 實施例4 0 注射劑 _ 依下述配方調製注射劑。 含岩藻糖硫酸多_ - ϋ〔實施例1 2〕 4 0毫克 生理食鹽水 適量 每1安瓿 2毫升 同樣地使用實施例12記載之含岩藻糖硫酸多醣-F調製 注射劑。 一 1 3 1- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 589320 A7 B7 五、發明説明（⑷） 實施例4 1 錠劑 依下述配方調製錠劑。 含岩_糖硫酸多醣樣品（實施例1 ) 1 〇毫克 玉米澱粉 6 5毫克 羧甲基纖維素 20毫克 聚乙烯基吡咯烷酮 3毫克 硬脂酸鎂 2毫克 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 每1錠 1 00毫克 實 施 例 4 2 注 射 劑 將 F - Fd - 1 溶 解 於 注 射 用 Μ 餾 水 作 成 5 %溶液。 此溶液 於 冷 凍 乾 燥 用 玻 璃 小 瓶 之 1 瓶 中 以 含 山 石 藻耱 硫酸多_ 為 50 毫 克 充 瑱 > 並 進 行 冷 凍 乾 燥 〇 另 外 添 加生 理食鹽水 2 毫 升 作 為 溶 解 液 〇 實 施 例 4 3 注 射 劑 依 下 述 配 方 調 製 注 射 劑 〇 實 施 例 1 9 、（ 6)所 得 之 含 山 石 藻 糖 硫 酸 多 醣-F 之 低 分 子 化 物 之 冷 凍 乾 燥 物 40毫克 生 理 食 鹽 水 適量 每 1 安 m 2毫升 實 施 例 4 4 錠 劑 依 下 述 配 方 調 製 錠 劑 〇 實 施 例 1 9 -（ :6)所 得 之 含 山 石 藻 他 椐 硫 酸 多 醣-F -1 3 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（…） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之 低 分 子 化 物 之 冷 凍 乾 燥 物 1 C 丨毫 克 玉 米 澱 粉 6 5 ►毫 克 羧 甲 基 纖 維 素 2 0 丨毫 克 聚 乙 烯 基 吡 咯 烷 m 3 丨毫 克 硬 脂 酸 m 2 毫 克 每 1 鍵 1 0 0 毫 克 發 明 之 效 果 依 據 本 發 明 提 供 對 不 要 的 或 病 原 性 細 胞 具 有 細 胞 白 滅 誘 發 作 用 且 於 癌 等 異 常 增 殖 細 胞 疾 病 和 病 毒 性 疾 病 中 ， 對 病 變 細 胞 能 誘 發 細 胞 白 滅 > 且 在 該 疾 病 之 預 防 治 療 上 有 效 的 藥 劑 〇 尤 其 是 大 腸 癌 9 胃 癌 等 消 化 器 % ，之 癌 之 情 形 5 由 於 經 □ 投 予 本 發 明 之 藥 劑 可 令 癌 細 胞 引 起 細 胞 白 滅 ， 故 以 來 g 天 然 食 品 之 含 山 石 藻 糖 硫 酸 多 醣 和 / 或 其 分 解 物 作 為 有 效 成 分 之 本 發 明 藥 劑 非 常 過 用 於 消 化 器 % 癌 之 制 癌 劑 0 又 經 由 其 之 致 癌 預 防 效 果 9 亦 可 預 防 由 化 學 致 癌 劑 之 致 癌 〇 本 發 明 之 藥 劑 以 食 用 褐 藻 植 物 、 食 用 海 參 等 食 用 物 質 作 為 原 料 而 可 以 廉 價 大 量 供 應 且 於 安 全 性 高 之 方 面 亦 為 優 異 〇 又 9 經 由 曰 常 攝 取 含 UU 石 藻 糖 硫 酸 多 m 和 / 或 其 分 解 物 之 食 品 或 飲 料 9 可 維 持 、 增 強 健 康 〇 又 依 據 本 發 明 提 供 簡 便 的 細 胞 白 滅 誘 發 方 法 且 使 用 本 發 明 之 方 法 j 可 進 行 細 胞 白 滅 機 槭 解 明 之 研 究 細 胞 白 滅 誘 發 阻 礙 劑 之 開 發 等 〇 又 依 據 本 發 明 提 供 實 質 上 不 含 山 石 藻 糖 硫 酸 多 酷 -F -13 3- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 589320 A7 B7 五、發明説明（^> ) 域亦 多翳解 和上藻滅分 領且 酸 、分 析索岩自低 等， 硫程其 解撿含胞之 學物 糖 Η 及 造性型細素 醫解 藻鏈-F構活端之酵 、分 岩糖醣 之物末胞該 程其 含在多-F生之細由 Η 及 有之酸 醣-F物癌經 鐽-U含質硫 多醣化對之 糖醣 不物糖 酸多子及~F 在多 上性藻 硫酸分 、酷 之酸 質色岩。糖硫低法多 W 硫 實著含法藻糖-F製酸 一 糖 供之明製岩藻 _ 其硫 色藻 提強發性含岩多 、糖 著岩。 ，性本率供含酸素藻 之含法明應的效提造硫酵岩 強明製發反用其，製糖解含 性發性本去有供明於藻分之 應本率據除中提發用岩_ 強 反的效依並域亦本可含多用 〇 去用其 aI,領且據，之酸作物 除有供更-U等，依解用硫發化 並中提 醣學物 分有糖誘子 末極可效 之下下佳 明在在極 發存存以 本子子素 之離離酵 造鈣鈣解 製於於分 定，，醣 安素明多 法酵發酸 無解本硫 今 π 據糖 迄-F依藻 將醣，岩 可多且含 明酸更梨 發硫。端 本糖造末 據藻製之 依岩地明 C ，含定發動 又型安本活 端為使率 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）
Claims (1)
- 5 89絮 ο 厂.八-六、申請專利範圍 第86 1 00995號「細胞自滅誘發劑」專利案 (93年3月31日修正本） Λ申請專利範圍： 1 ·〜種含岩藻糖硫酸多醣，其特徵爲具有下述理化性質， ⑴構成糖：含有糖醛酸， ⑵經由產黃菌屬（？1&乂〇5&〇161^1111〇30.3八- 0082 (CCRC9 1 0069 )生產之岩藻依聚糖分解酵素而低分 子化，並生成至少由下述式（I)、（II)、（III)所示之 化合物所選出之一種以上之化合物 589320 六、申請專利範圍OH589320 六、申請專利範圍ΌΙΙOHOH III ) 589320 六、申請專利範圍 2 . —種細胞自滅誘發劑，其特徵爲含有如申請專利範圍第 1項之含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物。 3 .如申請專利範圍第2項之細胞自滅誘發劑，其中分解物 爲由下述式（I )、（ I I )、（ I I I )所示化合物所選出之化合 物-4- 589320 六、申請專利範圍ch2〇hΌΜο111.) o=s=o I OHOH 589320 六、申請專利範圍 4 .如申請專利範圍第2項之細胞自滅誘發劑，其中分解物 爲使含岩藻糖硫酸多醣與產黃菌屬8?.3入-0082(CCRC9 1 0069 )所生產之末端型岩藻依聚糖分解酵素 予以作用，所得不被孔徑大小分子量1 0萬之超濾膜所 排除之分解物。 5 ·如申請專利範圍第2項之細胞自滅誘發劑，其中分解物 爲在含岩藻糖硫酸多醣存在下培養產黃菌屬sp.SA-0082(CCRC 91 0069 )，所得之培養液中所分級之未被孔 徑大小分子量1 0萬之超濾膜所排除之分解物。 6 ·如申請專利範圍第 2項之細胞自滅誘發劑，其中含岩 藻糖硫酸多醣爲來自高果美（GAGOME)海帶、真海帶、檜 葉叉、裙帶葉、真海參任一種之含岩藻糖硫酸多醣。 7 .如申請專利範圍第 2項之細胞自滅誘發劑，其中分解 物爲將含岩藻糖硫酸多醣予以酸分解而得之分解物。 8 ·如申請專利範圍第7項之細胞自滅誘發劑，其中分解物 爲經分子量分級者。 9 · 一種在活體外細胞自滅誘發方法，其特徵爲使用如申請 專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣和/或其分解物爲 有效成分者。 1 0 .如申請專利範圍第9項之細胞自滅誘發方法，其中分 解物爲由下述式（I )、（ 11 )、（ 111 )所示之化合物所選出 之化合物 ---- 589320 六、申請專利範圍589320 六、申請專利範圍OH CH2〇H589320 六、申請專利範圍 1 1 .如申請專利範圍第9項之細胞自滅誘發方法，其中分 解物爲含岩藻糖硫酸多醣與產黃菌屬sp. SA- 0082 (CCRC 9 1 0069 )所生產之末端型岩藻依聚糖分解酵素予以作 用，所得不被孔徑大小分子量1 0萬之超濾膜所排除之 分解物。 1 2 .如申請專利範圍第9項之細胞自滅誘發方法，其中分 解物爲在含岩藻糖硫酸多醣存在下培養產黃菌屬3?.3八-00 82 (CCRC 9 1 0069 )，所得之培養液中所分級之不被孔 徑大小分子量1 0萬之超濾膜所排除之分解物。 1 3 .如申請專利範圍第9項之細胞自滅誘發方法，其中含 岩藻糖硫酸多醣爲來自高果美（GAGOME)海帶、真海帶、 檜葉叉、裙帶葉、真海參任一種之含岩藻糖硫酸多醣。 1 4 .如申請範圍第9項之細胞自滅誘發方法，其中分解物 爲將含岩藻糖硫酸多醣予以酸分解而取得之分解物。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之細胞自滅誘發方法，其中分 解物爲經分子量分級者。 1 6 · —種抑制癌症用之醫藥組成物，其特徵爲含有如申請 專利範圍第1至8項中任一項之含岩藻糖硫酸多醣和/ 或其分解物。 1 7 · —種預防癌症用之醫藥組成物，其特徵爲含有如申請 專利範圍第1至8項中任一項之含岩藻糖硫酸多醣和/ 或其分解物。 1 8 · —種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣之製 589320 六、申請專利範圍 法，其特徵包含令含岩藻糖硫酸多醣混合物，於鹽類存 在下，以具有酸性多醣凝集能力之藥劑處理，除去沈澱 物之步驟。 1 9 . 一種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣之製 法’其特徵包含令含岩藻糖硫酸多醣混合物，於2價陽 離子混合存在下，以陰離子交換樹脂處理採集目的多醣 之步驟。 20 · —種如申請專利範圍第1項之含岩藻糖硫酸多醣之製 法’其特徵包含製造如申請專利範圍第1項之含岩藻糖 硫酸多醣時，令共存之著色性物質使用多醣性物質或具 有陰離子交換基之物質予以除去之步驟。 21 · —種含岩藻糖硫酸多醣混合物之製法，其特徵爲由海 藻萃取如申請專利範圍第1 8或1 9項中之含岩藻糖硫酸 多醣混合物時，令醋酸離子與鈣離子共存。 -10-
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|---|---|
| TW92120936A TWI237026B (en) | 1996-02-08 | 1997-01-29 | Fucose sulfuric acid-containing polysaccharide, the preparing method thereof and the anti-cancer agent and preventing agent for inducement of cancer |
| TW86100995A TW589320B (en) | 1996-02-08 | 1997-01-29 | Apoptosis inducer |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW92120936A TWI237026B (en) | 1996-02-08 | 1997-01-29 | Fucose sulfuric acid-containing polysaccharide, the preparing method thereof and the anti-cancer agent and preventing agent for inducement of cancer |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9822420B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-11-21 | Industrial Technology Research Institute | Method of separating carbohydrate |
-
1997
- 1997-01-29 TW TW92120936A patent/TWI237026B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-01-29 TW TW86100995A patent/TW589320B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9822420B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-11-21 | Industrial Technology Research Institute | Method of separating carbohydrate |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW200400195A (en) | 2004-01-01 |
| TWI237026B (en) | 2005-08-01 |
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