TW457297B - Regulatory DNA sequences - Google Patents

Description

4 5 729 7

組，仏修I 夠本7— " 五、發明説明（玉）一~— 本發明是有關可用於表現植物細胞中DNA序列之調 節性D Ν Α序列•本發明進一步包括含有該調節性D N A 序列並操作性鏈結至欲於植物細胞中表現之DNA之嵌合 體DNA，以及於其細胞中含該嵌合DNA之植物•本發 明進一步是有關製備植物之方法，該植物係可抗阻或至少 可較不遭受植物寄生性線蟲之侵害或其作用，以及細胞， 植物及其部份之植物* 技藝陳述· 國際專利案WO92/17054 *掲示自擬南芥（ Arabidopsis thaliana)中鑑定及接下來分離其內線蟲易 感受的調節性DNA序列之方法· 於 W0 92/21757 中•已自番笳（1^〇〇1^1'- s icon esculent um)中分離許多調節性DNA序列，其可 感受根結線蟲Meloidogyne incognita β這些調節性序列 中有某些（1«£11]111’3尤〇1>117(：〇06犷81<：〇116<5(：111611士11111-1!61-oidogyne_.incognita)可被刺激•而其他的似乎爲線蟲所 抑制。並不知是否有可爲較大範圍線蟲所刺激之任何可誘 導的調節性序列· 另一可爲根結線蟲一 Meloidogyne incognita所誘導 的調節性序列揭示於W〇 93/06710 »此調節性 序列TobRb 7之缺點爲其不爲許多胞襄線蟲所活化，其中 如異皮屬（Heterodera)及球頭屬（Globodera ) ·此使 得TobRb 7序列不適用於嵌合構體，此對準如在馬鈴薯中 ^紙張尺度適用中國國家標率（CNS )八4規格（210X297公釐) .., ----------^^-- (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) -訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -4 -

經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 45 729 7 五、發明説明（2 ) 具抗性之胞襄線蟲· 本發明的一個目的是提出調節性D NA序列’其可爲 胞囊及根結線蟲所誘導，且在線蟲飼養結構之控制下*其 可用於表現異質D NA序列，較好是在實質上飼養位置專 一方式下但也未必非要如此* 發明要點 本發明提出一種可自Arabidopsis thaliana獲得的 DNA片段，其當再引入植物中時可促進相連D N A序列 之根結及胞襄線蟲所誘導之轉錄作用·依據本發明較好的 序列是由SEQ ID No: 4所代表的的1至 2 3 6 1核替酸*所檢視的也包括依據本發明DNA片段 之部份或變型*其當再引入植物中時可促進相連D NA序 列之根結及胞襄線蟲可誘導之轉錄作用•本發明進一步較 佳方面包括實質上是線蟲飼養位置專一的調節性D N A片 段* 本發明進一步具髖實例包括一種嵌合型DNA序列， 其依轉錄方向包括依據本發明的調節性D NA片段，及在 其轉錄控制下可被表現的D NA序列，其並非先天即在 D NA片段之轉錄控制下*依據本發明在嵌合體D NA序 列中較佳的爲其中欲表現的D N A序列可造成破壞植物細 胞之物質，如barnase之產生。於不同的具體實例中，破 .壞細胞之物質包括互補於細胞存活所必需R N A之R N A 。又在另一個具體實例中，欲表現的DNA序列可造成對 本忍張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） β 5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂·

45 729 7 五、發明説明（3 ) 誘生線蟲有毒之物質之產製· (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的發現進一步可用於複製子*包括依據本發明 之DMA片段或嵌合髖DNA序列，含有此複製子之微生 物，以及在其基因體內已納有依據本發明之嵌合體D N A 序列之植物細胞*進一步有用的具體實例是植物之根系統 ，基本上含有依據本發明之細胞》以及基本上含有本發明 細胞之完全生長的植物，較好是雙子葉植物*且更好是馬 鈴薯。也檢視在內的爲接枝在依據本發明根系統上之植物 ，以及選自種子、花、莖、根、葉、果實、花粉及木材之 植物部份，及含有此植物之作物· 本發明也包括使用依據本發明之D NA片段，以鑑知 可促進植物中相連接D N A序列轉錄作用之次片段•也包 括依據本發明嵌合體DNA序列於轉形植物上之用途。本 發明進一步提出依據本發明調節性DNA片段，部份或變 型在製備融合體調節性D NA序列上之用法· 以下圖片進一步說明本發明* 鋰濟部中央標準局貝工消费合作社印策 附圖說明 圖1.二元載體PMOG2 3之圖解質體輿圖。 圖2.二元載髖PMOG800之圖解質體輿圖· 圖3.二元載體PMOG553之圖解質體輿圖* 圖4,二元載體PMOG819之圖解質體輿圖》 圖5.二元載體PMOG849之圖解質體輿圖· 圖6 .許多經P MO G 8 4 9轉形的Arabidopsis 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 > 729 7 年月

:!彡-1丄.. ..'•Jr -,V' 丨 JV A7 B7 ----Irk五、發明説明（4 ) 1:1^118118株”卩8外之表現型式* 圖7.圖解NFS破壞基因及中和基因於一個二組份 系統以遺俥操作線蟲抗阻性植物· 圖8.二元載體pM0G893之圖解質體輿圖· 以下更詳加說明實行本發明的某些方式，以及各種術 語之意義《> . 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 發明詳細說明 本發明提出一種可得自Arabidopsis thal.ian_a之調節 性D N A序列•其可爲根結及裹胞線蟲所誘導*且在植物 根部特殊線蟲飼養結構內顯示出任何相連D NA髙度的表 現優先性•此種線蟲飼養結構經由以入侵線蟲爲食物來源 而使用•由是線蟲誘導植物組織變化而可形成巨細胞（根 結線蟲）或合胞體（襄胞線蟲）·調節性DNA序列之分 離方法已於先前申請案中揭示及申請專利（W0 9 2/ 17054，此案已列入本發明參考中* 原則上依據本發明的調節性DNA序列，可於任何被 選擇植物中用來表現任何異質DNA，係將該DNA置於 該調節性DNA控制之下，並以已知方法將所生成之嵌合 體DNA序列轉形植物•異質DNA於各種根結線蟲感染 根部時會被表現，如蟲瘻線蟲（Meloidogyne incognita )·及襄胞線蟲，如異皮線蟲（Heterodera schachtii )及球頭線蟲（Globodera pallida )(爲更多了解，但 不欲予以限制，表列於表2中）·有益地，異質DNA可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (諳先聞讀背面之注$項再填寫^4頁)

45 729 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) 包括可指導合成對植物寄生性線蟲有毒或是抑制性之物質 之基因*以產生對植物寄生性線蟲感受性較低之植物。此 種毒性物質之實例有許多，如蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis )之內毒素（如 E P 0 3 5 2 052)，外源凝集素等* 使植物對植物寄生性線蟲感受性減低的較佳方式包括 ，依據本發明經由在調節性D NA序列控制下表現具植物 毒性物質·而將特殊化之飼養結構瓦解*此方式之一般原 則已於國際專利案WO 92/21757，WO 93/ 10251及W094/10320中揭示及申請專利， 且也列爲本案之參考文獻•爲一致起見，植物毒性物質在 下文中稱爲線蟲飼養位置（N F S )破壞物質· 雖然依據本發明之調節性D N A序列實質上爲線蟲飼 養結構所特異的，但由於在非檩的（即非一NF S )組織 中表現，N F S瓦解物質在其控制之下對植物之存活及/ 或產率有不佳作用·再者頃發現》依據本發明的調節性 DNA序列，其轉形步驟在組織培養期間是具活性的•在 此期間是必要使用中和物質的*爲了減少或消除（潛在的 )副作用，因此強烈地較喜使用依據本發明的嵌合體 N F S _破壞構體，並配合中和基因構體·此對線蟲具抗 性植物之遺傳操作所謂的二組份方式詳情示於WO 9 3/ 1 0 2 5 1中·依據此方式，NF S —破壞化合物（編碼 序列一 A)置於至少在NF S中具活性之啓動子控制之下 *且較好不在或幾乎不在NF S之外，由是NF S外不佳 本紙張尺度適用_國國家標準（€灿）八4规格（210><297公走）' (請先聞讀背面之注項再填寫本頁) 装. 訂 -8 - 45 729 7 ,τ： 年月ft α 了 ； Α7 ea 8. 〇〇 ；Mi w} b7 五、發明説明（6 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的植物毒性作用可爲中和化合物（編碼序列一 B)所中和 ，後者至少可在產生破壞物質之N F.S外的組織中表現* 依據二組份方式，適合的啓動子_ A可定義爲可驅動 NF S內下游編碼序列表現之啓動子•其水平足以危害 NFS之代謝及/或功能及/或存活，雖然此啓動子較好 在NF S以外之組織中是不具活性的，但也未必必要：其 在此水平下於NF S外應至少絕不具活性，如此爲編碼序 列- A所編碼之破壊物質之活性，不致爲編碼序列- B之 產物所充份中和· 依據本發明的調節性DNA序列，特別是# 1 1 6 4 之4、2. 1及1. 5 k b p片段，其特性使彼等可髙度

V 度用於二組份方式*如此中實例所說明的•很明顯的，許 多突變如刪除，添加及核替酸序列之變化及/或這些之組 合•在依據本發明的調節性DNA序列中是可能的，其不 會以對其意欲用法具決定性之方式來改變這些序列之特性 。因此，此種突變並不偏離本發明· 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 再者*如精藝者熟知的，調節性植物基因區域•由具 有就基因表現而言令人感興趣特性之不同的亞®域所組成 •亞區域之實例如此中所意味的•有加強子，但也有轉錄 之沈默子（silencers )*這些要件以一般（原構性）方 式運作，或以組織一特異方式進行。如實例中所說明的， 在依據本發明的調節性DNA序列中可有許多的刪除，並 可針對相連D NA之表現型式測試次片段·如此獲得的各 種次片段，或甚至其組合，均可用於遺傳操作線蟲抗性之 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

45729 7W“I.I 五、發明説明（7 ) 方法中，或涉及植物中異質DNA表現之其他應用中•依 據本發明DNA序列之用法*其可鐙定功能性亞苗，且接 下來其可用於促進或遏止植物中之基因表現*此也包括於 本發明中。 在本發明內容中，所謂N F S破壤物質及中和物質包 括一系列選定的化合物，其爲DNA所編碼且其基因產物 (不論是蛋白質或RNA或反意識股一RNA)對於 N F S或其中之細胞器之代謝及/或功能及/或存活力是 有害的，且當中和物質與破壊物質於相同細胞中@時表現 時，是可遏止破壞物質之活性•破壞及中和物質之較佳組 合如來自解锻粉芽抱桿菌之barnase / barstar ( Hartley * 1 9 8 8 * J . Μ ο 1 Biol. 2 0 2, 9 1 3 -915)，限制酶/相當的甲基化酶•如來自大腸桿菌之 E c 〇 R I (Greenet al.,1981 * J 1 Bi ο 1 . C h e m，2 5 6，2143-2 153)及 E c o R I 甲基化酶或相似之組合*如Π型限制修飾系統之總覽中所 述（Wi1son, 1 9 9 1 ，Nuc1·Acid Res. 1 9 ， 2539 -2566)，細菌肽及相當的免疫蛋白質，如來自大腸 桿菌之大腸桿菌素E 3 /免疫蛋白質（Lau et al·， 1 9 8 5 * Nuc 1,Aud Res — 1 2 * 87 3 3 — 8745) 或任何的破壞物質編碼基因，其可因反意識股RNA在啓 動子一 B控制下同時產製所中和，如編碼白喉毒素鏈A之 D N A 序列（Czako&An，1 9 9 1 * Plant Physiol. 9 5 • 687-692 ) ，RNAses 如 RNAse T 1，拮抗可指 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） {請先聞讀背面之注$項再填寫本頁)

-10 - 4 5 72 9 7

05;端 i i i. J A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 五、發明説明（8 ) 導合成植物毒性蛋白質之核糖核酸酶或蛋白酶及核糖酶。 依據本發明另一方面•破壤及中和物質之組合包括對 內源基因具抑制性的個別基因，此內源基因可編碼細胞存 活必要之蛋白質或多肽產物，至於中和基因是一種基因， 其編碼的蛋白質或多肽產物可替代內源蛋白質或多肽產物 之功能。此種破壞基因可選自下列包括（a )可編碼拮抗 內源RNA轉錄子之核糖酶之基因，（b)此基因當轉錄 產生RA N轉錄子時係與細胞存活所必要之內源基因之 RNA轉錄子互補或至少部份互補•此方法已知爲基因表 現之反意識股抑制作用（揭示於EP — A 2 4 0 2 0 8 )或（c )此基因當轉錄產生RNA轉錄子時係與 細胞存活所必要之內溫基因之轉錄子相同或至少極相似· 此爲基因表現尙未知之抑制方式，稱爲共抑制作用（由 Napoli c. et al. , 1 9 9 0，揭示於 Plant Cell _2_， 279，289)· 依據本發明較佳具體實例*是使用反意識股基因以抑 制細胞存活所必要之內源基因之表現*此基因經由依據本 發明之調節性D N A序列向上游融合該反意識股基因而可 在線蟲飼養結構中表現。 由對重要內源基因具抑制性之反意識股基因所帶來之 破壤作用，可因中和性化合物一 B之表現所中和，其表現 係在如上文定義之啓動子一B控制之下，該化合物一B係 一種蛋白質或多肽產物，其和由內源重要基因所編碼之蛋 白質或多肽相同或相似，且可替代內’源性基因產物在宿主 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 京· -11 - 4

5 72 9 T A7 B7 五、發明説明（9 ) 植物中之功能*較好，由中和基因編碼的RNA轉錄子之 核苷序列與內源重要的基因RNA轉錄子分隔開來以避免 可能的共遏止作用*因此，較好中和基因可編碼與內源重 要基因基本上有相同功能之蛋白質或多肽，即使R N A轉 錄子中間物是分隔的•符合此描述的中和基因可由不同植 物種類所得的基因庫中篩選而適當地獲得，或甚至是不同 的非植物種類，如酵母*動物真核細胞或原核細胞*較好 ，破壞反意識股導入外來基因及中和意識股導入外來基因 所編碼之轉錄子核苷酸序列之相同性少於9 0%，較好少 於8 0 % *又較好該中和意識股導入外來基因編碼的蛋白 質或多肽基因產物和破壞的基因產物在胺基酸序列上並不 相同，且其中與中和導入外來基因所編碼之轉錄子之核苷 酸序列相同性少於75%· 反意識股破壞基因之標的基因係選自其所指導合成的 酵素係細胞存活力所必要的基因，也稱之爲必需酵素*且 應是由核所編碼的，較好是呈單套數基因*然而小尺寸之 基因族也適用於本發明目的*再者，該基因之反意識股表 現作用必須不可爲來自其他細胞或爲該酵素正常合成之酵 素產物之細胞器之擴散或轉位所消去•較好選擇可指導合 成膜一轉位酵素之基因•因其涉及發展出穿越細胞器膜之 化學梯度•蛋白質經由反意識股表現之抑制作用，就定義 而言無法因物質穿越道些蛋白質所在之膜之擴散所消除* 經轉位的化合物並不限於有機分子，但可爲無機本質的； 如P，H*OH或電子· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> • J·. (#先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) " 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -12 - 45 729 7 Λ7 ___»7 五、發明説明（10 ) 較好，.膜轉位酵素應存在於細胞器中，其於寄生過程 中數目會增加，由是可說明此細胞器在含有NF S之細胞 中所有的基本角色•此細胞器之特殊實例有：粒線體，內 質網及胞間連絲（Hussey et al，1 9 9 2，Protoplas-ma _1__6 7 ; 5 5 — 6 5，Magnusson&Go 1 i nowsk i 1 9 9 l Can_J.Botany6 9 ; 4 4 - 5 2 )。標的酵素經 由實例列於表1，但本發明並不限於此表中所提及之酵素 。更詳盡之表列可組合自系列如Biochemistry of Plants (Eds. Stuapf & Conn, 1988—1991 1 Vols. 1 — 1 6 Academic Press )或Encyclopedia -of Plant Phys-i o 1 gy ( New Series，1 9 7 6 ，Springer-Verlag,Berl-i n ) e _ 雖然僅是某些例子，指導合成這些酵素的基因已被分-離，但基因套數未知，因此必須符合的準則述於本發明中 (誚先閱讀背而之注意事項再坑"本頁) π裝--- 訂--- .ο 經濟.邓中央橾準局炅工消费合作社印製 45729 7 Λ. Λ / Η 7 五、發明説明（11 ) 表1 用於NFS中反意識股表現及NFS外意識股表現之標的 經濟部中央標準局另工消费合作社印裝 酵素實例 酵素 路徑/細胞器 ΑΤΡ合成酶 粒線體 腺嚼呤核替酸轉位酶 粒線體 磷酸轉位酶 粒線體 三羧酸轉位酶 粒線體 二羧酸轉位酶 粒線體 2-酮基-戊二酸轉位酶 粒線體 細胞色素C 粒線體· 丙酮酸激酶 糖解作用 甘油醛-3Ρ-去氫酶 糖解作用 NADPH -細胞色素Ρ450還原酶 脂質代謝 脂肪酸合成酶複合物 脂質代謝 甘油-3Ρ-乙醯轉移酶 脂質代謝 羥甲基—戊二醯基CoA還原酶 甲羥戊酸路徑 胺基醯基轉移酶 核酸代謝 轉錄作用因子 核酸代謝 延長因子 核酸代謝 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4it格（2!ΟΧ2<Π公贷）_ 14 _ 45 729 7 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 適合的啓動子- B定義爲實質上可在所有細胞中（其 中編碼序列一 A可表現）驅動表現之啓動子，限制條件爲 其並不驅動線蟲飼養結構內之表現，或是並不有效率地表 現。（％實質上所有的細胞# ，意指至少是應可存活的細 胞以得到正常的植物生長及/或發展以爲此植物商業開發 所需）·至於其中破壊作用在宿主植物所有細胞中並不完 全被中和，且其雖然如此存活並逋於商業開發之植物之說 明爲其在雄蕊細胞中可表現依據本發明之破壊基因者；此 可生成雄性-不育植物•在某些作物中此點就商零上令人 吸引之特質而言是一致的••適合的啓動子一B型實例可 得自植物或植物病毒，或可由化學合成•調節性序列也可 包含有加強子序列，如見於C aMV之3 5 S啓動子（ Kyg et al., 1 9 8 7 * Science 236* 1299— 1 3 Ο 2)及mRNA穗定序列如苜蓿花葉病毒RNA4 之領導子序列（Brederodeet al，.l 9 8 0 * Nucl.Acids Re s.l，2213 — 2223)或可以相似方式作用的 其他任何序列· 另外，爲了可在所有的或實際上所有的植物組織中提 供表現*啓動子一 B/編碼序列一 B可添加第二啓動子一 B */編碼序列- B，後者具有部份重S或完全互補於啓 動子一B/編碼序列- B之表現型式，限制條件爲啓動子 —B及啓動子一 B '均不驅動在NF S中之表現。同時融 合體啓動子，含有不同啓動子（部份）之組合以提供如此 中定義所需之表現型式，也屬於本發明範圍內* 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 -15 - 45729 7 Λ7 _. _Η 7 五、發明説明（13 ) 較好*啓動子-B是苜蓿花葉病毒3 5 S啓動子或其 衍生物，其通常被視爲是植物組織中強的原構性啓動子（ Odell et al.l 9 8 5 Nature 313 · 8 1 0 — 812)。啓動子一B另一較佳的實例爲強根啓動子 r ο 1 D ( Leach & Aoyagi 19 9 1 Plant Sc i. 7 9 ;6 9 — 7 6 )來自發根土壤桿菌（Agrobacteriura rhizogenes)之質體 pRiA4;〇RF15 之 5 一鄰接 域（S 1 i g h t o m e t a 1，1 9 8 6，J. B i ο 1. C h e m. 2 6， 108—121)。其他原構性啓動子之適用性，如藍曙 紅合成酶啓動子（Bevan，l 9 8 4，. Nucl.Acids Res. 12 ，8 7 1—872 1)或玄參花葉病毒啓動子（EP -A 4 2 6 6 4 1 )在充作啓動子_B上可經由與標幟 基因，如 GU S (Jefferson，！· 9 8 7，Plant Mol· Biol. Reporter ，387 — 40 5)融合而測試，將這 些構體轉移至植物，並於以P P N感染後對此導入外來基 因之植物進行組織化學分析。 經濟部中央標準局貝工消资合作社印製 (請先間讀背而之注意事項再坑涔本頁) 其他調節性序列，如終結子序列及聚腺苷化作用訊號 包括可在此植物中作用的任何一種此序列《其選擇屬一般 精藝者技術水平之內。此種序列之實例有根癌土壤桿菌藍 曙紅合成酶（η 〇 s )基因之3 /鄰接區域（Bevan, 1 9 8 4 Nucl.Acids Res. 1 2 ， 8711 - 8721) ο 二組份方式進一步詳述可見於WO 9 3/1 0 2 5 1 (已列爲此中之參考）。 民張尺£適用中國國家摞準（CNS )_Λ4規格（ -16 - 4 5 72 9 7 Λ7 Η 7 五、發明説明（14) 植物種類之選擇主要由經估計可在農業中發生之 Ρ Ρ Ν感染之損害量’及植物對轉形作用之順從性來決定 。在農業實務中爲Ρ Ρ Ν損害之植物種類，以及經由本發 明對Ρ Ρ Ν感受性顯著較少者包括表2所列之種類，但並 不限於此》 定義於本發明申請書中之線蟲種類，包括可變化宿主 細胞成爲特殊適用之飼養結構之所有植物一寄生性線蟲， 其範圍由移行外寄生物（如劍線蟲屬）至較進化的不遷徒 性內寄生物（如異皮線蟲'蟲瘻線或1?〇171611(：11111111,3 6) ^寄生性線蟲列表於表2，但本發明並不限制於此表中所 述之種類。更詳細表列由Zuckerman et al 7Κ出（eds., in:Plant Parasitic Nematodes, Vol. I 1 9 7 1 ·

New York, ppl 3 9 — 1 6 2 )。 (請先聞讀背而之注意事項·#填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作讧印鉍 本紙張尺疫適用中國國家標準（CNS ) Λ4圯格（2〗0X29^砬） -17 - 45729 Λ7 I,i7 五、發明説明（l5 ) 表2 植物寄生性線蟲及其主要依主植物實例 線蟲種 主要依主植物 蟲瘇線蟲爲（Meloidogvn._e_) M. hap 1 a 大 Λώ； 範 圍 M. incognita 大 範 圍 M. ex i gus 咖 啡 、 茶、番椒屬、西瓜屬 M. i nd i ca 柚 M. javanica 大 範 圍 M. afr i cana 咖 啡 M. gram i n i s 穀 類 青草 M. graminicola 稻 M. arenar i a 大 範 圍 訂 (請先閲讀背而之注意事項再坑对本页) 經iri部中央標隼局®:工消费合作社印製 本纸張尺度適用中國闼家標4M CNS ) 格（2i0x 297':.>iM —18 - 15 7^ ^ ；τ. ί · f i 年 K 3 ν- _ A7 88. 3, Oh '4^：\ K.n B7 五、發明説明（16) 基皮線蟲&球瓸線蟲 (Heterodera 冷 r：l〇bodera) Η. mex i cana 紅茄、茄篇 Η. punctata 穀類、青草 G. rostochi ensis 馬鈴薯、茄靥 G. pallida 馬鈴薯 G. tabacum 娌草、煙草雇 Η. cajani 柳豆、豇豆 Η. glycines 黃大豆、黃大 Η. oryzae 粳 Η. schacht i i 恭菜、蔞苔雇 Η. trifolii 車軸草 Η. avenae 穀類、青草 Η. carotae 胡蘼荀 Η. cruci feerae 十字花科 Η. goettingiana 豌豆、蠶S 紅茄 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在本’發明內容中*植物對植物寄生性線蟲（P P N ) 感受性減少係指當與對照植物比較下，在植物根部表面觀 察到所發展之成熟的雌蟲數目具統計上有意義地減少·依 據成熟雌蟲感受性/抗阻性做分類，在囊胞及根結線蟲上 均是標準實務（如LeMondia，1 9 9 1，Plant Disease 7 5 ’ 4 5 3 — 4 5 4 ; Onwega et a 1. , 1 9 9 0， Phytopathol 8 0 ’ 745—748) · 依據本發明之線蟲飼養結構應包括最初之飼養細胞· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ί請先聞讀背面之注ί項再填寫本頁)

-19 - 5 729 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 20 A7 B7 五、發明説明（17 ) 其應表示一旦經侵入線蟲薛導*註定成爲線蟲飼養結構之 細胞或極有限數目之細胞· 依據本發明之N F S破壤作用並不限於僅在N F SI 之副作用，此外，破壤作用也欲指經由直接交互作用在線 蟲發展上之副作用· 將含有本發明所述之D N A序列之重組體D N A引入 植物宿主中有許多技術可運用*此種技術包括利用麫/聚 乙二醇方法之原生質體轉形作用*電泳脈動及微量注射或 (經塗佈的'）粒子撞擊（Potrykus, 1 9 9 0 *Bio/ T e c h η ο 1. ，535 - 542)β 除了所謂的直接DNA轉形方法*涉及載體之轉形系 統也被廣泛應用，如病毒載體（如來自花椰菜花葉病毒（ CaMV)及細菌載體（如來自土壤桿菌）（Potrykus, 1 9 9 0 * Biol/Technol · «§_，535 - 5 4 2) ·經篩 選及/或選擇之後，已被轉形之原生質體·細胞或植物部 份可再生成完整植物•利用技藝中已知之方法（Horsch et al. , 1 9 8 5» Science 2 2 5, 1 2 2 9 - 1231)·轉形及/或再生技術之選擇在本發明中並不 嚴格要求· 依據本發明用法的較佳具體實例•係使用所謂的二元 載體系統（揭示於EP-A 1 2 0 516)其中使用 土壤桿菌菌株*其中含有具毒性之輔助質體及含有各欲轉 移基因構體之可相容質體*即二元載體•此載體可於大腸 桿菌及土壊桿菌中複製；此中所使用的係衍生自二元載體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 - (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 72 9 7 _ Γ'88. 秦正丨 % II A7 —I_:^¾ !Z________ i r^)

Bin 1 9 ( Bevan, 1 9 8 4 * Nuc 1. Ac i ds Res . 12— ’ 8 7 1 1 — 8 7 2 1 ) ·如此實例中所使用的二元載體在 其T 一 D N A之左及右一邊緣序列間含有指導合成康徽素 抗性之相同的NPTI I —基因（Bevan ，1 9 8 4， Nucl. Acids Res. 12 · 8 t 1 1 - 8 7 2 1 )及欲於所 需之基因構體中選殖之多重選殖位置· 近來的科學進展顯示•原則上單子葉可接受轉形作用 ，且能繁殖的導入外來基因植物可自經轉形的細胞中再生 。發展針對這些作物之可再生組織培養系統，加上將遺傳 物質引入植物細胞之有力方法*有助於轉形作用•目前* 轉形單子葉之較佳方法爲分離塊或懸浮細胞之微注射撞擊 ，及直接DNTA攝入·或電穿孔（Shimamoto,et al., 1 9 8 9* Nature 3 3 8· 2 7 4 - 2 7 6 ) ·已可得 到導入外來基因之玉米植株，係將吸水鏈霉菌bar基因* 其編碼phosphinothricin酸基轉移酶（一種可使除草劑 phosphi-nothricin失去活性之酵素）*利用微粒撞擊引 入玉米懸浮培養之胚胎發生細胞內（Gordon-Kamra, 1 9 9 0，PlantCell，2，603-618) « 也有報 告是將遺傳物質引入其他單子葉作物*如小麥及大麥*之 糊粉原生質體內（Lee, 1 9 8 9，Plain Mol. Biol. 1 3 ，2 1 — 3 0 ) ·已可自胚胎發生懸液培養中再生小麥植 株》係僅選擇老齡密集的及節狀胚胎發生之癒傷組織以發 展出胚胎發生之懸液培養（¥8 8 11,1 9 9 0*8〖〇/16<;1)11-〇1._8_，4 2 9 - 4 3 4 )。近來也己揭示轉形稻子之土 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面乏注意事項再填寫本頁)

-21 - 45 45 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（19 ) 壤桿菌用法（W 09 5/1 6 03 1 ) *針對道些作物混 合轉形系統使得本發明可應用至軍子葉植物*這些方法也 可應用至雙子葉植物之轉形及再生* 以下實例之示出僅供說明目的*不欲限制本發明的範 圍。 實驗部份 D N A步驟 所有的DN A步驟均依Man i at is之標準方法進行（ Molecular Cloning,A laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 9 9 0 )

Arabidopsis之轉形作用 如下利用Arabidopsis thaliana(生態型C 2 4 )根 段與土壤桿菌株MOG101共培養進行轉形作用•後者 含有如Valvekens et al,之適合的二元載體（1 9 8 8， Proc.Nat.Acad,Sci.USA 85 ， 5536—5540): Arabidopsis種子在發芽前先於4°C下春化處理7天 •種子於7 0%E t OH中表面殺菌2分鐘*轉移至 5%NaOCl/0· 5%NaDodS04中15分鐘 ，以無菌的蒸餾水潤洗5次，再置於含有發芽培養基（ GM)之1 5 0 X2 5毫米巴氏皿中（表3 )以令其發芽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 京· 訂 -22 -

D45 729 T A7 B7 五、發明説明（20 ) (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) •巴氏血以透氣式轚療膝帶（Urg〇p〇re,Chenove France )封口《植物在2 2 °C下以1 6小時白天/8小時黑夜循 環生長*於組織培養步驟中使用相同的生長一空間條件· 所有的植物培養基均以0. 5克/升之2—(N—嗎輻啉 基）乙烷磺酸（PH5.7:以1M KOH調整）緩衝 ，以0 . 8 % Difco Bacto·瓊脂固化*再於12 1°C下髙 壓滅菌1 5分鐘•激素及抗生索分別溶於二甲亞硒及水中 ，於髙壓滅菌後及冷卻至6 5 eC後加至培養基中· 完整的根在已固化的0. 5/0. 05培養華中（表 3)培育3天·根再切成約〇. 5公分之小片狀（在此稱 爲|根分離塊#)並轉移至10毫升的液態0. 5/ 0. 05培養基中；加入0. 5—1. 0毫升的隔夜土壤 桿菌培養物·根分離塊及細菌緩和震盪約2分鐘以混合* 接下來，根分離塊在無菌濾紙上吸漬以移去大部份的液態 培養基，並在0. 5/0. 05瓊脂上培養48小時*分 離塊再於含有萬古黴素（Sigma ) ( 1 0 0 0毫克/升） 之液態0· 5/0. 05培養基中潤洗*小片吸潰再於添 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 加有7 5 0毫克/升萬古徽素及5 0毫克/升km之 0. 15/5瓊脂（表3)上培育。以含有嵌合的neo基 因之土壤桿菌感染三週後，可在微黃的根分離塊背景中形 成綠色的具km —抗性（kmR )癒傷組織。此時根分離 塊轉移至僅含5 〇 〇毫克/升萬古黴素及5 〇毫克/升 km之新鮮〇.15/5瓊脂上。三週後大部份綠色的癒 傷組織已形成枝條*經轉形的枝條轉移至含有G Μ之 本紙張尺度逋用中國國家榇準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -23 - 5 729 7 年月 〇 A i 修正I4Μκ1 Α7 Β7 五、發明説明（21 ) 1 5 Ο X 2 5毫米巴氏皿中，以形成根或種子或二者*在 這些巴氏皿中，許多再生株可形成無根之種子v有根的植 物也可轉移至土中以播種•修飾下以得最初的根物質：6 個經滅菌的.Arab i dop's i s. tha 1 i ama C 2 4 種子在,5 0 毫 升GM ( 2 5 0毫升三角錐瓶）中發芽，於旋轉震盪槽中 (1 0 0 r p m )置生長室內之低光線條件下進行9天· 導入外來基因之植物可在選擇培養基長出之根中再生（ 5 0毫克/升康徽素）·長根並轉移至發芽培養基或土中 一-----------/ '多！ (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 峩3 椬物焙巷基 CIM SIM GM R3· PG1* 0. 5/0. 05 0.05/7* 0.15/5* 鹽類+維生素 MS HS B5 B5 MS B5 蔗糖，克/升 葡萄糖，克/升 10 30 20 20 30 20 IAA,毫克/升 2, 4-D,毫克/升 2ipAed,毫克/克 — 5 0.5 2 0.5 .0.05 7 0.15 5 Kin,毫克/克 一 0.3 0.05 0.05 — 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（21〇Χ；297公釐） -24 -

45 72S

A7 B7 五、發明説明（22 ) L，升：IAA，q丨躲—3 —醋酸；Kin激動素： 2 i pAe d，Νβ —（2 —異戊烯基）腺嘌呤：C IM 誘生癒傷組織之培養基：S I Μ，誘生根之培養基； M S，Murashige&Skoog 培養基：Β 5，Gamborg Β 5 培 養基。 馬鈴薯的轉形作用 爲轉形馬鈴薯Kardal變種•使用略加修飾之Hoeke-ma et al.l 9 8 9 Bio/Te.chnology 7，273 — 278 策略β 將去皮且表面經滅菌的馬鈴薯塊莖切成之2毫米厚之 小片。在這些小片四週切出直徑爲1公分之圓片·圓片收 集於W Μ中（Murash ige&Skoog培養基*含有1毫克/升 硫胺素HC1 ，0.5毫克/升吡眵醇HC1 ，0. 5毫 克/升菸鹸酸* 1 0 0毫克/升肌醇，3 0克/升蔗糖， 0. 5克/升MES，pH5. 8)·以根結土壤桿菌 E H A 1 〇 5 株接種（Hoodet a 1，1 9 9 3 Transgenic Research 2，208 — 218)係以1 0 0毫升新鮮的 WM替換WM，其中懸浮有1 〇毫升土壤桿菌培養物並於 L B加適合抗生素之新鮮培養基中生長至〇 D βο。0 . 5 -0. 7*塊莖圓片於細菌懸浮液中培育20分鐘後，其 再以2 0個分離塊/巴氏皿之密度轉移至已固化之CM上 (WM添加8克/升瓊脂*3. 5毫克/升玉米素核糖核 苷，0. 03毫克/升吲躲醋酸）·2天後，圓片轉移至 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 輩· •訂 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印策 -25 - 4 5 -7W?年；j P,R. ?! n5 五、發明説明（ 23) PM ( CM添加2 Ο 0毫克/升頭孢瞎吩（cefotaxime) ，1 0 0毫克/升萬古徽素）以選出土壤桿菌抗性株。3 天後，圓片轉移至S I Μ盤（CM添加2 5 0毫克/升羧 苄青霉素，1 0 0奄克/升康徽素）密度爲1 〇個分離塊 /巴氏皿，經選擇以供經轉形根之再生· 2週後，組織圓 片轉移至新鮮的S I Μ ·且再3週後轉移至S EM ( SIM加1 Οχ較低濃度之激素）·共培養約8 — 9週後 ，根巳夠大了可自癒傷組織中切下，並轉移至含有1 〇毫 升RM(WM含有〇. 5XMS鹽，0_ 5X維丰素， 1 0克/升蔗糖，1 0 0毫克/升頭孢睡吩’ 5 0奄克/ 升萬古徽素及5 0毫克/升康徽素）之玻璃管內（Sigma， Cat. nr. C 5 9 1 6 )以於試管內維持根之生長及營養體 繁殖。 線蟲的處理，植物根之生長及感染 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Arabidopsis種子表面殺菌並種於皿內（炉：9公分 )·其中爲含有20克/升葡萄糖及20毫克/升康黴素 之Β5培養基。在4°C下歷3天後，盤在22°C下以1 6 小時白天/8小時黑夜循環之生長室內培育2週·具康徽 素抗性之植物再轉移至充滿土之透明塑膠管內（3 0 X 1 5 X 1 2 0 毫米，Kelder plastibox b.v.,The Nethe-rlands )。管子再以對垂直軸60°之角度傾斜擺置， 使根可在管之較低側生長*如此可用眼睛追踪感染過程， 並有助於自土中移出根系統以作GUS分析·2週多後進 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 -

A 5 72 9.X 88. 3. 0 5 修_ A7 B7 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 五 ) 行感染，係將每個根系統有5 Ο 0個異皮線蟲（Heterod-era schachtii )第二階段幼蟲（於3¾升Hj!〇)或 3 0 0 個蟲瘻線蟲（Ke 1 〇 i dogy n e i n c 〇gn i t a )第二階段 幼蟲之懸浮液注入土壤中· 類似地，將在含有康徽素之RM培養基中出根之馬鈴 薯枝條轉移至充滿土之透明塑膠管中C 3 0 X 1 5 X 1 2 0 毫米，Kelder plasitibox b.v.，The Netherlands )並於2 2 °C及1 6小時白天/ 8小時黑夜循環中再傾斜 生長2週。將每個根系統以5 0 0個球頭線蟲（0.1〇1)〇(^-ra Pal-lida)第二階段幼蟲之懸浮液（於3毫升Η2〇中 )注入土中以感染· G U S分析 在感染過程的各時間點決定G U S活性，係充份洗滌 根系統以移去大部份粘著的土壤•再於X_G 1 U c溶液 中（1 毫克/毫升 X-Gl uc · 50mM N a P 0 ^ (p Η 7 ) ♦ 1 m M K4Fe (CN)e，lmM K3Fe(CN)e，l〇mM EDTA，0. 1% 三硝 基甲苯XI 00)以37°C培育一夜*以70%乙醇培育 數小時移去組織中之葉綠素後，在顯微鏡下追踪GU S染 色。 實例1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -27 - 45 729 7 年月 aΰ. 〇〇 補 修正 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（25 ) 構築二元載體PMOG800 二元載體PM0G8 0 0爲PMOG 2 3之衍生物（ 圖 1，寄存在 C e n t r a a 1 B u r e a u v ο 〇 r s c h i m m e 1 c U 11 u r e s,

Oosterstraatl，Baarn.The Netherlands，！· 9 9.0 年 1 月 29 曰，CBS 102.90) *其中在£<:〇^1及

Sma I間之聚連接子中引入額外的Κρη I限制位置•此質體在 T—DNA之左及右邊緣間含有一個康徽素抗性基因，以 選擇導入外來基因之植物細胞（圖2) *大腸桿菌 DH5a，（帶有PMOG800 ) •之樣品寄存在

Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstra- atl ，Baarn，The Netherlands，]· 9 9 3 年 8 月 1 2， CBS414. 93。 實例2 構築無啓動子之GUS構體pMOG553 此載體之構築述於Goddijnetal,1 9 9 3 Plant J 4，863 — 873。在此參考文獻中有一錯誤處；構 體含有一個CaMV 3 5 S R N A 終結子在办一尿 甘酸酶基因之後而非所示之η 〇 s終結子•介於此二元載 體T-DNA邊緣間之列序可得自EMB L資料庫，編號 Χ84105. PMOG553·有一個HygR標幟可 供植物轉形（圖3 ) · 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁)

28 5 4 經濟部中央標準局員工消费合作社印裂 A7 B7 ;729 7 88 五「發明説明) 實例3

Arabidopsis thaliana中加飾的N F S —選擇性啓動子片 段之鑑定及分離 二元載體PM0G5 5 3以三親株交配至根結土壤桿 菌株M0G1 0 1而使流動•生成的菌株用於Arabidopsis根之轉形· 以此方式可得 1 1 0 0 以上有導入外來基因 之Arabidopsis植株·導入外來基因之植物令其生長成熟 ，令其自體受精且生成的種子（S 1 )回收再春化處理· 接下來S1種子在以〇.6%¾脂，10毫克/升潮霉素 固化之營養溶液上發芽（Goddijn et al. 1 9 9 3 Plant J.4，8 6 3 — 8 7 3) ，且貯於4°C下歷4天的吸稂 期。在第5天，盤轉移至室溫及中度光亮下（1 0 0 0 1 ux，16小時白天/8小時黑夜）以使發芽* 14天 大的籽苗轉移至傾斜透明塑膠管內之陶土中（3 0 X 15 X120 毫米），並在 5000 lux (20 °C下）進一 步生長》以此方式生長之植物其大部份的根系統可在土及 試管間之較低處生長· 2週後，根以如實驗部份所述之線 蟲感染。在接種後數個時間點下（由2— 14天）*如實 驗部份所述的•分析根系統之GUS活性•鑑定 pMOG 5 5 3 # 1 1 6 4株，此株可分別在由Heterod-era Scachtii 及 Meloidogqyne incognita 誘生之合胞體 及巨細胞內顯示較強的G U S表現。於未感染的對照組植 物中（以及在感染的植物中）*在年幼側根基部及植物的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁)

-29 - 補充 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 45 729Γ7 年月 38. 3. 05 五、發明説明（27 ) 某些綠色部份的一些細胞中可測及極弱的G U S表現* 於1 1 6 4株中，頃發現此表現型以1 : 3比例分隔 ，顯示G U S構體存在於毎基因體一蓖域中•以南方吸濟 分析證實僅存在一個T — D NA套數•以倒轉的PC R分 離鄰接至GUS開放謓譯架構之1. 5 kb加飾的啓動子 序列片段·此株之基因體DNA以限制酶Ms c I解離（ 其在GUS編碼區域中解離一次），並再連接。以酵索 S n a B I接下來水解環狀DNA可褥一個線型片段•其 在末端有已知之GU S序列且其間有鄰接的植物序列•此 片段利用引子組GUS i nv5 (5 >.CTT TCC C A C C A A CGC T G A T C 3-

S E Q ID N0:1)及 GUS7(5*"GTA AT G CTC T A C ACC A C G CCG

SEQ ID N0:2)擴大，選殖於多套數載 體內並定序（見下文）·爲將此經擴大片段選殖回GUS 前，植物序列利用引子GUSinv5及1164XBM (5 ** T C T AGA GGA TCC TGG C C A TAC AAA T C A A C G TTT AC 3 SEQ ID N0:3)自 Arabidopsis 基因體DNA中再擴大•撺有校讀活性之pfu D N A 聚合酶可用來減少錯誤率•引子1164XBM可在啓動 子5端引入一個BamHI位置，其可將1 48 Ob p Bam HI .啓動子片段選殖回構體pMOG 8 1 9之GU S前，而不 會改變GU S開放讀譯架構及植物啓動子間之序列β 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-30 - 5 729 7 A7 B7 年月 A _、發明说WTT9 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 。經線蟲感染後之GU S分析顯示•以pMOG 8 4 9轉 形之植株中有7 9 %可在合胞體中表現告知者基因•在側 根分枝菌域•根及葉之維管組織，蓮座及某些花組織中心 也發現某些弱的表現•在合胞體外的G u s表現顯示各株 間強烈的變異性（見圖6) *可能此變異是所引入之調節 性序列上基因位置作用之結果*然而在大多數株中，所發 現的表現型式和原先加飾之5 5 3#1 1 64株極相似· 即使在各種p MO G 8 4 9株中之啓動子片段活性大 體上較合胞體內之G U S活性還弱*合胞體一陽隹株中無 一者對飼養位置具有完全的特異性* 也可在爲Meloidogyne incognita感染所誘生之巨 細胞中發現G U S —表現•此爲可在爲Heterodera scha-cht i i誘生之合胞體中表現GUS之相同株*此顯示# 1 1 6 4片段可充作大概的飼養位置特異性啓動子，以遺 傳操作對 Meloidogyne incognita 及 Heterodera schac-htii感受性減低之植物。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 在組織培養相中*可觀察到# 1 1 6 4調節性序列也 可充作有用之啓動子•因此若# 1. 1 6 4啓動子片段轉移 至Arabidopsis時*但有植物細胞破壞基因於其控制下， 如bar nase (見實例8及9 )則可促進使用中和基因之需 求v _ 553#1 16 4—爲基礎之卩011片段可充作探針 以分離相當的基因體純系· 2. lkb之基因體片段（見 SEQ I D NO : 4)可再以如上述相似之方式使用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 年 附件三(A):第8S110414號專利申請案中文說明書修正頁 45729 7 民國89年9月呈 五、發明說明（3Q) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (PMOG889含有基因體Sis#]· 1 64並融合至 GUS插入子，其於1 9 9 6年8月2 3日寄存於台灣食品 工業發展研究所，寄存編號CCRC +9 40 128)。 同樣，於 H，Schachtii 及 M.incognita 分別感染 Arabopsis 根後，可在合胞體及巨細胞中觀察到由線蟲一誘導之 G U S表現。 實例6 啓動子標幟pMOG 5.5 3 # 1 1 6 4之序列決定 以引子移動策略在以CsCl純化之D N A上決定# 1 1 6 4基因體純系之序列，利用Pharmacia之自動定序 儀A L F »使用有螢光之（1八7?組合八111:〇1?63(1定序套組。步 驟述於 Voss et al，（ 1 9 9 2 ) Mol Ceil Biol 3， 153—155。序列示於SEQ ID N〇:4。 實例7 啓動子亞片段之選殖 以P CR製成啓動子# 1 1 6 4五個次片段，利用如 表4所示之引子。引子編號和序列表中所用的相同。於所 有的擴大作用中使用校讀DNA聚合酶p f u ，且 PMOG849充作標的DNA »所有5 <端引子均含有 —個Xho I位置。因此，所有由PCR產生之1 164 啓動子之刪除片段可再引入pMOG 8 1 9中，即利用此 X h ο I位置及BamHI位置，其位於PMOG5 5 3之多 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4572?^ /λ- -*r 1 4572?^ /λ- -*r 1 A7 B7 88年Λ妒 五、餐 (诗先閲铕背面之注$項再填寫本X) 重選殖位置且保留在G U S編碼區及加飾植物序列間之加 飾1 16 4株中•構體所指之編號始自於pM0G8 1 9 中選殖之亞片段：引子6 0 4 4 — 1至6 0 4 4 — 6分別 相當於SEQ ID NO:6至11* 表 4 P Μ 0 G 5 端 引 子 3 端 引 子 9 5 8 6 0 4 4 — 1 6 0 4 4 — 6 9 5 9 6 0 4 4 — 2 6 0 4 4 — 6 9 6 0 6 0 4 4 — 3 6 0 4 4 — 6 9 6 1 6 0 4 4 一 4 6 0 4 4 — 6 9 6 2 6 0 4 4 一 1 6 0 4 4 一 5 將道些基因匣再引入植物表現型式後，可如實例3中 1. 5kb#1164片段所述般決定恰當之時間等*頃 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 發現具有有用型式及/或適當時間之片段可再用於驅動其 他異質DNA序列（意識股/編碼股及反意識股二者）之 表現及/或用於製成融合的啓動子構體β再者’進一步分 析可洞察許多調節性元件*如不表現子•加強子等，並製 造可任意影春表現型及/或恰當時機之可能性·爲說明如 何使用依據本發明之啓動子片段來減低對線蟲之感受性’ 目前以基因體2. lkb之#11 64片段.，其選殖在 Barnase之前，充作N F S —破壤基因之實例加以說明* 本紙張尺度適用中圃國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -34 -

Α7 Β7 五、發明説明（34 ) 入1 1 6 4啓動子而生成pFL 1 5 ·此外，以此步驟， 含有T a g啓動子子及bars tar基因之片段可與此承接子 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 交換》 實例9 構築 rolD — B* 構體p F L 1 1在二元載髖中含有一個嵌合體barst-ar基因•此構體以下列方式選殖* Bars tar編碼面位於構 體 PMT3 16 之HUdlll/ BamHI 片段上（Hartley ( 1 9 8 8 ) J Mol Biol 202 ， 913-915)。 Hindlll位置可改變成BamHI位置，即在此位置內連接自 我回冷的承接子5#AGCTCGGATCCG 3 ^ ( 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 S E Q IDNO:18)·接下來*生成的BaιnHI片段 選殖在表現匣PMOG1 8 0中介於雙重加強之GMV 3 5 8啓動子及nos終結子之間·此表現匣述於WO , 93/10251，生成P〇G30·利用承接子 5<GGCTGCTCGAGC3'(SEQ ID NO: 1 9)，在η o s終結子之3 /端之HindlH位置 可變成Xhol位置，且利用承接子5 — AATTGACGA AGCTCCGTC 3 " ( S E Q ID N 0 ： 2 0 )，在啓動子5 端之EcoRI可改變成Hindlll位置•之 後3 5 S啓動子以來自發根土壤桿菌RolD基因之啓動子替 代•此啓動子呈Hindlll BamHI片段自構體pD02中切出* 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS ) M規格（210χ297公釐) 45 7 89· 9· !4 補充 Α7 Β7 五、發明說明（35) {請先閲讀背面之沒意事項再填窝本頁) 其得自 F. Leach ( Leach and A o y a g ί ( 1 9 9 1 ) Plant Sc i 7 9 ，69 — 76)。由生成的純系一POG38中 ，以Hindlll及Xhol水解切出含有啓動子及終結子之bar-star基因*再分別嵌入PM0G8 0 0中聚連接子之個別 位置上，生成了pFLll。 最後，嵌合的# 1 1 6 4啓ΐίί子—barnase基因可以 EcoRI片段自PFL15中解離，再以縱排方向嵌入介於 barnase及NP t I I標幟基因間之p F L 1 1唯一的 EcoRI位置中，而生成了 PM0G8 9 3，其於1 9 9 6 年8月2 3日寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存編號 CCRC 940129。 實例1 0 以PMOG8 9 3轉形馬鈴薯植物，並測試增加的抗Glo-bodera pallida之抗性 ° 二元載體.pMOG 8 9 3流動至根結土壤桿菌，生成 之菌株再如實驗部份所述般，用於馬鈴薯Karda丨培養株中 塊莖圓片之轉形作用。共可得到9 8個導入外來基因之植 株。這些再行營養體繁殖，係將含有至少一個節的枝條切 成片段，再於試管內使生根。如實驗部份所述，測試1 5 種植物對Glodera pal 1 ida抗性有否增加》可預期以含有 Barnase / Barstar構體之PM0G 8 9 3所轉形之馬鈴 薯植物，由於在（發展中的）線蟲飼養結構內有線蟲誘生 之Barnase表現，故對Globodera pallida之感受性應降 低。. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ 38 - 4 5 72 9 7 經濟部中央標準扃負工消費合作社印製 A7 H? 五、發明説明（36 ) 上述實例僅供說明本發明，且不欲予以限制。在本發 明範圍內精藝者可容易地進行許多修飾。 序列表 (1 ) 一般資料 (i )申請人 (A )名字：MOGEN International N.V. (B )街：Einsteinweg 97 (C )市：Leiden. (D )州：Zuid-Holland (E )國：T h e N e t h e r 1 a n d s

(F) 郵政號碼（ZIP) ： NL- 2 3 3 3 C B (G) 電話：31 — 71258282 (H) 傳真：31 — 71-221471 (i i )發明名稱：調節性D N A序列 (iii)序列數目：20 (i v )電腦可讀型式： (A) 媒體型式：軟式磁碟 (B) 電腦：IBM PC可相容

(C) 操作系統：PC — DOS / M S - D ◦ S (D )軟體：Patent IN Re 1 ease # 1 . 0 Version # 1 . 2 5 ( E P 0 ) (2 ) S E Q ID N〇:l 資料 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4ML梠（210X29·；公#) (請先閱讀背而之注意事項再4¾本页)

以 J*.r. .¾. 45 729 7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 hi 五、發明説明（37 ) (i )序列特性 (A)長度：20鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 (i X )特色： (A)名稱/索引：引子—結合 (B )位置：1 . . 2 0 (D)其他資料：/註二"引子回冷至2 2 4 -2 0_ 5位置之uidA基因（B -葡糖苷酸酶）其來自有標幟 之構體 PMOG553 (X83420)#

(xi)序列說明：SEQ ID N Ο ： 1 CTTTCCCACC AACGCTGATC (2 ) S E Q ID N〇:2 資料 (i )序列特色 (A)長度：21鹼基對 (B )型式：核酸 (C)股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4ί)ί格（2丨0X297公犮） (請先閲請If而之注意事項再坑，??本瓦) ί. 、-° -40 -

4 5 7 2 9 T AT Η 7 五、發明説明（38 ) (x i )序列說明：S E Q ID N 0 ·· 2 GTAATGCTCT acaccacgccg (2 ) S E Q ID N0:3 資料 (i )序列特色 (A)長度：3 5驗基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (i i )分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 (X i )特色 (A)名稱/索引：混合一特色

.-•i-r; E ./.., ¾先閱婧背而之注意事填寫本頁) •裝. *·1Τ (B )位置：1 . (D )其他資料： BamHI位置# (i X：)特色 (A )名稱/索引 2 註 凸出處有Xbal及 經濟部中央標準扃只工消费合作社印1i 引子一結合

(B)位置：13, , 35 (D)其他資料：/註=、此部份引子回冷至6 4 6 至6 6 8位置之604 4 — 〇序列，(X 1 )序列說明：s E q ! D N 〇 ； 3 TCTAGAGGAT CCTGGCCATA CAACG TTTAC 木紙張尺度適用中國國家標半{ CNS ) Λ4規格（ -41 - 經濟部中央標隼局負工消费合作社印51 45 729 7 A 7 H7 五、發明説明（39 ) (2 ) S E Q ID N0:4 資料 (i )序列特色 (A) 長度：2163鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：雙股 (D) 拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：無 (v i )來源： (A )有機體：Arabidopsis thaliana (B )株：C 2 4 (x i )特色 (A )名稱/索引：C D S (B)位置：2161.. 21 63 (D)其他資料：/密碼子—起點=2 1 6 1 (i x )特色 (A) 名稱/索引：混合—特色 (B) 位置：2128. 2 16 3 (D)其他資料：/註=，pMOG 5 5 3序列位 uidA轉譯起始密碼子上游（5 < )達RB /植物基因體轉 位’ (i X )特色 (A)名稱/索引：啓動子 本紙張尺度適用中國國家標孪（CNS ) Λ心t格（2 S 0 X 297.:.>兑） (請先"讀背而之注意事項再填巧本頁)

45 729 7 A7 in 五、發明説明（4〇 ) (B )位置 (X i )特色 (A )名稱 (B )位置 2 2 7 索引：引子一結合 7 8 7 · - 8 0 4 經濟部申央標準局員工消费合作社印製 (D)其他資料：/標織=引子6 ◦ 4 4_工 /註="引子6044 — 1回冷（表4)以擴 大亞片段' (i X )特色 (A )名稱/索引：引子—結合 (B)位置.1147. . 1169 (D)其他資料：/標幟=引子6〇 44_2 /註=a引子6〇44一2 (表4)回冷以擴 大亞片段， (i X )特色 (A)名稱/索引：引子—結合 (B )位置：1 8 5 3，.工 8 8 〇 (D)其他資料：/標幟=引子6〇 44_3 /註=引子6044—3(表4)回冷以擴 大亞片段" (i X〕特色 A)名稱/索引：引子__ B )位置：1 9 D )其他資料： 8 . 檩幟 結合 19 4 0 引子6044—4 註=、引子6〇44~4 ( k紙張尺度適用中國國家橾準（cns )八4規'—-— 表4 )回冷以擴 '45 729 7 A? }\Ί ~ 1 -- ---- — — .— — , — - 五、發明説明（41 ) 大亞片段1 (i X )特色 (A )名稱/索引：引子一結合 (B)位置：1897. · 19 17 (D)其他資料：/標幟=引子6 0 44 - 5 /註引子6044 — 5回汽（表4)以擴 大亞片段（相對股）" (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 4 * - 4-ϊ - I f --I V - 士^.. !| - 1 rJ (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁)

、1T 經濟部中央橾準局貞工消费合作社印¾ 本紙張尺度適Λ中國國家標準（CNS ) Λ4规格（2)0χ 297 :Μί._ ) , -44 - 經濟部中央摞準局只工消Φί合作社印^ 45 729 7 Λ7 _____B?__ 五、發明説明（42 ) GAATTCCATC AAATATTAAC TTTTAATATC ACTACATCAT CACCAGATAT GGATGAATAT 60 TTATATAATA TTCACTGCCA ATTAGTTCTT TTAACATATA TATGCTGCTT GTACATATAG 120 GTCATCCAAA TTTTTAGGGT TCAAAACAAA ACCAAAAGAA ACAGAAAAGA TCTGATAAAA 180 AGTCTTCATT TTAGACGAGG GATCAAACTT ATCTAGTGCA TCTGAATGAA AAAAAATGAT 240 | CTTAACACTG CAGGTGAAGG CTGGCTCAAT CTTTGACAAT ATATTGATCT GCGATGACCC 300 GGCATATGCA AGAAGCATCG TGGATGACTA TTTTGCCCAA CACAGGGAGG TAGATTTCCA 360 AGTCTTTGTA TATCTTTTTG CTTCTTTTTG GATAAAATCA AAGAAGTTTT TTGATCTTGC 420. AAGTGTGTAG TAATTGCAAA TGGATTTTOT GCATGCTATT ATATACGAAA ATGTCTTATT 480 AGTGAATTTG ATATGCTATA TACTTGGCCA TATGCACCAG TCTGAGAAGG AGTTATTTGC 540 ! GGAAGCAGAG AAAGAAAGAA AAGCTAGAGA AGATGAGGTT TGTAGTTCAC AAAAAAGTTC 600 ! TTGTTCTCTT TTCAAGTCTT CTCTGTATAT CCTAGTTAAC GAGCATGGCC ATACAAATCA 660 ACGTTTACAG GAAGCTCGGA TAGCAGGGGA AGAAGGTGAA CGCAGGCGGA AAGAAAGGGA 720 CCACCGGTAT GGAGACAGGA GGAGGCGTGA CAAACGGGTA AGTACTTATT TGAGTCCAAA 780 TGAATTATAA CCTTCTCAAC TCTGTTTTAT CTGGAAACCA AGTGAGTGAA TATTGTTGGA 840 j AATGGTTTGG TTTGTTTTGT TTTGTTTTGC AGCCGAATCC ACGTGATTAT ATGGATGATT 900 ACCATGTAAG TGTTCCTTCT ATCTCAACCA CTTTAAAAAG AATGGTTTAT GCATTTTAGT 960 ACTGAATCAT CTTAACTGTT CTAAAAATGT AAGTTTGTTA TGATTCTGAA TTTCGTGTAG 1020 ! GACGAGCTAT GAGGCGCAGA GTGGTGGGCA TTTGGCAAAG CATTGGGGGA AATTATCTAT 1090 j ATTTTGCCTT TGAATGTGTA CCTGTTTGTA ATTTCATAAT TTGTAACCTT TTGTATTCAT 1140 ATTCTTATAA TGTATTTTGG CATGAAAACT TGACTTGTTA TTTTTCCCTT CCAATACAAA 1200 AATTCTAAAA TTGGCAAGAA CGACTTACTA CCATGCAGTG ATTTGTGAAG TTTGATAGTG 1260 GTGGTAATTT TAATTGTTTC ACCACAGAAA ATTTCTCTAT ATCCTGAAGA AGATAGCTGA 1320 GTTGAACTGA GAGGTTGGCG TTTCTTAGTG AAAATACAAA AAATAGAAAT CTTTAGCTAG 1330 AAAGTGTGGT GTGGACCCGA CTGATGGTAA CCATGTTCAT ITTGGACjGAAC TAATGTGAAT 1440 ATTAGCTAAA AGCATATTGT TGAGTGTTGA CAAAATGACA ACAGATAAAT CGTCAAATAC 1500 TACTCCACCT AGCTAATATT TTTTTTTAAC TAATGTTAGA AACCCACCTA TTTGCATCCG 1560 TAATGATAAA AACTAAAAAA ATATTAGATT ATTAGAGTGA TACATTTTGT GTGAAAACGT 1620 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（2Ι0χπ7公^ ) _ 45 一 (誚先閲請背而之注意事項再访寫本頁)

4 5 72 9 7 Α7 Μ7 五、發明説明（43 ) AAACGAAAGT CAAAAGAAAG AAAAACGAAA GAAATTTAAA TGCGGTTTAT GGTGGGCACA 1630 AATGTTGTGA CCTGGTGTGT CCCTTTCCCA CTTAAATGTA CGGCTGATAA TCACATCAGT 1740 GGCGACTTTA GGAAATAGAA AATTCGCACA ATTGACTCGA TACGCATTAA AGTCGTAATC 1800 ACTAGACATT TTTGTTATCT GTCCTTTAGT GGTTCGTTTA ATCTGGAACG TCCTTATAAT I860； AACATAAGAT AAATATTTAC TTAATTAGCT ACGGAACTAC ATTAGTATTC AATTGATATA 1920： ACTAATGGTA ATTACTAATT AATTGCGGAA AGCCGAGAGA GGTGATGGTG CACGGTGCAT 19801 GTGAAGAGCT TTTGATACGT AAGTGGAGCA CTCATGATAA GCGAAGTTGT CTATTTATAA 2040 AGTTTAATTT ACTGTGCTTT TTATAATGTG ACACACTATT GGAATCCAAT GACTGCATTA 2100 TTTATTTATA TGTAAAAAAA AAAGTCTCAA AGCTTGGATC CCCGGG1AGG TCAGTCCCTT 2160【 ATG 21€3 Met 1 .i (2 ) S E Q ID N o : 5資料 J--TL------^，吖裝-- C (請先閱讀背面之注意事項丹¾¾本肓) (i )序列特色 (A)長度：1個胺基酸 (B )型式：胺基酸 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：蛋白質 (X i )序列說明：S E Q ID N 0 ： 5 Met (2 ) S E Q ID N0:6 資料 (i )序列特色 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 __—— - , ："—----- 本紙張尺度適用中國國家摞率{ CNS ) Μ規格（21 〇X2£>祕疗〉 λΆ 丁 -\s 衄_部中央榡準局員工消拎合作衩印製 45 729 7 A7 H7 五、發明説明（44 ) (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：無 (i i i i)反—意識股：無 (i x ).特色 (A)名稱/索引：混合特色 (B )位置：1 . . 12 (D)其他資料：/註="5 '凸出處含有Xhol及 EcoRI位置' (i X )特色 (A) 名稱/索引：引子一結合 (B) 位置：13. . 30 (D)其他資料：/註=此部份引子在7 8 7 — 804位置處回冷至6044 — 0序列（SEQ ID N 0 : 4 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製

(xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 6 CTCGAGAATT CTATAACCTT CTCATTCTCTG (2 ) S E Q ID N0:7 資料 (i )序列特色 (A)長度：35鹼基對 (B )型式：核酸 * ( C )股性：單股 本紙掁尺度適用中图國家標隼（CMS ) { 210X 297*泣） -4 ί - 45 729 7 A7 H7 五、發明説明（45 ) (D )拓撲學：線型 (i i )分子型式：DNA (基因體） (v i )來源 (A )有機體：A r a b i d 〇 p s i s t h a 1 i a n a (B )株·_ C 2 4 (x i )特色 (A)名稱/索引：混合特色 (B )位置：1 . 12 (D)其他資料：/註="5凸出處含有及

EcoR I位置〃 .(i X )特色 (A) 名稱/索引：引子一結合 (B) 位置：13..35 (D)其他資料：/註=、此部份引子在1 1 4 7 1 169位置處回冷至6044 — 0序列（sEQ 1 N 0 : 4 ) (xi)序列說明：SEQ ID N0:7 經濟部中央標準局员工消疗合作社印製 (請先閱讀背而之注意事項#填寫本頁)

CTCGAGAATT CTATAATGTA

TTTTGGCATG A A A A C (2 ) SEQ ID NO :8 資料 (i )序列特色 (A)長度：37鹼基對 (B )型式：核酸 _______________________________ ^张尺度用中國國家標ί ( iNS ) Λ4规格( 2IOX29Hi· ) _ J〇 -4〇 一 45 729 經濟部中央橾洛局員工消贽合作社印掣 ΑΊ Π7 五、發明説明（46 ) (C) 股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 (v i )來源 (i X )特色 (A)名稱/索引：混合特色 (B )位置：1 . . 12 (D) 其他資料註=A5凸出處含有Xhol及 EcoRI 位置"f (i X )特色 (A) 名稱/索引：引子一結合 (B) 位置：13· 37 (D)其他資料：/註=a此部份引子在1 8 5 3 — 1880位置處回冷至6044 — 0序列（SEQ I D N 0 ： 4 )

(xi)序列說明：SEQ ID No. 8 CTCGAGAATT CTATAATAAC ATAAGATAAA T A T T T A C (2 ) SEQ ID N0:9 資料 (i )序列特色 (A)長度：35鹼基對 (B )型式：核酸 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4规格（2丨) (請先閲婧背而之注意事項再瑱耗本頁) τ裝. -49 - 經濟部中央標豕局兵工消费合作社印製 45 729 7 A 7 ]57 五、發明説明（47 ) (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA¢基因體） (i i i )假設：有 (X i )特色 (A) 名稱/索引：混合特色 (B )位置：1 . 12 (D)其他資料：/註=^5 /凸出處含有Xhol及 EcoRI位置， (i X )特色 (A )名稱/索引：引子一結合 (B) 位置：13. . 35 (D)其他資料：/註="此部份引子在1 9 1 8 — 1940位置處回冷至6044 — 0序列（SEQ ID N 0 ： 4 )

(xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 9 CTCGAGAATT CTATAACTAA TGGTAATTAC TAATT (2 ) SEQ ID N0:l〇 資料 (i )序列特色 (A)長度：35鹼基對 (B )型式：核酸 . (C )股性：單股 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X247公^ ) {請先閱讀背而之注意事項丹填寫本"}

4 經濟部中央標準局員工消赀合作社印製 5 729 7 Λ 7 Η7 五、發明説明（48 ) (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA(基因體） (i i i )假設：有 (X i )特色 .(A)名稱/索引：混合一特色 (B )位置：1 . . 14 (D)其他資料：/註=*此部份引子回冷至 6044 — 0 序列（SEQ I D NO: 4)由 2 1 28至2 1 42位置，同.時造成片段1 9 0 9至 2 1 2 7之刪除 " (i X )特色 (A) 名稱/索引：引子一結合 (B) 位置：15· · 35 (D)其他資料：/註此部份引子在1897 — 1917位置處回冷至6044 — 0序列（SEQ ID N 0 ： 4 )

(xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 1 0 GGATCCAAGC TTIGATCAAT TGAATACTAA TGTAG (2 ) SEQ ID NO:ll 資料 (i )序列特色 (A)長度：20鹼基對 (B )型式：核酸 本紙浪尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4：«ί格（2!〇Χ2Ν.公垃） (#先閲讀背而之注意事項再填-"本页)

-51 - 4 5 729 1 A7 經濟部中央標準局只工消费合作社印^ Η 7五、發明説明（49 ) (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 (X ί )特色 (Α)名稱/索引：混合特色 (B )位置：1 · 2 0 (D)其他資料：/註=a引子於224 — 205 位置回冷至uidA基因（召-葡糖苷酸酶）其來自有標幟之 構體 PMOG553. ( X 8 3 4 2 0 )"。 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 1 1 CTTTCCCACC AACGCTGATC (2 ) SEQ ID NO:12 資料 (i )序列特色 (A)長度：22鹼基對 (B )型式：核酸 (C)股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA(基因體） (i i i )假設：有 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 1 2 CGGACTCTGG ATCCGGAAAG T G 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4iJi格（2!0Χ2<Π公犮） {請先閱讀背而之泣意事填?本頁) -装. -5 ¼ -52 - 45 7297 A 7 B7 五、發明説明（50 ) (2 ) S E Q ID NO :13 資料 (i )序列特色 (A)長度：36鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA(基因體） (i i i )假設：有

(xi)序列說明：SEQ ID N〇：13 CTGCTCGAGC CTAGGCACAG

GTTATCAACA CGTTTG (2 ) S E Q ID N〇：14 資料 (i )序列特色 經濟部中央標準局®:工消费合作社印ιί (A)長度：2 2鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (i i )分子型式·· DNA (基因體） (i i i )假設：有

(xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 1 4 CGGACTCTGG ATCCGGAAAG

T G 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ΛΜ兄格（UOxMDi ) ΓΟ 經濟部中央標率局M工消t合作社印製 I G 1 ( c ••對 . A Q 0 基 NET N 鹼 型 D sc 4 酸股線 ·.有 ：A D 4 核單：式：明 G 1 色......學型設說 A 特度式性撲子假列 τ Q 列長型股拓分} 序 c E 序 S N \ ,s N i xlyτ s \1/ A B o D i i i A ) i ( ( ( ( i i X G 2 ( ¢(( 料 資 6 體 因 基

6 1 ο N D

T T C G A A G A

T G A c T G G A T G G G c c c c T A G G

45729T A 7 · Β7 五、發明説明（51 ) (2 ) S E Q ID N0:15 資料 (i )序列特色 (A)長度：27鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA(基因體） (i i i )假設：有

(X i )序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 5 CTTACTCGAG CCATGGTAAG T T T C T G C 本紙張尺度適用中國國家惊準（CNS )如蚬掐（210><2叩公处） ^ ^ -54 -

4 5 729 Α7 Β7 五、發明説明（52 )

C C C C (2 ) S E Q ID N〇：17 資料 (i )序列特色 (A) 長度：44鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有

(X i )序列說明：S E Q ID N 0 ： 1 7 CATGGGGAC TGACCTACCC GGGGATCCAA GCTTCTCGAG T C T A (2 ) S E Q ID N0:18 資料 (i )序列特色 經濟部中央標挛局貝工消f合作社印裝 (A )長度：1 2鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i)假設：有 (X i )序列說明：S E Q ID N 0 : 1 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4^枯(2ΙΟΧ29?^ϊ!, ) _ _ 45729? Λ7 B7

五、發明説明（53 ) AGCTCGGATC

C G

2 ) S E Q ID N〇:19 資料-(i )序列特色 C A)長度：12鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (ii)分子型式：DNA (基因體） (i i i )假設：有 (X i )序列說明：S E Q ID N 0 ： GGCTGCTCGA GC (請先聞讀背而之注意事項再填寫本頁) •裝- 、\=° 經濟部中央標準局炅工消f合作社印掣 E 序 \—/ \I/ NJ, s ) A B c D ) i ( ( ( ( 2 (

X 料 體 Τ 資 因 D Τ ο 基 I C 2 ( G •.對 A Q ο 基 ΝΕΑ Ν 鹼 型 D s A 8 酸股線：有 ：G D 1 核單：式：明 C I 色......學型設說 A 特度式性撲子假列 G Q 列長型股拓分 }序丁 ο 2 ο Ν

C Τ G C 本紙張尺度適用中國國家摞準（CN'S ) Λ4規格（2!0父？()7.公牮） -56 -

Claims (1)

1. 5 Αα

   六、申請專利範圍 附件（A ) 第8511 04 14號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國90年6月修正 1 · 一種可得自擬南芥（Arabidopsis thaliana)之 D N A片段，其當再引入植物時可促進可由根結及囊胞線 蟲所誘導之相連DNA序列之轉錄，該DNA片段係由 SEQ ID NO: 4中核替酸646至2141所 示之核苷酸序列所構成。 SEQ ID NO: 4 : ' . GAATTCCATC ΛΑΛΤΛΤΤΛΛΟ ΤΤΤΤΛΛΤΛΤΟ ACTACATCAT CACCAGATAT GGATGAATAT 60 ! 5 ΤΤΛΤΛΤΑΑΤΛ TTCACTGCCA AT^TAGITCTT TTAACATATA TATGCTGCTT GTACATATAG 120 I GTCATCCAAA TTTTTAGGGT ΤΟΑΛΛΛΟΛΛΛ ΛΟΟΛΛΛΛΘΛΛ ACAGAAAAGA TCTGATAAAA 180 ' \ . AGTCTTCATT TTAGACGAGG GATCAAACTT ATCTAGTGCA TCTGAATG7UV AAAAAATGAT 240 10 , . CTTAACACTG CAGGTGAAGG CTGGCTCAAX CTTTGACAAT ATATTGATCT GCGATGACCC 300 GGCAtATGCA AGAAGCATCG TGGATGACTA TTTTGCCCAA CACAGGGAGG TAGATTTCCA 360 15 AGTCTTTGTA TATCTTTTTG CTTCTTTTTG GATAAAATCA AAGAAGTTTT TTGATCTTGC 420 AJyGTGTGTAG TAATTGCAAA TGGATTTTCT GCATGCTATT ATATACGAAA ATGTCTTATT 400 AGTGAATTTG ATATGCTATA TACTTGGCCA TATGCACCAG TCTGAGAAGG AGTTATTTGC 540 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGAAGCAGAG-AAAGAAAGAA XAGCTAGAGA AGATGAGGTT TGTAGTTCAC AAAAAAGTTC 600 TTGTTCTCTT TTCAAGTCTT CTCTGTATAT CCTAGTTAAC GAGCATGGCC ATACAAATCA 660 25 ACGTTTACAG GAAGCTCGGA TAGCACGGGA AGAAGGTGAA CGCAGGCGGA AAGAAAGGGA 720 CCACCGGTAT GGAGACAGGa GGAGGCGTGA; CAAACGGGTA AGTACTTATT TGAGTCCAAA 780 TGAATTATftA CCTTCTCAAC TCTGTTTXAT CTGGATUVCCA AGTGAGTGAA TATTGTTGGA Θ40 30 AATGGTTTGG tttgttttgt tttgttttgc agccgaatcc ACGTGA^TAT ATGGATGATT 900 ACCATGTAAG XGTXCCTTCT ATCTCAACCA CXTTA/UVAAG AATGGTTTAT GCATTTTAGT 960 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 45 7297 AS RS C8 D3 六、申請專利範圍 35 ACTGAATCAT CTTAACTGTT CTAAAAATGT AAGTTTGTTA TGATTCTGAA TTTCGTGTAG 1020 GACGAGCTAT GAGGCGCAGA GTGGTGGGCA TTTGGCAAAG CATTGGGGGA AATTATCTAT 1080 40 ATTTTGCCTT TGAATGTGTA CCTGTTTGTA ΛΤΤΤΟΛΤΛΛΤ TTGTAACCTT TTGTATTCAT 1140! i ΑΤΤΟΤΤΛΤΛΛ TGTATTTTGG CATG^AAACT TGACTTGTTA TTTTTCCCTT CCAATACAAA f 1200 ΑΛΤΤΟΤΛΛΛΑ TTGGCAAGJVA CGACTTACTA CCATGCAGTG ATTTGTGAAG 4 TTTGATAGTG . 1260 、 ! 45 GTGGTAATTT TAATTGTTTC ACCACAGAAA ATTTCTCTAT ATCCTGAAGA AGATAGCTGA 1320| GTTG^ACTGA GAGGTTGGCG' TTTCTTAGTG ΛΛΑΛΤΛΟΛΛΛ AAATAGAAAT CTTTAGCTAG 13G0 50 AAAGTGTGGT GTGGACCCGA CXGATGGTAA CCATGTTCAI! TTGGAGGAAC TAATGTGAAT 1440 ATTAGCTAAA AGCATATTGT TGAGTGTTGA C2VAAATGACA ACAGATAAM1 CGTCAAATAC 1500； TACTCCACCT AGCTAATATT TTTTTTTAAC TAATGTTAGA AAGCCACCTA TTTGCATCCG 1560 55 TAATGATAAA AACTAAAAAA ATATTAGATT ATTAGAGTGA TACATTTTGT GXGAAAACGT 1620 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 AAACGAAAGT CAAAAGAAAG AAAAACGAAA GAAATTTAAA TGCGGTTTAT GGTGGGCACA 1680 -AATGTTGTGA CCTGGTGTGT * CCCTTTCCCA CTTAAATGTA CGGCTGATAA TCACATCAGT ： 1740 GGCGACTTTA GGAAATAGAA AATTCGCACA ATTGACTCGA TACGCATTJVA AGTCGTAATC . 1_: ACTAGACATT TTTGTTATCT GTCCTTTAGT GGTTCGXXTA ATCTGGAACG TCCTTATAAT 1860 AACAXAAGAT ΛΛΛΤΛΤΤΤΛΟ TTAATTAGCT ACGGAACTAC ATTAGTAT^C AATTGATATA 1920 ACTAATGGTA ΛΧΤΛΟΤΛΛΤΤ AATTGCGGAA AGCCGAGAGA GGTGATGGTG CACGGTGCAT 1980 GTGAAGAGCT TTTGATACGT AAGTGGAGCA CTCATGATAA GCGAAGTTGT CTATTXAXAA 2040 AGTTTAATTT ACTGTGCTTT TTATAATGTG ACACACTATT GGAMCCAAT GACTGCATTA 2100 ΤΤΤΛΤΤΤΛΤΛ TGTAMAAAA AAAGTCTCAA AGCTTGGATC CCCGGGTAGG TCAGTCCCTT 2160 )ATG . 2163 Met 2 · 一種可得自擬南芥（Arabidopsis thaliana)之 D N A片段’其當再引入植物時可促進可由根結及囊胞線 蟲所誘導之相連D NA序列之轉錄，該D NA片段係由 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I n B^i n It c- 2 4 5 729 7 A8 BS 08 D8 六、申請專利耗圍 SEQ ID NO:4中核苷酸1至2141所示之核 苷酸序列所構成。 3.如申請專利範圍第1或2項之DNA片段，其實 質上具線蟲飼養位置專一性。 4‘ 一種嵌合體DNA片段’其依轉錄方向係由申請 專利範圍第1或2項之D N A片段及在其轉錄控制下被表 現之burnase基因所構成’其特徵在於該jburnase基因並非 天然地在該D N A片段之轉錄控制下》 5 .如申請專利範圍第4項之嵌合體D NA片段，其 中該被表現之burnase基因導致產生對誘導線蟲爲毒性之 物質》 6. 如申請專利範圍第1或2項之DNA片段，其係 用於鑑定植物中可促進相連之D N A序列轉錄之次片段。 7. 如申請專利範圍第4或5項之嵌合體DNA片段 ，其係用於轉形植物。 8. 如申請專利範圍第1或2項之DNA片段，其 係用於製備雜交調節性D N A序列。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,/装 -------c 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚） 3