CN1265572A - 活体内造影细胞死亡的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用放射性标记的膜联蛋白以活体内造影细胞死亡的方法。
Description
此项工作的一部分受NIH Grant HL-47151资助，因此，美国政府对此发明拥有某些权利。
发明领域
本发明涉及活体内造影(imaging)细胞死亡的方法，具体涉及使用γ射线造影，用经放射性标记的膜联蛋白造影哺乳动物细胞死亡区域。
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发明背景
细胞凋亡或编程性细胞死亡在发育和多种稳态和疾病过程中起着重要作用(Thompson，1995)，因此，调制细胞凋亡性细胞死亡不失为各种疾病的新的治疗策略。检测和监控活体内细胞凋亡性细胞死亡的非侵害性方法的缺乏，障碍了对促进或抑制细胞凋亡性细胞死亡的新药剂的研究。
脂质质子核磁共振波谱学(1H-NMRS)可用于检测遭受细胞凋亡性细胞死亡的淋巴母细胞和其他细胞系之质膜组成和/或流动性的特异性变化(Blankenberg等，1996)。目前，很多组织和器官中天然存在的复杂的磁性微环境限制了脂质1H-NMRS研究细胞凋亡的临床应用。
发明简述
一方面，本发明包括活体内造影哺乳动物受试者区域性细胞死亡(如内细胞凋亡或坏死所致的细胞死亡)的方法。该方法包括步骤(a)给受试者施用经生物相容的放射性核素标记的膜联蛋白。(b)过一段时间后，当标记的膜联蛋白于受试者中定位之后，将此受试者置于放射检测装置的检测区，以及(c)用放射检测装置测量定位于受试者的放射性核素散发的放射性放射以构建出放射性放射影像，此影像即代表此哺乳动物受试者特定区域的细胞死亡。在其中一实施方案中，此方法还包括步骤(d)处理此影像，减去标记的膜联蛋白的非特异性定位的信号，例如肾脏中非特异性定位的信号。
可用于本发明的放射性核素包括碘123，碘131，镓67，铟111，氟18，与锝99m。氟18发射阳电子，故可利用于阳电子放射局部X射线检法(positron emission tomography；PET)。I 123，I 131，Ga67，In 111，与Tc 99m可利用于标准γ射线散发检测。Tc 99m于本发明的方法中是优选的放射性核素。在一优选实施方案中，Tc 99m由hydrazino nicotinamide(HYNIC)连结于膜联蛋白。Tc 99m标记的膜联蛋白的标准给药剂量是界于5到20mCi。
本发明的一般实施方案中，放射检测装置是γ射线检测装置，测量的放射性放射是γ射线放射。在另一一般实施方案中，放射检测装置是阳电子放射检测装置，测量的放射性放射是阳电子放射。
本发明又一一般实施方案中，当重复步骤(b)与(c)能有效追踪一区域中放射性放射如γ射线或阳离子放射强度随时间的改变时，(放射性放射强度的改变反映出细胞死亡数目的改变)，此方法还包括以选定的时间间隔重复步骤(b)与(c)。
本发明又另一一般实施方案中，当重复步骤(b)与(c)能有效追踪一区域中γ射线放射的定位随时间的改变时，(放射性放射强度的改变反映出细胞死亡位置的改变)，此方法还包括以选定的时间间隔重复步骤(b)与(c)。
此放射检测装置可以是例如安格γ闪烁照相机(Anger gammascintillation camera)或是立体造影照相机。
本发明优选的膜联蛋白是膜联蛋白V。标准给药剂量是小于约300μg蛋白质/kg，优选的是界于约1到10μg蛋白质/kg。许多可行的给药途径包括静脉内的(i.v.)腹膜内的(i.p.)椎管内的，以及胸膜内的给药。
为构建影像而进行的γ射线放射的测量典型地是于施予标记的膜联蛋白后5分钟至约2小时测量。在其中一实施方案中，为构建影像而进行的γ射线放射的测量典型地是于施于标记的膜联蛋白后约1小时测量。
利用本文公开的方法可造影受试者的不同部位。例如，此区域基本上可包括整个受试者或此受试者之一部分，如头部或头的一部分，心脏或心脏的一部分，肝脏或肝脏的一部分等。
本发明还提供了活体内造影细胞死亡的试剂盒。此试剂盒包括(i)一密封小瓶，其中含有HYNIC标记的膜联蛋白，可以按例如〔材料与方法(A)〕中所述来制备；(ii)一密封小瓶，其中含有Sn-tricine溶液，可以按例如〔材料与方法(B)〕中所述来制备，并保存于N2环境下；(iii)利用(i)与(ii)的成分以及Tc-99m制备Tc-99m标记的膜联蛋白的说明书；以及(iv)给药Tc-99m标记的膜联蛋白以活体内造影细胞死亡区的说明书。在一实施方案中，此试剂盒保存在-70℃下并且在干冰中运输。在另一实施方案中，HYNIC标记的膜联蛋白经冻干。
为让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文结合附图作详细说明如下：
图的简单说明
图1是一电脑形成影像，显示以Tc 99m HYNIC膜联蛋白V检测Fas-介导的暴发性肝脏细胞凋亡。图2是一电脑形成影像，显示发生Fas-介导的暴发性肝脏细胞凋亡，来自Tc 99m HYNIC-卵白蛋白的信号。
本发明的详细说明1.定义
“细胞死亡”此一术语出现在“检测细胞死亡”或“定位细胞死亡”时，意指失去质膜完整性的细胞以及哺乳动物细胞死亡的过程。此过程包括细胞凋亡(apoptosis)以及涉及细胞凋亡(例如细胞衰老)与坏死的过程。在此，“细胞死亡”特指有核细胞(例如神经元，肌细胞，肝细胞等等)的死亡或逼近的死亡以及无核细胞(例如红血细胞，血小板等等)的死亡或逼近的死亡。
“生物相容的放射性核素〕或“生物相容的放射性同位素”是指被认可为适用于注射核药物给病人的同位素。生物相容的放射性核素的例子包括I123，I 131，Ga 67，In 111，F 18，与Tc 99m。II.细胞死亡-细胞凋亡与坏死
细胞凋亡(apoptosis)意指“编程性细胞死亡”细胞藉以执行“细胞自杀”程序。一般认为，对多细胞生物以及一些特定生物的所有细胞而言，细胞凋亡程序在进化上是保守的。更甚者，据信在许多例子中，在健康的存活细胞中，细胞凋亡是一个必须被主动抑制的“不执行”程序。
多种规律性的刺激以及环境因子会影响细胞决定是否进行细胞凋亡(Thompson，1995)。细胞凋亡的生理活化剂包括肿瘤坏死因子(TNF)，Fas配体，转化生长因子β，神经递质谷氨酸，多巴胺，N-甲基-D-天冬氨酸，生长因子的释出，丧失基质附着，钙与糖皮质素。细胞凋亡的伤害性相关诱导因子包括热激，病毒感染，细菌毒素，致癌基因myc，rel以及EIA，肿瘤抑制基因p53，溶细胞的T-细胞，氧化剂，自由基以及营养缺乏(抗代谢物)。疗法相关的细胞凋亡诱导因子包括γ射线照射，UV射线照射与种种化疗药物有顺铂，阿霉素，博来霉素，阿糖胞苷，氮芥，甲氨喋呤与长春新碱。毒素相关的细胞凋亡诱导因子包括乙醇与β-淀粉样肽。当细胞凋亡病理性地发生于无法正常再生的细胞，例如神经元时常造成严重的后果。由于当这些细胞死亡时，没有细胞可取代之，丧失这些，细胞导致被感染器官的功能衰退甚至是致命性的功能失常。与细胞凋亡增加相关的大量神经变性失调疾病中可见这种功能失常，所述疾病包括老年痴呆症，帕金森氏症，肌萎缩性侧索硬化，色素性视网膜炎和小脑退化。
不必要的细胞凋亡的后果对其他的病症同样具有严重的破坏，包括局部缺血伤害，例如心肌梗塞，再灌注伤害和中风。一般认为细胞凋亡于中度的焦点式局部缺血后，对延迟血梗起重要作用。(Du，等，1996)。其他与细胞凋亡增加相关的疾病包括但不限于：AIDS；脊髓发育不良综合症，如再生障碍性贫血；以及毒素诱导的肝病，包括酗酒过多造成的伤害。
坏死(necrosis)是指除了细胞凋亡外(即除了执行细胞内在的自杀程序外)造成的局部性细胞或组织死亡。坏死的成因有外伤，细菌感染，急性缺氧等等。此二类细胞死亡有重叠处，因为有些刺激会造成细胞凋亡或坏死或两者，这取决于伤害的严重程度。III.生物膜的不对称性
一般认为，相对于特定的膜磷脂，生物膜为不对称的。特别是真核质膜的外膜主要由胆碱磷脂，如鞘磷脂和磷脂酰胆碱(PC)，组成；而内膜主要包括氨基磷脂，如磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。一般而言，不对称性是藉由依赖于ATP的氨基磷脂转位酶的活性来维持，所述酶选择性地传运PS与PE于双膜之间(Seigneuret and Devaux，1984)。其他关于传运磷脂于双膜之间的酶包括依赖于ATP的floppase(Connor，等，1992)与lipid scramblase(Zwell，等，1993)。
正常细胞具有不对称性，丧失此不对称性会与特定的生理与致病程序相关。举例而言，当于质膜外膜检测到PS的出现时(PS暴露)，是细胞凋亡，先前性的DNA破裂，质膜起水泡以及丧失膜完整性的早期征兆之一。(Martin，等，1995；Fadok，等，1992)。
相似的重定位于镰刀形细胞疾病(Lane，等，1994)，β-地中海型贫血(Borenstain-Ben Yashar，等，1993)，血小板活化，以及具有PS传运缺陷的突变肿瘤细胞中皆可发现。逐渐老化的红血细胞外膜中会发现PS逐渐出现(Tait and Gibson，1994)。当这些细胞上的PS暴露到一极限值，这些细胞会被巨噬细胞从循环中清除(Pak andFidler，1991)。上述这些情形大致显示感染细胞(即显著暴露的细胞)的PS死亡达到最高点。
不错的是PS暴露是细胞凋亡与坏死的共同征兆。它在细胞凋亡初期的作用已如上述。一旦凋亡的细胞达到凋亡的最终期时(也就是丧失膜的完整性)，在两层质膜上的PS皆会暴露出细胞外环境。相同的情形发生在坏死所致的细胞死亡，其中丧失膜完整性是坏死性细胞死亡过程的起始因素或早期现象，因此，因为双层细胞膜皆暴露出所以坏死细胞皆具有暴露的PS。IV.膜联蛋白
膜联蛋白族的蛋白质可应用于实施本发明。在许多的细胞中，包括胎盘，淋巴细胞，单核细胞，胆与肾的管状上皮细胞，的胞质中可发现高含量的膜联蛋白V。虽然膜联蛋白的生理学功能至今尚未完全清楚，但是因为膜联蛋白的几个特性，膜联蛋白已成为有用的诊断和/或治疗药剂。特别地，膜联蛋白对阴离子磷脂表面，如有磷脂酰丝氨酸(PS)暴露表面的膜层，有特别强的亲和力。V.实验结果概况
实验结果证明放射性标记的膜联蛋白可被利用于活体内造影细胞死亡。举例而言，实施例1的实验显示当注射纯化的Jo2抗体于小鼠时，Fas-介导的肝脏细胞死亡的造影与定量(Ogasawara，等，1993)。这些实验的结果(例见图1)显示分别在第一与第二小时时，肝细胞对放射性标记的膜联蛋白有增加两倍与四倍的肝摄取量，具体原因是注射Jo2抗体之后由Fas-介导的肝脏细胞死亡。在脾细胞中经注射后的早期，短暂地增加了两倍的脾摄取量，接着又降至对照值。来自脾的信号下降可能是因为循环与脾淋巴细胞对注射在由Fas介导的细胞凋亡突然出现作出回应的快速清除作用。
肾脏中亦可发现膜联蛋白结合。然而，膜联蛋白结合是在无任何细胞凋亡诱导刺激存在下才有的，并且在肝细胞信号增强时，此结合减少。在供给抗Fas抗体后，肾脏活性急速下降的同时肝摄取量增加，这暗示非细胞凋亡相关对膜联蛋白V的肾亲和力远低于细胞凋亡的组织。肾皮质对注射的膜联蛋白V的结合可能部分因为膜联蛋白与肾小管磷脂的交叉反应性。
值得一提的是，肾分泌物含有极少量的标记膜联蛋白，显示在实验期间，放射性标记(在此为Tc 99m)保持与膜联蛋白结合。再者，注射的经Tc 99m标记的膜联蛋白在血流中很快地被清除，血清半寿期约为3到7分钟。这些因素使得可以在给药后1到2小时造影放射性药物信号。
以上的性质使得连续每日或每双日的造影研究得以进行，每日或每双日的造影研究代表当注射放射性标记的膜联蛋白V时所需器官或组织的快速照相细胞凋亡活性。VI.活体内细胞死亡造影
本发明之一方面包括-哺乳动物受试者区域活体内造影细胞死亡(由例如细胞凋亡或坏死所致的)的方法。本方法中先给药放射性标记的膜联蛋白(如Tc 99m-标记的膜联蛋白V)于受试者。经过一段时间使得共轭物到达受试者中定位后，将受试者置于γ射线检测装置的检测区内。当利用γ射线检测装置测量由Tc 99m放射的γ射线时，受试者大致上是固定化状态。接着，γ射线放射的影像就构建出来了。此构建出的γ射线放射影像用来给临床医师提供一图谱，或哺乳动物受试者或哺乳动物受试者待分析区域的细胞死亡定位区。
为了清楚地解释由上述方法所得的影像，此影像又经过数字处理以滤去背景信号，杂信和/或膜联蛋白/Tc 99m共轭物非特异性的定位，如肾定位。
上述方法的优点是，藉由测量γ射线放射以及在特定时间区间形成影像，本方法可用于追踪一段时间内受试者的γ射线放射强度变化，反映出进行细胞死亡过程的细胞数目的改变。本方法亦可用于追踪一段时间内受试者的γ射线放射定位的变化，反映出进行细胞死亡过程的细胞分布的变化。A.放射性标记膜联蛋白的合成
本发明可利用天然纯化的，重组的，或者是合成的膜联蛋白。膜联蛋白V，举例而言，可以是如传统地由人类胎盘纯化得到(Funakoshi，等，1987)。重组膜联蛋白具有许多优点包括容易制备，低成本。许多不同种的膜联蛋白可由人体或其他生物体克隆而来。其序列可由序列数据库如GenBank获得。
本发明优选地是使用膜联蛋白V，有许多原因。第一，膜联蛋白V是最丰足易得的膜联蛋白之一。再者，易于从自然的或重组的来源获得。第三，它对磷脂膜有高亲和性(Tait，等，1988)。人类膜联蛋白V的分子量为36kd并且对PS有高亲和性(kd＝7n mol/L)。人类膜联蛋白V的序列可由GenBank获得，编号为U05760-U05770。
在〔材料与方法〕中提及一示范性的适用于本发明的表达系统。其利用在E. coli中的pET12a表达载体。(Novagen，Madison，Wisconsin)。
也可以利用其他细菌的表达载体。包括pGEX质粒(Smith，等，1988)及其衍生物，例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ的pGEX系列。这些载体表达框内融合于谷胱甘肽-S-转移酶的克隆插入片段的多肽序列。可转化重组pGEX质粒于适当的E.coli菌株，可通过加入异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白质的生产。根据标准方法，利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析(glutathione agarose affinitychromatography)可将溶解的重组融合蛋白质由诱导培养物的细胞裂解物中纯化出来(Ausubel，等)。其他可商购的表达系统包括酵母表达系统，如Invitrogen(San Diego，CA)的pichia表达试剂盒；杆状病毒表达系统(Reilly，等；Beames，等；Ciontech，Palo Alto CA)与哺乳动物细胞表达系统(Clontech，Palo Alto CA；Gibco-BRL，Gaithersburg MD)。
许多特征，如促进表达序列分泌入培养基的前导序列，可被建入表达载体。重组生成的多肽传统上是由裂解细胞或培养基分离出来。
分离出的重组多肽可由标准蛋白质纯化方法来纯化。包括示差沉淀法，分子筛层析，离子交换层析，等电聚焦，凝胶电泳，与亲和层析。蛋白质制品也可以由过滤法来浓缩(Amicon，Danvers，Mass)。
依照上述方法制成的膜联蛋白再被特定的放射性核素标记。特定同位素的选择是依据特殊应用而定。
任何目前可得的放射性核素皆可应用于本发明。选择适当放射性核素时一般应考虑发明的特定应用以及核造影普遍需考虑的几个因素，所述因素包括(i)颗粒放射的最小值(ii)介于50到500kEv的初级光子能(iii)物理半寿期要大于准备给药物质所需时间(iv)大于检验时间的有效半寿期适当的化学形式与反应性，低毒性，以及经放射性核素标记的膜联蛋白的稳定性。
例举的放射性核素是Tc 99m，Tc 99m的半寿期约6小时，对标记膜联蛋白有很高的特异活性。其满足上述大部分条件，且超过80％的核医学造影方法都用到Tc 99m。其他可供利用的同位素包括I 123(半寿期约13.2小时)，I 131(半寿期约8天)，Ga 67(半寿期约78小时)，In 111(半寿期约2.8天)。
许多已知方法公开了结合同位素与膜联蛋白的方法。例如如下文材料和方法一节中所述可通过使用AnorMED，Langley，BritishColumbia，Canada的hydrazino nicotinamide(HYNIC)结合Tc 99m与膜联蛋白。利用Hnatowich，等，1983(列入本文作为参考)所述的方法可以使Ga 67，In 111与放射性标记的蛋白质结合。
还有其他以核标记蛋白质的方法。例如，1996年9月3日核准的美国专利案号5,552,525(Dean)，教导-制造Tc 99m标记的肽的方法。美国专利案号5,443,815和5,508,020中公开了用Tc-99m标记肽和多肽的方法。1990年Lind等教导Tc 99m标记的单克隆抗体。LaMuraglia，等，(1989)教导111I标记的非特异性人类免疫球蛋白。Fischman，等，(1991)教导趋化甲酰基肽(fMLF)111In标记的DTPA其轭物。B.放射性标记膜联蛋白的给药
放射性标记膜联蛋白可以利用放射性标记化合物的标准给药方案来给药。供给的剂量取决于两个主要考虑：(i)注射放射性核素的量与形式以及(ii)注射膜联蛋白蛋白质的量。
Tc 99m给药于一成年人的剂量可高至20mCi。单次Tc 99m给药的优选的剂量约介于5到20mCi。
在剂量大于300μg/kg时，膜联蛋白V开始有药物效应(抗促凝剂效应)。因此，本发明的诊断方法(该方法旨在避免标记的膜联蛋白的药物效应)优选是在低于300μg/kg，特别是低于50μg/kg的剂量下进行。这样的放射示踪剂剂量(10μg/kg到50μg/kg)对动物或人体并无报导出的药物或毒性副作用。
放射性标记的膜联蛋白一般在适合的传输载体中，例如是无菌生理盐水中，作成悬浮液。载体包括本领域公知的稳定剂，传输剂(carrier)，赋形剂，稳定剂，乳化剂等。
任何有效给药放射性标记蛋白质以用于核医学造影的途径皆可用于给药放射性标记的膜联蛋白。优选的给药方法是静脉内(i.v.)注射。对于内部广布血管的器官的造影更是适合，如心、肝、脾等等。静脉内注射放射性药物的方法是已知的。例如，使用Oldendorf/Tourniquet方法或静脉内推入法(Mettler与Guierbteau，1985，附录D)，以注射造影剂团的方式施用经放射性标记的药物。
当进行脑的显影时，标记的膜联蛋白可利用鞘内给药。鞘内给药直接传输药物至含有大脑脊柱液(CSF)的次蛛网膜空间。欲传输至脊髓区必须通过硬膜外注射至蛛网膜外部的脊髓区来实现。
其他给药方法包括腹膜内(对肾透析患者)与胸膜内给药。在特殊情况下，本发明还包括其它传输方式，包括肌肉内注射，皮下的，淋巴内的，喷注以及口服，阴道内的和/或直肠给药。
前述给药方法为本领域技术人员所公知。C.放射性标记膜联蛋白的定位
在施用标记膜联蛋白之后，接下来就是使放射性标记膜联蛋白定位于一靶组织或器官。“定位”在此指受试者体内结合的，“驻定的”与非结合，“游离的”，标记膜联蛋白之间达到一平衡或假稳定状态的关系。达到定位所需的时间从数分钟到数十分钟。达到定位的时间可藉由标记膜联蛋白血清半寿期估计。当静脉内注射经Tc 99m标记的膜联蛋白时，血清半寿期为约3至7分钟。定位时间也取决于靶组织允许经标记的膜联蛋白接近的能力，这反过来又取决于给药方式，这一点是本领域所公知的。
优选在大多数经标记的膜联蛋白已定位于其靶之后开始造影对于Tc 99m标记的膜联蛋白V经静脉内注射而言，定位在数个半寿期后产生。十倍半寿期(对膜联蛋白/Tc 99m共轭物而言，约30到70分钟)的时间足以达到基本上完全的定位。本领域技术人员会希望在大于或小于此约10倍半寿期的时间点进行造影。例如，在造影因血管受伤造成的细胞死亡时，靶组织非常易于接近，因此在短短几分钟内，就可获得自靶位点来的强烈信号，特别是当低剂量的标记膜联蛋白被渐渐给药以减少来自循环标记来的信号时更是如此。
在上述的例子中，本领域技术人员皆可对达到定位的时间做到合理的估计。另外，作为时间的函数的定位状态确定之后，即可根据本发明的方法造影得自经标记膜联蛋白的γ射线信号。D.γ射线检测装置
γ射线造影装置是藉在一段时间内收集自受试者放射的γ射线信号以发挥作用。最普遍使用的γ射线检测方法之一是Anger γ闪烁照相机(Mettler与Guibertau，1985)，它将放射性核素放射的γ射线转变为光子(通常配合Nal(T1)晶体)，再于光电倍增管(PMTs)中放大，转变成为电压信号再藉以构建一影像。Anger γ闪烁照相机的组件典型地包括准直管，闪烁晶体，一列PMTs，脉冲高度分析仪，阴极射线管(CRT)与控制台。此照相系统通常包括电脑。PMTs与显示(CRT)之间的处理可以是类比的或数字的。许多评论和/或核医学教科书(例如Mettler与Guiberteau，1985)有对Anger γ闪烁照相机的理论与操作方法的详细叙述。
利用放射估计局部X光检法(ETC)以产生三维立体图提供一更资讯丰富的影像。ETC有两种，一是单光子放射估计局部X光检法(SPECT)其利用如Tc-99m的同位素，再者是阳电子放射局部X光检法(PET)其利用高能量(SII-Kev)消灭光子以提供高度准确的定位。PET的缺点是其一般与短生命的用回旋加速器产生的同位素，如11C，13N与18F一起使用。另外，SPECT适用于本文描述的放射性药物类型如Tc-99m。
SPECT系统一般包括一个或两个电脑控制Anger γ闪烁照相机头，此机头以圆形或椭圆形轨道绕患者转动。此种SPECT照相机可自，例如是Siemens(Des Plains，IL)，供应商获得。Siemens发售多种此类照相机，包括E-CAM，ORBITER，ECAT，MULTISPECT 3，MULTISPECT 2以及DIACAM。
上述的照相机一般包括一体化的影像处理器，其处理影像为数字文档以减除背景与加上假色彩等。一旦影像以数字文档的形式存在时，可在个人电脑如IBM兼容PC或Apple Macintosh(Apple Computer，Cupertino)上利用多种造影处理程序，例如ADOBE PHOTOSHOP，Adobe System，Mt.View，CA，处理并打印出结果。E.放置受试者于γ射线检测装置的检测区中
1.装置的检测区 装置的检测区的定义是可获得恒定可靠的γ射线放射测量结果的区域。假如利用ETC以收聚影像时，此装置的检测区是γ射线放射可靠地被测量的全部空间或ETC系统按计划包括在扫描中的部分空间。此空间一般基本上大于-单个-非ETC照相机的检测区。
一般可知，并不需要将整个动物或受试者置于γ射线检测装置的检测区。例如，假如我们有兴趣分析得自特定器官的信号，只需要测量得自包括此器官的区域以及周围黑暗区来的信号即可得到所需信息。
2.放置受试者；固定化
在测量γ射线以构建影像的时间内，将受试者置于光检测装置的检测区中以收集用以集汇出影像的信号。假如信号够强使影像可于20毫秒内藉测量γ射线放射构建出，和/或受试者相对于造影平面的移动不足以破坏影像，就不需要额外的固定化步骤。而是只需要在测量期间将受试者置于检测装置的检测区。
假如，测量γ射线放射需时大于20毫秒，而受试者被激烈摇动时，确保γ射线放射测量期间与受试者之激烈摇动程度相称的受试者固定化的措施都应被考虑以保留构建的影像的空间信息。例如，假如受试者是人，光子放射测量时间是数秒钟，在γ射线放射测量(造影)时，受试者最好是尽量维持静止。另外，假如受试者是动物，例如小鼠，可藉由麻醉或机械控制装置固定之。
机械控制装置有很多种，例如，利用一端有凹槽的海绵垫，将小鼠头置于凹槽外使之自由呼吸，而小鼠身体的移动受海绵垫限制，再将-γ射线可穿透的薄片覆盖绑紧于上。如此制作的控制装置可固定小鼠数十秒至数分钟。
欲造影区域可基本上包括整个受试者或受试者需诊断或监测细胞死亡的一部分，例如，此区域可以是一附件或是该附件的部分，头，中枢神经系统或一内体腔，如胸腔或腹腔。在一些特殊的实施方案中，此区域可仅包括特定的器官或器官的一部分。例如，本方法仅可利用于分析中枢神经系统，脑，心，肝，脾，肺，骨髓或上述之一部分中的细胞死亡。再者，被分析区域可被限制于肿瘤如接受造成肿瘤细胞死亡治疗的癌症患者。F.构建γ射线放射影像：造影处理
许多适用的照相机可将γ射线放射的测量值汇集为电压信号，其可显示在CRT或以电脑储存和/或分析为一数字列。以标准造影方法，可利用这些数字汇集出影像。举例而言，一般通过标准化γ射线计数(对一固定，先前选择的数值或对以任何图素侦测出的最大值)并转换这些标准化数值为显示器上的亮度(灰度)或色彩(假色)来分析影像。假色表现时，典型色彩的分配如下。计数为零的图素为黑色，低计数为蓝色，计数愈高色彩的波长愈长，最高的γ射线计数值是红色。显示器上色彩的位置表示γ射线放射的分布也就是细胞死亡的区域的位置。
假如想要追踪一段时间内的定位和/或信号，例如，要记录一种治疗方法对细胞死亡的分布和/或定位的影向，可以在一定时间间隔中重复γ射线放射测定或造影，以构建一系列的影像。时间间隔可短至几分钟或长至数天，数周，数月或数年。
许多方法都可用以分析藉本发明的方法汇集的影像，包括最简单的视觉检视，心理评估和/或印出清样，或复杂的数字影像分析。VII.应用
放射性标记的膜联蛋白V的主要应用包括检测不该发生的疾病中不适当的细胞凋亡，例如红斑狼疮，移植排斥等免疫失常，或严重的细胞局部缺血，以及检测该发生而没有发生足够的细胞凋亡，如肿瘤或病毒感染的细胞。
本文所述结果显示放射性标记的膜联蛋白可应用于临床上需要检测细胞凋亡或坏死性细胞死亡时，例如，但不限于，器官和骨髓移植排斥或受伤，感染性及非感染性炎性疾病，自身免疫病，大脑的及心肌梗塞以及局部贫血，心肌症，动脉粥样硬化，神经与肌神经老化疾病，新月形细胞疾病，β-地中海型贫血，癌症疗法，AIDS，脊髓发育不良综合征，与毒素诱导肝病等等。另外，也可利用放射性标记膜联蛋白作为研究正常免疫系统，胚胎发育，免疫耐受与变态反应的临床工具。
放射性标记膜联蛋白V也可利用在，例如，造影或定量接受治疗的正常以及恶性组织的细胞凋亡性细胞死亡。藉由放射性标记膜联蛋白V与连续造影研究以监控细胞凋亡可应用于新药与各种疾病疗法的快速检验与发展。此外，此方法又可用于监控治疗过程，监控疾病进程或两者兼备。再者，这些方法又可有助于特定疾病的早期监控。
以下的实施例是为了说明本发明，但非限制本发明。
材料与方法A.HYNIC标记的膜联蛋白V的制备
依据前述方法在E.coli中由pET12a-PAPI质粒表达产生人膜联蛋白V，并纯化之(Wood，等，1996)。制备30mM的hydrazinonicotinamide(HYNIC；得自AnorMED，Langley，British Columbia，Canada；Babich，等，1993)N-羟基琥珀酰亚胺酯的储备溶液(HYNICester stock solution)，制备方法为将220μg的succinimidyl 6-hydrazinonicotinate hydrochloride(SHNH)悬浮于18.5μL的N，N-dimethyl formamide。溶解于893μL缓冲液A(20mM HEPES，pH7.4，100mM NaCl)的5mg膜联蛋白V先与NYCIN酯储备溶液于室温下反应3小时，反应时温和地搅动，遮光。(Schwartz，等，1991)。加入500L的500mM pH5.3的甘氨酸以停止反应。然后在4℃下对20mM的柠檬酸钠pH5.2，100mM NaCl透析。再以1500xg，10分钟离心以移除沉淀，将100μL(100μg)的HYNIC膜联蛋白V等分试样储存于-70℃。B.放射性标记HYNIC膜联蛋白V
将80μL的SnCl2(50mg/ml 0.1N HCl，以氮气净化两小时)加入50ml的20mM tricine溶液中pH7.1，以氮气净化1小时；tricine＝N-〔tris(羟甲基)甲基〕甘氨酸)。按Larson等1995所述方法，将200μL的Sn-tricine溶液加入与100μL膜联蛋白V等分试样(按上述制备)混合的100μl Tc 99m(4-8mCi活性)中。
以saline为溶剂，用即时薄层层析法(Instant thin layerchromatography；ITLC)来测定放射性标记的膜联蛋白的比活是20-200μCi/μg蛋白质(取决于所需活性)，放射性纯度为92-97％，HYNIC膜联蛋白V的膜结合活性与衰减的Tc 99m HYNIC膜联蛋白V是以修饰的竞争分析法测定，其中5nM的FITC-膜联蛋白V被I125膜联蛋白V置换(Wood，等，1996)。室温下15分钟后，离心此样品，结合于沉淀细胞的FITC-膜联蛋白V藉由EDTA释出而释出的FITC-膜联蛋白V藉由萤光测定法测量。在此分析系统中，未修饰的膜联蛋白，HYNIC膜联蛋白，与Tc 99m HYNIC膜联蛋白V分别有8nM，10.5nM与12.3nM的竞争抑制(FITC-膜联蛋白V结合的50％浓度)。每摩尔膜联蛋白V有0.9摩尔的HYNIC参入膜联蛋白V。C.造影与生物分布研究
在利用ITLC盐水为溶剂，测定游离对结合Tc 99m后，给小鼠注射50-150μCi的Tc 99m-HYNIC膜联蛋白(0.125-0.25μg的蛋白质)。在注射放射性药物之后，小鼠先置于俯卧姿势，造影1至2小时。利用低能可动(LEM)闪烁照相机与高敏感度平行孔准直管与128×128造影阵列(Siemens，Des Plains，IL)15分钟后可得影像。同样的方法可用于所有扫描的先前处理以及后处理。
在得到来自子宫颈瘤，唾腺，大脑，胸腺，心，肺，肝，脾，胃，GI神经束，肾，骨骼肌，脂肪，血液，以及遗骸的样品之后，就可进行生物分布的研究。样品先置于Packard Cobra II自动γ闪烁计数器上计数(Packard Instrument，Downer Grove，IL)表示为每分钟同位素衰变与背景活性的校正计数。D.结合的人体膜联蛋白V与细胞凋亡的细胞核的免疫染色
经福尔马林固定，石蜡包埋的组织先切成5μm大小，再以苏木精/伊红或其他技术染色。结合人类膜联蛋白V的免疫染色可藉由人体胎盘膜联蛋白V诱生的兔抗血清进行，所述抗血清亲和纯化自与Affi-Gel(Bio-Rad)偶联的重组膜联蛋白V。接着，依次与生物素标记的山羊抗兔抗体和亲和素-辣根过氧化物酶复合物保温(JacksonImmuno Reserch)，以及与3，3’-二氨基联苯胺反应(Bindl，J.M.&Warnke，R.A.，1986)之后，可完成免疫组织化学检测。
欲检测细胞凋亡细胞核时，可用Gavrieli等公开的末端脱氧核苷酸转移酶-介导的UPT末端标记(TUNEL)法的修正方法来染色切片。在抑制内源性过氧化物酶之后，再用蛋白酶K(20μg/ml)于室温下消化石蜡切片15分钟。这些切片又接着与5单位/ml的λ外切核酸酶(LifeTechnologies，Gaithersburg)于37℃保温30分钟，再以末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液(0.2M potassium cacodylate，25mM Tris-HCl，0.25mg/ml BSA，1.5mM CaCl2，20mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，与20mg/mlFicoll)与5μM dAPT使达到平衡。此末端标记反应也是在末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液中进行，末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液也包括最终浓度为75单位/ml的末端脱氧核苷酸转移酶与100μM的1，N-6-ethenol-ATP(Sigma)。37℃保温60分钟之后，以1×SSC(标准的柠檬酸盐水)润湿终止反应。这些切片再与鼠1G4mAb(ReginaSantella赠，Columbia University)保温，所述mAb能识别ethenoadenin组成成分(Young，T.L.&Santella，R.M.，1988)，随后的免疫组织化学检测如前述，利用的是生物素标记的山羊抗小鼠抗体。
实施例1
活体内造影Fas-介导的细胞凋亡
小鼠的肝细胞凋亡是藉注射抗Fas抗体诱导出的，其在1至2小时内造成大规模的肝细胞凋亡，在90％的受处理小鼠中在3小时之时会造成死亡(Ogasawara)。
5至6周龄的18-24克雌性Balb/c小鼠接受静脉内注射，注射以纯化的仓鼠单克隆抗-Fas抗体(Jo2，10μg每只动物，Pharmingen，San，Diego，CA)。接着，在3个分别的实验中，此动物于0，1，2小时，再静脉内接受以约90μCi的Tc 99m HYNIC放射性标记的膜联蛋白V。结果如图1所示。
表1
放射性标记的膜联蛋白V与HAS的生物分布分析
| Tc 99m膜联蛋白V％I.D./gm | 对照组(n＝6) | 抗Fas处理的小鼠(10μ/小鼠) | |
| 1小时(n＝8) | 2小时(n＝6) | ||
| 肝 | 11.7±1.35 | 15.0±3.5* | 41.6±10.0** |
| 肾 | 187.9±21.8 | 127.7±42.6* | 64.9±37.5** |
| 脾 | 12.1±1.08 | 20.8±7.8* | 17.5±7.55(N.S.) |
| I123HSA％I.D./gm | 对照组(n＝4) | 抗Fas处理的小鼠(10μ/小鼠) | |
| 1小时(n＝6) | 2小时(n＝5) | ||
| 肝 | 3.87±0.76 | 6.92±1.81* | 6.87±1.2** |
| 肾 | 4.6±0.89 | 6.0±0.42* | 5.84±0.88** |
| 脾 | 3.52±0.67 | 3.75±0.86(N.S.) | 3.42±0.56(N.S.) |
| 器官重量(g) | 对照组(n＝6) | 抗Fas处理的小鼠 | |
| 1小时(n＝8) | 2小时(n＝6) | ||
| 肝 | 1.02±0.086 | 1.41±0.37** | 1.32±0.25* |
| 肾 | 0.33±0.061 | 0.34±0.082(N.S.) | 0.34±0.048(N.S.) |
| 脾 | 0.11±0.023 | 0.12±0.02(N.S.) | 0.11±0.018(N.S.) |
| 总体重 | 19.5±1.1 | 20.7±2.2(N.S.) | 19.3±1.6(N.S.) |
* 与对照值有显著性差异(p＜0.05)
** 与对照值有高显著性差异(p＜0.001)
N.S.与对照值无显著性差异
在第一与第二小时观察到显著的放射性标记膜联蛋白V肝摄取量的逐渐增加，分别为对照值的148％到372％，这是藉由如图1所示的特定研究区域(region-of-interest；ROI)影像分析法来测定的。在处理后1小时时，脾摄取量瞬时升至对照值的140％，在2小时时，降至110％。在处理之后1和2小时，肾摄取量降至40％。
另一组小鼠(对照组)在Jo2抗体处理之后0，1，2小时，即注射以90μCi Tc 99m HYNIC卵白蛋白(MW＝43kd；2μg蛋白质)。如图2所示，这些动物在抗Fas抗体处理后第一小时时，肝摄取量增加为127％，第二小时时，仍几乎维持不变(131％)。脾摄取放射性标记的卵白蛋白量在处理之后保持不变。肾摄取放射性标志的卵白蛋白量在处理后1小时时升至对照值的138％，并在2小时时，维持在对照值的131％。
第三组小鼠除接受上述的处理外，并且于三个分别的实验中，在第0，1，2小时，注射Tc 99m标记的膜联蛋白V与I125标记的人血清白蛋白(HSA)。不同实验的动物在相应的时间点之后被杀死以作生物分布研究。结果如上表1所示，以注射剂量/g组织的百分比(％ID/gm)表示。此数据与由放射性标记的膜联蛋白V与HAS的ROI造影分析所得的数据成比例。
实施例2
心脏同种异体移植排斥的活体内造影
基本上按前述方法制备99mTc HYNIC-膜联蛋白V。除特别说明之外造影与生物分布研究亦如前述进行，依据Ono与Lindsey(Woodley，等，1993)修饰过的方法，将自PVG供体(得自Harlen-Sprague-Dawley)异位心脏同种异体移植至成年雄性ACI大鼠(250-350g)腹大动脉与下静脉。将ACI供体的同系心脏移植物移植至宿主ACI大鼠的腹部。在上述模型的ACI受体体内的PVG心脏同种异体移植物在移植之后4到5天开始有排斥反应，其是以心跳脉博的降低来评估的。移植之后五天，所有动物经由尾部静脉血管接受700-900μCi的99mTcHYNIC-膜联蛋白V(10-20μg蛋白质/kg)并且在1小时后显影。再杀死这些动物，原有的自身心脏与移植的心脏再进行闪烁计数与组织病理研究。
移植后5天，使用哦99mTc HYNIC-膜联蛋白V可以使所有PVG同种异体移植心脏(n＝4)轻易地造影。ACI同系心脏移植物(n＝3)在注射99mTc HYNIC-膜联蛋白之后没有可见的活性，而经闪烁孔计数证实，放射性药物的摄入等同于原来的心脏活性。PVG同种异体移植物的整体活性百分比超过ACI同系移植物活性百分比的213％(p＜0.005；two-tailed斯式t检验)，这是由ROI造影分析测定的。闪烁孔计数分析揭示出PVG同种异体移植物相对于原有心脏活性有超过11倍的99mTc HYNIC-膜联蛋白V摄取量。
所有的动物中，PVG心脏同种异体移植物的切片在移植5天之后有显著的单核炎性细胞的浸润。同系或原来的心脏并未发现这种侵入。浸润围绕心肌受伤区域，并与心肌血管血栓形成相关。这些区域的中心，不须苏木精染色就有明显的细胞坏死。但在周边，以TUNEL染色可确定有细胞凋亡变化的细胞核。在心肌发炎细胞与细胞坏死区的交界处可观察颗粒状模式的99mTc HYNIC-膜联蛋白V免疫染色。这些细胞的细胞核仍被苏木精染色，更进一步说明了他们是细胞凋亡而不是坏死。以阳性肌细胞数目而言，抗膜联蛋白V染色比起TUNEL更广效，对比度也更强。如一般预测，抗膜联蛋白染色在坏死区很浓且结块但这种染色是特异性的。同系或原来的心脏并未观察到染色，在省略了第一抗体的同种异体心脏移植物中也未观察到染色。
在另一组不同但相似的实验中，ACI大鼠(每组n＝6)接受自PVG供体的异位心脏同种异体移植物。自ACI供体(每组n＝3)的同系心脏移植物被移植于宿主ACI大鼠。没有任何一组接受移植排斥处理。
移植之后第1，2，3，4，5，6，7天，对受体大鼠进行核扫描。核扫描前1小时，先注射1.0mCi 99mTc HYNIC-膜联蛋白V。
移植后4天，以99mTc HYNIC-膜联蛋白V可轻易地使PVG心脏同种异体移植物显现。在注射99mTc HYNIC-膜联蛋白V之后，ACI同系心脏移植物没有可见的活性。
99mTc HYNIC-膜联蛋白V摄取量可用ROI分析来定量。移植心脏的摄取以整体摄取的百分比来计算。结果如图3。
核扫描之后即刻就使这些动物安乐死。取出移植的心脏以作分析。对经标准苏木精和伊红染色的切片进行急性排斥的组织分级，分级方案示于下表2。
表2急性排斥的组织分级
| 等级0 | 无排斥 |
| 等级1 | 温和排斥 |
| 等级2 | 中度排斥 |
| 等级3 | 严重排斥 |
使用商购的过氧化物酶试剂盒(APOPTAG，Oncor，Gaithersburg，MD)，通过核DNA裂解的TUNEL染色在组织切片上鉴定细胞凋亡的细胞核。如表3的数据所示，在心脏同种异体排斥的过程中，在肌细胞与炎性细胞皆发现细胞凋亡。
表3
心脏同种异体移植的TUNEL染色；
在排斥过程中阳性细胞核的显现
| 排斥 | 发炎的 | 内皮细胞 | 肌细胞 |
| 等级0 | 0 | 0 | 0 |
| 等级1 | + | + | + |
| 等级2 | ++ | + | + |
| 等级3 | + | + | ++ |
如表4的数据与图4所显示，99mTc HYNIC-膜联蛋白V的摄取量与急性排斥组织等级相关。
表4
在心脏同种异体移植排斥过程中
99mTc HYNIC-膜联蛋白V的摄取百分比
* 斯氏t检验，双尾的偏差不相等。
| 排斥 | ％摄取量±STDV | 显著性* |
| 等级0 | 0.42±0.17 | |
| 等级1 | 0.83±0.31 | p＝0.036vs.等级0 |
| 等级2 | 1.43±0.40 | p＝0.008vs.等级1 |
| 等级3 | 2.40±0.53 | p＝0.001vs.等级2 |
实施例3
活体造影处理过的鼠淋巴瘤99mTc HYNIC-膜联蛋白V大致如上述方法制备。除非特别说明造影与生物分布研究，亦如上述方法进行。
于C3H.HeN小鼠(Harlan Breeders，Indianapolis)中，培养38C13鼠B细胞淋巴瘤(Maloney，等，1985)，再将悬浮于200μl RPMI培养基1640(不含血清)的400个肿瘤细胞皮下注射于小鼠左肋。移植之后14天，小鼠又接受100mg/kg环磷酰胺腹膜内注射。环磷酰胺腹膜内注射后20小时，小鼠又接受25-50μg/kg的99mTc HYNIC-膜联蛋白V(100-150μCi/动物)的静脉内注射。在注射放射性药物后1小时，造影与杀死该动物，再移除肿瘤作闪烁计数与组织病理研究。
未处理的肋肿瘤移植物(n＝8)可轻易藉由闪烁照相造影而得见，并且以ROI显影分析可知其有超过正常软组织活性365％的膜联蛋白V摄取量。处理过的肋肿瘤(n＝6)的99mTc HYNIC-膜联蛋白V活性相对对照值有高于78％的增加量，所述值以每克肿瘤的总体活性表示。(p＜0.05，two-tailed student’s test)。闪烁孔计数又确认了此结果，其中经处理的肿瘤的膜联蛋白V摄取量增加了132％(p＜0.05)，所述摄取量以每克肿瘤注射剂量的百分比表示，并且与对照组比较重量降低了58％(p＜0.05)。以ROI造影分析得到的每克肿瘤总体活性与以生物分布研究(r2＝0.831)测定的每克肿瘤注射剂量百分比线性相关。
组织分析证明经处理的肿瘤的全部成淋巴细胞完全(大于95％)细胞凋亡，而对照组只有低于5％的细胞凋亡。
虽然参照特定方法和实施方案描述了本发明，但在不背离本发明精神的情况下也可对本发明进行多种修饰和改革。
Claims (28)
1.活体内造影哺乳动物受试者区域性细胞死亡的方法，所述方法：
(a)给药于该受试者标记有生物相容性放射性核素的膜联蛋白；
(b)经过一段时间后，当该标记的膜联蛋白于该受试者中定位之后，将该受试者置于一放射检测装置的检测区；以及
(c)用该放射检测装置测量定位于该受试者的放射性核素的放射性放射(radiation emission)以构建出放射影像，其中该影像代表该所述哺乳动物受试者的所述区域的细胞死亡。
2.如权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括步骤(d)处理该影像以减去该受试者的膜联蛋白的非特异性定位所致的信号。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述非特异性定位在肾脏中。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该放射性核素选自I 123，I 131，Ga 67，In 111，F 18，以及Tc 99m。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该放射性核素为Tc99m。
6.如权利要求5所述的方法，其中Tc99m藉由hydrazinonicotinamide(HYNIC)连结于该膜联蛋白。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中该Tc99m标记的膜联蛋白的给药剂量界于约5到20mCi。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述放射检测装置是γ射线检测装置而所述放射性放射是γ射线放射。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述γ射线检测装置是γ闪烁照相机。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中施用该标记的膜联蛋白后约5分钟至约2小时后测量该γ射线放射以构建该影像。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中施用该标记的膜联蛋白后约1小时后测量该γ射线放射以构建该影像。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该细胞死亡是细胞凋亡所致。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括在以选定时间间隔重复步骤(b)与(c)，
其中重复步骤(b)与(c)能有效追踪在一段时间内，该区域放射性放射强度的改变，反映出遭受细胞死亡的细胞数目的改变。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，进一步包括在选定时间间隔重复步骤(b)与(c)。
其中重复步骤(b)与(c)能有效追踪在一段时间内，在该区域放射性放射定位的改变，反映出遭受细胞死亡的细胞位置的改变。
15.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该放射检测装置是立体造影照相机。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述膜联蛋白是膜联蛋白V。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白的给药剂量是小于约300μg蛋白质/kg。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白的给药剂量是界于约1到10μg蛋白质/kg。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由静脉内给药。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由腹膜内给药。
21.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由椎管内给药。
22.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由胸膜内给药。
23.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由淋巴内给药。
24.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该标记的膜联蛋白经由肌肉内给药。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述区域基本上包括整个受试者。
26.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述区域包括头部或头部的一部分。
27.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述区域包括心脏或心脏的一部分。
28.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述区域包括肝脏或肝脏的一部分。
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