TW486518B

TW486518B - Oxidoreductase and processes for producing 3-(p-hydroxyphenyl)-2-propenol derivatives and other compounds using the same

Info

Publication number: TW486518B
Application number: TW086102214A
Authority: TW
Inventors: Toru Nagasawa; Hiroshi Morita; Yumiko Iwasawa
Original assignee: Chisso Corp
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2002-05-11
Also published as: EP0893497A4; EP0893497A1; WO1997031101A1; AU1734897A; US6017724A; JP4309969B2

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 486518 A7 _____B7 _ 五、發明説明（i ) 〔技術領域〕本發明係，自螢光性假單胞桿菌屬菌株的菌體取得，能催化對-羥基苯衍生物、對-烷基酚衍生物等基質的氧化反應的新型酶，及使用該酶能從該基質製造3 -（對羥苯基）-2-丙烯醇衍生物、對-羥苯甲醯醛衍生物、對一烷基酚衍生物、具光學活性的S ( —）一 1 一（4 一羥苯基）醇衍生物等相關方法。 _ 〔先行技術〕在水及電子受體的存在之下，使典型的丁香酚類化合物對-烯丙基酚衍生物等基質的α位的雙鍵向旁邊移動，並使羥基在該α位產生加成反應的雩化還原催化酶，至今尙未被提出，且使用此類酶來製造典型的4 —羥一 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇）類化合物3 -（對羥苯基）一 2 -丙烯醇衍生物也尙未被開發，再則此類酶對各種反應的催化作用的相關報告，至今也尙未被提出。另，3 -（對羥苯基）一 2 —丙烯醇衍生物一支的4 一經- 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇），在過去被認爲可廣泛地應用在醫藥品、化妝品、香料、農藥、食品添加物、飼料添加物、液晶等的製造中，作爲還料之用。但是在此工程中所得的4 -羥- 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）的量非常的少，因此4 一羥一 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）變得非常昂貴，進而使得其廣泛利用性受限。已有人利用微生物作用，將便宜的丁香酚嘗試製成香本.^張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210/ 297公釐） ~ 一 4 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 486518 A7 B7 五、發明説明（2 ) 草精的相關化合物

雖然可生產出香草精或香草酸，但谷P 無法有效地生產出4 —經- 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）在水及電子受體的存在之下，有效對〜烷基酚衍生物，來合成具光學活性的S (-）一 1 一（4 一經苯基）醇衍生物的氧化還原催化酶，尙無報告例。具光學活性的S (-）一 1— (4 —經苯基）醇衍生物，被認爲可廣泛地應用在醫藥品、化妝品、香料、農藥、食品添加物、飼料添加物、液晶等的製造中，作爲原料之用。特別是作爲血管擴張劑的光學活性中間體之用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製〔技術的明示〕本發明所欲解決之課題是，生產在水及電子受體的存在之下，能使丁香酚等基質的α位的雙鍵向旁邊移動，並使羥基在該α位產生加成反應的氧化還原催化酶，及提供使用此類酶有效地製造典型的4 一羥- 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）般有用化合物的方法。進一步，利用該酶所能催化的各種有機反應，提供製造3 —（對羥苯基）一 2 -丙烯醇、對一羥苯甲醯醛及具光學活性的s (一）一]_一（ 4 一羥苯基）醇等衍生物的相關方法。本發明是以提供具有下列性質的氧化還原酶： (1)•作用：在水的存在之下，丁香酚的α位的雙鍵向旁移動，並使羥基在該α位產生加成反應得到4 -羥- 3 一甲氧桂皮醇（松柏醇）。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）訂 -5 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 486518 A7 B7 五、發明説明（3 ) (2) .基質特異性：作用於一般式（1一a)，( 1— b) ，（l — c) ，（1 — c 一），（1 一 d)所示之化合物，而後分別生成一般式（2 - a ) ，（ 2 —，b ) ’ （2 - c) ’ ( 2 — c " ) ，（2 - d)所示之化合物〇 (3) •基質親合性：對丁香酚及吩嗪硫酸甲替酯的米海利斯常數，分別爲1.75及0.4微莫耳。 (4) •最佳ρΗ:ρΗ5·5左右。 (5 ) ·最佳溫度：5 0 °C。 (6) •安定pH範圍：以30 °C、30分的處理而言，最安定是PH5 — 9。 (7 ) •各種金屬鹽之影響：二價鐵、銅、銀、水銀等鹽類，有明顯的活性阻礙作用。 (8) •各種阻礙劑之影響：對-氯汞苯甲酸、苯聯胺會阻礙活性。 (9) •分子量：各由一個分子量10400的α次單位及分子量5 8 2 0 0的yS次單位構成分子量6 8 0 0 0的異種雙分子。本發明更提供具下列性質的氧化還原酶。以含丁香酚的營養培養基來培養螢光性假單胞桿菌屬的菌株。使用該菌株的菌體中產生的酶，至少可催化下列 A、B、C反應。本紙張尺度適用不國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — 一 6 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝------訂------^---- !»!1 - - - ; 1.^1 —^1 ----- 486518 A7 B7 五、發明説明（

CH2OH

(反應式A R2 R2 (1 一 a) (2· - a) rR3 CHO i 《- ^ άι R1 R1 R2 R! 1 (1 -b) (2 -b) OH R4 R5 R4— -R5 O,- -^ A I^R1 R R2 1 l1 (1 一 c) (2 — c) (反應式B )

(反應式C (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表經基或甲氧基，R3表氫原子或羥基，R4表氫原子或甲基，R5 表1 一 1 0碳長的院基或甲胺基^ ) 本發明欲得之酶是，當反應式C中的R 4爲氫原子時，能誘發此不對稱反應。本發明欲得之酶的種類屬於螢光性假單胞菌株，其全名爲 Pseudomonas fluoresens E118 (FERM P-15185)。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7 486518 A7 ____ B7 五、發明説明（5 ) 本發明進一步以上述酶做爲觸媒，在水及電子受體的存在下，由反應式A中的一般式（1 — a )所示之對—烯丙基酚衍生物出發，合成出如一般式（2 - a )所示之3 一（對羥苯基）一 2 -丙烯醇衍生物之方法。

(1 一

CH2OH

(2 — a nfr.il n r.....--- n I..... I —i I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

’（反應式A 訂 (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基。）本發明進一步以上述酶做爲觸媒，在水及電子受體的存在下，由反應式A中的一般式（1 一 b )所示之對一羥甲苯衍生物出發，合成出如一般式（2 - b )所示之對一羥苯甲醯醛衍生物之方法經濟部中央標準局員工消費合作社印製

(1 -b)

(2 — b) (反應式B ) (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基，R 3表氫原子或羥基。）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - 486518 A7 _____B7五、發明説明（6 ) 本發明進一步以上述酶做爲觸媒，在水及電子受體的存在下，由反應式C中的一般式（1 一 c )所示之對一烷基酚衍生物出發，合成出如一般式（2 — c )所示之對一羥苯甲基醇衍生物之方法。

(1 一 c)

0H

(2 —c)

(反應式C (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基，R3表氫原子或羥基，R 4表氫原子或甲基，R5 表1一10碳長的烷基或甲胺基。） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明進一步以上述酶做爲觸媒，在水及電子受體的存在下，由反應式C /中的一般式（1 一 c >)所示之烷基酚衍生物出發，合成出如一般式（2 — c >)所示之羥苯甲基醇衍生物之方法。 0H f-RS | H-C.-R 1 ^ - - 4 R1 1 R2 R2 (1 —c，） (2 - c，

(反應式C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 486518 A7 ____B7__五、發明説明（7 ) (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥甲氧基，R3表氫原子或羥基，R 4表氫原子或甲基，：r5 表1一10碳長的烷基或甲胺基。）本發明進一步以上述酶做爲觸媒，在水及電子受體@ 存在下，由反應式D中的一般式（1 — d )所τκ之化合物出發，合成出如一般式（2 — d )所示之化合物之方法。

(反應式D ) (2 - d) 〔實施本發明的最佳形態〕要得到本發明之酶，首先將生產該酶，即，屬螢光性假單胞桿菌的菌株，在含丁香酚的好氣性培養液中進行培養。雖說，培養液只要含丁香酚且能讓本菌生長之物即可。但最好是，使用含丁香酚0 · 1 - 0 · 4% (V/V) Γ碕先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 -訂· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 { } 酵液金鹽碘 % V 、合。水、 2 \ } 混液 2 g •WV 鹽養鈣 4 0 C \ 屬培化 ο 1 %w金之氯 · 5 1 C 及 ο 入 ο .·%} •加鹽 0 0 2 V 8 中水膝一 · \ I 升 5 、 1 oW5 公銅 } o I C .一酸 V · 5%6 水硫 /ο ο 1 Η 子、 W鹽 · · Ρ 離 g 丨水 ο ο 、去 3 % 7 鹽一 % 以 · 3 錶水 1 2 是 ο 一酸 7 ο · 好酸 5 硫鐵 · ο 最硼 • 、一 ο I 液、 ο } 第液 5 合 g 糖 V 酸取 ο 混 4 蔗 / 硫萃 ·鹽 · 、 W 、母 ο 屬 ο 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10 - 486518 A7 _____B7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 化鉀0 · 1 g、硫酸錳7水鹽0 · 4 g、鉬酸鈉2水鹽 0 · 2g溶解後之溶液。培養在20 — 35 °C、通氣72 小時、攪拌、培養。所得的培養液以離心分離或過濾收集菌體，再將菌體懸浮於1莫耳磷酸鉀緩衝溶液（p Η 7·0)中。將此菌體懸濁液以超音波破碎機或菌體破碎機來打碎菌體後即得粗酵素液。所得的粗酵素溶液以硫酸胺做鹽析處理，及/或以離子交換、凝膠過濾/疏水性等各種管柱沈析法處理後可得到高純度的酶標準品。之後，以SD S聚丙烯胺，凝膠電泳也確認爲本酶爲單一成份的精製酶標準品。這種酶之酵素化學的各種性質如下所述。〔本酶的各種酵素化學性質〕 (1).作用：在水的存在之下，丁香酚的α位的雙鍵向旁移動，並使羥基在該α位產生加成反應得到4 一羥—3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2 ) •基質特異性：如反應式Α - D所示，作用於一般式（1 一 a) ，（1— b) ，（1 — c)，（ 1 - c ^ ) ，（1 一 d)所表之化合物，而後分別生成一般式（2 — a) ，（2 - b)，（ 2 - c) ，（2 - c ) ，（2 — d)所示之化合物。細胞色素C、2，6 -二氯靛酚、吩嗪硫酸甲替酯作爲電子受體之用。 (3)•基質親合性：對丁香酚及吩嗪硫酸甲替酯的米海 -11 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇〆297公釐） 486518 A7 _B7_ 五、發明説明（9 ) 利斯常數，分別爲1·75及0·4微莫耳。 (4)•最佳ρΗ:ρΗ5·5左右。 (5 ) •最佳溫度：5 0 t。 (6) •安定pH範圍：以30 °C、30分的處理而言，最安定是PH5 — 9。 (7) •各種金屬鹽之影響：如表1所示，二價鐵、銅、銀、水銀等鹽類，有明顯的活性阻礙作用。_ 表1 各種金屬鹽之影響金屬鹽相對活性（％ ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製未加入 1 0 0 N a C 1 9 9 • 8 Co C 1 2 · 6 H 2〇 8 9 • 8 F e c 1 2 * n H 2〇 2 8 • 9 F e c 1 3 · 6 H 2〇 7 6 .9 M g c 1 2 · 6 H 2〇 9 6 .2 C a c 1 2 1 1 3 、N i c 1 2 * 6 H 2〇 9 4 .2 Z n c 1 2 1 1 3 Μ n c 1 2 · 4 H 2〇 8 2 • 7 S n c 1 2 * 2 H 2 〇 1 0 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12 - 486518 A7 B7 五、發明説明（10) 表1 續金屬鹽相對活性（％) A 1 2 ( s 〇 4) 2 • 1 8 H 2 0 1 0 2 C u C 1 2 • 2 H 2〇 6 · 7 5 A g 2 S 〇 4 1 . 1 0 Η g C 1 3 1 1 . 1 Β a C 1 2 • 2 H 2〇 1 0 5 C d C 1 2 • 2 H 2〇 9 1 · 5 P b C 1 9 0.4 8).各種阻礙劑之影響：如表2所示，對-氯汞苯甲酸、苯聯胺會阻礙活性。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） -13 - 486518 A7 B7 五、發明説明（n) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表2 各種阻礙劑之影響阻礙劑相對活性（％ ) 未加入 1 0 0 5 ，5 / _二硫代雙（2 —硝苯甲酸） 7 9 . .8 N-乙基馬來醯亞胺 1 0 5 - 碘乙酸 9 3 . .8 對一氯汞苯甲酸 4 1 . .8 羥基胺 8 4 · • 4 苯聯胺 4 6 . .2 胺脲 9 3 . .9 冷一氫硫基乙胺 1 1 0 L 一青徵素胺 7 7 . • 1 D -青徵素胺 8 2 . .4 D -環絲胺酸 9 6 · ,8 〇 -菲啉 1 1 5 α，α / -聯吡啶基 1 1 3 兒苯酚一 3，5 -二磺酸鈉 1 0 0 E D T A 9 2 . .0 8 -羥基喹啉 9 2 . 、2 氰酸鉀 7 2 . .5 疊氮化鈉 8 7 _ .0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝_ 訂 h -ri 14 - 五、發明説明（12 ) Α7 Β7 表2 績

硫代甲酸

2 —硫醇基乙醇 L〜抗壞血酸 N a 2 S 2 0 4 Η 2 Ο 2 過硫酸氨 Cuprizone E S N P PMSF 8 7 . 9 5 . 8 7 . 6 9 . 9 7. 9 4 . 0 0 9 5 . 8 3 . 8 3 . 3 5 3 36 8 1.^----^-----0^------、訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 EDTA:伸乙二胺四乙酸 EPNP : 1 ，2 —環氧一3 一（對一硝酚羥基）丙烷 PMSF:苯甲磺醯氟 (9 ) •分子量：以S D S聚丙烯胺•凝膠電泳結果得知爲5 9 0 〇〇、以離心分離的結果則爲 1 1 0000 ’推論由兩個相同的次單位所構成，但使用TOF— MS作更精密的分析時，其結果顯示，各由一個分子量1 〇 4 0 0的α次單位本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 15 - 486518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13) 及分子量5 8 2 0 〇的石次單位構成分子量 68000的異種雙分子。 (10) •酵素活性之測定：由加入2 0 〇微莫耳丁香酚的正辛烷溶液5 〇 # L， 5 0微莫耳吩嗪硫酸甲替酯的水溶液2〇〇，1莫耳的磷酸鈣緩衝液（PH7 · 〇) 50yL及去離子水 6 7 5 // L所構成酵素活性測定用反應液的試管中，加入酶液25//L ’ 30°C振盪20分鐘，加入甲醇1毫升使反應中止’接著將所得的反應液進行分離，上清液以高速液相沈析儀分析，以檢測出的4 -羥-3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）的吸收峰進行定量即可。高速液相沈析儀是使用尺寸爲4 . 6 X 1 5 0毫米的〇DS C18管柱，甲醇：去離子水：酢酸=45: 5 2 : 3的成分比（容積比）之展開液以每分鐘1毫升的流速來展開，檢測的吸光度爲2 8 0 nm。以丁香酚的標準保持時間3·6分鐘的吸收峰作爲4一羥一3—甲氧桂皮醇（松柏醇）的標準。本酵素活性之1單位爲1分鐘能產生1微莫耳的4 -羥一 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）的酵素活性。在此先以4 一羥- 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇）的製造法爲例作爲說明使用本酶來生產一般式（2 - a )所表化合物之方法。從上述之酵素活性測定用反應液中去除緩衝液後所成之物（200微莫耳丁香酚的正辛烷溶液50//L，50 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -1^1 am In n «ϋ_ϋ nn n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂一 16 - 486518 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _____B7五、發明説明（14 ) 微莫耳吩嗪硫酸甲替酯的水溶液2 0 0 # L，1莫耳的磷酸鈣緩衝液（PH7 · 0) 50/zL及去離子水（675 以L )以滴入稀硫酸或氨水來調整酸鹼至pH5 - 7，溫度2 5 - 50 °C、攪拌1 5 — 1 80分鐘。反應終結後，以酢酸乙酯 '氯仿、氯化乙烯或是乙醚等有機溶劑，從反應液中淬取出4 一羥一 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇），再以矽凝膠沈析法、逆相沈析法或是真空蒸餾等方法進行精製，必要時可用活性碳進行脫色、真空乾燥後可得無色的4 —羥一 3二甲氧桂皮醇（松柏醇）粉末。同樣地，也可分別合成，由一般式（1 一 a )之化合物至一般式（2 - a)之化合物、一般式（1 一 b)之化合物至一般式（2-b)之化合物、一般式（1一c)之化合物至一般式（2 - c )之化合物、一般式（1 一 c / )之化合物至一般式（2 - c /)之化合物、一般式（ 1 一 d)之化合物至一般式（2 — d)之化合物。另外，一般式（1 一 c )的R4爲氫原子時，可誘發不對稱碳反應，進行光學活性化合物之合成。就本發明以上述及合成各種化合物時所使用的水，除了作爲溶劑及氧原子供給外，同時也是作爲酶反應之電子供體之用。在本發明中，水及電子受體之使用量分別在各反應中，至少爲與基質等莫耳所需之量或過量亦可。通常’水當作溶劑使用之故，因此大量過剩地使用。 n J ....... =_ H— 1 i m I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 486518 第86102214號專利申請案 A7 中文說明書修正頁 _______________ 民國89年11月修正五、發明說明（15 ) ί ^ 〔實施例〕 1 >f 接著，以實施例對本發明做具體說明。但本發明並不局限於這些實施例。實施例1 將螢光性假單胞桿菌E118 FERM BP - 6497菌株置入含丁香酚0 · 15%(v/v) 、蔗糖 l%(w/v)、膝 0.1%(w/v)、磷酸 2 鉀 0 · 2% (w/v)、硫酸鎂 7 水鹽 0 · 05% (w/ v)、酵母淬取液0.0 3% (w/v)、硫酸第一鐵7 水鹽0 · 1% (w/v)及金屬鹽混合液0 . 1%、pH 7·0之培養液20公升中，通氣攪拌培養54小時。金屬鹽混合液是以去離子水一公升中加入氯化鈣2水鹽 0 · 4g 、硼酸0 · 3g、硫酸銅5水鹽0 . 04g、碘化鉀0 . 1 g、硫酸錳7水鹽0 . 4 g、鉬酸鈉2水鹽 0 · 2g溶解後之溶液。培養在20 - 35 °C、通氣72 小時、攪拌、培養。所得的培養液以離心分離收集菌體，以生理食鹽水洗淨後，再將菌體懸浮於1 0微莫耳磷酸鉀緩衝溶液（PH7 · 0) 300毫升中。此菌體懸浮液以下述方式進行淬取、精製本酶。精製的示意圖如表3所示〇將菌體懸濁液以超音波破碎機打碎菌體後，以離心分離得到上清液2 1 4 0毫克（總活性2 7 0單位）作爲無細胞淬取液。接著在此之中加入硫酸胺得到3 0 — 5 0 % 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ' "~ -18 - --------#裝--------訂---------§. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 486518 A7 __________B7 五、發明説明（l6 ) (w / V )的硫安飽和濃度劃分1 3 1 0毫克（總活性 2 2 8單位）。將此劃分以〇丑八£ Sephacel ( Pharmacia公司產品）管柱分離後得到活性劃分5 8毫克 (總活性1 1 5單位）。此活性劃分之中加入硫酸胺得到 40 — 80% (w/v)的硫安飽和濃度劃分37 . 2毫克（總活性1 0 2單位）。將此劃分以Phenyl Sepharose 、DEAE Sephacel、Octyl Sepharose (均爲Pharmaci a 公司產品）管柱的順序，進行沈析，最後可得酶標準品 0 · 4毫克（總活性1 2 · 1單位）。此標準品以S D S 聚丙烯胺·凝膠電泳確認爲單一成分。再者，自無細胞淬取液至最終’比活性上昇2 0 9倍、回收率爲4 · 5 %。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

486518 A7 B7 五、發明説明（17) 表3 本酶的精製概要經濟部中央標準局員工消費合作社印製總蛋白質量比活性總活性回收率純度 fflg 單位/mg 單位 % 倍無細胞淬取液 2140 0.13 270 100 1.0 硫安鹽析3G-50% 1310 0.17 288 84.4 1.4 DEAE Sephacel 58.0 1.98 115 42.6 15.7 硫安鹽析4G-80% 37.2 2.74 108 37.8 21.7 Phenyl Sepharose 11.8 6.88 81.6 30.2 54.6 DEAE Sepharose 1.98 14. 1 27.5 10.3 112 Octyl Sepharose 0. 16 26.3 12. 1 4.48 209 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 - 486518 A7 B7 五、發明説明（18 ) 實施例2 將插好迴流器且已加入2 0 0微莫耳濃度丁香酚的正已烷溶液5 0毫升，5 0微莫耳濃度吩嗪硫酸甲替酯的水溶液2 0 OmL·及去離子水7 2 5毫升的反應容器中，加入以實施例1之方法製作第二次、硫安鹽析完畢後的酵素液2 5毫升（20單位），以稀硫酸酸鹼自動調整維持在 PH5 · 5、50°C攪拌2小時。反應液中加入醋酸乙酯 3 0 0毫升進行淬取，所得的醋酸乙酯層以迴旋蒸發器濃縮至2 0毫升後，以矽凝膠管柱進行分離。以甲醇：氯仿 (1:1)比的溶劑展開後，收集各劃分，接著室溫下真空乾燥，完成後可得融解溫度7 4 °C的無色粉末1 · 6克。收率爲8 9%。將此粉末進行GC— MS分析，所得的結果顯示母峰爲1 8 Om/z ，與標準品4 一經一3 —甲氧桂皮醇（松柏醇）相同。紅外線吸收光譜也與4 -羥一 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇）相同，可知所得之物即爲4 一羥一 3 —甲氧桂皮醇（松柏醇）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例3 與實施例2同法製造，如表4 - 5所示的各基質及其對應的生成物。各個生成物是以G C - MS分析、紅外線吸收光譜進行固定。光學活性是以裝置Chiralcel 0B管柱的高速液相沈析儀進行分離，移動相以正辛烷：正丙醇（ 9:1)，吸收峰的檢測及使用紫外線檢測器及旋光度檢測器。各種基質的相對活性是以丁香酚當作基質時的相對本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -21 486518 A7 B7 五、發明説明（19)活性爲1 0 0相對計算出的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 22 - 486518 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（20 ) 表4 基質生成物相對活性 - 一般式 R1 R2 R3 一般式 R1 R2 (1 - a ) och3 OH — (2- a ) och3 OH 100 實施例2 (1-a) och3 och3 — (2 — a ) och3 och3 42.5 (1—b) H OH H (2- b) H OH 7.93 基質：對一曱酚酶 (1—b) H OH OH (2- b ) H OH 122 (1-b) och3 OH OH (2- b) och3 OH 90.4 生成物：香草精 --i-----0^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -23 - 486518 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 表5 基質/一般式（1 — c/l — c，）生成物/-«式（2 - c/2-c/) 相對活性 R1 R2 R4 R5 R1 R2 R4 R5 立體 l/e e (%) - Η OH H ch3 H OH H ch3 S(-) /91.5 78.0 Η OH H c2h5 H OH H c2h5 S(-) /91-1 72.8 Η OH H c3h7 H OH H c3h7 S(-) /90-8 66.4 Η OH H C5H11 H OH H C5H11 S(-) /90< 38.1 OH H H ch3 OH H H ch3 s(-) /90< 18.8 Η OH ch3 ch3 H OH ch3 ch3 /------ 6.25 Η OH ch3 C 2H5 H OH ch3 c2h5 12.1 OH OH H ch2nh2 OH OH H ch2nh2 1 0< (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 24 - 486518 A7 B7 五、發明説明（22) 實施例4 進一步本發明之酶，對下列反應式D所示之反應亦顯示活性，與實施例2相同的作法可由（1 一 d )所示的基質合成（2 — d )所示之化合物。並且確認此反應爲不對稱碳誘發反應。 H0

OH 〇H (1 - d) (2-d) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (反應式D ) 〔產業上之利用可能性〕本發明，隨著基質的α位雙鍵之轉移，在該α位產生羥基加成反應以催化製造醇類反應的酶，並且使用此酶，能有效率地製造4 -羥- 3 -甲氧桂皮醇（松柏醇）爲始，及各種3 -（對羥苯基）一 2 -丙烯醇衍生物、對一羥苯甲醯醛衍生物及具光學活性的S (-）一 1一（4 一羥苯基）醇等衍生物。經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -25

Claims

486518 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本 f ΑΒΨ V. OC D 第86102214號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國8 9年1 1月修正 1 · 一種氧化還原酶，其特徵爲具下列性質： (1 )作用：在水的存在之下，丁香酚的α位的雙鍵向旁移動，並使羥基在該α位產生加成反應得 2 到4一羥一3-甲氧桂皮醇（松柏醇）；基質特異性··作用於一般式（1 一 a )，( 一 b ) 1 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) d )所示之化合物，而後分別生成一般式 2 - a) ，( 2 — b ) ，（2 — c) ，（2 c ^ ) ，（2 - d)所示之化合物；

1 一 a)

1 一 b) 、言· CH20H

(2 — a)

(2 — b) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 486518 ABCD 申請專利範圍

〔1 - c) (2-c) OH 1H-R5 1 HU5 1 R1 R2 R1 R2 :1 -c’） (2 - c，） HO 0Η OH (1 -d) (2 — d) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 )基質親合性：對丁香酚或吩嗪硫酸甲替酯的米海利斯常數，分別爲1 · 7 5或0 . 4微莫耳 j 4)最佳pH:pH5·5左右； 5 )最佳溫度·· 5 0 °C ; 6)安定pH範圍：以30 °C、30分的處理而言，最安定是pH5—9; 良紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 486518 ABCD 爲含丁香酚的營養培養基來培養 •、申請專利範圍 (7)各種金屬鹽之影響：二價鐵、銅、銀、水銀等鹽類，有明顯的活性阻礙作用； (8 )各種阻礙劑之影響：對-氯录苯甲酸、苯聯胺會阻礙活性； (9 )分子量：各由一個分子量1 0 4 0 0的^位單位及分子量5 8 2 0 0的/3次單位構成分子量Μ 〇〇〇的異種雙分子。 ~ 2 .

螢光性假單胞桿菌屬的菌株’其全名爲Pseudomonas fluoresens E118 (FERM BP- 6 4 9 7 )使用該菌株的菌體中產生的酶，至少可催化下列A、B、C反應 CH20H 反應式A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -Ο R1 R2 R1 R2 (1 — a) (2 - a) rR3 CHO I 4 - R1 R2 R1 R2 (1 -b) (2 — b) (反應式B ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） 486518 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍

(1 - c )

(2 — c) 反應式C (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基，R3表氫原子或羥基，R4表氫原子或甲基，R5 表1 — 1 0碳長的烷基或甲胺基）。 3 .如申請專利範圍第2項之酶，其中當反應式C中的R 4爲氫原子時，能誘發此不對稱反應。 4 種如式（2 - a)所示的3 —（P —羥苯基） -2 —丙烯醇衍生物之製造方法，其特徵爲使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之酵素作爲觸媒，於水以及電子受容體的存在下，經由下述式A所示的反應，由一般式〔1 一 a )所示的P -烯丙基酚衍生物所製得。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1 一 a) CH2〇H

(2 — a: 反應式A (式中，R1表氫原、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基，R 3表氫原子或羥基）。 5 · —種如式（2 - b )所示的P -羥苯甲醯醛衍生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 486518 ABCD 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物之製造方法，其特徵爲使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之酵素作爲觸媒，於水以及電子受容體的存在下，經由下述式B所示的反應，由一般式（1 一 b )所示的 P —羥甲苯衍生物製得

(1 一 b) (2 — b) (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基）。 6 . —種如式（2 — c)所示的P —羥苯甲基醇衍生物之製造方法，其特徵爲使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之酵素作爲觸媒，於水以及電子受容體的存在下，經由下述式C所示的反應，由一般式（1 一 c )所示的 P -烷基酚衍生物所製得 0H

經濟部智慧財產局員工消費合作社印¾ (式中，R1表氫原子、羥基或甲氧基’ R2表羥基或甲氧基，R3表氫原子或羥基，R 4表氫原子或甲基，R5 表1 一 10碳長的烷基或甲胺基）。 ______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 4^6518 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 了· 種如式（2 - c )所示的光學活性經苯甲基醇衍生物之製造方法，其特徵爲使用如申請專利範圍第工至3項中任一項之酵素作爲觸媒’於水以及電子受容體的存在下，經由下述式C —所示的反應，由一般式（1 一 c )所市的院基酌衍生物製得。 OH I CH2-R5 HU5 φ,, - φι 丁 R】 T Ri (反應式C，） R2 R2 (1 - c’）（2 - c’） (式中，R1表氫原、羥基或甲氧基，R2表羥基或甲氧基，R3表氫原子或羥基，R4表氫原子或甲基，R5表 1 一 10碳長的烷基或甲胺基）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 · —種如式（2 — d)所示的化合物之製造方法，其特徵爲使用如申請專利範圍第1至3項中任一項之酵素作爲觸媒，於水以及電子受容體的存在下，經由下述式D 所示的反應，由一般式（1 一 d)所示的化合物所製得。 H0

[QJ (反應式D) OH 0H (1 一 d) (2 — d) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 b 一