TW459044B - Protein MP-121 of the TGF-β-like family - Google Patents

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經濟部中央橾準局員工消費合作社印？4 459044 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明是有關TG F 族新穎的生長/分化因子， 及其所編碼之D N A序列。 BMP —，TGF—及抑制素一相關之蛋白質爲生長 因子 TGF — 家族中之成員（Roberts and Sporn, Ha_ n d b ο o k of Experimental Pharmacology 9 5, 4 1 9 - 4 7 2 ( 1990))。其與各樣的醫學治療方法及應用有關聯。這些 因子適用於和傷口癒合及組織再生有關之方法。再者許多 TGF — 族成員可誘導組織生長，如骨骼之生長。

Wozney (Progress in Growth Factor Research 1 ( 1989)., 267-280)及 Vale et: al. (Handbook of Experi-rn e n t a 丨 P h a r m a c o 1 q g y 9 5 ( 1 9 9 0 ) ， 2 11 - 2 4 8 ) 描述 各種生 長因子，如和BMP及抑制素群有關者。此群之成員有顯 著的結構相似性。蛋白質之前驅體由胺基末端訊號序列， 前肽序列及1 1 Q至1 4 0個胺基酸之羧基末端序列所組 成，後者可自前驅體中解離，且代表成熟的蛋白質。再者 其成員可由胺基酸序列同質性明定。成熟蛋白質含有最具 保留性之序列，特別是在家族成員中固有的7個半胱胺酸 殘基。類TG F — /3蛋白質爲多重功能的，激素上活性之 生長因子。其也有相關的生物活性如：細胞之趨化性，細 胞分化之促進及組織誘導能力。 E p 〇 2 2 2 491 A1揭示抑制素》及鏈之 序列。 大致上類TGF_ /3蛋白質在其結構上顯示差異’此 造成其確實生物功能上相當大的差異。此外其可見於各種 本紙張尺度逋用中囤國家標準（CNS ) Λ4現格（210Χ 297公釐） -I n^i ^^^^1 tt 7 -^ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 5 9 0 4 4 A7 __B7 五、發明説明（2 ) 不同的組織型式及發展階段。因此其因爲確實的功能而不 同，如所需之細胞生理環境，其壽命，標的區域，對於輔 助因子之需求及其對退化之抗性。雖然已經描述許多具有 組織-誘導潛力之蛋白質，然而其在有機體中之天然功能 及甚至更重要的是其醫學相關性，仍需詳加硏究。大概可 假設在類TG F - 蛋白質中仍有未知之成員在各種型式 組織之分化/誘導上十分重要。然而，分離這些新穎的類 一 TG F 蛋白質之主要難處在於其功能尙未能精確說 明以發展出高度有識別力之生物分析法。另一方面與類 TG F.-々蛋白質中已知成員同質之預期的核苷酸序列太 小，無法以典型的核酸雜交技術篩選。然而爲了提供可符 合醫學需求之進一步誘導及分化蛋白質，迫切需要進一步 分離及鑑定新的類TG F — Θ蛋白質。這些因子可醫學上 用來癒合傷處及治療各種組織之退化疾病。 經濟部中央欉準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於母案PCT/EP9 3/0 〇 3 5 0中已示出類 TGF — /5蛋白質MP-1 2 1-之核苷酸及胺基酸序列， 其中陳述相當於成熟蛋白質之大部份序列。並未揭示前肽 Μ P — 1 2 1完整的序列。 本發明之基本目的是指出可指導合成類TG F — 蛋 白質中具有弱分裂及/或分化誘導潛力之新晈員之D N A 序列。本發明目的特別是提出類TG F — 蛋白質MP — 1 2 1完整的D N A及胺基酸序列。 此目的可以指導合成類TG F 蛋白質之DN A分 子所達成，且其包括 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐） /各 A7 B7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 (： 1 I ( a ) 可 指 導 合 成 成 熟 蛋 白 質 之 部 份 且 若 必 要 時 進 一 1 1 步 示 於 S E Q I D Ν 0 1 核 Μ 酸 序 列 之 功 能 性 部 份 1 I \ 9 /<—S 請 1 I ( b ) 相 由 於 ( a ) 序 列 在 遺 傳 密 碼 簡 併 性 ^f*r· 範 圍 內 先 r I 讀 1 之 核 甘 酸 序 列 背 面 1 I 中 之 之 之 1 ( C ) 相 當 於 ( a ) 及 ( b ) 序 列 對 偶 質 衍 意 1 1 生 物 之 核 酸 序 列 ， 或 事 項 再 1 ! ( d ) 可 與 ( a ) ( b ) 或 ( C ) 序 列 之 雜 交 之 填 % —>J 本 I 序 列 η 1 1 限 制 條 件 爲 依 據 ( d ) 之 D N A 分 子 含 有 至 少 是 可 指 導 合 I 1 成 成 熟 之 類 T G F — β 蛋 白 質 之 部 份 0 1 I 本 發 明 進 — 步 的 具 MiMr 想 實 例 是 有 關 丰 請 專 利 範 圍 第 2 至 訂 I 1 0 項 之 主 體 0 本 發 明 的 其 他 特 色 及 益 處 可 由 較 佳 具 體 實 1 1 I 例 之 說 明 中 浮 現 0 現 在 簡 要 說 明 序 列 策 略 及 附 圖 0 1 1 S E Q I D Ν 0 1 示 出 可 指 導 合 成 類 Τ G F — 1 1 β 蛋 白 質 Μ P — 1 2 1 之 D N A 之 兀 整 的 核 甘 酸 序 列 Ο 1 A Τ G 起 始 密 碼 子 始 於 1 2 8 號 核 甘 酸 0 成 熟 的 蛋 白 質 始 1 1 於 8 3 6 m 核 甘 酸 〇 ί I 在 本 發 明 範 圍 內 > 冬 成 熟 蛋 白 質 ft 也 包 括 功 能 性 衍 生 I 1 i 物 其 中 包 括 至 少 在 類 T G F 一 β 蛋 白 質 中 固 有 的 7 個 半 f 1 1 胱 胺 酸 菡 域 0 1 S E Q I D Ν 0 2 示 出 類 T G F — β 蛋 白 質 1 1 Μ Ρ — 1 2 1 7U 整 的 胺 基 酸 序 列 9 其 衍 生 S Ε Q I D 1 1 Ν 0 1 中 所 示 之 核 甘 酸 序 列 0 1 1 本紙張·尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公t ) 經濟部中央標準局貝Η消費合作杜印策 4 59 0 44 A7 B7 - — — /五、發明説明（4 ) 圖式簡單說明 圖1示出MP — 1 2 1與類TGF —々蛋白質某些成 '員胺基酸序列之比較，始自7個固有的半胱胺酸殘基的第 一個。*表示胺基酸在所有比較的蛋白質中是相同的；+ 表示胺基酸相當於與MP—121比較之至少一種蛋白質 0 圖2示出寡核苷酸引子之核笹酸序列，其係用於本發 明中，及這些序列與類TGF- A蛋白質中已知成員之比 較。Μ表示A或C，S表示C或G ’.R表不A或G ’且K 表示G或T。2 a示出引子OD之序列，2 b示出引子 Ο I D之序列。 本發明包括至少是指導合成成熟蛋白質之部份’且若 必要時示於S E Q ID N 〇 : 1梭苜酸序列之功能性 部份，以及在遺傳密碼簡併性範圍內相當於此序列之序列 ，及此序列之對偶質衍生物。此外本發明也是有.關與此序 列雜交之序列，限制條件爲此D N A序列至少完全包括可 指導合成成熟之類TG F _/?蛋白質之部份° 在本發明義意中之、功能性部份’一語表示可作用如 訊號肽，前肽或成熟蛋白質部份之蛋白質部份’即其符合 Μ P — 1 2 1成熟部份的至少一種生物功能。 蛋白質成熟部份之編碼區域，由8 3 6號核替酸延伸 至停止密碼子，其始自SEQ ID No,1所示序列 的1 1 8 4號核苷酸。若必要時，DN A分子可包括 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ΙΟΧ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本育)

J 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 459044 A? B7五、發明説明（5 ) S E Q ID No. 1所示序列之進一步功能部份，即 指導合成訊號及/或前肽部份之核苷酸序列。特佳的是， DN A分子包括訊號及前肽部份之序列，及成熟蛋白質部 份，即S E Q ID No. 1所示序列的1 2 8號至 1 1 8 4號核μ酸。另一方面DNA分子也可包括其他蛋 白質之功能性訊號及/或前肽部份，特別是類TG F - /3 蛋白質的其他蛋白質，如上述的抑制素或BMP蛋白質， 加上指導合成成熟蛋白質之部份。個別的核奋酸序列可見 於上述揭示之參考文獻中，其爲藉此所作之參考文獻。 雖然爲本發明所涵蓋之對偶質，簡併的及雜交序列， 由於在核轻酸及/或胺基酸序列上有些略變化而具有結構 上的差異，但爲此序列所編碼之蛋白質基本上仍有相同有 用的特性，使其可在基本上用於相同的應用醫學領域中。 依據本發明，所謂"雜交〃表示有用的雜交條件，較 好是6 X S S C之塩濃度在6 2 — 6 6 °C下，繼以0 . 6 X S S C » 0 . 1 % S S 在 6 2 - 6 6 X 下一小時洗滌 之條件。 本發明較佳之具體實例爲由上所定義之DNA序列， 其可得自脊椎動物，較好是晡乳動物如豬，牛及齒類，如 大鼠或老鼠，及特別是得自靈長類如人類，或可拷貝自相 當的序列。 本發明較佳之具體實例是SEQ ID No. 1所 示之序列，且示以MP—1 2 1 °MP-1 2 1之轉錄子 可得自肝組織，且所指導合成之蛋白質可與抑制素/類一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4_ϋ ( 210X297公旒)— "一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，1Τ 經濟部中央標準局員工消费合作社印掣 4 5 9 0 4 4 A7 B7 五、發明説明（6 ) 活性素蛋白質之成熟部份有相當多的胺基酸同質性（見圖. 1)。人類抑制素，抑制素卢A及抑制素之蛋白 質序列由 Mason et al 所描述（Biochem. and Biophys. R e s C o m m u π i c a t t ο n s , 1 3 5 , 9 5 7 - 9 6 4 ( 1 9 8 6 ))。與已 知抑制素序列特異的某些典型的序列同質性也見於Μ P — 1 2 1之前肽部份，而MP—1 2 1其他前驅體部份顯示 與抑制素前驅體有相當多的差異。 此外本發明是有關含有至少一套數本發明D N A分子 之載體，在此載體中，依據本發明之DN A序列較好可與 表現控制序列操作性連接。此載體適合在穩定或瞬時轉形 之細胞中產製類一TG F - /3蛋白質。於轉形及接續之培 養中可使用各種動物-植物，眞菌及細菌系統。依據本發 明之載體較好含有在前肽部份中複製所必需之分離，且其 可自主地複製。此外載體之使用較好其中含有可選擇之標 幟基因，以此方法可偵測到前肽部份之轉形。 再者，本發明是有關可爲本發明之DNA或本發明之 載體所轉形之宿主細胞。適合的宿主細胞實例包括各種眞 核及原核細胞，如大腸桿菌，昆虫細胞，植物細胞，晡乳 動物細胞及眞菌如酵母。 此外本發明是有關類TGF- 蛋白質，其可爲根據 申請專利範圍第1項之：D N A序列所編碼。依據本發明之 蛋白質較好具有SEQ ID No. 2所示之胺基酸序 列，或若欲求時其功能部份，且可呈現生物特性如組織-誘導特性，其和治療應用有關。蛋白質上述特色可依與其 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

I 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 A7 B7 五、發明説明（7 ) 他類TG F — Θ蛋白質彤成同二體或異二體而定。此種結 構也証明是適用於臨床應用的。 依據本發明蛋白質之生物特色，較好是MP_ 1 2 1 ，可根據下列的分析法來決定，如：Wrana等人（Cell 71, 1003-1014 (1992)), Ling et al. (Proc. Natl. Acad, of Science, 82, 7217-7221 (1985)), Takuwa et al.( Am. J. Physiol. 257, E797-E803 (1989)}f Fann and Patterson (Proc. Natl. Acad, of Science, 91, 43-47 (1994)), Broxraeyer et al. (Proc. Natl. Acad, of Science, 85, 9052-9056 (1988)), Green et al. (Cel-1, 71, 731-739 (1992)或Partridge et al. (Endocrinology ， 1 08 ， 2 1 3 - 2 1 9 ( 1 9 8 1 ) ) 。 此外本發明是有關類TG F — 蛋白質之製法，其特 徵在於：培養以本發明D N A或本發明載體所轉瑕之宿主 細胞，再自細胞及/或培養物上清液中分離出類T G F — /?蛋白質。此一方法包括於適合的培養基中培養經轉形之 宿主細胞，並純化所形成的類TG F -卢蛋白質。以此方 式，該製法可產生適量的欲求蛋白質，以應用於醫學治療 或是於利用細胞培養技術（其中需有生長因子）之應用中 。宿主細胞可以是細菌，如杆菌或大腸桿菌，眞菌如酵母 ，植物細胞如煙草，馬鈴薯或a r a b i d d p s i s或動物細胞’ 尤其是脊椎動物細胞株，如Mo，C 〇 s或CHO細胞株 或昆虫細胞株。 又本發明另一主題是提出藥學組成物’其中含有藥學 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210><297公釐） 10 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 五、發明説明（8 ) 上有效劑量之根據本發明之類TG F 蛋白質爲活性物 .質。若欲求時，此組成物包括藥學上可接受之載劑或輔助 物質，稀釋劑或充塡劑。此藥學組成物可單獨使用於傷口 癒合及組織再生，或可與其他活性物質混合，如類TG F —々蛋白質之其他蛋白質或生長因子，如EG F (上皮生 長因子）或PDGF (血小板衍生之生長因子）。再者此 藥學組成物可用於預防疾病。 依據本發明之藥學組成物，較好可用於治療及預防骨 骼，軟骨，結締組織，皮庙，粘膜，內皮，上皮，神經元 ，腎臟或牙齒之傷害，可應用於牙科移植物，應用於傷口 癒合或組織再生過程，充作促發育素用於肝組織生長之誘 導，前驅體細胞或骨髓細胞增殖之誘導，維持分化狀態及 可治療生育力之混亂或可用於避孕。 依據本發明之類一 TG F — /?蛋白質，其進一步可能 的臨床應用是可充作免疫反應之遏止劑使用，以避免器官 移植之排斥，或配合血管形成使用。再者，依據本發明的 蛋白質可用來增加生育力或用於避孕。依據本發明的藥學 組成物也可預防性地使用或用於美容手術。再者，組成物 之應用並不限於人類，也可包括動物特別是寵物及家蓄。 最後，本發明是有關可特異結合至本發明蛋白質之抗 體，或此抗體之片段（如Fab或Fab<)。此特異抗 體或抗體片段產製之方法，爲精藝者一般知識的一部份。 此抗體較好是單株抗體。此抗體或抗體片段也可適用於診 斷方法。 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ox'297公釐） A7 B7 經濟部中央橾準局員Η消費合作杜印製 五、發明説明（9 ) 此外希望可由下列實例來說明本發明。 實例1 Μ P — 1 2 1之分離_ 1.1 總 RNA 依 Chirgwin et al之方法（8丨〇(：11-eoustry，18，5 29 4 - 5 2 9 9 ( 1 9 7 9 ))分離自人類肝組織（ 4 〇歲的人）。以寡（dT)層析，依廠商指示（Strat-agene po丨y (A)快速管柱）自總RNA中分出聚（A+) -R N A ° 1. 2 於反轉錄反應中，1至2. 5微克的poly( A+) RNA以5分鐘加熱至6 5°C，並在冰上快速冷卻 。反應混合物中含有2 7單位的R N A — Guard ( Pharmacia) 1 2. 5 微克 oligo(dT) 12-18 (Pharmacia) ， 5X緩衝物質（2 5 0毫莫耳/升Tr i s/HCj? P Η 8 . 5，50毫莫耳/升“昇（：又2 ，50毫莫耳/ 升DTT，各5毫莫耳/升的dNTP，6 0 0毫莫耳/ 升KCJ?)及2 0單位的AMV反轉錄酶（Boehringer Mannheim)此爲每微克poly (A+) RNA計。反應混合 物（2 5微升）在4 2 τ下培育2小時。c D N A匯集再 貯於一2 0 °C下。 1. 3 示於圖2之去氧核苷酸引子OD及OID， 在自動化D N A合成儀上製備（b 1 〇 s e a r c h )。利用變性 的聚西烯醯胺凝膠電泳進行純化，並以等速電泳分離出凝 謬中之主帶。比較類TG F 蛋白質已知成員之核酸序 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -IJUK tut —m m in · --6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSU4規格（训乂所公慶） 12 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10 ) 列並選擇具高保留性區域以設計寡核苷酸。此蓝域之比較 示於圖2。爲了促進選殖，二種寡核Μ酸均含有 Ec 〇R I解離位置，自OD在其5 >末端另外含有一個 N c ο I限制酶解離位置。 1 . 4 在PCR反應中，使用相當於20毫微克p- oly(A+)RNA 之 cDNA 爲起始物（見 1. 2)。 反應在5 0微升體積中進行，且含有1 X P C R緩衝溶液 (16. 6毫莫耳/升（NH4) 2S〇4，6‘7毫莫耳/ 升 Tris/HCJ? PH8. 8，2毫莫耳/升 M g C J2 2 ，6· 7微莫耳/升EDTA，1 〇莫耳/升 点一锍基乙醇，1 7 0微克/毫升牛血清白蛋白Ulb(；(3 )，各2 0 0微莫耳/升的dNTP(PhaΓInacia)，各 30微莫耳的寡核苷酸（〇D及OID)，及1. 5單位 T a q 聚合酶（AmpHTaq, Perkin Elmer Cetus)。反應 混合物上覆以液態石蠘，並進行4 Q個PCR循環。 P c R反應之產物利用酚/氯仿萃取方法純化·，再以乙醇 沈澱濃縮。 1.5 —半的P C R反應產物以限制酶S p h !( Pharmacia)及 A 1 wN I (Bio labs)依廠商指示解離。 另一半在利用 Αν a I (BRL) ，AIwNl (Bio_ labs)及Tf i I (Biolabs)之系列反應中解離。限 制反應於1 0 0微升中進行，利用8單位酵素在3 7。(：下 歷2至1 2小時（除了 Tf i I是在65 °C上）。 1 . 6 限制解離作用之產物利用瓊脂糖凝膠電泳分 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙伕尺度通用中國國家標準（CNS)/\4規格（2丨0X297公A ) 13 4S9044 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、 發明説明 (11 ) 1 級 分 離 〇經 澳 化乙 鈴 染 色 後 未 解 離 之 擴 大產 物 自凝膠中 1 I 切 出 並 以酚 萃 取分 離 0 所 得 之 D Ν A 再 以 酚/ 氯 仿萃取純 1 I 化 二 次 0 ί | 1 .7 經分 離 的 D N A 於 乙 醇 沈 澱 後取 1 / 4或 請 1 1 1 / 5 利用 如 第一 次 擴 大 作 用 之 條 件 再 擴 大之 9 但循環次 讀 背 1 1 數 減 至 1 3 次 0再 擴 大 產 物 純 化 9 以 如 上 之酵 素 解離，且 之 注 1 I 意 i 未 解 離 之產 物 如上 文 對 擴 大 產 物 所 說 明 的 自瓊 脂 糖凝膠中 事 項 1 1 分 離 0 重覆 再 擴大 步 驟 0 再 填 寫 本 1 1 .8 在凝 膠 的 最 後 —1 次 分 離 後 擴大 產 物以4單 賁 1 i 位 的 Ε C 0 R I ( Ph a r m a c 1 a ) 在廠商建議之條件下解離 1 I 0 取 1 / 4 的 限制 反 應 混 合 物 連 接 至 載 體 ρ B 1 u e s c r i p t 1 1 I SK + (S t r a t ag e n e ) ， 後者已經E c 〇 R : [解離c >經連接 1 訂 1 之 後 各酵 素 組合 中 取 2 4 個 純 系 以 疋 序 進一 步 分析。在 1 i 1 經 A 1 w N I及 S P h I 解 離 之 混 合 物中 並 無新的分 I i 離 其 僅含 B Μ Ρ 6 及 抑 制 素 β A 分 離 0 1 9 個 相同的新 i i 序 列 命名 爲 Μ Ρ — 1 2. 1 可 見 於 以 A v a I » i A 1 W N I 及τ f I I 解 離 之 混 合 物 中 〇 些質體命 1 1 名 爲 Ρ S K — Μ Ρ 1 2 1 ( 0 D / 〇 I D )° 另 外發現與 1 | 此 分 離 有2 個 Jl-J - 4··#· 核甘 酸 差 異 的 二 個 序 列 如 S a m b Γ 0 ok e t a 1 1 * } Μ ο 1 e c u 1 a r C 1 0 n i ng A Lab 〇 r at 0 Γ y M a n u a 1 (1989) 1 1 | 所 述 進 行連 接 作用 及 在 大 腸 桿 -1 < 囷 1.+J 之 轉 形 Ο 1 依 據Fr 〇 h m a η η 所 詳 述 之 方 法 純 系 ί申 展至 C D N A的 ! ! 3 -1* 端 (由 Pe r k 1 η -E In e r C or Ρ · ，發表 A m ρ 1 i f 1 cations, 1 1 5, 1 1 - 15 ( 1 9 9 0 ) ) α 已 用 來 分 離 第 — 個 Μ Ρ — 1 2 1片 1 1 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（2!OZ 297公釐） 459 459 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 段的相同的肝m R N A，如上述利用〇 1丨g 〇 d T ( 1 6成員. )連接至承接子引子（AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC -Tu)進行反轉錄。擴大作用利用製備自MP — 1 2 1序 列之承接子引子（AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)及內部引 子（GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA )進行。擴大產物利用製 備自MP - 1 2 1分離之進一步內部引子（ACATAGCAGGC-ATGCCTGGTATTG )及承接子引子製備。經以S p h I限 制後，再擴大產物選殖至載體pT7/T3 -U1 9 (P- harmacia)，其已以相同方式解離並定序。純系的特徵在 於其與MP—121分離已知部份重叠之分離。取一個純 系，命名爲pl21Lt MP13，來分離 N c ο I (利用T 4聚合酶使平齊化）/ S p h I片 段。此片段選殖至上述pSK - MP12 1 (0D/ Ο I D )載體之一，其中其〇D引子分離經定向使面對 pSK多重選殖位置之T7引子。爲此載體以Sph I 及Sma I解離。構體命名爲pMP12 1DFus6 。其含有Μ P — 1 2 1序列，如S E Q ID No. 1 所示由9 2 2位置至1 3 6 0位置。

1. 9 以 pMP—12lDFus6 之 Dde I 片段，其在SEQ ID No. 1中由位置931延伸 至1 3 0 4 ，來篩選人類肝cDNA庫（Clontech, #HL3006b, lot 36223)，如 Ausubel et al·,所詳述（ Current Protocols in Molecular Biology,由 Greene

Publishing Associates and Wi 1ey- 1ntersc i eπce (1989 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） .H· % 1·— ^—^1 I - ----- - 1^ ij-. — ί·1 J :《 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（13 ) )出版）°自8. 1X105噬菌斑中挑出2 4個混合的 噬菌斑，並分離。由此1 〇個純系，利用來自Dd e I 片段的引子 L02 ( ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG )及 L Ο I 1 ( CTGCAGCTGTGTTGGCCTTGAGA )可選出陽性訊號 ，並分離之。cDNA利用Ec oR I限制作用自噬菌 斑中分離，並選殖至巳用Ec oR I解離之phuescri-pt SK載體中。 定序生成的質體SKI 2 1 L9. 1之一顯示，起始 密磚子始自SEQ ID No.1之128位置，因爲 三個停止密碼子在此起始密碼子前端，於在架構方式定位 在6 2，7 7及9 2猇位置。成熟的MP— 1 2 1始自 SEQ ID Nol的836位置，可推測分離類似其 他類TGF—冷蛋白質，其係相當於SEQ ID No. 2中之237位肢基酸。停止密碼子始自SEQ ID No. 1 之 1184 位置。 質體SK12 1L9.1在1 994年1 1月29日 ，寄存於台漘食品工業發展硏究所中，編號爲CCRC 9 4 0 0 5 8 ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公复） <請先Μ讀背面之注意Ϋ項再ίι'Α本X) 訂 五、發明説明（14) SEQ ID NO.1 10 20 A7 B7 30 12.Ί 4567890

40 1234567QCQ 50 1234^67^90 經i#部中夹標準局®ί工消费合作社印装 G^iXAGCCA CA030-GAG ATTGCTCMG CTTICICCIC AGTGTCCrAQC CTCCTIUITG CCMCQCCCA CACTOCAQC^ CMCAACCAG GTK^CAGGGA lOCAATSCCA T^ATAOCA^C GIQQCTGGCA CAGGGGCAOC CTCAGTOVIC TGAGAGTICG GGftGGCTXA G^TTQQCIOG TCIQCATAGG GCCICCITIU AGGCACCACT TCTCIUTQCT CCPGACATCG GQGCAGCCCA CITCAGAQGA TICCIGAGCA GYIUT卿QC P03GCATAGT TCAGACCCAT CAECCrr^O： ocmcmrr aXCAATTIT TTTAGATCAC GTCAGOCCCr TQCAT^CCTT AAXGCTGAC TTCCTOCIGA Turovrccrr

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GGiamxA CTCTGC^CT MCTUTTCM CCOVQCaATC CCACAGIGQC 0QCACCTK3G G^O^JXAIC GXCIGIGIC GIUXACajGG CATCAGCnr ΑΊΤΐ'ΐαοτ GQCAGICIGV GAMGTGAG^ CCOCAGm ci?o:<xni3 QCiairAciT CIOOCCA^-G CAGATTCACC TCGACAAGAG TCATCCAXC CIACAj QCICA CATCCICTGT AGGGACAGCA CIUIOGGITX GGAAMGO3 TCATICTUTG ATDCCCCAC ocGvicrra: ^GICCATCCC GAGCAATCCC TAGCCCCAT CACICCMGA m^CAdxx: MT^^OOCT Grrcnucwx; TTUIOCTTCT TCTATCAOCT TnCTTATCC GBXCTATK： CITCCaOGGC AOQCIGAGCC^nnccic^T CACICCC?^ AACTOGAGAG TIQGACAAGC C?GA£3CIQCT G3QCACITCT GCTGAGACAG CIOCTCIGATTCncmGr

GKXTIUIOC CCT3CI13GAG AAGCICAAGC G^mXAGG aX'i'ITIGTG GA.CGAGGCAT TITmUIGG TGAGGQCTAC CAQQCATGCC CTCAAGGCCA ACCCACQGCC ACATIGTCAA AGITAGICIA CCCCTACACA TCC^ATCT CTTK^CTTC TC^XACIX： cnxmrA ΑΊΌτασπα: AACCCflCTAT TGAGITCACA CTICrmjGA. TACCX7VCOX TCAACT^CTA CIOXTTICr G^arraxcr CIGITCCCIClurrjrcccTA

CICTGQC^CC CIUAGICUTT TQCTICTQGC GCTGQCQG?TC CCAOOGOGAG TOCACCICAC TIGAQGACD3 i^JGGACAAC QCCTCICOiC /OACIGCIG GCAGCTCCCT TO3GTCCACA GIGQATGCEA TQCCTGCA.GC mUCCK^G QCAGCOCQQG CGACPGCCAA ACTICCGTCA

ACACAGCIG： CQGCGCCCCC GACIGACm TGICIGGI^TAGicacnc CGACICCCIC MG.^£CTTccicmccT CICCiCCGA-C CfiOGCAAAGA

O^CCCCTK： TTCAOIWG CCTCTTICIT AATTCICTT CIMOOCCTT GCCCIUIOGC TCIUIUM3 OCTACCTCG 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 S50 900 550 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 14Q0 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 I--------^------^------^ - 麵 一 (锖先閲讀背面之注意事項再蛾寫本f) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210X29*7公釐） -17 - A7 __ί---........_ Β7 五、發明説明（15丨+ ，渗丄 -i D- 2 it.

CmxrCCIT CCAIQQCCCC AGCIUIOCCT ACATTCIGAT ΤΓΙΤΓτΤΤΤΓ ΊΤΙΊΊΤΠΊΤ TCAAA^erm AAAATTTCIT ΜΤΠΊΤΕΥΓ TCCTGGI?CC POTJXACAA TTI?CaaXC ΜΊΆΤΛΟΟΌ ATCTAATCAA Ai^CAAiWGA MMGACMA GCTACMC^3 ATAAMM： TCACGAATCT ACATCTAATT GACACTACAT TGCATEAMC AATMCTQCA Cm'i'lGCAA ACTCTQGCIA TCW^GIOCT GAA2AAGAAG GGITICCIUr TEAAGCTOCA GT?iAL'iTI'I'C TGACIKIGGA TCMOGTIO： ΤΓ 0 0 0 0 0 0 2 0 5 0 5 0 5 7 0 0 1 12 2 2 2 2 2 2 2 2 2 SEQ ID NO.2 (請先閩讀背面之注意事項再导寫本頁) 裝.

10 20 30 40 50 1234567B90 1234S67^Q0 12^4S67RQ0 1234567890 1234S67890 MTSSLLLAFL UAPITVATP RAGC32CPAX GFTLELESQR ELLLDtAKRS ILCKLHLTQR PKMWSRA ALRTWOTH GVFQGALLED NREQE3CEIIS FAETGLSTIN QTRLDffiFSS DRIAGDREWQ QASLMFFVQL PasTTIWTLKV FWLVIjGFHlSrr NLTLATQYLL EVD^SGWHQL PIjGPEAQAAC SQGHL1LELV LH3QV7^SSV ILG3AAHRPF VMRVRV〇]K HQIHRPGIDC QQGSHMXFQ EFFVDFREIG WHEWIIQPBG YAMNTCIQQC： PLHIAaylFGI AASFHIAVLN LLiKANTAAGT TOQGSCCVFT ARRPLSLLYY DRBSNIVKTD IPCMWEACG CS -v·· C3Q0Q0O02 9^555055 1 L 2 2 3 3 3 經濟部中央標牟局貝工消费合作社印製 - 18 - 本紙張尺度逋用中國國家梯準（CNS ) A4*t格（210X297公釐） 五、發明説叻（16) A7 B7 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1558 base pairs (B) TYPE； nucleic acid {〇 STRANDEDNESS; single (D) TOPOLOGY： linear (ii) MOLECULE TYPE： DNA (genomic) (x)· PUBLICATION INFORMATION: (H) DOCUMENT NUMBER: US 08/289,222' (I) FILING DATE: 12-A[JG-1994 · (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SE〇 ID NO：3: 請先閲背 面 之 注 項 i 裝 經濟部中夹標準局貝工消费合作社印装 AAGGAGTCAT GCCAGTCGGA GGTCAGTCAC ATTCCTCCCA GGGTCCCTGG TGCCCAGGAC 60 AGAGTTGAAG 'CACTCCCGTT GAGACCCT^A ATATAGGCTT TGGGTCCTTT AAGGAGGCTA 120 TCCTCCAGCA ATGGCCTCCT CCTTGCTCCT GGCTCTTCTG TTCCTGACTC CAACCACAGT 130 AGTGAACCCC AAAACTGAGG GTCCATGCCC AGCAtGTTGG GGTGCCATCT TTGACCTGGA 240 GAGCCAGCGG GAGCTGCTTC TCGATTTGGC CAAGAAAAGT ATCCTGGACA AGCTGCACCT 300 CAGCGAGCGC CCCATACTCA GTCGGCCAGT GTCCAGAGGG GCTCTCAA.GA CCGCGCTGCA 3S0 GCGCCTCCGG GGGCCTCGAC GGGAAACCCT GTTGGAGCAT GACCAGAGAC AAGAAGAATA 420 TGAGATCATC AGCTTTGCTG ACAC^GACCT CTCCAGCATC AACCAGACCC GGCTCGAGTT 480 CCACTTCTCT GGTAGAATGG CCAGTGGCAT GGAGGTCCGG CAGACCCGCT TCATGTTCTT 540 CGTGCAGTTC CCCCACAATG CCACCCAGAC CATGAATATA AGAGTTCTTG TGCTAAGACC 600 ATATGACACC AACCTCACCT TGACAAGTCA GTACGTGGTG CAGGTGAATG CCAGTGGCTG eso GTACCAGCTT CTCCTGGGAC CTGAAGCTCA AGCTGCTTGC AGCCAGGGAC. ACCTTACTCT 720 GGAGCTGGTA CCAGAAAGCC AGGTGGCCCA CAGTTCCTTG ATCCTGGGCT GGTTTTCCCA 780 CAGGCCTTTT GTGGCAGCCC AGGTAAGGGt TGAGGGCAAG CATCGGGTTC GCCGGCGAGG 840 訂 本紙張尺度適用中國®家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 19 A7 B7 459044 五、發明説明（17) ATCGATTGC CAGGGGGGGT CCAGGATGTG CTGTCGACAA GAGTTTTTTG TAGACTTCCG 900 f

TGAGATTGGC TGGAATGACT GGATCATCGA GCCTGAAGGC TATGCCATGA ACTTCTGCAC 9SO TGGGCAGTGC CCACTACATG TGGCAGGCAT GCCTGGCATC TCTGCCTCCT TTCACACTGC 1020 AGTGCTGAAT CTGCTCAAAG CCAACGCAGC TGCTGGCACC ACTGGCAGGG GCTCGTGCTG 1080 CGTGCCTACA TCTCGGCGCC CTCTGTCTTT GCTCTACTAT GACAGGGACA GCAACATTGT 1140 CAAGACGGAT ATACCTGACA TGGTGGTCGA GGCCTGCGGG TGTAGTTAGC TTATGGGTGA 1200 TACAGGCTGC CTGAGGTAGA ATGGCCTTCC TCAGGAAGGG AAACTCTGTT CCCACTTCTG 12S0 TCCAGAATGG AAAGACCTTT CTAAGCATGC AGACATCCCT CTGTGGACTT CAGGGGATCC 1320 ACCTCTAAAG AGAGTCACTA GTGACCAACA GCCTTTCTCT CTCCTGGGAC ATGGTTGACC 1380 CAGTACACCC 'ATCCTCAGCC TTAAGTTAGA GGCTAATCGA CTCCTACATA TATATGTCAT 1440 TTTGTCCTAG CAAACACCCC TTAGCTCCCCS TTAGTCAACT ATGTAATCTA CTCTGCCTCC 1500 CTGACCCTGC CAGCGGAAGG TTCCTATTCC ACGATGATAT GCCTTAGTGT CTCCCCTT 1558 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO：4： / . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ..: .(A) LENGTH： 3S2 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS： single (D) TOPOLOGY： linear (ii) MOLECULE TYPE： peptide (x) PUBLICATION INFORMATION: (H) DOCUMENT NUMBER: US 08/289,222 (II FILING DATE: 12-AUG-1994 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION： SEQ ID NO：4：

Met Ala Ser Sar Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Pro Thr Thr IS 10 15 本紙浪又度適用中國围家標率（CNS ) A4規格（210XM7公釐） (請先閣讀背面之注意事項再續寫本頁) .裝. ,ιτ 經清部中央標率局員工消费合作社印裝

經濟部中央橾準局員工消费合作社印製

Val Val Asn Pro Lys Thr Glu Gly Pro Cys Pro Ala Cya Trp Gly Ala 20 25 30 I lie Phe Asp Leu Glu Ser Gin Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys 35 40 45 Lya Ser lie Leu Asp Lys Leu His Leu Ser Gin Arg Pro lie Leu Ser 50 55 60 Arg Pro Val Ser Arg Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Gin Arg Leu Arg 65 70 75 80 Gly· Pro Arg Arg Glu Thr Leu Leu Glu His Asp Gin Arg Gin Glu Glu 85 90 95 Tyr Glu lie lie Ser Phe Ala Asp Thr Asp Leu Ser Ser lie Asn Gin 100 105 1X0 Thr Arg Leu Glu Phe His Phe Ser Gly Arg Met Ala Ser Gly Met Glu 115 v 120 125 V Val Arg Gin Thr Arg Phe Met Phe Phe Val Gin Phe Pro His Asn Ala 130 135 140 Thr Gin Thr Met Asn lie Arg Val Lea Val Leu Arg Pro Tyr Asp Thr 145 ： ： 150 155 160; Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gin Tyr Val Val Gin Val Asn Ala Ser Gly 165 170 17S Trp Tyr Gin Leu Leu Leu Gly Pro Glu Ala Gin Ala Ala Cys Ser Gin 180 18S 190 Gly His Leu Thr Leu Glu Leu VaL Pro Glu Ser Gin Val Ala His Ser 195 200 205 Ser Leu lie Leu Gly Trp Phe Ser His Arg Pro Phe Val Ala Ala Gin 210 215 220 Val Arg Val Glu Gly Lys His Arg Val Arg Arg Arg Gly lie Asp Cys 225 230 235 240 Gin Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gin Glu Phe Phe Val Aap Phe 245 250 2SS {請先閱讀背面之注意事項再續寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS)八4说格（2IOX297公釐） -21 -

經济部中央標準局员工消费合作社印«. 五、發明説明（19) Arg Glu lie Gly Trp Asn Asp Trp lie lie Gin Pro Glu Gly Tyr Ala: 260 265 270 i Met Asn Phe Cys Thr Gly Gin Cys Pro Leu His Val Ala Gly Met Pro； 275 280 285 Gly lie Ser Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn Leu Leu Lys Ala. 290 295 300 Asn Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Arg Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr 305 310 315 320 Ser Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn lie 325 330 335 Val Lys Thr Asp lie Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser 340 34S 350 SEQ ID 1^0.3表示編碼鼠1'(5尸—彡蛋白 質MP 1 2 1之DNA的完整核苔酸序列·編碼區域起始 位置1 3 1核苷酸之ATG起始密碼子，且終止於終止密 碼子（起始於位置1 1 87)。成熟蛋白質起始於位置 839之核苷酸。約5·5kb大之不表現子係位在介於 位置446至447間之染色體DNAi。 SEQ ID NO. 4 表示由 SEQ ID NO . 3所示之核替酸序列所編碼之鼠TGF — β蛋白質 MP 1 2 1的蛋白質先質之完整胺基酸序列。該成熟蛋白 質起始於胺基酸217-240區域•其與SEQ ID NO . 2之人類MP 1 21類似。最佳的是當成熟蛋 白質起始於胺基酸2 3 7時，該成热蛋白質部份係由 1 1 6個胺基酸所組成，如同人類之MP 1 2 1。TGF —石族之成員通常係於RXXR切割部位之後被切割，以 ； 裝 訂 線 ί f (請先閲讀背面之注意事項再禎裒本頁) 本紙張又度適用中國國家橾準{ CNS ) A4規格（210X297公釐} -22 - Φ ；Ί ^ , Α7 __;浦 >t」_^_ ϋ. 一乙 ίί------------------; -- 五、發明説明（20) 自蛋白質先質分離出成熟蛋白質部份（參閱^zkaynak et a 1. , J . B i ο 1. C h e πι. 2 6 7，2 5 2 2 0 - 2 5 2 2 7 ( 1 9 9 2 )及本文 白 蛋 熟 成 信 相 可 。 亦 6 ， 3 1 2 2 酸 1 基 P 胺 Μ 於 鼠位 於時 對有 。 少 } 至 獻係 文點 之始 證起 引之 所質 (請先閣讀背面之注意事項再頊寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 本紙浪尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 修正 附件二(A):第83111408號專利申請案 459 044 中文說明書修正頁 民國87年1月呈 五、發明説明（a)- 年月曰、、> 87. 1.㈣補充 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH： 1558 base pairs (B) TYPE： nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY： linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (X). PUBLICATION INFORMATION： (H) DOCUMENT NUMBER: US 08/289,222· (I) FILING DATE： 12-AUG-1994 ' (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :3: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 AAGGAGTCAT GCCAGTCGGA GGTCAGTCAC ATTCCTCCCA GGGTCCCTGG TGCCCAGGAC SO AGAGTTGAAG CACTCCCGTT GAGACCCT^A ATATAGGCTT TGGGTCCTTT AAGGAGGCTA 12Q TCCTCCAGCA ATGGCCTCCT CCTTGCTCCT GGCTCTTCTG TTCCTGACTC CAACCACAGT 180 AGTGAACCCC AAAACTGAGG GTCCATGCCC AGCATGTTGG GGTGCCATCT TTGACCTGGA. 240 GAGCCAGCGG GAGCTGCTTC TCGATTTGGC CAAGAAAAGT ATCCTGGACA AGCTGCACCT 30Q CAGCGAGCGC CCCATACTCA GTCGGCCAGT GTCCAGAGGG GCTCTCAAGA CCGCGCTGCA 360 GCGCCTCCGC GGGCCTCGAC GGGAAACCCT GTTGGAGCAT GACCAGAGAC AAGAAGAATA 420 TGAGATCATC AGCTTTGCTG ACACAGACCT CTCCAGCATC AACCAGACCC GGCTCGAGTT 480 CCACTTCTCT GGTAGAATGG CCAGTGGCAT GGAGGTCCGG CAGACCCGCT TCATGTTCTT 540 CGTGCAGTTC CCCCACAATG CCACQCAGAC CATGAATATA AGAGTTCTTG TGCTAAGACC δαο ATATGACACC AACCTCACCT TGACAAGTCA GTACGTGGTG CAGGTGAATG CCAGTGGCTG 560 GTACCAGCTT CTCCTGGGAC CTGAAGCTCA AGCTGCTTGC AGCCAGGGAC ACCTTACTCT 720 GGAGCTGGTA CCAGAAAGCC AGGTGGCCOV CAGTTCCTTG ATCCTGGGCT GGTTTTCCCA 730 CAGGCCTTTT GTGGCAGCCC AGGTAAGGCt TGAGGGCAAG CATCGGGTTC GCCGGCGAGG 840 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦） 5 15 20 u 附件三（A):第831 1140 8號專利申請案 中文補充實驗數據 民國8 6年9月圼 為研究Μ P 1 2 1對肝衍生之細胞的影響，自鼠（Wistar )肝臓分離肝细胞，且依據Yasuda et al. (J. Clin. Invest. Vol. 92，1491-1496, 1993)所描述之方法加以 培養。清洗細胞後，將細胞接種至含有O.lnM胰島素* 0.1%BSA及InM EGF之不含血清的新蛘培養基中。Μ慣常之 方式*將由苯基一 sepharose及逆相HPLC所部份純化之冷 凍乾燥的MP 1 2 1溶於乙腈中，且進一步以不同之濃度 加入至培養基中。取以類似之方式加Μ純化之對照組上清 液的相對應量（w t )充作對照組。培養該肝綑胞達7 2 小時，且以Mead & Fausto (Proc. Nat 1 . Acad. Sci . USA 86，1558-1562, 1989)所描述之方法，於其培養期間的 最後2 4小時加入0.5 W Ci (3H)胸腺核苷。隨後，Μ McNiel et al.(J. Cell Biol. 101, 372-379, 1985)所 描述之方法，測董〔3H〕胸腺核管併入至三氯醋酸可沈澱 之物質。 為研究MP 1 2 1對紅血球分化之影響，測量其對 Friend紅白血球細胞（F 5 — 5)之影響。因此，主要依 據Eto et a 1. (B i ochem. Biophys. Res. Com. 142， 1095-1103, 1987)所描述之方法’於微滴定盤中培養 Friend紅白血球細胞。將上述由苯基一 sepharose及逆相 T 4 (210 x 297公置） Η Ρ L C所部份純化之冷凍乾燥的ΜΡ 1 2 1溶液，Μ不 同之濃度加入至該Friend細胞中，且進行培養5天。經Μ 鄰聯（二）茴香胺染色後，測定分化细胞之百分比。 由窗.VI Ρ Ί ?? 1某闲^無效突雄(knock outfiM 所苺苜未 夕Μ P 1 P 1對目平_疾病夕竟義 利用此技藝已習知之方法，選殖且定性鼠MP 1 2 1基 因。將約1百萬個源自12 9/SV —鼠染色體FIX π嗤 菌體庫（Stratagene)之嗤菌斑轉移至薄膜上*且利用〔 α - 32P〕dCTP標記之探計進行雜交。藉由PCR自鼠染 色體DNA利用寡核苷酸引子製備該探針，其中該寡核苷 酸引子係相對應於人類ΜP 1 2 1 e DNA之核苷酸序 列（分別為本案S E Q ID Ν Ο · 1位置8 2 9至 8 4 7及位置1 145至1 164之核苷酸序列）。再將 雜交嗤菌體之插入物選殖至pBluescr ipt II SK ( + )中*且 藉由D N A定序證買其同一性。該基因為約1 4 k b且含 有2個表現子。該結果可導致產生突變鼠，以分析該相對 應之MP 1 2 1蛋白質之功能。依據標準方法利用基因標 的（gene targeting)於胚幹（E S)细胞中，進行MP121 基因之無效突變。經由培育鼠子代，獲致同型鼠。 該同型鼠係可存活，且殺死其部份鼠隻以分離其肝臟。 同樣地，自功能正常之MP 1 2 1基因的鼠，分離對照組 肝臓。每一次分析係收取3至4個肝臓。依據Weibu 11-T4 (210X 297公釐） 2

Stoldt所描述之方法，測定總脂肪量。經由甲酵KOH處 理及&〇1^1^£11_>〇^1〇|衍生後，利用氣相層析法測定脂肪酸 量。其結果如表1和2所示。很明顯地，於未表現MP121 蛋白質之突變鼠中，其總脂肪含虽顯著地提高。且，於對 5 照組鼠中未偵測出之脂肪酸，亦出現在該突變鼠中。該額 外之脂肪酸係為長碳鏈之脂肪酸*例如山簽酸和二十碳烯 酸。此結果清楚地說明Μ P 1 2 1對肝臟代謝之意義，且 該結果有力地說明ΜΡ121對治療諸如脂肪代謝或肝纖 維變性疾病之肝臓疾病的重要性。 對照組鼠的肝 無鼠的肝 分析1 分析2 平 分析1 分析2 平均值 總脂肪[%] 2,2 2,3 2,25 3,0 3,0 3,0 表1 .分析無效鼠（未表現Μ Ρ 1 2 1 )與對照組鼠 (正常薄見ΜΡ 1 2 1)之5干_窓脂肪百分比。 15 脂肪酸： ..酬組鼠b肝： 無效突變鼠的ff :: 分析1 分析2 平均值 .分析1 分析2 平鄉 月桂酸|[%1 nd nd nd nd nd nd 肉‘豆蔻酸[X]: ί nd nd nd 〇,2 〇,9 0,6 惊傾酸[X] 35 40,2 37,6 38,4 32,9 35,7 榇傾油酸W -. nd nd nd 1,8 3,4 2,6 硬脂酸rxi. 29,9 24,6 27^ 21,5 17,0 193 油酸[X]丨 15，】 12/7 i3,y 15,9 19,4 17,7 亞油酸[幻. 20 22,5 213 18,1 22,6 20,4 亞麻肢⑴ nd nd nd nd nd nd 花生酸[X] nd nd nd 0,7 0,6 0,7 «[X]： nd nd nd nd nd nd 山搞酸[X] nd nd nd 2,5 2,1 2,3 二十碳讎[X】 nd nd nd 0,7 1,1 〇,9 Τ 4 (210 X 297公釐） 3 5 表2 ·分析無效突變鼠（未表現Μ P 1 2 1 )與對照組鼠1 (正常表現Μ P 1 2 1 )之肝的脂肪酸分佈情彩。 (n d :未偵測出） 10 15 20 甲 4 (210X297公釐）

459044 年月曰部，4. 09補充 附件：第831114〇8號專利申請案 中文補充實驗數據 民國8 6年4月里 5 本發明蛋白質（特別是ΜP 1 2 1 )之生物性質，可依 據，例如，Wrana et a 1, , (Cell 71, 1003-1014 (1992) )，Ling et a 1. (Proc. Nat 1. Acad. of Science, 82， 7217-7221 (1985)) , Takuwa et al, (Am. J. Physiol. 257，E797-E803 (1989)), Farm and Patterson (Proc* 10 Nat 1. Acad * of Science, 91，43-47 (1994)) * Broxmeyer et al. (Proc· Nat 1. Acad. of Science, 85, 9052-9056 (1988)), Green et al. (Cell， 71， t 731-739 (1992)) ， Partridge et al· (Endocrinolo^y, 108, 213-219 (1981))sKKrieg 1stein et al. (ΕΜΒ0 J. 15 14, 736-742 (1995))所揭示之分析方法加M測定。 笨两酸諾龍 A (activin A)及TGF-/5 1, TGF-/3 2和TGF-/5 3係可於活體外促進多巴胺激導神經元之存活（ Kr ieg1ste in et a 1., EMBO J. 14, 736-742 (1995)及 Kr ies1ste!n et a 1., Neuroscience. 63, 1189-1196 ( 20 1994))。於部份純化Μ P 1 2 1之情況下*可顯示於8天 之培養下，多巴胺激導神經元存活被促進之程度係大於受 對照組上清液之影W。 於視覺:系統發展期，建立自視網膜神經節細胞至腦特定 區域之蚰突突起。數個研究顯示•自腦視覺區所分離之可 Ή (210X297公发） 1 溶性因子，可局部剌激視網膜神經節細胞（Nurcombe, V. & Bennett, M.R. , Exp. Brain Res. 44，249-258 (1981 )，Hyndman, A.G., Adler, R., Dev. Neurosci.5， 40— 53 (.1982), Turner , J.E. et a 1 . , Dev . Bra in Res . 6 , 77-83 ¢1983), Carri, H-G. & Ebendal, T., Dev. Brain Res. 6, 219-229 (1983)) 〇芊申經纖維束（最可酋旨 代表自視網膜神經節細胞延伸之視覺軸突）之形成，係取 決於神經營養性因子。利用MP 1 2 1，強烈剌激於雞胚 胎視網膜之人工培養物中向外生長之視網膜神經纖維，係 如表1所τρί。 MP 1 2 1之活性可用於治療眼之疾病，例如視網膜或 眼神經之疾病。其特別適用於治療視網膜神經及眼神經之 傷害。該傷害可由，例如，意外，發炎或血液供給障礙所 引起。其亦可用於視網膜移植之手術上。進一步，其對其 他脊椎神經之治療亦是重要的。實例係為亦提供眼睛部份 之三叉神經。因此，T G F — /5族成員（特別是Μ P 121 )可用於角膜之移植手術上。另外•亦可治療由，例如* 疱疹感染所引起之角膜局部傷害。進一步，針對眼睛表面 之退化疾病的治療，正在深究中。 初級培養之鼠肝纟田胞的结果顯示，部份純化之Μ Ρ 121 抑制DΝΑ合成之起始作用。ΜΡ 1 2 1之功效係與苯丙 酸諾龍八及 T CJ F — >3 相类貞iW (Yasuda et al ‘，J* Clin. Invest. Voi. 92，1491-1496 (1993)) * 但用於阻斷EGF 促進生長之作用所滞之Μ P 1 2 1濃度較高。雖然如此’ Ή (210X297公釐） 2 15 20 可假設ΜP 1 2 1係影響肝臓生長。因此，其可用於治療 數種肝臓疾病，包括肝癌。 進一步，已知苯丙酸諾龍A可促進Friend紅白血球细胞 (F 5 — 5)之分化，因此亦被指定為紅白血球分化因子 (EDF) (Eto et a 1., Biochera. Biophys. Res. Com. 142，1095-1103 (1987))。方$此一分析系統中，咅f5份純化 之Μ P 1 2 1亦闕示些微之活性。因此，MP121可用 於剌激紅白血球之生成。 窗麻例 Μ Ρ 1 2 1 份烛及檢驗咅已份純4hM Ρ 1 Ρ. 1夕活个年 藉由2個管柱，部份純化表現於疫苗病毒糸統中之MP121 蛋白質。 為產製Μ P121蛋白質，於37 °C下利用相同數目的 重組病毒感染融合性NIH — 3T3细胞（DSM A C C 5 9，瑞士老鼠胚胎）達3 Ο分鐘*隨後加入含 有1 ◦% F C S及青撇素/鏈撇素之適當培養基。 經4小時後，於3 7 °C下除去培養基，沖洗細朐兩次且 加入不含有F C S之生產培養基。經2 Ο至2 2小時之生 產後，收集細胞上清液，且離心以除去病毒（4 °C下， 4〇00〇xg達30分鐘）*進而過滅（〇* 1 wm孔 徑，Millex VV，Millipore tf5LVV 25LS) ° 經由野生型疫 苗病毒感染後，Μ類似之方式獲致對照組上清液<w t ) 利用西方墨潰分析法（Western bbt analysis)檢驗 T4 (210x297公釐） 3 M P ：L 2 1之表璃’且估計產量為50— 又 Ο 將含有ΜΡ121之細胞培養上清液與蛋白酶抑制劑 PMSF (1WM)混合’加入至最終濃度為1Μ( NH4)2S〇4* 2〇mM Tris pH 8· O 溶液 中，且置入事先Μ緩衝液A (1Μ (NH4)2S〇4,20iaM Tris pH8. *0)平衡之 ^^基一Sepharose (流速快 (高取代）Pharmacia #17-0973-05)管柱（5m 床） 中。進而，以1 5倍管柱體積之媛衝液A及1 ◦倍管柱體 積之緩衝液B (2〇mM T r i s PH8.0)沖洗 該管柱，且於5 〇分鐘内（5m 分注液）利用線性梯 度至1 Ο 〇 %之緩衝液C (20mM Tris pH 8 · Ο，8 Ο%乙二醇）以1 m β/分鐘之流速加以流洗 。可藉由西方墨濱分析法，檢驗介於5 ◦至8 05¾乙二醇 間所流洗出之MP 1 2 1。依照製造商之指示（Silver Stain-II, Dai ίchi ttSE 140000)，利用 1 5 %聚丙嫌醯 胺銀墨漬凝膠檢驗部份之分注液，且收集含有MP 1 2 1 蛋白質之分注液。經純化對照組上清液且經銀墨潰凝膠之 分析後，收集相比較之分注液。 利用逆相Η P L C進一步純化所收集之分注液。對此， Μ緩衝液Α (Ο . 1%三乙酸/水）平衡C8管拄（ Aquapore RP 300, App 1 ied B iosystems,顆粒大小：T w m ’孑L·徑大小：3 Ο 〇 A )。將自絮基一Sepha「ose管 柱所收集到含有ΜP 1 2 ]之分注液注入該C 8管柱中後 f 4 (210x297公釐） 4 ，大量地Μ緩衝液A加以沖洗。Μ線性梯度1 · 5%緩衝 液Β ( 9〇％乙睛，Ο · 1 %三氟乙酸）於◦ - 2 m又/ 分鐘之流速下，流洗所鍵結之蛋白質。收集6 ◦◦ w 分 注液，且K西方墨濱分析法及銀墨湏凝膠加以分析。於經 選定之條件下，在約5 5%乙腈後，流洗出MP 1 2 1蛋 白質。收集含有ΜP 1 2 1之分注液。對自純化對照組上 清液所獲致之相對應分注液，進行相同之步驟。銀墨潰凝 膠之分析結果顯示ΜΡ121蛋白質仍然被其他蛋白質所 污染。為獲致純ΜΡ 1 2 1，進一步之純化步驟係必要的 熟悉此一技藝之人士所習知之其他方法，諸如凝膨篩 管柱*離子交換管柱，親和性管柱或金屬蟹合管柱*亦可 用於進一步之純化。 由西方墨潰分析法估計，自1 β细胞培養上清液可獲致 約8 w g之部份純化ΜΡ 1 2 1 °該部份純化之蛋白質係 經冷凍乾燥後貯存於一 8 ◦C ° 為研究ΜΡ 1 2 1對多巴胺激導神經元之影響’依據 Shimoda et al.所描述之方法（Brain Res. 586, 319- 331 (1992))，自1 4天大鼠胚胎（E 1 4)之中腦層分 20離神經元。單離細胞且依照Krieglstein et al.所描述之 方法（Neuroscience 63，U89-1196 (1994))加以培養。 於聚鳥胺酸/毘布胺酸塗覆之玻璃上的细胞密度係為 200,000,細胞/ c m2。經2 4小時培養後及随後之每三天 培養期間，除去3分之2之培基（5〇◦ ^ β )且以含 Τ4 (210X297公釐） 5 459044 10 15 20 有各別添加物之新鮮培養基加Μ取代。將經苯基 —Sepharose及逆相Η P L C部份純化之冷凍乾燥的ΜΡ121 溶解於5 Ο%乙睛中，且加入至培養基中。ΜΡ 1 2 1於 培養基中之最終濃度係為2 0 n g/rni?(乙睛之最終濃 度係為Ο · 3%)。將相對等量之對照組上清液（w t ) (經相同之方式加Μ純化）溶解於5 Ο %乙腈中，且加入 至培養基中。該對照組培養基亦含有Ο· 3%乙腈。經8 天後，亦室溫下固定培養物於4%多聚甲酸中達1 Ο分鐘 ;丙酮可浸透入該細胞（1 ◦分鐘，—2 Ο °C)，且以 PBS (磷酸鹽緩衝鹽水）沖洗該细胞。經Μ溶於PBS 之1 %Η2〇 2處理後，Μ馬血清加Μ沖洗且阻斷，進行免 疫細胞化學染色。於多巴胺及其他兒茶酚胺之生物合成中 ，胳氨酸羥化酶（ΤΗ)係為限制性酶，因此對於此培養 中之多巴胺激導神經元（未分離含有去甲腎上腺素之细胞） ，Τ Η可充作指標物。偵測τ Η可藉由於3 7 °C下利用括 抗鼠T Η之鼠簞株抗體之1小時培育（該單株抗體係以1 :2 ΟΟ加以稀釋，Boehringer Mannheim)，及隨後之利 MVectastain ABCg旦套(Vecto Labs)之偵棋 1ί 〇 方它0.12cm2 之區域内，計算對T Η圼陽性之綑胞。可顯示MP 1 2 1 對多巴胺激導神經元之存活具有正面的效果C, 為研究於其他系統中MP 1 2 1對神經之影響，使用胚 胎視網賴之移出培養物。該有機塑態之培養糸係詳述於 Carri，N.G. & Ebenda1, T. (Dev . Brain Res. 6，219-229 (1983)), Carri, H.G. & Ebendal, T. (Anat. Rec. f4 (210x297公M) 6 214, 226-229 (1986)及Carri, H.G. et al. (J·

Neurosci . Res. 19, 428-439 (1988))之文獻中 ° 該分析 測量於勝原底層上自胚胎視網膜延伸之神經纖維之剌激作 用。簡言之，自雞視網膜（White Leghorn,第6天胚胎） 取出視網膜移出物，且藉由重覆沖洗自色素上皮細胞及間 葉細胞分離神經視網膜。將該有機型態移出物轉移至塗覆 膠原之培養皿中，且作隔夜培養（37 · 5°C， )。將自苯基一Sepharose及逆相H P L C所部份純化之 冷凍乾燥MP121溶解於水性緩衝液或5乙腈中， 且於培養基中加Μ稀釋Μ達到最終濃度為1,25,12.5,25, 50,100及2001^/1115，因此用於溶解之水性緩衝液或乙睛 並不會對结果造成差異。取用相對等量之對照組上清液（ w t )(已經相同之方式加Μ纯化）進行對照組分析。對 於基底纖維之生長，係使用僅添加牛血清之標準組織培養 基。持續培育且經4天後，於反向顯微鏡在黑面光照下， 測量引領束之最大長度。如示於表1，依賴Μ Ρ 1 2 1劑 垦所剌激之神經纖維的生長，於濃度約2 5 n g/m 5下 達到最大的活性，產生約1 · 7mm之纖維長度。 平均值士平均標準誤差 7.5 + 1 - 5 19.5 + 2.6 58.5+3.4 35.6 + 3.8 16.5+2.9 10.2+0.β MP121 (ng/ml) 1.25 12.5 25 SO 100 200 長度（單位）· 7/12/5/6 19/20/13/25 50/52/60/71/65/53 37/32/48/41/36/20 21/8/19/18 11/Θ/12/10 f l (210x297公釐） 7 10 15 20 表1:利用不同濃度之MP121處理之4天培養的視網 膜神經長度。於對照組組繃培養基中，基底纖維生 長之神經長度係為5.5/8/10/11/4.8/7單位*平均 值為7.7單位（平均搮準誤差為1單位）。對照組 (w t )之神經長度（使用如MP 1 2 1之相等濃 度）係如基底纖維之相同範圍。每一個單位代表培 養皿之◦'03mm真實刻度。 肀4 (210x297公釐） 8

Claims (1)

1. 六、申請專利範圍 附件一（A ) _· 第83111408號專利申請案 中文申請專利範圍修正本民國90年6月修正1.一種源自人類編碼類TGF一Θ蛋白質之DNA 分子，其係具有 (a)如示於SEQ ID ΝΟ·1編碼類TGF一占蛋白質前驅物起始於核苷酸1 2 8之核替酸序列’或 編碼類T G F - Θ成熟蛋白質起始於核苷酸8 3 6之部份 ’ SEQ ID ftO . 1 ： ' ‘ ' 10 ' 20 . 30 40 50 1214567.990 l2.14Sn7P90 L234^7fl90 ΐ2145Γ,7·99〇 1234567^90_ ___________{^--------訂---1-----Λ ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C^PlTAGCCA Oa^C^G^JG KHQZVCAPC cmorac .iGiarcc^iX' CTGCTTCrTC CMXCCCA CACHXA。:、 ACO^VCiGG CATC^CC^G σπ^ΟΰΧΛ TtOAT^.CCA TPKTPCCPKl CTCGCTCGCA O.GQOXACC CIC^GTCMC TC^.G^GTTDG CCPOHICOK G^.TTOGCTX TCTCCWGG CCCTUCTTir ^XCACCACr TGiuicrrrt' CCK^CTVPX cca^cccGK .CTTC^GAOGA TOCCAGCTOG TTC^OCM： 冲 GGXCTTC ctojckc^a ATUTGCOXG ATCTGGXAA ^CPCV^PCC CCTCOCOX AATCTGPMT ^.cicaicrrc Q7TCCA(XAG cnm^ccrT CICACOTOG TOACTCCCC TCACTCTZIA CTGCCTCCAC CQ71^C.^C OGATGTXTC ◦CG^CTOGA COCTTOXCA ^CACrcOGT GOAcmxcr CDYHATCAC T»CT^G^CCC AOTrrXATC： ax^ATi^cc .fOCOCir 户mUTTG^G CCCAQCaATC CGOCIOX ccoxnroG &CN^CCNFC OXCK7IGIC GTOpOCG CATCAGCTIT ATTTTCACTT OCC^CrCTCA CPPKTSX^aK CX?DX-CCTG QCTQGTiCTT CTaXCATP-G Ci'G^TTO'CC TCQO形G TCATCoax emCAT?G CCK^ATUIT CATCCTGTCT /'.GCCyO.GCA CICTOGGIOC OG^MOCG raTTCTCTC /CCTCCTCAT c/om^GA A^CIO^GAG TKJCPCN^OC CAG^GCTGCT QGXACncr GCTGAGACAG CTDCICTCAT Tuncmcr GTOCTI1GTCC CCTCCTOG^r； 7^£CTCAA0C GAADOCCAGG QOcriTTUic GACGAOQOT ττττΓπτπχ TGAGGQCT^C CAGOCATGOC CTCPPCCCCA PCCCACQ33Z ^CATTUVCPA W3TTAGrcrA CCCCITOGA TCCX^ATUT crcimzAix CTCAGICIGT TQCTTCTOGC GCrGQCQCTIt： CCACOGQGf'G TOZACCTCftC TIGAOG^CIC AGWIGOX： OZCKHX1CPC A.GAACTCCTG QCAGCICCCT TOOCTCOCA GTCCATCCCA TOCCTOOGC TPGCCOOG O^GCQCQQG CG'CraCCAA actdccctuga aXATGA^CT TCGTATTGCT ACAC^GCIGC CCOCCXCCCC G^CK^CATA TXTTCTCCTDVr ^CTCOCITC GGaCTCCCTC 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 SCO 550 1000 1050 1100' L150 1200 1250 1300 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 459044 Λ8 Π8 C8 1)8 六、申請專利範圍 TKXTCAQCA 'lUTPViaPA ATOCCCOC CITTCACTTC 沖G^OCIT 'L350c^TcrA^^a: ^/arc^ncr gccatcttcc tc^cc^ci^c cctctttcct 1400 ΑΟΖΤΛΤΑΟΓ COVKXCXT PGTCCATCCC CTO.0CC0CA CICCa03GAC U50 TOGACCCAT CTCOVOCAT GAOCMTOX ΛΊ^ΈΧΤΠΧ OOGCW^GA 1500 C^CCCIT^CC TCACCTIXfiA V^GKUCCJKT AACCCACD\T GCCTKOUT 1550 CCmCT^LT G&ATC^IOCC C^CTCC/'iCA ΤΟ^ΓΓΚ>£Λ CA/'CCCCITC 1600 COXAArriT TCTCGATCTC ΟΠΛΟΛΟΟΧ CTICrrnXA TICACC^AOG 1650 TTT?0\T〇\C AATT'G'.cScr Ί^ΟΓΓΚΤσ： ΟΓΚΤΠΧΤΓΓ 1700 GIGAOXCCr GTCCnurCA CTIUK：0〇DC TG^CIMA'Α^ίΧΙΟΠΤΙΤ 1750 TCCAT^CCIT CATCCa.TTTr TrUPCClTCT CTOXTTICr CmTXCCTT 1800 M0337TG·飞c TTOXTO、CC TCTTMOjCCT G^arroOCCT OOXTCIOX 1850 TiccroriGA cciorax^ TnciTATCC ciunrarrc TciuicEMX； · ig〇〇 ΤΤΠΖΑΊΌ7ΓΤ CIGTUC'/'Cr CIOXTATTC TUICTCCCIA CACTACCIOG 1950 α?οχαχΓ ocatoxox AancraxT acattcigat τπτπτπτ 2〇〇〇 ΊΤΠτίΤΤΤΤ TGWPCTCV ΛΛΑΛΓΚΧΤΓ MTITITEAT TCCTOOIXT 2050 ίΟ^ίΧΑΟνχ TTIX^GOGC AATATCACCTC ATGT^ATCAA 2100 ^PAPCAO'jW QCIAC^C^G A^/'MG^CC TC/OGAATCT iCATOTATT 2150 G^CIACAT TXATTAATC ΜΊΧΠΌΖΑ CmTIOCAA A.CIGI03ZTA 2200 TG/OGTCCr GAACAPG'/'G OGmCCIUr TD^GCIQCA GTAACnTIC 2250 TC^CIATOC^ TOatUTTCC ΊΤ · 2272 或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印*!私 (b )在遺傳密碼簡併性之範圍內相對應於（a )之 序列之核苷酸序列。 2 . —種源自人類由申請專利範圍第1項之DNA分 子所編碼之類T G F _石蛋白質’其胺基酸序列係示於 S E Q I D NO . 2或其起始於胺基酸237之成熟 部份； S E Q D N 0 2 10 20 30 40 50 1214Sfi7H90 1?νΐ%7Γ,9Π 1214Sfi7n^n 1214567Π9Π 12.34567Π90 HTSSLLLAFL UAPOVATP ΠΛΟΧΧΙΡΛΟ： GRLELE5QR ELTuLDLAKRS 50 rLn<LHLTQR PIUIRFVSRA ALRITVLjQflU-i GVFQGALLED NRH}CniIIS 100 FAE^ULSTUM QmLDF>tFG3 DRTAGDREVO QA5LMFFVQL P3>rnWIIJW 150 〇·〇Λ.. 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X297公芨） 2 459 C 4 4 儲 C8 D8 六、申請專利範圍 RVLVLGHlNf 卜ΙΙ/ΓΙΛΤΟΥΓ丄 EVD\SGWHQ「j PLjGPEAQAAC S^Gi-iLTLELV LEGQVAQSSV ILGGAAHRPP VAAKVRVOTC 丨-OD'tnHGICC QGGSRMXRQ CFFVDmEIG WI-O'/IIQPCG YAMNrciOCC PLITIAOIPGI AASFin7\VLN LLKAMPMGT rIU3G3XVPr ARRPLSLLYY DUDSNIVIOD IPCMWEACG C5 200 250 * 300 350 352. c: 3 · —種源自鼠編碼類TGF —"蛋白質之DNA分 子，其係具有 (a)如示於SEQ ID 1^0.3編碼類丁0尸 -万蛋白質前驅物起始於核苷酸1 3 1之核苞酸序列*或 編碼類TGF - /3成熟蛋白質起始於核替酸8 3 9之部份 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ；S E Q ID NO . 3 : AAGGAGTCAT gccagtcgga GGTCAGICAC ATTCCTCCCA GGGTCCCTGG TGCCCAGGAC 60 AGAGTTGAj\G CACTCCCGTT GAGACCCTGA « ATATAGGCTT TGGGTCCTTT： ；U\GGAGGC 丁 λ 120 TCCTCCAGCA ATGGCCTCCT CCTTGCTCCT GGCTCTTCTG TTCCTGACTC ςί>Λ€ακ€Α0Τ 180 Ίί AGTGAACCCC AAAAC 丁 GAGG GTCCATGCCC AGCATGTTGG GGTGCCATCT TTGACCTGG^ 2Λ.0 1 GAGCCAGCGG GAGCTGCTTC TCGATTTGGC CAAG/VAAAGT KTCCTGGACA AGCTGCACCT < 300； CAGCCAGCGC CCCATACTCA gtcCgccagt GTCC^GAGGG GCTCTCKAGA CCGCGCTGCA 360 GCGCCTCCGC GGGCCTCGAC GGGPJKhQCCT GTTGGAGCAT GACCAG/VGAC PJKGhAGAATh 420 TGAGATCATC AGCTTTGCTG ACACAGAC^T CTCCftGCATC AACCT^CCC GGCTCGAGTT 4β0 CCACTTCTCT GGTAG^TGG CCAGTGGCAT GGAGGTCCGG CAGACCCGCT TCATGTTCTT s^o CGTGCAGTTC CCCCACAATG CCACCCAGAC CATG/VATATA AGAGTTCTTG TGCTAAGACC GOO ATATGACACC AACCTCACCT TGACAAGTCA GTACGTGGTG CAGGTGAATG ccagtggctg 6G0 GTACCAGCTT CTCCTGGGAC CTGAAGCTCA AGCTGCTTGC AGCCAGGG/Vt ACCTTACTCT 720 GGAGCTGGTA CCAGAAAGCC AGGTGGCCCA CAGTTCCTTG ATCCTGGGCT GGTTTTCCCA 780 cAGGccmr GTGGCAGCCC AGGTAAGGGT TGAGGGCAAG CATCGGGTTC GCCGGCGAGG S40 tatcgattgc' "CAGGGGGGGT ccaggatgtg "CTGTCGACAA GAGTTTTTTG TAG/VCT 丁 CCG 900 TGAGATTGGC TGGAATGACT GGiVTCATCCA GCCTGAAGGC TATGCCATGA ACTTCTGCAC 1 9$0: TGGGCAGTGC CCACTACATG TGGCAGGCAT gcctggcatc TCTGCCTCCT TTCACACTGC 102C AGTGCTGAAT ctgctcaaag CC^ACCCAQC TGCTGGCACC ACTCGCAGGG GCTCGTGCTG xoao: (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) -·,衣，I 1 訂---------線、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 3 _ Q - 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 CGTGCCTACA TCTCGGCGCC CTCTGTCTTT GCTCTACTAT GACAGGGACA GCAACATTGT 1140| CAAGACGC^T /OT\CCTGi\CA TGGTCGTCGA GGCCTGCGGG TGTAGTTAGC TTATGGGTGA 120〇j TACAGGCTGC CTGAGGTAGA ATGGCCTTCC TCAGGAAGGG AAACTCTGTT CCCACTTCTG 12G〇l TCCAG/VATGG MACACCTTT CTAAGCATGC AGACATCCCT CTGTGGACTT CAGGGGATCC 1320 ACCTCTAAAG AGAGTCACTA GTGACCAACA GCCTTTCTCT CTCCTGCG^ ATGGTTGACC 1300 ·* CAGTACACCC ATCCTCAGCC ΤΤΛΛσΤΓΛβΛ GGCTAJVTCC八 CTCCTACATA TATATGTCAT- Λ〇: TTTGTCCTftG CAAACACCCC TTAGCTCCCC TTAGTCAACT A.TGTAATCTA CTCTGCCTCC 1.500 i CTGACCCTGC CACCGGAAGG TTCCTATTCC ACGATGATAT GCCTTAGTGT CTCCCCTT 15SBj 或 . (b )在遺傳密碼簡併性之範圍內相對應於（a 序列之核苷酸序列。 4 . 一種源自鼠由申請專利範圍第3項之DNA分子 所編碼之類T G F - /9蛋白質，其胺基酸序列係示於 SEQ ID NO . 4或其起始於胺基酸237之成熟 部份； <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ' — — — —— I— 11111111 j 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 S E Q ID N 0 . 4 Met Ala Ser Ser Leu Leu Leu Ala r r . 1 ς Ala Leu Leu Phe Leu Thr Pro Thr Thr 10 15 ； Val VaL Asn Pro LyS -Thr Glu Gly Pro Cys' Pro" Ala Cys Trp Gly Ala 25 30 He Phe Asp Leu Glu Ser Gin Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys 35 40 45 'LyS~SeT-TlV''L'eu^^p™Ly_s~Li^riTr3 Leu^siV Gin Arg""Pr0_~nTT；V^ 50 53 60 Arg Pro val Ser Arg Gly /Ua. Leu Lys Thr Ala Leu Gin Arg Leu Arcj 65 70 75 BO Gly Pro Arg Arg Glu Thr Leu Leu Glu His Asp Gin Arg Gin Glu Glu 05 · 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公S ) -4 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Λ8 1J8 C8 D8 六、申請專利範圍 Tyr Glu lie lie Ser Phe Ala Asp Thr Asp Leu Ser Ser lie Asn Gin 100 105 110 Thr Arg Leu Glu Phe His Phe Ser Gly Arg Met Ala Ser Gly Met Glu 115 S 120 125 Val Arg Gin Thr Arg Phe Met Phe Phe Val Gin Phe Pro His Asa Ala I：0 135 140 Thr Gin Thr Met Asn lie Arg Val Leu Val Leu Arg Pro Tyr Asp Thr 145 150 155 160 Asn Leu Thr Leu Thr Ser Glp Tyr Val Val Gin Val Asn Ala Ser Gly 165 170 175 Trp Tyr Gin Leu Leu Leu Gly Pro Glu Ala Gin Ala Ala Cys .Ser Gin 100 1Θ5 190 Gly His Leu Thr Leu Glu Lqu Val Pro Glu Ser Gin Val Ala His Ser 195 200 205 Ser Leu lie Leu Gly Trp Phe Ser Kia Arg Pro Phe Val Ala Ala Gin 210 215 220 Val Arg Val Glu Gly Lys Hig Arg Val Arg Arg Axg Gly lie Asp Cys 225 230 235 240 Gin Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Axg Gin Glu Phe Phe Val Aap Phe： 245 250 255 Arg Glu lie Gly Trp Asn Aep Trp lie lie Gin Pro Glu Gly Tyr Ala 260 265 270 Met Asn Phe Cys Thr Gly Gin Cys Pro Leu His Val Ala Gly. Met Pro 275 2Θ0 205 Gly lie Ser Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn Leu Leu Lys Ala 290 295 300 j . I I Asn Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Axg Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr i 305 310 315 320 j •. ! Ser Arg‘ Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn lie 325 330 335 Val Lys Thr Asp lie Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser 340 345 350 _________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公t ) --^----I------' -衣--------訂---I----- | _ <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 - Λ8 R8 ‘ C8 1)8 六、申請專利範圍 5’· 一種產製如申請專利範圍第2或4項之類TG F -冷蛋白質之方法，其係培養以衍生自質體P S K 12 1 L 9 · 1之表現載體所轉形之大腸桿菌宿主細胞 ，該質體PSK 121 L9.1含有如申請專利範圍 第1或3項之DNA分子，再自該宿主細胞及/或培養物 上清液中分離出該類TG F — 蛋白質a ----I i ---— — — I I I I I 訂- ιίι! I <靖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 6