TW541184B

TW541184B - Use of annexin for imaging cell death in vivo

Info

Publication number: TW541184B
Application number: TW087106507A
Authority: TW
Inventors: Francis G Blankenberg; H William Strauss; Jonathan F Tait; Peter D Katsikis
Original assignee: Univ Leland Stanford Junior; Univ Washington
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2003-07-11
Also published as: US7357915B2; ES2398118T3; KR20010020443A; CA2288131A1; DE69838811T2; AU754577B2; EP1017318B1; EP1017318A1; US6197278B1; DE69838811D1; US20070243133A1; ATE379990T1; NZ500598A; AU7271498A; RU2228765C2; CN1265572A; WO1998048699A1; HUP0001261A3; JP4963748B2; HUP0001261A2

Description

541184 A7 B7 3006pif3.doc/012 五、發明說明（丨）此計劃部分由NIHHL-47151獎助支持。因此，美國政府擁有本發明之部分權利。發明之領域本發明係有關於一種活體內（/〃 Wvo)顯像細胞死亡之方法。別是有關於利用放射標記爾類辛（radiolabeled annexin)以及迦瑪射線（r-ray)以顯像哺乳動物區域細胞死亡之方法。發明背景細胞自滅（apoptotic)或是程式化細胞死亡在成長與許多活體內平衡與疾病過程中扮演一很重要角色（Thompson， 1995 )。近來新的許多疾病治療策略，因此，可藉調整細胞自滅。可促進或抑制細胞自滅之新藥劑硏究目前面臨之阻礙係缺乏一種非侵入式之細胞自滅之活體內檢測與監控方法。脂體質子磁核共振光譜pH NMRS)在檢測淋巴胚細胞與他種細胞系於細胞自滅時，其原漿膜成分以及液流度之特殊改變是相當有用的（Blankenberg，eia/.,1996)。然而臨床應用脂體1H NMRS以硏究細胞自滅目前受到許多組織與器官中自然地複雜的區域磁性微環境的限制。發明摘要本發明之一目的包括一種在哺乳動物標的局部活體內顯像細胞死亡，例如因爲自滅或壞死（necrosis)導致之死亡，之方法。本方法包括下列步驟：（a)給藥於一標的一標記有生物相容性的放射核種annexin，（b)經過一段時間後，當標記的annexin於標的中定位之後，將此標的置於 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • 了象, « I · ϋ ·ϋ n Mmmmm n ^ ，· ·ϋ I ft— ·1 l ϋ ϋ I ϋ ^^^^1 an ·1 ·>1 ·1 1 n I ϋ ·ϋ n ϋ n ϋ n ·ϋ ·ϋ ϋ —i n n n n · 541184 A7 B7 3006pifi.doc/012 五、發明說明（> ) 放射檢測裝置之檢測區，以及（C)用放射檢測裝置測量定位於標的之核種散發之放射量以建構出放射散發影像，此影像即代表此晡乳動物標的特定區域之細胞死亡。在其中一實施例中，此方法更包括步驟（d)處理此影像，減去標記的annexm之非特定定位之訊號，例如是腎臟中非特定定位之訊號。可用於本發明之核種包括I 123，I 131，Ga 67，In 111，F 18，與Tc99m。F 18是陽電子故可利用於陽電子發散局部 X 射線檢法（positron emission tomography ; PET)。 I 123，I 131，Ga 67，In 111，與Tc99m可利用於標準迦瑪放射散發檢測。Tc99m於本發&明之方法中是較佳的核種。在一較佳實施例中，Tc99m係藉由hydrazino nicotinamide (HYNIC)連結於annexin。Tc99m標記之annexin之標準給藥劑量是界於5到20 mCi。本發明之一實施例中，放射檢測裝置是迦瑪射線檢測裝置。測量的放射發散是迦瑪射線發散。在另——般實施例中’放射檢測裝置是陽電子發散檢測裝置。測量的放射發散是陽電子發散。本發明又一實施例中，當重複步驟（b)與（c)能有效追蹤放射發散強度之改變時，（放射發散強度之改變反映出細胞死亡數目之改變），此方法包括重複步驟（b)與 (c) 〇本發明又另一實施例中，當重複步驟（b)與（c)能有效追蹤一區域中迦瑪射線發散之定位之改變時，（放射發散強度之改變反映出細胞死亡數目之改變），此方法包 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • T 象_ • ϋ ·ϋ ϋ mmrnm t n 卜· n i-i n I ϋ an ί I ϋ ·ϋ ·ϋ ·ϋ ϋ I n I ϋ I n a— n ϋ ϋ n I n ϋ ·1 n n ϋ _ 541184 A7 B7 3006pifi.doc/012 五、發明說明（子） _ 括重複步驟（b)與（c)。此放射檢測裝置可以例如是安格迦瑪閃光攝影機 (Anger gamma scintillation camera )或是立體顯像攝影機。 ¥發明較佳的annexin是annexinV。標準給藥劑量是小於300pg/kg，較佳的是界於1到lOpg/kg。許多可行之給藥途徑包括靜脈的，腹膜內的，椎管內的，以及胸膜的給藥0 迦瑪射線發散之測量典型地是於施予標記的 annexin 後5分鐘至約2小時後測量。在其中一實施例中，迦瑪射線發散之測量典型地是於施予標記的annexin後約1小時後測量利用此處揭露之方法可顯像標的之不同部位。例如，此區域可包括大約是整個標的或此標的之一部份，就如頭部或頭的一部份，心臟或心臟的一部份，肝臟或肝臟的一部份。本發明並且提供一套組用來活體顯像細胞死亡。此套組包括（0 —密封小瓶含有HYNIC標記的annexin，可以利用例如是「材料與方法（A)」中所述來配製；（ii) 一密封小瓶含有Sn-tricine溶液，可以利用例如是「材料與方法 (B)」中所述來配製，並保存於沁環境下；（iii)利用 (i)與（ii)之成分以及Tc-99m製作Tc-99m標記的 annexin 之說明書；以及（iv)給藥Tc-99m標記的annexin以活體顯像細胞死亡區之說明書。在一實施例中，此套組係保存在-7〇°C下並且在乾冰中托運。在另一實施例中，HYNIC標 —____ 6 本紙張尺度遇用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -I · n n n ϋ n I n 一gtfj· n mmmmf amaw B_i n n n I ϋ ammt I ϋ ϋ 1 1 I ϋ 1 ί I n «1 ·Ι ϋ ϋ n ϋ ϋ ϋ 541184 A7 B7 3006pifi.doc/012 五、發明說明（ψ) _ 記的annexin經高真空冷凍脫水。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉一較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：圖式之ά單說明第1圖係一電腦形成影像顯示以Tc99m HYNIC-annexin 檢測Fas-媒介的猛暴性肝臟自滅；第2圖係一電腦形成影像顯示發生Fas-媒介的猛暴性肝臟自滅時，來自Tc99mHYNIC-ovalbumin之訊號；第3圖係繪示以ACI老鼠接受自PVG捐贈者之心臟異體移植的實驗，硏究心臟同種異體移植排斥之活體內顯像的結果，圖中分別表示ACI類基因同體心臟（allogenic) 與 PVG 異體移植心臟（synegenic)之 99mTc HYNIC-annexin V攝取量對移植後天數的關係；以及第4圖係繪示99mTc HYNIC-annexin V之攝取量與急性排斥組織等級的相關性。本發明之詳細説明 I. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製「細胞死亡」此一專有名詞出現在「檢測細胞死亡」或「定位細胞死亡」時，意指失去原漿膜完整性之細胞以及晡乳動物細胞死亡的過程。此過程包括細胞自滅 (apoptosis)以及涉及細胞自滅（例如細胞衰老）與壞死的過程。在此，「細胞死亡」特指有核細胞（例如是神經元’肌細胞或肝細胞等等）之死亡或逼近的死亡以及無核細胞（例如是紅血球細胞，血小板等等）之死亡或逼近的 ___ 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 3006pif3.doc/012 B7 五、發明說明（<) 死亡。「生物相容的放射性核種」或「生物相容的放射性同位素」是指被認可爲適用於注射核子藥物的病人的同位素。生物相容的放射性核種的例子包括I 123，I 131，Ga 67， In 111，F 18，與 Tc99m 〇 II.細胞死亡-細朐自滅與壞死細胞自滅（apoptosis)意指「程式的細胞死亡」，細胞藉以執行「細胞自殺」程序。一般認爲，對多細胞生物以及一些特定生物之所有細胞而言，細胞自滅程序是演化保存下來的。更甚者，在許多例子中，在健康的存活細胞中，細胞自滅是一個必須被主動抑制的「不執行」程式。規律性的刺激以及環境因子會影響細胞決定是否進行細胞自滅（Thompson，1995 )。細胞自滅的生理活化劑包括腫瘤壞死因子，Fas配合基，轉型生長因子，神經傳導物質麩氨酸鹽，多巴胺，N-methyl-D-aspartate，生長因子的釋出’喪失基質附著，鈣與類皮質糖。細胞自滅之傷害性相關誘導因子包括熱擊，病毒感染，細菌毒素，致癌基因re/以及E1A，腫瘤抑制因子P53，溶細胞的T-細胞，氧化劑，自由基以及營養缺乏。療法相關的細胞自滅誘導因子包括迦瑪射線，UV射線與種種化療藥物有 cisplatin，doxorubicin，bleomycin，cytosine arabinoside， nitrogen mustard，methotrexate 與 vincristine。毒素相關的誘導因子包括乙酉学與/5 -amyloid peptide。當細胞自滅發生於無法再生之細胞，例如是神經元，時 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

> I · ί ϋ ϋ ϋ ί n -trgj0 n H ϋ I n _1 n I n I ϋ I «I ·1 ϋ I n ϋ ϋ n ·1 ϋ ϋ I n ·1 ·1 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 3006pif3.doc/012 B7 五、發明說明（心）常造成嚴重之後果。喪失此些無法被取代的細胞導致被感染器官的功能衰退甚至是致命性的功能失常。細胞自滅相關的神經變性失序疾病包括老年癡呆症，巴金森氏症’肌萎縮性側索硬化，色素性視網膜炎和小腦退化。細涵自滅對其他的病症同樣的具有嚴重的破壞，包括絕血傷害，例如心肌梗塞。一般認爲細胞自滅於中度的焦點式絕血後，對延遲血梗扮演一重要角色。（Du，W α/·， 1 996 )。其他與細胞自滅相關的疾病包括但不僅只於： AIDS ;脊髓發育不良如成形不全性貧血；以及毒素誘導的肝病，包括酗酒過多造成之傷害。壞死（necrosis)是指除了細胞自滅造成之局部性細胞或組織死亡。壞死的成因有外傷，細菌感染，急性缺氧等等。此二類細胞死亡有重疊處。有些刺激會造成細胞自滅或壞死或兩者，決定於傷害之嚴重程度。 III.牛物膜之不對稱件一般認爲，相對於特定的磷脂，生物膜爲不對稱的。特別是真核原漿膜之外膜主要由膽素磷脂，如sphingomyelin 和phosphatidylcholine (PC)，組成；而內膜主要包括胺基磷月旨，如 phophatidylserine ( PS )和 phosphatidylehtanolamine (PE )。一般而言，不對稱性是藉由ATP-dependent aminophosphlipid translocase 之活性來維持。ATP-dependent aminophosphlipid translocase 選擇性的傳運 PS 與 PE 於雙膜之間（Seigneuret and Devaux，1984)。其他關於傳運磷脂於雙膜之間的酵素包括ATP-dependent floppase (Connor，以 α/.，1992)與 lipid scramblase (Zwall，α/·，1993) 〇 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-I · i_i Βϋ I n mmmmm i ·ϋ I mmmmm l Mmm§ ϋ I I 1 ϋ ϋ n ϋ ·1 n ·.1 ϋ β— ϋ ϋ «II ·Ι ϋ ^1 ϋ n mma§ n I ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 3006piC.doc/012 〇7 五、發明說明（9) _ 正常細胞具有不對稱性，喪失此不對稱性會與特定的生理與致病程序相關。舉例而言，當於原漿膜外膜偵測到PS 之出現時（PS暴露），是細胞自滅，先前性的DNA破裂，原漿膜水泡以及喪失膜完整性的早期徵兆之一。（Martin，W α/.5 1995; Fadok5 et al., 1992) 相似的重定位於新月形細胞疾病（Lane，α/.，1994)， /3-地中海型貧血（Borenstain-BenYashar，eia/.，1993 )，血小板活化，以及具有不全PS傳運的突變腫瘤細胞皆可發現。老化的紅血球細胞外膜中會發現PS逐漸出現(Tait and Gibson，1994)。當這些細胞上的PS暴露到一極限値，這些細胞會被巨噬細胞移除（Pak and Fidler，1991 )。這些上述情形大致顯示感染細胞之死亡達到最高點。不錯的是PS暴露是細胞自滅與壞死的共同徵兆。他在細胞壞死的起始期間之角色已如上述。當自滅的細胞達到自滅的最終期時（也就是喪失膜之完整性），在兩層原漿膜上的PS皆會暴露出細胞外。相同的情形發生在因壞死的細胞死亡。其中喪失膜完整性是細胞壞死之起始因素或者是細胞壞死的早期現象。因此，因爲雙層細胞膜皆暴露出所以壞死細胞皆具有暴露的PS。 IV.爾類辛 Annexin 爾類辛(Annexin)族的蛋白質可應用於實施本發明。在許多的細胞中，包括胎盤，淋巴球，單核白血球，膽與腎的管狀上皮層，的胞體漿中可發現高含量的annexinV。雖然annexin之功用至今尙未完全淸楚但是因爲annexin之特質，annenix已成爲有用的診斷與治療藥劑。特別地，annexin 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-I · ·1 1 I I ϋ «I ·1 · 1· ϋ ϋ -ϋ I ϋ ·1 I ·1 ·_1 n ϋ -i ϋ i-i .1 ϋ ϋ ϋ I ϋ H ·.1 H ϋ I* ϋ I ϋ I 541184 A7 3006pifi.doc/012 B7 五、發明說明（g ) 對陰離子磷脂表面，如有Phosphatidylserine (PS)暴露，有特別強的親附力。 V.實驗結果槪觀實驗結果證明放射性標記的annexin可被利用於活體內顯it細胞死亡。舉例而言，例證一顯示當注射純化的 J〇2抗體於老鼠時，Fas-媒介的肝臟細胞死亡之影像與量 (Ogasawara，d α/·，1993 )。第一圖顯示分別在第一與第二小時時，肝細胞對放射性標記的annexinV有增加兩倍與四倍的肝攝取量，特別是因爲注射J〇2抗體之後的肝臟細胞死亡。在脾細胞中經注射後的早期，短暫地增加了兩倍的肝攝取量，接著又降至控制値。來自脾的訊號下降可能是因爲循環與脾白血球回應的快速淸除作用。腎臟中亦可發現annenix鍵結。然而，annenix鍵結是在無細胞自滅誘導刺激存在下才有的，並且在肝細胞訊號增強時，此鍵結減少。在供給抗Fas抗體後，腎臟活性急速下降並且肝攝取量增加。此暗示非細胞自滅相關對 aimexinV之腎親附力係遠低於細胞自滅之組織的。腎皮質對amiexinV之鍵結部分可能因爲與腎皮質磷脂的交互反應。値得一提的是，腎分泌物含有些微的標記annexiii。顯示在實驗期間，放射標記（在此爲Tc99m)保持與annexin 鍵結。再者，Tc99m標記的annexin在血流中很快地被清除。血淸半生期約爲3到7分鐘。因爲此性質使得可以在給藥後1到2小時顯像放射性藥物訊號。以上之性質使得連續每日或每雙日的顯像硏究得以進本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -· · n an tame n an MMmmm n · n ·ϋ I ammmw n ϋ 1 I n l n n ϋ n n ϋ I I— n ϋ n ϋ ·1 ϋ n I— n I— n i ϋ · 541184 A7 B7 3006pifi.doc/012 五、發明說明（q) _ 行。每曰或每雙日的顯像硏究代表當注射放射性標記之 annexin V時標的器官或組織之快速照相細胞自滅活性。 IV.活體內細胞死本發明之一目的包括一哺乳動物標的區域活體內顯像 9 -1 細胞死亡之方法。本方法中先給藥一放射性標的的 annexin 於標的。經過一段時間使得共軛結合於標的中定位後，將標的物置於迦馬射線檢測裝置之檢測場內。當利用迦馬射線檢測裝置測量由Tc99m迦馬射線之發散時，標的物大致上是維持固定的。接著，迦馬射線發散之影像就建構出來了。此建構出的迦馬射線發散影像用來提供臨床醫師一圖譜或一晡乳標的動物之細胞死亡定位區。爲了淸楚地解讀由上述方法所得之影像，此影像又經過一數位過濾以除去背景訊號，雜訊或非特定之定位，如腎定位。本發明之其一優點是，藉由測量迦馬射線發散以及在特定時間區間形成影像，本方法可用於追蹤一段時間內標的物的迦馬射線發散強度變化，反映出進行細胞死亡過程的細胞數目之改變。本方法亦可用於追蹤一段時間內標的物的迦馬射線發散定位之變化，反映出進行細胞死亡過程的分布之變化。 A·放射性標記爾類辛（annexin)之合成本發明可利用天然純化的，重組的，或者是合成的 annexin。AnnexmV，舉例而言，可以是如傳統地由人類胎盤純化（Funakoshi，以α/·5 1987 )。重組annexin具有許多優點包括容易製備，低成本。許多不同種的annexin可由人 ___12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製春--------訂· — ϋ n n ϋ ·1 a_n I 線 1·---------.——1---------- 541184 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 3006pif3.doc/012 β7 五、發明說明（p ) ^ 體或其他生物體複製而來。其序列可由序列資料庫如 GenBank 獲得。本發明較佳地是使用annexin V，有許多原因。第一， • amiexin V是最豐足易得的annexin。再者，易於從自然的或重組的i源獲得。第三，它對磷脂膜有高親附性(Tait，Να/.， 1988)。人類annexinV之分子量爲36kd並且對PS有高親附性。人類annexinV之序列可由GenBank獲得，編號 U05760-U05770 〇在「材料與方法」中有提及一示範性的適用於本發明之一表現系統。其利用在五· co/z··中的pET12a表現載體。 (Novagen, Madison, Wisconsin) 也可以利用其他細菌之表現載體。包括pGEX質體 (Smith，e/ a/·，1988)以及其衍生物，例如 Pharmacia Biotech， Piscataway，NJ之pGEX系列。此些載體表現一加框融合於 glutathione-S_transferase 之複製插入段之 p〇lypeptide 序列。可轉植重組pGEX質體於適當的[co//.系，可藉加入 isopropyl_thio galactopyranoside (IPTG)誘導融合蛋白質之生產。根據傳統方法，利用麩氨基硫洋菜親附管柱 (glutathione agarose affinity chromatography)可將固化重組融合蛋白質由誘導培養基之細胞溶成物中純化出來 (Ausubel，d α/.)。其他可購買而得的表現系統包括酵母表現系統，如 Invitrogen (San Diego, CA)的表現套組； baculovirus 表現系統（Reilly，wa/·; Beames，以从；Clontech， Palo Alto CA)與哺乳動物細胞表現系統（ci〇ntech，Palo Alto CA; Gibco-BRL, Gaithersburg MD) 〇 13 冢纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱) " -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---I----訂·---I-- ——線」 541184 ： A7 3006pif3.doc/012 〇7 •五、發明說明（丨1 ) 許多特徵，如促進表現序列的分泌入培養基的引領序歹[J，可被建入表現載體。重組生成的polypeptide傳統上是由溶融細胞或培養基分離出來。 • 分離出的重組polypeptide可由標準蛋白質純化程序來純化。€括解析沉澱法，分子篩管柱，離子交換管柱，等電位聚焦，電泳，與親附管柱。蛋白質之製備也可以由過濾法來濃縮（Amicon，Danvers, Mass)。依照上述方法製成支annexin再來就標記以特定的核種。特定同位素的選擇是依據特殊應用而定。任何目前可得之核種皆可應用於本發明。應用時考慮的因素包括(0特定發散的最小値(ii)介於50到500kEv的基礎光子能(iii)物理半生期要大於準備給藥物質所需時間（iv)有效半生期要大於檢驗時間，適當的化學形式與反應性，低毒性，以及標記核種的annexin之穩定性。較佳的核種例如是Tc99n^Tc99m之半生期約6小時，對標記annexin有很高的特定活性。其滿足上述大部分條件，且超過80%的核子醫學顯像程序都用到Tc99m。其他可資利用的同位素包括1123(半生期約13.2小時），1131 (半生期約8天），Ga67(半生期約78小時），Inlll(半生期約2.8天）。許多習知方法揭露結合同位素與annexin的方法。例如，可藉使用 AnorMED，Langley，British Columbia，Canada 的 hydrazino nicotinamide (HYNIC)結合 Tc99m 與 annexin。利用Hnatowich，et al·，1983所揭露之方法可以結合Ga 67，In 111於放射性標記的蛋白質。本紙張足度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

-I · ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ n ί 1 1 κ I ·ϋ I ϋ ϋ n I ϋ ϋ H ϋ H ϋ ϋ I ϋ ·1 ·1 ϋ ϋ —.1 H ϋ ϋ ^1 ϋ I 541184 A7 _3006pif3.doc/012__B7 五、發明說明（（>) _ 還有其他以放射性核種標記蛋白質之方法。例如，1996 年9月3日核准之美國專利案號5,552,525(Dean)，教導一製造Tc99m標記的peptide之方法。1990年Lind教導一 Tc99m 標記的單株抗體。LaMuraglia，et al.，（1989)教導一 ηιΙ標言1 己的非專一性人類免疫球蛋白。Fischman，et al.， (1991)教導fMLF_mIn_標記的DTPA共軛物。 Β·放射件標記annexin之給藥放射性標記annexin可以利用標準放射性標記化合物來給藥。供給的劑量包括下列考量：⑴注射核種的量與形式以及（ii)注射annexin之量。

Tc99m給藥於一成年人的劑量可高至20mCi。較佳的劑量約介於5到20mCi。在劑量大於300pg/kg時，annexin V開始有藥物效應（抗凝結劑效應）。因此，本發明之診斷方法較佳係在低於 300pg/kg，特別是低於50pg/kg之劑量下進行。這樣的放射追蹤劑劑量（lOpg/kg到5(^g/kg)對動物或人體並無報導出的藥物或毒性副作用。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 放射性annexin傳統上是在適合的傳輸介質中，例如是無菌生理食鹽水，作成懸浮液。傳輸介質包括固定劑，傳輸劑（carrier)，賦形劑，固化劑，乳化劑等。任何有效給藥放射性標記蛋白質於核子藥物顯像的方法皆可用於給藥放射性annexin。較佳的方法是靜脈注射。對於內部廣佈血管之器官更是適合，如心，肝，脾等等。碑脈注射放射藥丨生的方法很多。例如，Oldendorf/Tourniquet 方法或靜脈推動法。（Mettler與Guierbteau，1985 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 297公釐） 541184 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3006pif3.doc/012 五、發明說明（丨7 ) -當進f了腦之顯影時，標記的annexin可利用腦脊隨膜內給藥。腦脊隨膜內給藥直接傳輸藥物至含有大腦脊柱液 (CSF)的次蛛網膜空間。欲傳輸至脊柱索狀區必須配合硬膜注射至脊柱索狀外部。其ftL給藥方法包括腹膜內（對洗腎患者）與胸膜內給藥。在特殊形況下，包括肌肉內注射，皮下的，淋巴內的，噴注以及口服，陰道內的及或直腸注射。前述施行該些給藥方法爲熟悉此技藝者所廣知。 C. 方女射性標記annexin之定位在給藥標記annexin之後，接下來就是使放射性標記 annexin定位於一標的組織或器官。「定位」在此指鍵結的，駐定的與非鍵結，自由的，標記annexin之間達到一平衡或假穩定狀態之情況。達到定位之時間從數分鐘到數十分鐘。達到定位之時間可藉由標記annexin血淸半生期估計。當Tc99m-標記之annexin v靜脈注射之後，定位在數個半生期後產生。十倍半生期（對annexin/Tc99m共軛物而言，約30到70分鐘）足以達到基本上完全之定位。熟悉此技藝者會希望在大於或小於此約10倍半生期之時間點進行顯像。例如，在顯像因血管受傷造成之細胞死亡時，標的組織之獲得率相當高，因此在短短幾分鐘內，就可獲得自標的來的強烈訊號，又特別是當低劑量之標記annexin被漸漸給藥以減少自循環標記來的訊號。在上述的例子中，熟悉此技藝者皆可對達到定位之時間做到合理之估計。 D. 迦馬射線檢測裝置 16 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

541184 A7 3006piD.doc/012 β7 五、發明說明（#) _ 迦馬射線檢測裝置是藉在一段時間內收集自標的物發散之迦馬射線訊號以產生功用。最普遍使用之迦馬射線檢測方法之一是Anger*迦馬閃光攝影機（Mettler與Guibertau， 1985 )，其轉換自核種發散之迦馬射線爲光子（通常配合 Nal (ΤΪ)結晶），再於光增倍器管（PMTs)中放大成爲電壓訊號再藉以建構一影像。Anger迦馬閃光攝影機典型地包括準直管，閃光結晶，一列PMTs，脈衝高度分析器，陰極射線管（CRT)與控制台。此攝影系統通常包括電腦。PMTs 與顯示（CRT)之程序可以是類比的或數位的。許多評論與核子醫學教科書（例如Mettler與Guiberteau，1985 )有對Anger迦馬閃光攝影機之理論與操作方法有詳細之敘述。利用發散估計局部X光檢法（ETC)以產生三相立體圖提供一更資訊豐富之影像。ETC有兩種，一是單光子發散估計局部X光檢法（SPECT)其利用如Tc-99m之同位素，再者是陽電子發散局部X光檢法（PET)其利用高能量 (511-Kev)消滅光子以提供高度準確之定位。PET之缺點之一是其典型上是應用於短生命之用迴旋加速器產生的同位素，如nC，13N與18F。另外，SPECT適用於此所描述之放射性藥物，如Tc-99m。 SPECT典型上包括一個或兩個電腦控制Anger迦馬閃光攝影機頭，此機頭以圓形或橢圓形軌道繞患者轉動。此種 SPECT 攝影機可自，例如是 Siemens ( Des Plains，IL)，供應商獲得。Siemens發售多種此類攝影機，包括E-CAM， ORBITER，ECAT，MULTISPECT 3，MULTISPECT 2 以及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ..... 閱讀背項再填寫本頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 B7 3006pifi.doc/012 五、發明說明（I < ) DIACAM。 ~ 上述之攝影機典型上包括整合影像處理器，其放大影像爲數位檔案以減除背景與加上假色彩。一旦影像係以數位檔案之形式存在時，它可利用多種顯像處理程式，例如， ADOBE PHOTOSHOP，Adobe System，Mt. View，CA，放大之並以個人電腦如IBM相容PC或Apple Macintosh( Apple Computer, Cupertino)歹！J印出。 E.放置標的物於迦馬射線檢測裝置之檢測場中 1·裝置之檢測場裝置之檢測場之定義是可獲得固定可依賴之迦馬射線發散區域。假如利用ECT以收聚影像時’此裝置之檢測係迦馬射線發散可被信賴地測量之全部空間或ETC系統施行之部分空間。此空間典型上約大於一單一非ETC攝影機之檢測場。一般可知，並不需要將整個動物或標的物置於迦馬射線檢測裝置之檢測區。例如，假如我們有興趣於分析一自一特定器官來的訊號，只有需要測量自包括此器官之區域以及周圍黑暗區來的訊號。 2·放置標的物；因宏化. 在測量迦馬射線以建構影像之時間內，標的物係置於光檢測裝置之檢測區中以收集用以集匯出影像之訊號。假如訊號夠強使影像可於20微秒內藉測量迦馬射線發散建構出及或標的物相對於顯像板之移動不足以破壞影像，就不而要額外之固定化步驟。而是只需要將標的物置於檢測裝置之檢測場。 / 假如，測重迦馬射線發散需時大於2〇微秒時，與標的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ίφ--------訂---------線 -----------------------

541184 A7 B7 3006pif3.doc/012 五、發明說明（u) -物被激烈搖動時’先前步驟以確定迦馬射線發散測量期間之固定化以及標的物之激烈搖動程度都應被考慮以保留建構的影像之空間訊息。例如，假如標的物是人，光子發散測量時間是數秒鐘，在迦馬射線發散測量時，標的物最好

? I 是盡量維持靜止。另外，假如標的物是動物，例如老鼠，可藉由麻醉或機械控制裝置固定之。機械控制裝置有很多種。例如，利用一端有凹槽之泡棉塾’將老鼠頭置於凹槽外使之自由呼吸，再將一迦馬射線可穿透之薄片覆蓋綁緊於上。如此可固定老鼠數十秒至數分鐘。欲顯像區域可能包括整個標的物或標的物之一部份。例 $口，此區域可以是一附肢或是該附肢之部分，頭，中心神經系統或一內體腔，如胸腔或腹腔。在一些特殊的實施力，此區域可包括僅僅是特定的器官或器官的一部份。例如，本方法僅可利用於中心神經系統，腦，心，脾，肺，脊髓或上述之一部份。再者，被分析區域可被限制於腫瘤如接受造成腫瘤細胞死亡治療之癌症患者。 F建遵J5馬射線發敗影像；顯像程序許多適用的攝影機可將迦馬射線發散之量測値匯集爲電壓訊號，其可顯示在CRT或以電腦儲存及或分析爲一數字列。以標準顯像方法，可利用該些數字以匯集出影像。舉例而言，藉著標準化迦馬射線計數（對一固定，先前選擇之數値或任何圖素偵測出之最大値）並轉換此些標準化數値爲顯示器上之亮度或色彩。假擬色彩表現時，典型之色彩之分配如下。計數爲零的圖素爲黑色，低計數爲藍色， !!!-------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

541184 A7 3006pif3.doc/012 B7 五、發明說明（/)) 計數愈高色彩之波長愈長，最高的迦馬射線計數値是紅色。顯示器上色彩之顏色表示迦馬射線發散之分布也就是細胞死亡之區域。假如想要追蹤一段時間內之定位及或訊號，例如，要紀錄一種备療方法對細胞死亡之分佈與定位之影響，可以在一定時間間格中重複迦馬射線發散或顯像，以獲得一系列之影像。時間間格可短至幾分鐘或長至數天，數週，數月或數年。許多方法都可用以分析藉本發明之方法匯集之影像，包括最簡單的視覺檢視，心理估算及或印出淸樣，或複雜的數位影像分析。 vii. mm. 放射性標記的annexin V之主要應用包括檢測不該發生而發生的細胞自滅，例如紅斑性狼瘡，移植排斥等之免疫失序，或嚴重的細胞局部貧血，以及檢測該發生而沒有發生足夠之細胞自滅，如腫瘤或病毒感染之細胞。在此之結果顯示放射性標記之annexin可應用於臨床上需要檢測細胞自滅或壞死時，例如，但不限於此，器官或骨脊髓移植排斥或受傷，感染性及非感染性發炎疾病，自體免疫疾病，大腦的及心肌梗塞以及局部貧血，心肌症，動脈粥樣硬化，神經與肌神經老化疾病，新月形細胞疾病，冷-地中海型貧血，癌症療法，AIDS，與毒物誘導肝病等等。另外’也可利用放射性標記annexin作爲硏究正常免疫系統’胚胎發展，免疫容忍度與過敏之臨床工具。放射性標記annexin V也可利用在，例如，顯像或定量 _ 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 βI ena ea·! a·· ·mb a··· mm 蠢線 1»------------------------ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ; .- u/ r. .T. 、 541184 A7 B7 3006piD.doc/012 五、發明說明（丨？）接受治療的正常以及惡性組織之細胞自滅性細胞死亡。藉由放射性標記annexin V與連續顯像硏究以監控細胞自滅可應用於新藥與療法之快速檢驗與發展。此外，此方法又可用於監控治療過程，或以及疾病或成。再者，此些方法又可用会特定疾病之早期監控。以下之例證說明本發明，但非以限制本發明。材料與方法 A. HYNIC 標記的 annexin V 製備人類annexin V係藉在[cW中表現，自pET12a-PAPI 質體且依據前述方法純化而來（Wood，βία/·，1996 )。製備 30mM 的 hydrazino nicotinamide ( HYNIC ； obtained from AnorMED, Langley, British Columbia, Canada; Babich, et aLy 1 993 )N-hydroxysuccinimide ester 之儲備溶液（HYNIC ester stock solution )可將 220pg 的 succinimidyl 6-hydrazinonicotinate hydrochloride ( SHNH)溶於 1 8.5μί 的 N，N-dimethyl formamide。溶解於 893pL 緩衝液 A ( 20mM HEPES，pH 7.4, lOOmM NaCl)的 5mg annexin V 先與 NYCIN ester*儲備溶液於室溫下反應3小時，溫和地攪動，遮光。 (Schwartz, et al, 1991 )。加入 500L 之 500mM ρΗ5·3 的 glycine以停止反應。然後在4°C下，以20mM的sodium citrate，pH 5.2, lOOmM NaCl 滲析。再以 1500xg，10 分鐘離心以移除沉澱。ΙΟΟμί ( 100pg)的HYNIC-annexin V整溶液（aliquot)即儲存於-7(TC。

B. 放射件標記 HYNIC-annexin V 將 80μί 的 SnCl2 ( 50mg/ml 0·1Ν HC卜以 N2 purge 兩本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

«» ,I · n ϋ ϋ ϋ ϋ n 1 一0- · I n ϋ n ϋ ϋ ϋ I ϋ n «ϋ ϋ 1· 1 1 ί ϋ ϋ n ϋ ϋ ι ϋ ϋ ϋ n ϋ ϋ ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 3006pif3.doc/012 37 五、發明說明（叫）小時）加入 50ml 的 20mM tricine 溶液（pH7.1，以 N2 purge 1 小時；tricine=N-[tris ( hydroxymethyl) methyl]glycine) o 將 200pL 的 Sn_tricine 溶液加入 100pL Tc99m ( 4-8mCi 活性），混合1〇〇μί annexin V整溶液。其是使用Larson，ei α/·， 1995所k之方法。放射性標記的annexin之專一活性是20-20(^Ci~g蛋白質，放射性純度爲92-97%，以saline爲溶液，即時薄層層析法（instant thin layer chromatography ; ITLC)來決定。 HYNIC-annexin V的膜鍵結活性與衰變Tc99m HYNIC-annexin V是以修飾之競爭分析法決定’其中5 nM的 FITC-annexinV 係被 I125 annexin V 置換（Wood，以 α/·， 1996)。室溫下15分鐘後，離心此樣本，附於pelleted細胞之FITC-annexin V係藉由EDTA釋出而釋出之FITC-annexin V係以螢光計測量。在此分析系統，無修飾之 annexin，HYNIC annexin，與 Tc99m HYNIC annexin V 分別有 8nM’ 10·5ηΜ 與 12·3ηΜ 之競爭抑制。每 mole 的 annexin V 有 0.9 mol 的 HYNIC 結合於 annexin V 〇 C.顯像與生物分布硏究在利用ITLC saline爲溶劑，測定自由對鍵結Tc99m 後，將老鼠注射 50-150μ(3ί 的 Tc99m_HYNIC annexin ( 0.125-0.25叫的蛋白質）。在注射放射性藥物之後，老鼠先置於俯臥姿勢，顯像2小時。利用低能可動（LEM) 閃光攝影機與高敏感度平行孔準直管與128*128顯像陣列 (Siemens，Des Plains，IL) 15分鐘後可得影像。同樣之方法可用於所有掃描之先前處理以及後處理。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先153讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 I I ϋ I ϋ 1 n I I ϋ 1 n emmw ϋ n n ϋ ϋ n ϋ n ϋ ϋ n I ϋ ϋ ·1 ϋ ϋ ϋ * 541184 A7 3006pifi.doc/012 B7 五、發明說明（/) _ 在得到來自子宮頸瘤，唾腺，大腦，胸腺，心，肺，肝，脾，胃，GI神經束，腎，骨骼肌，脂肪，血液，以及遺骸的樣本之後，就可進行生物分布之硏究。樣本先置於 Packard Cobra II自動迦馬閃光計數器上計數（Packard Instrument，Downer Grove，IL)表現以同位素衰變與背景活性每分鐘之正確計數。 D.鍵結的人體aimexin V與細胞自滅的細朐核之染色福馬林固定之，石蠟嵌入之組織先切成5μιη大小，再以hematoxylin/eosin或其他技術染色。鍵結人類annexin V 之免疫染色可藉由人體胎盤annexin V誘生之兔抗血淸以及親和純化自重組annexin V。接著，與biotin標記的羊抗兔抗體與avidin-horseradish peroxidase複合物培養之後 (Jackson Immuno Reserch)，以及與 3,3’-diaminobenidine 反應（Bindl，J.M.&Warnke，R.A.，1986)之後，可完成免疫組織化學檢測。欲檢測細胞自滅細胞核時，可用Gavrielieia/.揭露之 terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UPT end labeling (TUNEL) method之修正方法來染色。在抑制 endogenous peroxidase 之後，再用 proteinase K(20pg/ml)於室溫下切割去石蠟片段15分鐘。這些片段又接著與5imit/ml 之又 exonuclease (Life Technologies, Gaithersburg)於 37〇C 培育30分鐘。再以終止deoxynucleotidyltransferase反應緩衝液（0.2 M potassium cacodylate，25mM Tris.HCL，0.25 mg/ml BSA，1.5mM CaCl2, 20mg/ml polyvinylpyrrolidone,與 20mg/ml Ficoll)與5μΜ d ATP使達到平衡。此端點標記反 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • — ^9_________________Aw_______________________ 541184 A7 B7 3006pif3.doc/012 五、發明說明（Μ) 應也是在 terminal deoxynucleotidyltransferase 反應緩衝液中進行，terminal deoxynucleotidyltransferase 反應緩衝液也包括最終濃度爲 75unit/ml 的 terminal deoxynucleotidyltransferase 與 ΙΟΟμΜ 的 l，N-6-ethenol-dATP(Sigma)。在37 °C下培育60分鐘之後，以1 x SSC(standard saline citrate)潤濕終止反應。這些片段再與鼠 lG4mAb(Regina Santella，Columbia University 所得），其能辨識 ethenoadenin moiety (Young，T.L.&Santella，R.M·， 1988)，培育。接續之免疫組織化學檢測如前述，係利用 biotin標記的羊抗鼠抗體。舉例一活體內顯像Fas-Mediated細胞自滅鼠之肝細胞壞死是藉注射抗Fas抗體誘導出的，其在1 至2小時內造成大規模的肝細胞壞死，在90%的受處理老鼠中在3小時之時會造成死亡（Ogasawara) 〇 5至6週18-24克雌Balb/c鼠接受靜脈注射，注射以純化之 hamster 單株抗-Fas 抗體 po2，10pg per animal， Pharmingen，San Diego, CA)。接著，在3個分別之實驗中，此動物於0，1，2小時，再接受以90pCi的Tc99m HYNIC 放射性標記的annexin V。結果如第一表所示。 24 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ▼--------訂---------線丨 •_______________________ B7 541184 A7 3006pif3.doc/012 五、發明說明（》) 放裂記的Annexin t與HAS之生物分佈分析

Tc99m annexin γ f Ί 控制組抗Fas處理的老鼠（ΙΟμ/mouse) %I.D./gm (n = 6 ) 1小時（n=8 ) 2小時（n=6) 肝 Ιί·7 士 1.35 ---—--- ’ 15.0 土 3.5* 41.6 士 10.0** 腎 187.9 土 21.8 127.7 士 42.6* 64.9 土 37.5** . 脾 12.1士1.08 20.8±7.8* 17.5±7.55(N.S.) I125 HSA 控制組抗Fas處理的老 ;鼠（ΙΟμ/mouse) %I.D./gm (η=4) 1小時（n=6 ) 2小時0=5) 肝 3.87±0·76 6.92 士 1.81* 6.87 土 1.2** 腎 4.6±0.89 6.0 土 0.42* 5.84 土 0.88" 脾 3.52±0.67 3.75±〇.86(N.S.) 3.42±〇.56(N.S.) 器官重量控制組抗Fas處理的老鼠 (g) (n = 6 ) 1小時（n=8 ) 2小時（n=6) 肝 l.〇2±〇.〇86 1.41±0.37** 1.32 土 0.25* 腎〇·33 士 0.061 〇.34±0.〇82(N.S) 0.34 土〇.〇48(N.S) 脾 0.11士0.023 0.12 土 0.02(N.S·) 0.11士0.018(N.S) 總體 19.5士1·1 20.7±2,2(N.S.) 19.3 土 1.6(N.S·) 氺* 與控制値顯著偏差(P<〇.05) 與控制値高顯著偏差(ρ<0·001) N.S.與控制値無顯著偏差在第一與第二小時有觀察到顯著的放射性標記 annexin V之肝攝取量，分別爲控制値之148%到372%，係藉由如第一圖所不之特定硏究區域(1^丨011-0厂丨1^代51：;11〇1)影像分 25 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -· i_l ϋ ·1 ϋ ϋ 1_ι 1 0 n 1 H ϋ ϋ ϋ n I I n I- ϋ ϋ ϋ n n H ϋ n ϋ ϋ ϋ 1· n n n ϋ H ϋ n n - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 541184 A7 3006pif3.doc/012 B7 五、發明說明（>)) 析法來決定。在1小時時’脾攝取量升至控制値之140%，在2小時時，降至110%。在處理之後1，2小時，腎攝取量降至40%。另一群老鼠（控制組）在J〇2抗體處理之後0，1，2 小時，即’注射以 90μί：ί Tc99m HYNIC ovalbumin ( MW=43kd; 2pg of protein )。如第二圖所示，此些動物在第一小時時，肝攝取量爲127%，其在抗Fas抗體處理後，第二小時時，仍幾乎維持不變（131%)。脾攝取放射性標記之ovalbumin 量在處理之後保持不變。腎攝取放射性標記之ovalbumin 量在1小時時升至控制値之138%，並在2小時時，維持在 1 3 1 % 第三群老鼠除接受上述之處理外，並且於三個分別之實驗中，第0，1，2小時，注射Tc99m標記的annexin V與 I125標記的human serum albumin (HSA)。不同實驗之動物在相對之時間點被殺死以作生物分佈硏究。結果如第一表所示，其係以 percent injected dose per gram of tissue (%ID/gm) 表示。此數據與由放射性標記之annexin V與HAS之ROI 顯像分析所得之數據成比例。心臟同種異體移植排斥之活體內顯像 99mTc HYNIC_annexin V以前述方法製備。顯像與生物分佈硏究亦如前述進行，除一些例外之外。依據Ono與 Lindsey(Woodley，et al.，1993)之修飾過之方法，將自 PVG (得自Harlen-Sprague-Dawley)異位心臟同種異體移植至成熟雄ACI老鼠(250-350g)腹大動脈與下靜脈。ACI捐贈者 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公爱) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •________tr_________線曹Φ____________:__________ 541184 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3006pif3.doc/012 五、發明說明（w ) _ 的類基因心臟異體移植至寄主ACI老鼠之腹部。在ACI受者體內之PVG心臟在移植之後4到5天開始有排斥作用，其是以心跳脈搏之降低來分析。移植之後五天，所有動物經由尾部血管接受700-900μα的99mTc HYNIC-annexin V(10-20pg protein/kg)並且在1小時候顯影。再殺死這些動 _，k有的心臟與移植的心臟再進行閃光計數與組織病理硏究。移植後5天，使用9§mTc HYNIC-annexin V可以使所有 PVG異體移植心臟(n=4)輕易的顯像。ACI類基因同體心臟 (11=3)在注射99mTc HYNIC-annexin之後沒有可見之活性。 PVG異體之整體活性百分比超過ACI同體百分比之213% (P<0.005; two-tailed students t test)，此是藉由 ROI 顯像分析。閃光井計數分析透露出PVG異體相對於原有心臟有超過11倍的99mTc HYNIC-annexin V攝取量。所有的動物部分PVG心臟異體在移植5天之後有顯著的單核發炎細胞的侵入。同體或原來的心臟並無發現此種侵入。單核發炎細胞侵入的周圍區受傷並伴隨血栓。這些區域的中心，不須hematoxylin染色就有明顯的細胞壞死。但在週邊，以TUNEL可確定有細胞自滅之細胞核。在心肌細胞發炎細胞與細胞壞死區之交界，利用99mTc HYNIC-annexin V免疫染色可觀察到顆粒狀圖樣。此些細胞之細胞核以hematoxylin染色，更進一步說明了他們是細胞自滅而不是壞死。以陽性肌細胞而言，抗annexinV染色比起 TUNEL更廣效也更深。如一般預測，抗annexin染色在壞死區很濃且結塊但只在特定區。類基因或原本之心臟並無 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

541184 Α7 _3006pif3.doc/012 B7 五、發明說明（/) _ 觀察到染色。在另一組不同但相似的實驗中，ACI老鼠(每組n=6)接受自PVG捐贈者之異位心異體移植。自ACI捐贈者(每組 n=3)的類基因心臟同體被移植於寄主ACI老鼠。沒有任何 —組接会移植排斥處理。移植之後第1，2, 3, 4, 5, 6, 7天，受體老鼠進行核子掃描。核子掃描前1小時，先注射l.OmCi 99mTc HYNIC-annexin V 〇移植後4天，以99mTc HYNIC-annexin V可輕易地使 PVG心臟異體顯現。在注射99mTc HYNIC-annexin之後， ACI類基因心臟同體沒有可見活性。 99mTc HYNIC-annexin V攝取量可用ROI分析來定量。移植心臟的攝取是以整體攝取的百分比來計算。結果如第3 圖。核子掃描之後即刻就使此些動物安樂死。取出心臟以作分析。結果如第2表。第2表急件排斥的組織等級等級0 無排斥等級1 溫和排斥等級2 中度排斥等級3 嚴重排斥細胞自滅細胞核可藉核DNA嵌段TUNEL染色，使用巾場上可得之 peroxidase 套組（APOPTAG®，Oncor， Gaithersburg，MD)。如第3表之數據所示，在心異體排斥之 28 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -I · I I— e§ mmmt n n met t ·ϋ 1 n in ϋ an I n in ϋ n ϋ n l Hi I ϋ ϋ I I ϋ ·ϋ Hi ϋ I —ϋ ϋ ϋ < 541184 A7 3006pif3.doc/012 Β7 五、發明說明（yG ) 過程當中，在肌細胞與發炎細胞皆有發現細胞自滅。第3表心臟同種異體移植之TUNEL染色；在排斥作用時陽性細胞核的顯現排芹發炎的內皮細胞肌細胞等級〇 0 0 0 等級1 + + + 等級2 ++ + + 等級3 + + ++ 如第4表之數據與第4圖所顯示，99mTcHYNIC-annexin V之攝取量與急性排斥組織等級相關。先閱讀項再填寫本頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製第4表在心臟同種異體移植排斥作用時 99mTc HYNIC-annexin V 之攝取百分[± 排斥 %攝取量±STDV 顯著性* 等級〇 0.42±0.17 等級1 0.83 士 0.31 P=0.036 VS.等級〇等級2 1.43 土 0.40 P=0.008 VS·等級 i 等級3 2·40±0·53 Ρ=0·001 vs.等級 2 *Student，s t_test，two_tailed，unequal variance 舉例三活體顯像處理過之鼠類淋Rf 99mTc HYNIC-annexin V大致如上述方法製備。顯像與生物分佈硏究，除一些特例之外，亦如上述方法進行。^ 生長 38C13 鼠 Β 細胞淋巴瘤（Maloney，ei α/.，1985 ) ______tr_________線藤·___________________ 29 541184 A7 3006pifi.doc/012 B7 五、發明說明09) 於 C3H.HeN 鼠（Harlan Breeders，Indianapolis)，再將懸浮於200μ1 RPMI介質1640 (不含血淸）的400個腫瘤細胞 s.c.注射於左腰窩。移植之後14天，老鼠又接受100mg/kg cyclophosphamide i.p.注身寸。cyclophosphamide i.p.注身寸後 20 小時，έ鼠又接受 25-50pg/kg 的 99mTc HYNIC-annexin V (100-150pCi/animal)的i.v·注射。在注射放射性藥物後1 小時，接著顯像與殺死該動物，再移除腫瘤作閃光計數與組織病理硏究。未處理之腰窩腫瘤移植（n=8)可輕易藉由閃光攝影顯像而得見，並且以ROI顯影分析可知其有超過正常軟組織活性365%的armexin V攝取量。處理過之腰窩腫瘤（n=6) 之99mTc HYNIC-annexin V活性相對控制値有高於78%的增加量，其是以每克腫瘤細胞之總體活性表示。（P<〇.05, two-tailed student’s test)。閃光井計數又確認了此結果。處理的腫瘤之annexin V攝取量增加了 132%，其係以每克腫瘤（P<0.05)注射劑量百分比，並且與控制組比較重量降低了 58% (P<0.05)。以ROI顯像分析得之每克腫瘤總體活性與以生物分佈硏究（r2=0.831)得之每克腫瘤注射劑量百分比線性相關。組織分析證明在處理的腫瘤的全部淋巴瘤之完全（大於 95%)細胞自滅比控制組少5%。雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者爲準。 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -· ϋ ϋ ϋ ϋ n I ϋ n I H 1 ϋ ϋ n I I H I» ϋ ϋ 1· ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ I ϋ ϋ n I* ϋ ί ϋ .

Claims

541184 3006pifi.doc/012 A8 R8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 · 一標記有一生物相容的放射核種之一爾類辛 (Annexin)用以顯像哺乳類標的體內一區域細胞死亡之使用，包括有： (a) 對該標的施用標記有一生物相容的放射核種之， Ί annexin ； (b) 將該標的放置於一放射檢測裝置之檢測區中；以及 (c) 以該放射檢測裝置來測量該標的中該放射性核種之放射能量，以建構出一放射影像；其中該影像代表該哺乳類標的中該區域之細胞死亡。 2·如申請專利範圍第1項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射性核種係選自I 123、I 131、Ga 67、 In 111、F 18以及Tc99m所組成的族群。 3·如申請專利範圍第2項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用’其中該放射性核種係Tc99m。 4·如申請專利範圍第3項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該Tc99m係藉由hydrazino nicotinamide (HYNIC)連結至該 annexin 上。 5·如申請專利範圍第3項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用’其中Tc99m標記之annexin之施予劑量是界於5 到 20 mCi。 6·如申請專利範圍第1項中所述標記有一生物相容的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ··________tr_________線丨费____________：___________ 541184 3006pif3.doc/012 A8 R8 C8 Π8 六、申請專利範圍放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射檢測裝置是一迦瑪射線檢測裝置，而該放射能量是迦瑪射線。 7·如申請專利範圍第6項中所述標記有一生物相容的 ; Ί 放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該迦瑪射線檢測裝置係一迦瑪閃光攝影機。 8·如申請專利範圍第6項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中用以建構該影像之迦瑪射線能量之測量，係在該已標記的annexin施藥後的5分鐘至2小時內進行。 9·如申請專利範圍第8項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死^ 之使用，其中用以建構該影像之迦瑪射線能量之測籩，在該已標記的annexin施藥1小時後進行。 ’、 1〇·如申請專利範圍第1項中所述標記有一生物彳自、的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域袖谷亡之使用，其中該細胞死亡係因細胞自滅所造成。 & 11.如申請專利範圍第1項中所述標記有經濟部智慧財產局員工消費合作社印$机的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域袖=奪广之使用，更包括在特定時間間隔內重德7h)朱驗^ ^ 一、（％亡之使用，更包括在特定時間間隔內重複(b)步驟驟，其中重複(b)步驟與(c)步驟能有效追蹤在一段時％區域放射能量強度之變化，以反映出進行細胞死亡 & 數目的變化。 % (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 12·如申請專利範圍第1項中所述標記有一生％ 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐〉 541184 3006pif3.doc/012 AS R8 C8 D8 位置的變化。 13·如申請專利範圍第1項中所述標記有的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區經濟部智慧財產局員工消費合作社印製牛目鸯

六、申請專利範圍的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內] 亡之使用，更包括在特定時間間隔內重複(b)步驟驟， — 其中重複(b)步驟與（c)步驟能有效追蹤在一段_ 區域放和能量強度之變化，以反映出進行細胞死卜生％域糸田_泳亡之使用，.其中該放射檢測裝置是一立體顯像攝影_ 14·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物彳目@ \ 放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞^^ 之使用，其中該annexin是annexin V。 15.如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容％放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞％£ 之使用，其中該已標記之annexin的施藥劑量是小於3〇〇gg protein/kg 〇 16·如申請專利範圍第15項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin的施藥劑量是介於1〜 10pg protein/kg 〇 17·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由靜脈內施藥。 I8·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡 33 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ：297公釐） 541184 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 R8 C8 3006piB.doc/012 D8 __ 六、申請專利範圍之使用’其中該已標記的annexin係經由腹膜內力也藥。 19·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用’其中該已標記的annexin係經由椎膜內施藥。 20·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由胸膜腔內施藥。 21·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之1使用’其中該已標記的 annexin 係經由淋巴內施藥。 22·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用’其中該已標記的annexin係經由肌肉內施藥。 23·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之*使用’其中該區域大槪包括該整個標的。 24·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡用’其中該區域大槪包括頭部或頭部的一部份。 2 5 ·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之*使用’其中該區域大槪包括心臟或心臟的一部彳分。 26·如申請專利範圍第1項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡 β使用’其中該區域大槪包括肝臟或肝臟的—部份。 34 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I n n I I i n n ,—·—11111 I n n ϋ n ϋ I n ϋ n I n n ϋ ϋ ϋ n ϋ ϋ ϋ I ϋ I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵“视公楚） 541184 3006pifi.doc/012 A8 R8 C8 D8 六、申請專利範圍 27· —標記有一生物相容的放射核種之一爾類辛 (Annexin)用以顯像哺乳類標的體內一區域細胞死亡之使用，包括有： (a) 對該標的施用標記有一生物相容的放射核種之 ' I annexin ； (b) 測量該標的中該放射性核種之放射能量，以建構出一放射影像；其中該影像代表該哺乳類標的中該區域之細胞死亡。 28. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射性核種係選自I 123、I 131、Ga 67、 In 111、F 18以及Tc99m所組成的族群。 29. 如申請專利範圍第28項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射性核種係Tc99m。 30. 如申請專利範圍第29項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該Tc99m係藉由hydrazino nicotinamide (HYNIC)連結至該annexin上。 31. 如申請專利範圍第29項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中Tc99m標記之annexin之施予劑量是界於5 到 20 mCi 〇 32. 如申請專利範圍第29項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（2】〇χ297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ·________tr_____________________________ 541184 3006pif3.doc/012 A8 R8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍亡之使用，其中該放射能量之測量是使用迦瑪射線檢測裝置° 33.如申請專利範圍第32項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使，其中該迦瑪射線檢測裝置係一迦瑪閃光攝影 34·如申請專利範圍第32項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，.其中用以建構該影像之迦瑪射線能量之測量，係在該已標記的annexin施藥後的5分鐘至2小時內進行。 35·如申請專利範圍第34項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中用以建構該影像之迦瑪射線能量之測量，係在該已標記的annexin施藥1小時後進行。 36. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該細胞死亡係因細胞自滅所造成。 37. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，更包括在特定時間間隔內重複(b)步驟，其中重複該步驟能有效追蹤在一段時間內該區域放射能量強度之變化，以反映出進行細胞死亡之細胞數目的變化。 38·如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死 36 ϋ紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（2】0 X 297公爱Γ --------I---I I Aw - IIIIIII ^« — — — — — — 1— —^wi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541184 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 3006pif3.doc/012 Π8 _ 六、申請專利範圍亡之使用，更包括在特定時間間隔內重複(b)步驟，其中重複該步驟能有效追蹤在一段時間內該區域放射能量強度之變化，以反映出進行細胞死亡之細胞位置的變化。 39/如申請專利範圍第32項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射檢測裝置是一立體顯像攝影機。 40. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該annexin是 annexin V ° 41. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記之annexin的施藥劑量是小於 300pg protein/kg 〇 42·如申請專利範圍第41項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin的施藥劑量是介於1〜 1 Opg protein/kg 〇 43·如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由靜脈內施藥。 44·如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由腹膜內施藥。 45·如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容 37 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ297公f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ··________訂_________線—·_________」____________ 541184 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Qg 3006pif3.doc/012 D8 — 丨丨 -—— --——- —--- 六、申請專利範圍的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的armexin係經由椎膜內施藥。 46. 如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使角，其中該已標記的annexin係經由胸膜腔內施藥。 47. 如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由淋巴內施藥。 48·如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該已標記的annexin係經由肌肉內施藥。 49.如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該區域大槪包括該整個標的。 5〇.如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像晡乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該區域大槪包括頭部或頭部的一部份。 51. 如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該區域大槪包括心臟或心臟的一部份。 52. 如申請專利範圍第27項所述標記有一生物相容的放射核種之爾類羊用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該區域大槪包括肝臟或肝臟的一部份。 53·如申請專利範圍第1項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類半用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死 38 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .·--------tr---------ft-----------」---------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公釐） 541184 3006pifi.doc/0l2 A8 R8 C8 D8 六、申請專利範圍亡之使用，其中該細胞死亡係因細胞壞死所造成。 54·如申請專利範圍第27項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該細胞死亡係因細胞壞死所造成。 I 55.如申請專利範圍第1項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用’其中該放射檢測裝置係一陽電子放射檢測裝置。 1 纟&如申請專利範圍第29項中所述標記有一生物相容的放射核種之爾類辛用以顯像哺乳類標的體內區域細胞死亡之使用，其中該放射能量之測量係利用一陽電子放射檢測裝置。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 39 I -· I n I I I I I 一S^J I I I I n n I I — —— — — — — — — — — —— — — — — — — — — It 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297公爱）