KR20010020443A

KR20010020443A - 생체내 세포 치사를 이미지화시키는 방법

Info

Publication number: KR20010020443A
Application number: KR1019997010074A
Authority: KR
Inventors: 프란시스 지. 블랑켄버그; 에이치. 더블유. 스트라우스; 조나단 에프. 타이트; 피터 디. 케이트시키스
Original assignee: 캐서린 구; 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버서티 이사회; 엘. 데이예를 카렌.; 유니버시티 오브 워싱톤
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2001-03-15
Also published as: JP4963748B2; NZ500598A; EP1017318A4; DE69838811D1; TW541184B; CA2288131A1; US20070243133A1; US7357915B2; HUP0001261A3; US7666389B2; ATE379990T1; JP2002500757A; EP1017318A1; WO1998048699A1; DE69838811T2; HUP0001261A2; US20080138279A1; ES2398118T3; PL336571A1; US6197278B1

Abstract

본 발명은 방사성 표지된 아넥신을 사용하여 생체내 고사를 이미지화하는 방법에 관한 것이다.

Description

생체내 세포 치사를 이미지화시키는 방법 {METHOD OF IMAGING CELL DEATH IN VIVO}

고사(apoptotic) 또는 프로그래밍된 세포 치사는 진행 중인 다수의 항상성 및 질병 과정에 중요한 역할을 한다(Tompson, 1995). 따라서, 다양한 질병의 신규 치료 방법이 고사 세포 치사의 변형을 통해 가능할 수 있다. 고사 세포 치사를 촉진시키거나 억제하기 위한 신규 약제의 연구는 생체내 고사 세포 치사를 검출하고 모니터링하는 비침습성 방법의 결여로 방해되어 왔다.

지질 양자 핵자기 공명 분광법(¹H NMRS)은 고사 세포 치사가 진행되는 림프아세포의 혈장막 및 기타 세포계의 유동성 및/또는 조성물의 특이적 변화를 검출하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다(Blankenberg, et al., 1996). 고사(apoptosis) 연구를 위한 지질¹H NMRS의 임상적 용도는 최근 많은 조직 및 기관에서 본래 발견되는 복잡성 국부 자기 미소환경으로 제한되어 있다.

발명의 요약

본 발명의 일면은 생체내 포유 동물 시험체의 영역에서 세포 치사(예를 들어, 고사 또는 회저로 인한 세포 치사)를 이미지화시키는 방법을 포함한다. 이 방법에는 (a) 대상에 생체적합성 방사성 핵종으로 표시된 아넥신을 투여하는 단계, (b) 표지된 아넥신이 대상에 편재될 수 있는 일정 기간이 지난 후, 시험체를 방사선 검출 장치의 검출 영역내에 위치시키는 단계 및 (c) 방사선 검출 장치를 사용하여 시험체내 편재된 방사성 핵종으로부터 방사선 방출을 측정하여, 포유 동물 시험체의 영역에서 세포 치사를 나타내는 방사선 방출의 이미지를 형성하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 (d) 이미지를 처리하여 신장의 비특이적 편재화와 같은 표지된 아넥신의 비특이적 편재화로 인한 시그날을 공제하는 단계를 추가로 포함한다.

상기 방법에 유용한 방사성 핵종에는 요오드 123, 요오드 131, 갈륨 67, 인듐 111, 불소 18 및 테크네튬 99m(Tc99m)이 포함된다. 불소 18은 양전자 방사체이며, 따라서 양전자 방출 단층 촬영법(positron emission tomography: PET)에 유용하다. 요오드 123, 요오드 131, 갈륨 67, 인듐 111, 불소 18 및 테크네튬 99m은 표준 감마선 방출 검출법에 유용하다. Tc99m은 본 발명의 방법에 유용한 방사성 핵종이다. 바람직한 구체예에서, Tc99m은 히드라지노 니코틴아미드(HYNIC)를 통해 아넥신에 결합된다. Tc99m 표지된 아넥신은 일반적으로 약 5 내지 약 20mCi의 투여량으로 투여된다.

본 발명의 일반적인 일 구체예에서, 방사선 검출 장치는 감마선 검출 장치이며, 측정되는 방사선 방출은 감마선 방출이다. 또 다른 일반적인 구체예에서, 방사선 검출 장치는 양전자 방출 검출 장치이며, 검출되는 방사선 방출은 양전자 방출이다.

또 다른 일반적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 추가로 선택적 간격으로 단계(b) 및 (c)를 반복적으로 포함하며, 이러한 반복은 세포 치사가 진행되는 다수의 세포에서의 변화를 반영하여, 시간에 따라 영역으로부터 방사선 방출(예를 들어, 감마선 또는 양전자 방출)의 강도 변화를 추적하는 데 효과적이다.

또 다른 일반적인 구체예에서는 선택적 간격으로 단계(b) 및 (c)를 반복하여 포함하며, 이러한 반복은 세포 치사가 진행되는 세포의 위치 변화를 반영하여, 시간에 따라 영역으로부터 감마선 방출의 편재화 변화를 추적하는 데 효과적이다.

방사선 검출 장치는 예를 들어, 앤저 감마선 섬광 카메라(Anger gamma scintillation camera) 또는 3차원 이미지화 카메라를 들 수 있다.

본 발명에 사용하기에 바람직한 아넥신은 아넥신 V이다. 이는 약 300㎍ 단백질/kg 미만, 바람직하게는 약 1 내지 10㎍ 단백질/kg의 투여량으로 투여되는 것이 일반적이다. 투여 경로는 여러가지가 가능하며, 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 초내 및 흉막내 투여가 포함된다.

이미지를 형성하기 위한 감마선 방출 측정은 일반적으로 표지된 아넥신의 투여 후, 약 5분 내지 약 2시간 사이에 수행된다. 일 구체예에서, 이미지를 형성하기 위한 감마선 방출의 측정은 표지된 아넥신을 투여한 후 약 1시간 후에 수행된다.

시험체의 상이한 부분은 본원에 기재된 방법을 사용하여 이미지화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 영역은 실질적으로 시험체 전부, 또는 두부 또는 그의 일부, 심장 또는 그의 일부, 간 또는 그의 일부 등과 같은 시험체의 부분을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 생체내 세포 치사를 이미지화하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 (i) 예를 들어 물질 및 방법(A)에 기재된 바와 같이 제조된 HYNIC 표지된 아넥신을 함유하는 밀봉된 바이알, (ii) 예를 들어 물질 및 방법(B)에 기재된 바와 같이 제조되고, N₂하에 유지되는 Sn-트리신 용액을 함유하는 밀봉된 바이알, 성분(i) 및 (ii)와 함께 Tc-99m를 사용하여 Tc-99m 표지된 아넥신을 제조하기 위한 설명서, 및 (iv) Tc-99m 아넥신을 투여하여 생체내 세포 치사 영역을 이미지화하기 위한 설명서를 포함한다. 일 구체예에서, 키트는 -70㎍에서 유지되고, 드라이 아이스 상에서 수송된다. 또 다른 구체예에서, HYNIC 표지된 아넥신은 동결건조된다.

상기 목적 및 그 밖의 목적과 본 발명의 특징은 첨부되는 도면과 함께 하기 상세한 설명을 숙지하는 경우에 보다 완전히 이해될 것이다.

본 발명은 생체내 세포 치사를 이미지화시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감마선 이미지화를 사용하여 세포 치사 이미지 영역에 대한 방사성 표지된 아넥신(annexin)의 사용에 관한 것이다.

참고 문헌

도 1은 Tc-99m HYNIC 아넥신 V로 검출된, Fas 매개된 전격성 간장 고사를 나타내는 컴퓨터에 의한 이미지이다.

도 2는 Fas 매개된 전격성 고사 동안에 Tc-99m HYNIC-난알부민으로부터의 시그날을 나타내는 컴퓨터에 의한 이미지이다.

I. 정의

"세포 치사 검출" 또는 "세포 치사 편재화"와 관련한 용어 "세포 치사"는 온전하지 않은 혈장 막을 갖는 세포 뿐만 아니라 포유 동물의 세포가 치사하는 과정을 말한다. 이러한 과정은 고사 및 고사와 관련되는 것으로 여겨지는 과정(예를 들어, 세포 노화) 뿐만 아니라 회저를 포함한다. "세포 치사"는 본원에서 유핵 세포(예를 들어, 뉴우런, 근세포, 간세포 등)의 치사 또는 급박한 치사 뿐만 아니라 무핵 세포(예를 들어, 적혈구, 혈소판 등)의 치사 또는 급박한 치사를 말한다.

"생체적합 방사성 핵종" 또는 "생체적합 방사성동위원소"는 핵 의학 적용을 위해 환자에게 주입하는 데 유용한 것으로 인정된 동위원소이다. 생체적합 방사성 핵종의 예에는 요오드 123, 요오드 131, 갈륨 67, 인듐 111, 불소 18 및 테크네튬 99m을 포함한다.

II. 세포 치사 - 고사 및 회저

고사는 "프로그래밍된 세포 치사"를 말하며, 이로써 세포는 "세포 자발적 치사" 프로그램을 수행한다. 고사 프로그램은 실질적으로 모든 다세포 유기체 중에서 뿐만 아니라 특정 유기체의 모든 세포 중에서 진화적으로 보존되는 것으로 여겨진다. 또한, 많은 경우에, 고사는 건강한 생존 세포에서 활성적으로 억제되어야 하는 "결함" 프로그램일 수 있다.

세포에 의해서 고사에 따르게 되는 결정은 다양한 규제되는 자극 및 환경 인자에 의해 영향받을 수 있다(Thompson, 1995). 고사의 생리적 활성인자에는 종양 회저 인자(TNF), Fas 리간드, 형질전환 성장 인자 β, 신경전달물질 글루타메이트, 도파민, N-메틸-D-아스파르테이트, 성장 인자의 중지, 매트릭스 부착의 소실, 칼슘 및 글루코코르티코이드가 포함된다. 고사의 손상 관련 유발 인자에는, 열쇼크, 바이러스 감염, 세균 독소, 종양 유전자 myc, rel 및 EIA, 종양 억제제 p53, 세포 융해 T-세포, 산화제, 유리 라디칼, 영양소 부족(항대사물)이 포함된다. 치료 관련 고사 유발인자에는 감마선 조사, UV 조사, 및 시스플라틴, 독소루비신, 블레오마이신, 시토신 아라비노사이드, 질소 머스타드, 메토트렉세이트 및 빈그리스틴과 같은 다양한 화학치료제가 포함된다. 고사의 독소 관련 유발 인자에는 에탄올 및 β-아밀로이드 펩티드가 포함된다.

고사는 뉴우런과 같이 정상적으로 재생하지 않는 세포에서 병적으로 발생하는 경우에 특히 치명적인 결과를 가질 수 있다. 이러한 세포는 치사하는 경우에 대체되지 않기 때문에, 이들 세포의 손실은 쇠약하거나, 때로 영향받는 기관에 치명적인 기능장애를 유발할 수 있다. 이러한 기능 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 외측 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 변성을 포함하는, 증가된 고사와 관련된 다수의 신경 변성 질환으로 입증된다.

바람직하지 않은 고사의 결과는 심근 경색의 경우에서 일반적으로 발생하는 것과 같은 국소 빈혈 손상을 포함하는 그 밖의 병에서도 유사하게 치명적일 수 있다. 특히, 고사는 약한 병소의 국소 빈혈 후에 매우 지연된 경색에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(Du, et al., 1996). 증가된 고사와 관련된 이외의 질병에는 AIDS, 형성불능성 빈혈증과 같은 골수이형성 증후군, 및 알코올 과소비로 인한 손상을 포함하는 독소 유도 간 질병을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

회저는 고사 이외의 원인(즉, 세포의 자발적 치사 프로그램의 수행 이외의 원인)으로 인한 세포 또는 조직의 편재된 치사이다. 회저는 외상성 손상, 세균 감염, 급성 저산소혈증 등에 의해 유발될 수 있다. 두가지 형의 세포 치사에는 중복되는 부분이 있으며, 일부 자극은 손상의 중증도에 따라 회저 또는 고사 또는 둘모두를 어느 정도 유발시킬 수 있다.

III. 생물학적 막의 비대칭

일반적으로, 생물학적 막은 특이적 막 인지질에 대해 비대칭인 것으로 여겨진다. 특히, 진핵세포 혈장막의 외측 소편은 스핑고미엘린 및 포스파티딜콜린(PC)와 같이 주로 콜린인지질로 형성되나, 내측 소편은 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)와 같은 아미노인지질을 주로 함유한다. 이러한 비대칭은 두층의 소편 사이에서 PS 및 PE를 선택적으로 운반하는 아데노신 트리포스페이트(ATP) 의존 아미노인지질 트랜스로카아제의 활성에 의해 유지되는 것으로 여겨진다(Seigneuret and Devaux, 1984). 소편 사이에서의 인지질의 운반에 관여하는 것으로 여겨지는 다른 효소에는 ATP 의존 플로파아제(Conner, et al., 1992) 및 지질 스크람블라아제(scramblase)(Zwaal, et al., 1993)가 포함된다.

비대칭이 정상 세포에 대해 표준인 것으로 나타나지만, 이러한 비대칭의 손실은 특정 생리적 과정 뿐만 아니라 병원(病原) 과정과 관련된다. 예를 들어, 혈장 막("PS 노출")의 외측 소편 상의 PS의 출현으로 검출된 막 비대칭은 고사, 선행 DNA 단편화, 혈장 막 수포화 및 막 완전성 손실의 최초 징후중 하나인 것으로 인식되었다(Martin, et al., 1995; Fadok, et al., 1992).

유사한 재배향이, 겸상 적혈구 질병(Lane, et al., 1994), β-탈라세미아(Bornstain-Ben Yashar, et al., 1993), 혈소판 활성화 및 PS 운반에 결함이 있는 일부 변이 종양 세포계에서 관찰되었다. 외측 소판 상의 PS의 점증적 출현은 또한 노화하는 적혈구 세포에서 발생하는 것으로 관찰되었다(Tait and Gibson, 1994). 이러한 세포 상의 PS 노출이 한계 수준에 이르게 되는 경우, 세포는 마아크로파아지에 의해 순환으로부터 제거된다(Pak and Fidler, 1991). 상기 상태는 모두 관련된 세포(즉, PS에 상당히 노출된 세포)의 치사시에 거의 극에 이른다.

PS 노출은 고사 및 회저 둘 모두에서의 구성 요소임을 알 수 있을 것이다. 고사의 초기 단계에서의 역할은 상기에 요약되어 있다. 고사 세포가 고사의 마지막 단계에 이르게 되면(즉, 막의 완전성 손실), 두 혈장 막 소판의 PS는 세포외 매질로 "노출"될 것이다. 회저에 의한 세포 치사에서 유사한 상황이 있는 경우에, 막 완전성의 손실은 개시 인자이거나, 회저 세포 치사 과정의 조기에 발생하며, 이에 따라 두 혈장 막 소편이 "노출"되기 때문에, 이러한 회저 세포 또한 "노출된" PS를 갖는다.

IV. 아넥신

아넥신 류 단백질이 본 발명의 실시예 유용하다. 아넥신 V는 일반적으로 태반, 림프구, 단핵 세포, 담관 및 신장 (피층) 관상 상피를 포함하는 다수의 세포의 세포질에 고수준으로 발견된다. 아넥신의 생리적 기능이 완전히 밝혀진 것은 아니지만, 아넥신의 몇몇 특성은 진단제 및/또는 치료제로서 유용하게 한다. 특히, 아넥신은 포스파티딜세린(PS)의 노출 표면을 갖는 막 소편과 같은 음이온성 인지질 표면에 대해 매우 높은 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

V. 실험 결과의 개요

본 발명을 지지하기 위해 수행된 실험은 방사성 표지된 아넥신의 투여가 생체내 세포 치사를 이미지화하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 예를 들어, 실시예 1의 실험은 쥐의 정제된 Jo2 항체 주입에 반응하는 Fas 매개된 간세포 치사의 이미지화 및 정량화를 기술하고 있다(Ogasawara, et al., 1993). 이러한 실험의 결과(예를 들어, 도 1 참조)는 특히 Jo2 항체 주입 후의 Fas 매개된 간세포 치사로 인해 1시간 및 2시간 각각에 방사성 표지된 아넥신 V의 간 흡수시 2배 및 4배 증가함을 보여준다. 처리 후 비장 흡수 초기에 일시적인 2배 증가가 또한 관찰되었고, 이후 이것은 대조군 값으로 떨어졌다. 이러한 비장으로부터 시그날의 쇠퇴는 처리 후 Fas 매개된 고사의 격발에 반응하는 순환하는 비장 림프구의 신속한 제거로 인한 것일 수 있다.

아넥신 결합이 신장에서도 관찰되었다. 그러나, 이러한 결합은 고사 유도 자극의 부재하에서 존재하며, 사실상 간세포 시그날이 증가함에 따라 감소한다. 동일 기간 후에 간 흡수가 증가하면서, 항 Fas Ab 투여 후 시간이 경과함에 따라 신장 활성이 점증적으로 감소하는 것은 아넥신 V에 대한 비고사 관련 신장 친화성이 고사 조직의 것보다 낮다는 것을 의미한다. 주입된 아넥신 V의 신장 피질 결합은 부분적으로는 신장 관상 인지질과의 아넥신의 교차 반응성에 의한 것일 수 있다.

표지된 아넥신의 신장 배설 작용은 거의 없으며, 이는 방사성 표지(이 경우에, Tc99m)가 실험 기간 동안에 아넥신에 결합되어 존재함을 시사하는 것으로 인지되어야 할 것이다. 또한, 주입된 Tc99m 표지된 아넥신은 반감기가 약 3 내지 7분인 혈청을 가지는 혈류로부터 신속하게 제거되었다. 이러한 인자는 투여 후 1 내지 2시간 후에 방사성 약물 시그날의 이미지화를 가능하게 하였다.

상기 기재된 특성은 방사성 표지된 아넥신 V의 주입 시간에 따른 관심있는 조직 또는 기관에 대한 고사 활성의 속사를 나타내어 각각을 연소적으로 매일 (또는 2일마다) 이미지 연구를 가능하게 한다.

VI. 생체내 세포 치사 이미지화

본 발명은 일면에서 생체내 포유 동물 시험체의 영역에서 세포 치사(예를 들어, 고사 또는 회저로 인한)를 이미지화하는 방법을 포함한다. 이 방법에서 방사성 표지된 아넥신(예를 들어, 테크네튬 99m 표지된 아넥신 V)가 시험체에 투여된다. 시험체내에서 컨쥬게이트가 편재될 수 있는 기간이 경과한 후, 시험체를 감마선 검출 장치의 검출 영역내에 둔다. 시험체가 사실상 부동화 상태로 유지되면서 테크네튬 99m으로부터의 감마선 방출이 감마선 방출 장치를 사용하여 측정된다. 측정 단계 후, 감마선 방출의 이미지가 구성된다. 이렇게 구성된 이미지는 이후 포유 동물 시험체의 또는 분석하려는 포유 동물의 시험체 영역의 세포 치사 영역의 맵 또는 편재화로 임상학자에게 제공되어 사용된다.

상기 방법을 사용하여 얻어진 이미지를 용이하게 해석하기 위해, 이미지는 하기 보다 상세히 기재되는 바와 같이 아넥신/Tc99m 컨쥬게이트의 기준선, 잡음 및/또는 비특이적 편재화(예를 들어, 신장 편재화)를 걸러내기 위해 디지털 방식으로 처리될 수 있다.

상기 방법의 이점은 감마선 방출을 측정하고, 선택된 간격으로 이미지를 형성하므로써, 상기 방법은 세포 치사가 진행되는 다수의 세포의 변화를 반영하는, 시간에 따른 시험체로부터의 감마선 방출 세기의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있다.

A. 방사성 표지된 아넥신의 합성

본 발명은 정제된 천연, 재조합 또는 합성 제조된 아넥신을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 아넥신 V는 사람 태반으로부터 용이하게 정제될 수 있다(Funakoshi, et al., 1987). 그러나, 재조합 아넥신은 제조의 용이성 및 경제적 효율성을 포함하는 수개의 이점을 제공한다. 다수의 상이한 아넥신이 사람 및 기타 유기체로부터 클로닝되었다. 이들의 서열은 유전자 은행을 포함하는 서열 데이타베이스에서 입수할 수 있다.

본 발명은 몇몇 이유로 아넥신 V를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 첫째, 아넥신 V는 가장 풍부한 아넥신 중 하나이며, 둘째, 천연 또는 재조합 공급원으로부터 제조가 간단하고, 셋째, 인지질 막에 대해 높은 친화성을 갖는다(Tait, et al., 1988). 사람 아넥신 V는 분자량이 36kd이고, 포스파티딜세린(PS)에 대해 높은 친화성(kd = 7nmol/L)을 갖는다. 사람 아넥신 V의 서열은 수탁 번호 U05760-U05770으로 유전자 은행으로부터 입수될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 아넥신을 제조하는 데 적합한 예시적 발현 시스템이 물질 및 방법 부분에 언급된다. 이러한 발현 시스템은 대장균내 pET12a 발현 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin)를 사용한다.

또 다른 박테리아 발현 벡터가 사용될 수 있다. 이들 벡터에는, 예를 들어,플라스미드 pGEX(Smith, et al., 1988) 및 이들의 유도체(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ로부터의 pGEX 계열)가 포함된다. 이들 벡터는 글루타티온-S-트랜스퍼라아제로 프레임내 융합된 클로닝된 인서트의 폴리펩티드 서열을 발현시킨다. 재조합 pGEX 플라스미드는 적합한 균주의 대장균으로 형질전환될 수 있으며, 유합 단백질 생성은 IPTG(이소프로필티오 갈락토피라노사이드)의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 이후 용해된 재조합 융합 단백질은 표준 방법(Ausubel, et al.)에 따라 글루타티온 아가로오스 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유도된 배양물질의 세포 융해물로부터 정제될 수 있다. 이외 상업적으로 입수할 수 있는 발현 시스템에는 이스트 발현 시스템, 예컨대 인비트로겐(Invitrogen, San diego, CA)사로부터의 피키아(Pichia) 발현 키트; 바쿨로바이러스 발현 시스템(Reilly, et al.; Beames, et al.; Clontech, Palo Alto CA); 및 포유 동물 세포 발현 시스템(Clontech, Palo Alto Ca; Gibco-BRL, Gaithersburg MD)이 포함된다.

많은 특성이 리이더 서열과 같은 발현 벡터로 조작되어, 배지로의 발현 서열의 배설을 촉진할 수 있다. 이러한 재조합에 의해 생성된 폴리펩티드는 일반적으로 융해된 세포 또는 배지로부터 분리된다.

상기 기재된 바와 같이 생성된 분리된 재조합 폴리펩티드는 시차 침전, 분자체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 등전 집속(isoelectric focusing), 겔 전기이동 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 표준 단백질 정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 단백질 제제는 또한 예를 들어 여과에 의해 농축될 수 있다(Amicon, Danvers, Mass.).

상기 기재된 바와 같이 생성된 아넥신은 이후 선택된 방사성 핵종으로 표지된다. 선택된 특정 동위원소는 청구되는 방법의 특정 적용에 의존할 것이다.

본 발명은 최근 입수할 수 있는 여러 방사성 핵종중 하나로 실시될 수 있다. 적합한 방사성 핵종을 선택함에 있어서, 실시자들은 일반적으로 본 발명의 특별한 적용을 고려하면서, 핵 이미지화에 통상적인 인자를 함께 고려해야 할 것이다. 이러한 인자에는 (i) 최소의 입자 방출, (ii) 약 50 내지 500kEv의 일차 양자 에너지, (iii) 투여용 물질을 제조하는 데 요구되는 시간보다 더 긴 물리적 반감기, (iv) 이러한 방사성 핵종으로 표지된 아넥신의 조사 시간보다 긴 효과적인 반감기, 적합한 화학적 형태 및 반응성, 저독성, 안정성 또는 근접 안정성이 포함된다.

예시적인 방사성 핵종은 Tc99m이며, 이는 반감기가 약 6시간이고, 높은 특이적 활성으로 아넥신을 표지하는 데 사용될 수 있다. Tc99m은 상기 기준의 대부분을 이행하며, 80%를 넘는 핵 의학 이미지화 절차에 사용되고 있다. 사용될 수 있는 또 다른 동위원소에는 요오드 123(반감기 약 13.2시간), 요오드 131(반감기 약 8일), 갈륨 67(반감기 약 78시간) 및 인듐 111(반감기 약 2.8일)이 포함된다.

아넥신과의 동위원소의 결합은 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, Tc99m은 하기 물질 및 방법 부분에서 기재되는 바와 같이, 입수될 수 있는(예를 들어, AnorMED, Langley, British Columbia, Canada로부터 입수) 히드라지노 니코틴아미드(HYNIC)를 사용하여 아넥신에 결합될 수 있다. 갈륨 67 및 인듐 111은 예를 들어 본원에서 참고문헌으로 인용되는 문헌(Hnatowich, et al.)의 방법을 사용하여 단백질을 방사성 표지하는 데 사용될 수 있다.

방사성 핵종으로 단백질을 표지하는 그 밖의 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,552,525호(1996.9.3 공고(Dean))에는 테크네튬-99m(Tc-99m) 표지된 펩티드를 제조하는 방법을 기술하고 있다. Tc-99m으로 펩티드 및 폴리펩티드를 표지하는 방법은 또한 미국 특허 제 5,443,815호 및 제 5,508,020호에 기재되어 있다. 린드(Lind, 1990) 등은 Tc-99m 표지된 단일클론성 항체를 설명하고 있다. 라무라글리아(LaMuraglia, 1989) 등은¹¹¹In 표지된 비특이적 사람 면역글로불린을 설명하고 있으며, 피시맨(Fischman, 1991) 등은 화학주성 포르밀 펩티드(fMLF)-¹¹¹In 표지된 DTPA 컨쥬게이트를 설명하고 있다.

B. 방사성 표지된 아넥신의 투여

방사성 표지된 아넥신은 방사성 표지된 화합물을 투여하기 위한 표준 원안을 사용하여 투여될 수 있다. 투여량은 두가지 주요 고려 사항으로서, (i) 주입되는 방사성 핵종의 양 및 유형, 및 (ii) 주입되는 아넥신 단백질의 양에 의존한다.

테크네늄 99m은 약 20mCi 이하의 투여량으로 성인에게 투여될 수 있다. 단일 Tc-99m 투여를 위한 바람직한 투여량은 약 5 내지 20mCi이다.

아넥신 V는 약 300㎍/kg를 넘는 투여량에서 약물 효과(항응집 효과)를 갖기 시작한다. 따라서, 본 발명(표지된 아넥신의 약물 효과를 피하고자 하는)의 진단 방법은 300㎍/kg 미만, 일반적으로는 약 50㎍/kg 미만의 투여량으로 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 미량의 투여량(예를 들어 10㎍/kg 내지 50㎍/kg)은 동물 또는 사람 시험체에서의 약물 또는 독성 부작용에 대해 보고된 바 없다.

방사성 표지된 아넥신은 일반적으로 살균 염수와 같은 적합한 운반 비히클 중에서 현탁된다. 이러한 비히클은 또한 당해 공지되어 있는 안정제, 담체, 부형제, 안정화제, 유화제 등을 함유할 수 있다.

방사성 표지된 아넥신은 핵 의학 이미지화를 위한 방사성 표지된 단백질의 투여에 적합한 것으로 공지된 몇몇 경로로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방법은 정맥내(i.v.) 주입이다. 이 방법은 심장, 간, 비장 등과 같은 혈관이 많은 내부 기관을 이미지화하는 데 특히 적합하다. 방사성 약품의 정맥내 주입을 위한 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성 표지된 약품은 일반적으로 올덴도르프/토우니켓(Oldendorf/Tourniquet) 방법 또는 정맥내 밀어넣기 방법(예를 들어, Mettler and Guierbteau, 1985, Appendix D)을 사용하는 식괴(bolus) 주입으로 투여된다.

뇌를 이미지화하기 위해, 표지된 아넥신은 초내(intrathecal) 투여될 수 있다. 초내 투여는 대뇌 척수액(CSF)을 함유하는 지주막 아래 공간에 화합물을 직접 전달한다. 척수 영역으로부터 전달은 또한 지주막 외부의 척수 영역으로의 경막외 주입에 의해 달성될 수 있다.

또 다른 투여 형태에는 복강내(예를 들어, 신장 투석중인 환자를 위해) 및 흉막내 투여가 포함되다. 특정 적용을 위해, 본 발명은 근육내 주사, 피하, 임파선내, 취입 및 경우, 질내 및/또는 직장내 투여를 포함하는 추가의 전달 형태를 고려할 수 있다.

상기 기재된 투여 형태를 실시하는 방법은 당해 공지되어 있다.

C. 방사성 표지된 아넥신의 편재화

표지된 아넥신이 투여된 후, 표적 조직 또는 기관에 편재되도록 한다. 본원에서 편재화는 시험체내 결합되어 있는 "편재된 아넥신과 결합되지 않은 "유리된" 표지된 아넥신 간에 평형 또는 가정상 상태가 달성된 경우의 상태를 의미한다. 이러한 편재화에 요구되는 시간은 일반적으로 1 내지 10분 정도이다. 이것은 표지된 아넥신의 혈청 반감기에 의한 추정될 수 있다. Tc-99m 표지된 아넥신 V가 정맥내 주입되는 경우, 혈청 반감기는 약 3 내지 7분이다. 편재화 시간은 또한 표지된 아넥신과의 표적 조직의 접근도에 의존한다. 이는 또한 당해 인지된 투여 형태에 의존한다.

이미지화는 바람직하게는 대부분의 표지된 아넥신이 표적 물질에 편재된 후에 개시된다. 예를 들어, Tc-99m 표지된 아넥신 V가 정맥내 투여된 경우에, 수개의 반감기 후에 이미지화가 일어난다. 약 10개의 반감기 기간(아넥신/Tc-99m 컨쥬게이트의 경우에 약 30 내지 70분)은 거의 완전한 편재화를 달성하기에 충분한 시간인 것으로 간주된다. 그러나, 당해 기술자는 상기 기재된 약 10개의 반감기 시점보다 짧거나 오랜 시점에서 이미지화가 수행되는 것이 바람직할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 혈관 손상으로 인한 세포 치사를 이미지화함에 있어서, 표적 조직의 접근도는 매우 높아, 특히 낮은 투여량의 표지된 아넥신이 순환 수준으로부터의 시그날을 최소화하기 위해 점증적으로 투여되는 경우에 단지 수분 후에 표적 부위로부터 강한 시그날을 얻을 수 있다.

상기 경우 모두에 있어서, 편재화 달성을 위한 시간을 적당하게 추정하는 것은 당해 기술자들에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 시간의 함수로서 편재화 상태는 본 발명의 방법에 따라 표지된 아넥신으로부터 감마선 시그날을 이미지화하므로써 수행될 수 있다.

D. 감마선 검출 장치

감사선 이미지화 장치는 시험체로부터 시간이 경과함에 따라 방출되는 감마선으로부터의 상승하는 신호를 축적하므로써 작동한다. 가장 광범위하게 사용되는 감마선 검출 방법중 하나는 앤저 감마선 섬광 카메라이다(Mettler and Guiberteau, 1985). 이는 방사성 핵종에 의해 방출된 감마선을 광자로 전환시키고(보통 NaI(TI) 결정을 사용하여), 이후, 광전 배증관(PMT)에서 증폭시키고, 전압 시그날로 전환시킨 후, 이미지를 구성하는 데 사용된다. 앤저 섬광 카메라의 구성 요소로는 일반적으로 시준기, 섬광 결정, PMT의 어레이(array), 펄스 높이 분석기, 음극선 튜브(CRT) 및 대조군 콘솔(console)이 포함된다. 카메라 시스템은 또한 일반적으로 컴퓨터를 포함한다. PMT와 디스플레이(예를 들어, CRT) 간의 프로세싱은 아날로그 또는 디지탈 방식일 수 있다. 앤저 감마선 섬광 카메라의 이론 및 작동에 대한 상세한 설명은 많은 논평 및/또는 핵 의학 서적로부터 알 수 있다(참조예: 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 Mettler and Guiberteau, 1985).

보다 상세한 이미지는 3차원 이미지를 발생시키는 방출-컴퓨터화 단층 촬영(ECT)을 사용하여 얻을 수 있다. ECT의 주요 두가지 유형은 Tc-99m과 같은 동위원소를 사용하는 단일 광자 방출-컴퓨터화 단층 촬영(SPECT) 및 고도의 정확한 편재화를 제공하는 고에너지(511-keV) 폭사(annihilation) 광자에 의존하는 양전자 방출 단층 촬영(PET)이다. PET의 단점은 일반적으로,¹¹C,¹³N 및¹⁸F과 같은 생존이 짧은 사이클로트론 생성 동위원소를 사용한다는 것이다. 한편, SPECT는 본원에서 기재된 유형의 방사성 약품(예를 들어, Tc-99m)에 사용될 수 있다.

SPECT 시스템에는 일반적으로 환자에 대해 원형 또는 타원형 궤도로 회전할 수 있는 하나 또는 두개의 컴퓨터 제어되는 앤저 감마선 섬광 카메라가 포함된다. 이러한 SPECT 카메라는 많은 공급사로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 지멘스(Des Plains, IL)는 "E-CAM", "ORBITER", "ECAT", "MULTISPECT 3", "MULTISPECT 2" 및 "DIACAM"을 포함하는 카메라를 판매하고 있다.

상기 기재된 바와 같은 카메라는 일반적으로 디지탈 파일로서 이미지를 처리하여 바탕값을 공제하고, 의사 색 등을 가산하는 통합 이미지 프로세서를 포함한다. 이미지가 디지탈 파일의 형태로 존재하게 되면, 이러한 이미지는 IBM 호환성 PC 또는 애플 맥킨토시(Apple Computer, Cupertino, CA)와 같은 PC로 여러 이미지 프로세싱 프로그램에 의해 처리되고, 인쇄될 수 있다.

E. 시험체를 감마선 검출 장치 영역에 배치

1. 장치의 검출 영역

상기 장치의 검출 영역은 일관되고 신뢰성 있는 감마선 방출이 얻어질 수 있는 영역으로 정의된다. ECT가 이미지를 발생시키는 데 사용되는 경우, 장치의 검출은 감마선 방출이 확실하게 측정될 수 있는 전체 공간이거나 ECT 시스템이 프로그래밍되어 스캔닝되는 공간의 일부이다. 이러한 공간은 단일 비-ECT 카메라의 검출 영역보다 상당히 더 큰 것이 일반적이다.

동물 또는 시험체 전체를 반드시 감마선 검출 장치의 검출 영역내에 둘 필요는 없는 것으로 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 특정 기관으로부터 시그날을 측정하고자 하는 경우, 목적하는 정보를 얻기 위해서는 상기 특정 기관을 함유하는 영역의 시그날과 및 충분한 주변의 "어두운" 영역을 측정하기만 하면 된다.

2. 시험체의 배치: 부동화

이미지를 발생시키는 데 사용되는 시그날을 수집하기 위해, 이미지를 구성하는 데 사용될 감마선이 측정되는 기간 동안 광검출 장치의 검출 영역에 시험체를 위치시킨다. 시그날이 약 20밀리초 미만으로 측정된 감마선 방출로부터 구성될 수 있도록 충분히 강한 경우 및/또는 시험체가 실질적으로 이미지를 악화시키기 충분한 이미지 평면에 대해 이동하지 않는 경우, 특별한 부동화 조치는 일반적으로 필요하지 않다. 필요한 것은 측정 기간 동안에 검출 장치의 영역에 시험체를 위치시키는 것이 전부이다.

한편, 감마선 방출 측정이 약 20밀리초보다 오래 걸리는 경우, 시험체가 흥분하여, 시험체의 흥분도와 같은 정도인, 감마선 방출 측정 동안에 시험체의 부동화를 보장하는 조치가 구성되는 이미지에 공간적 정보를 보존하기 위해 간주되어야 한다. 예를 들어, 시험체가 사람인 경우, 광자 방출 측정 시간은 수초 정도이며, 시험체는 간단히 감마선 방출 측정(이미지화) 동안에 가능한한 계속해서 유지될 수 있다. 한편, 시험체가 마우스와 같은 동물인 경우, 시험체는 예를 들어, 마취 또는 기계적 감금 장치를 사용하여 부동화시킬 수 있다.

여러 감금 장치가 구성될 수 있다. 예를 들어, 수십초 내지 수십분 동안 마우스를 부동화시키기에 적합한 감금 장치는 포움 쿠션 상에서 감마선에 투명한 시이트를 고정시키므로써 형성될 수 있다. 이러한 쿠션은 동물 두부용으로 한 단부에 만입부를 갖는다. 동물은 두부가 만입부 상에 놓이도록 시이트 아래에 위치하고, 자유롭게 호흡하도록 하나, 신체의 이동은 포움 쿠션에 의해 제한되게 된다.

이미지화된 영역은 실질적으로 시험체 전부 또는 세포 치사에 대해 진단되거나 모니터링 되어야 할 필요가 있는 시험체의 일부를 포함할 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 이러한 영역은 부속물 또는 이러한 부속물의 일부, 두부, 중추 신경계 또는 흉강 또는 복강과 같은 내부 공동만을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 영역은 기관 또는 그의 일부만을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 중추신경계, 뇌, 심장, 간, 비장, 폐, 골수, 또는 이들의 일부에서 세포 치사를 분석하는 데 적용될 수 있다. 또한, 분석된 영역은 예를 들어, 종양의 세포 치사를 유발하는 것에 대한 치료가 진행중인 암 환자의 종양으로 한정될 수 있다.

F. 감마선 방출의 이미지 구성; 이미지 프로세싱

대부분의 적합한 카메라에서, 감마선 방출의 측정은 다수개의 어레이로서 컴퓨터에 의해 저장되고/저장되거나 분석되는 CRT 상에 디스플레이될 수 있는 전압 시그날을 발생시킨다. 예를 들어, 이미지는 일반적으로 감마선 계수(고정된, 사전 선택된 값 또는 어떠한 픽셀에서 검출된 최대 수로)를 표준화시키고, 표준화된 수를 모니터 상에서 디스플레이되는 밝기(회색 계열) 또는 색(의사 색)으로 전화시키므로써 분석된다. 의사 색으로 표시되는 경우에, 일반적인 색 할당은 다음과 같다. 계수 제로를 가지는 픽셀은 흑색이고, 낮은 계수는 청색이며, 최고 감마선 계수 값은 적색이며, 그 이하로 파장이 증가함에 따라 색의 계수는 증가한다. 모니터 상의 색의 위치는 감마선 방출의 분포를 나타내며, 따라서 치사 세포 영역의 위치를 나타낸다.

예를 들어 세포 치상의 분포 및/또는 편재화에 대한 치료 효과를 기록하기 위한 시간에 따른 편재화 및/또는 시그날을 수행하고자 하는 경우, 감마선 방출의 측정 또는 이미지는 선택된 시간 간격으로 반복되어 일련의 이미지를 구성할 수 있다. 이러한 간격은 몇분으로 짧을 수도 있고, 몇일, 몇주, 몇달 또는 몇년으로 길 수도 있다.

본 발명의 방법에 의해 생성된 이미지는 여러 방법으로 분석될 수 있다. 이들은 단순한 육안 관찰, 지적 평가 및/또는 하드카피의 인쇄에서, 복잡한 디지탈 이미지 분석에 이르기까지 다양하다.

VII. 응용

방사성 표지된 아넥신 V의 주요 용도에는 발생하지 않아야 하는 질병 상태, 예를 들어, 루푸스, 이식 거부와 같은 면역 질환, 또는 심각한 국소 빈혈이 있는 세포에서 부적당한 고사의 검출 및 예를 들어 종양 또는 바이러스에 의해 감염된 세포에서와 같이, 고사가 발생하는 경우의 불충분한 고사의 검출이 포함된다.

본원에서 기재된 결과는 방사성 표지된 아넥신이 기관 및 골수 이식 거부 또는 손상, 감염 및 비감염 염증성 질병, 자가면역 질병, 대뇌 및 심근 경색 및 국소 빈혈, 심근증, 죽상경화성 질병, 신경계 및 신경근 퇴행성 질병, 겸상 적혈구 질병, β-탈라세미아, 암 치료, AIDS, 골수이형성 증후군 및 독소 유도된 간 질환 등과 같이 고사 및/또는 회저 세포 치사가 모니터링되어야 하는 여러 임상 셋팅에 사용될 수 있다. 방사성 표지된 아넥신은 또한 정상 면역 계통, 발생학 개발 및 면역 허용도 및 알레르기를 연구하기 위한 임상 연구 기구로서 유용할 수 있다.

방사성 표지된 아넥신 V는 예를 들어, 정상적인 고사 세포 치사 및 치료 중인 악성 조직을 이미지화하고 정량하하는 데 사용될 수 있다. 방사성 아넥신 V를 사용하는 일련의 이미지화 연구로 고사를 모니터링하는 것은 새로운 약물의 신속한 시험 및 개발 및 여러 질병의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 치료의 진행, 질병의 진행 및 이 둘 모두를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 또한, 특정 질병의 조기 검출에 도움을 주는 데 사용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.

물질 및 방법

A. HYNIC 표지된 아넥신 V의 생성

사람 아넥신 V를 pET12a-PAPT 플라스미드로부터 대장균내 발현에 의해 생성하고, 사전 기술된 바와 같이 정제하였다[참조: Wood, et al,, (1996) 본원에서 참고문헌으로 인용됨]. 히드라지노 니코틴아미드의 N-히드록시숙신이미드 에스테르(HYNIC: AnorMED 사로부터 입수, Langley, British Columbia, Canada; Babich, et al., 1993, 본원에서 참고문헌으로 인용됨)의 30mM의 원액("HYNIN 에스테르 원액")을, 220㎍의 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 히드로클로라이드(SHNH)를 18.5㎕의 N,N-디메틸 포름아미드 중에 현탁시키므로써 제조하였다. 893㎕의 완충액 A(20mM HEPES, pH 7.4, 100mM NaCl)에 용해된 5mg의 아넥신 V를, 본원에서 참고 문헌으로 인용된 문헌(Schwartz, et al., 1991)에 기술된 방법에 따라 실온에서 빛으로부터 차단시키고 온건하게 교반하면서 3시간 동안 HYNIC 에스테르 원액과 반응시켰다. 반응을 500㎕의 500mM 글리세린(pH 5.3)으로 켄칭(quenching)시킨 후, 20mM 시트르산나트륨(pH 5.2)에 대해 100mM NaCl로 4℃에서 투석하였다. 침전물을 10분 동안 1500 x g에서 원심분리시켜 제거하였다. 100㎕(100㎍)의 HYNIC 아넥신 V의 분취액을 -70℃에서 저장하였다.

B. HYNIC 아넥신 V의 방사성 표지화

80㎕의 SnCl₂(2시간 동안 N₂기체로 퍼어징된 0.1N HCl 중의 50mg/ml)를 50ml dml 20mM 트리신 용액(pH 7.1, 1시간 동안 N₂기체로 퍼어징됨; 트리신 = N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신)에 첨가하였다. 200㎕의 Sn-트리신 용액을 문헌(Larson, et al., 1995)에 기재된 방법에 따라 100㎕의 아넥신 V(상기 기재된 바와 같이 제조됨)의 100㎕ 분취액이 혼합되는 100㎕의 Tc99m(4-8mCi 활성)에 첨가하였다.

방사성 표지된 아넥신의 특이적 활성은 용매로서 염수를 사용하는 순간 얇은막 크로마토그래피(ITLC)로 측정되는 방사성 순도가 92 내지 97%인 20 내지 200μCi/㎍ 단백질(목적하는 활성에 의존함)을 사용하였다. HYNIC 아넥신 V 및 붕괴된 Tc99m HYNIC 아넥신 V의 막 결합 활성을 변형된 경합 검정에 의해 결정하였으며, 이 검정에서 5nM FITC 아넥신 V는¹²³I 아넥신으로 치환되었다(Wood, et al., 1996). 실온에서 15분 후, 샘플을 원심분리시키고, 펠릿화된 세포에 결합된 FITC 아넥신 V를 EDTA로 이탈시키고, 이탈된 FITC 아넥신 V를 형광 측정법으로 측정하였다. 이 검정 시스템에서, 변형되지 않은 아넥신, HYNIC 아넥신 및 Tc99m HYNIC 아넥신 V은 각각 8nM, 10.5nM 및 12.3nM를 경합적 억제능(FITC 아넥신 V의 결합의 50% 농도)을 가졌다. HYNIC의 아넥신 V로의 혼입량은 아넥신 V 몰당 0.9몰인 것으로 밝혀졌다.

C. 이미지화 및 생분포 연구

용매로서 ITLC 염수를 사용하여 유리 Tc99m에 대해 결합된 Tc99m를 측정한 후, 50 내지 150μCi의 Tc99m HYNIC 아넥신(0.125-0.25㎍의 단백질)을 마우스에 주입하였다. 마우스를 엎드린 자세로 방사성 약품을 주사한 지 1 내지 2시간 후에 이미화하였다. 고감도 평행 홀 시준기 및 128 x 128 이미지화 매트릭스가 있는 저에너지 이동상(LEM) 섬광 카메라(Simens, Des Plains, IL)를 사용하여 15분 동안 이미지를 얻었다. 동일한 원안을 치료 전 및 후 모든 스캔에 사용하였다.

생분포 연구는 경부절/타액선, 뇌, 흉선, 폐, 간, 비장, 위, GI 관, 신장, 골격근, 지방, 혈액 및 잔해의 표본을 수거한 후 수행하였다. 샘플을, 동위원소 붕괴 및 기본 활성에 대해 분당 보정된 계수로서 표현되는 팩커드 코브라(Packard Cobra) II 자동 감마선 섬광 계수기(Pakard Instrument, Downers Grove, IL)로 계수하였다.

D. 결합된 사람 아넥신 V 및 고사 핵에 대한 면역착색

포르말린 고정된 파라핀 삽입된 조직을 헤마톡실린/에오신 또는 다른 방법을 사용하여 착색시키기 위해 5㎛로 분할하였다. 결합된 사람 아넥신 V의 면역착색화를, 사람 플라센탈 아넥신 V에 대해 상승되며, Affi-Gel(Bio-Rad)로 결합된 재조합 아넥신 V로 친화성 정제된 토끼 항 혈청으로 수행하였다. 이후, 면역조직화학적 검출을, 차례로 비오틴 표지된 염소 항 토끼 항체 및 아비딘-고추냉이 퍼옥시다아제 복합체로 인큐베이션하므로써 이행한 후(Jackson Immuno Research), 문헌에 기재된 바와 같이 3,3'-디아미노벤지딘과 반응시켰다[참조: Bindl, J. M. ＆ Warnke, R.A., 1986, 본원에서 참고문헌으로 인용됨].

고사 핵의 검출을 위해, 섹션을 문헌(Gavrieli, Y., et al., 1992; 본원에서 참고 문헌으로 인용됨)에 기재된, 말단 데옥시누클레오티딜트랜스퍼라아제 매개된 UTP 단부 표지화(TUNEL) 방법을 변형하여 착색시켰다. 내인성 퍼옥시다아제의 억제 후, 실온에서 15분 동안 프로테이나아제 K(20㎍/ml)로 파라핀 제거된 섹션을 분해하였다. 이후, 이 섹션을 λ 엑소누클레아제(Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 37℃에서 30분 동안 5 단위/ml로 인규베이팅시킨 후, 말단 데옥시누클레오티딜트랜스퍼라아제 반응 완충액(0.2M 칼륨 카코딜레이트, 25mM Tris·HCl, 0.25mg/ml BSA, 1.5mM CaCl₂, 20mg/ml 폴리비닐피롤리돈 및 20mg/ml 피콜) 및 5μM dATP로 평형화시켰다. 이후, 말기 표지화 반응을 최종 농도로 75 단위/ml의 말단 데옥시누클레오티딜트랜스퍼라아제 및 100μM의 1,N-6-에탄올-dATP(시그마)를 함유하는 말단 데옥시누클레오디틸트랜스퍼라아제 반응 완충액 중에서 수행하였다. 37℃에서 60분 인큐베이팅한 후, 반응을 1 x SSC(표준 염수 시트레이트)로 헹구어 켄칭시켰다. 이후, 섹션을 쥐과 동물 1G4 mAb(Regina Santella, Columbia University로부터 입수)로 인큐베이팅시키고, 에테노아데닌 부분을 인식하였다[참조: Young, T.L. ＆ Santella, R.M., 1988; 본원에서 참고문헌으로 인용됨]. 이후, 비오틴 표지된 염소 항마우스 항체를 사용하여 면역조직화학적 검출을 수행하였다.

실시예 1

Fas 매개된 고사의 생체내 이미지화

항-Fas 항체의 주입으로 마우스에 간 고사를 유도하였으며, 이는 1 내지 2시간 내로 간 고사를 광범위하게 일으켜 처리된 동물의 90%를 3시간째에 치사시켰다.

5 내지 6주령의 18 내지 24g의 암컷 Balb/c 마우스를 정제된 밤스터(bamster) 단일클론상 항-Fas 항체(Jo2, 동물당 10㎍, Pharmingen, San Diego, CA)를 정맥내 주입하였다. 항-Fas 항체를 주입한 후, 동물에 약 90μCi의 테크네튬 99m(Tc99m) 하이드라지노 니코틴아미드(HYNIC) 방사성 표지된 아넥신 V로 0, 1 및 2 시간째에 정맥내 주사하고, 세개의 별도의 실험으로 항체를 투여하였다. 이 결과가 도 1에 기재된다.

방사성 표지된 아넥신의 간 흡수에서의 현저한 점증적인 증가가, 도 1에 도시된 관심있는 영역(ROI) 이미지 분석에 의해 결정되어, 각각 148% 및 372%의 대조 값에 상응하는 1시간 및 2시간째에 관찰되었다. 비장 흡수는 처리후 1시간 째에 대조 값의 140%로 일시적으로 상승하였으나 2시간 째에 110%로 떨어졌다. 신장 흡수는 처리후 1시간 및 2시간 째에 40%로 떨어졌다.

마우스의 또 다른 군(대조군)을 Jo2 항체 처리 후, 0, 1 및 2시간째에 90μCi의 Tc99m HYNIC 난알부민(MW=43kd; 2㎍의 단백질)을 주사하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 이들 동물은 항-Fas 항체 처리 후 1시간 째(127%)에 간 흡수에서 초기 증가하였고, 2시간째(131%)에 변함없이 존재함이 입증되었다. 방사성 표지된 난알부민의 비장 흡수는 처리 후 대조군 값으로부터 변함이 없었다. 방사성 표지된 난알부민의 신장 흡수는 처리 후 1시간 째에 대조군 값의 138%로 증가하였고, 2시간 째에 131%로 비슷하였다.

마우스의 제 3군을 상기와 같이 처리하고, 세개의 별개의 실험으로 0, 1 및 2 시간 째에 Tc99m 표지된 아넥신 V 및¹²⁵I 사람 혈청 알부민(HSA)를 함께 주입하였다. 상이한 실험에서 동물들을 각각의 해당 시점 후 치사시키고, 생분포 연구를 수행하였다. 이 결과는 조직 g 당 주입된 투여량 %(% ID/g)으로 표현되며, 하기 표 1에 기재된다. 이들 데이타는 방사성 표지된 아넥신 V 및 HSA 둘다에 대해 ROI 이미지 분석으로 얻어진 것들과 비례하였다.

표 1

방사성 표지된 아넥신 V 및 HSA의 생분포 검정

* 대조군 값과 상당히 다름(p ＜0.05)

** 대조군 값과 매우 상당히 다름(p ＜0.001)

N.S. 대조군 값과 거의 다르지 않음

N.B.평균값의 통계적 비교를 두개의 테일링된 학생 시험으로 수행하였다.

실시예 2

심장 동종이식편 거부의 생체내 이미지화

^99mTc HYNIC-아넥신 V를 사실상 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 특별하게 명시되는 부분을 제외하고, 이미지화 및 생분포 연구를 상기와 같이 수행하였다.

PVG 도너로 부터 이소성 심장 동종이식편이 주입된 성숙한 수컷 ACI 래트(250-350g)(Harlan-Sprague-Dawley로부터 입수)를 오노(Ono) 및 린드세이(Lindsey)의 기술(Woodley, et al., 1993; 본원에서 참고 문헌으로 인용됨)을 변형하므로써 숙주의 복부 대동맥 및 내부 대정맥에 문합시켰다. ACI 도너로부터의 선천성 심장 동계이식편을 숙주 ACI 래트의 복부에 이식하였다. 상기 모델을 사용하여 ACI 수용체에서 PVG 심장 동종이식이 개시하여 이식 후 4 내지 5일 사이에 거부가 진행되었으며, 이는 심계항진에 대한 맥박이 감소하므로써 평가되었다. 이식 5일 후, 모든 동물에게 꼬리 정맥을 통해 700 내지 900μCi의^99mTc HYNIC-아넥신 V(10 내지 20μg 단백질/kg)을 투여하고, 1시간 후에 이미지화하였다. 이후, 동물을 치사시키고, 원래의 심장과 이식된 심장에서 섬광 계수와 조직병인 연구를 수행하였다.

모든 PVG 심장 동종이식편(n=4)은 이식 후 5일에^99mTc HYNIC-아넥신 V로 용이하게 가시화되었다. ACI 선천성 심장 동계이식편(n=3)은 섬광 웰 계수에 의해 확인된 바와 같이 원래의 심장과 동일한 방사성약품을 흡수와 함께,^99mTc HYNIC-아넥신의 주입 후에 가시적 활성은 없었다. PVG 동종이식편의 전제 신체 활성의 %는 ROI 이미질 분석에 의해 측정되어 ACI 동계이식편 활성을 초과하는 213%였다(P ＜0.005; 두개의 테일링된 학생의 t 시험). 섬광 웰 계수 검정은 원래의 심장 활성과 비교하여 PVG 동종이식편에서의^99mTc HYNIC-아넥신 V 흡수가 11배 큼을 밝혀냈다.

이식 후 5일째에 PVG 심장 동종이식편의 섹션은 모든 동물에 현저한 단핵 염증성 세포 침윤물이 있음을 보여주고 있으나, 선천성 또는 원래의 심장에서 이러한 침윤물은 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 침윤물은 심근 손상의 영역을 둘러싸고 있었으며, 심근 혈관의 혈전증과 관련되어 있다. 이러한 영역의 중심에는 명백한 회저가 있었으며 헤마톡실린에 의한 착색은 없었으나, 그 주변에는 TUNEL 착색에 의해 확인된 바와 같이 고사의 변화가 있는 핵이 있었다.^99mTc HYNIC-아넥신 V에 대한 면역착색은 염증이 있는 영역 및 회저 영역의 결합부분에 심장의 근세포에 과립 형태로 관찰되었으며, 이러한 세포의 핵은 헤마톡실린에 의해 착색되었고, 이는 이러한 핵이 회저보다는 고사임을 시사한다. 항아넥신 V 착색은 TUNEL과 비교하여 많은 포지티브 근세포 및 강도에 있어서 훨씬 광범위하다. 항아넥신 착색은 예상된 바와 같이 명백하게 회저 영역에서 진하며, 응집되어 있었고, 특이적이었으나, 선천성 또는 원래의 심장 또는 일차 항체가 생략된 동종이식된 심장에서는 착색이 전혀 관찰되지 않았다.

별도로, 그러나, 유사한 실험에서, ACI 래트(각 군에서 n=6)에게 PVG 도너로부터 이소성 심장 종종이식편을 주입하였다. ACI 도너(각 군에서 n=3)로부터의 선천성 심장 동계이식편을 숙주 ACI 래트에 이식하였다. 다른 두 군에는 이식 거부를 위한 치료를 하지 않았다.

수용체 래트의 군을 치료 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7일째에 핵 스캐닝을 수행하였다. 1.0mCi의^99mTc HYNIC-아넥신 V를 핵 스캐닝 1 시간 전에 주입하였다.

PVG 심장 동종이식편은 이식 4일 후에^99mTc HYNIC-아넥신 V로 용이하게 가시화되었다. ACI 선천성 심장 동계이식편은^99mTc HYNIC-아넥신의 주입 후 가시적 할성을 가지지 않았다.

가치 있는 영역 분석을^99mTc HYNIC-아넥신 V 흡수를 정량화하는 데 사용하였다. 이식된 심장에 의한 흡수율은 전체 신체 흡수의 %로서 계산하였다. 이 결과가 도 3에 도시된다.

핵 스캐닝 직후, 동물들을 안락사시켰다. 이식된 심장을 분석하기 위해 수집하였다. 급성 거부의 조직학적 등급화를 표준 헤마톡실린 및 에오신 착색된 섹션상에 수행하였다. 이러한 등급이 하기 표 2에 도시된다.

표 2

급성 거부의 조직학적 등급

등급 0	거부 없음
등급 1	약간의 거부
등급 2	중간정도의 거부
등급 3	심한 거부

고사 핵을 통상적으로 입수할 수 있는 퍼옥시다아제 키트(APOPTAG(등록상표명), Oncor, Gaithersburg, MD)를 사용하여 핵 DNA 분해의 TUNEL 착색에 의해 조직학적으로 확인하였다. 표 3의 데이타에 기재된 바와 같이, 고사는 심장 동종이식 동안에 근세포 및 염증성 세포에서 발생하는 것으로 보인다.

표 3

심장 동종이식편에서의 TUNEL 착색: 거부 동안에 포지티브 핵의 존재

거부	염증 세포	내피 세포	근세포
등급 0	0	0	0
등급 1	+	+	+
등급 2	++	+	+
등급 3	+	+	++

하기 표 4에 데이타 및 도 4의 그래피에 기재된 바와 같이,^99mTc HYNIC-아넥신 V 의 흡수는 급성 거부의 조직학적 등급과 상호관련이 있다.

표 4

심장 동종 이식 거부 동안에^99mTc HYNIC-아넥신 V의 % 흡수

거부	% 흡수 ± STDV	의의^*
등급 0	0.42 ± 0.17
등급 1	0.83 ± 0.31	등급 0에 대해 P = 0.036
등급 2	1.43 ± 0.40	등급 1에 대해 P = 0.008
등급 3	2.40 ± 0.53	등급 2에 대해 P = 0.001

* 학생의 t 시험, 두개의 테일링된 균등하지 않은 변수

실시예 3

시험된 쥐과 동물 림프종의 생체내 이미지화

38C13 쥐과 동물 B 세포 림프종(Maloney, et al., 1985)을 C3H.HeN 마우스(Harlan Breeders, Indianapolis)에서 배양한 후, 200㎕의 RPMI 매질 1640(혈청 없이) 중에서 현탁된 400개의 종양 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 주입하였다. 이식 14일 후, 마우스를 복강내 주입되는 100mg/kg의 시클로포스파미드로 처리하였다. 마우스를 시클로포스파미드 투여 20시간 후 20 내지 50㎍/kg의^99mTc HYNIC-아넥신 V(100 내지 150μCi/동물)를 정맥내 투여하였다. 이후, 동물을 이미지화시키고, 섬광 계수 및 조직학적 병인 연구를 위해 종양 제거 후 방사성 약품을 주입한 후 1시간 후에 치사시켰다.

처리되지 않은 옆구리 종양 이식체(n=8)가 섬광 카메라 이미지화에 의해 용이하게 관찰되었으며, ROI 이미지 분석에 의해 나타난 바와 같이 아넥신 V의 흡수율은 365%로 정상 연조직 활성보다 높았다. 처리된 옆구리 종양(n=6)은 종양 g당 전체 신체 활성으로 표시하여 대조군 값의^99mTc HYNIC-아넥신 V 활성의 78%로 증가한 것으로 가시화되었다(P ＜0.05; 의의에 있어서 두개의 테일링된 학생 t 시험 사용). 이러한 결과는 대조군과 비교하여 중량에서 58% 떨어진(P<0.05) 종양 g 당 주입된 투여량의 %로서 표현하여 아넥신 V 흡수에서 132%(P<0.05) 증가하였음을 보여주는 섬광 웰 계수에 의해 확인되었다. ROI 이미지 분석에 의해 보여지는 바와 같이 종양의 g 당 전체 신체 활성은 생분포 연구(r²= 0.831)로 측정된 종양 g 당 주입된 투여량의 %에 대해 상호 직선적으로 관련된다. 조직학적 분석으로 대조군에서 5% 미만의 고사 세포를 가지는 처리된 종양에서 모든 림프아세포의 거의 완전한(95%를 넘는) 고사가 입증되었다.

본 발명은 특정 방법 및 구체예와 관련하여 기재된 것이며, 여러 변형 및 변경이 본 발명에서 출발하지 않고 이루어질 수 있는 것으로 이해해야 할 것이다.

Claims

(a) 대상에 생체적합성 방사성 핵종으로 표시된 아넥신을 투여하는 단계,

(b) 표지된 아넥신이 대상에 편재될 수 있는 일정 기간이 지난 후, 시험체를 방사선 검출 장치의 검출 영역내에 위치시키는 단계 및

(c) 방사선 검출 장치를 사용하여 시험체내 편재된 방사성 핵종으로부터 방사선 방출을 측정하여, 포유 동물 시험체의 영역에서 세포 치사를 나타내는 방사선 방출의 이미지를 형성하는 단계를 포함하는 생체내 포유 동물 시험체의 영역에서 세포 치사를 이미지화시키는 방법에 있어서, 이미지가 포유 동물 시험체의 영역에서 세초 치사를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (d) 이미지를 처리하여 표지된 아넥신의 비특이적 편재화로 인한 시그날을 공제하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 비특이적 편재화가 신장에 존재함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사성 핵종이 요오드 123, 요오드 131, 갈륨 67, 인듐 111, 불소 18 및 테크네튬 99m(Tc99m)로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사성 핵종이 테크네튬 99m(Tc99m)임을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, Tc99m가 히드라지노 니코틴아미드(HYNIC)를 통해 아넥신에 결합되어 있음을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 투여된 Tc99m 표지된 아넥신의 양이 약 5 내지 약 20 mCi의 투여량임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사선 검출 장치가 감마선 검출 장치이고, 방사선 방출이 감마선 방출임을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 감마선 검출 장치가 감마선 섬광 카메라임을 특징으로 하는 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 이미지를 구성하기 위한 감마선 방출 측정이 표지된 아넥신의 투여 후 약 5분 내지 2 시간 사이에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서, 이미지를 구성하기 위한 감마선 방출 측정이 표지된 아넥신의 투여 후 약 1 시간째에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 치사가 고사에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택된 간격으로 (b) 및 (c) 단계를 반복하는 것을 추가로 포함하며, 이러한 반복이 세포 치사가 진행되는 다수의 세포에서의 변화를 반영하여, 시간에 따라 영역으로부터 방사선 방출의 강도 변화를 추적하는 데 효과적임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택된 간격으로 (b) 및 (c) 단계를 반복하는 것을 추가로 포함하며, 이러한 반복이 세포 치사가 진행되는 세포 위치에서의 변화를 반영하여, 시간에 따라 영역에서 방사선 방출의 편재화 변화를 추적하는 데 효과적임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 방사선 검출 장치가 3차원 이미지화 카메라임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서, 아넥신이 아넥신 V임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여된 표지된 아넥신의 양이 약 300㎍ 단백질/kg 미만임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여된 표지된 아넥신의 양이 약 1 내지 10㎍ 단백질/kg임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 정맥내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 복강내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 초내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 흉막내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 임파선내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표지된 아넥신이 근육내 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 영역이 사실상 전체 시험체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 영역이 두부 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 영역이 심장 또는 이의 일부를 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 영역이 간 또는 이의 일부를 특징으로 하는 방법.