CN105669855A - 一种18F快速标记Cys-Annexin V的方法及其应用 - Google Patents

一种18F快速标记Cys-Annexin V的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于正电子发射计算机断层(PET)显像技术领域，具体涉及一种18F快速标记Cys-Annexin？V的方法，以及获得的18F-Al-NOTA-Cys-Annexin？V在检测细胞凋亡方面的应用，本发明所述的18F快速标记Cys-Annexin？V的方法，首次采用18F-Al-NOTA-Maleimide标记Cys-Annexin？V，该标记方法所用标记时间短，标记率高，并可实现18F定位标记Cys-Annexin？V，且18F-Al-NOTA-Cys-Annexin？V与PS保持良好的亲和性，作为PET显像剂可实现良好的显像效果，具有较为理想的显像特异性。

Description

一种18F快速标记Cys-Annexin V的方法及其应用
技术领域
本发明属于PET显像领域，具体涉及一种18F快速标记Cys-AnnexinV的方法及其应用。
背景技术
细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath，PCD)，是不同于坏死和意外死亡的、由基因调控的细胞主动性死亡过程。作为细胞生命周期中的重要组成部分，细胞凋亡的过程中伴随着一系列的生物分子及细胞形态学的改变。其中，细胞膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻转至外层，进而暴露于细胞表面，是细胞凋亡早期事件，发生在凋亡细胞形态学的改变之前，也是凋亡级联反应的初始事件。PS的外翻作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，将会进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核内DNA降解等现象。因此，外翻的PS作为凋亡检测的靶点，具有较高的时效性，可早期检测细胞凋亡。目前，在利用检测外翻的PS来获知细胞凋亡情况的技术中，正电子断层显像(positronemissiontomography，PET)是常用的技术手段之一，其主要是利用11C、13N、15O或18F等放射性核素标记的、可与PS特异性结合的物质作为显像剂，通过显像剂在代谢中聚集与分布的呈像，来获知细胞凋亡的情况，从而达到诊断的目的。
在可与PS特异性结合的物质中，以AnnexinV作为PET显像剂的相关技术具有良好的应用前景。AnnexinV(膜联蛋白V，又称AnnexinA5和AnxA5)是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80个氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究表明，AnnexinV与PS特异性结合的亲和力高达10-9mol/L，其在被放射性核素标记、进而作为PET显像剂进行体内细胞凋亡的显像时，可实时监测体内凋亡的发生并且可实现细胞凋亡的活体无创显像，因此，已成为监测活体细胞凋亡领域的研究热点。在对AnnexinV进行正电子核素标记的技术中，以18F标记AnnexinV的18F-SFB-AnnexinV最为常见。但是，由于18F-SFB-AnnexinV是通过功能基团(18F-SFB)连接AnnexinV中赖氨酸残基上的氨基，进而标记上放射性核素的，而一分子的AnnexinV蛋白中含有21个赖氨酸残基，因此，18F-SFB标记在AnnexinV上的位置是不确定的，甚至标记上的个数也不确定。另外，AnnexinV中的一些赖氨酸残基处在AnnexinV与PS结合的活性区域附近，18F-SFB与该处的赖氨酸残基连接则会影响AnnexinV与PS的亲和性。这些均会导致18F-SFB-AnnexinV在细胞凋亡显像时特异性较低。
为实现对AnnexinV的定位标记，且不影响AnnexinV与PS的亲和性，进而提高AnnexinV凋亡显像的特异性，现有技术中出现了对AnnexinV进行修饰，研究新的AnnexinV蛋白变体的相关技术。例如，2008年Li,Xuehe等用18F-FBABM对N端接一个半胱氨酸的AnnexinV蛋白进行标记，研究结果显示，AnnexinV经上述修饰后不影响其与PS结合的亲和力，但是18F-FBABM与蛋白的标记率比较低，仅为37％，无法实现更为高效标记。
为解决上述问题，中国专利文献CN104193820A中公开了一种18F标记Cys-AnnexinV的方法及其应用，其中采用18F定位标记的辅助基团是N-[2-(4-[18F]氟苯甲酰氨基)乙基]马来酰亚胺(18F-FBEM)标记Cys-AnnexinV，然而18F-FBEM合成步骤复杂，合成时间长达2小时左右，而且由于标记的辅助基团18F-FBEM的脂溶性大，导致其不易溶于蛋白溶液中，不利于该标记辅基与蛋白溶液中的Cys-AnnexinV进行反应，影响Cys-AnnexinV的标记，使得所述Cys-AnnexinV的标记率低，标记所用时间长，效率低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的18F定位标记Cys-AnnexinV的标记率低，标记时间长，效率低的缺陷，从而提供一种标记率高、标记时间短、效率高的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法与应用。
为此，本发明提供了一种18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，采用18F-Al-NOTA-Maleimide标记Cys-AnnexinV。
所述的方法，包括如下步骤：
(1)取含18F的溶液，加入含有AlCl3的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混合均匀，于80-100℃下加热5-20min，即得含有所述18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后进行纯化，备用；
(2)取步骤(1)中纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys-AnnexinV的缓冲溶液中，混合均匀得到反应液，将所述反应液置于35-37℃下水浴反应至生成具有如18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV所示结构的标记产物。
所述18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV也可以表示为18F-AlF-NOTA-Cys-AnnexinV。
优选的，所述的方法，包括如下步骤：
(1)取含18F的溶液，加入含有AlCl3的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混合均匀，于90℃下加热10min，即得含有所述标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后进行纯化，备用；
(2)取步骤(1)中纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys-AnnexinV的缓冲溶液中，混合均匀得到反应液，将所述反应液置于36℃下水浴反应20-40min，即得如18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV所示结构的所述标记产物。
所述步骤(1)中，将制备的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法进行纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱，以含质量浓度为0.05％-0.3％三氟乙酸和质量浓度为5％-20％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5-5mL/min，检测波长为210-230nm，收集出峰时间为8-13min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液。
优选的，所述步骤(1)中，还包括将制备的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化的步骤，色谱条件为：制备型反相C18柱，以含质量浓度为0.1％三氟乙酸的质量浓度为10％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集出峰时间为12.34min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液。
所述的方法，所述步骤(1)中，加入的所述含18F的溶液、所述含有AlCl3的缓冲溶液和所述NOTA-Maleimide溶液的体积比例为1：1：1，其中所述NOTA-Maleimide的浓度为3-10mg/mL，所述含有AlCl3的缓冲溶液中AlCl3的浓度为5-15mg/mL。
所述的方法，所述步骤(2)中，所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液与所述Cys-AnnexinV溶液的体积比为1：1-10，所述Cys-AnnexinV的浓度为0.2-20mg/mL，所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液的放射性活度为1-1000MBq/mL。
优选的，所述含有AlCl3的缓冲溶液中AlCl3的浓度为10mg/mL；所述NOTA-Maleimide的浓度为7mg/mL；所述Cys-AnnexinV的浓度为10mg/mL。
优选的，所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液的放射性活度为500MBq/mL。
所述的方法，所述含有AlCl3的缓冲溶液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或几种的混合液；所述含Cys-AnnexinV的缓冲溶液为水、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的任意一种或几种的混合液；所述含NOTA-maleimide的溶液为乙腈、乙醇或水。所述含AlCl3的缓冲溶液pH值为3-5，pH值优选为4。所述含Cys-AnnexinV的缓冲溶液pH值为6-8，pH值优选为7。
优选的，所述含有AlCl3的缓冲溶液为乙酸钠-乙酸缓冲液，浓度为0.2-0.5mol/L，pH值在3-5范围内。
所述NOTA-maleimide的中文名称为马来酰亚胺基乙基酰胺单1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸。
所述的方法，还包括采用缓冲液调节混合均匀的所述18F-Al-NOTA-Maleimide和含Cys-AnnexinV的溶液的混合液即反应液的pH值至5-9的步骤。优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或两种的混合液。
本发明提供了一种由上述的方法制备得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
本发明提供了一种所述的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV在制备PET显像剂中的应用
本发明还提供了一种PET显像剂，包括标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
本发明技术方案相比现有技术，具有如下优点：
(1)本发明所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，采用18F-Al-NOTA-Maleimide标记Cys-AnnexinV，首先，AnnexinV的三维结构显示，其N-端和C-端都位于分子膜结合点的对面，在重组过程中对AnnexinV的两端进行修饰并不影响重组蛋白在Escherichiacolli的表达或折叠，也不改变其与膜PS结合的亲合性，因此，在AnnexinV的C-末端添加1个半胱氨酸得到的Cys-AnnexinV，其与PS结合的亲合性并未受到影响，与此同时，经过修饰得到的Cys-AnnexinV可与所述标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide的基团实现高选择性的连接，Cys-AnnexinV的C端的游离巯基与所述标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide上的双键发生特异性连接，可较好的保证正电子显像核素18F的定位标记，避免了标记位置、标记数量的不确定带来的显像特异性低的问题，同时显著提高了标记率，大大缩短了标记时间，提高了标记效率，解决了现有技术中的正电子显像核素18F定位标记Cys-AnnexinV的标记率低，标记时间长，效率低的问题；
虽然现有技术中18F-FBEM-Cys-AnnexinV，18F-FBEM也是定位标记Cys-AnnexinV半胱氨酸上游离的巯基，但是从18F离子到18F-FBEM-Cys-AnnexinV的标记时间大约120分钟，而本发明从18F离子到18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的标记时间约为60分钟，与现有技术相比，本发明的标记时间大大缩短，操作步骤更加简单易行,这一点对于18F标记的显像探针来说，非常重要，因为18F的半衰期为109分钟，如果操作时间太长，很多同位素18F会衰变，没有起到显像的作用，而且操作人员接受到的放射性辐射也会增加。因此，本发明与现有技术相比有很大的提高；
同时，现有技术用18F-FBEM标记水溶性的蛋白不合适，因为18F-FBEM是脂溶性的，溶于乙醇而不溶于水，而Cys-AnnexinV蛋白是水溶性的，溶液中乙醇的浓度不能超过10％，否则蛋白会变性，导致无法标记。而本发明所用的标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide是水溶性的，与Cys-AnnexinV蛋白标记就非常方便，由此可见，本发明的技术方案，在标记时间和标记物性质方面优于现有技术；
(2)本发明所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，通过(1)取正电子显像核素18F溶液，加入含有AlCl3的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，，混合均匀，于80-100℃下加热5-20min，即得含有所述18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后进行纯化，备用；(2)取步骤(1)中得到的含有所述标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，加入到含Cys-AnnexinV的溶液中，混合均匀得反应液，将所述反应液置于35-37℃下水浴反应至生成具有如18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV所示结构的所述标记产物；通过步骤(1)中获得标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide，然后将纯化后的标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到含Cys-AnnexinV的溶液中，在35-37℃下水浴条件下，Cys-AnnexinV的C端的游离巯基与所述标记前体18F-Al-NOTA-Maleimide上的双键发生特异性连接，可较好的保证正电子显像核素的定位标记，避免了标记位置、标记数量的不确定带来的显像特异性低的问题，同时显著提高了标记率，大大缩短了标记时间，提高了标记效率，解决了现有技术中的正电子显像核素18F定位标记Cys-AnnexinV的标记率低，标记时间长，效率低的问题；
(3)本发明所述的放射性核素快速标记Cys-AnnexinV的方法，通过在所述步骤(1)中，将制备的所述18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液采用制备型HPLC法进行纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱，以含质量浓度为0.05％-0.3％三氟乙酸的质量浓度为5-20％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5-5mL/min，检测波长为210-230nm，收集出峰时间为8-13min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液；通过对步骤(1)中制备得到的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液进行纯化，使得所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液杂质含量降低，所述18F-Al-NOTA-Maleimide的纯度大大提高，进而促进其与Cys-AnnexinV的连接，大大提高了标记率和缩短了标记时间，提高了标记效率，解决了现有技术中的18F定位标记Cys-AnnexinV的标记率低，标记时间长，效率低的问题，同时还大大提高了标记产物18F-NOTA-Cys-AnnexinV的纯度，获得了显著的技术效果；
(4)本发明所述的PET显像剂，包括18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV，标记后的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV与Cys-AnnexinV具有相近似的性能，作为显像剂应用于检测时，可直观反映出细胞的凋亡情况，且显像结果与原位末端标记法检测细胞凋亡的结果相一致，结果准确，并且，实现了定位标记的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV，其显像特异性优异，可实现良好的显像效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中Cys-AnnexinV的HPLC色谱图(tR＝10.6min)；
图2为实施例1中标记蛋白18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的HPLC色谱图(tR＝10.6min，标记率大于90％)；
图3为实施例1中纯化后18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的HPLC色谱图(tR＝10.6min，放化纯大于95％)；
图4为实施例1中18F-Al-NOTA-Maleimide的HPLC色谱图(tR＝15.6min)；
图5为实施例1中原料18F-离子的HPLC色谱图(tR＝15.0min)；
图6为实施例11中大鼠肝脏凋亡模型注射18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV1h后的显像图，箭头所指为肝脏区域。
具体实施方式
下述实施例中，所用的原料正电子显像核素18F、NOTA-Maleimide与Cys-AnnexinV可采用本领域技术人员常规方法制备或购买得到。例如，所述Cys-AnnexinV可采用中国专利文献CN102690345A中记载的在大肠杆菌中克隆、表达并纯化得到的AnnexinV变体的方法得到；本发明中的Cys-AnnexinV由江苏靶标生物医药研究所有限公司提供；所述NOTA-maleimide可购自法国Chematech公司或美国Macrocyclics公司；上述各型号产品并无明显区别，对本发明的技术效果不产生影响。
下述实施例中涉及到的，所述18F-Al-NOTA-Maleimide，即氟(18F)化铝-((4-羧甲基-7–[(2-马来酰亚胺基-乙基氨甲基)-羧甲基]-[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基)-乙酸，其结构式如下：
所述Cys-AnnexinV为AnnexinV的变体蛋白，在天然的AnnexinV的C-末端添加1个半胱氨酸，其结构如下：
所述18F-Al-NOTA-Maleimide与Cys-AnnexinV的标记反应过程如下所示：
实施例1
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含AlCl3的浓度为0.5mol/L、pH＝4的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和200μL含5mg/mL的NOTA-maleimide的乙腈溶液，其中所述含AlCl3的缓冲溶液中AlCl3的浓度为10mg/mL，混合均匀后于90℃反应10分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.1％三氟乙酸的质量浓度为10％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集出峰时间为12.34min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，用生理盐水稀释成370MBq/mL，取100μL稀释的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到200μL的含浓度为1mg/mL的Cys-AnnexinV的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，置于37℃水浴中反应30min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
将上述方法得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV采用高效液相色谱(HPLC)法检测，取所述标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV溶液上TSKGEL凝胶柱(SWG2000swxL)，以浓度为0.05M(即mol/L，下同)、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液为流动相，流动相的流速为1.0mL/min，紫外检测波长为278nm，同时设置有同位素检测仪，进行检测。再以相同的检测条件检测未标记的Cys-AnnexinV，18F-离子以及18F-Al-NOTA-Maleimide溶液。如图1、3、4、5所示，分别为Cys-AnnexinV、18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV、18F-Al-NOTA-Maleimide以及18F-离子色谱图。通过图1、图3、图4与图5的对比可知，18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的保留时间(tR)为10.6min，与没有标记的Cys-AnnexinV的保留时间相一致，而18F-Al-NOTA-Maleimide和18F-离子的保留时间(tR)分别为15.7min和15min。通过分析图2，计算得到标记率为90.1％。
将得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV经PD-10柱纯化后，得到的产品的放化纯大于95％，其HPLC色谱图见图3所示。
上述结果表明，本发明的18F-Al-NOTA-Maleimide标记Cys-AnnexinV的方法，具有较高的标记率90.1％，标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV与18F-Al-NOTA-Maleimide能很好的分离，经纯化后18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的放化纯大于95％。
实施例2
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入150μL含10mg/mL的AlCl3的浓度为0.5mol/L、pH＝4的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和300μL含5mg/mL的NOTA-maleimide的乙腈溶液，混合均匀后于90℃反应10分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.01％三氟乙酸的质量浓度为30％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为210nm，收集出峰时间为13.5min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，用生理盐水稀释成370MBq/mL，取100μL稀释的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到50μL的含浓度为1mg/mL的Cys-AnnexinV的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，置于37℃水浴中反应30min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为82.0％，放化纯大于95％。
实施例3
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水250μL(约3700MBq)，加入100μL含5mg/mL的AlCl3的浓度为0.2mol/L、pH＝5的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和100μL含10mg/mL的NOTA-maleimide的乙腈溶液，混合均匀后于80℃反应20分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为1％三氟乙酸的质量浓度为4％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为6mL/min，检测波长为230nm，收集出峰时间为7.5min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为1MBq/mL的水溶液，取100μL的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到1100μL的含浓度为0.2mg/mL的Cys-AnnexinV的水中，混合均匀后，置于35℃水浴中反应20min，即得到标记产物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为81.0％，放化纯大于95％。
实施例4
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含15mg/mL的AlCl3的浓度为0.3mol/L、pH＝3的磷酸盐缓冲溶液和200μL含3mg/mL的NOTA-maleimide的乙醇溶液，混合均匀后于100℃反应5分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.05％三氟乙酸的质量浓度为20％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为5mL/min，检测波长为210nm，收集出峰时间为8min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为1000MBq/mL的水溶液，取100μL18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到200μL的含浓度为20mg/mL的Cys-AnnexinV的柠檬酸盐缓冲液中，混合均匀后得反应液，将所述反应液调节pH值至5，然后将所述反应液置于36℃水浴中反应40min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为85.7％，放化纯大于95％。
实施例5
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含10mg/mL的AlCl3的浓度为0.5mol/L、pH＝4的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和200μL含5mg/mL的NOTA-maleimide的乙腈溶液，混合均匀后于90℃反应10分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.3％三氟乙酸的质量浓度为10％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集出峰时间为12.5min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为500MBq/mL的水溶液，取100μL18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到200μL含浓度为10mg/mL的Cys-AnnexinV的磷酸盐与柠檬酸盐混合的缓冲液中，混合均匀后，得到反应液，将所述反应液置于37℃水浴中反应30min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为85.2％，放化纯大于95％。
实施例6
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含2mg/mL的AlCl3的浓度为1mol/L、pH＝6的柠檬酸盐缓冲溶液和200μL含1mg/mL的NOTA-maleimide的水中，混合均匀后于105℃反应2分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.2％三氟乙酸的质量浓度为15％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5mL/min，检测波长为220nm，收集出峰时间为12.5min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为1050MBq/mL的水溶液，取100μL18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到200μL的含浓度为0.1mg/mL的Cys-AnnexinV的柠檬酸盐缓冲液中，所述含Cys-AnnexinV的缓冲溶液pH值为7，混合均匀后得反应液，向所述反应液中加入磷酸盐缓冲液，将所述反应液调节pH值至5，然后将所述反应液置于37.5℃水浴中反应15min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为87.7％，放化纯大于95％。
实施例7
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含20mg/mL的AlCl3的浓度为0.1mol/L、pH＝2.8的磷酸盐与柠檬酸盐混合溶液和200μL含12mg/mL的NOTA-maleimide的乙醇溶液，混合均匀后于75℃反应25分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.25％三氟乙酸的质量浓度为18％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集出峰时间为12.34min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为0.8MBq/mL的水溶液，取100μL18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到500μL的含浓度为25mg/mL的Cys-AnnexinV的柠檬酸盐缓冲液中，所述含Cys-AnnexinV的缓冲溶液pH值为8，混合均匀后得反应液，向所述反应液中加入柠檬酸盐缓冲液，将所述反应液调节pH值至7.5，然后将所述反应液置于34.5℃水浴中反应45min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为86.7％，放化纯大于95％。
实施例8
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含5mg/mL的AlCl3的浓度为0.2mol/L、pH＝3的乙酸钠-乙酸缓冲溶液和200μL含10mg/mL的NOTA-maleimide的乙腈溶液，混合均匀后于80℃反应20分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV溶液采用制备型HPLC法纯化的步骤，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.3％三氟乙酸的质量浓度为5％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为230nm，收集出峰时间为12min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为1MBq/mL的水溶液，取100μL的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到1000μL的含浓度为0.2mg/mL的Cys-AnnexinV的水中，混合均匀后，置于35℃水浴中反应20min，即得到标记产物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为90.0％，放化纯大于98％。
实施例9
本实施例所述的18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，具体包括以下步骤：
(1)18F-Al-NOTA-Maleimide的制备：取回旋加速器打出的含18F的靶水200μL(约3700MBq)，加入200μL含15mg/mL的AlCl3的浓度为0.3mol/L、pH＝4的磷酸盐缓冲溶液和200μL含3mg/mL的NOTA-maleimide的乙醇溶液，混合均匀后于100℃反应5分钟，即得18F-Al-NOTA-Maleimide，将制备的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV溶液采用制备型HPLC法纯化的步骤，色谱条件为：制备型反相C18柱(Phenomenex00G-4252-N0,5μm，250x10mm)，以含质量浓度为0.05％三氟乙酸的质量浓度为20％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5mL/min，检测波长为210nm，收集出峰时间为13min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，备用；
(2)18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的制备：取步骤(1)中得到的18F-Al-NOTA-Maleimide配制为放射性活度为1000MBq/mL的水溶液，取100μL18F-Al-NOTA-Maleimide溶液加入到100μL的含浓度为20mg/mL的Cys-AnnexinV的柠檬酸盐缓冲液中，所述含Cys-AnnexinV的缓冲溶液pH值为6，混合均匀后得反应液，向所述反应液中加入磷酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液的混合液，将所述反应液调节pH值至9，然后将所述反应液置于36℃水浴中反应40min，即得到标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
按照与实施例1相同的方法对得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV进行测定，计算得到标记率为89.0％，放化纯大于97％。
实施例1018F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV与细胞的结合实验
取两管100μL的浓度为5％膜外翻的红细胞溶液和两管100μL生理盐水做对照，分别加入1mlHNKGB缓冲液(包含10mmol/LHEPES-Na，PH7.4,136mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，5mmol/L葡萄糖，1mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)，2.5mmol/L的CaCl2)和20μL实施1制备的稀的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV溶液，震荡30秒，放置15分钟，离心(9000g，5min)，分别取上清液800μL，测计数。计算结合率的公式为100×[1-(有红细胞管上清液的计数)/(无红细胞管上清液的计数)]，计算得到的结合率为：89.5±0.71％。说明本发明制备的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV与红细胞内膜有很好的亲和性。
实施例11大鼠肝脏凋亡模型的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的MicroPET显像
选择SD大鼠5只(卫生部核医学重点实验提供)，体重280-290g，以5mg/kg的放线菌酮剂量制备大鼠肝脏凋亡模型，3只大鼠分别经尾静脉注射放线菌酮溶液，另2只大鼠注射生理盐水作对照。3小时后，取实施例1中标记得到的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV，用生理盐水稀释成放射性活度为37MBq/mL的溶液，取0.2ml分别经尾静脉注射入大鼠体内，注射显像剂后1h和2h分别进行MicroPET显像，各静态采集10min。如图6所示，左侧为模型鼠，箭头处为凋亡肝脏显像，右侧为正常对照鼠，在左侧模型鼠的MicroPET显像图中可观察到肝脏部位有明显的放射性浓聚。经计算，在注射后1h时，模型鼠肝脏的放射性摄取(％ID/g)分别是对照组肝脏的6.23±0.23倍。
上述实验结果表明：化学药物诱导的肝凋亡细胞对18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的摄取明显高于正常肝细胞，说明18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV具有显现细胞凋亡的能力。
实施例1218F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV与18F-FBEM-Cys-AnnexinV的对比
对于Cys-AnnexinV进行定位18F标记的文献报道很少，现有技术中以18F-FBEM-Cys-AnnexinV为代表，如果以18F-FBEM为基础计算18F-FBEM-Cys-AnnexinV的标记率为80％左右，其标记率不仅远远低于本发明的标记率，而且18F-FBEM-Cys-AnnexinV标记从18F离子到得到产品需要2小时左右，而本发明中从18F离子到得到产品18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV只需60分钟左右。众所周知，18F的半衰期也只有109分钟，标记时间越长，放射性衰变就越多，拿到的产品就越少，操作人员接受到不必要的放射性辐射就会增多。本发明大大缩短标记时间，另外，现有技术用18F-FBEM标记水溶性的蛋白不合适，因为18F-FBEM是脂溶性的，溶于乙醇而不溶于水，而Cys-AnnexinV蛋白是水溶性的，溶液中乙醇的浓度不能超过10％，否则蛋白会变性，导致无法标记。而本发明所用的标记辅助基团18F-Al-NOTA-Maleimide是水溶性的，与Cys-AnnexinV蛋白标记方便、快速，而且标记率高。由此可见，本发明的技术方案，在标记时间和标记物性质方面优于现有技术。
现有技术中得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，在放线菌酮诱导的大鼠肝脏凋亡模型的显像中，18F-FBEM-Cys-AnnexinV注射后1h，模型组肝脏的放射性摄取是对照组的5.18倍。而本发明得到的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV在放线菌酮诱导的大鼠肝脏凋亡模型的显像中，注射后1h,模型组肝脏的放射性摄取是对照组的6.23±0.23倍(如实施例11所示)，说明18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV的凋亡显像的特异性高于于现有技术的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，而且标记时间缩短，标记效率提高。
综上所述，本发明的18F标记Cys-AnnexinV的方法可实现高标记率，且应用于显像时放射性摄取高，Cys-AnnexinV与PS的亲和性较好，显像特异性高，作为PET显像剂可实现较为理想的显像效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种18F快速标记Cys-AnnexinV的方法，其特征在于，采用18F-Al-NOTA-Maleimide标记Cys-AnnexinV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取含18F的溶液，加入含有AlCl3的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混合均匀，于80-100℃下加热5-20min，即得含有所述18F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后进行纯化，备用；
(2)取步骤(1)中纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys-AnnexinV的溶液中，混合均匀得反应液，将所述反应液置于35-37℃下水浴反应至生成具有如18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV所示结构的标记产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将制备的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法进行纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱，以含质量浓度为0.05％-0.3％三氟乙酸的质量浓度为5-20％的乙腈溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5-5mL/min，检测波长为210-230nm，收集出峰时间为8-13min下流出的组分，即为纯化后的所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，加入的所述含18F的溶液、所述含有AlCl3的缓冲溶液和所述NOTA-Maleimide溶液的体积比例为1：1：1，其中所述NOTA-Maleimide的浓度为3-10mg/mL，所述含有AlCl3的缓冲溶液中AlCl3浓度为5-15mg/mL。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液与所述Cys-AnnexinV溶液的体积比为1：1-10，所述Cys-AnnexinV的浓度为0.2-20mg/mL，所述18F-Al-NOTA-Maleimide溶液的放射性活度为1-1000MBq/mL。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述含有AlCl3的缓冲溶液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的任意一种或几种的混合液；所述含Cys-AnnexinV的溶液为水、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的任意一种或几种的混合液；所述含NOTA-maleimide的溶液为乙腈、乙醇或水。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，还包括采用缓冲液调节所述反应液的pH值至5-9的步骤。
8.一种如权利要求1-7任一所述的方法制备得到的标记产物18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
9.权利要求8中所述的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV在制备PET显像剂中的应用。
10.一种PET显像剂，其特征在于，包括权利要求8中所述的18F-Al-NOTA-Cys-AnnexinV。
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